JPH06508025A

JPH06508025A - 癌胎児性抗原を発現する組換えウイルスとその使用方法

Info

Publication number: JPH06508025A
Application number: JP4512025A
Authority: JP
Inventors: スクロム，ジェフリー; カンター，ジュディス
Original assignee: アメリカ合衆国
Priority date: 1991-05-06
Filing date: 1992-05-06
Publication date: 1994-09-14
Anticipated expiration: 2018-04-28
Also published as: EP0584266A1; WO1992019266A1; DK0584266T3; CA2102623C; AU674492B2; DE69233186D1; CA2102623A1; DE69233186T2; EP0584266B1; US5698530A; ATE248924T1; AU2006092A; ES2206446T3; EP0584266A4; JP3399943B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】癌胎児性抗原を発現する組換えウィルスとその使用方法発明の背景光肌夏肢五分団本発明は一般に組換えウィルスに関する。詳しくは本発明は癌胎児性抗原が挿入された組換えワクシニアウィルスなどのウィルスのヘクターおよび活性免疫応答を誘発するその使用方法に関する。

宜量孜逝皇１−報癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は、多数の原発性および転移性の結腸直腸腫瘍を含む大部分の胃腸癌で発現され、および非常に低濃度ではあるがいくつかの正常な内胚葉で誘導される組織にもみとめられる高度にグリコジル化された１８０，０００ダルトンのタンパク譬であるＣＥＡは１９６５年にはじめて報告されたがその遺伝子は単離されていなかった。そしてその配列は１９８７年になって決定された（Ｏ４ｋａｅ＋ａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍ＋ｗ、＋　１４２巻、５１１〜５１Ｂ頁、１９８７年参照）。ＣＥＡは腫瘍関連の抗原の中で最も広く研究されているものの一つである。ＣＥＡは原発性腫瘍の切除を行った後に手術後患者を監視するのに臨床上利用されてきた。さらに、抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、原発性結腸腫瘍の診断画像化および転移性疾患のｉ＊ｍｕｎｏ１ｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎに利用して成功してきた（例えば５ｉｋｏｒｓｋａら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｅｔ、　Ｐｒｅｖ、＋　１２巻、３２１〜３５５頁、１９８８年；　ＣＪ、　Ｖｏｇｅｌ＆１集”　ＩＩｌｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：　八ｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　ｉｎ　Ｒａｄｉｏｉｍａｇｉｎｇ　ａｎｄＴｈｅｒａｐｙ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ”２５９〜２８０頁、米国、ニューヨーク：　０ｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ＋　１９８７年のＧｏ　ｌｄｅｎｂｅｒｇらの論文”Ｃａｎｃｅｒ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｗｉｔｈ　ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”；　Ｍａｃｈ　ら、Ｉ＋ｗａｅｕｎｏｌ。

Ｔｏｄａｙ、　２巻、２３９〜２４９頁、１９８１年参照）。

ＣＥＡは、ヒト内でごく弱い免疫原性であると一般に考えられているが（正常なヒトまたは癌患者においてＣＥＡに対する体液性もしくは細胞性の免疫が存在するという証拠は見出されていない）、本発明は、生体内で例えば腫瘍の免疫治療時に抗ＣＥＡ応答を誘発する、ＣＥＡの強力な免疫原との同時表示（ｃｏ−ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）に関する。

ワクシニアウィルスは高度に免疫原性で体液性応答と細胞性応答の両方を刺激し、腫瘍抗原を、主要細胞組織適合性複合体抗原とともに提供することもできる。

さらに組換えワクシニアウィルスを生体内で使用することは、その安全性、効力、および価格から有利である。このウィルスの毒力は、このウィルスの異なる株を使うことによって減らすことができ；このウィルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子またはその一部を欠失させると高度に減弱されたワクシニアウィルスが得られ；そのウィルスは長期間にあたって安定なので多数のヒトに容易に投与することができ；ワクシニアでベクター化したワクチン（ｖａｃｃｉｎｉａ−ｖｅｃｔｏｒｅｄ　ｖａｃｃｉｎｅ）の開発費用は他の多くのワクチン開発方法より少なく；および組換えワクシニアウィルスは、これと同時表示された抗原の免疫原性を低下させることなく、ワクシニアウィルスに予め暴露された個体に使用できる。

組換えワクシニアウィルス構造体は、従来、Ｂ型肝炎、単純庖疹ウィルス、パラインフルエンザ３型、およびラッサ熱ウィルスを含む各種の感染疾患に対して製造され有効に利用されてきた（Ｍｏｓｓら、Ｎａｔｕｒｅ、　３１１巻、６７〜６９頁、１９８４年ＨＷａｃｈｓｍａｎら、Ｂｉｏｓｃｉ、　Ｒｅｐ、＋８巻、３２３〜３３４頁、１９８８年ｉ　ＳｐｒｌｇｇＳ　ら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　６２巻、１２９３〜１２９６頁、１９８８年；　Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、　８６巻、３１７〜３２１頁、１９８９年それぞれを参照）。腫瘍対抗防護（ｔｕｍｏｒ　ｃｈａｌｌｅｎｇｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）も、同様に組換えワクシニアウィルスを用いて動物モデルで示されている（Ｌａｔｈｅら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、　３２６巻、８７８〜８８０頁、１９８７年ＨＢｅｒｎａｒｄｓら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ＋　８４巻、６８５４〜６８５Ｂ頁、１９８７年ＨＥｓｔｉｎ　ら、Ｐｒｏｃ、　ＮａＬ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ＋　８５巻、１０５２〜１０５６頁、１９８８年参照）。

本発明は、組換えＣＥＡワクシニアウィルスを使用することからなる、胃腸癌なとのＣＥＡを発現する癌を含む、ＣＥＡタンパク質を発現する癌の治療方法を提供するものである。“癌を治療すること”とは、ＣＥＡに対する免疫応答を誘発する組換えＣＥＡ／ワクシニアウィルスを患者に投与する（免疫化または予防接種）ことによって、ＣＥＡを発現する癌細胞に対して免疫系を刺激することであると定義する。

発明の要約本発明は、ヒト腫瘍関連抗原ＣＥＡを発現する組換えウィルスおよびその使用法に関する。本発明にしたがって製造されるウィルス構造体は抗ＣＥＡモノクローナル抗体によって認識されるタンパク質産物（ＣＥＡ）を発現する。さらに本発明の組換えウィルスは、生体内で使用すると、ＣＥＡに対して体液性免疫応答および／または細胞性応答を誘発する。

本発明の好ましい実施態様は、相同的組換えによって、ワクシニアウィルスのゲノムに、２．４キロベース（ｋｂ）のＣＥＡのＳｅａ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼフラグメントを挿入することによって構築されたＲＶ−ＣＥＡと呼ばれる組換えＣＥＡワクシニアウィルスで構成されている。なお上記のフラグメントは、ＣＥＡに対する完全なコーディング配列、すなわち５１と３１の非翻訳領域の両方の部分を含有する２、１０６個のヌクレオチドのコーディング領域を含有している。得られたウィルスは、感染した細胞の表面上にＣＥＡを発現する。

この発明の他の態様として、本願に開示された一般原理にしたがって製造されたＲＶ−ＣＥＡ構造体または他のワクシニアウィルス−ＣＥＡ構造体は、ＣＥＡを発現するヒトの癌を治療する際の治療剤として役立つと考えられる。

図面の簡単な説明図１はＰＳＣ１ｌ−ＣＥＡプラスミド構造体の概略図である。異種遺伝子セグメントを挿入する５ｔａａ　Ｉ制限部位は、ウィルスプロモーターをクローン化遺伝子とつなぐワクシニア２７．５プロモーターと並んでいる。β−ガラクトシダーゼをコードされるイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ＬａｃＺ遺伝子はワクシニアウィルスｐＨプロモーターの調節下にある。

ＬａｃＺ遺伝子とＳｍａ　Ｉクローニング部はともに右（ＴＫ−Ｒ）と左（ＴＫ −Ｌ）のワクシニアチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子配列のセグメント内に含まれている。これらのウィルス配列は、組換えプラスミドの野性型ワタシニアＴＫ遺伝子への挿入を導（、ワクシニアＴＫは非必須ウィルス遺伝子であるが、ＰＳＣ１１クローニングプラスミドと相同的組換えを行うとＴに欠失ウィルスが得られる（図ＩＡ）。挿入遺伝子セグメントは、５′非翻訳領域の９５個の塩基対、３′非翻訳領域の２６４個の塩基対、およびコーディング配列の２，１０６個の塩基対を含有するＣＥＡのｃＤＮＡクローンである。Ｐｌ　とＰｇはＰＣＲＤＮＡ増幅に用いられるプライマーである。そのｃＤＮＡはＰＳＣ−１１５ｌｌａ　Ｉクローニング部位に平滑末端連結を行った（図ＩＢ）、得られたキメラ構遺体はＰＳＣ１ｌ−ＣＥＡと呼称されるが、Ｂａ−旧による制限エンドヌクレアーゼマツピングによって配向させた。

図２は組換えワクシニアＣＥ＾で誘発されたプラークを示す。これらの組織培養プレートは、（Ａ）野性型ウィルスすなわちＶ−ＷＲｌまたは（Ｂ）組換えワタシニアー〇Ｅ＾ウィルスすなわちＲｖ−ＣＥＡを感染させた）ＩｕＴＫ　１４３Ｂ細胞の集密単層を示す。そのウィルス感染は２５μｌ／ｍｌのＢＵＤＲおよび３００μｇ　／ｍｌのＸ−Ｇａ１を補充した培地で伝播させた。組換えウィルスはこれらの条件下で明確な青色のプラークを生成する。

図３は組換えワタシニアーＣＥＡウィルスのサザーンプロット分析の結果を示す。ＨｉｎｄｌＩ［で消化したＶ−ＷＲとＲｖ−ＣＥＡは、（Ａ）放射能標識を付けたワクシニアウィルスＤＮＡプローブまたは（Ｂ）放射能標識を付けたβ−ガラクトシダーゼＤＮ＾プローブとハイブリッドを形成した。サザーンプロット（Ａ）は、Ｒｖ−ＣＥ＾構遺体中に、５．１キロベース（ｋｂ）の旧ｎｄｌｌ［ｊフラグメントが欠如していることを示している。サザーンプロット（Ｂ）は、ワクシニア旧ｎｄｎｌｊフラグメント中に、組換えプラスミド構造体を示すβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する９、２キロベース（ｋｂ）の旧ｎｄｎｌフラグメントが存在していることを示している。

図４は直接プラークハイブリッド形成による組換えウィルスの検出を示す。（Ａ）Ｖ−ＷＲ，（Ｂ）Ｒｖ−ＣＥＡ、または（Ｃ）組換えワクシニア−β−ガラクトシダーゼウィルスを細胞単層からナイロン膜に転移させて放射能標識をつけたＣＥＡプローブとハイブリッドを形成させた。

図５は組換えワクシニア−ＣＥＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析の結果である。ウィルスのプラークを小ようじで取出し、ＣＥＡ遺伝子の５′−および３′−末端で構築したプライマーを用いてＰＣＲ分析に付した。ＰＣＲ反応生成物の一部を電気泳動に付し、ナイロン膜にプロットし、次いで放射能標識を付けたＣＥＡプローブとハイブリッドを形成させた。レーンｌはＣＥＡ−陽性の対照；レーン２〜９は個々の組換えワクシニア（Ｒｖ−ＣＥＡ）ウィルスの単離株；レーン１０は野生型（ＶＪＩＲ）を示す。

図６は免疫蛍光染色法で抗−ＣＥＡ　Ｍａｂ　Ｃ０Ｌ−１を用いる細胞中のＣＥ＾の免疫検定の結果、およびワクシニアウィルスを感染させた細胞単層の対応する光学顕微鏡写真を示す、パネル（Ａ）は組換えワクシニア（Ｒｖ−ＣＥＡ）を感染させたＨｕＴに−１４３Ｂ細胞の光学顕微鏡写真である。パネル（Ｂ）は、組換えワクシニア（Ｒｖ−ＣＥＡ）を感染させてＭａｂ　Ｃ０Ｌ−１で処理したＨｕＴに一１４３Ｂ細胞を免疫蛍光染色したものを示す、パネル（Ｃ）は野生型（Ｖ−ＷＲ）を感染させたＨｕＴＫ１４３Ｂ細胞の光学顕微鏡写真である。パネル（Ｄ）は、野生型（Ｖ−ＷＲ）を感染させてＭａｂ　Ｃ０Ｌ−１で処理した細胞を免疫蛍光染色したものを示す。パネル（Ｅ）は組換えワクシニア（Ｒｖ−ＣＥＡ）を感染させたＨｕＴに１４３Ｂ細胞の光学顕微鏡写真である。パネル（Ｆ）は組換えワクシニア（Ｒｖ−ＣＥＡ）を感染させてＭａｂ　８７２．３で処理したＨｕＴＫ１４３Ｂ細胞を免疫蛍光染色したものを示す。

