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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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1. Gebiet
der Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft die Verwendung eines nackten Polynucleotids,
das operativ für
ein therapeutisch wirksames, Tumor-assoziiertes Antigen kodiert,
das Klasse-I-MHC-Moleküle an Antigen-präsentierenden
Zellen bindet, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung
eines Tumors in einem Wirt, worin
das nackte Polynucleotid
an die Haut des Wirts verabreicht wird;
die Haut eine hohe
Konzentration an darin enthaltenen, Antigen-präsentierenden Zellen im Vergleich
zu anderen Wirtgeweben aufweist;
das Tumor-assoziierte Antigen
in den Antigen-präsentierenden
Zellen ohne wesentliche Sekretion daraus exprimiert wird; und
die
Zufuhr des Tumor-assoziierten Antigens im Wirt eine Th1-Antwort
bevorzugt gegenüber
einer Th2-Antwort induziert.
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2. Stand der
Technik
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Das
direkte Einführen
eines biologisch aktiven Peptids oder Proteins in die Zellen eines
Patienten kann von signifikantem therapeutischem Wert sein. Dieser
Ansatz birgt jedoch auch mehrere Nachteile. Ein vordergründiges Problem
ist das Risiko potenzieller Toxizitäten, insbesondere bei Dosierungen, die
ausreichend sind, um eine biologische Antwort auf das Peptid hervorzurufen.
Praktisch gesehen besteht auch das Problem der Kosten, die durch
das Isolieren und Reinigen oder Synthetisieren der Peptide entstehen.
Darüber
hinaus ist die klinische Wirkung der Peptide auch durch ihre relativ
kurze Halbwertszeit in vivo eingeschränkt, die üblicherweise aus ihrem Abbau
durch jegliche Protease, die im Targetgewebe vorhanden ist, resultiert.
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Aus
diesen Gründen
ist das Einführen
eines Proteins in einen Patienten durch die Zufuhr eines Gens, das
das Protein im Patienten/Wirt exprimiert, eine interessante Alternative
zur Verabreichung des Proteins.
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Im
Jahr 1984 wurde am NIH eine Studie veröffentlicht, die zeigte, dass
intrahepatische Injektion von nackter klonierter Plasmid-DNA für Eichhörnchen-Hepatitis
in Eichhörnchen
sowohl eine Virusinfektion als auch die Bildung von antiviralen
Antikörpern
in den Eichhörnchen
förderte
(Seeger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5849-5852 (1984)). Mehrere
Jahre später
berichteten Felgner et al., dass sie Expression von Protein aus "nackten" Polynucleotiden
(d.h. DNA oder RNA, die nicht mit Liposomen oder einem viralen Expressionsvektor
assoziiert ist), die in Skelettmuskelgewebe injiziert wurden, erzielten
(Felgner et al., Science 247, 1465 (1990); siehe auch die PCT-Anmeldung
WO 90/11092). Felgner et al. vermuteten, dass Muskelzellen aufgrund
der einmaligen Struktur von Muskelgewebe, das aus mehrkernigen Zellen,
Sarkoplasmatischem Retikulum und einem Transversalsystem besteht,
das sich bis tief in die Muskelzelle erstreckt, Polynucleotide effizient aufnehmen
und exprimieren.
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Auch
wenn bisher angenommen wurde, dass Zellen anderer Gewebe auch in
der Lage sein können,
nackte Polynucleotide aufzunehmen, wurde Expression in anderen Geweben
bis heute nur identifiziert, wenn die Zufuhr des exprimierten Gens über ein
Zufuhrsystem, z.B. über
liposomale Transformation der Zellen, erfolgte. Tatsächlich schlugen
andere Forscher vor, dass Aufnahme und Expression nackter Polynucleotide
in Geweben, die nicht Skelettmuskel sind, nicht auf nachweisbaren
oder biologisch aktiven Niveaus stattfinden (siehe z.B. Stribling
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 11277-11281 (1992) [Expression
nach Aerosolzufuhr eines Gens trat unter Verwendung eines liposomalen
Zufuhrsystems auf, jedoch nicht bei Einführung von DNA alleine]; und
Tang et al., Nature 356, 162-154 (1992) [Injektion mit einer Vakzinen-"Kanone" eines hGH-Plasmids, gebunden
an kolloidale Goldperlen, in die Haut von Mäusen rief keine Immunantwort
hervor]).
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Auch
wenn sie im Allgemeinen für
Genexpression innerhalb von Muskelzellen wirksam ist, erfordert
Injektion von DNA oder RNA in Muskelzellen im Rahmen einer langfristigen
Therapie den Einsatz wiederholter Injektionen, um Expressionsverlust durch
Genabbau auszugleichen. Dieser Ansatz kann nicht nur zeitaufwendig
und kostenintensiv, sondern aufgrund von Entzündungen, die an und nahe der
Injektions stelle hervorgerufen werden, auch unpraktisch sein. Solche
Entzündungsreaktionen
können dazu
führen,
dass Muskel- oder andere Somazellen, in die Nucleotide eingeführt werden,
selbst eine Immunantwort auf sich ziehen (siehe z.B. Beispiel I), und
können
zu schwerwiegender Myonekrose führen.
Darüber
hinaus besteht durch intramuskuläre
Injektion von DNA nicht nur das Risiko einer Verletzung von Muskelgewebe,
sondern auch, dass die Verletzung die Wirksamkeit der Therapie eindeutig
beeinträchtigt.
Forscher, die an der University of Ottawa arbeiten, beobachteten,
dass Skelettmuskel das einzige Gewebe ist, für das erkannt wurde, dass es
in der Lage ist, Reportergene aufzunehmen und zu exprimieren, die
in Form von Plasmid-DNA
transferiert werden, wobei jedoch die Erkenntnisse der Forscher darauf
hinweisen, dass Fasern, die durch das Injektionsverfahren geschädigt wurden,
Plasmid-DNA weder
aufnehmen noch exprimieren (Davis et al., Human Gene Therapy 4,
151-159 (1993)).
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Obwohl
weiters die Verwendung von intramuskulären Injektionen zumindest kurzfristig
in Therapien wirksam sein kann, die auf Erkrankungen im Muskelgewebe
selbst abzielen, ist sie wahrscheinlich zur Stimulierung einer gewebespezifischen
Immun- oder anderen
biologischen Antwort auf das exprimierte Peptid an einer anderen
Stelle im Körper
des Patienten weniger wirksam. Folglich ist intramuskuläre Injektion
kein besonders günstiger
Weg zur Erreichung der Expression von Peptiden an den primären Eintrittspunkten
für zahlreiche
Infektionen; d.h. Haut und Schleimhaut.
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Weiters
scheint es, dass intramuskuläre
Injektionen von Polynucleotiden aufgrund der Freisetzung von jeglichem
kodierten Protein durch Target-Muskelzellen zur Bildung sowohl von
Antikörpern als
auch zytotoxischen T-Zellen im Gewebe führt. Hingegen induziert die
Injektion von Protein (z.B. in einem Impfschema) üblicherweise
keine zytotoxische T-Zellbildung, da exogene Proteine nicht effizient
in den Klasse-I-Processingstoffwechselweg
eintreten.
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In
der PCT-Anmeldung WO 90/11092 (oben erläutert) schlagen die Erfinder
vor, dass die Injektion von nackter DNA in Skelettmuskel oder andere
somatischen Gewebe zu direkter Genexpression im Zytoplasma der injizierten
Zellen führt.
Die Erfin der schlagen weiters vor, dass das kodierte Protein anschließend in
den Klasse-I-Processingstoffwechselweg
eintreten, um zytotoxische T-Zellbildung zu induzieren (die für die Kontrolle
entwickelter Virusinfektionen und Krebsarten erforderlich ist).
Wie zuvor bereits erläutert,
scheint es jedoch, dass anstelle dessen jegliche Somazelle, die
Antigen exprimiert, zuerst das Antigen in den extrazellulären Raum
zur Aufnahme durch Antigen-präsentierende
Zellen freisetzen muss, bevor eine eingeschränkte zytotoxische Klasse-I-T-Zellantwort
auf das Antigen induziert werden kann. Diese Schlussfolgerung wird
durch jüngste Forschungsarbeiten
in Bezug auf Antigen-Präsentation
untermauert, im Rahmen derer die Beobachtung gemacht wurde, dass
das Primen einer Immunantwort gegen eingeschränktes Klasse-I-Antigen, das ausschließlich in
nicht-blutbildenden Zellen exprimiert wird, den Transfer dieses
Antigens vor seiner Präsentation
zu einer aus Wirtknochenmark abgeleiteten Zelle umfasst. Die Autoren
schlossen daraus, dass "professionelle" Antigen-präsentierende
Zellen (d.h. jene, deren erstrangiger Zweck Antigen-Präsentation
ist) zur Induktion der eingeschränkten
zytotoxischen Klasse-I-MHC-T-Lymphozyten ("CTLs"),
die für
die Behandlung von Tumoren in Krebserkrankungen notwendig sind,
erforderlich waren (Huang et al., Science 264, 961-965 (1994)).
Somit ist zumindest eine Voraussetzung, auf der das Verfahren zum
Einführen
von genetischem Material in Muskelzellen für Proteinexpression der PCT-Anmeldung
WO 90/11092 basierte, möglicherweise
nicht zutreffend.
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Die
Verwendung von intramuskulären
Injektionen kann jedoch relativ hohe Konzentrationen an Proteinexpression,
systemisch betrachtet vor dem Abbau des injizierten Gens, erzielen.
Während
diese Reaktion in Therapien wünschenswert
ist, in denen Proteinersetzung das Ziel ist, kann sie in Immunisierungsprotokollen
zu unerwünschten
Toxizitäten
führen,
in denen relativ rasche Clearance oder geringere Expressionsniveaus
optimal sind. Folglich wäre
das Einführen
des Gens in Gewebe, die regelmäßig abschuppen
oder sich neu bilden (wie Haut z.B.) und/oder in Zellen mit einer
relativ hohen Abnützungsrate
in vivo (wie Antigen-präsentierende
Zellen z.B.) ein nützlicherer
Weg für
Genimmunisierung.
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Hinsichtlich
Zufuhrsysteme für
Gene bringen Mittel wie Virusvektoren, die das Gen in das Wirtsgenom
einführen,
potenzielle Gesundheitsrisiken in Verbindung mit Schädigungen
des genetischen Materials in der Wirtszelle mit sich. Die Verwendung
kationischer Liposomen oder einer biolistischen Vorrichtung (d.h.
einer Vakzinen-"Kanone", die an Perlen gebundene
Polynucleotide in Gewebe "schießen") zur Zufuhr von
Genen in vivo ist intensiv in der Vorbereitung und erfordert auch
gewisses Experimentieren, um geeignete Partikelgrößen für die Transmission
in Targetzellen auszuwählen.
Weiters bringen jegliche invasiven Mittel zum Einführen von
Nucleotiden (z.B. Injektion) die Probleme von Gewebetraumata (insbesondere
bei Langzeittherapien) mit sich und haben auch nur eingeschränkten Zugang
zu bestimmten Targetgeweben wie beispielsweise Organen.
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Mittel
für nichtinvasive
Zufuhr pharmazeutischer Präparate
von Peptiden, wie Iontophorese und andere Mittel zur transdermalen
Transmission, haben zumindest den Vorteil, das Problem des Gewebetraumas
zu minimieren. Dennoch wird angenommen, dass die Bioverfügbarkeit
von Peptiden nach transdermaler oder mukosaler Transmission durch die
relativ hohe Konzentration von Proteasen in diesen Geweben eingeschränkt ist.
Leider sind bis heute keine zuverlässigen Mittel zur Zufuhr von
Peptiden (wie von Tumor-assoziierten Antigenen) durch transdermale
oder mukosale Transmission von Genen, die für diese kodieren, verfügbar.
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Die
möglichen
Vorteile einer erfolgreichen Verabreichung von Peptiden über In-vivo-Expression nackter
Polynucleotide kann durch einen Vergleich mit dem aktuellen Entwicklungsstand
der Allergenimmuntherapie veranschaulicht werden, worin einem Patienten
sogenannte "Tumorantigene" verabreicht werden,
um Krebs zu behandeln.
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Herkömmliche
Krebsimmuntherapieverfahren konnten bisher im Allgemeinen noch keine CTL-Antwort
induzieren, die ausreichend gewesen wäre, um die Genesung von einer
Malignität
zu bewirken. Die meisten solcher Ansätze umfassten Injektion in
den Patienten von getöteten,
chemisch modifizierten Krebszellen in Adjuvans (siehe Quan et al., Cancer
Treat. Res. 65, 257-277 (1993)). Was ein Problem darstellt, ist,
dass die exogenen Proteinantigene, die in solchen Zellen vorhanden
sind, durch Antigen-präsentierende
Zellen aufgenommen werden und somit in lysosomale Vesikel eintreten,
sodass auf Proteinantigen basierende Krebsvakzinen eingeschränkte Klasse-I-Immunantworten
nicht induzieren können.
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Ein
anderes zentrales Problem für
die Entwicklung eines wirksamen Verfahrens für Proteinvakzinen basierte
Krebsimmuntherapie liegt im mangelhaften Wissen über die Identifikation von "echten Tumorantigenen", d.h. von Antigenen,
die nur mit Zellen eines Tumors und keinen anderen Zellen assoziiert sind.
Bis heute wurden keine solche echten Tumorantigene identifiziert.
Jene, die angeblich am ehesten Tumorantigene sind, sind entweder
embryonale Proteine, die durch transformierte Zellen neuerlich exprimiert
wurden, oder Autoantigene, die nicht wirklich tumorspezifisch sind.
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Jüngste Versuche
zur Krebsimmuntherapie versuchten, Expression von immunstimulierenden Cytokin-Kodiergenen
in Krebszellen zu stimulieren. Für
das Einführen
von Cytokingenen in Krebszellen wurde jedoch gezeigt, dass es zwar
ihre Fähigkeit
erhöhte,
sekundäre
Immunantworten zu stimulieren, dass es jedoch nicht die anfängliche
Funktion von Antigen-Processing und -Präsentation ersetzen konnte,
die durch professionelle, Antigen-präsentierende Zellen ausgeführt wurde.
Somit war, außer
bei einer geringen Zahl an Patienten, die an malignem Melanom erkrankt
waren, Cytokin-basierte Immuntherapie bei der Erzielung einer wirksamen
Behandlung von Malignitäten
nicht erfolgreich (siehe z.B. Pandoll, Curr. Opin. Immunol. 5, 719-725
(1993)).
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CTLs,
die sich als eingeschränkte
Klasse-I-Lymphozyten entwickelt haben, lysieren Targetzellen, die "Fremd"-Peptide, gebunden
an ihre Klasse-I-MHC-Moleküle,
exprimieren. Die primäre
Funktion von Klasse-I-MHC-Molekülen
ist offensichtlich, als Kanäle
für das
Display endogener Proteine an der Oberfläche von APCs als Peptid/MHC-Liganden
für geeignete
T-Zellrezeptoren zu wirken. Das Display endogener Peptid/MHC-Komplexe
an Zelloberflächen
ist für
Targeting lytischer Aktivität
von CTLs, spezifisch auf Zellen, die neue intrazelluläre Proteine nach
Virusinfektion oder kanzerogener Transformation von Zellen synthetisieren,
sowie für
das Deletieren von selbstreaktiven T-Zellen im Thymus essenziell (siehe
z.B. Shastri & Gonzalez,
J.
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Immunol.
150, 2724-2736 (1993)). Wie jedoch bereits an anderer Stelle hierin
erwähnt,
lassen jüngste
Erkenntnisse darauf schließen,
dass primäre T-Lymphozyten-Immunantworten nur
durch professionelle Artigen-präsentierende
Zellen induziert werden können.
Weiters erfordert die Bildung einer eingeschränkten zytotoxischen Klasse-I-T-Lymphozytenantwort üblicherweise,
dass das Antigen im Zytoplasma einer Zelle, d.h. von einer Antigen-präsentierenden
Zelle, exprimiert wird (Huang et al., s.o., S. 964). Solche intrazelluläre Expression
und Antigen-Präsentation
wird durch extrazelluläre
Verabreichung eines Tumor-assoziierten Antigens an einen Wirt nicht
wirksam erreicht (wie im Verfahren, das von Quan et al., s.o., beschrieben
wird) und würde auch
nicht durch Einführen
eines Tumor-assoziierten, Antigen-kodierenden Polynucleotids in
Gewebezellen, wie z.B. Muskelzellen, wirksam erreicht werden (wie
beispielsweise im Verfahren, das von Felgner et al., Science, s.o.,
und in der PCT-Anmeldung WO 90/11092 vorgestellt wird).
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Ein
anderes Problem bei Krebsimmuntherapie, die auf Immunisierung des
Wirts gegenüber
Tumor-assoziierten Antigenen beruhl, ist die Toleranz des Immunsystems
des Wirts gegenüber
solchen Antigenen. Jüngste
Versuche schlugen vor, dass T-Lymphozyten-Immuntoleranz
gegenüber
einen Selbstantigen durch Immunisieren des Wirts mit einem Gemisch
aus Selbstantigenen und fremden molekularen Mimetika solcher Antigene
gebrochen werden kann (Mamula et al., J. Immunol. 152, 1453-1460 (1994)). Solche
Gemische induzieren jedoch keine eingeschränkten Klasse-I-CTL-Antworten im
Wirt, da die Antigene extrazelluläre, und nicht im Zytoplasma von
APCs, exprimiert werden.
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Es
besteht daher Bedarf an einem Verfahren zur Behandlung von Krebs,
das die Entwicklung von Tumor-assoziierten, Antigen-spezifischen
eingeschränkten
Klasse-I-CTLs induziert.
Auch weisen diese Erkenntnisse auf einen Bedarf an einem Mittel zum
Einführen
eines Gens, das für
ein biologisch aktives Peptid kodiert, in einen Wirt auf gewebespezifische
Weise ohne signifikantes Gewebetrauma hin.
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Die
vorliegende Erfindung beschäftigt
sich mit all diesen Anforderungen.
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Die
Erfindung stellt die Verwendung eines nackten Polynucleotids, das
operativ für
ein therapeutisch wirksames, Tumor-assoziiertes Antigen kodiert,
das Klasse-I-MHC-Moleküle an Antigen-präsentierende
Zellen bindet, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung
eines Tumors in einem Wirt bereit, worin
das nackte Polynucleotid
an die Haut des Wirts verabreicht wird;
die Haut eine hohe
Konzentration an darin enthaltenen Antigen-präsentierenden Zellen im Vergleich
zu anderen Wirtsgeweben aufweist;
das Tumor-assoziierte Antigen
in den Antigen-präsentierenden
Zellen ohne nennenswerte Sekretion daraus exprimiert wird; und
die
Zufuhr des Tumor-assoziierten Antigens im Wirt eine Th1-Antwort
bevorzugt gegenüber
einer Th2-Antwort induziert.
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Die
Details der bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung sind in den beiliegenden Zeichnungen
und der nachstehenden Beschreibung erläutert. Sind die Details der
Erfindung bekannt, so ergeben sich für Fachleute zahlreiche zusätzliche
Neuerungen und Änderungen.
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DEFINITIONEN
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Die
folgenden Definitionen werden bereitgestellt, um die Erläuterung
der Erfindung zu vereinfachen. Fachleute werden jedoch erkennen,
dass diese Definitionen auf Äquivalente
erweitert werden können,
ohne vom begründeten
Schutzumfang oder von der grundlegenden Idee der Erfindung abzuweichen.
- a. "Nackte(s)
Polynucleotid(e)" bezieht
sich auf DNA oder RNA und kann, je nach Eignung für den jeweiligen
Zweck der Therapie, die gemäß der Erfindung
praktiziert wird, Sense- und Antisense-Stränge umfassen. Polynucleotid
in diesem Zusammenhang kann Oligonucleotide umfassen. Nackt in diesem
Zusammenhang beschreibt Polynucleotide, die nicht mit kolloidalen
Materialien (einschließlich
liposomaler Präparate)
Komplexe bilden und nicht in einem Vektor enthalten sind, der die
Integration des Polynucleotids in das Wirtsgenom verursachen würde.
- b. "Operativ
kodierend" bezieht
sich auf ein Polynucleotid, das modifiziert wurde, um Promotor- und
andere Sequenzen, die für
Expression und, sofern erwünscht,
Sekretion des erwünschten Translationsprodukts,
z.B. eines Peptids oder Proteins, erforderlich sind, zu umfassen.
Alle Ausführungsformen
der Erfindung können
unter Verwendung bekannter Plasmidexpressionsvektoren praktiziert
werden. Vorzugsweise umfassen diese Vektoren cDNA(s), die für das erwünschte Translationsprodukt
kodiert/kodieren. Daher wird, außer der Kontext erfordert es
anders, angenommen, dass sich "Polynucleotid" oder "nacktes Polynucleotid" auf operativ kodierende
Sequenzen bezieht, die in einem geeigneten Plasmidexpressionsvektor
enthalten sind, wofür
hierin Beispiele bereitgestellt werden.
- c. "Polynucleotidgemisch" soll sich auf mehr
als eine und bis zu 200 Polynucleotidspezies beziehen, die unter
der Steuerung desselben Promotors stehen.
- d. "Synthese" bezieht sich auf
durchwegs bekannte Mittel zum Synthetisieren von Polynucleotidsequenzen
und kann das Isolieren und Reinigen nativer Polynucleotide umfassen.
- e. "Peptid" bezieht sich auf
kleine Peptide, Polypeptide, Oligopeptide und Proteine, die in vivo eine
erwünschte
biologische Wirkung zeigen.