図７は野生型ウィルスおよび組換えＣＥＡ−ワクシニアウィルスで免疫化したマウスの抗−ＣＥ＾抗体応答を比較している。８週齢のＣ５７／ＢＬ６マウスＩＯ頭づつのグループを、ワクシニアウィルス（Ｖ−ＷＲ）またはそのＩＪＩ換え誘導体（Ｒｖ−ＣＥＡ）　Ｉ　Ｘ１０”ｐｆｕを含有する粗製溶液１００＃１の腹腔内注射を３回１４日間隔で行って免疫化した。血清試料を、−次免疫化を行ってから２週間後と、三次免疫化を行ってから１週間後に収集した。抗−ＣＥ＾抗体を酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ法）で定量した。

図８はヒトＣＥＡを形質同人されてそれを発現するマウス腺癌細胞系の増殖に対する、組換えＣＥＡ−ワクシニア構造体の投与の効果を示す。１０頭のＣ５７／Ｂ１６雌マウスからなる群に、ＣＥＡを発現するマウス結腸癌ＭＣＡ３Ｂ腫瘍細胞２Ｘ１０’を皮下注射した。７日後に、これらマウスに、尾部の乱切法によって、野生型（Ｖ−ＷＲ）ワクシニアまたは組換え（Ｒｖ−ＣＥＡ）ワクシニアＩ　ＸＩＯ”ｐｆｕの１０μｍを投与し、次いで１４日間づつ間隔をおいて２回追加の接種を行った。皮下の腫瘍を一週間毎に、２方向の寸法を測定し；式：輻２ ×長さ＋２によってその容積を計算した。パネル（Ａ）は、野生型ワクシニア（Ｖ−ＷＲ）ウィルスを接種された１０頭の個々のマウスの腫瘍の増殖を示す、パネル（Ｂ）は、ヒトＣＥＡを含有する組換えワクシニア（ＲシーＣＥＡ　）ウィルスを接種された１０頭の個々のマウスの腫瘍の増殖を示す。

図９は、組換えＣＥＡワクシニア構造体を用いて３回免疫化した後のヒトＣＥＡを形質導入されてヒ）　Ｃｆ！Ａを発現するマウス腺癌細胞系の皮下増殖の阻害を示す、　１０頭のＣ５７／Ｂ１６雌マウスからなる群を、尾部の乱切法にて、粗製野生型ワクシニア（Ｖ−ＷＲ）または組換えワクシニア（Ｒｖ−ＣＥＡ）のｌＯμｌで免疫化した。各免疫化は１４日間隔で行った。予防接種を一３０日、 −１６日、−２日目に行った。最後の免疫化を行ってから２日目に、ヒｌ−ＣＥＡを発現するＭＣＡ３８結腸癌細胞２Ｘ１０’を皮下に移植した。パネル（Ａ）は野生型（Ｖ−ＷＲ）ウィルスで免疫化された１０頭の個々の動物の腫瘍の増殖を示す、パネル（Ｂ）はヒトＣＥ＾を含有する組換えワクシニア（Ｒｖ−ＣＨＡ）ウィルスで免疫化した１０頭の動物の腫瘍の増殖を示す。

図１０は、ヒｌ−ＣＥＡを発現するマウス腺癌細胞系の増殖に対する、組換えＣＥＡワクシニア構造体と組合わせたシクロホスファミド投与の効果を示す。Ｃ５７／ＢＬ６雌マウスに、腫腫を移植する２日前に、腹腔内注射までシクロホスファミド（１００ｍｇ／ｋｇ）を投与した。ヒトＣＨＡを発現するＭＣＡ３８腺癌細胞２Ｘ１０５を皮下注射で移植し、２日後に、尾部乱切法で、野生型ワクシニア（Ｖ−ＷＲ）または組換えワクシニア（Ｒｖ−ＣＥＡ）のＩ　Ｘｌ０１０ｐｆｕの１０μｌを投与し、続いて１４日間づつ間隔をおいて２回追加の接種を行った。皮下の腫瘍を１週間毎に２方向の寸法を測定し、容積を計算した。パネル（Ａ）は、シクロホスファミドを投与されかつ野生型ワクシニア（ＶＪＩＲ）ウィルスを接種された１０匹の個々のマウスの腫瘍の増殖を示す。パネル（Ｂ）は、ヒ１−ＣＥ＾を含有する組換えワクシニア（Ｒｖ−ＣＥＡ　）ウィルスを接種した１０頭の個々のマウスの腫瘍の増殖を示す。矢印はワクシニア接種の日を示す。

図１１は、ヒトＣＥＡを発現するマウス腺癌細胞系の増殖に対する、組換えヒトインターロイキン−２（ｒｈ　ＩＬ−２）および組換えＣＥＡワクシニア構造体の投与の効果を示す、５頭づつのマウスからなる群にヒトＣＥＡを発現する２Ｘ１０’の肛へ３８マウス腺癌細胞を移植した。

組換えヒトインターロイキン−２（ｒｈ　ＩＬ−２）は、１日に２回づつ腹腔内注射（２５，０００単位／注射）で、腫瘍移植後＋１．＋２．＋−３゜＋４日後に投与した。野生型ワクシニア（Ｖ−ＷＲ）ウィルスまたは組換えワクシニア（ＲシーＣＥＡ）ウィルスのｌ　ＸＩＯ”ｐｆｕの１０μｌを、尾部乱切法によって腫瘍移植＋２日後に投与した。２回の追加の免疫化を１４日間の間隔をおいて行った。矢印は免疫化の日を示し、星印は組換えヒトインターロイキン−２（ｒｈ　ＩＬ−２）を注射した日を示す。

パネル（Ａ）は組換えヒトインターロイキン−２（ｒｈ　ＩＬ−２）だけを投与された動物の腫瘍の増殖を示す。パネル（Ｂ）は、ｒｈ　ＩＬ−２と野生型ワクシニアウィルス（Ｖ−ＷＲ）を４２日間にわたって投与された動物の腫瘍の増殖を示す。パネル（Ｃ）はｒｈ　ＩＬ−２と組換えワクシニア（Ｒｖ−ＣＥＡ）ウィルスを投与された動物の腫瘍の増殖を示す。

図１２は、移植された、ヒトＣＥ＾を発現するマウス腺癌細胞系の増殖に対する、＆［ｌ換えＣＥＡワクシニア構造体の事前の予防接種の効果を示す。１０頭づつの群のマウスに、尾部乱切法で、Ｖ−ＮＹＣ（パネルＡとＣ）またはｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡ（パネルＢとＤ）の１０’ｐｆｕの１０．ｃｒｌを予防接種した。３回の予防接種を１４日間隔で行った。最後の予防接種を行ってから７日後（０日）に、２Ｘ１０’の腫瘍細胞を、皮下接種によって移植した。パネルＡとＢは、非ＣＥＡ発現性細胞系ＮＣ３８の増殖速度を示し、パネルＣとＤはＣＥＡ発現性腫瘍すなわちＭＣ−３８−ＣＥＡ−２の増殖速度を示す。二方向の測定を一週間毎に行った。

図１３は、ＣＥＡを形質導入されたかまたは導入されなかったＭＣ−３８マウス結腸腺癌を有するマウスのｒＶ　（ＮＹＣ）−ＣＥＡによる治療を示す。

１０頭づつのマウスの群に、２Ｘ１０’のＭＣ−３８細胞（パネルＡとＢ）またはＣＥＡを形質導入されたＭＣ−３８−ＣＥＡ−２細胞（パネルＣとＤ）を皮下に注射した（０日）。７日後、動物に尾部乱切法で、Ｖ−ＮＹＣ（パネルＡとＣ）またはｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡ（パネルＢとＤ）の１０７ｐｆｕの１０μｍをワクチン注射した。２回の追加の予防接種を１４日間間隔をおいて、２１日目と３５日目に行った。腫瘍を２方向について一週間毎に測定した。

図１４は、サルに組換えワクシニアウィルスを接種した際の抗体応答を示す。動物に、１日目、４２日目、８４日目に（矢印）　、Ｖ−ＮＹＣ（白記号）またはｒＶ（ＮＹＣ）−Ｃｌｌ！Ａ（黒記号）を予防接種した。抗ＣＥＡ抗体を、異なる時点でＥＬＩＳＡ法によって定量した。

図１５は、ｒＶ−ＣＥＡで誘発されたサルの抗血清によるヒトＰＢＭＣの＾ＤＣＣ活性の特異性を示す。（Ａ）　ｒＶ−ＣＥＡを２回接種したサルから得た血清を、ＣＥＡタンパク質を発現するマウス腫瘍細胞に対する活性についてＡＤＣＣ検定法で試験した。ヒトＰＢＭＣを添加する前に、標的細胞（Ｉ　ＸＩＯ’）は、免疫剤血清の１＝５０希釈液（白記号）または２回目の免疫化後２１日目に得られた血清（黒記号）とともに３７℃にて１時間、前インキュベーションを行った。血清は、ＣＥＡでトランスフェクトされたマウス結腸癌細胞系（四角記号）または形質導入されなかった対照の腫瘍細胞（円形記号）に対するＡＤＣＣ活性について試験した。（Ｂ）はヒトエフェクター細胞を１８時間ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）で前処理したことを除いて（Ａ）に同じである。血清は、ＣＥＡでトランスフェクトされたマウス結腸癌細胞系に対するＡＤＣＣ活性について試験した。

特定の実施態様の詳細な説明本発明は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）が挿入されているワクシニアウィルスなどのウィルスのベクターを含有する組換えウィルスであって、そのウィルスに感染した細胞の表面にＣＥＡまたはその抗原性フラグメントを発現し、かつＣＥＡおよびＣＥＡを発現する細胞に対して生体内で免疫応答を誘発する組換えウィルスに関する。ワクシニアウィルスは、好ましくは、ＣＥＡもしくはその免疫原性フラグメントが挿入もしくは組換えられているＶ−ＷＲもしくはＮＹＣの株のウィルスであり、または他の弱毒ヒトワクシニアウィルス株を用いることができる。免疫原として用いる組換えワクチン製剤の製造については例えば米国特許第４，７２２，８４８号と同第５，０１７，４８７号およびＰＣＴ特許願公開第＄１０８７１０２２０３８号に記載されている。なおこれらの文献は本願に援用するものである。このワクシニアウィルスは、ＣＥＡの発現を増大するプロモーター、例えばプラスミドＰＭＪ６０１の合成の後期プロモーターを含有している。（Ｄａｖｉｓｏｎ＋　Ａ、Ｊ、およびＭｏ５ｓ＋　８．、　Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１８巻、４２８５〜４２８６頁、１９９０年）。当業者にとって明らかなように他のウィルスベクターも使用することができる。これらのウィルスとしては例えば、ＣＥＡまたはその所望の免疫原性部分をコードするＤＮ八が挿入されているバキュロウィルス（例えばヨーロッパ特許第２２８０３６号に報告されている）、ヒトアデノウィルス、ＳＶ４０、鶏痘またはウシ乳頭腫ウィルスがある。本発明に用いられる他のベクターとしては、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属の細菌〔例えばサルモネラ・ティフィ（Ｓａｌ＋ｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）　）およびＢＣＧ（ＢａｃｉｌｌｅＣａｌｍｅｔｔｅ　Ｇｕｅｒｉｎ）　（Ｓｔｏｖｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、　３５１巻、４５６〜４６０頁、１９９１年に製造されている。なおこの文献は本願に援用するものとする）のベクターがある。

さらにＣＥＡは単一もしくは多数の免疫優性のＴ細胞エピトープを含有していてもよい、　Ｒｖ−ＣＥＡからなるＣＥ＾／ワクシニアウィルスは、ＡＴＣＣに受託番号第ＶＲ２３２３号で寄託されている。ＣＥＡの配列はＯｉｋａｗａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍ＠、＋　１４２巻、５１１〜５１８頁、１９８７年に報告されており、ヒトＣＥＡをコードするｃＤＮＡクローンの特性決定結果はＺｉｍｓｅｒｍａｎ　ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　８４巻、２９６０〜２９６４頁、１９８７年に記載されている。なおこれらの文献は本願に援用するものとする０本発明に用いるために、これらの配列は、ＣＨＡの配列の全体または抗原性部分から誘導することができる。ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は変えてもよく、または同定された抗原性部分は当該技術分野の当業者にとって周知の技術にしたがって本発明の組換えワクチン製剤に挿入される。

他の実施態様において、本発明は上記の組換えウィルスおよび医薬として許容される希釈剤、担体もしくは賦形剤からなる医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、投与の経路によって選択された量の組換えＣＥＡ／ワタシニアウイルスを含有している。好ましい投与経路としては、静脈内、腹腔内、皮膚すりこみ、経口、皮下または皮膚内の経路がある。当該技術分野の当業者は、特定の治療方法において投与すべき量は容易に決定できることが分かるであろう。

適切な量は、１０’ｐｆｕ＝ｌＯ’ｐｆｕの範囲に入ると考えられる。

他の実施態様について、本発明は、癌の細胞がＣＥＡを発現する癌にかかっている患者に上記組換えウィルスを投与することからなる該患者を治療する方法に関する。さらに具体的に述べると、その癌の細胞は、胃腸、乳房、すい臓、膀胱、卵巣、肺、または前立腺の癌細胞、またはＣＥ＾エピトープを発現する上皮由来の癌である。一つの好ましい実施態様において、上記の方法にはさらに上記組換えウィルスとともに、生体応答調節剤を投与することが含まれる。好ましくは、生体応答調節剤は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）　、インターロイキン− ６（ＩＬ−６）　、インターフェロン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ　’Ｊおよびシクロホスファミドからなる群から選択され、その製造もしくは入手性は当該技術分野の当業者には公知である。例えば組換えヒ目Ｌ−２の製造は米国特許第４．７３８．９２７号および同第４．９９２，３６７号に詳細に記載されており、およびＴＮＦの発現は米国特許第４，６５０，６７４号に詳細に記載されている。なおこれらの各文献は本願に援用するものとする。上記の方法にはさらに組換えウィルスとアジュバントを投与することを含まれる。当該技術分野の当業者であれば、特定の処理法で投与すべき量は容易に決定できることは分かるであろう。適切なアジュバントとしては、限定はないが、無機のゲル、例えば水酸化アルミニウム、ミョウバン、リゾレシチンのような表面活性物質、プルロニックポリオール類、ポリアニオン類、ペプチド類、オイルエマルション類がある。

別の実施態様において、本発明は、癌細胞の定着と増殖を防止するために、ＣＥＡに対する哺乳類の免疫系を刺激する方法であって、前記刺激を行うのに充分な量の前記組換えウィルスを哺乳類に投与することからなる方法を提供するものである。ワクシニアウィルスとしてはＮＹＣ株のウィルス、または弱毒ヒトワクシニアウィルス株で組換えたウィルスでもよい。１つの好ましい実施態様において、前記の方法はさらに、組換えウィルスとともに生体応答調節剤を投与する方法が含まれる（なお好ましくは、生体応答調節剤は、インターロイキン−２（ＩＬ −２）　、インターロイキン−６（ＩＬ−６）　、インターフェロン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）　、およびシクロホスファミドからなる群から選択される）。また上記の方法には、組換えウィルスをアジュバントとともに投与する方法が含まれる。当該技術分野の当業者であれば、特定の治療法について投与すべき量は容易に決定できることは分かるであろう、好ましい投与経路は上記のとおりである。

本発明は下記の実施例でさらに詳細に説明するがこれらの実施例は本発明を限定するものではない。

ｚ旌■土え　クシニアウィルス−ＣＥＡの組換えワクシニアウィルスはＭａｃｋｅｔｔらが報告したのとほぼ同様にして構築した（Ｄ、Ｍ、Ｇｌｏｖｅｒ［集ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ、　１９１−２１１頁、０ｘｆｏｒｄ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８５年の“Ｔｈｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖａｃｃｉｎｉａ　ｖｉｒｕｓ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｆｏｒｅｉｇｎ　ｇｅｎｅｓ″）。具体的に述べると、ヒトＣＥＡ　ｃＤＮＡのクローンをヒト結腸腫瘍細胞ライブラリーから単離した。　ＧＥＯ細胞由来のポリへ十ＤＮＡ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｔｕｍｏｒ　Ｔｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ＋　ＮＣＩ）を単離し、ｃＤＮＡを逆転写で合成し、次いでＤＮＡポリメラーゼによって二本鎖にした。制限酵素旧ｎｄＩ［［とＢａ■Ｈ１の部位を含有するリンカ−をｃＤＮＡに連結し、定方向クローン化ベクタ・λｏｒｆ−８に挿入した（Ｍｃｉｓｓｎｅｒら、ＰＮＡＳ、　８４ＪＳ、４１７１〜４１７５頁、１９８７年に記載された方法にしたがって行った）。ＣＥＡを含有する組換えプラークは核酸ハイプリント形成法を用いて検出した。陽性のプラークを精製して配列を決定した。２．８キロベース（ｋｂ）のクローンが、ポリＡ°尾部を含む５′非翻訳領域の１００個のヌクレオチドを越えて、ＣＥＡの全コーディング領域（２，１０６個のヌクレオチド）を含有することが分かった。２．４キロベース（ｋｂ）のＳｅａ　Ｉフラグメントを上記のクローンから単離し、供与プラスミドｐＳＣ−１１のＳｍａ　Ｉ制限部位に平滑末端連結を行った。プラスミド挿入断片の配向は、Ｂａｓ＋　Ｈｌエンドヌクレアーゼ消化と分析によって測定した。生成したプラスミドの構造体をＰＳＣＩＩ−ＣＥＡと命名した（図１）。

ウィルスキメラウィルスの旧ｎｄＩ［ＩＪフラグメント中に非必須ＴＫ遺伝子を有するワクシニアウィルスと、ＰＳＣＩＩ−ＣＥＡとの相同的組換え（Ｍａｃｋｅｔｔらの上記文献；ＰＮＡＳ、　７９巻、７４１５〜７４１９頁、１９８２年参照）。

組換えウィルス中に、β−ガラクトシダーゼをコードするＰＳＣＩＩ−ＣＥＡＬ５ｃＺ遺伝子が存在するので選択方法が提供される。

組換えウィルスｒＶ−ＣＥ＾を次のようにして構築した。はり集密したｃｖ−ｉ細胞、アフリカグリーンサル腎臓細胞（八ＴＣＣＮｏ、　ＣＣＬ７０）の６０− 組織培養皿を、Ｖ−Ｍｌ？の約０．２０プラ一ク形成単位／細胞（ｐｆｕ／細胞）に約２時間３７℃で感染させた。感染を進行させながら、ｐｓｃｌｌ−ＣＥＡＤＮＡの沈澱を、１ｍｌのトランスフェクション緩衝液（０，１４Ｍ　ＮａＣｌ。

５ｍＭ　ＭＣＩ、１ｍＭ　ＮａＪＰＯ，、０，１％デキストロースおよび２０ｗＭ　ＨＨＰＥＳ（４（２−ヒドロキシエチル〕−１−ピペラジン−エタンスルホン酸）〕、７．０〜７．１に調節したｐＨ，５ｇｇのキメラｐｓｃ１１−ＣＥ八プラスミドＤＮＡ、および担体としての１ｇｇのワクシニアウィルスＤＮＡを用いて製造した。この溶液を混合し、約５０μｌの２．５Ｍ　ＣａＣ１ｇを添加し、その混合物をゆっくり攪拌し、次いでＤＮＡを沈澱させながら、室温で約２０分間貯蔵した。

感染後、ウィルス接種物を吸引してＣＶ−１単一層を取出し、１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回すすいだ。上記のＤＮＡ沈澱物をＣＶ−１単層に滴下して加え、その細胞上に室温で約３０分静置し、次に５％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）を補充した新しい培地（ダルベ・ツユの培地；Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）　５　ｍｌを添加し、細胞を３７”Ｃで約３時間インキュベートした。次に培地を皿から吸引し、５％ＦＣＳを補充した新しい培地５ｍｌで置換し、細胞を３７°Ｃで再びインキュベートした。なおこのインキュベーションの時間は約４８時間であった。

インキュベーションに続いて細胞を培地にスクレープ（ｓｃｒａｐｅ）し遠心分離で集めた。得られた細胞のベレットを、ＭＥＭ　（最小必須培地；　Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）　０．５ｍｌに再懸濁させた。細胞を３サイクルの凍結−解凍に付し、続いて、４５０ワツトの水浴ソニヶーターで約１分間音波処理することによって、細胞から子孫ウィルスを放出させた。

子孫ウィルスと野生型Ｖ−Ｗｉｌｌ対照を、ＨｕＴＫ−１４３８細胞、すなわち欠損チミジンキナーゼ遺伝子を有するヒト骨肉腫細胞系の密集単層上に、２μｇ／＋ｗｌの５−フ゛ロモデオキシウリジン（ＢｕＤＲ；　ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｗ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手した）および３００μｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（Ｘ−Ｇａｌ；　Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）の存在下でプレートした。組換えウィルスのクローンは、青色のプラークの生成で立証されるＨｕＴＫ”　１４３Ｂ細胞上での増殖で選択した。（図２Ｂ）次にプラークを単離し、先に述べたのと類似の選択条件を用いてプラークを５ラウンド精製することによって子孫ウィルスを精製した。精製ウィルス単離株の高力価の溶液を、標準の方法にしたがって組織培養フラスコ中で連続継代によって製造した（Ｍａｃｋｅｔｔらの１９８２年の前記文献参照）。一般にＩ　Ｘ　１０’ｐｆｕ／　＋ｍｌ〜Ｉ　Ｘ　１０”ｐｆｕ／　ｍｌの力価が得られた。ウィルス株は一７０°Ｃで貯蔵した。

実施１拭辰組換えワクシニアウィルス−ＣＥＡ　ＤＮＡを抽出し、そのウィルスゲノムを旧ｎｄｌ［Ｉ制限エンドヌクレアーゼ消化とサザーンブロッティングで分析した。

この考察を行うために、好ましい組換えワクシニアウィルス−ＣＥＡ単離株のｒＶ−ＣＥＡのみを参照する。

組換えウィルスＤＮＡと野生型の対照ウィルスＤＮＡの試料を得るために、ＨｕＴＫ−１４３Ｂ細胞のぼり集密状態の単層を、先に述べたのとは一同様にして、約３０ｐｆｕ／細胞のＶ−ｎｉｌまたはｒＶ−ＧＥ八を感染させた。

感染は、最大の細胞変性効果がみとめられるまで約２４時間道行させ、次に細胞を培地中にスクレープし、遠心分離でベレット化し、次いで約５０μｍのＩＸＰＢｓ中に再懸濁させた。

各試料に、３００μｌの低塩緩衝液（ｐＨｓ、ｏに緩衝された２０１１Ｍ　）リスー〇ＣＩＯリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）　、１０＋ａＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、および０．７５％のＳＯ５（ドデシル硫酸ナトリウム）およびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手したブロティナーゼＫ　（１０ｍｇ／ａ＋１）の２０μｌ〕を添加して混合した。

得られた混合物を、振盪しなから３７°Ｃで一夜インキュベートし、次いでフェノール／クロロホルムの混合物で２回抽出し次にクロロホルムだけで２回抽出した。酢酸ナトリウムｐＨ５，０を０．３Ｎになるまで添加し、２倍容積のエタノールを添加してＤＮＡを沈澱させた。そのＤＮＡを遠心分離によって集めて、７０％エタノールで２回洗浄し、乾燥し次いで下記のようにして分析した。

裏隻貫主エンドヌクレアーゼによる　− Ｖ−ＷＲとｒＶ−ＣＥＡ（７）ＤＮＡを、メーカーの指示（Ｇｉｂｃｏ／ＵＲＬ）　（７）指示にしたがい旧ｎｄｌｌｌエンドヌクレアーゼで消化し、０．６％アガロースゲル上４５ポルトで一夜電気泳動させた。そのＤＮＡをＢｉｏｔｒａｎナイロン膜（ＩＣＮ）に転移させて、Ｐ”−ｄＣＴＰで標識をつけたワクシニアウィルスＤＮＡプローブとハイブリッドを形成させた。ワクシニアウィルスのＤＮＡは上記の所定の方法で単離した。２０Ａｚｉ。単位の精製野生型ワクシニアウィルス（約５０μｇ）を、５０ｗＭ　）リス−〇ＣＩ；　ｐＨ７〜８　（）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〕中に入れ最終容積を１．２ｍｌにした。この溶液に、０．１１の１０％ＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．２１の６０％スクロース、０．４ｍｌのプロテイナーゼＫ　（ｉｏＩ１ｇ／＋＊Ｉ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｗ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）を添加し、３７°Ｃで４時間インキュベートした。この溶液を、５０１１１Ｍ　トリス−）ＩＣ１ｐｌ＋７〜８と平衡化させたフェノールの等容積で２回抽出し、次いでフェノール／クロロホルム（１：１）で−回抽出した。１／１０の容積の１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７，０）と、２．５倍の容積のエタノールとを加え、［ｌＮＡを約２０°Ｃで一夜沈澱させた。ＤＮＡを遠心分離で集め、上澄み液を吸引し、ペレットを９５％エタノールで洗浄し、風乾させた。乾燥したベレットを水１００μｌに再懸濁させその濃度を２６Ｏｎ＋ｗ波長光の吸光度で測定した。このＤＮＡ　２５μｇに、メーカーの指示にしたがってＧｉｂｃｏ／ＢＲＬ　Ｒａｎｄｏｍ　Ｐｒｉｍｅｒｓ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍを用いて、ｐｚｚ−ｄＣＴＰで標識をつけた。そのフィルターを、４０％ホルムアミド（Ｃ１ｏｎｅｔｅｃｈ）と５×デンハート（０，１％Ｆｉｃｏｌ１４００．　（Ｓｉｇｗａ社）；　０．１％ポリビニルピロリジン（Ｓｉｇ＋＋＋ａ社）と０．１％ＢＳ＾（ウシ血清アルブミン、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｓｉｃａｌｓ）　；　３　Ｘ５ＳＣ（０，４５Ｍ　ＮａＣ１゜０．０４５Ｍクエン酸ナトリウム）、２．５％硫酸デキストラン（Ｓｉｇｓ＋ａ社）および０．１ｍｇ／＋ｗｌ変性サケ精液ＤＮ＾（Ｌｏｆｓｔｒａｎｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で３７°Ｃにて一夜、前インキュベートした。変性ワクシニアウィルスｄＣＴＰで標識をつけたプローブＩ　Ｘ１０”ｃｐｓ＋／ｍｌを添加し、攪拌しなから３７°Ｃで一夜ハイブリント形成を行った。フィルターを、２ＸＳＳＣと０．１％ＳＤＳ中で室温にて１５分間づつ２回洗浄し、次にｏ、　ｉ　ｘ　ｓｓｃ。