- f. "Iontophorese" bezieht sich auf
ein bekanntes Mittel transdermaler Transmission, das zur Zeit verwendet
wird, um Peptide auf kontinuierliche Weise einem Wirt zuzuführen. Insbesondere
ist dies ein Verfahren, das den Transport ionischer Spezies durch
Anlegen eines physiologisch annehmbaren elektrischen Stroms erleichtert.
Dieses Verfahren und andere transdermale Transmissionsmittel werden
in Chien et al., Transdermal Drug Delivery, "Novel Drug Delivery Systems", K. 7, Teil C, Marcel
Dekker (1992), beschrieben, wovon die relevanten Offenbarungen durch
diesen Verweis zum Zwecke der Veranschaulichung des Standes der
Technik bezüglich Verfahren
zur Wirkstoffzufuhr hierin aufgenommen sind.
- g. "Detergenzien/Absorptionspromotoren" beziehen sich auf
chemische Mittel, die zur Zeit auf dem Gebiet der Erfindung dafür bekannt
sind, Absorption und Transfektion bestimmter kleiner Moleküle sowie
Peptide zu erleichtern.
- h. "Antigen-präsentierende
Zellen" oder "APCs" umfassen bekannte
APCs wie Langerhanssche Zellen, verschleierte Zellen afferenter
Lymphgefäße, dendritische
Zellen und ineinander verzahnte Zellen aus Lymphorganen. Die Definition
umfasst auch einkernige Zellen wie (1) Lymphozyten und Makrophagen,
die Polynucleotide gemäß der Erfindung
in Haut aufnehmen und exprimieren, und (2) einkernige Zellen, die
in hierin enthaltenen, histologischen Aufnahmen dargestellt werden. Diese
Zellen sind keine Gewebezellen, sind jedoch wahrscheinlich Antigen-präsentierende
Zellen. Die Wichtigsten unter diesen in Hinblick auf die vorliegende
Erfindung sind jene APCs, die dafür bekannt sind, in mit Epithel
und Thymus zusammenhängenden
Bereichen der Lymphgewebe zahlreich vorhanden zu sein, einschließlich Epidermis
und Schleimhaut-Plattenepithel der Mundschleimhaut, Vagina, Zervix
und Speiseröhre
(Bereiche mit "relativ
hohen" Konzentrationen an
APCs). Zusätzlich
zu ihren nachstehend bereitgestellten Definitionen beziehen sich
daher "Haut" und "Schleimhaut", wie hierin verwendet, insbesondere
auf diese Stellen hoher Konzentration von APCs. Darüber hinaus
sollen sich "professionelle
APCs" auf Zellen
beziehen, deren primärer
Zweck Antigen-Präsentation
ist; d.h. aus Knochenmark stammende Zellen.
- i. "Wirt" bezieht sich auf
den Rezipienten der Therapie, die gemäß der Erfindung durchzuführen ist. Der
Wirt kann jedes beliebige Wirbeltier sein, ist jedoch vorzugsweise
ein Säugetier.
Ist er ein Säugetier,
so ist der Wirt vorzugsweise ein Mensch, kann jedoch auch ein Nutztier
oder Haustier sein.
- j. "Zielgewebe" bezieht sich auf
das Gewebe des Wirts, in dem Expression des nackten Polynucleotids
angestrebt wird.
- k. "Haut" wie hierin verwendet
bezieht sich auf die epidermalen, dermalen und subkutanen Gewebe eines
Wirts.
- l. "Schleimhaut" bezieht sich auf
Schleimhautgewebe eines Wirts, unabhängig davon, wo im Körper sie
angeordnet sind, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, Atemwege (einschließlich Bronchialwege,
Lungenepithel und Nasenepithel), Genitalwege (einschließlich Vaginal-,
penile und Analschleimhaut), Harnwege (z.B. Harnröhre, Blase),
Mund, Augen und Stimmbänder.
- m. "Eintrittspunkt" bezieht sich auf
die Stelle, an der das nackte Polynucleotid in einen Wirt eingeführt wird,
einschließlich
unmittelbar benachbarter Gewebe.
- n. "Dermale" und "Epidermale Verabreichung" bezeichnet Wege
der Verabreichung, bei denen das/die nackte(n) Polynucleotid(e)
auf die Haut aufgetragen oder durch die Haut verabreicht wird/werden.
Dermale Verabreichung umfasst intradermale und subkutane Injektionen
sowie transdermale Transmission. Epidermale Verabreichung umfasst
jegliches Mittel zur Reizung der äußersten Hautschichten, die
ausreichend ist, um eine Immunantwort auf den Reizstoff hervorzurufen.
Der Reizstoff kann ein mechanischer oder chemischer (vorzugsweise
topischer) Stoff sein.
- o. "Epitheliale
Verabreichung" umfasst
im Wesentlichen dasselbe Verfahren wie chemische epidermale Verabreichung,
außer
dass der chemische Reizstoff auf Schleimhautepithel aufgetragen
wird.
- p. "IL" bezieht sich auf
Interleukin.
- q. "TH1-Antwort(en)" bezieht sich auf
eine zelluläre
Immunantwort, die vorzugsweise durch Antigene induziert wird, die
sich an bestimmte APCs, d.h. Makrophagen und dendritische Zellen,
binden und diese aktivieren.
- r. "Biologisch
aktive(s) Peptid(e)" bezieht
sich auf ein Peptid, das, wenn es einem Wirt verabreicht wird, einen
therapeutischen Nutzen bewirkt oder in ihm eine Immunantwort induziert.
- s. "Aktivierender
Ligand" bezieht
sich auf einen Liganden, der, wenn er an einen Kernrezeptor gebunden
ist, Aktivität
an dem Teil des Rezeptors induziert.
- t. "Tumor-assoziierte(s)
Antigen(e)" bezieht
sich auf embryonale Proteine, die durch transformierte Zellen oder
Autoantigene neuerlich exprimiert wurden, die nicht wirklich tumorspezifisch
sind, jedoch in Säugetier-Tumorgewebe
vorhanden sind.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung besteht in der Verwendung eines nackten Polynucleotids,
das operativ für
ein therapeutisch wirksames, Tumor-assoziiertes Antigen kodiert,
das Klasse-I-MHC-Moleküle an Antigen-präsentierenden
Zellen bindet, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung
eines Tumors in einem Wirt, worin
das nackte Polynucleotid
an die Haut des Wirts verabreicht wird;
die Haut eine hohe
Konzentration an darin enthaltenen, Antigen-präsentierenden Zellen im Vergleich
zu anderen Wirtgeweben aufweist;
das Tumor-assoziierte Antigen
in den Antigen-präsentierenden
Zellen ohne nennenswerte Sekretion daraus exprimiert wird; und
die
Zufuhr des Tumor-assoziierten Antigens im Wirt eine Th1-Antwort
bevorzugt gegenüber
einer Th2-Antwort induziert.
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Das
nackte Polynucleotid wird vorzugsweise an die Haut verabreicht,
die im Vergleich zu anderen Geweben des Körpers eine relativ hohe Konzentration
an Antigen-präsentierenden
Zellen enthält.
Auch wenn nicht beabsichtigt wird, dass die gesamte Erfindung auf
eine bestimmte Theorie bezüglich
der eingebundenen Expressionsmechanismen eingeschränkt ist,
wird angenommen, dass eine biologische Antwort in der Haut nach
Verabreichung des nackten Polynucleotids erreicht wird, da das Polynucleotid
intrazellulär
im Zytoplasma einkerniger Zellen, am wahrscheinlichsten Antigen-präsentierender
Zellen des Wirts, exprimiert wird. Auch wird angenommen, dass die
einkernigen Zellen in eine Entzündungsimmunantwort
auf das nackte Polynucleotid eingebunden sein können, sobald die Zellen in
das Lymphsystem migriert sind und das exprimierte Peptid als Antigen
aufweisen.
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Auf
Grundlage histologischer Studien scheinen die nackten Polynucleotide
nicht direkt von Fibroblasten oder anderen Gewebezellen in signifikanten
Mengen aufgenommen zu werden (siehe Beispiel IV und 6).
Diese Schlussfolgerung beruht auf Studien, die zeigen, dass (1)
intradermale Verabreichung von sogar geringen Mengen an nackten
Polynucleotiden in Mäuse
eine maßgebende
TH1-Antwort induzierte (was ein Hinweis auf Antigen-Präsentation
durch Makrophagen und dendritische Zellen ist; siehe Beispiel XI
und die 13-14); (2)
intradermale Verabreichung nackter Polynucleotide an Mäuse die
Bildung von zytotoxischen T-Zellen induzierte, ohne die Bildung
nachweisbarer Konzentrationen an Antikörper zu stimulieren (siehe
Beispiel IX und 11); und zeigen (3)
die Induktion von verlängertem
immunologischem Gedächtnis
hinsichtlich des Polynucleotid-Expressionsprodukts als ein Antigen
(Beispiel X und 12-13). Es
scheint daher, dass die Immunogenität nackter Polynucleotide nicht
von der Menge an dadurch exprimiertem Protein abhängt, sondern
anstelle dessen vom Typ der transfizierten Zelle (z.B. Antigen-präsentierende
Zellen gegenüber
Gewebezellen).
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In
Anbetracht der offensichtlichen Rolle von Entzündung in einem der Erfindung
zugrundeliegenden Mechanismus wird Fachleuten auch verständlich sein,
dass erhöhte
Durchlässigkeit
von Zellmembranen des Zielgewebes, das von der Entzündung betroffen
ist, die Aufnahme der nackten Polynucleotide steigern kann (insbesondere über Barrieren
wie Haut).
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Das
Zielgewebe ist Haut, worin etwa 1 % bis 2 % der Zellpopulation aus
Antigen-präsentierenden Zellen
bestehen. Dieses Gewebe ist besonders geeignet, wenn die Therapie
auf Erkrankungen abzielt, bei denen es wünschenswert ist, eine örtliche
therapeutische oder Immunantwort zu induzieren. Haut wird auch aufgrund
ihrer Regenerationsfähigkeit
bevorzugt, die die Zeitspanne reduziert, innerhalb derer eingeführte Materialien
am Eintrittspunkt verweilen.
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Da
die Antigen-präsentierenden
Zellen, die im Zielgewebe vorhanden sind, dazu dienen können, die
Expression des nackten Polynucleotids zu vermitteln, kann die Erfindung
zur Induktion systemischer Antworten auf das exprimierte Peptid
nicht so nütz lich
sein wie zur Induktion einer örtlichen
Antwort. Bei ausreichender Dosierungshöhe kann jedoch auch eine vorübergehende
systemische Wirkung induziert werden. Eine nützliche Anwendung für diesen
Aspekt der Erfindung zur Induktion systemischer Antworten auf das
exprimierte Peptid kann daher als ein Adjuvans für andere systemische Therapien
sein.
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In
einem anderen Aspekt der Erfindung dienen die APCs als Vehikel,
um das nackte Polynucleotid zu lymphatischen Organen und zu Schleimhautgeweben,
die nicht jene des Eintrittspunktes sind, zuzuführen. Diese Ausführungsform
wird durch Verweis auf die folgende Hypothese veranschaulicht; der
beschriebene Mechanismus sollte jedoch nicht als Einschränkung der
Erfindung verstanden werden.
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In
dieser Ausführungsform
wird angenommen, dass die APCs das nackte Polynucleotid am Eintrittspunkt
oder in der Nähe
dieses Punktes aufnehmen und es dann in den lymphatischen Kreislauf tragen.
Sobald sie an einem Lymphknoten angelangt ist, präsentiert
die APC das intrazellulär
exprimierte Protein als ein Antigen und stimuliert dadurch eine Immunantwort.
Von hier ausgehende können
jene APCs, die "Homing"-Rezeptoren für z.B. Schleimhaut
aufweisen, neuerlich in den lymphatischen Kreislauf eintreten, bis
sie sich in einem Zielgewebe, das nicht das Gewebe am Eintrittspunkt
ist, niederlassen. Sofern erwünscht,
können
Homing-Rezeptoren (spezifische Membranproteine, die sich an Target-Zellliganden
binden) sequenziert und in das nackte Polynucleotid inkorporiert
werden. Hinsichtlich der Expression im Lymphsystem stellt diese
Ausführungsform
durch Zuführen
von Cytokinen, um die Konzentration an spezifischen Cytokinen im
Wirt zu steigern, auch ein Mittel zur Steigerung der Reaktionsfähigkeit
des Immunsystems des Wirts bereit. Insbesondere in den lymphatischen
Organen können Steigerungen
der Konzentrationen an zirkulierenden Cytokinen in Wirten (verabreicht
gleichzeitig mit oder kurz nach Antigen-Challenge) die Immunantwort
des Wirts auf pathogene Antigene steigern und (1) als Adjuvans für Vakzinen
dienen, (2) die Immunantwort auf Selbstantigene bei Autoimmunerkrankungen senken,
oder (3) die Immunantwort auf Fremdantigene (beispielsweise nach
Gewebe- oder Organtransplantation gebildet) senken.
-
Migrieren
die APCs, die das Gen von Interesse tragen, aus Lymphknoten hinaus
und zirkulieren zu Geweben, für
die sie einen Homing-Rezeptor aufweisen, so kann das Gen an einem
zugänglichen Eintrittspunkt
zur Expression an einer weniger praktischen oder zugänglichen
Stelle verabreicht werden.
-
Eine
andere Verwendung für
die Erfindung wäre
das Mäßigen einer
Immunantwort auf ein Antigen (wie z.B. ein Tumor-assoziiertes Antigen)
durch Immunisieren des Wirts gegen das Antigen. Der Verabreichungsweg über die
Haut ist in dieser Hinsicht besonders nützlich.
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Zur
Verwendung bei Krebsimmuntherapie würde das Verfahren vorzugsweise
die folgenden Schritte umfassen:
- 1. Selektion
oder Identifikation eines Tumor-assoziierten Antigens von Interesse
und eines Polynucleotids, das für
das Antigen kodiert.
- 2. Sofern das Antigen ein Selbstantigen (im Gegensatz zu einem
Tumor-assoziierten Antigen aus einer anderen Säugetierspezies) ist, Modifikation
eines Polynucleotids, das für
das Tumor-assoziierte Antigen von Interesse kodiert zu einem Selbstantigen,
das das Selbstantigen nachahmen, jedoch nicht identisch damit sein
soll. Vorzugsweise substituiert oder deletiert die Mutation ein
einzelnes Nucleotid, das der Region des Selbstantigens entspricht,
die am stärksten
immunogen ist.
- 3. Verleihen der Fähigkeit
an das Polynucleotid, operativ zu kodieren; d.h. durch Insertion
in einen rekombinanten Expressionsvektor.
- 4. Verabreichung des operativ kodierenden Polynucleotids als
ein nacktes Polynucleotid gemäß der Erfindung.
- 5. Gegebenenfalls Co-Immunisieren des Wirts mit Protein-Tumor-assoziiertes-Antigen-Vakzinen, um
die Unterstützung
durch Helfer-T-Lymphozyten zu stimulieren, und/oder mit für Cytokin
kodierenden Polynucleotiden, um die Leistung des Wirts immunsystems
zu steigern. Da jedoch die Entwicklung von Anti-Tumor-assoziiertes-Antigen-Antikörpern mit
der Freisetzung von löslichem
Antigen einhergeht (was das Risiko mit sich bringt, CTL-Aktivität zu stören und
Immunkomplexkrankheit zu fördern),
werden bei der bevorzugten Ausführung
der Erfindung CTLs induziert, ohne Antikörperbildung zu induzieren (durch
Vermeiden der extrazellulären
Freisetzung von löslichem
Antigen).
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Ein
verwandter Aspekt des oben beschriebenen Verfahrens ist die Verwendung
in vitro oder in einem Tiermodell (vorzugsweise einem Primaten oder Nagetier),
um für
Tumor-assoziiertes Antigen kodierende Polynucleotide, die gemäß Schritt
2 mutiert sind, auf ihre Fähigkeit,
für Tumor-assoziiertes
Antigen spezifische CTLs in einem Wirt zu produzieren, zu screenen.
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Ein
anderer besonderer Vorteil der Erfindung ist, dass sie die Verabreichung
von relativ kleinen Dosen an Antigen einbindet. Insbesondere ist,
da ein Polynucleotid, das operativ für ein Antigen kodiert, anstelle
des Antigens selbst verabreicht wird, die Menge an Fremdmaterial,
das in den Wirt eingeführt wird,
relativ gesehen minimal. Darüber
hinaus erfordert die Verabreichung von nackten Polynucleotiden durch
die Haut eine geringe Konzentration an DNA, um dasselbe Ausmaß an Immunantwort
hervorzurufen, wie dies bei intramuskulärer Verabreichung der Fall
ist (z.B. etwa 10-50fach
geringer; siehe z.B. Beispiel X und die 12-13).
Folglich eignet sich die Erfindung durchwegs zur Verabreichung nackter Polynucleotide,
die für
bis zu mehreren hundert verschiedenen Antigene kodieren, zur Verwendung
als eine polyvalente Vakzine beispielsweise.
-
Die
bevorzugten Arten der Verabreichung zur Induktion lokaler Immunität in oder
nahe der Haut sind transdermale Transmission, intradermale Injektion
oder oberflächliches
Kratzen oder Reizen der äußersten
Schicht an Epidermiszellen (d.h. epidermale Verabreichung), wobei
in bestimmten Anwendungen auch subkutane Injektion nützlich sein
kann.
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Werden
die nackten Polynucleotide in die Haut eingeführt, so wird die Zufuhr des
Polynucleotids vorzugsweise, ohne Bedarf an einer Injektion, durch
die Verwendung von Detergenzien, Absorptionspromotoren, chemischen
Reizstoffen (wie keratinolytischen Mitteln) oder mechanischen Reizstoffen erleichtert.
Detergenzien und Absorptionspromotoren, die die Aufnahme kleiner
Moleküle,
die keine Gene sind, erleichtern, sind auf dem Gebiet der Erfindung
durchwegs bekannt und können,
ohne übermäßiges Experimentieren,
an die Verwendung zur Erleichterung der Aufnahme von Genen angepasst werden.
Ein anderer, im Wesentlichen nicht invasiver Ansatz zum Einführen der
nackten Polynucleotide arbeitet mit transdermaler Transmission (vorzugsweise Iontophorese),
die bereits erfolgreich zur transdermalen Transmission von Peptiden
verwendet wurde.
-
Ausführungsformen
der Erfindung umfassen das Stimulieren der Produktion von Cytokinen
und verwandten Peptiden im Blutkreislauf. Das Einführen des/der
nackten Polynucleotids/e in einen Körperbereich, der regenerativ
ist und der in der vorliegenden Erfindung die Haut ist, wird aufgrund
seiner Fähigkeit verwendet,
Zeilen, die durch mit jeder Dosierung assoziierte Traumata direkt
beeinträchtigt
sind, zu ersetzen. Sofern erwünscht,
werden, um Sekretion der zu exprimierenden Proteine sicherzustellen,
Sequenzen, die Sekretion steuern und Fachleuten bekannt sind, in
das verabreichte nackte Polynucleotid eingebunden, sofern sie nicht
bereits im Gen voller Länge vorhanden
sind. Für
die Verwendung zur Immunisierung eines Wirts gegenüber einem
Antigen wird jedoch bevorzugt, dass das Antigen nicht von APCs sekretiert
wird, in denen es exprimiert wird, sondern eher an der Zelloberfläche vorhanden
ist. Für
die Verwendung in Ausführungsformen
der Erfindung, die darauf abzielen, den Wirt gegenüber einem
Antigen zu immunisieren, stehen somit die nackten Polynucleotide
vorzugsweise unter der Steuerung von Sequenzen, die Sekretion des
exprimierten Proteins unterbinden, wobei diese Sequenzen Fachleuten
bekannt sind.
-
Die
Verwendung von Liposomen zur Zufuhr der nackten Polynucleotide der
Erfindung ist nicht Teil der vorliegenden Erfindung. Solch eine
Verwendung führt
wahrscheinlich eher zu reduzierten Expressionsniveaus. Dieses Phänomen ist
wahr scheinlich das Resultat schlechterer Erkennung eines Liposoms
als antigenes Material durch APCs.
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KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt Schnitte von Muskelgewebe, das chronische
Entzündung
(Schautafel A) und Myonekrose (Schautafel B) aufweist, nach intramuskulären Injektionen
von pREVk3 und pRSVIL-2. Schautafel C zeigt Schnitte von ähnlichem
Muskelgewebe nach subkutanen Injektionen von pREVK3 oder pRSVIL-2.
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2A zeigt
die Resultate eines ELISA für Anti-NP-IgG
in Serum nach intradermaler Injektion von nacktem pCMVRNP; 2B zeigt
die Resultate eines ELISA für
Anti-NP-IgG in Serum
nach intramuskulärer
Injektion von nacktem pCMVRNP.
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3 zeigt
die Resultate eines ELISA für Anti-NP-IgG
vor intranasaler Einführung
von nacktem pCMVRNP in Balb/c-Mäuse.
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4 zeigt
die Resultate eines ELISA für Anti-NP-IgG
in einer nicht anästhesierten
Gruppe von Balb/c-Mäusen.
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5 zeigt
die Resultate eines ELISA für Anti-NP-IgG
in einer anästhesierten
Gruppe von Balb/c-Mäusen.
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6 ist
eine Photographie der Resultate histologischer Studien von Haut
an einem Eintrittspunkt für
pCMVRNP in Balb/c-Mäusen,
die die Aufnahme des Plasmids durch einkernige Zellen (APCs) zeigt.
Eine APC ist durch einen Pfeil angezeigt; eine Gewebezelle (die
kein Plasmid enthält)
ist durch eine strichlierte Linie angezeigt.
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7 zeigt
die Resultate eines ELISA für Anti-NP-IgG
nach mechanischer epidermaler Verabreichung von nacktem pCMVRNP
an Balb/c-Mäuse.
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8 zeigt
die Resultate eines ELISA für Anti-NP-IgG
nach chemischer epidermaler Verabreichung von nacktem pCMVRNP an
Balb/c-Mäuse.
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9 enthält eine
Kaplan-Meyer-Überlebenskurve,
die die Zeitspanne darstellt, die Balb/c-Mäuse, denen intradermal nacktes pCMVRNP
verabreicht wurde, nach dem Virus-Challenge überlebten.
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10 vergleicht
in einem Diagramm NP-Genexpression nach separaten intradermalen
Injektionen von nackten Plasmiden, die entweder eine CMV- oder eine
RSV-Promotorsequenz
enthielten.
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11 zeigt die Konzentrationen zytotoxischer
T-Zellen, die in Mäusen
nach Injektion von Ovalbumin-cDNA und Ovalbumin, das durch intradermale
Injektion verabreicht wurde, nachgewiesen wurden.
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12 zeigt
die Resultate eines ELISA für Anti-Ovalbumin-Antikörper in
Seren aus den in Bezug auf 12 beschriebenen
Mäusen.
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13 zeigt
die Resultate eines ELISA für Anti-β-Galactosidase-Antikörper nach
Verabreichung (1) eines Polynucleotids, das für das Enzym kodiert, durch
intramuskuläre
oder intradermale Injektion und (2) des Enzyms durch intradermale
Injektion.
-
14 zeigt
die Resultate aus eines ELISA für
Anti-β-Galactosidase-Antikörper in
Seren aus den in Bezug auf 13 beschriebenen
Mäusen
nach einer Booster-Injektion von Antigen.
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15 zeigt
die Resultate eines ELISA für IgG-2A-Typ-Antikörper in
Seren aus Mäusen,
denen (1) intradermal oder intramuskulär ein Polynucleotid, das für β-Galactosidase
kodiert, verabreicht wurde, oder (2) das Enzym durch intradermale
Injektion verabreicht wurde.
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16 zeigt
die Resultate eines ELISA für IgG-1-Typ-Antikörper in
Seren aus Mäusen,
denen (1) intradermal oder intramuskulär ein Polynucleotid, das für β-Galactosidase
kodiert, verabreicht wurde, oder (2) das Enzym durch intradermale
Injektion verabreicht wurde.
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17 zeigt
die Resultate eines ELISA für IgG-2A-Typ-Antikörper in
Seren der in Bezug auf 25 beschriebenen Mäuse nach
einer Booster-Injektion von Antigen.
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18 zeigt
die Resultate eines ELISA für IgG-1-Typ-Antikörper in
Seren der in Bezug auf 24 beschriebenen Mäuse nach
einer Booster-Injektion von Antigen.
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19 zeigt
die Resultate eines ELISA für IgG-1-Typ-Antikörper in
Seren aus Mäusen,
die (1) durch Kratzen der Haut mit Zinken, die mit einem für β-Galactosidase
kodierenden Polynucleotid beschichtet waren, eingeführt wurden,
oder (2) in die das Enzym durch intradermale Injektion eingeführt wurde.
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20 zeigt
die Resultate eines ELISA für IgG-2A-Typ-Antikörper in
Seren aus Mäusen,
die (1) durch Kratzen der Haut mit Zinken, die mit einem für β-Galactosidase
kodierenden Polynucleotid beschichtet waren, eingeführt wurden,
oder (2) in die das Enzym durch intradermale Injektion eingeführt wurde.
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21 ist
eine Karte des eukaryotischen pGREtk-Expressionsvektors.
-
22 ist
eine Karte des eukaryotischen pVDRtk-Expressionsvektors.
-
23 zeigt
die Resultate eines ELISA für die
Konzentrationen von IL-2 und INFγ nach
Immunisierung von Mäusen
mit einem für
Antigen kodierenden Plasmid (pCMV-Lac-Z) oder dem Antigen selbst (β-Galactosidase).
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24 zeigt
die Resultate eines Tests zur Detektion von Antigen-spezifischer
Zelllyse durch T-Lymphozyten aus Mäusen, die durch epidermale Verabreichung
von pCMV-NP-Plasmid immunisiert wurden.
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25 zeigt
die Resultate eines Tests zur Detektion von Antigen-spezifischer
Zelllyse durch T-Lymphozyten aus Mäusen, die in 24 beschrieben
wurden, ohne Pulsen der Zellen mit dem Antigen.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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1. EINFÜHRUNG NACKTER
POLYNUCLEOTIDE IN ZIELGEWEBE, DIE WESENTLICHE KONZENTRATIONEN AN
ANTIGEN-PRÄSENTIERENDEN
ZELLEN AUFWEISEN
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A. Herstellung nackter
Polynucleotide
-
Die
in der Erfindung zu verwendenden Polynucleotide können DNA
oder RNA sein, sind jedoch vorzugsweise eine komplementäre DNA-(cDNA-)Sequenz.
Die in der Erfindung verwendeten Polynucleotidsequenzen müssen (a)
exprimierbar und (b) entweder nicht-replizierend oder durch Mittel,
die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, gentechnisch verändert sein,
sodass sie nicht in das Wirtsgenom replizieren. Nun folgen Veranschaulichungen der
Herstellung von Polynucleotiden, die zur Verwendung in der Erfindung
geeignet sind, und spezifische Beispiele, die zeigen, wie bestimmte
Polynucleotidzusammensetzungen hergestellt wurden, werden nachstehend
bereitgestellt. Fachleuten ist jedoch klar, dass auch andere bekannte
Mittel zur Herstellung nichtreplizierender Polynucleotide geeignet
sein können.
-
Polynucleotide
zur Verwendung in der Erfindung können unter Anwendung von auf
dem Gebiet der Erfindung bekannten Hybridisierungsverfahren gewonnen
werden. DNA und RNA können
auch unter Verwendung automatisierter Nucleinsäuresynthesevorrichtungen, die
auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt sind, synthetisiert
werden. Die Verwendung der bekannten Polymerasekettenreaktion (PCR)
wird zur Herstellung von Polynucleotidgemischen besonders bevorzugt.
Genomische Nucleinsäure
kann durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Mittel, wie beispielsweise
unter Einsatz der in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular
Biology, Kap. 2 und 4, Wiley Interscience (1989), beschriebenen
Arbeitsvorschriften, hergestellt werden. cDNA kann gemäß nach dem
Stand der Technik bekannten Mitteln synthetisiert werden (siehe
z.B. Maniatis et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Lab, New York (1982)). Eine cDNA-Expressionsbibliothek, die
Polynucleotide von Interesse enthält, kann auch durch Mittel,
die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, gescreent werden.
Bezug genommen kann hierzu auf die Beispiele für solche Mittel, die in der
nachstehenden Erläuterung
veranschaulicht werden.
-
Polynucleotide
zur Verwendung in der vorliegenden Anwendung sind in der vorangehenden
Zusammenfassung der Erfindung angegeben.
-
Wie
hierin verwendet bezieht sich "Polynucleotid" auf ein Polymer
von Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden in Form eines separaten
Fragments oder als eine Komponente eines größeren Konstrukts. DNA, die
für ein
therapeutisches und/oder immunogenes Peptid der Erfindung kodiert, kann
aus DNA-Fragmenten oder aus Oligonucleotiden assembliert werden,
die ein synthetisches Gen liefern, das in der Lage ist, in einer
rekombinanten Transkriptionseinheit exprimiert zu werden. Polynucleotidsequenzen
der Erfindung umfassen DNA-, RNA- und cDNA-Sequenzen. Eine Polynucleotidsequenz
kann aus dem genetischen Code abgeleitet werden, wobei jedoch die
Degeneration des Codes in Betracht gezogen werden muss. Polynucleotide
der Erfindung umfassen Sequenzen, die als ein Resultat des genetischen
Codes degeneriert sind, worin die Sequenzen von Fachleuten leicht
bestimmt werden können.
-
Polynucleotidsequenzen,
die für
das Peptid kodieren, können
entweder in Eukaryoten oder in Prokaryoten exprimiert werden. Wirte
können
Mikroben-, Hefe-, Insekten- und
Säugetierorganismen
umfassen. Verfahren zur Expression von DNA-Sequenzen mit eukaryotischen
oder viralen Sequenzen in Prokaryoten sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs
bekannt. Biologisch funktionelle Virus- und Plasmid-DNA-Vek toren,
die zur Expression und Replikation in einem Wirt in der Lage sind,
sind ebenfalls auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Solche Vektoren
werden verwendet, um DNA der Erfindung aufzunehmen.
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DNA-Sequenzen
zur Verwendung bei der Herstellung von Peptiden der Erfindung können auch durch
mehrere Verfahren gewonnen werden. Die DNA kann beispielsweise unter
Verwendung von Hybridisierungsverfahren isoliert werden, die auf
dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Diese umfassen, sind jedoch
nicht beschränkt
auf: 1) Hybridisierung von Sonden an genomische oder cDNA-Bibliotheken,
um gemeinsame Nucleotidsequenzen nachzuweisen; 2) Antikörper-Screening
von Expressionsbibliotheken, um gemeinsame strukturelle Eigenschaften
nachzuweisen; und 3) Synthese durch Polymerasekettenreaktion (PCR).
Die Entwicklung von spezifischen kodierenden DNA-Sequenzen oder
Fragmenten davon kann auch durch: 1) Isolieren von doppelsträngigen DNA-Sequenzen
aus der genomischen DNA; 2) chemische Herstellung einer DNA-Sequenz, um
die erforderlichen Codons für
das Polypeptid von Interesse bereitzustellen; und 3) In-vitro-Synthese
einer doppelsträngigen
DNA-Sequenz durch
reverse Transkription von mRNA, die aus einer eukaryotischen Donorzelle
isoliert ist, erreicht werden. Im letztgenannten Fall wird schließlich ein
doppelsträngiges DNA-Komplement
von mRNA gebildet, das im Allgemeinen als cDNA bezeichnet wird.
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Hybridisierungsverfahren
sind zum Screenen rekombinanter Klone unter Verwendung markierter
gemischter synthetischer Oligonucleotidsonden nützlich, worin jede Sonde potenziell
das vollständige Komplement
einer spezifischen DNA-Sequenz in der Hybridisierungsprobe ist,
die ein heterologes Gemisch von denaturierter doppelsträngiger DNA
umfasst. Für
solches Screenen erfolgt Hybridisierung vorzugsweise entweder an
einzelsträngiger
DNA oder denaturierter doppelsträngiger
DNA. Hybridisierung ist besonders zur Detektion von cDNA-Klonen nützlich,
die aus Quellen stammen, in denen eine äußerst geringe Menge an mRNA-Sequenzen,
die mit dem Polypeptid von Interesse zusammenhängen, vorhanden ist. In anderen
Worten ist es durch die Verwendung stringenter Hybridisierungsbedingungen,
die darauf abzielen, nichtspezifische Bindung zu vermeiden, möglich, beispielsweise
die autoradiogra phische Sichtbarmachung eines spezifischen cDNA-Klons
durch die Hybridisierung der Target-DNA an jene einzelne Probe im
Gemisch zu ermöglichen.
-
Eine
cDNA-Bibliothek, von der angenommen wird, dass sie ein Polynucleotid
von Interesse enthält, kann
durch Injizieren verschiedener mRNA, die aus cDNAs stammt, in Eizellen,
wodurch ausreichend Zeit zur Verfügung gestellt wird, dass Expression
der cDNA-Genprodukte eintreten kann, und Testen auf die Gegenwart
des erwünschten
cDNA-Expressionsprodukts, beispielsweise unter Verwendung von Antikörper, der
für ein
Peptid spezifisch ist, für
das das Polynucleotid von Interesse kodiert, oder unter Verwendung
von Sonden für
die Wiederholungsmotive und ein Gewebeexpressionsmuster, das für ein Peptid
charakteristisch ist, für
das das Polynucleotid von Interesse kodiert, gescreent werden. Alternativ
dazu kann eine cDNA-Bibliothek
indirekt auf Expression der therapeutischen und/oder immunogenen
Peptide, die zumindest ein Epitop aufweisen, unter Verwendung von
Antikörpern,
die für
die Peptide spezifisch sind, gescreent werden. Solche Antikörper können entweder
polyklonal oder monoklonal abgeleitet werden und verwendet werden,
um Expressionsprodukt nachzuweisen, das auf die Gegenwart der cDNA von
Interesse hinweist.
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Screening-Verfahren,
die auf Nucleinsäurehybridisierung
beruhen, ermöglichen
es, jegliche Gensequenz aus jeglichem Organismus zu isolieren, vorausgesetzt,
die geeignete Sonde ist verfügbar. Oligonucleotidsonden,
die einem Teil der Sequenz entsprechen, die für das betreffende Protein kodiert, können chemisch
synthetisiert werden. Dies erfordert, dass kurze Oligonucleotidabschnitte
von Aminosäuresequenz
bekannt sein müssen.
Die für
das Protein kodierende DNA-Sequenz kann aus dem genetischen Code
abgeleitet werden, wobei jedoch die Degeneration des Codes berücksichtigt
werden muss. Es ist möglich,
eine gemischte Additionsreaktion durchzuführen, wenn die Sequenz degeneriert ist.
Dies induziert ein heterogenes Gemisch von denaturierter doppelsträngiger DNA.
Für solches Screening
erfolgt Hybridisierung vorzugsweise entweder an einzelsträngiger DNA
oder denaturierter doppelsträngiger
DNA.
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Die
nackten Polynucleotide können
an andere Polynucleotide konjugiert werden oder in Verbindung mit
anderen Polynucleotiden verwendet werden, die operativ für Regulationsproteine
kodieren, die die Expression dieser Polypeptide steuern oder Erkennungs-,
Promotor- und Sekretionssequenzen enthalten können. Fachleute sind in der
Lage, Regulationspolynucleotide ohne übermäßiges Experimentieren zu selektieren
und sie in die nackten Polynucleotide der Erfindung (sofern sie
darin nicht schon vorhanden sind) zu inkorporieren. Geeignete Promotoren
zur Verwendung in murinen oder menschlichen Systemen und ihre Verwendung
werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology,
s.o., Kap. 1, beschrieben.
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Eine
besonders bevorzugte Form eines nackten Polynucleotids zur Verwendung
in der Erfindung ist eine, die in einen Plasmidvektor inkorporiert wurde.
Die Verwendung eines Plasmidvektors, insbesondere eines, der einen
Replikator umfasst, verlängert
die Expression des Gens in Targetgeweben. Bestimmte Plasmidvektoren
sind auch gute Vermittler von Immunantworten auf immunogene Peptide, da
hohe Expressionsniveaus erzielt werden, wenn das für die Peptide
kodierende Gen in den Vektor inkorporiert ist.
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Geeignete
Plasmidvektoren sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt
und umfassen die in Current Protocols in Molecular Biology, s.o.,
Kap. 1, beschriebenen Vektoren. Zwei besonders bevorzugte Plasmidvektoren
sind die pRSV-(Rous-Sarkom-Virus-)
und pCMV-(Zytomegalie-Virus-)Promotorvektoren. Von diesen Promotoren wird
CMV für
Polynucleotide, die es in Gewebe, die nicht Muskel sind, einzuführen gilt,
bevorzugt. Diese Präferenz
basiert auf Beobachtungen, dass höhere Expressionsniveaus in
diesem Zusammenhang erreicht werden, wenn der CMV-Promotor verwendet wird.
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Eine
geeignete Arbeitsvorschrift für
das Isolieren des RSV-Promotors und seine Verwendung bei der Konstruktion
eines Plasmidvektors wird in Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 79, 6777 (1982), beschrieben. Andere bevorzugte Plasmidvektoren
sind pREP7 und pREV, die im Handel bei Invitrogen aus San Diego,
Kalifornien, erhältlich sind.
Zum Klonieren von Polynucleotiden ist ein besonders geeignetes Plas mid
zur Herstellung von mRNA der pSP64T-Kloniervektor, der von Kreig
et al., Nucleic Acids Res. 12, 7057-7070 (1984), beschrieben wird.
Jegliche cDNA, die ein Initiationscodon enthält, kann in dieses Plasmid
eingeführt
werden, und mRNA kann aus den exprimierten DNA-Matrices unter Verwendung
herkömmlicher
Verfahren hergestellt werden.
-
Besonders
nützliche
Vektoren zur Verabreichung jeglichen nackten Polynucleotids gemäß der Erfindung
sind jene, die einen Promotor enthalten, der "an-" oder "ab-" geschaltet werden
kann, nachdem der Vektor dem Patienten verabreicht wurde.
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Besonders
wirksame Beispiele für
solche Promotoren sind die Liganden-induzierbaren Kernrezeptorpromotoren.
Kernrezeptoren stellen eine Familie von Transkriptionsenhancerfaktoren
dar, die durch Binden an spezifische DNA-Sequenzen, die in als Reaktionselemente
bekannten Targetpromotoren zu finden sind, wirken. Spezifische Elemente
der Kernrezeptorfamilie umfassen die primären intrazellulären Targets
für kleine,
in Lipid lösliche
Liganden, wie Vitamin D3 und Retinoide,
sowie Steroid- und Thyroidhormone ("aktivierende Liganden").
-
Kernrezeptoren,
die durch spezifische aktivierende Liganden aktiviert werden, sind
zur Verwendung als Promotoren in eukaryotischen Expressionsvektoren
gut geeignet, da Expression von Genen einfach durch Steuern der
Konzentration an Ligand, der für
den Rezeptor verfügbar
ist, reguliert werden kann. Glucocorticoid-induzierbare Promotoren
wie beispielsweise jene der langen terminalen Wiederholung des Maus-Brusttumor-Virus
(MMTV) wurden in diesem Zusammenhang umfassend verwendet, da die
Glucocorticoid-Reaktionselemente in zahlreichen verschiedenen Zelltypen
exprimiert werden. Ein Expressionssystem, das Glucocorticoid-Reaktionselemente,
die auf zahlreiche verschiedene Steroidhormone (z.B. Dexamethason
und Progesteron) reaktiv sind, nutzt, ist ein pGREtk-Plasmid (das
ein oder mehrere Ratten-Tyrosinaminotransferase-Glucocorticoid-Reaktionselemente
stromauf des Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase-(tk-)Promotors
in pBLCAT8+ enthält),
transfiziert in HeLa-Zellen (siehe Mader & White, Proc. Natl. Acad. Sci USA
90, 5603-5607 (1993) [pGRE2tk]; und Klein-Hitpass et al., Cell 46,
1053-1061 (1986) [pBLCAT8+]; deren Offenbarung durch diesen Verweis
hierin aufgenommen sind, um das Wissen auf dem Gebiet der Erfindung
bezüglich
des Einführens
geeigneter Promotoren, die aus Kernrezeptor-Reaktionselementen stammen
["NRRE-Promotoren"] zu veranschaulichen). Der
pGREtk-Promotor (siehe Karte in 20) ist
zur Stimulierung gesteuerter Überexpression
klonierter Gene in eukaryotischen Zellen besonders wirksam (Mader & White, s.o.,
5607).
-
Ein
anderer, besonders geeigneter NRRE-Promotor zur Verwendung in der
Erfindung ist einer, der durch die Vitamin-D3-Verbindung
1,25-Dihydroxyvitamin D3 und durch nicht-hyperkalzämische Analoga
davon (zusammengefasst als "Vitamin-D3-aktivierende
Liganden") induzierbar
ist. NRRE-Promotoren, die durch Vitamin-D3-aktivierende Liganden
induzierbar sind, enthalten die Vitamin-D3-Rezeptor-(VDR-)Reaktionselemente PurG(G/T)TCA,
die direkte Wiederholungen, die durch 3 Basenpaare voneinander getrennt
sind, erkennen. Vitamin-D3-Reaktionselemente
sind stromauf von menschlichen Osteocalcin- und Maus-Osteopontin-Genen
zu finden; Transkription von diesen Genen wird bei Bindung des VDR
aktiviert (siehe z.B. Morrison & Eisman,
J. Bone Miner. Res. 6, 893-899 (1991); und Ferrara et al., J. Biol.
Chem. 269, 2971-2981 (1994), deren Offenbarungen durch diesen Verweis
hierin aufgenommen sind, um das auf dem Gebiet der Erfindung vorhandene
Wissen zu Vitamin-D3-reaktiven, induzierbaren
Promotoren zu veranschaulichen). Jüngste Resultate aus Versuchen
zum Testen eines rekombinanten Expressionsvektors, der den Maus-Osteopontin-VDR
stromauf eines trunkierten Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase-(tk-)Promotors
enthält,
ließen
darauf schließen, dass
9-cis-Retinsäure
die Reaktion von VDR auf 1,25-Hydroxyvitamin D3 steigern
kann (siehe Carlberg et al., Nature 361, 657-660 (1993)).
-
Ferrara
et al. beschrieben auch Vitamin-D3-induzierbare
Promotoren in rekombinanten Expressionsvektoren, die unter Verwendung
von Mehrfachkopien eines starken VDR; insbesondere unter Verwendung
des Maus-Osteopontin-VDR (zusammengesetzt aus einer direkten Wiederholung von
PurGTTCA-Motiven, getrennt durch 3 Basenpaare); konstruiert wurden.