０．１％ＳＤＳ中６５°Ｃで１５分間づつ２回洗浄した。そのプロットをＸ線フィルムに４時間暴露し、現像し、野生型Ｈｉｎｄｌ［［Ｊフラグメントに対応する５、１キロベース（ｋｂ）の存在について分析した。

Ｖ−１４ＲＤＮＡは旧ｎｄＩ［ＩＪフラグメントに対応する５、１キロベース（ｋｂ）のバンドを含む一般的なワクシニアウィルスの制限パターン（ＭａＣａｒｒｏｎら、Ｖｉｒｏｌ、＋　８６巻、８８〜１０１頁、１９７８年）を示した。

それに対して、ｒＶ−ＣＥＡ　ＤＮＡは、キメラプラスミド構造体をウィルスＴに遺伝子に挿入したため５．ＩＨｉｎｄＩ［［のバンドを示さなかった。

図３Ａに示すように、野生型Ｖ−ＷＲＤＮＡの５．１キロベース（ｋｂ）のＨｉｎｄｌ［［ＪフラグメントはワクシニアウィルスＤＮＡプローブとハイブリッドを形成した。　ｒＶ−ＣＥＡ　ＤＮＡＮ土中の大きさの範囲には対応するバンドはみとめられなかった。したがって、ｒＶ−ＣＢＡ　ＤＮＡには明らかに５．１キロベース（ｋｂ）の旧ｎｄｌｌｌＪフラグメントが欠除している。

組換えＪフラグメントの大きさを測定するため、旧ｎｄｌｌ［で消化したＶ−１４Ｒ，ｒＶ−ＣＥＡおよびヒトゲノムＤＮＡを含有するサザーンプロットを、Ｐ ”−ｄＣＴＰで標識をつけてプローブで、イー・コリのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子とハイブリッドを形成させた。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の１キロベース（ｋｂ）のフラグメントを結合した特定の２０個の塩基からなる２株のオリゴマー　（５’　ＧＧＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＣＧＴＴＡＣＣ３’　と　５　’　ＴＣＧＡＡＴＣＡＧＣＡＡＣＧＧＣＴＴＧＣ３’　）をプライマーとして用いて行った。これはｖｓｃ　ｓからＰＣＲさせた（ＰＣＲ’　ｄ）が、その１キロベース（ｋｂ）のバンドは０．８％アガロースゲルから切断され、メーカーの指示にしたがってＧｉｂｃｏ／ＢＲＬ　ＲａｎｄｏｍＲｒｉｍｅｒｓ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　５ｙｓｔｅａ＋を使って標識を付け、配列は５ｈａｐｉｒａら、Ｇｅｎｅ、　２５巻、７１〜８２頁、１９８３年から得た。

図３Ｂに示すように、β−ガラクトシダーゼ遺伝子は、ＲＶ−ＣＥＡウィルスＤＮＡプロット中の９．２ｋｂの明確なバンドで明らかなように組換えウィルス中に存在している。この結果は、組換え旧ｎｄｌ［ｌＪフラグメントの考えられる大きさと一致している。β−ガラクトシダーゼ遺伝子は野性型ワクシニアのゲノム中には存在せずヒトゲノムＤＮＡ中に存在する。

１隻拠土プラークバイブリソトノ組換えワクシニアウィルスゲノム中のＣＥ＾遺伝子の存在は、ＤＮ＾ハイブリッド形成とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析で測定した。

ハイブリッド形成の試験では、６０ｎｍ組織培養皿内で増殖させたＨｕＴＫ−１４３Ｂ細胞のはヌ集密した単層に、負の対照として約１０ｐｆｕ／細胞のｒＶ− ＣＥＡ、　Ｖ−ＷＲを感染させ、および組換えワクシニア−β−ガラクトシダーゼウィルス（ＶＳＣ８，Ｂｅｒｎａｒｄ　Ｍｏ５ｓ博士、Ｎｌ＾１０　、米国、メリーランド州、ベセズダから入手）を正の対照として感染させた。

ＶＳＣ８は、ワタシニアＴＫ遺伝子に挿入されたイー・コリＬａｃＺ遺伝子を含有する組換えワクシニアウィルスである（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら、Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、＋　５巻、３４０３〜３４ｏ９頁、１９８５年）、感染させた細胞を３７°Ｃで約２４時間インキニーベートし、インキュベーションに続いてウィルスＤＮＡは、ナイロン膜を細胞単層の上に約１ｏ分間直接当てることによって該層に直接転移させた。　ＤＮＡの転移が完了した後、膜をプレートから取外し、変性し、中和し、次いで２　Ｘ５ＳＣ（０，３Ｍ　ＮａＣ１゜０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）中に数分間浸漬した０次にＤＮＡは、転移ランフ” 　（Ｆｏｔｏ　Ｄｙｎｅ社、米国、ウィスコンシン州、二ニーベルリン）を用い、約２分間紫外（ＵＶ）線に暴露することによって、膜に架橋させた。ＵＶへの暴露に続いて、膜はＰ”−ｄＣＴＰで標識を付けたＣＥＡプローブとハイブリッドを形成させ、Ｘ線フィルムに一夜暴露した。

そのＣＥＡプローブは、Ｖｅｃｔｏｒ　ｐＧＥＭ　７　（Ｊｏｈｎ　５ｈｉｖｅｌｙ博士、米国、カリフォルニア州、デュアート、シティ・オブ・ホープ）から切取った５６０個の塩基対のＰＳＴ　Ｉフラグメントであった。このフラグメント２５ｎｇに、メーカーの指示にしたがってＧｉｂｃｏ／ＢＲＬのＲａｎｄｏｍＰｒｉｍｅｒｓ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍを用いてｄＣＴＰ”で標識を付けた。このプローブを先に述べたのと同様にしてプロットとハイブリッドを形成させた。

図４に示すように、ｒＶ−ＣＥＡプラーク（図４Ｂ）はＣＥＡプローブと良好にハイブリッドを形成したが、Ｖ−ＷＲ（図４Ａ）とνｓｃ８プラーク（図４Ｃ）はハイブリッドを形成しなかった。

１ｆｉｌ− ボ１メーーゼ゛宴′　・のＰＣＲを試験するために、ＨｕＴＫ−１４３Ｂ細胞のほぼ密集した単層を６０閘 −の組織培養皿中で増殖させ、約１０ｐｆｕ／細胞のｒＶ−ＣＥＡまたはＶ−ＷＲを感染させ、次いで３７℃で約２４時間インキュベートした。感染に続いて、単層をアガロースの重層で覆って、ウィルスプラークの位置を皿上に固定した０次に個々のプラークを、小ようじによる転移によって単離し、カルシウムもしくはマグネシウムなしの１ＸＰＢＳ約１ｍｌ中にいれ、約１０分間沸騰させ次いで氷冷させた。

標準のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ”）を、Ｃｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐ、が供給する増幅キントを用いメーカーの指示にしたがって実施した。この試験を行うために、全ＣＥＡ　ｃＤＮＡセグメントを認識するオリゴヌクレオチドのプライマーをＰＣＲ反応を開始するために構築した。すなわち、プライマーをＣＥＡ遺伝子の５′と３′の末端から構築した（図ＩＡのＰ、とＰ！参照）。野生型ワクシニアウィルスのプラークは負の対照として使用した。

ウィルスの増幅を３０サイクル行ってから、各プラークの単離物の試料を１％アガロースゲル上で電気泳動を行わせ、ナイロン膜に転移させ、次いで前記のようにして放射能標識をつけたＣＥＡプローブとハイブリッドを形成させた。結果を図５に示す。組換え単離物の全部とＣＥＡの正の対照（レーン１−９）はＣＢＡ遺伝子プローブとハイブリッドを形成したが、一方野生型ワクシニアウィルスのＤＮＡ　（レーン１０）はハイブリッド形成を全く示さなかった。

実施■旦タンパク　のノＣＥＡタンパク質の発現と位置は、ＭＡｂ　Ｃ０Ｌ−１すなわちＣＢＡに対して特異的でかつ反応性のマウスモノクローナル抗体を用いて、Ｖ−ＷＲとｒＶ−ＣＥＡを感染させた細胞の免疫蛍光染色を行うことによって測定した（Ｍｕｒａｎｏら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４５巻、５７６９〜５７８０頁、１９８５年）。

ＣＥＡタンパク質の発現を試験するため、ＨｕＴＫ−１４３Ｂ細胞のぼり集密した単層に、Ｖ−ＷＲもしくはｒＶ−ＣＥＡの３０ｐｆｕ／細胞を接種し、約５時間３７°Ｃでインキュベートした。ウィルス接種物を細胞から吸引し、単層をＩＸＰＢＳで３回洗浄した。次に細胞を、新しく調製した、２％バラホルムアルデヒドＰＢＳ溶液を用いて室温で約３０分間固定した。

固定した後、細胞は最少必須培地（ＭＥＭ；　Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）で３回洗浄し、次いでＰＢＳ中１％ＢＳＡで約３０分間“ブロックＣｂｌｏｃｋ）”した。

上記処理に続いて、固定しブロックした細胞は、１Ｍｇ／ｌｌｌのＭＡｂＣＯＬ −１またはＭＡｂ　８７２．３（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｔｕｍｏｒ　Ｉ＋ｕ＋ｕｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄＢｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　ＮＣＩ）すなわちＣＥＡと反応しない負の対照のマウス抗体を添加して処理し、室温で約１時間振盪した。次に細胞をＩＸＰＢＳで５回洗浄し、次いで蛍光抱合ヤギ抗マウス第二抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、）を１：１００の希釈率で添加した。約３０分後に、細胞をＩＸＰＢｓで５回洗浄し、次いでＣＥＡの発現と細胞位置を免疫蛍光顕微鏡で測定した。免疫蛍光染色は初期ウィルス感染してから５時間以内が最高であった。ウィルスとともにさらにインキュベートして感染した細胞を細胞溶解させて膜タンパク質を分解させた。

図６Ａと６Ｂに示すように、組換えワクシニア（ｒＶ−ＣＥＡ）を感染させた細胞は、蛍光によって、Ｍａｂ　Ｃ０Ｌ−１でスティン（ｓｔａｉｎ）　している明確な細胞表面を示し、感染細胞の細胞膜中にＣＥＡを発現する組換えワクシニア（ｒＶ−ＣＥＡ）ウィルスはＣＥへの通常の細胞位置と一致した。それに対して、野生型ワクシニア（Ｖ−ＷＲ）ウィルスを感染させた細胞は、Ｃ０Ｌ−１での免疫蛍光ステイニングを示すことができなかった（図６０と６０）。イソタイブー整合（ｍａ　ｔｃｈｅｄ）負対照抗体ＢＴ２．３での免疫蛍光ステイニングは、組換えワクシニア（ｒＶ−ＣＥＡ）ウィルスを感染させた細胞に画像を誘発できなかった（図６Ｅと６Ｆ）。

１隻■１紅玉り分析８週齢のＣ５７／ＢＬ６雌マウス（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆａｃｉｌｉｔｙ）の試験試料当り１０頭づつに、約Ｉ　Ｘ１０” ｐｆｕの野生型（Ｖ−ＷＲ）または組換えワクシニア（ｒＶ−ＣＥＡ）を含有する粗製溶液１００μｌを、腹腔内（ＩＰ）注射で１４日間隔で３回接種した。− 次注射を行ってから約２週間後と三次注射を行ってから１週間後に、各マウスから血液を抜出し血清を分離した。下記の表１と図７に示すように、マウスは、接種してから約１４日間以内でＣＨＡに対する抗体力価を示し、および続く免疫化で増強された応答を示した。

表１ｒＶ−ＣＥＡおよびＶ−ＷＲで免疫化されたマウス中のヒトＣＥ＾抗原とワクシニアウィルス抗原に対する免疫応答Ｖ−ｗｌ？　＜０．０５（０，００９〜０．０９）　＜０．０３　（０，０１〜０．０５）　＋＋　＋＋＋ｒＶ−ＣＥ＾　１．５６　（０，７〜３．１２）　− １２，５（６，２５〜５０．０）　＋＋　＋＋＋ａ　抗ＣＥＡ抗体は、Ａ４０５において同等のＥＬＩＳＡ反応性を与えるのに必要なＣＥＡ−特異的ＭＡｂ　Ｃ０Ｌ−１の濃度（μｇ　／ｍｌ　）として示した。

括弧内の数は１０頭のマウスの範囲である。示した結果は第−接種後１４４日目第三接種後７日目に集めた血清についての試験結果である。マウス抗血清は１：１００の比率で希釈した。