Dieser VDR passt sich an die PurGG/TTCA-Consensusmotive an, für die bereits
gezeigt wurde, dass sie nicht nur auf Vitamin D3 reaktiv sind,
sondern auch auf Thyroidhormon und/oder Retinsäure. Drei Kopien des Maus-VDR wurden in pBLCAT8+
insertiert; unmittelbar stromauf des Herpes-Simplex-Virus-tk-Promotors
(siehe z.B. 21 [Karte von pVDREtk]). Transfektion
des resultierenden VDREtk-Vektors in COS-Zellen (wodurch ein "VDR-Expressionssystem" gebildet wurde) erwies
sich insofern als besonders nützlich,
als dass COS-Zellen den Kernretinoid-X-Rezeptor (RXR) enthalten,
für den
gezeigt wurde, dass er als ein Hilfsfaktor für Bindung von VDR an sein Reaktionselement wirkt.
-
Das
VDR-Expressionssystem (und funktionell äquivalente Expressionssysteme
unter der Steuerung von beispielsweise menschlichem Osteocalcin-Genpromotor)
ist für
die Verwendung in der Erfindung einmalig geeignet. Insbesondere
Expression eines nackten Polynucleotids, das einem Säugetier
gemäß der Erfindung
mittels epidermaler oder dermaler Zufuhr (besonders Ersteres) in
einem Vitamin-D3-reaktiven Expressionssystem
verabreicht wird, kann durch topische Verabreichung eines 1,25-Dihydroxyvitamin-D3-Präparats
am Eintrittspunkt angeschaltet werden (und durch Entzug des Vitamin-D3-Präparats abgeschaltet
und/oder durch Zusatz oder Entzug einer Quelle von Retinsäure am oder
aus dem Eintrittspunkt moduliert werden). Praktischerweise wurden 1,25-Dihydroxyvitamin
D3 und nicht-hyperkalzämische Analoga davon von der
United States Food and Drug Administration für die Verwendung in topischen Präparaten
zur Behandlung von Psoriasis bereits genehmigt und sind im Handel
erhältlich.
-
In-vivo-Tests
der NRRE-Promotoren weisen darauf hin, dass sie bei systemischer
Aussetzung gegenüber
ihren entsprechenden Reaktionselementen induzierbar sind (siehe
Tsou et al., Exp. Cell Res. 214, 27-34). Unter Anbetracht der erwarteten
Retention von Polynucleotiden, die dermal oder epidermal am Eintrittspunkt
verabreicht werden (was sie für Aussetzung
gegenüber
topisch absorbierten Reaktionselementen verfügbar macht; siehe die Erläuterung
auf den Seiten 15-16 und die Daten aus Beispiel IV), kann in angemessener
Weise vorhergesagt werden, dass die Verwendung von NRRE-Promotoren zur
Expression solcher Polynucleotide auch ihre Invivo-Steuerung durch
topische Verabreichung geeigneter, NRRE-Promotor-aktivierender Liganden
(z.B. 1,25-Dihydroxyvitamin-D3-Transkriptionsaktivatoren mit
einem VDR-Expressionsvektor zur Expression des Polynucleotids von
Interesse) ermöglicht.
-
Somit
ermöglicht
die Verwendung eines rekombinanten NRRE-Promotor-Expressionsvektors zur
Verabreichung und Expression nackter Polynucleotide gemäß der Erfindung
die Steuerung von Expression, um beispielsweise Expression anzuschalten,
wenn Dosierung erforderlich ist, oder im Fall einer negativen Reaktion
auf das exprimierte Protein oder Peptid Expression abzuschalten.
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B. Pharmazeutische Präparate nackter
Polynucleotide
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Zusammensetzungen
nackter Polynucleotide und Gemische von Polynucleotiden können in eine
pharmazeutisch annehmbare Suspension, Lösung oder Emulsion übergeführt werden.
Geeignete Medien umfassen Kochsalzlösung.
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Insbesondere
können
pharmazeutisch annehmbare Träger
sterile wässrige
oder nichtwässrige Lösungen,
Suspensionen und Emulsionen umfassen. Beispiele für nichtwässrige Lösungsmittel
sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, Pflanzenöle wie Olivenöl und injizierbare
organische Ester wie Ethyloleat. Wässrige Träger umfassen Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen,
Emulsionen oder Suspensionen, einschließlich Kochsalzlösung und
gepufferte Medien. Parenterale Vehikel umfassen Natriumchloridlösung, Ringer-Dextrose,
Dextrose und Natriumchlorid, Ringerlaktat oder fixierte Öle. Intravenöse Vehikel
umfassen Flüssigkeit
und Nährstoffergänzungsmittel,
Elektrolytenergänzungsmittel
(wie jene, die auf Ringer-Dextrose basieren) und dergleichen. Konservierungsmittel
und andere Additive können auch
vorhanden sein, wie beispielsweise antimikrobielle Mittel, Antioxidanzien,
Chelatbildner und Inertgase und dergleichen. Weiters kann eine Zusammensetzung
nackter Polynucleotide unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung
bekannten Mitteln zur darauf folgenden Rekonstitution und Verwendung gemäß der Erfindung
lyophilisiert werden.
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Fachleuten
ist klar, dass die Vorteile der Verwendung der vorliegenden Erfindung,
nackte Polynucleotide zu verabreichen, und der Verabreichung jener
Nucleotide an Gewebe, die relativ hohe Konzentrationen an Antigen-präsentierenden
Zellen aufweisen, so beschaffen sind, dass die Verwendung kolloidaler
Dispersionssysteme zur Zufuhr von Polynucleotiden nicht im Rahmen
der vorliegenden Erfindung liegt. Die nachstehende Erläuterung
in Bezug auf solche Systeme wird daher allgemein als Bezugsmaterial
bereitgestellt.
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Kolloidale
Dispersionssysteme umfassen Makromolekülkomplexe, Nanokapseln, Mikrokügelchen,
Perlen und lipidbasierte Systeme einschließlich Öl-in-Wasser-Emulsionen, Micellen,
gemischte Micellen und Liposomen.
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Liposomen
sind künstliche
Membranvesikel, die als Zufuhrvehikel in vitro und in vivo nützlich sind. Es
wurde gezeigt, dass große
einschichtige Vesikel (LUV), die in einem Größenbereich von 0,2-4,0 μm liegen,
einen wesentlichen Prozentsatz eines wässrigen Puffers, der große Makromoleküle enthält, einkapseln
können.
RNA, DNA und intakte Virionen können
innerhalb des wässrigen
Innenraums eingekapselt und Zellen in einer biologisch aktiven Form
zugeführt
werden (Fraley et al., Trends Biochem. Sci 6, 77 (1981)). Zusätzlich zu
Säugetierzellen
wurden Liposomen auch zur Zufuhr von Polynucleotiden in Pflanzen-,
Hefe- und Bakterienzellen verwendet. Damit ein Liposom ein wirksames
Gentransfervehikel ist, sollten die folgenden Eigenschaften zutreffen:
(1) Einkapselung der Gene, die für
die Antisense-Polynucleotide kodieren, bei hoher Effizienz, während sie nicht
ihre biologische Aktivität
umfassen; (2) bevorzugte und wesentliche Bindung an eine Targetzelle im
Vergleich zu Nicht-Targetzellen; (3) Zufuhr der wässrigen
Inhalte des Vesikels zum Target-Zellzytoplasma mit hoher Effizienz;
und (4) exakte und wirksame Expression von genetischer Information
(Mannino et al., Biotechniques 6, 682 (1988)).
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Die
Zusammensetzung des Liposoms ist üblicherweise eine Kombination
von Phospholipiden, insbesondere Phospholipiden mit hoher Phasenübergangstemperatur, üblicherweise
mit Steroiden, insbesondere Cholesterin. Andere Phospholipide oder
andere Lipide können
auch verwendet werden. Die physikalischen Eigenschaften von Liposomen hängen von
pH, Ionenstärke
und der Gegenwart von zweiwertigen Kationen ab.
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Beispiele
für Lipide,
die zur Liposomenproduktion nützlich
sind, umfassen Phosphatidylverbindungen, wie Phosphatidylglycerin,
Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin, Sphingolipide,
Cerebroside und Ganglioside. Besonders nützlich sind Diacylphosphatidylglycerine,
worin die Lipidgruppierung 14-18 Kohlenstoffatome, insbesondere
16-18 Kohlenstoffatome, enthält
und gesättigt
ist. Veranschaulichende Phospholipide umfassen Ei-Phosphatidylcholin,
Dipalmitoylphosphatidylcholin und Distearoylphosphatidylcholin.
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Das
Targeting von Liposomen kann basierend auf anatomischen und mechanistischen
Faktoren klassifiziert werden. Anatomische Klassifizierung basiert
auf der Ebene der Selektivität,
beispielsweise organspezifisch, zellspezifisch und organellenspezifisch.
Mechanistisches Targeting kann darauf basierend unterschieden werden,
ob es passiv oder aktiv geschieht. Passives Targeting arbeitet mit
der natürlichen
Neigung von Liposomen, sich auf Zellen des retikuloendothelialen
Systems (RES) in Organen zu verteilen, die sinusförmige Kapillaren
enthalten. Aktives Targeting andererseits umfasst die Veränderung des
Liposoms durch Binden des Liposoms an einen spezifischen Liganden
wie einen monoklonalen Antikörper,
Zucker, Glykolipid oder Protein oder durch Verändern der Zusammensetzung oder
Größe des Liposoms,
um Targeting auf Organe und Zelltypen zu erreichen, die andere sind,
als die natürlich
vorkommenden Lokalisierungssteilen.
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Die
Oberfläche
des gerichteten Zufuhrsystems kann auf zahlreiche verschiedene Arten
modifiziert werden. Im Fall eines gerichteten Liposomen-Zufuhrsystems
können
Lipidgruppen in die Lipid-Bilayer des Liposoms inkorporiert werden,
um den Target-Liganden
in stabiler Assoziation mit der Liposomen-Bilayer zu halten. Verschiedene
Verbindungsgruppen können
zum Binden der Lipidketten an den Target-Ligand verwendet werden.
Isotonisch gepufferte Lösung
ist das bevorzugte Medium für
maximale Aufnahme der nackten Polynucleotide in Ausführungsformen
der Erfindung, die auf APC-Expression beruhen. Weiters wird auch
die Verwendung von Absorptions promotoren, Detergenzien, chemischen Reizstoffen
oder mechanischen Reizstoffen bevorzugt, um Transmission der Nacktpolynucleotid-Zusammensetzung
durch den Eintrittspunkt zu steigern. Allgemeine Prinzipien in Bezug
auf Promotoren und Detergenzien, die bereits erfolgreich zur Schleimhautzufuhr
organischer und peptidbasierter Wirkstoffe verwendet wurden sind
in Chien, Novel Drug Delivery Systems, Kap. 4, Marcel Dekker (1992),
nachzulesen. Spezifische Information bezüglich bekannter Mittel und
Prinzipien zur nasalen Wirkstoffzufuhr werden in Chien, s.o., Kap.
5, erläutert.
Beispiele für
geeignete nasale Absorptionspromotoren werden in Kap. 5, Tabelle
2 und 3, beschrieben; mildere Mittel werden bevorzugt. Darüber hinaus
werden bekannte Mittel und Prinzipien zur transdermalen Wirkstoffzufuhr
auch in Chien, s.o., Kap. 7, erläutert.
Geeignete Mittel zur Verwendung im Verfahren dieser Erfindung für mukosale/nasale
Zufuhr werden auch in Chang et al., Nasal Drug Delivery, "Treatise on Controlled
Drug Delivery",
Marcel Dekker, Kap. 9 sowie Tabellen 3-4B darin (1992), beschrieben.
Geeignete Mittel, die dafür
bekannt sind, Absorption von Wirkstoffen durch die Haut zu steigern,
werden in Sloan, Use of Solubility Parameters from Regular Solution
Theory to Describe Partitioning-Driven Processes, Kap. 5, "Prodrugs: Topical
and Ocular Drug Delivery",
Marcel Dekker (1992), sowie an anderen Stellen im Text beschrieben.
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Es
wird angenommen, dass diese Verfahren (und andere, die auf herkömmliche
Weise verwendet werden, um Wirkstoffzufuhr zu erleichtern) von durchschnittlichen
Fachleuten ohne übermäßiges Experimentieren
an die Herstellung von nackten Polynucleotiden zur Verwendung in
den Verfahren der Erfindung angepasst werden können. Obwohl die in den vorangehenden
Absätzen
erläuterten
Verfahren, soweit den Erfindern bekannt ist, bisher noch nicht für Polynucleotidzufuhr
verwendet wurden, wird insbesondere angenommen, dass sie zur Verwendung
zu diesem Zweck geeignet sind. Spezifische Beispiele, die diese
Eignung veranschaulichen, werden nachstehend beschrieben.
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C. Mittel zur und Arten
der Verabreichung von nackten Polynucleotiden
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Zur
dermalen Verabreichung können
die Zufuhrmittel epidermale Verabreichung, subkutane oder intradermale
Injektion umfassen. Von diesen Mitteln wird für größere Konzentrationen an APCs,
die in intradermalem Gewebe erwartet werden, epidermale Verabreichung
bevorzugt.
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Die
Zufuhrmittel für
dermale Verabreichung, die am meisten bevorzugt sind, sind jedoch
jene, die am wenigsten invasiv sind. Bevorzugt unter diesen Mitteln
sind transdermale Transmission und epidermale Verabreichung.
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Für transdermale
Transmission ist Iontophorese ein geeignetes Verfahren. Iontophoretische Transmission
kann unter Verwendung von handelsüblichen "Pflastern", die ihr Produkt kontinuierlich durch
unverletzte Haut über
mehrere Tage hinweg oder länger
zuführen,
erfolgen. Die Verwendung dieses Verfahrens ermöglicht gesteuerte Transmission pharmazeutischer
Zusammensetzungen in relativ hohen Konzentrationen, ermöglicht die
Infusion von Kombinationswirkstoffen und erlaubt die gleichzeitige Verwendung
eines Absorptionspromotors.
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Ein
beispielhaftes Pflasterprodukt zur Verwendung in diesem Verfahren
ist das Produkt mit dem geschützten
Warenzeichen LECTRO PATCH von General Medical Company aus Los Angeles,
CA. Dieses Produkt hält
Reservoir-Elektroden elektronisch bei neutralem pH aufrecht und
kann so angepasst werden, dass es Dosierungen mit unterschiedlichen
Konzentrationen bereitstellt, kontinuierlich Dosen abgibt und/oder
regelmäßig Dosen
abgibt. Vorbereitung und Verwendung des Pflasters sollten gemäß den schriftlichen
Anweisungen des Herstellers, die mit dem LECTRO PATCH-Produkt mitgeliefert werden,
erfolgen; diese Anweisungen sind hierin durch Verweis aufgenommen.
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Epidermale
Verabreichung umfasst im Wesentlichen mechanisches oder chemisches
Reizen der äußersten
Schicht der Epidermis in ausreichender Weise, um eine Immunantwort
auf den Reizstoff zu provozieren. Insbesondere sollte die Reizung
aus reichend sein, um APCs zur gereizten Stelle hin anzuziehen. Wie
zuvor erläutert
wird angenommen, dass die APCs dann das verabreichte nackte Polynucleotid
aufnehmen und exprimieren.
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Ein
beispielhaftes mechanisches Reizmittel verwendet zahlreiche kurze
Zinken mit sehr geringem Durchmesser, die verwendet werden können, um
die Haut zu reizen und APCs zur gereizten Stelle hin anzuziehen,
sodass diese nackte Polynucleotide, die aus den Enden der Zinken
transferiert werden, aufnehmen. Der MONO-VACC-Kochsches-Tuberculin-Test, hergestellt
von Pasteur Merieux, Lyon, Frankreich, beispielsweise enthält eine
Vorrichtung, die zur Einführung
nackter Polynucleotide geeignet ist.
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Die
Vorrichtung (die in den Vereinigten Staaten von Connaught Laboratories,
Inc. aus Swiftwater, PA, vertrieben wird) besteht aus einem Kunststoffbehältnis, das
einen Spritzenkolben an einem Ende und eine Zinkenscheibe am anderen
Ende aufweist. Die Zinkenscheibe trägt zahlreiche Zinken mit geringem Durchmesser
und mit einer Länge,
die gerade die äußerste Schicht
von Epidermiszellen ankratzt. Jede Zinke im MONO-VACC-Set ist mit
Kochschem Tuberculin beschichtet; in der vorliegenden Erfindung
wird jede Nadel mit einer pharmazeutischen Zusammensetzung aus nacktem
Polynucleotid oder einem Gemisch davon beschichtet. Die Verwendung
der Vorrichtung erfolgt gemäß den schriftlichen
Anweisungen des Herstellers, die mit dem Vorrichtungsprodukt geliefert
werden; diese Anweisungen bezüglich
Verwendung und Verabreichung sind hierin durch Verweis aufgenommen,
um die herkömmliche
Verwendung der Vorrichtung zu veranschaulichen. Ähnliche Vorrichtungen, die
in dieser Ausführungsform
auch verwendet werden können,
sind jene, die zur Zeit verwendet werden, um Allergietests durchzuführen.
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Ein
anderer geeigneter Ansatz zur epidermalen Verabreichung nackter
Polynucleotide arbeitet mit der Verwendung einer Chemikalie, die
die äußersten
Zellen der Epidermis reizt und dadurch eine ausreichende Immunantwort
hervorruft, um APCs in den jeweiligen Körperbereich zu locken. Ein
Beispiel hierfür
ist ein keratinolytisches Mittel wie beispielsweise die Salicylsäure, die
in der im Handel erhältlichen,
topi schen Enthaarungscreme verwendet wird, welche von Noxema Corporation
unter der Handelsmarke NAIR verkauft wird. Dieser Ansatz kann auch verwendet
werden, um epitheliale Verabreichung in die Schleimhaut zu erreichen.
Der chemische Reizstoff kann auch in Verbindung mit dem mechanischen Reizstoff
aufgetragen werden (was beispielsweise eintreten würde, wenn
die Zinken vom MONO-VACC-Typ auch mit dem chemischen Reizstoff beschichtet
wären).
Das nackte Polynucleotid kann in einem Träger suspendiert werden, der
auch den chemischen Reizstoff enthält, oder zusammen damit verabreicht
werden.
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Die
Dosierung von jedem nackten Polynucleotid oder Gemisch davon, das
unter Verwendung der Erfindung zugeführt werden soll, variiert je
nach der erwünschten
Reaktion durch den Wirt und dem verwendeten Polynucleotid. Im Allgemeinen
wird erwartet, dass bis zu 100-200 μg DNA in einer einzelnen Dosierung
verabreicht werden können,
auch wenn bereits nur etwa 0,3 μg
DNA, die durch die Haut verabreicht wird, langandauernde Immunantworten
induzieren können.
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Für die Zwecke
der Erfindung ist es jedoch ausreichend, wenn die nackten Polynucleotide
in einer Dosierung zugeführt
werden, die ausreichend ist, um Expression des biologisch aktiven
Peptids, für das
das Polynucleotid kodiert, auszulösen. Dosierungen, die für bestimmte
Indikationen (z.B. zum Zuführen
einer subtherapeutischen Dosierung von Cytokin) geeignet sind, werden
durch die nachstehend bereitgestellte(n) Erläuterung und Beispiele veranschaulicht.
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Diese
Dosierungen können
modifiziert werden, um therapeutische, subtherapeutische oder immunogene
Expressionsniveaus zu erzielen. Mittel zur Bestätigung der Gegenwart und Menge
exprimierter Peptide sind Fachleuten durchwegs bekannt und werden
daher nicht im Detail beschrieben. Bestimmte solche Mittel werden
in den nachstehend bereitgestellten Beispielen veranschaulicht;
im Allgemeinen umfassen sie Immuntests (wie enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung),
PCR-Verfahren und immunhistologische Analysen, die gemäß Verfahren
durchgeführt
werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Dosierungen
der verabreichten Poly nucleotide können basierend auf der Information,
die durch diese Detektions- und Quantifizierungsmittel geliefert
wird, sowie auf klinischen In-vivo-Zeichen, die Fachleuten auf dem
Gebiet der Medizin bekannt sind, so eingestellt werden, dass das
erwünschte
Expressionsniveau erreicht wird.
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II. VERABREICHUNG VON
MISCHUNGEN NACKTER POLYNUCLEOTIDE
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Ein
anderer Aspekt der Erfindung ist die Verabreichung einer Peptidmischung
(d.h. eines Gemisches aus Polynucleotiden) über Expression von Genkonstrukten,
die beispielsweise bis zu 200 Polynucleotidsequenzen enthalten,
unter der Steuerung eines einzigen Promotors.
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Die
Verabreichung von Gemischen aus Polynucleotiden könnte auch
dazu dienen, Peptide zuzuführen,
die mehr als eine biologische Aktivität aufweisen. Ein nacktes Polynucleotid,
das operativ für
ein immunogenes Peptid kodiert, kann an ein nacktes Polynucleotid,
das operativ für
einen Antikörper
kodiert, auf solch eine Weise gebunden oder mit diesem verabreicht
werden, dass sowohl Peptid als auch Antikörper exprimiert werden. Um
dies zu veranschaulichen, kann Verabreichung von Genen, die zusammen
IL-2 und anti-gp71 exprimieren, (basierend auf Resultaten, die mit
dem IL-2-Protein erzielt wurden) zur Lokalisierung des Antikörpers im
Tumorgewebe, das sich in Reaktion auf murines Leukämievirus
(MuLV) in Mäusen
entwickelte, führen
(siehe die Resultate, die mit gleichzeitiger Verabreichung von IL-2/anti-gp71-mAbs
erzielt wurden, Schultz et al., Cancer Res. 50, 5421-5425 (1990)).
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III. INDUKTION VON TUMOR-ASSOZIIERTEN,
ANTIGEN-SPEZIFISCHEN ZYTOTOXISCHEN T-LYMPHOZYTEN
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A. Produktion von rekombinanten,
immunreaktiven, Tumor-assoziierten Antigenmimetika
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Diese
Ausführungsform
der Erfindung basiert auf dem Prinzip, dass Peptide, für die nackte
Polynucleotide kodieren, die an Gewebe mit relativ hohen Konzentrationen
an APCs gemäß der Erfindung aufweisen,
intrazellulär
in den APCs exprimieren (die dann in lymphatisches Gewebe wandern
und eine Immunantwort stimulieren). Somit ist das Verfahren der
Erfindung besonders gut geeignet, um intrazelluläre Expression von immunreaktiven
Target-Antigenen zu erreichen, die die Entwicklung von eingeschränkten, Antigen-spezifischen
Klasse-I-CTLs stimulieren, die wiederum für Krebsimmuntherapie nützlich sind.
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(1) Selektion oder Identifikation
eines Tumor-assoziierten Antigens von Interesse und eines Polynucleotid,
das für
das Antigen kodiert
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Auch
wenn die Erfindung angewandt werden könnte, um CTLs gegen Tumor-assoziierte
Antigene an Zellen eines intakten Tumors zu bilden, kann erwartet
werden, dass das Verfahren seine größte Wirksamkeit zeigt, wenn
es zur Induktion von CTL-Aktivität gegen
verbleibende Krebszellen nach Entfernung des Primärtumors
oder eines Organs, das mit dem Tumor assoziiert war, (worin Letzteres kein
lebensnotwendiges Organ darstellt, wie beispielsweise endokrine
oder exokrine Drüsen,
Geschlechtsorgane, Regionen des Magendarmtrakts und Haut) eingesetzt
wird.
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Zu
diesem Zweck werden organspezifische oder carcinoembryonale, Tumor-assoziierte,
Antigen-kodierende Polynucleotide selektiert oder, sofern nicht
bekannt, identifiziert. Beispiele für organspezifische, Tumor-assoziierte
Antigene, deren cDNA-Kodiersequenzen durchschnittlichen Fachleuten bekannt
sind, umfassen das Prostataspezifische Transmembranprotein (PSM)
(siehe Israeli et al., Cancer Res. 54, 1807-1811 (1994), und 53, 227-230 (1993));
Brustepithelantigene (siehe Ceriani et al., Anal. Biochem. 201,
178-184 (1992)); menschliches Magendarmkrebs-Antigen, Schistosoma-mansoni-assoziiertes
Antigen und Melanom-spezifisches Antigen (siehe Bellacosa et al.,
Mol. Cell Biol. 11, 2864-1874 (1991)). Carcinoembryonales Antigen (das
am Epithel des Darmlumens angeordnet ist; siehe Benchimol et al.,
Cell 57, 327-324 (1989)) und das Antigen, das mit Wilms-Tumor assoziiert
ist (der an der Niere angeordnet ist; siehe Roth et al., Verh. Dtsch.
Ges. Pathol. 73, 372-387 (1989)), sind Beispiele für carcinoembryonale,
Tumor-assoziierte Antigene, für
die cDNA-Ko diersequenzen bekannt sind und die zur Verwendung im
Verfahren der Erfindung geeignet sind.
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Mittel
zur Identifikation zusätzlicher,
Tumor-assoziierter Antigene unter Anwendung bekannter Hybridisierungs-
und/oder Polymerasekettenreaktions-(PCR-)Verfahren werden im Abschnitt
I(A), s.o., beschrieben. Ein Verfahren zur Identifikation von Antigen-kodierenden
Polynucleotiden, die von besonderem Nutzen bei der Identifikation
von Tumor-assoziierten Antigenen zur Verwendung in der Erfindung sein
können,
ist Subtraktionshybridisierung, die erst jüngst als Werkzeug eingesetzt
wurde, um Gene zu identifizieren, die in einer Population vorhanden
sind, nicht aber in einer anderen, wie beispielsweise Polymorphismen
zwischen dem Genom oder bestimmte Gene zweier Individuen (siehe
Lisitsyn et al., Science 259, 946-951 (1993), dessen Offenbarung
hierin durch Verweis aufgenommen ist, um das auf dem Gebiet der
Erfindung vorhandene Wissen bezüglich der
Durchführung
und Verwendung von cDNA-Subtraktionshybridisierungsverfahren zu
veranschaulichen). Lisityn et al. berichten, dass ihr Subtraktionshybridisierungsverfahren
durch die Verwendung von "kinetischer
Anreicherung" bessere Resultate
als herkömmliche
Subtraktionshybridisierungsverfahren erzielt; d.h. durch die Verwendung von
PCR, um nur ein doppelsträngiges "Tester"-DNA-Fragment, das
in geringeren Mengen als Target-DNA-Stränge in einer Population von DNA-Fragmenten
vorhanden ist, zu schmelzen und wiederherzustellen. Das Verfahren
wird als Ermöglichung "der Entdeckung genomischer
Veränderungen,
die in Krebszellen auftreten" beschrieben
(siehe Lisityn, S. 949).
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Ein
anderes Verfahren, das zur Identifikation von Genen geeignet ist,
verwendet PCR, um unterschiedlich exprimierte RNAs zu identifizieren,
wie in Liang & Pardee,
Science 257, 967-971 (1992), beschrieben wird. Dieses Verfahren
verwendet eine Reihe von Oligonucleotidprimern, wobei einer am Polyadenylatende
einer Untergruppe von mRNAs verankert ist und der andere eine kurze
und willkürliche
Sequenz aufweist, sodass er im Vergleich zum ersten Primer an unterschiedlichen
Positionen anelliert. Die mRNA-Subpopulationen, die durch diese Primerpaare
definiert sind, werden durch reverse Transkription amplifiziert
und an einem DNA-Sequenzierungsgel aufgelöst. Nach der Verwendung von
Mehrfachprimersets berichteten die Auto ren, dass sie in der Lage
waren, reproduzierbare Muster amplifizierter komplementärer DNA-Fragmente
zu erhalten, die starke Abhängigkeit
von Sequenzspezifität
in beiden Primern eines Primerpaars zeigten.
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Einen Überblick
zur Konstruktion von cDNA-Bibliotheken, um Klone zu isolieren, die
mRNAs entsprechen, die in einem Zell- oder Gewebetyp vorhanden sind,
jedoch nicht in einem anderen, können Fachleute
in den Standard-Arbeitsvorschriften finden, die in Ausubel et al., "Current Protocols
in Molecular Biology",
Abschnitt 5.8B, Wiley & Sons
(1994), beschrieben werden und deren Offenbarung durch diesen Verweis
hierin aufgenommen ist, um das auf dem Gebiet der Erfindung vorhandene
Wissen bezüglich
der Konstruktion subtrahierter cDNA-Bibliotheken zu veranschaulichen.
Ein kurzer Überblick über geeignete
Detektionsverfahren, die mit PCR arbeiten, ist nachstehend bereitgestellt.
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Allgemeinen
umfasst die Detektion von Target-Polynucleotiden in Proben oder
Bibliotheken durch PCR die Verwendung von Primern, die Oligonucleotide
mit ausreichender Länge
und geeigneter Sequenz umfassen, um spezifische Polymerisationsinitiation
einer beträchtlichen
Anzahl an Nucleinsäuremolekülen, die
die Target-Nucleinsäure
enthalten, unter den stringenten Bedingungen für die Reaktion unter Verwendung
der Primer bereitzustellen. Auf diese Weise ist es möglich, die
die Nucleinsäure
von Interesse enthaltende, spezifische Target-Nucleinsäuresequenz
selektiv zu amplifizieren. Insbesondere bezieht sich die Bezeichnung "Primer" wie hierin verwendet
auf eine Sequenz, die zwei oder mehr Desoxyribonucleotide oder Ribonucleotide,
vorzugsweise zumindest acht, umfasst, worin die Sequenz in der Lage
ist, Synthese eines Primer-Extensionsprodukts zu initiieren, das
zu einem Target-Nucleinsäurestrang
im Wesentlichen komplementär
ist.
-
Der
Oligonucleotidprimer enthält
typischerweise 15-22 oder mehr Nucleotide, wobei er auch weniger
Nucleotide enthalten kann, solange der Primer ausreichend spezifisch
ist, um im Wesentlichen nur die Amplifikation der spezifisch erwünschten
Target-Nucleotidsequenz zu ermöglichen
(d.h. der Primer ist im Wesentlichen komplementär).
-
Versuchsbedingungen,
die Primersynthese dienlich sind, umfassen die Gegenwart von Nucleosidtriphosphaten
und einem Mittel für
Polymerisation, wie DNA-Polymerase, sowie geeignete(n) Temperatur
und pH. Der Primer ist für
maximale Effizienz bei der Amplifikation vorzugsweise einzelsträngig, kann jedoch
auch doppelsträngig
sein. Sofern er doppelsträngig
ist, wird der Primer zuerst behandelt, um seine Stränge zu trennen,
bevor er verwendet wird, um Extensionsprodukte herzustellen. Vorzugsweise
ist der Primer ein Oligodesoxyribonucleotid. Der Primer muss ausreichend
lang sein, um die Synthese von Extensionsprodukten in der Gegenwart
des Polymerisationsinduktionsmittels zu primen. Die exakte Primerlänge hängt von
zahlreichen Faktoren ab, einschließlich Temperatur, Puffer und
Nucleotidzusammensetzung.
-
Primer,
die für
PCR-Detektion von Tumor-assoziierten Antigenen verwendet werden,
werden als "im Wesentlichen" komplementär zu jedem
Strang der zu amplifizierenden Nucleotidsequenz bezeichnet. Im Wesentlichen
komplementär
bedeutet, dass die Primer ausreichend komplementär sein müssen, um mit ihren jeweiligen
Strängen
unter Bedingungen zu hybridisieren, die ermöglichen, dass das Polymerisationsmittel
funktioniert. Anders gesagt sollten die Primer ausreichend Komplementarität mit den
flankierenden Sequenzen, die damit hybridisieren sollten, aufweisen
und Amplifikation der mutierten Nucleotidsequenz ermöglichen.
Vorzugsweise weist der 3'-Terminus des Primers,
der verlängert
wird, perfekt basengepaarte Komplementarität mit dem komplementären flankierenden
Strang auf.
-
Oligonucleotidprimer
werden in jeglichem Amplifikationsverfahren verwendet, das erhöhte Mengen
an Target-Nucleinsäure
bildet. Typischerweise ist ein Primer komplementär zum negativen (–) Strang
der mutierten Nucleotidsequenz, und der andere ist komplementär zum positiven
(+) Strang. Anellieren der Primer an denaturierte Nucleinsäure, gefolgt
von Extension mit einem Enzym, wie beispielsweise dem große Fragment
von DNA-Polymerase I (Klenow) oder Taq-DNA-Polymerase und Nucleotiden
oder Ligasen, resultiert in neu synthetisierten + und – Strängen, die
die Target-Nucleinsäure enthalten.
Da diese neu synthetisierten Nucleinsäuren auch Matrices sind, führen wiederholte
Zyklen von Denaturieren, Primer-Anellieren und Extension zur exponentiellen
Produktion der Region (d.h. der mutierten Target-Nucleotidse quenz),
die durch den Primer definiert ist. Das Produkt der Amplifikationsreaktion
ist ein einzelner Nucleinsäureduplex
mit Termini, die den Enden der spezifischen verwendeten Primer entsprechen.
Fachleuten werden andere Amplifikationsverfahren bekannt sein, die
auch verwendet werden können,
um die Kopienanzahl von Target-Nucleinsäure zu steigern.
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Die
Oligonucleotidprimer zur Verwendung in der Erfindung können unter
Verwendung jeglichen geeigneten Verfahrens, wie beispielsweise herkömmliche
Phosphotriester- und Phosphodiesterverfahren oder automatisierte
Ausführungsformen
davon hergestellt werden. In einer solchen automatisierten Ausführungsform
werden Diethylphosphoramidite als Ausgangsmaterialien verwendet
und können
wie von Beaucage et al. (Tetrahedron Letters 22, 1859-1862 (1981))
beschrieben synthetisiert werden. Ein Verfahren zur Synthese von
Oligonucleotiden an einem modifizierten festen Träger wird
im US-Patent Nr. 4.458.066 beschrieben. Ein Amplifikationsverfahren,
das gemäß dieser
Erfindung verwendet werden kann, ist Polymerasekettenreaktion (PCR),
die in den US-Patenten Nr. 4.683.202 und 4.683.195 beschrieben wird.
-
Die
Nucleinsäure
aus jeglichem histologischen Gewebemuster, in gereinigter oder nichtgereinigter
Form, kann als Ausgangsnucleinsäure
oder -säuren
verwendet werden, vorausgesetzt, sie enthält die spezifische Nucleinsäuresequenz,
die die Target-Nucleinsäure enthält, oder
es wird von ihr angenommen, dass sie diese enthält. Somit kann das Verfahren
beispielsweise DNA oder RNA, einschließlich Messenger-RNA (mRNA), verwenden,
worin DNA oder RNA einzelsträngig
oder doppelsträngig sein
kann. Sofern RNA als Matrix verwendet wird, würden Enzyme und/oder Bedingungen,
die für
reverse Transkription der Matrix zu DNA optimal sind, verwendet
werden. Darüber
hinaus kann ein DNA-RNA-Hybrid, das jeweils einen Strang von DNA und
RNA enthält,
verwendet werden. Ein Gemisch aus Nucleinsäuren kann auch verwendet werden, oder
es können
auch die Nucleinsäuren
verwendet werden, die in einer vorigen Amplifikationsreaktion hierin
unter Verwendung derselben oder unterschiedlicher Primer gebildet
wurden. Die zu amplifizierende Nucleotidsequenz kann ein Teil eines
größeren Moleküls sein
oder kann anfänglich
als separates Molekül vorliegen,
sodass die spezifische Sequenz die gesamte Nucleinsäure bildet.
Es ist nicht erforderlich, dass die zu amplifizierende Sequenz anfänglich in reiner
Form vorhanden ist; sie kann ein geringer Teil eines komplexen Gemisches,
wie er in menschlicher Gesamt-DNA enthalten ist, sein.
-
Enthält die Target-Nucleotidsequenz
der Probe zwei Stränge,
so ist es erforderlich, die Stränge
der Nucleinsäure
zu trennen, bevor sie als Matrix verwendet werden kann. Strangtrennung
kann entweder als separater Schritt erfolgen oder gleichzeitig mit
der Synthese der Primer-Extensionsprodukte stattfinden. Diese Strangtrennung
kann unter Verwendung verschiedener geeigneter Denaturierungsbedingungen
erfolgen, einschließlich
physikalischer, chemischer oder enzymatischer Mittel; das Wort "Denaturierung" umfasst alle solche
Mittel. Ein physikalisches Verfahren zur Trennung von Nucleinsäuresträngen umfasst
das Erhitzen der Nucleinsäure,
bis sie denaturiert ist. Typische Hitzedenaturierung kann Temperaturen
im Bereich von etwa 80 °C
bis 105 °C für Zeitspannen
im Bereich von etwa 1 bis 10 min umfassen. Strangtrennung kann auch
durch ein Enzym aus der Klasse von Enzymen, die als Helicasen bekannt
sind, oder durch das Enzym RecA, das Helicase-Aktivität aufweist,
und in der Gegenwart von riboATP, das bekannt dafür ist, DNA
zu denaturieren, induziert werden. Die für Strangtrennung von Nucleinsäuren mit
Helicasen geeigneten Reaktionsbedingungen werden von Kuhn Hoffmann-Berling (CSH-Quantitative
Biology 43, 63 (1978)) beschrieben, und ein Überblick zu Verfahren zur Verwendung von
RecA wird in C. Radding (Ann. Rev. Genetics 16, 405-437 (1982))
bereitgestellt.
-
Ist
die Nucleinsäure,
die die zu amplifizierende Target-Nucleinsäure enthält, einzelsträngig, so wird
ihr Komplement durch Zusetzen von einem oder zwei Oligonucleotidprimer(n)
synthetisiert. Wird ein einzelner Primer verwendet, so wird ein
Primer-Extensionsprodukt
in Gegenwart von Primer, einem Polymerisationsmittel und den vier
Nucleosidtriphosphaten, wie nachstehend beschrieben, synthetisiert. Das
Produkt ist komplementär
zur einzelsträngigen Nucleinsäure und
hybridisiert mit einer einzelsträngigen
Nucleinsäure,
um einen Duplex mit ungleich langen Strängen zu bilden, die dann zu
Einzelsträngen geteilt
werden können,
um zwei einzelne, getrennte, komplementäre Stränge zu bilden. Alternativ dazu können zwei
Primer zur einzelsträngigen
Nucleinsäure
hinzugefügt
werden und kann die Reaktion wie beschrieben durchgeführt werden.
-
Werden
komplementäre
Stränge
von Nucleinsäure
oder -säuren
getrennt, unabhängig
davon, ob die Nucleinsäure
ursprünglich
doppel- oder einzelsträngig
war, so sind die getrennten Stränge
bereit, als Matrix für
die Synthese zusätzlicher
Nucleinsäurestränge verwendet
zu werden. Diese Synthese erfolgte unter Bedingungen, die Hybridisierung
von Primern an Matrices ermöglichten.
Im Allgemeinen tritt Synthese in einer gepufferten wässrigen
Lösung
ein, vorzugsweise bei einem pH von 7-9, am bevorzugtesten von etwa
8. Vorzugsweise wird ein molarer Überschuss (für genomische
Nucleinsäure üblicherweise
etwa 108:1 Primer:Matrix) der zwei Oligonucleotidprimer
zum Puffer, der die getrennten Matrixstränge enthält, zugesetzt. Es gilt jedoch
zu verstehen, dass die Menge an komplementärem Strang unbekannt sein kann,
wenn das Verfahren der Erfindung für diagnostische Anwendungen
verwendet wird, sodass die Menge an Primer in Bezug auf die Menge
an komplementärem
Strang nicht mit Sicherheit bestimmt werden kann. Aus praktischen
Gründen
weist jedoch die Menge an zugesetztem Primer im Allgemeinen einen
molaren Überschuss
gegenüber
der Menge an komplementärem
Strang (Matrix) auf, wenn die zu amplifizierende Sequenz in einem Gemisch
aus komplizierten langkettigen Nucleinsäuresträngen enthalten ist. Ein großer molarer Überschuss
wird bevorzugt, um die Effizienz des Verfahrens zu verbessern.
-
In
manchen Amplifikations-Ausführungsformen
werden die Substrate, beispielsweise die Desoxyribonucleotidtriphosphate
dATP, dCTP, dGTP und dTTP, entweder getrennt oder zusammen mit den Primern
in adäquaten
Mengen zum Synthesegemisch zugesetzt, und die resultierende Lösung wird auf
etwa 90 °C – 100 °C etwa 1
bis 10 min lang, vorzugsweise 1 bis 4 min lang, erhitzt. Nach dieser
Wärmephase
wird die Lösung
auf Raumtemperatur abkühlen
gelassen, was für
die Primerhybridisierung bevorzugt wird. Zum gekühlten Gemisch wird ein geeignetes
Mittel (hierin als "Polymerisationsmittel" bezeichnet) zugesetzt,
um die Primer-Extensionsreaktion zu bewirken, und die Reaktion wird
unter Bedingungen, die auf dem Gebiet der Erfin dung bekannt sind,
eintreten gelassen. Das Polymerisationsmittel kann auch zusammen
mit den anderen Reagenzien zugesetzt werden, sofern es wärmestabil
ist. Diese Synthese-(oder Amplifikations-)reaktion kann bei Raumtemperatur
bis hin zu einer Temperatur, über der
das Polymerisationsmittel nicht mehr funktioniert, eintreten. Somit
liegt beispielsweise, wenn DNA-Polymerase als Mittel verwendet wird,
die Temperatur im Allgemeinen nicht über etwa 40 °C.
-
Das
Polymerisationsmittel kann jegliche Verbindung oder jegliches System
sein, die/das so funktioniert, dass die Synthese von Primer-Extensionsprodukten,
einschließlich
Enzymen, zu einem Abschluss gebracht wird. Geeignete Enzyme für diesen Zweck
umfassen beispielsweise E.-coli-DNA-Polymerase I, Taq-Polymerase,
Klenow-Fragment von E.-coli-DNA-Polymerase I, T4-DNA-Polymerase,
andere verfügbare
DNA-Polymerasen, Polymerasemuteine, reverse Transkriptase, Ligase
und andere Enzyme, einschließlich
wärmestabiler
Enzyme (d.h. jene Enzyme, die Primerextension vollbringen, nachdem
sie Temperaturen ausgesetzt wurden, die ausreichend hoch sind, um
Denaturierung zu verursachen). Geeignete Enzyme erleichtern die
Kombination der Nucleotide auf geeignete Weise, um die Primer-Extensionsprodukte
zu bilden, die zu jedem mutierten Nucleotidstrang komplementär sind.
Im Allgemeinen beginnt die Synthese am 3'-Ende von jedem Primer und verläuft in der
5'-Richtung entlang
des Matrixstrangs, bis die Synthese endet und Moleküle verschiedener
Länge hervorbringt.
Es kann jedoch Polymerisationsmittel geben, die die Synthese am 5'-Ende beginnen und
sie unter Verwendung desselben Verfahrens wie zuvor beschrieben
genau in entgegengesetzter Richtung ablaufen lassen.