ｂ　抗ワクシニアウィルス抗体は標準ＥＬＩＳ＾検定法で検出し、希釈率が１　：　２０，０００　（＋＋＋）および１　：　３０．０００　（＋＋）のときのウサギポリクローナル抗血清の標準曲線と比較したときの同等のＡ４０５読取り値として示す。マウス抗血清は１：１００の比率で希釈した。

抗−ＣＥＡと抗ワクシニアウィルスの抗体は、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）によって次のようにして血清中で定量した。

野性型（Ｖ−ＷＲ）抗原（すなわち約ｌＸｌ０’のウィルス粒子）を含有する０、１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，６）　１００μｌで、９６ウ工ル微量滴定プレートを一夜コートした。次にこのプレートを、０．１％グルタルアルデヒドを含有するトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ　）中の１％ＢＳ八でブロックし、ＰＢＳで３回洗い、次いで先に得られたマウス血清とともに室温で約１時間インキュベートした。

ワクシニア抗原Ｖ−ＷＲに結合したマウス血清抗体を、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬから入手したＩ蒙−ｕｎｏ　５ｅｌｅｃｔ　Ｋｉｔを用いて検出した。このキットによって、固体支持体に固定化された抗原に対するポリクローナルまたはモノクローナルのウサギもしくはマウスの一次抗体を検出できる。

ビオチニル化された二次抗体（ヤギ抗マウス）をストレブタビデンーアルカリホスファターゼ接合体に結合させ、この予め製造した複合体を、−次抗体に続いてＥＬＩＳ＾プレートに添加する。そのプレートをトリスで緩衝した食塩（ＴＢＳ　）で洗浄し、得られたアルカリホスファターゼ複合体は色素原ｐＮＰＰ　（リン酸ｐ−ニトロフェニル）を用いて検出する。この反応は水酸化ナトリウムを添加することによって停止させ、試料の４０５１−波長光の吸光度をＥＬＩＳ＾読取装置（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ｒｅａｄｅｒ、　Ｍｏｄｅｌ　ＥＬ　３１０）で読取った。ウサギのポリクローナル抗ワタシニア抗体（米国、メリーランド州ベセズダ、ＮＩＡＬＤのＭａｒｋ　Ｂｕｌｌｅｒ博士提供）を抗ワタシニアのプレートで正の対照として使用した。

試験抗原としてＣＥＡを用いて同様の手順にしたがって行った。９６ウエルの微量滴定プレートを１００μｍ　（２５０ｎｇ）の精製ＣＥ＾タンパクｆ　（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｅｎｚｙｍｅ社、米国、カリフォルニア州、サン・ディエゴ）でコードン３７°Ｃで一夜保管した。次にプレートを１％ＢＳＡ含有ＴＢＳでブロックした。正の対照の抗体としてＭａｂ　Ｃ０Ｌ−１を使用したこと以外は前述のＥＬＩＳＡ法を実施した。

これらの試験の結果をまとめ、Ａ４０５の読取り値対Ｍａｂ　Ｃ０Ｌ−１の添加量の関係を示す標準曲線を作成した。次に、各試験試料中に存在するＣＥＡ特異的抗体の量は、適切な希釈で得られた直線部分の＾４０５読取り値からＭａｂの当量で計算し、そして抗ワタシニア抗体の産生量は抗ＣＥＡ抗体の産生量と相関関係があった。この試験の結果を図７に要約した。

ＥＬＩＳＡ試験においては、マウスのワクシニアウィルス自体に対する生体内応答も抗ワタシニア抗体について検定することによって測定してマウスがワクシニアウィルスで適正に免疫化されていたことを保証した。表１はワクシニアウィルスに対する抗体応答を示し、明らかに、マウスがウィルスの適正な接種物を受けたことを示している。

この生体内試験の場合、マウスの対照グループは２週間間隔でｌＸ１Ｏ”ｐｆｕ／ｍｌの野生型ワクシニア（Ｖ−ＷＲ）を受けた。これらのマウスは、組換えウィルス（ｒＶ−ＣＥＡ）で処理した動物と比べた場合、ワクシニアウィルスに対して類似の抗体応答を行った。対照の動物はＣＥＡに対する抗体応答をしなかった（表１、図７）。予防接種を行ったマウスは、免疫化に続＜４２日間の観察期間に毒性の徴候を全く示さなかった。

これらのデータは、組換えワクシニア（ｒＶ−ＣＥＡ　）ウィルスを接種すると、免疫系がヒトＣＥＡを認識し、かつ抗原に対する体液性免疫応答をマウントする（ｍｏｕｎｔ）ことができるようになることを示唆している。

１星１血盪拭辰Ｆｒｅｄｅｒｉｃ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆａｃｉｌｉｔｙから入手した４〜５週齢の雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、ヒトＣＥＡ遺伝子を予め形質導入したＭＣＡ３８マウス腺癌細胞２Ｘ１０’を皮下注射によって接種した。これらの細胞はＣ０Ｌ−１エピトープを含有するヒ）ＣＩ！＾遺伝子を発現することが分かった。１グループ当り１０頭づつの動物に、腫瘍を移植してから７日後に、野生型のＶ−ＨＲまたは組換えワクシニアのｒＶ−ＣＥＡのｌＸｌ０”ｐｆｕを含有する粗製溶液１０μｌを、尾部乱切法で接種した。第二および第三の免疫化を１４日間隔で行った。動物は腫瘍の存在について一週間毎に検査した。腫瘍はキャリパで２方向の寸法を測定、その容積を式：幅２×長さ＋２を用いて計算した。

図８は、野生型ワクシニアウィルス（Ｖ−ＷＲ１図８Ａ）または組換えワクシニアウィルス（ｒＶ−ＣＥＡ、図８Ｂ）を投与された１０頭の個々のマウスの７日間かけて定着させた皮下腫瘍の増殖の結果を示す。

ヒトＣＥ＾を含有する組換えワクシニアウィルスを受けた動物は４２日間の経過を通して腫瘍増殖の劇的な減少を経験した。さらに組換えワクシニア（ｒＶ−ＣＥＡ）を受けた動物のうちの２頭は腫瘍を全く発現しなかった。これらの腫瘍なしの動物は、次いで２Ｘ１０’の？ＩＣＡ３８ＣＥＡ−形質導入細胞を再度移植した。９０日後、これらの動物は腫瘍なしのま＼であった。これに対して、野性型（Ｖ−Ｗｉ＋）ウィルスを投与された動物は、急速に増殖する腫瘍を発現した。ワクシニア構造体を受けなかった動物も腫瘍を発現し、その増殖速度は野性型ワクシニア（Ｖ−ＷＲ）を投与された動物と類似していた。

スｍ訪」ＪＫ訣Ｆｒｅｄｅｒｉｃ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆａｃｉｌｉｔｙから入手した５〜６週齢の雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、Ｉ　ＸＩＯ”ｐｆｕのウィルスを含有する粗製溶液１０μｌを、１４日間隔で３回接種した。１グループ当り１０頭づつの動物に、野生型ワクシニア（Ｖ−ＷＲ）ウィルスまたは組換えワクシニアｂＶ−ＣＥＡ　）ウィルスを投与した。最後の免疫化を行ってから２日後、ヒ）　ＣＥＡ遺伝子を形質導入された２Ｘ１０’のｌ’ｌｃ＾３８マウス腺癌細胞をマウスに皮下移植した。動物は腫瘍の存在について１週間毎に検査した。腫瘍はキャリパによって２方向の寸法を測定し、容積を式：幅２×長さ＋２を用いて計算した。

図９は、野生型ワクシニアウィルス（Ｖ−ＷＲ，図９Ａ）または組換えワクシニアウィルス（ｒＶ−ＣＥＡ、図９Ｂ）を３回投与した後の１０頭の個々のマウスの皮下腫瘍の増殖の結果を示す。組換えワクシニア（ｒＶ−ＣＥＡ）で免疫化を行うと、腫瘍の増殖が劇的に減少するのみならず腫瘍増殖の開始が７〜１０日間遅れた。これに対して、野生型ウィルス（ＩＩ−ＷＲ）を投与された動物は観察期間の５６日を通じて急速に腫瘍が増殖した。

尖旌炎刊ワクシニアとシクロホスファミドによる汐Ｆｒｅｄｅｒｉｃ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆａｃｉｌｉｔｙから入手した４〜５週齢の雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスを、腹腔内注射によってシクロホスファミド（１００ｍｇ／ｋｇ）で処理した。この注射をしてから２日後、ヒトＣＥＡ遺伝子で形質導入されたＭＣＡ３Ｂマウス腺癌細胞２Ｘ１０’を皮下注射で移植した。１０頭の動物からなるグループに、野性型ウィルスのＶ−ＷＲまたは組換えワクシニアウィルスｒＶ−ＣＥＡのＩ　Ｘｌ０１０ｐｆｕを含有する粗製溶液１０μｌを、腫瘍移植して２日後に、尾部乱切法によって接種した。第二と第三の接種は１４日間の間隔で行った。動物は腫瘍の存在について１週間毎に検査した。腫瘍はキャリパで２方向の寸法を測定し、式：幅２×長さ＋２を用いて容積を計算した。

シクロホスファミドは、癌を有する動物またはヒトの免疫応答を和らげると考えられるアルキル化剤である。サプレッサーＴ細胞は、リンパ球の他の分集団に作用しない濃度で上記医薬に対して感受性であることは公知である。したがってこの医薬は、恐らく、腫瘍細胞に対する宿主細胞の免疫認識と免疫応答を促進することができるであろう。予防接種を行う前に投与されるシクロホスファミドによる宿主の免疫系の免疫調節によって、免疫化に対する抗腫瘍応答を増大することができることを本願発明者らは実証する。

図１０は、シクロホスファミドとワクシニアによる免疫化を与えられた動物中のＭＣＡ３８ヒｌ−ＣＥＡを発現する腫瘍の増殖の結果を示す。

１０頭の個々の動物には、腫瘍を移植した後、野性型ワクシニア（Ｖ−−Ｒ：図１０Ａ）または組換え体（ｒＶ−ＣＥＡ　；図１０Ｂ）による免疫化を３・回行った。シクロホスファミドと組換えワクシニア（ｒＶ−ＣＥＡ　）を受けている動物は４９日間にわたって腫瘍の大きさが劇的に減少していることを示した。２頭の動物は腫瘍を発現しなかった。これらの動物には、ＣＥＡを発現するＭＣＡ３Ｂマウス腺癌細胞２Ｘ１０’を再度移植したが再移植後１２０日目でも腫瘍を発現しなかった。それに対して、野生型（Ｖ−ＷＲ）ワクシニアとシクロホスファミドを投与された動物はｌＩｌ瘍の増殖を停止させることができなかった。ワクシニアを受けなかったがシクロホスファミドを受けた動物は腫瘍の増殖を阻害できなかった。

１蓬ｆｉＬＬワクシニアとヒト　えイン　−ロイキンー２による′ムＦｒｅｄｅｒｉｃｋ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆａｃｉｌｉｔｙから入手した４〜５週齢の雌Ｃ５７／ＢＬ６のマウスに、ヒトＣＥＡを発現するＭＣＡ３８マウス腺癌細胞２Ｘ１０Ｓを皮下注射で接種した。腫瘍を移植後、＋１．＋２．＋３および＋４日目に２５　、０００単位の精製組換えヒトインターロイキン−２（ｒｈ　ＩＬ− ２；　Ｃｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐ、）、　３．６Ｘ１０ｈ単位／ｒａｇを、１日に２回マウスに腹腔内注射で投与した。また＋２日目に、動物に、野生型（Ｖ−ＷＲ）　マタハ組換えワクシニア　（ｒＶ−ＣＥＡ）　（７）ウィルスの１×１０１０ｐｆｕの１０μｍを尾部乱切法によって投与した０次の２回の免疫化は１４日間の間隔で行った。動物は腫瘍の存在について１週間毎に検査した。ｔＷ瘍はキャリパで２方向の寸法を測定し、容積を式：輻２×長さ＋２を用いて計算した。

両者のマウス腫瘍モデルと転移性癌に冒されているヒトの治療とにおける抗腫瘍効果は、個々の＆ｌ換えサイトカイン類の高い投与量を使って、時々達成されている。例えばＲｏｓｅｎｂｅｒｇら（Ｎ、　Ｅｎｇ、　Ｊ。

Ｍｅｄ、、　１３１巻、１４８５〜１４９２頁、１９８５年）は、マウスとヒトにおいて、高投与量のインターロイキン−２だけを用いるかまたは養子細胞治療を組合わせて腫瘍の退縮を達成した。インターロイキン−２は活性化ヘルパー下リンパ球によって放出されるタンパク質である。抗原でトリガーされるＴリンパ球と、悪性になることが多い細胞障害性Ｔ細胞との膨張のためにインターロイキン−２は必須である。インターロイキン２　（ＩＬ−２）で膨張される細胞障害性Ｔ細胞は、生体内で抗腫瘍活性を保持することが分かっている。