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Der
neu synthetisierte, mutierte Nucleotidstrang und sein komplementärer Nucleinsäurestrang bilden
unter den zuvor beschriebenen Bedingungen ein doppelsträngiges Molekül, und dieses
Hybrid wird in darauffolgenden Schritten des Verfahrens verwendet.
Im nächsten
Schritt wird das neu synthetisierte, doppelsträngige Molekül unter Verwendung jedes beliebigen
der zuvor beschriebenen Verfahren denaturierenden Bedingungen unterzogen,
um einzelsträngige
Moleküle
bereitzustellen.
-
Das
oben beschriebene Verfahren wird an den einzelsträngigen Molekülen wiederholt.
Zusätzliche
Polymerisationsmittel, Nucleoside und Primer können zugesetzt werden, sofern
dies erforderlich ist, um die Reaktion unter den zuvor vorgeschriebenen
Bedingungen fortzusetzen. Die Synthese wird wiederum an einem Ende
von jedem der Oligonucleotidprimer begonnen und wird entlang der
einzelnen Stränge
der Matrix fortlaufen gelassen, um zusätzliche Nucleinsäure zu bilden.
Nach diesem Schritt besteht die Hälfte des Extensionsprodukts
aus der spezifischen Nucleinsäuresequenz,
die durch die zwei Primer gebunden ist.
-
Die
Schritte der Denaturierung und Extensionsproduktsynthese können so
oft wie nötig
wiederholt werden, um die mutierte Target-Nucleotidsequenz zu dem
Ausmaß zu
amplifizieren, das für
Detektion erforderlich ist. Die Menge der produzierten mutierten
Nucleotidsequenz akkumuliert sich auf exponentielle Weise.
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Das
amplifizierte Produkt kann durch Southern-Blot-Analyse ohne Einsatz
radioaktiver Sonden nachgewiesen werden. In solch einem Verfahren
wird beispielsweise eine kleine DNA-Probe, die eine sehr geringe
Konzentration an Target-Nucleotidsequenz enthält, amplifiziert und über ein Southern-Blotting-Verfahren
analysiert. Die Verwendung von nicht-radioaktiven Sonden oder Markierungen
wird durch das hohe Ausmaß des
amplifizierten Signals erleichtert.
-
Polynucleotide,
die wie zuvor beschrieben nachgewiesen wurden, können, entweder in Lösung oder
nach Bindung an einen festen Träger,
durch jedes beliebige Verfahren, das üblicherweise zur Detektion
einer spezifischen DNA-Sequenz verwendet wird, wie PCR, Oligomerrestriktion
(Saiki et al., Bio/Technology 3, 1008-1012 (1985)), Allel-spezifische
Oligonucleotid-(ASO-)Sondenanalyse (Conner et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 80, 278 (1983)), Oligonucleotidligationstests (OLAs (Landegren
et al., Science 241, 1077 (1988)) und dergleichen weiter evaluiert,
detektiert, kloniert, sequenziert und dergleichen werden. Über Molekularverfahren
für DNA-Analyse
wurde bereits berichtet und sie sind auf dem Gebiet der Erfindung
bekannt (Landegren et al., Science 242, 229-237 (1988)).
-
(2) Sofern das Antigen
ein Selbstantigen (im Gegensatz zu einem Tumor-assoziierten Antigen
aus einer anderen Säugetierspezies)
ist, Modifikation eines Polynucleotids, das für das Tumor-assoziierte Antigen
von Interesse als Selbstantigen kodiert, um das Selbstantigen nachzuahmen,
nicht jedoch identisch damit zu sein
-
Um
ein rekombinantes Selbstantigen "fremd" zu machen, um Immuntoleranz
gegenüber
dem Selbstantigen zu vermeiden, ist es im Allgemeinen ausreichend,
ein einzelnes Nucleotid in der Kodierregion des Gens zu modifizieren,
das für
das Selbstantigen kodiert. Die Erfindung stellt daher ein Verfahren zur
Identifikation bereit, welche Mutationen in einem Tumor-assoziierten,
Antigen-kodierenden Polynucleotid zur Modifikation eines Tumor-assoziierten Selbstantigens
zu einem ausreichenden Ausmaß wirksam
sind, um T-Lymphozyten-Toleranz hier gegenüber in einem Wirt zu brechen
(d.h. Mutationen, die immunreaktive "mimische" Antigene zur Stimulierung spezifischer
Autoimmun-T-Lymphozyten-Antworten produzieren).
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Um
geeignete mimische Antigene zur Verwendung in der Erfindung zu identifizieren,
werden Tumor-assoziierte, für
Selbstantigen kodierende Polynucleotide wie nachstehend beschrieben
mutiert. Vorzugsweise erfolgt die Mutation in der Region des Polynucleotids,
die für
eine immunogene Region des Selbstantigens kodiert; d.h. für das/die
T-Zellepitop(e) im Selbstantigen.
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Wenn
auch arbeitsintensivere Mittel zur Kartierung von T-Zellepitopen
auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, können auf praktische Weise epitopische
Regionen eines Proteins unter Verwendung des Algorithmus nach Berzofsky
vorhergesagt werden (siehe Margalit et al., J. Immunol. 138, 2213-2229
(1987), dessen Offenbarung durch diesen Verweis hierin aufgenommen
ist, um das Wissen auf dem Gebiet der Erfindung bezüglich der
Verwendung des Algorithmus nach Berzofsky zu veranschaulichen).
Der Algorithmus filtert sich überlappende
Aminosäurereste
in einem Protein heraus und sagt die Gegenwart und Position von
T-Zellepitop(en), basierend auf der Fähigkeit von Restreihen, eine
amphipathische α-Helixkonfiguration
zu bilden, vorher. Je höher
das amphipathische Ergebnis für
ein vorhergesagtes Epitop ist, desto größer ist dessen wahrscheinliche
Immunreaktivität.
Ein Software-Pro gramm zur Anwendung des Algorithmus auf Aminosäuresequenzen
in einem Protein ist im Handel unter dem Handelsnamen AMPHI-Programm
erhältlich und
wird üblicherweise
auf dem Gebiet der Erfindung verwendet, um T-Zellepitope vorherzusagen.
Rotzschike und Mitarbeiter beschrieben jüngst auch ein Verfahren, das
sie beschreiben als eines, das die "exakte" Vorhersage eines T-Zellepitops ermöglicht (Rotzschike
et al., Eur. J. Immunol. 21, 2431 (1991)). Nachdem T-Zellepitope
in einem Tumor-assoziierten Antigen identifiziert wurden, können isolierte
oder sequenzierte und synthetisierte Peptide, die das mutmaßliche T-Zellepitop
enthalten, in einem T-Zell-Proliferationstest getestet werden, um
die Gegenwart und Reaktivität
des Epitops im Peptid zu bestätigen.
-
Nachdem
Epitope in einem Tumor-assoziierten Selbstantigen identifiziert
wurden, können
mutierte Polynucleotide, die operativ für nachahmende Antigene kodieren,
gemäß den Verfahren
der Erfindung zur Verwendung in Krebsimmuntherapie gebildet, getestet
und/oder verabreicht werden. Beispiele für geeignete Mutationen umfassen
die Bildung eines Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP),
einer Nucleotiddeletion, einer Nucleotidsubstitution oder jeder
beliebigen anderen Säugetier-Nucleinsäuresequenz
von Interesse. Daher soll, wie hierin verwendet, die Bezeichnung "Mutante oder mutiert" in Verbindung mit
einer Polynucleotidsequenz eine Mutation, einen Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus,
eine Nucleinsäuredeletion
oder eine Nucleinsäuresubstitution
umfassen, die ein Tumor-assoziiertes Antigen im Wirt immunreaktiv
machen. Besonders bevorzugte Mutationen sind jene, die auf Primärstrukturebene
eine Ähnlichkeit
zwischen ein Selbstantigen und einem kreuzreaktiven Antigen aus einer
anderen Säugetierspezies
(z.B. murine und menschliche Ribonucleoproteine) schaffen (siehe z.B.
Mamula et al., J. Immunol. 152, 1453-1461 (1994)). Für die Zwecke
dieser Offenbarung werden nachahmende, Tumor-assoziierte Antigene,
die durch Modifikation von Selbstantigenen gebildet werden, als "homogene, Tumor-assoziierte
Antigenmimetika" bezeichnet,
während
Tumor-assoziierte Antigene aus einer Spezies, die nicht die Wirtspezies ist
(die immunologisch betrachtet den Tumor-assoziierten Antigenen,
die an Tumorzellen in der Wirtsspezies vorhanden sind, ähnlich sind),
als "heterogene, Tumor-assoziierte
Antigenmimetika" bezeichnet
werden.
-
Verfahren
zur Mutation von Polynucleotiden, um modifizierte Genprodukte zu
bilden, gibt es, und sie sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs
bekannt. Ein Tumorassoziiertes, Antigen-kodierendes Polynucleotid
mit einer wünschenswerten
Mutation kann beispielsweise durch ortspezifische Mutagenese unter
Verwendung einer herkömmlichen
Polymerasekettenreaktion (PCR) und eines Primerpaars, das den 3'- und 5'-Regionen der cDNA entspricht, gebildet
werden. Ein bevorzugtes Verfahren der Mutations-bildenden PCR-Amplifikation
ist das Überlappungs-Extensions-PCR-Verfahren, das von
Ho et al., Gene 77, 51-59 (1989), beschrieben wird, dessen Offenbarung
durch diesen Verweis hierin aufgenommen ist. Im Allgemeinen führt dieses
Verfahren zu ortspezifischer Mutagenese des Klons durch Verwendung
eines 3'-Primers, um die fehlgepaarten
mutierenden Basen zuzusetzen (Primer B im Artikel von Ho, der mit
dem 5'-Primer A
im ersten beschriebenen PCR-Zyklus verwendet wird). Amplifikation
unter Verwendung der A- und B-Primer ergibt ein AB-Fragment. Ein
zweiter PCR-Zyklus verwendet einen Primer (D) vom 3'-Ende des Gens und
einen 5'-mutierten
Primer (C), der komplementär
zu Primer B ist. Das resultierende Amplifikationsprodukt (Fragment CD) überlappt
das AB-Fragment. Werden die AB- und
CD-Fragmente denaturiert, wiederhergestellt und unter Verwendung
der A- und D-Primer amplifiziert, so enthält das resultierende Fusionsprodukt (AD)
die cDNA-Sequenz voller Länge
und die erwünschte
Mutation.
-
Zur
Bildung von zufälligen
Mutationen in Genen ist ein PCR-Verfahren, das modifiziert ist,
um die Zuverlässigkeit
von Taq-Polymerase während DNA-Synthese
zu reduzieren, besonders nützlich. Insbesondere
wird die PCR unter Bedingungen durchgeführt, die im Allgemeinen eine
kumulative Fehlerhäufigkeit
von 2 % über
die gesamte DNA-Nucleotidsequenz und eine Mutantenausbeute (für Targets
mit über
300 bp) von mehr als 90 % ergeben; das heißt, Bedingungen hoher und Pool-vorgegebener
dNTP-Konzentrationen (1 mM jeweils von dTTP, dCTP, dGTP, 200 μM dATP),
eine hohe Konzentration an MgCl2 in Gegenwart
von MnCl2 (0,5 mM) und 25 PCR-Zyklen, beginnend
mit 1 ng kloniertem Plasmidtarget. Einen weiteren Überblick
zu dieser Arbeitsvorschrift zu randomisierter PCR-Mutagenese können Fachleute
in Leung et al., Technique 1, 11-15 (1989), finden; eine Modifikation
des Verfahrens, um zufällige
Punktmutationen zu erzielen, ist auch in Cadwell & Joyce, PCR Methods and
Applications 2, 28-33 (1992), zu finden; und Information zur Bildung einer
PCR-abgeleiteten
Bibliothek an zufälligen Punktmutationen
sind in Kirchoff & Desrosiers,
PCR Methods and Applications 2, 301-304 (1993) zu finden, deren
Offenbarungen durch diesen Verweis hierin aufgenommen sind, um PCR-Mutageneseverfahren,
die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, zu veranschaulichen.
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Ein
anderer geeigneter Ansatz zur Herstellung einzelner Basensubstitutionen
oder -deletionen wird von Shaw im US-Patent Nr. 4.904.584 ("Site-Specific Homogenous
Modification of Polypeptides")
beschrieben, dessen Offenbarung durch diesen Verweis zur Veranschaulichung
des Wissens auf dem Gebiet der Erfindung in Bezug auf Verfahren
zur Erreichung spezifischer Mutationen in einer Nucleinsäuresequenz
hierin aufgenommen ist.
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3. Verleihen der Fähigkeit
an das nackte, Tumor-assoziierte Antigen-Gen, operativ zu kodieren;
d.h. durch Insertion in einen rekombinanten Expressionsvektor
-
Geeignete
Verfahren und Vektoren zur Verwendung in diesem Schritt der Erfindung
sind durchschnittlichen Fachleuten durchwegs bekannt oder können ohne übermäßiges Experimentieren
ermittelt werden; siehe z.B. den Überblick und die Erläuterung der
Abschnitte I(A) und II, oben.
-
B. Verfahren zum Screenen
therapeutisch wirksamer, Tumor-assoziierter Antigenmimetika.
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Nachdem
Tumor-assoziierte Antigenmimetika (a) gemäß Schritt 1 oben identifiziert;
und (b) durch Expression unter Verwendung der Polynucleotide und
rekombinanten Expressionsvektoren, die gemäß Schritt 2 und 3 oben konstruiert
wurden, hergestellt wurden; oder (b') unter Verwendung herkömmlicher
Peptidsyntheseverfahren synthetisiert wurden, werden die Mimetika
vorzugsweise auf ihre Fähigkeit
gescreent, autoimmunreaktive CTLs zu stimulieren, die Tumorzellen
lysieren, die das Target-Tumorantigen an der Zelloberfläche aufweisen.
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Wie
zuvor erläutert
hängt CTL-Lyse
von Targetzellen von der Präsentation
von "Fremd-"Peptiden, die an
Klasse-I-MHC-Moleküle
gebunden sind, ab. Somit sind Tumor-assoziierte Antigenmimetika, die
zur Verwendung bei Krebsimmuntherapie geeignet sind, jene, die Peptid/MHC-Komplexe
an der Oberfläche
von APCs in vivo bilden.
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Von
Peptiden, die an Klasse-I-MHC-Moleküle an APCs gebunden sind, wird
angenommen, dass sie durch eine Länge von etwa 8 bis 10 Aminosäureresten
charakterisiert sind (siehe z.B. Falk et al., Nature 351, 290 (1991);
und Jardetzky et al., Nature 353, 326 (1991)). Es wurde gezeigt,
dass, wenn solche Peptide in transfizierten APCs rekombinant exprimiert
werden, sie Klasse-I-MHC binden können (siehe z.B. Townsend et
al., Cell 42, 457 (1985); Townsend et al., Nature 324, 575 (1986);
und Shastri et al., J. Immunol. 150, 2724-2736 (1993)).
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Die
Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein Tumor-assoziiertes,
Antigen-kodierendes Kandidaten-Polynucleotid "therapeutische Wirksamkeit" aufweist, bereit;
d.h. dieses Polynucleotid exprimiert ein Tumor-assoziiertes Antigenmimetikum im
Zytoplasma von APCs, und dieses Antigen (a) wird seinerseits an
Klasse-I-MHC-Moleküle an der APC-Zelloberfläche gebunden;
und (b) stimuliert CTL-Lyse von Wirtstumorzellen, die das Tumor-assoziierte
Targetantigen in sich tragen.
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Um
zu bestimmen, ob ein Tumor-assoziiertes Targetantigenmimetikum,
das in APCs rekombinant exprimiert wird, an Klasse-I-MHC gebunden wird,
können
herkömmliche
Verfahren wie Massenspektrometrieanalyse transfizierter APCs verwendet werden.
Ein anderes Verfahren jedoch, das aufgrund seiner praktischen Anwendung
bevorzugt wird, umfasst die Transfektion von MHC-exprimierenden CHO-(Chinahamster-Eierstock-)Zellen
als Modell-APC mit einem Tumor-assoziierten Kandidaten-Antigenmimetikum,
das für
Polynucleotid kodiert. Nachdem Expression des Mimetikums in transfizierten
APCs bestätigt
wurde (beispielsweise durch Western-Blotting), kann Bindung des
exprimierten Mimetikums an Klasse-I-MHC-Moleküle in einem Antigenspezifischen
In-vitro-T-Zellaktivitätstest
bestätigt
werden.
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Arbeitsvorschriften
für solche
Tests sind durchwegs bekannt und werden daher hierin nicht im Detail
beschrieben. Einen Überblick
hierzu können Fachleute
jedoch in Coligan et al., "Current
Protocols in Immunology",
Abschnitt 3.11, Wiley & Sons
(1994) (insbesondere im Abschnitt 3.11.2, der grundlegenden Arbeitsvorschrift
zum Testen von lytischer Aktivität
von T-Zellen als Reaktion auf Stimulierung durch MHC-Antigene),
finden. Bezüglich
einer Quelle von Antwortzellen, die Antigen-Processing und Präsentationsmechanismen
in menschlichen APCs vorhersagen, gilt festzuhalten, dass für solche
Mechanismen gezeigt wurde, dass sie zwischen murinen und simianen
Spezies hoch konserviert sind (siehe z.B. Shastri et al., s.o.,
2727-2728), sodass Maus- oder nicht menschliche Primatenzellen geeignete
Modelle zur Verwendung in T-Zellaktivitätstests sind, um Tumor-assoziierte
Antigen-nachahmende Präsentation durch
menschliche APCs vorherzusagen.
-
In ähnlicher
Weise sind murine und nicht-menschliche Primatenmodelle für die Vorhersage
von In-vivo-CTL-Antworten auf APCs, die in vivo gemäß dem Verfahren
der Erfindung transfiziert wurden, geeignet; d.h. für die Vorhersage,
ob solche APCs CTL-Antworten gegen Tumor-assoziierte Antigene an
Tumorzellen im Wirt stimulieren können oder nicht. Am praktischsten
ist, wenn ein Modell zur Bestimmung von Antigen-spezifischer CTL-Aktivität die Verwendung
von Rezipienten-Mäusen
ohne endogene aktive T-Lymphozyten umfasst; z.B. Nacktmäuse oder
bestrahlte Mäuse.
Passive Immunisierung von Tumor-assoziierten, Antigen-geprimten
CTLs in Mäuse,
in die Tumorzellen aus einem Wirt oder einer Zelllinie eingeführt wurden,
ermöglicht
In-vivo-Bewertung der lytischen Fähigkeit der transferierten
CTLs gegenüber
den Tumorzellen (siehe z.B. die Standard-Arbeitsvorschriften für passive
Immunisierung, CTL-Erschöpfung
und In-vivo-T-Zellaktivitätstests, die
in Coligan et al., "Current
Protocols in Immunology",
s.o., Abschnitt 4.1, beschrieben werden; siehe auch Shastri et al.,
s.o., S. 2734 [basierend auf Schätzungen
verarbeiteter Peptide, die aus APCs isoliert wurden, und der Anzahl
an Peptid-gebundenen MHC daran, die aus Scatchard-Diagrammen extrapoliert
wurde, liegt die minimale Anzahl an Peptid/MHC-Komplexen, die für T-Zellstimulierung in vivo erforderlich
ist, im Bereich zwischen 100 und 1.000 Kopien/Zelle]).
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Unter
Verwendung des oben beschriebenen Screening-Verfahrens können Tumor-assoziierte, für Antigenmimetikum
kodierende Polynucleotide zur Verwendung in Krebsimmuntherapie gemäß der Erfindung
oder zur Bildung von Antikörpern
für Verwendungen
wie Affinitätsreinigung
von Tumor-assoziierten Antigenen und Mimetika identifiziert und
konstruiert werden.
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C. Verfahren für Krebsimmuntherapie
durch Verabreichung von nackten Polynucleotiden, die operativ für Tumor-assoziierte
Antigene und Tumor-assoziierte Antigenmimetika kodieren
-
(1) Verabreichung des
operativ kodierenden Polynucleotids als nacktes Polynucleotid gemäß der Erfindung
-
Verfahren
zur Verabreichung von operativ kodierenden, nackten Polynucleotiden
gemäß der Erfindung
werden in Abschnitt I(C), oben, beschrieben. Die Haut ist eine wirksame
Stelle für
die Verabreichung nackter Polynucleotide, die für die Antigene von Interesse
kodieren, zur Behandlung einer bestimmten Malignität. Dieser
Bereich des Körpers
ist eine Stelle, an der die meisten Viren und andere Antigene, die
CTL-Antworten induzieren,
zuerst auf den Wirt treffen. Zufällig
sind diese Stellen auch jene außerhalb
des lymphatischen Systems, die dazu neigen, die höchsten Konzentrationen
an APCs zu enthalten (z.B. etwa 1-2 % der Zellen in der Epidermis sind
Makrophagen und dendritische Zellen).
-
Die
nackten, Tumor-assoziierten, Antigen-kodierenden Polynucleotide
der Erfindung werden gemäß medizinisch
an Krebsimmuntherapie angepassten Parametern – z.B. den Verlauf der Behandlung
und das Geringhalten von Nebenwirkungen betreffend – verabreicht.
Vorzugsweise wird das Verfahren der Erfindung verwendet, um nach
Entfernung des Organs oder Gewebes, in dem der Tumor vorhanden war,
eine Tumor-assoziierte, Antigen-spezifische CTL-Antwort gegen restliche,
das Antigen aufweisende Tumorzellen zu stimulieren. Am bevorzugtesten
wird das Verfahren der Erfindung verwendet, um eine Tumor-assoziierte,
Antigen-spezifische CTL-Antwort gegen Tumorzellen in Geweben des Wirts,
die eine relativ hohe Konzentration an APCs in sich aufweisen, d.h.
Haut im Fall der vorliegenden Erfindung, zu stimulieren.
-
Auf
dem Gebiet der Erfindung wurde berichtet, dass T-Lymphozytentoleranz
gegenüber
Selbstantigenen wirksamer durch Co-Immunisierung des Wirts mit Selbstantigenen
und Fremdantigenen, die Selbstantigenen ähnlich sind, gebrochen wird
(siehe Mamula et al., J. Immunol., s.o., 1456). Somit wird der Wirt,
um den Abbau von T-Lymphozytentoleranz gegenüber dem
Tumor-assoziierten Antigen im Wirt zu optimieren, vorzugsweise mit
Polynucleotiden behandelt, die sowohl für homologe als auch für heterologe,
Tumor-assoziierte Antigene kodieren.
-
Gegebenenfalls
wird der Wirt mit Tumor-assoziierten-Antigen-Protein-Vakzinen (gemäß medizinisch
zugelassenen Parametern für
Krebsimmuntherapie) co-immunisiert, um Unterstützung durch Helfer-T-Lymphozyten
und/oder mit für
Cytokin kodierenden Polynucleotiden zu stimulieren, um die Leistung
des Immunsystems des Wirts zu steigern (siehe z.B. Abschnitt I,
oben, und Caligiuri et al., J. Clin. Invest. 91, 123-132 (1993)
[Infusionen von rekombinantem IL-2-Protein an Patienten mit fortgeschrittenen
Krebserkrankungen]).
-
Da
jedoch die Entwicklung von löslichen
Anti-Tumor-assoziierten-Antigen-Antikörpern mit der Freisetzung von
löslichem
Antigen einhergeht (was das Risiko einer Störung der CTL-Aktivität und einer Förderung
von Immunkomplexkrankheit birgt), induziert die bevorzugte praktische
Ausführung
der Erfindung CTLs, ohne Antikörperbildung
zu induzieren (durch Vermeiden der extrazellulären Freisetzung von löslichem
Antigen, wie zuvor erläutert).
-
In
Beispiel IX wurden Antigen-kodierende Polynucleotide zur Expression
in APCs gemäß der Erfindung
Mäusen
intradermal verabreicht. Wie in den 11 und 12 gezeigt,
wurden Antigen-spezifische CTLs in Seren aus den Mäusen nach Injektion
nachgewiesen, wobei jedoch keine Antikörper, die mit dem injizierten
Antigen reaktiv sind, nachgewiesen wurden. Hierzu gilt anzumerken,
dass die Erfinder zeigten, dass die Verabreichung von Antigenen
gemäß dem Verfahren
der Erfindung selektiv die Produktion von TH1-Lymphozyten bevorzugt
gegenüber
TH2-Lymphozyten verstärkt
(siehe Beispiele XI und XII). Somit stimuliert das Verfahren der
Erfindung die Tumor-assoziierte,
Antigen-spezifische CTL-Antwort, die für wirksame Krebsimmuntherapie
erforderlich ist, ohne Autoantikörperproduktion
(d.h. gegen Tumor-assoziierte Selbstantigene im Wirt) zu stimulieren.
-
Insbesondere
die Beispiele IX-XIII, die nachstehend bereitgestellt werden, sind
Veranschaulichungen der vorliegenden Erfindung. Jene Beispiele, die,
wie angemerkt, "zur
Information" bereitgestellt werden,
beziehen sich auf Inhalte, die nicht unmittelbar in den Schutzumfang
der vorliegenden Erfindung fallen.
-
BEISPIEL I (zur Information)
-
ÖRTLICHE
VERZÖGERTE ÜBEREMPFINDLICHKEITSREAKTIONEN
IN MÄUSEN
TRETEN NACH INTRAMUSKULÄREN
INJEKTIONEN VON NACKTEM POLYNUCLEOTID AUF
-
Obwohl
(in Übereinstimmung
mit früher
berichteten Resultaten) intramuskuläre Injektion von nackter Plasmid-cDNA
zu Expression von Peptiden, für
die Polynucleotide kodieren, führt,
ruft sie (im Gegensatz zu früher
berichteten Resultaten) auch eine Immunantwort auf das Gen im Muskelgewebe
hervor. Bei Co-Injektion von 2 Plasmiden wird diese Entzündungsreaktion
chronisch und weist Myonekrose auf. Beide Reaktionen stimmen mit
einer Diagnose einer örtlichen
verzögerten Überempfindlichkeitsreaktion
auf das Gen an seinem Eintrittspunkt, d.h. im Muskelgewebe, überein.
Im Gegensatz zu früheren Annahmen
ist es diese Entzündungsreaktion,
und nicht die Aufnahme durch Muskelzellen, die wahrscheinlich (wenn
auch nicht alleine) für
Expression von nackten Polynucleotiden nach intramuskulären Injektionen
davon verantwortlich ist.
-
Um
die Immunantwort zu veranschaulichen, die durch intramuskuläre Injektion
von nackter cDNA hervorgerufen wurde, wurden pREVk3 und pRSVIL2 wie
folgt hergestellt.
-
Herstellung
von Plasmiden. Ein neu angeordnetes κ-Leichtgen aus einem menschlichen
Patienten mit chronischer lymphozytischer Leukämie wurde isoliert, das ein
Humkv 325 enthält
(das für den
17.109-kreuzreaktiven Idiotyp kodiert, der üblicherweise von IgM-Autoantikörpern und
chronischen lymphozytischen Leukämiezellen
exprimiert wird). Dieses Gen ist auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und
wird beispielsweise in Martin et al., J. Exp. Med. 175, 983 (1992),
beschrieben, wobei dieser Artikel durch diesen Verweis hierin aufgenommen
ist.
-
Ein
1040 bp umfassendes HindIII-XhoI-Fragment, das die V-J-Region dieses
Gens enthielt, wurde ausgeschnitten und in die Polyklonierungsstelle des
Säugetier-Expressionsvektors
pREP7 (Invitrogen, San Diego, CA), stromab der langen terminalen Wiederholung
(LTR) des Rous-Sarkum-Virus (RSV) insertiert, um einen Vektor zu
bilden, der als pREVk3 bezeichnet wurde. Stromab des neu angeordneten JK1-Segments
ist ein natürliches
Stoppcodon vorhanden, das Translation beendet.
-
Um
einen IL-2-Expressionsvektor, bezeichnet als pRSVIL-2, zu bilden,
wurde die Luciferase-cDNA im Vektor pRSVL (Wolff et al., Science
247, 1465 (1990)) durch ein 680 bp umfassendes HindIII-BamHI-Fragment
aus pBC12/HIV/IL-2 (American Type Culture Collection, Nr. 67618)
gemäß dem Verfahren,
das in Cullen, Cell 46, 937 (1986), beschrieben wird, ersetzt. Die
Quellenverweise auf Wolff et al. und Cullen sind hierin aufgenommen,
um das Wissen auf dem Gebiet der Erfindung bezüglich der Konstruktion dieser
Expressionsvektoren zu veranschaulichen.
-
Intramuskuläre Injektion
von Plasmid-cDNA in Mäuse.
Acht Wochen alte BALB/c-Mäuse wurden mit
Methoxyfluran anästhesiert.
Plasmid-cDNA (100 μg
pro Injektion) wurde in 100 μl
Kochsalzlösung
suspendiert und wurde dann durch eine 28-Gauge-Nadel in wöchentlichen Intervallen viermal
in die Quadrizepsmuskeln injiziert. Eine Gruppe von sechs Mäusen erhielt
100 μg pREVk3.
Eine andere Gruppe von sechs Mäusen
erhielt 100 μg
jeweils von pREVk3 und pRSVIL-2, während eine dritte Gruppe 100 μg Kochsalzlösung alleine
erhielt. Kurz vor jeder Injektion wurden Blutproben aus den Orbitalarterien
genommen.
-
ELISA
zur Überprüfung von
In-vivo-Genexpression durch die Plasmide. Antikörper gegen Humkv325-Produkte
wurden durch ELISA (enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung)
gemessen. Für
den IgM-Rheumafaktor Glo kodiert das Humkv325-Gen, und dieser Faktor weist 17.109-Idiotyp-positive κ-Leichtketten
auf. Das gereinigte Protein wurde bei 10 μg/ml in 0,1 M Borat, 0,2 M NaCl,
pH 8,2 (d.h. in gepufferter Boratkochsalzlösung oder BBS) aufgelöst, und
anschließend
wurden 100 μl
Aliquote zu den Wells der Kunststoff-Mikrotiterplatten zugesetzt.
Nach Inkubation über
Nacht bei 4 °C
wurden die Platten zweimal mit BBS, die 0,5 % Tween-20 enthielt,
(BBS/Tween) gewaschen und mit BBS, ergänzt mit 1 % Rinderserumalbumin,
(BBS/BSA) vier Stunden lang bei Raumtemperatur gequencht. Nach zweimaligem
Waschen mit BBS/Tween wurden die in Serie in BBS/BSA verdünnten Proben
in zweifacher Ausführung
auf die Wells aufgeteilt. Nach dreistündiger Inkubation bei Raumtemperatur
wurden die Platten viermal mit BBS/Tween gewaschen und wurden dann
mit biotinyliertem Ziege-Anti-Maus-IgG (Kirkegaard & Perry, Gaithersburg,
MD), verdünnt
auf 1:2.000 in BBS/BSA, inkubiert. Eine Stunde später wurden
die Platten viermal mit BBS/Tween gewaschen und mit 25 μl TMB-Peroxidasesubstrat
(Kirkegaard & Perry)
inkubiert. 30 min später
wurde Absorption bei 450 nm in einem Mikroplattenleser (Molecular
Devices, Menlo Park, CA) gemessen. Um den Antikörpergehalt in den Immunseren
zu bewerten, wurden die Resultate mit einer Standardkurve verglichen,
die mit monoklonalem Antikörper
17.109 erstellt wurde (siehe z.B. die Beschreibung dieses mAb von
Carson et al., Mol. Immunol. 20, 1081-1087 (1983)).
-
Diese
Tests zeigten, dass Produktion der Antikörper von Interesse gesteigert
wurde, wodurch Expression der Gene durch die Plasmide bestätigt war.
-
Histologische
Bewertung. An Tag 49 wurden die mittels intramuskulärer Injektion
behandelten Mäuse
getötet.
Muskeln, in die die Gene injiziert worden waren, wurden in 10 %
Formalin fixiert und für histologische
Bewertung verarbeitet.
-
Schnitte
von Muskeln, denen pREVk3 und pRSVIL2 co-injiziert wurden, zeigten
chronische Entzündung
und Myonekrose, was mit einer örtlichen, verzögerten Über empfindlichkeitsreaktion übereinstimmte
(1A und B). Im Gegensatz dazu wiesen Muskel, denen
pREVk3 oder pRSVIL2 alleine injiziert wurde, ein Lymphinfiltrat
auf, das an der Stelle der subkutanen Injektion angeordnet war (1C).
-
BEISPIEL II (zur Information)
-
GENEXPRESSION NACH INTRADERMALER
INJEKTION EINES NACKTEN POLYNUCLEOTIDS
-
Um
Alternativen zu intramuskulären
Injektionen nackter Polynucleotide zu erforschen, wurde Mäusen ein
nacktes cDNA-Plasmid intradermal injiziert. Genexpression wurde
beobachtet und gemessen.
-
Das
Gen für
Influenza-Ribonucleoprotein (RNP) wurde in ein pCMV-Plasmid wie
zuvor beschrieben subkloniert. RNP-Gene aus zahlreichen Influenza-Stämmen sind
auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und sind im Vergleich zu verschiedenen
Stämmen
bezüglich
ihrer Sequenz hoch konserviert (siehe z.B. Gorman et al., J. Virol.
65, 3704 (1991)).
-
Vier
acht Wochen alten Balb/c-Mäuse
wurden dreimal 15 μg
pCMV-RNP, suspendiert in 100 μl HBSS,
injiziert. Injektionen erfolgten intradermal am Ansatz des Schwanzes
in Intervallen von zwei Wochen. Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL)
erkennen vorhandene Antigene durch Klasse-I-MHC-Moleküle und spielen
eine wichtige Rolle in der Eliminierung von virusinfizierten Zellen.
Intramuskuläre
(i.m.) Immunisierung mittels cDNA-Expressionsvektoren sollte ein
wirksames Verfahren zur Einführung
von Antigen in Klasse-I-MHC-Moleküle und folglich zur Stimulierung
von CTL-Antworten sein. In dieser Studie induzierte intradermale
(i.d.) Injektion eines Plasmids, das das Influenza-Nucleoprotein-(NP)Antigengen
enthält,
sowohl NP-spezifische CTL als auch hohe Titer an Anti-NP-Antikörpern. Diese
Antikörper erreichten
ein Maximum sechs Wochen nach Injektion und blieben, ohne lokale
Entzündung,
zumindest 28 Wochen lang unverändert.
-
Plasmid-DNA
wurde durch CsCl-Bänderung in
der Gegenwart von Ethidiumbromid gereinigt und wurde gefroren in
10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0, gelagert. Vor der Injektion
wurde das Plasmid in Ethanol ausgefällt und in normaler Kochsalzlösung, die
0,1 mM EDTA enthielt, aufgelöst.
-
Die
Gegenwart von Anti-NP-IgG in Serum wurde mittels ELISA, im Wesentlichen
wie in Viera et al., Int. Immunol. 2, 487 (1990), beschrieben, gemessen.
Die Resultate dieses Tests sind in 2A gezeigt;
alle Tiere entwickelten Anti-NP-Antikörper mit hohem Titer, der länger als
20 Wochen anhielt. Wie in 2B gezeigt,
schienen die intradermalen Injektionen etwa vierfach höhere Antikörpertiter
als intramuskuläre
Injektionen (verabreicht wie in Beispiel I beschrieben) gleicher
Mengen an Plasmid-DNA
zu ergeben.
-
Die
Achsen aus 2 stehen jeweils für den ELISA-Titer
(Mittelwert, 1 Unze) über
Zeit. Serumverdünnung
für alle
Diagrammpunkte beläuft
sich auf 2.560.
-
BEISPIEL III (zur Information)
-
GENEXPRESSION NACH INTRANSALAER
EINFÜHRUNG
EINES NACKTEN POLYNUCLEOTIDS
-
Unter
Verwendung desselben Plasmids (pCMV-RNP) in derselben HBSS-Suspension
wie in Beispiel II beschrieben wurde nacktes Polynucleotid, das
für Influenza-Ribonucleoprotein
kodierte, in Balb/c-Mäuse
in 3 Gruppen mit 6 Tieren intranasal eingeführt. Konzentrationen von Anti-NP-IgG
in peripherem Blut vor und nach Einführung des Plasmids bei verschiedenen
Serumverdünnungen
wurden mittels ELISA, wie in Beispiel II beschrieben, gemessen. Blut
wurde jeder Maus nach intranasaler Einführung 6 Wochen später abgenommen.
-
3 zeigt
in einem Diagramm die Resultate des ELISA-Tests vor und nach intranasaler
Einführung
des Plasmids. Die Diagramme zeigen ELISA-Titer über Serumverdünnung. In 3 sind
Werte für einzelne
Mäuse aus
jeder Gruppe (Nr. 1-3) und ein Mittelwert für alle Mäuse aus jeder Gruppe (Nr. G1-G3)
gezeigt.
-
Ohne
Anästhesie
zeigten Mäuse
in einer zweiten Gruppe, die 3 × 7,5 μg Plasmid
erhielten, im Vergleich zu Hintergrund erhöhte Antikörpertiter (3).
Diese Daten sind in 4 gezeigt.
-
Eine
dritte Gruppe von Mäusen
erhielt dasselbe Ausmaß an
Plasmiden unter Anästhesie.
Expression von RNP, wie durch die Titer von Anti-NP-IgG angezeigt
wird, in diesen Mäusen
war im Wesentlichen der Expression ähnlich, die in den nicht anästhesierten
Mäusen
erzielt wurde. Die Daten für die
anästhesierten
Mäuse sind
in 5 gezeigt.
-
Expression
kann durch zusätzliche
Verwendung von Absorptionspromotoren gesteigert und durch zeitausgelöste Promotoren,
deren Identität
und Verwendung auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie jene,
die in Chien, s.o., in Kap. 5 vorgeschlagen werden, verlängert werden.
-
BEISPIEL IV (zur Information)
-
HISTOLOGISCHE STUDIEN,
DIE ZELLAUFNAHME NACKTER POLYNUCLEOTIDE DURCH EINKERNIGE ZELLEN
AM EINTRITTSPUNKT DER HAUT ZEIGEN
-
Drei
Tage nach intradermaler Injektion der Enden von nacktem pCMV/lacz
in Balb/c-Mäuse wurden
die Mäuse
getötet.
Gewebekulturen wurden am Eintrittspunkt für das Plasmid abgenommen und
wurden auf E.-coli-β-Galactosidaseaktivität gefärbt. Eine Photographie
(40fache Vergrößerung)
eines Objektträgers
aus der histologischen Untersuchung von diesen Kulturen ist in 6 zu
sehen.
-
Wie
in 6 gezeigt, wird für die Aufnahme des Plasmids
(in Blau) gezeigt, dass sie durch einkernige Zellen erfolgt. Die
Fibroblasten in den Gewebeproben sind nicht gefärbt, was darauf hinweist, dass das
Plasmid durch diese Zellen nicht aufgenommen wurden. Die rundlichen,
einkernigen Zellen, die das Plasmid aufnahmen, scheinen Makrophagen und/oder
Antigen-präsentierende
Zellen zu sein, was darauf hinweisen würde, dass die Aufnahme des Plasmids
durch Phagozytose erfolgt.
-
BEISPIEL V (zur Information)
-
EPIDERMALE
VERABREICHUNG EINES NACKTEN POLYNUCLEOTIDS UNTER VERWENDUNG EINES
MECHANISCHEN REIZSTOFFES, UM EINE IMMUNANTWORT HERVORZURUFEN
-
7 zeigt
die Resultate einer ELISA, die wie in Beispiel I beschrieben durchgeführt wurde,
bezüglich
Serumkonzentrationen an Anti-NP-IgG nach epidermaler Verabreichung
von pCMVRNP über
mechanische Mittel.
-
Das
Plasmid wurde auf die Zinken einer unbeschichteten MONO-VACC®-Vorrichtung,
wie oben beschrieben, aufgeschichtet. (Es gilt anzumerken, dass
es alternativ für
die nackten Polynucleotide auch möglich ist, für längere Lagerstabilität, auf die Zinken
der Vorrichtung lyophilisiert zu werden.) Die gesamte Plasmidkonzentration
an allen Vorrichtungszinken betrug etwa 50 μg in einem isotonischen normalen
Kochsalzlösungsträger (etwa
150 μg Plasmid
pro ml). Der Rücken
einer Balb/c-Maus wurde geschoren, und die geschorene Haut wurde
mit der Zinkenvorrichtung leicht angekratzt. Wie in 7 gezeigt,
wurde Anti-NG-IgG daraufhin in Serum nachgewiesen (an Tag 42 z.B.
enthielt das Serum aus dieser Maus Antikörper als einen Titer von 1:10.240.).
-
BEISPIEL VI (zur Information)
-
EPIDERMALE VERABREICHUNG
EINES NACKTEN POLYNUCLEOTIDS UNTER VERWENDUNG EINES CHEMISCHEN MITTELS,
UM EINE IMMUNANTWORT HERVORZURUFEN
-
8 zeigt
die Resultate einer ELISA, die wie in Beispiel I beschrieben für Serumkonzentrationen
von Anti-NP-IgG nach epidermaler Verabreichung von pCMVRNP in Verbindung
mit der Anwendung eines chemischen Mittels durchgeführt wurde.
-
Das
Plasmid wurde in 40 μg
einer isotonischen normalen Kochsalzlösung, die etwa 150 μg Plasmid
pro ml enthielt, suspendiert. Diese Lösung wurde am nichtadhäsiven Kissen
eines BAND-AID-Brandverbandes (Johnson & Johnson) absorbiert.
-
Eine
Balb/c-Maus wurde wie in Beispiel V beschrieben geschoren, und ein
handelsübliches
keratinolytisches Mittel (hierein die zuvor beschriebene Enthaarungscreme,
die unter dem Handelsnamen NAIR verkauft wird) wurde auf die geschorene
Haut aufgetragen. Nach mehreren Minuten wurde das keratinolytische
Mittel von der Haut abgewaschen, und der plasmidhältige Verband
wurde darüber
angelegt. Wie in 8 gezeigt entwickelte das behandelte
Tier Serum-Anti-NP-IgG bei einem Titer von 1:640.
-
BEISPIEL VII (zur Information)
-
IMMUNANTWORT AUF VIRUS-CHALLENGE
VON MÄUSEN,
DENEN INTRADERMAL NACKTES pCMVRNP VERABREICHT WURDE
-
Um
zu testen, ob die durch Impfung mit geeigneten nackten Polynucleotiden
entstandene Immunität
Tiere vor einem letalen Virus-Challenge schützen konnte, wurde Gruppen
von 10 Balb/c-Mäusen
intradermal dreimal 15 μg
eines pCMVRNP-Plasmids injiziert, das das NP-Gen aus einem H1N1-Stamm
von Influenza-Virus (A/PR/8/34; bereitgestellt von Dr. Inocent N.
Mbawuike vom Baylor College of Medicine, USA) enthielt. Kontrollgruppen
umfassten Tiere, denen nichts injiziert wurde, sowie Tiere, denen
ein irrelevantes Plasmid (pnBL3) injiziert wurde.