またインターロイキン２はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を促進し、かつナチュラルキラー細胞障害性を生体内で増大する。組換え体の予防接種を行う前に、組換えヒトインターロイキン−２（ｒｈ　ＩＬ−２）で宿主の免疫系を免疫調節すると、抗腫瘍応答が増大されることが実証された。

図１１は、ヒトＣＥＡを発現するＭＣＡ３８マウス腺癌細胞の増殖に対する、組換えヒトインターロイキン−２（ｒｈ　ＩＬ−２）および組換えワクシニアウィルス（ｒＶ−ＣＥＡ　）の投与の効果を示す、５頭づつの動物からなる群に、組換えヒトインターロイキン−２（ｒｈ　ＩＬ−２）だけの投与（図１１Ａ）、または組換えヒトインターロイキン−２の投与およびこれに続く野生型ワクシニアウィルス（Ｖ−ＷＲｉ図１１Ｂ）もしくは組換えワクシニア（ｒＶ−ＣＥＡ　；図１１Ｃ）での、腫瘍移植してから２日後の尾部乱切法による免疫化を行った０組換えヒトインターロイキン−２（ｒｈ　ＩＬ−２）と組換えワクシニアウィルス（ｒＶ−ＣＥＡ）を受けた動物は４２日間の過程にわたって腫瘍の増殖の劇的減少を示した。それに対して、組換えヒトインターロイキン−２（ｒｈ　ＩＬ− ２）と野生型（Ｖ−ＷＲ）ウィルス、または組換えヒトインターロイキン−２（ｒｈ　ＩＬ−２）だけを投与された動物は、急速に増殖する腫瘍を発現した。

叉旌炎旦組換えＣＥＡ−ワクシニアウィルスを、ＡＴＣＣ（Ｎｏ、　ＶＲ−３２５；ロックビル）から入手したワクシニアウィルスのニューヨーク市衛生局株を用いて製造した。上記実施例１に記載されているヒ１−ＣＥ＾遺伝子を含有するｐＳＣ− １１プラスミドの相同的組換えによって、ｒＶ　（ＮＹＣ）−ＣＥＡと命名された組換えウィルスを製造した。　ｐＳＣ−１１１ラスミドはワクシニアウィルスの後期プロモーターｐ−１１の制御下にあるイー・コリＬａｃＺ遺伝子を含有していた。このプラスミドを使用することによって、組換えウィルス粒子を得る選択法が得られる。ｒＶ　（ＮＹＣ）−ＣＥＡの発現は、ＭＡｂ　Ｃ０Ｌ−１を用いるウェスターンプロット分析法で検出した。ウィルスは、遠心分離で直接ペレット化したＨｅ１ａ細胞の攪拌培養で増殖させ、次にｈａｃｋｅｔｔら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、＋　４９巻、８５７〜８６４頁、１９８４年に記載の方法にしたがい、２０〜４０％のスクロースの勾配液で精製した。なおこの文献は本願に援用するものとする。

ｒＶ　（ＮＹＣ）−ＣＥＡおよびｒＶ（畦）−ＣＥＡＯ組換え構造体によって発現されたＣＥ＾産物の分子量は抗ＣＥＡ　ＭＡｂ　Ｃ０Ｌ−１を用いウェスターンプロット分析法で測定した。精製ヒトＣＥＡの１８キロダルトンの産物と、株化されたヒト結腸癌細胞系ＧＥＯの抽出物中に検出されたＣＥＡとを対照に使用した。　ｖ−ＮＹＣ，ｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡ、　Ｖ−１１ＲおよびｒＶ　（ＷＲ）−ＣＥＡを感染させた細胞の抽出物を膜に移し、Ｃ０Ｌ−１について分析した。　ｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡを感染させた細胞は９０キロダルトンの産物を発現したが、野性型Ｖ−ＮＹＣまたはＶ−ＷＲを感染させた細胞はＣＥＡの存在を全（示さなかった。一方ｒＶ（ＷＲ）−ＣＥＡを感染させた細胞は９０キロダルトンと１８０キロダルトンの産物を発現したがこれらの産物はＣ０Ｌ−１と反応した。

発現産物が変化する理由は現在分かっていないが、ｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡまたはｒＶ（ＷＲ）−ＣＥＡを感染させたＢ５−Ｃ−１をノーザンプロット分析法で分析したところ２．４〜２．５ｋｂの＋ｗＲＮＡ種が検出されたが、このことは全ＣＥＡ転写物がこれらの細胞中に存在していることを示している。

より二層変性されたｒＶ　（ＮＹＣ）−ＣＥＡの構造体を、動物モデル中に腫瘍移植体が定着するのを防止するために使用した。形質導入されたヒトＣＥＡ遺伝子を有するＭＣ−３８結腸癌細胞およびもっていない該細胞を、抗腫瘍作用がＣＥＡに対して特異的であるか否かを決定するために用いた。また野生型Ｖ−ＮＹＣは、発生した防御免疫応答がＮＹＣワクシニア株に挿入されたヒトＣＥＡ遺伝子の結果であることを確認するための対照免疫原として用いた。

１２Ａ図と１２Ｂ図に示すように、野生型、またはＣＥＡ挿入断片なしの組換えワタシニア構造体はいずれも、移植されたＣＥＡ非導入腫瘍細胞の増殖に対して保護を与えなかった。各グループ中の１０頭のマウス全部から、腫瘍かは一゛同じ速度で迅速に増殖した。ＣＥＡ非導入およびＣＥＡ導入のＭＣ−３８腫瘍は、ワタシニアの接種を全く受けていない対照動物中で類似の速度で増殖し、および野生型のワタシニア（Ｖ−ＮＹＣ）の接種を受けたマウス中で増殖する腫瘍と同じ速度で増殖した。

図１２Ｃと１２Ｄは、ＣＥ＾導入結腸癌細胞の移植を阻害する際のＶ−ＮＹＣ対ｒＶ　（ＮＹＣ）　−ＣＥＡの効力を比較している０図１２Ｃに示すように、野生型Ｖ−ＮＹＣを接種したマウスにおいては、移植された腫瘍の８／１０が迅速に増殖し、最終的には１０個の腫瘍がすべて増殖した。これに対して、ｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡ構遺体を接種した１０種のマウスには腫瘍が全く増殖しなかった。さらにｒＶ　（ＮＹＣ）−ＣＥＡで免疫化したこれらのマウスは、その最初の腫瘍移植に続＜１２０日間は腫瘍が全くなかった。また１２０２０日目×ｌＯｈのＣＥＡ形質導入腫瘍細胞を移植したがやはり続り１２０日間の観察期間を通じて腫瘍はなかった。　ｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡまたはＶ−ＮＹＣの投与による毒性は全（みとめられなかった。

ｒＶ　（ＮＹＣ）−ＣＥＡ構造体を予防接種すると、腫瘍の治療に有効であることが分かった。すなわち定着した腫瘍の増殖を阻害することが分かった。組換えワタシニアウイルスによる治療を行う７日前に、腫瘍を動物に移植した。図１３Ａと１３Ｂに示すように、ＭＣ−３８癌細胞（非ＣＥ＾形質導入）の増殖速度は、Ｖ−ＮＹＣまたはｒＶ　（ＮＹＣ）−ＣＥＡの構造体が処理に用いられていても類似していた。またＣＥ＾形質導入ＭＣ−３８細胞を有するマウスも野生型Ｖ −ＮＹＣで処理された場合は類似の腫瘍増殖速度示した（図１３０）。しかしこれに対して、腫瘍を有するマウスでｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡ構遺体で処理されたＩＯＩ！Ｊｌはすべて腫瘍の増殖が大きく低下した（図１３Ｄ）。さらにこのグループの３頭の動物は４ケ月間腫瘍を発現しなかったが、ＣＥＡ形質導入ＭＣ− ３８細胞ｌＸｌ０＆を再び移植したがその後の１２０日間の観察期間を通じて腫瘍なしのままであった。非ＣＥＡ形質導入ＭＣ−３８腫瘍を反対側の側部に同時に移植したところその部位で増殖した。ｒＶ　（ＮＹＣ）−ＣＥＡの投与による毒性は、処理された動物に全くみとめられなかった。

ｒＶ　（ＮＹＣ）　−ＣＥ＾ワクシニアワクチンによってもたらされた免疫応答の性質を試験した。表２に見られるように、ＣＥＡに対する血清の力価は、ｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡを投与されたマウスの場合１　：　７００〜１７５，２５０（平均１　：　２，２５５）であったが、Ｖ−ＮＹＣを接種された１４頭のマウス全部と前接種された（ｐｒｅ−ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）　２４頭のマウス全部の血清の力価は１：２０以下（平均≦１：８２）であった。前接種グループと、いずれかのワタシニア構造体を接種されたグループとの全血清はすべて、力価が１ニア５０の一頭のマウスを除いて、オボアルブミンに対する反応性が負もしくは弱い陽性であった。ｒＶ　（ＮＹＣ）−ＣＥＡを接種した後の抗体力価の増大の動力学も監視した。ｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡの第１回の接種の後、抗ＣＥＡ力価はゆるやかに上昇し、第２回と３回の接種を行った後大きく増大した。

表」− ｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡおよびＶ−ＮＹＣを接種されたマウス由来の血清の、精製ＣＥ＾とオボアルブミンに対する反応性Ｃ０Ｄ＝０．５）　（ＯＤ＝０．５）免皮凰　マウス　Ｐｒｅ　旦剥　Ｐｒｅ　Ｄ３５ｒＶ　（ＮＹＣ）−ＣＥＡと野生型ｒＶ−ＮＹＣを接種されたマウスの体液性応答。

Ｃ５７ＢＬ１６マウスに、精製されたｒＶ　（ＮＹＣ）−ＣＥＡまたはＶ−ＮＹＣの１０’ｐｆｕを尾部乱切法で３回接種した。免疫化前に（ｐｒｅと呼称する）、ｌ：５０で開始し５倍希釈の血清を採取し、免疫化後３５日目に、精製ＣＥ＾と対照抗原のオボアルブミンに対する反応性についてＥＬＩＳＡ法で試験した。個々の血清の力価は、光学濃度（Ａ４９０）　０．５における希釈ファクターとして測定した。

ｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡ構造体に対する細胞仲介免疫応答は遅延型過敏症（ＤＴＨ）　：リンパ球増殖および細胞毒性に関する検定法を用いて測定した。　ＤＴＨ反応は、ｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡまたはＶ−ＮＹＣを２回もしくは３回、尾部乱切法で接種されたマウス（１４日間隔で１０’ｐｆｕの１０μｍを接種）について測定した。最後のワタシニア接種を終って６日後、一方の内置に、イラディエートされた（ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ）非形質導入ＭＣ−３８細胞（ＰＢＳ中５　ＸＩＯ’　ＭＣ−３８細胞の２０μｌ）を、他方の内置にイラデ４−１−トサｔＬりＣＥＡ−形質導入ＭＣ−３８細胞（ＰＢＳ中５　ＸＩＯ’　（７）ＭＣ− ３８−ＣＥＡ−２細胞）を注射した。内置の厚さを接種してから４８時間後に測定した。

対照のＰＢＳ溶液を注射したマウスには内置間に差異はほとんど見られないか又は全くみとめられなかったので、ベースライン値を決定するのに用いた。マウスにシーＮＹＣ構造体を２回接種したときに同様の負の結果が得られた。　ｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡを２回注射された１０頭のマウスのうち２頭は、ＣＥ＾形質導入腫瘍細胞を注射された内証にいくらか異なる膨張を示した。Ｖ−ＮＹＣ構遺体を３回注射されたマウスは、ＣＥＡ形質導入腫瘍に対してＤＴＨ応答をほとんど示さないかまたは全く示さなかったが、ｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡ構遺体を３回注射されたマウスの大部分（１４／２０）は、ＣＥＡ−形質導入腫瘍細胞に対して異なる０７０反応性を示した。ｒＶ　（ＮＹＣ）−ＣＥＡ構造体とＶ−ＮＹＣ構遺体の３回の注射後のＤＴＨの試験結果の差は統計的に有意な差であった。　（Ｐ　＜０．００１゜スチューデント検定法）、シたがって、これらの試験結果は、ｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡの３回の投与が、ヒ）　ＣＥＡ形質導入腫瘍細胞に対しＤＴＨ反応をもたらす２回の投与より明らかに優れている（ｐ値〈０１００１対＜０．０１）ことを示した。

ｒＶ　（ＮＹＣ）−ＣＥＡのワクチン注射の結果起こるリンパ球増殖応答を評価するため、第３と最後のワタシニアを接種後２８日目に未免疫化マウスまたは免疫化マウスから単離した牌ｌＩＴ細胞を、各種の刺激に対する応答における増殖で示される機能応答能と抗原特異性について試験した（表３）。試験したＴリンパ球の３グループの中の、ｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡで免疫化されたマウスのグループだけが可溶性ＣＥＡに応答した。ＣＥＡに対する抗原特異性はオボアルブミンすなわち関連のない可溶性抗原を用いて示したが、オボアルブミンはこれらのマウス由来のリンパ球を刺激しなかった。　ＣＥＡに加えて、ｒＶ　（ＮＹＣ）　−ＣＥ＾マウス由来のリンパ球は、生体外でのリコールチャレンジ（ｒｅｃａｌｌｃｈａｌｌｅｎｇｅ）のＵＶ不活性化ワクシニアウィルスに対して応答した。さらにＶ−ＮＹＣを受けているが免疫化されていないマウス由来のリンパ球は［ＵＶ不活性化ワクシニアウィルスに対する反応性を示した。したがってこのことは、Ｖ−ＮＹＣグループの、このウィルス抗原に対する特異性および未機能応答能を確証している。最後に、リンパ球の３グル一プ全部が、機能Ｔ細胞適応能の一般的尺度としてのＣｏｎＡに対して強く応答した。したがってｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡで免疫化されているがＶ−ＮＹＣで免疫化されていないと、ＣＥＡに対するＴ細胞の応答性を誘発した。このことは生体内の抗腫瘍作用と関連がある。

表３Ｖ−ＮＹＣまたはｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡで　されたマウスのリンパ　・３Ｈ− チミジン取込み（ｃｐｓ）　” 免疫原Ｉ　條−生　Ｋ１　ユえ之とヱ　ＣＥＡ　オボアルブミンｒＶ（ＮＹＣ） −２，６７９１５３，２４７４１，９Ｂ２　５１．９６３　２．５０２ＣＥＡ　 ±　３０９　±　８０７９　±３６８３　±１７２６　±　１８６Ｖ−ＮＹＣ２，３１９１３２，４４３４０，２０６３，２７５２，７２５±　２７０　±　５２７４　±２９２４　±　２０５　±　３９１Ｎｏｎｅ　７４７　１２６．１２０　５３９　３８５　４８６±７２　±　６７７８　±　１３２　±４４　±　１１５１　Ｃ５７ＢＬ／６　マウスに１　ｘｌＯ’　ｐｆｕ　（７）Ｖ−ＮＹＣまたはｒＶ　（ＮＹＣ）−ＣＥＡを、尾部乱切法で１４日間隔で３回別の時期に接種した。最後の暴露後２８日目の上記マウス由来の肺臓子細胞を精製した。何も投与されなかった非免疫化マウスを追加の対象として用いた。

２　リンパ球（ＩＸＩＯ’／ウェル）を、被照射（ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ）の正常同系肺臓細胞（５Ｘ１０’ウエル）の存在下、刺激なしく媒体対照）および次の各種刺激ありでインキュベートした。すなわちＣｏｎＡ　（２ｕ　ｇ　１＋ｉｌ）　、ＵＶ不活性化Ｖ−ＮＹＣ（Ｉ　ＸＩＯ’　ｐｆｕ／ｍｌ）、精製ＣＥ＾（５０ｐ　ｇ　／　Ｉｌｌ　；　Ｖｉｔｒｕ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから入手）または精製オポアルプミン（５０ｕ　ｇ　／ｍｌ　）とともに、３日間（ＣｏｎＡ）または５日間（抗原類に対して）までインキュベートした。培養物は、このインキュベート期間の最後の１８〜２４時間の間に〔３Ｈ〕−チミジン（ｌμ Ｃｉ／ウェル）でパルス（ｐｕｌｓｅ）　Ｌ、取込まれた放射能を液体シンチレーション分光法で測定した。

データは３個のウェルの平均ｃｐｓ　＋　ＳＥＭとして報告しである。

動物中のワクチン誘発抗ＣＥＡ細胞障害性応答の存在を評価するため、第２回のワクシニア接種後５日目に、Ｖ−ＮＹＣまたはｒＶ（ＮＹＣ）　−ＣＥＡで免疫化されたマウスから牌１１Ｔリンパ球を直接単離した。というのはＣＴＬの誘発が追加免疫化後（ｂｏｏｓ　ｔ）すぐに最大になるからである。表４にその結果を示したが、ｒＶ　（ＮＹＣ）−ＣＥＡで免疫化され、Ｖ−ＮＹＣでは免疫化されていないマウス由来のリンパ球は、同族体の抗原を有する一Ｇ−３８−ＣＥＡ −２Ｉｌｌ瘍細胞の溶解を仲介した。これに対して、両エフェクターグループを有する類似のインキュベーション条件下、溶菌活性のバンクグランドレベルだけが、ＭＣ−３８、すなわちＣＥＡ−陰性ＩＩ瘍標的に対して検出できた。　ＣｏｎＡの存在下（ＣｏｎＡは抗原特異的認識を妨げかつレクチン依存性細胞障害性を促進する）、両方のエフェクターのグループは効率的にＭＣ−３８を溶解した。このことはＶ−ＮＹＣを受けているマウス由来のリンパ球は溶解活性があり、腫瘍細胞系は溶解作用に対して本質的に抵抗性ではないことを確証している。

表４：ＣＥＡ−発現腫瘍に対する細胞障害性リンパ球仲介溶解作用％スペシフィックリリース３ｒＶ（ＮＹＣ）　−ＣＥＡ　３６±３２２±５１４±３７±２＋　ＮＴ　ＮＴ　５５±４１８±２Ｖ−ＮＹＣ−１２＋３　６±２１０±２６±１＋　ＮＴ　ＮＴ　５５±５４０± ４１　Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１４日間の間隔をおいて２つの別個の時点に、尾部乱切法で１×１０７ｐｆｕのＶ−ＮＹＣまたはｒＶ　（ＮＹＣ）−ＣＥＡを接種した。最後の暴露から５日後にこれらマウスから肺臓子細胞を取出し精製した。

２　ＣｏｎＡ（２，５μｇ／ｍｌ）を指定の培養物に直接添加し、レクチン依存性の細胞の細胞毒性を誘発させた。

３　ＣＥＡ形質導入（ＭＣ−３８−ＣＥＡ−２）および非形質導入（ＭＣ−３８）の標的に対する溶解活性を、２つのエフェクター二標的比で通常の５１ｃｒ放出試験法で評価した０反応は１６時間後に停止させ、比溶解性（ｓｐｅｃｆｉｃ　Ｉｙｓｉｓ）％を測定し、３個の培養物の平均値±ＳＥＭとして報告した。類似の溶解パターンは４時間の検定法でみられたがその活性はすべて低かった。ＮＴは試験しなかったことを示す。

４　エフェクター：標的細胞の比率は４０：１と２０：１であった。

実施例１３でのｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥ＾ワクチンの　とｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥ＾ワクチンによって霊長類内にもたらされる免疫応答を測定しおよびこのワクチンの安全性を評価するために試験を行った。

１２頭の５〜７年齢の成熟アカゲザル〔マカカ・ムラター（Ｍａｃａｃａｍｕｌａｔｔａ）　）を使用した。これらのサルは、ｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＩ！ＡまたはＶ−ＮＹＣのｌＸｌ０＠もしくは５Ｘ１０”プラーク形成単位（ｐｆｕ）を含有する精製ウィルス１０μｌまたは５０μｌを用い、皮膚乱切法で６週間間隔にて３回または４回免疫化した。４頭の動物がＩ　Ｘ１０”ｐｆｕのｒＶ（ＮＹＣ） −ＣＥＡを受け、４頭の動物が５　ＸＩＯ”　ｐｆｕのｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡを受け、および４頭の動物が５　ＸＩＯ”　ｐｆｕのＶ−ＮＹＣを受けた。免疫化の方法は表５に詳細に記載しである。

表５アカゲザルに対するＣＥ八へ換えおよび野生型のワクシニアウィルス１、　Ｉ　Ｖ−ＮＹＣ５ＸＩＯ’　４２．８４．１７４２　Ｖ−ＮＹＣ５Ｘ１０８　４２．８４．１７４３　ｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡ　５　ＸＩＯ＠４２．８４．１７４４　ｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡ　５　ＸＩＯ”　４２．８４．１７４５　ｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡ　１　ｘｌＯ＠４２．８４．１７４６　ｒＶ　（ＮＹＣ）　−ＣＥＡ　Ｉ　ＸＩＯ＠４２．８４．１７４Ｉ１．　７　Ｖ−ＮＹＣ５ＸＩＯ”　４２．８４８　Ｖ−ＮＹＣ５ＸＩＯ＠４２．８４９　ｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡ　５　ｘｌＯ＠４２．８４１０　ｒＶ　（ＮＹＣ）　−ＣＥＡ　５　ＸＩＯ”　４２．８４１１　ｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡ　Ｉ　ＸＩＯ”　４２．８４１２　ｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡ　Ｉ　ＸＩＯ”　４２．８４ａ　６週間間隔の皮膚経由の投与量ｂ　グループ■には免疫原を４回投与したＣ　最初の接種（１日日）後の日数安全性：ワクチンによってもたらされる外傷の面積を各接種後続いて２４時間分析した。一般にはじめの２回の接種後の方が第３もしくは第４の接種後と比べて腫れが大きい、しかし各免疫後の外傷の期間はは＼“同じであった。ワクチン注射に続く局所リンパ節の腫れはいくつかのサルでは第１回の免疫化後の方が第２、第３または第４の免疫化の場合より大きかった。一般に、ｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡワクチンまたはＶ−ＮＹＣワクチンの使用によってパラメータに差はみとめられなかった。

野生型ワクシニアウィルスを受けているサルは、体温、体重、局所のリンパ節症、および巨牌腫と肝腫の存在については組換えワクシニアウィルスを受けているサルと同等であった。ゆるやかな体温上昇はワクチン注射後すべての動物に見られた。ゆるやかな局所リンパ節症が免疫化後に続く数週間にわたってみとめられたが、どの動物にも、体重減少、肝腫または巨牌腫の徴候は全くなく、対照と組換えワクシニア投与の動物間に差は全くみとめられなかった。動物は、全血球計算、鑑別血球計算、肝臓の化学的性質（血清アルブミン、ビリルビン、５ＧＯＴ、　５ＧＰＴおよびＴ−グルタミルトランスペプチダーゼ）および腎臓の化学的性質（血液尿素窒素および血清クレアチニンのレベル）について試験したが、これらについてはすべて試験期間を通じて全動物について正常のま＼であるか、または組換えワクチンの注射と野生型ワクチンの注射を行った動物との間に有意差は全くみとめられなかった。

サル（とヒト）の顆粒球を、非特異的交差反応性抗原（ＮＣＡ　）とＣＥＡの発現について評価した。ＣＥＡ遺伝子は免疫グロブリン遺伝子のスーパーファミリーに属することが報告されており、正常なヒト顆粒球に見られるＮＣへのようないくつかの正常な成人組織に発現するタンパク質といくらかの相同性を共有していることが報告されている。

ＣＥＡはヒトの顆粒球で発現することは今まで報告されていない。ＮＣＡに対する免疫交差反応性を誘発する可能性は鑑別血球計算およびＥＬＩＳＡ法によって評価した。鑑別血球計算ではワクチン注射を行った動物のいずれについても全く差がなく、かつ抗ＮＣＡ応答はｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡのワクチン注射によって誘発されなかった。サルの顆粒球の表面ＮＣＡの発現は、モノクローナル抗体の８６．２（これがヒトＮＧ＾と反応することはすでに報告されている；　Ｈｏｒａｎ　Ｈａｎｄら、Ｉｎｔ、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｍａｒｋｅｒｓ、　７巻、１〜１５頁、１９９２年）および８１．１（ＮＣＡ　とＣＥＡが共有しているエピトープと反応することはすでに報告されているＨ　Ｋｕｒｏｋｉら、Ｉｎｔ、Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ＋４４巻、２０８〜２１８頁、１９８９年）を用いてフローサイトメトリー（ｆｌｏｔｓ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で測定した。両抗体はサルの顆粒球の表面上のＮＣＡに対して有意な表面反応性を示した。

動物を、ＣＥＡを発現する組換えワクシニアウィルスで免疫化してもＮＣ＾エピトープに対して明らかな免疫応答を誘発しなかった。

免疫原性：免疫化したサルを、ｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡによって誘発される体液性免疫応答と細胞性免疫応答の両方について試験した。

各サルからの血清を、ＣＥＡ　、　ＮＣＡおよび対照抗原としてのオポアルプミン（ＯＶＡ　）に対する免疫反応性についてＥＬＩＳＡ法で分析した。

抗−ＣＥＡ抗体は、精製ＣＥＡ、　ＮＣＡ　（Ｋｏｒｏｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、＋　２１１巻、７１３〜７２０頁、１９８１年の方法にしたがって正常なヒトの肺の過塩素酸による粗製抽出物から精製）、またはＰＢＳ中のオボアルブミン（Ｓｉｇ＋ｗａ社、米国、セント・ルイス）の１１００ｎでコートした微量滴定プレートを使ってＥｌｊＳＡ法で定量した。プレートはＰＢＳ中５％のＢＳＡでブロックし、乾燥し使用するまで一２０℃で貯蔵した。そしてプレートは種々の希釈率のサル血清および標準対照としてのＭａｂＣＯＬ−１とともに３７ °Ｃで１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼを接合したヤギ抗ヒトＩｇＧ　Ｆｔ特異的抗血清（１：　８０００　；　５ｏｕｔｈ−ｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｉｎｃ、＋米国、アラバマ州、バーミンガム）で検出し、続いて、０．０１５％過酸化水素と２．８請りの０−フェニレンジアミンニ塩酸を含有する０、１７リン酸−クエン酸緩衝液ｐＨ５，０の１００μｍとともに１０分間インキュベートした。４Ｎ硫酸２５μｍを添加して反応を停止させ、旧ｏ−Ｔｅｋの微小プレー１−　ＥＬＩＳＡ読取り器を用いて４９０ｎｍで吸光度を読取った。