-
Sechs
Wochen nach den anfänglichen
Plasmidinjektionen wurden die Tiere mit einer LD90-Dosis eines
H3N2-Influenza-Stamms (A/HK/68; ebenfalls von Dr. Mbawuike bereitgestellt)
provoziert. Intradermal geimpfte Mäuse waren vor dem Challenge
im Vergleich zu nicht geimpften Kontrollmäusen (P<0,01) signifikant geschützt; siehe 9 (eine
Kaplan-Meyer-Überlebenskurve).
-
BEISPIEL VIII (zur Information)
-
RELATIVE KONZENTRATIONEN
AN GENEXPRESSION NACH INTRADERMALEN INJEKTIONEN VON NACKTES-ZYTOMEGALIE-VIRUS-
ODER ROUS-SARKOM-VIRUS-PROMOTOR-HÄLTIGEN, NACKTEN PLASMIDEN
-
Die
mögliche
Wirkung der in einem Expressionsvektor verwendeten Promotorregion
wurde durch Testen von zwei Plasmiden, die das RNP-Gen wie in Beispiel
II beschrieben enthalten, bewertet. Ein Plasmid, pCMVRNP, enthielt
den unmittelbar frühen
Promotor, die Enhancer- und Intronregion von Zytomegalie-Virus.
Das andere Plasmid enthielt den Promotor aus der Rous-Sarkom-Virus-LTR-Region
(pRSVRNP). Wie in 10 gezeigt waren Antikörperantworten
des NP-Protein, das von den Plasmiden exprimiert wurde, nach intradermalen
Injektionen mit dem CMV-Promotor konstant höher. Dies steht im Gegensatz
zu den Anfworten, die nach intramuskulärer Injektion des NP-Gens beobachtet
wurden, worin die durch die zwei Plasmide produzierten Antikörperkonzentrationen äquivalent
waren (Daten nicht dargestellt).
-
BEISPIEL IX
-
SELEKTIVE
INDUKTION VON ZYTOTOXISCHEN T-LYMPHOZYTEN-ANTWORTEN NACH INTRADERMALER
VERABREICHUNG VON NACKTEN POLYNUCLEOTIDEN
-
Mäusen des
C57/B6-Stamms wurden intradermal in den Schwanz 100 μg nackte
DNA, gereinigt aus einem CDM8-Ova-Plasmid (im Detail in Shastri et
al., J. Immunol. 150, 2724-2736 (1993), beschrieben), in Intervallen
von zwei Wochen verabreicht. Das CDM8-Ova-Plasmid enthält die cDNA
voller Länge
(1,8 kb) für
Ovalbumin.
-
Zwei
Wochen nach der zweiten Genverabreichung wurden die Milzen der Mäuse entfernt
und in vitro mit letal bestrahlten (3.000 Rad) syngenetischen Splenozyten,
die mit einem synthetischen Ovalbuminpeptid (SIIMFEKL) gepulst wurden
waren, kultiviert. Dieses Peptid ist ein eingeschränktes Klasse-I-Target
für zytotoxische
T-Zellen in Mäusen
mit dem Histokompatibilitätshaplotyp
Kb, der von Shastri et al. beschrieben wird.
Nach fünf
Tagen Kultur wurden die Zellen mit Targets zweier Typen inku biert,
um auf die Bildung zytotoxischer T-Zellen durch die Mäuse, die
das für
Ovalbumin kodierende Gen erhalten hatten, zu testen. Die Targets
waren Maus-EL-4-Lymphozyten, die mit dem synthetischen Ovalbuminpeptid
gepulst worden waren, oder EL-4-Zellen, die mit der cDNA für Ovalbumin
stabil transfiziert worden waren (siehe 11;
die cDNA für
Ovalbumin ist in der Figur als "EG7" bezeichnet). Die
prozentuelle Lyse der zwei Targets wurde für verschiedene Effektor:Target-Verhältnisse
(in 11 als "E:T-Verhältnis" bezeichnet) bestimmt. Wie in 11 gezeigt, hatten die Tiere, die das
nackte CDM8-Ova-Plasmid erhalten hatten, zytotoxische T-Zellen produziert,
die für
die Ovalbumintargets (d.h. für
EL-4 mit dem Ovalbuminpeptid und für EG7) spezifisch waren, jedoch
für die
Kontroll-EL-4-Zellen (d.h. jene ohne das Ovalbuminpeptid) nicht
spezifisch waren.
-
C57/B6-Mäuse, die
intradermal mit CDM8-Ova-Plasmiden geimpft worden waren, wurden
auch auf Antikörper
gegen Ovalbumin gescreent. Seren, die sechs Wochen nach Verabreichung
der CDM8-Ova-Plasmide abgenommen wurden, enthielten keine nachweisbaren
Konzentrationen an Antikörper
(wie unter Verwendung von enzymgekoppelter Immunadsorptionsbestimmung
an Mikrotiterplatten, die mit Ovalbumin beschichtet waren, gemessen
wurde; siehe 12). Insgesamt zeigen diese
Daten auf, dass die Verfahren zur Verabreichung nackter Polynucleotide
der Erfindung eingeschränkte
zytotoxische MHC-Klasse-I-T-Zellen (hierin gegen Ovalbumin) induzieren,
ohne jedoch Antikörperproduktion
zu induzieren.
-
BEISPIEL X
-
VERLÄNGERTES IMMUNOLOGISCHES GEDÄCHTNIS NACH
INTRADERMALER VERABREICHUNG NACKTER POLYNUCLEOTIDE, INDUZIERT DURCH
ANTIGENSTIMULIERUNG VON T-ZELLEN
-
0,1,
1, 10 und 100 μg
nackte Polynucleotide in Plasmidform (0,5-5 ng/1 mg DNA-Endotoxingehalt),
die unter der Steuerung des CMV-Promotors ("pCMV Lac-Z") für
die E.-coli-Enzym-β-Galactosidase
kodierten, wurden Gruppen von 4 Mäusen (nach Dosierung und Art
der Verabreichung eingeteilt) entweder intramuskulär ("IM") oder intradermal
("ID") verabreicht. Zu
Vergleichszwecken erhielt eine andere Dosierungsgruppe von 4 Mäusen 100 μg β-Galactosidaseprotein
("PR") intradermal verabreicht.
Alle Injektionen wurden unter Verwendung von 50 μl normaler Kochsalzlösung als
Träger
hergestellt. IM- und ID-Injektionen wurden mit einer 0,5-ml-Spritze
und einer 28,5-Gauge-Nadel verabreicht. Antikörper wurden hiernach durch
enzymgekoppelten Immunadsorptionstest in Intervallen von zwei Wochen
gemessen.
-
Kurz
zusammengefasst wurden Gesamt-Antikörper unter Verwendung von β-Galactosidase
(Calbiochem, CA) als Festphasenantigen gemessen. Mikrotiterplatten
(Costar, Cambridge, MA) wurden mit 5 μg Antigen, aufgelöst in 90
mM Borat (pH 8,3) und 89 mM NaCl (d.h. gepufferter Boratkochsalzlösung; BBS), über Nacht
bei Raumtemperatur beschichtet und über Nacht mit 10 mg/ml Rinderserunalbumin
in BBS blockiert.
-
Serumproben
wurden seriell in BBS verdünnt,
beginnend bei einer 1:40-Verdünnung
in den ersten 8 Wochen und anschließend mit einer 1:320-Verdünnung. Diese
Proben wurden zu den Platten zugesetzt und über Nacht bei Raumtemperatur
gelagert. Platten wurden in BBS + 0,05 % Polysorbat 20 gewaschen
und dann mit einer 1:2.000-Verdünnung
von mit alkalischer Phosphatase markiertem Ziege-Anti-Maus-IgG-Antikörper (Jackson
Immunoresearch Labs., West Grove, PA) 1 h lang bei Raumtemperatur
umgesetzt, oder sie wurden mit einer 1:2.000-Verdünnung von
mit alkalischer Phosphatase markiertem Ziege-Anti-Maus-IgG1-Antikörper (Southern
Biotech, AL) umgesetzt, oder sie wurden mit einer 1:500-Verdünnung von
mit alkalischer Phosphatse markiertem Ratte-Anti-Maus-IgG-2A-Antikörper (Pharmingen,
CA) unter denselben Bedingungen umgesetzt. Die Platten wurden wiederum
gewaschen, und anschließend
wurde eine Lösung
von 1 mg/ml p-Nitrophenolphosphat (Boehringer-Mannheim, Indianapolis,
IN) in 0,05 M Carbonatpuffer (pH 9,8), der 1 mM MgCl2 enthielt,
zugesetzt. Absorption bei 405 nm wurde 1 h nach Zusatz von Substrat
zu den Platten abgelesen.
-
Wie
in 13 gezeigt, wurden Antikörperantworten von äquivalenter
Größenordnung
in den Tieren induziert, die die pCMV-Lac-Z-Plasmide durch ID-Injektion
erhalten hätten,
und in den Tieren, die das PR erhalten hatten, während schwächere Antikörperantworten in den Tieren
gemessen wurden, die die pCMV-Lac-Z-Plasmide durch IM-Injektion erhalten
hatten.
-
Um
sie auf T-Zell-Gedächtnis
zu bewerten, wurden die Tiere mit 0,5 μg PR an einer anderen Stelle
durch ID-Injektion geboostet. Hätten
diese Tiere Gedächtnis-T-Zellen
entwickelt, um die Produktion von Antikörper gegen β-Galactosidase zu steuern, so wäre anzunehmen,
dass sie eine stärkere
Immunantwort nach dem Boosten mit löslichem Proteinantigen als
in Reaktion auf die erste Dosis Antigen zeigen würden.
-
Wie
in 14 gezeigt, ist eindeutig, dass die Tiere, die
ID-Injektionen von pCMV-Lac-Z-Plasmid erhalten
hatten, ein wesentlich besseres immunologisches Gedächtnis entwickelt
hatten als Tiere, die entweder IM-Injektionen von Plasmid oder PR
erhalten hatten. Darüber
hinaus hielt das Gedächtnis,
das die ID-injizierten Tiere entwickelt hatten, mindestens etwa
12 Wochen an.
-
BEISPIEL XI
-
SELEKTIVE INDUKTION EINER
TH1-ANTWORT NACH INTRADERMALER VERABREICHUNG NACKTER POLYNUCLEOTIDE
-
In
Mäusen
sind IgG-2A-Antikörper
serologische Marker für
eine TH1-Typ-Immunantwort, während
IgG-1-Antikörper
ein Hinweis auf eine TH2-Typ-Immunantwort sind. TH2-Antworten umfassen
die Klasse der Allergie-assoziierten IgE-Antikörper; lösliche Proteinantigene neigen
dazu, relativ starke TH2-Antworten zu stimulieren. Hingegen werden
TH1-Antworten durch Antigenbindung an Makrophagen und dendritische
Zellen induziert. TH1-Antworten sind bei der Behandlung von Allergien
und AIDS von besonderer Bedeutung.
-
Um
zu bestimmen, welche Antwort, sofern es überhaupt eine gäbe, von
Mäusen
produziert werden würde,
die nackte Polynucleotide gemäß der Erfindung
erhielten, wurden Mäuse
mit pCMV-Lac-Z-Protein wie im vorangehenden Beispiel beschrieben
geimpft. In Intervallen von zwei Wochen wurden jegliche IgG 2A und
IgG 1 gegen β-Galactosidase
durch enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (unter Verwendung
von Antikörpern,
die für
die IgG-1- und IgG-2A-Unterklassen spezifisch waren) auf Mikrotiterplatten,
die mit dem Enzym beschichtet waren, gemessen.
-
Wie
in 15 gezeigt, produzierten nur zwei Mäuse, die
das Plasmid durch ID-Injektion erhielten, hohe Titer an IgG-2A-Antikörper. Wie
in 16 gezeigt, induzierte die Immunisierung der Mäuse mit dem
Enzym selbst ("PR") die Produktion
von relativ hohen Titern an IgG-1-Antikörpern. In den IM injizierten
Mäusen
wurden geringe Titer sowohl an IgG-2A- als auch an IgG-1-Antikörpern ohne
eindeutige Selektivität
produziert. Die in den Figuren gezeigten Daten umfassen Mittelwerte
der für
jede Gruppe an 4 Mäusen
erhaltenen Werte.
-
Um
die Stabilität
der Antikörperantwort
im Laufe der Zeit zu bestimmen, wurde dieselbe Gruppe an Tieren
mit 0,5 μg
Enzym, das intradermal injiziert wurde, geboostet. Wie in den 17 und 18 gezeigt,
induzierte das Boosten von mittels ID-Injektion geprimten Tieren
mit dem Enzym einen beinahe 10fachen Anstieg der IgG-2A-Antikörperantworten (d.h.
der Antikörpertiter
stieg von 1:640 auf 1:5120), stimulierte jedoch keine IgG-1-Antwort.
Diese Daten weisen darauf hin, dass die selektive TH1-Antwort, die
durch ID-Verabreichung nackter Polynucleotide induziert wurde, trotz
der darauf folgenden Aussetzung gegenüber Antigen im Wirt aufrechterhalten wird.
-
BEISPIEL XII
-
TH1-ANTWORTEN IN MÄUSEN NACH
VERABREICHUNG NACKTER POLYNUCLEOTIDE MIT EINEM MECHANISCHEN REIZSTOFF
-
Die
in Beispiel XI beschriebenen Versuche wurden in getrennten Gruppen
von Mäusen
wiederholt, außer
dass (1) nur eine Priming-Dosis getestet wurde und (2) das pCMV-Lac-Z-Plasmid
einer Gruppe von 4 Mäusen
unter Verwendung der in Beispiel V beschriebenen Zinkenvorrichtung
verabreicht wurde, während β-Galactosidaseprotein
(10 μg)
einer anderen Gruppe von 4 Mäusen
durch intradermale (ID) Injektion verabreicht wurde.
-
Wie
in 19 gezeigt, produzierten die Mäuse, die Plasmid erhielten,
im Vergleich zu den Mäusen,
die das Protein erhielten, relativ geringe Titer an IgG-1-Antikörper. Hingegen
produzierten, wie in 20 gezeigt wird, die Mäuse, die
Plasmid erhielten, im Vergleich zu den Mäusen, die Protein erhielten,
wesentlich höherer
Titer an IgG-2A-Antikörper.
-
Diese
Resultate sind jenen ähnlich,
die in Beispiel XI erzielt wurden, mit der Ausnahme, dass interessanterweise
die Mäuse,
die das Plasmid über Ankratzen
ihrer Haut mit der Zinkenvorrichtung erhielten, sogar noch höhere Titer
an IgG-2A-Antikörper
als die Mäuse
produzierten, die dasselbe Plasmid mittels ID-Injektion erhielten
(wobei beide Gruppen höhere
Titer an IgG-2A-Antikörper
als die Mäuse
produzierten, die das Plasmid mittels IM-Injektion erhielten). Diese
Resultate weisen darauf hin, dass ein Ankratzen der Haut mit der
Zinkenvorrichtung mehr APCs zum "verletzten" Eintrittspunkt für die nackten Polynucleotide
hin anzieht, und stimmen mit der Theorie überein, dass APCs für Genverabreichung
und -expression effizientere Targets als Muskel- oder andere Somazellen
sind.
-
Die
in den Figuren gezeigten Daten umfassen Mittelwerte der für jede Gruppe
aus 4 Mäusen
erhaltenen Werte.
-
BEISPIEL XIII
-
IL-4 UND INFγ-KONZENTRATIONEN
IN MÄUSEN NACH
IMMUNISIERUNG MIT ANTIGEN ODER ANTIGEN-KODIERENDEN POLYNUCLEOTIDEN
-
Um
zu bestätigen,
dass die durch die in den Beispielen XI und XII präsentierten
Daten gezeigten Resultate der selektiven Induktion von TH1-Antworten
(z.B. INFγ-Sekretion)
in Plasmid-injizierten Mäusen
zugeschrieben werden können,
wurden Konzentrationen von IL-2 (Hinweis auf eine TH2-Antwort) und
INFγ in
den Seren der Plasmid- und Protein-injizierten Mäuse aus Beispiel XI nach einer
Booster-Injektion von Antigen getestet. IL-2-Konzentrationen wurden
wie in Beispiel I beschrieben getestet; INFγ-Konzentrationen wurden mit
einem Anti-INFγ-Murin-Antikörper-Test
getestet (siehe z.B. Coligan, "Current
Protocols in Immunology",
Abschnitt 6.9.5, Bd. 1, Wiley & Sons
(1994)).
-
Wie
in 23 gezeigt, waren die Konzentrationen an IL-4
in Protein-injizierten Mäusen
wesentlich höher
als in Plasmid-injizierten Mäusen
(etwa um ein 9:1-Verhältnis).
Umgekehrt waren die Konzentrationen an INFγ in den Plasmid-injizierten
Mäusen
wesentlich höher
als in den Protein-injizierten Mäusen (um
ein Verhältnis
von etwa 11:1).
-
BEISPIEL XIV (zur Information)
-
IN-VIVO-PRODUKTION UND
AUFRECHTERHALTUNG VON ZYTOTOXISCHEN T-LYMPHOZYTEN NACH IMMUNISIERUNG
MIT ANTIGEN ODER ANTIGEN-KODIERENDEN POLYNUCLEOTIDEN
-
Um
zu bestätigen,
ob die Plasmid-injizierten Mäuse
CTLs entwickelten und den dadurch geleisteten Anti-Antigen-Schutz
aufrechterhielten, wurden CTL-Konzentrationen in Plasmid-inijizierten
Mäusen und
in Kontrollmäusen
gemessen.
-
Die
Mäuse wurden
wie in Beispiel V beschrieben immunisiert, außer dass sie pCMV-NP (in Beispiel I
beschrieben) anstelle von Ovalbumin-DNA erhielten. Kontrollmäuse erhielten
pCMV-BL (ein Plasmid mit einem nicht-kodierenden Insert). Die Gesamtmenge
an pDNA, die auf die Zinkenvorrichtung pro Inokulation geladen wurde,
betrug 50 μg pCMV-NP
und 25 μg
pCMV-BL.
-
36
Wochen nach Immunisierung wurden die Mäuse getötet, und Splenozyten wurden
zur Verwendung in gemischten Standard-Lymphozytenkulturen entnommen.
Die Kulturen wurden in der Gegenwart eines bekannten synthetischen
Peptids gezüchtet, das
das eingeschränkte
Haupt-H-2d-CTL-Epitop des NP-Proteins aufwies.
Die Kulturen wurden 5-6 Tage später
unter Verwendung von NP-Peptid-gepulsten, syngenetischen P815-Tumorzellen
(ATCC-Nr. TIB64, Rockville, MD) als Targets auf Anti-NP-CTL-Aktivität getestet.
-
Wie
in 24 gezeigt, wiesen gemischte Lymphozytenkulturen,
die aus den pCMV-NP-injizierten
Tieren hergestellt wurden, höhere
Konzentrationen an spezifischer zytolytischer Anti-NP-Aktivität auf und
erreichten 10 %, 30 % und 80 % spezifische Lyse bei einem Effektor:Target-Verhältnis (E:T-Verhältnis) von
5:1, 15:1 bzw. 45:1. Kontrollmäuse
zeigten nur 1 %, 1 % und 9 % unter denselben Bedingungen. Darüber hinaus
gab es bei keiner Aussetzung gegenüber dem H-2d-Epitoppeptid
keine signifikanten Unterschiede in der CTL-Aktivität zwischen
den pCMV-NP-injizierten Mäusen
und den Kontrollmäusen
(25). Diese Daten sind ein Hinweis auf selektive
Aktivierung von TH1-Zellen in den pCMV-NP-injizierten Mäusen.
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FIGUREN ...
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3/18
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- AVERAGE ersetzen durch MITTEL
- TIME (WEEKS) ersetzen durch ZEIT (WOCHEN)
- WEEK ersetzen durch WOCHE
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4/18, 5/18
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- DILUTION ersetzen durch VERDÜNNUNG
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6/18
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7/18
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- DILUTION ersetzen durch VERDÜNNUNG
- DAY ersetzen durch TAG
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8/18
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- SURVIVAL (MICE) ersetzen durch ÜBERLEBENDE (MÄUSE)
- CONTROL ersetzen durch KONTROLLE
- DAY ersetzen durch TAG
- WEEK ersetzen durch WOCHE
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9/18
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- LYSIS ersetzen durch LYSE
- E:T RATIO ersetzen durch E:T-VERHÄLTNIS
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10/18
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- KORRIGIERTE ABSORPTION (senkrecht)
- WOCHE 5 SERUM
- WOCHE 10 SERUM
- KONTROLLE SERUM
- VERDÜNNUNGSFAKTOR
(unten)
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11/18
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- WEEK ersetzen durch WOCHE
- WEEK (POST BOOSTING) ersetzen durch WOCHE (NACH BOOST)
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12/18
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- WEEK ersetzen durch WOCHE
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13/18
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- WEEK (POST BOOSTING) ersetzen durch WOCHE (NACH BOOST)
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14/18
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- WEEK ersetzen durch WOCHE
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15/18
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- RESTRICTION SITE ersetzen durch RESTRIKTIONSSTELLE
- PROMOTER ersetzen durch PROMOTOR
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16/18
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- Tyne ersetzen durch Zinke
- CYTOKINE ersetzen durch CYTOKIN
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17/18, 18/18
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- SPECIFIC LYSIS ersetzen durch SPEZIFISCHE LYSE
- E/T RATIO ersetzen durch E:T-VERHÄLTNIS