結果を表６に示したが、免疫前の血清はすべて３種の全抗原に対して陰性であった。−次の免疫化後２８日目において、８頭のｒＶ　（ＮＹＣ）　−ＣＥＡを接種されたサルのなかの２頭に、ＣＥＡに対する強い抗体力価（１：１，０００血清希釈より大きい）が観察された。４９日目すなわち第１回の追加免疫化後１週間目に１：２５００の血清希釈以上に大きい抗体力価がｒＶ　（ＮＹＣ）−ＣＥＡを受けている８頭のすべてのサルにみとめられたがＶ−ＮＹ（：を受けているサルのどれにもみとめられなかった。

６３日目にも類似の結果がみとめられた。９１日目（第２回の追加免疫化後７日目）には、ｒＶ　（ＮＹＣ）−ＣＥＡを受けて試験された７ｇＩのすべてのサルに１７１．０００血清希釈以上に大きい抗体力価がみとめられ、そのうち四頭の力価はｌ：５．８００以上に大きかった。ｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡを受けている８頭のサルのうちの１頭は９１日目にＮＧ八に対する免疫応答がｌ：１２５０であることがみとめられたが、ＯＶＡに対する反応性もいくらかこのサルにみとめられた。別の２頭のサル、すなわちＶ−ＮＹＣを受けている一頭とｒＶ　（ＮＹＣ）−ＣＥＡを受けている一頭も９１日目にＮＣＡに対する抗体力価をいくらか示したがＯＶＡに対しても同じ力価がみとめられた。このことは潜在的な非特異的反応性があることを示唆している。したがって、ｒＶ　（ＮＹＣ）　−ＣＥＡは、アカゲザル中のＣＥＡに発現されたエピトープに対して強い応答を誘発したが、ＮＣＡ特異的エピトープに対してはほとんどまたは全く応答しなかったようである。抗ＣＥ＾応答の時間の経過による力価を図１４に示す。

ｒＶ−ＣＢへの最初のワクチン注射をしだ後３５日目の１頭のサル由来の血清試料を、（：ＥＡ、　ＮＣＡおよびオボアルブミンに対する反応性についてウェスターンプロット法で分析した。精製ＣＥＡを認識するがオボアルブミンまたは精製ＮＣＡは認識しない抗血清がプロット中に見出された。同じサル由来の免疫前の血清はＣＥＡ、　ＮＣＡまたはオボアルブミンを検出しなかった。ＣＥＡとＮＣＡをそれぞれ認識するモノクローナル抗体Ｃ０Ｌ−１とＢ６．２を陽性の対照として使用した。

ｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡワクチンによって誘発された免疫グロブリンの生物活性を、エフェクターとしてヒト末梢血液単核細胞を用い、標的としてヒ）　ＣＥＡ形質導入マウス腫瘍細胞系を用いる抗体依存性細胞障害検定法で分析した。非ＣＥＡ形質導入細胞は対照として用いた。図１５Ａに示すように、ＣＥＡを発現する腫瘍細胞の特異的溶解（ｌｙｓｉｓ）は、ｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡで免疫化されたサル由来の血清を使ったときにみとめられたが、標的として非形質導入腫瘍細胞を用いたときには溶解は全くみとめられなかった。免疫前の血清またはＶ− ＮＹＣを接種されたサル由来の血清には溶解は全くみられなかった。図１５Ｂに示すように、ｒＶ　（ＮＹＣ）−ＣＥＡで免疫化されたサル由来の血清のＡＤＣＣ活性は、ＩＬ−２で活性化されたヒト末梢血液単核細胞を使って増大された。

ｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡで誘発された細胞免疫応答を、遅延型過敏症（ＤＴ）Ｉ　）応答とリンパ球増殖検定法で評価した。ＤＴＦＩ応答は最後の免疫化後７日目に皮膚試験を行って評価した。精製ＣＥＡ　（Ｖｉｔｒｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、米国、コロラド州、リトルトン）とオボアルブミン（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州、セント・ルイス）の１００μｇを含有するＰＢＳ　Ｏ，１ｓ＋ｇを皮肉注射した。陽性の対照として、Ｕシネ活性化ワクシニアウィルスｌ　Ｘｌ０７ｐｆｕ　（１０分間２５４ｎｍ）を注射した。腫れと紅斑を４８時間後に測定し、次いで陽性応答のパンチ生検試料を採取し、その反応のＤＴＨ性を＆１１織病理学的試験によって確認した。その試験結果は、免疫原としてｒＶ（ＮＹＣ） −ＣＥＡを受けている７頭のサル全部と、免疫原として対照のＶ−ＮＹＣを受けている５頭のうち４頭とは、不活性化Ｖ−ＮＹＣワクシニアウィルスの注射に対して陽性のＤＴＩ（で応答した。一方これら１２頭のサルのどれも、オボアルブミン対照の抗原接種に対して応答しなかった。Ｖ−ＮＹＣを接種されたサルのどれも接種抗原（Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ　ａｎｔｉｇｅｎ）としてのＣＥＡに応答しなかったが、ｒＶ　（ＮＹＣ）　−ＣＥＡで免疫化された８頭のサルの中の７頭がＣＥＡ抗原あ注射に対してＤＴＩ（反応で応答した。これらの試験結果は図１６に示す。

リンパ球増殖検定法を行うため、免疫化サルから、それらの最後の免疫化を行ってから６箇月後または１２箇月後にＰＢＭＣを単離した。

ＰＢＭＣはＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｍｅｄｊｕ−を用いヘパリン処理を行った血液から単離し、ＰＢ？ＩＣは、１０％の熟年活性化つシ胎仔血清を補充したＲＰ旧１６４０の０．２＋ｗｌ中２Ｘ１０’の細胞を平底９６ウエルプレート（Ｃｏｓ　ｔａｒ社、米国、マサチューセッツ州、ケンブリッジ）の１ウエル当りにプレートし、適切な抗原とともに６日間またはコンカナバリンＡ　（ＣｏｎＡ　ＨＳｉｇｍａ社）とともに３日間培養した。細胞は、インキュベーションの最後の１８〜２４時間に、ｌ！ＩＣ１／ウェルの〔３Ｈ〕−チミジン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ社）とともにインキュベートして標識をつけ、Ｐ）１０細胞ハーベスタ−（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国、マサチューセッツ州、ケンブリッジ）で収穫した。取込まれた放射能を液体シンチレーション分光法（Ｂｅｃｋｍａｎ　ＬＳ　３８０１）で測定し、３個のウェルから得た試験結果を平均し、平均値±ＳＥＭとして報告した。

試験結果を表７に示すが、すべてのサルはｒＶ　（ＮＹＣ）　−ＣＥＡまたはＶ −ＮＹＣを受けているにかかわらず良好に応答したことを示した。Ｖ−ＮＹＣで免疫化されたサルからは、オボアルブミンに比べてＣＥＡに対して特異的なリンパ球応答はほとんどないか全くなかった。しかしＣＥＡ対オボアルブミンに対する鑑別応答は、ｒＶ（ＮＹＣ）−ＣＥＡで免疫化された３頭のサルに、最後の免疫化を行ってから１２箇月目にもみられた。

したがってこれらの試験結果とＤＴＨの結果は、ｒＶ　（ＮＹＣ）　−ＣＥＡワクチンの、ＣＥ＾に対する特異的細胞応答を誘発する性能を示している。

先に挙げた刊行物はすべて、その全体を本願に援用するものとする。

上記発明は、明白に理解するために詳細に説明したが、当該技術分野の当業者であれば、上記の開示事項を呼んで、形態と細部の種々の変更は、本発明の真の適用範囲と後述の特許請求の範囲から逸脱することな〈実施できることが分かるであろう。

Ｆｌｇ、ＩＡＦｌｇ、１ＢＡｍｐ’ ＦＩＧ　２Ａ。

ＲＧ２θ ４１番］ＦＩＧ　３Ａ、　ＦＩＧ　、辺ＦＩＧ　６Ａ。

Ｆ１６ｔ　６Ｂ。

ＦＩＧ　６Ｃ。

ＦＩＧ　ｆ；Ｄ。

ＦＩＧ、　６Ｅ／’７５６ＦＴＬｐｙ＊　Ｆ希釈度（、町）」８０節蘇（１期）」８０１１ｉｌｌ１１富、１４組換えワクシニアウィルスの接種に対する霊長類の抗体応答−次接種後の日数Ｆ１４．　１５＾駐：Ｔの比！ｉ１．１９１＋Ｔの比フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５／１２／／Ｃｌ２Ｎ　５／１０８４１２−４Ｂ（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＳＥ）、　ＡＵ、　ＣＡ、ＪＰＩＣ１２Ｎ　５１００　Ｂ

Claims

【特許請求の範囲】

１．癌胎児性抗原（ＣＥＡ）遺伝子が挿入されたワクシニアウイルスからなる組換えウイルスであって；このウイルスに感染した細胞の表面にＣＥＡを発現し、かつＣＥ４およびＣＥＡを発現する細胞に対して特異的な生体内免疫応答を誘発する組換えウイルス。
２．前記ワクシニアウイルスがＶ−ＷＲ株のウイルスである請求の範囲第１項記載の組換えウイルス。
３．前記ワクシニアウイルスがＮＹＣ株のウイルスである請求の範囲第１項記載の組換えウイルス。
４．前記ワクシニアウイルスが他の弱毒ヒトワクシニアウイルス株で組換えられている請求の範囲第１項記載の組換えウイルス。
５．前記ＣＥＡが単一または多数の免疫優性Ｔ細胞エピトープからなる請求の範囲第１項記載の組換えウイルス。
６．ｒＶ−ＣＥＡで構成されている組換え癌胎児性抗原／ワクシニアウイルス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ２３２３）。
７．前記ワクシニアウイルスがＣＥＡの発現を増大するプロモーターを含有している請求の範囲第１項記載の組換えウイルス。
８．癌の細胞がＣＥＡを発現する癌にかかっている患者に請求の範囲第１項記載の組換えウイルスを投与することからなる該患者の治療方法。
９．前記癌細胞が胃腸、乳房、すい臓、膀胱、卵巣、肺または前立腺の癌細胞である請求の範囲第８項記載の方法。
１０．前記癌細胞が、ＣＥＡエピトープを発現する上皮誘導癌細胞からなる請求の範囲第８項記載の方法。
１１．さらに、前記組換えウイルスとともに、生体応答調節剤を投与することからなる請求の範囲第８項記載の方法。
１２．前記生体応答調節剤がインターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターフェロン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびシクロホスフアミドからなる群から選択される請求の範囲第１１項記載の方法。
１３．さらに、前記組換えウイルスとともにアジュバントを投与することからなる請求の範囲第８項記載の方法。
１４．癌胎児性抗原（ＥＣＡ）遺伝子が挿入されているバキュウイルス、サルモネラ属の細菌、ヒトアデノウイルス、ＳＶ４０およびウシ乳頭腫ウイルスからなる群から選択されるウイルスからなる組換えウイルスであって；これに感染した細胞の表面にＣＥＡを発現し、かつＣＥＡまたはＣＥＡを発現する細胞に対して特異的な生体内免疫応答を誘発する組換えウイルス。
１５．癌の細胞がＣＥＡを発現する癌にかかっている患者に請求の範囲第１４項記載の組換えウイルスを投与することからなる該患者の治療方法。
１６．癌細胞の定着と増殖を防止するために、ＣＥＡに対する哺乳類の免疫系を刺激する方法であって；前記哺乳類に対し、請求項１記載の組換えウイルスを前記刺激を行うのに十分な量で投与することからなる方法。
１７．前記ワクシニアウイルスがＮＹＣ株のウイルスである請求の範囲第１６項記載の方法。
１８．前記ワクシニアウイルスが、弱毒ヒトワクシニアウイルス株で組換えられている請求の範囲第１６項記載の方法。
１９．さらに、前記組換えウイルスとともに生体応答調節剤を投与することからなる請求の範囲第１６項記載の方法。
２０．前記生体応答調節剤が、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インタ−フェロン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびシクロホスフアミドからなる群から選択される請求の範囲第１９項記載の方法。
２１．さらに、前記組換えウイルスとともにアジュバントを投与することからなる請求の範囲第１６項記載の方法。
２２．癌細胞の定着と増殖を防止するために、ＣＥＡに対する哺乳類の免疫系を刺激する方法であって；前記哺乳類に対し、請求の範囲第１４項記載の組換えウイルスを前記刺激を行うのに充分な量で投与することからなる方法。
２３．請求の範囲第１項記載の組換えウイルス、および医薬として許容される希釈剤、担体または賦形剤担体からなる医薬組成物。
２４．請求の範囲第１４項記載の組換えウイルス、および医薬として許容される希釈剤、担体または賦形剤担体からなる医薬組成物。