DE3720911A1 - Hochgereinigte informatorische ribonukleinsaeure (i-rna), verfahren zur herstellung und verwendung - Google Patents

Description

Ein Virus oder Bakterium, eine Tumor- oder Karzinomzelle oder ein Allergen stellt für den menschlichen oder tierischen Organismus ein Antigen (AG) dar. Dagegen muß der Organismus einen Antikörper (AK) bilden.

Seit längerer Zeit versucht man, einen für jedes Antigen spezifischen Antikörper herzustellen, der i-RNA genannt wird, jedoch waren die bisherigen Versuche, wohl wegen mangelnder Reinheit oder unzureichender Spezifität unbefriedigend.

Es wurde nun gefunden, daß durch verbesserte Züchtungs- und Reinigungsbedingungen eine hochreine i-RNA erhalten werden kann, die, wenn man von äußerst sauber isolierten, reinen Tumor- oder Karzinomzellen ausgeht, auch zur Bildung einer für Tumorantigene spezifischen i-RNA führt.

Über das Züchten von isolierten Zellen, also der Reinigungsisolierung von Zell- und Gewebekulturen findet sich eine gute Zusammenfassung bei W. Müller, Habilitationsschrift, 1986, Medizinische Hochschule Hannover.

Durch ähnliche Methoden, wie sie dort beschrieben sind, wurden nun aus Gewebeproben von Tumoren oder Karzinomen in Form von Gewebe-Biopsien isolierte Tumor- oder Karzinomzellen gezüchtet und eine dafür spezifische i-RNA dargestellt.

Unter einer informatorischen RNA versteht man eine RNA mit dem mittleren Molekulargewicht von 2 bis 3 × 10⁶, die in immunkompetenten Zellen nach antigener Stimulation gebildet wird. Diese RNA verhält sich einerseits wie ein normales Messenger-RNS-Molekül, andererseits kann sie von Zelle zu Zelle oder von einem Makroorganismus auf einen anderen Makroorganismus übertragen werden. Außerdem wird sie im Gegensatz zur normalen Messenger-RNA durch eine spezifische, i-RNA abhängige RNA-Polymerase (Replikase) identisch dupliziert und sie dient einer i-RNA abhängigen DNA-Polymerase (reverse transcriptase) als Matrize für die Synthese einer entsprechenden doppelsträngigen DNA.

Über Herstellung und Wirkungsweise von i-RNA gibt es zahlreiche Publikationen, z. B. DE-A 17 92 609, DE-A 16 17 545, DE-A 27 55 802 und DE-A 31 15 559 sowie z. B. Affinity Chromatographie, Juni 1979, Uppsala, SE LJUNGFÖRETAGEN AB: "Poly (U)-Sepharose 4B", Seiten 62-66, J. M. Orten et al.: BIOCHEMISTRY, 8. Ausgabe 1970, THE C. V. MOSBY Comp., Saint Louis, USA, S. 904, CHEMICAL ABSTRACTS, Band 79, Nr. 13, 1. Oktober 1973, S. 337, Nr. 76823x und JACHERTZ, Molecular and Cellular Biochemistry, Band 24, Nr. 2, S. 92-126, um nur einige Beispiele zu nennen. Die Erfolge mit derartigen RNA's waren jedoch bis jetzt nicht befriedigend und über eine gefahrlose Anwendung solcher RNA's beim Menschen ist nichts bekannt geworden. Diese unbefriedigenden Ergebnisse könnten auf die Isolierung und/oder die Reinigung zurückzuführen sein.

Es besteht daher weiterhin ein Bedürfnis nach hochgereinigter i-RNA, die ohne schädliche Nebenreaktionen beim Menschen angewandt werden kann.

Zur Lösung dieser Aufgabe wird in der zweiten Reinigungsstufe ein abgeändertes Reinigungsverfahren angewandt, nämlich statt Cäsiumsulfat einer Dichte 1,5 wird Cäsiumchlorid einer Dichte 1,73 benutzt (oder "ein kontinuierlicher CsCl₂-Gradient, der Dichtewerte von 1,3 g/ml bis 1,7 g/ml abdeckt) oder diese Reinigungsstufe, und gegebenenfalls auch die vorhergehende Zentrifugierung und/oder die nachstehende Sephadex-Behandlung werden durch die Verwendung von Ultrafiltrationsmembranen für Molekulargewichte bis 30 000 einerseits und für Molekulargewichte bis 100 000 andererseits ersetzt.

Mit Hilfe enzymatisch-mechanischer Methoden der Zellisolierung steht eine sichere und zuverlässige Verfahrensweise zur Verfügung, um aus den humanen Tumorgeweben die isolierten Einzelzellen zu isolieren und in Kultur zu bringen. Als Nachweise für die Synthese einer i-RNA wird dem Stimulationsansatz radioaktiv markiertes Tritium-³H-UTP zugesetzt. Da UTP nur in Ribonukleinsäuren, nicht aber in Desoxyribonukleinsäuren vorkommt, weist eingebautes Tritium-markiertes UTP auf die Synthese einer RNA, also von i-RNA hin. Die Zeitabhängigkeit des Einbaus von ³H-UTP weist auf einen schnellen Abbau der i-RNA durch RNasen hin. Eine Inkubationszeit von 3 Minuten für die Stimulation hat sich als geeignet erwiesen.

Das synthetisierte Material wird drei Reinigungsschritten unterworfen:

• a) Der erste Reinigungsschritt erfolgt durch einen kontinuierlichen CsCl₂-Saccharose-Gradienten. Durch die hohe Dichte des CsCl₂-Kissens von 1,91 g/ml werden Proteine, die in der Regel eine Dichte von ca. 1,2 g/ml besitzen, von der gebildeten i-RNA getrennt. Die i-RNA kann aufgrund ihrer hohen Dichte in die CsCl₂-Schicht eindringen und so bereits in einem hohen Reinigungsgrad gewonnen werden.
• b) In einem zweiten Reinigungsschritt wird ein kontinuierlicher CsCl₂-Gradient aufgebaut (CsCl₂-Lösung, Dichte = 1,73), der Dichtewerte von 1,3 g/ml bis 1,7 g/ml abdeckt. Durch dieses Verfahren können kleine, unvollständig synthetisierte RNA-Moleküle und bereits entstandene RNA-Bruchstücke durch den Abbau durch RNasen von hochmolekularen Ribonukleinsäuren getrennt werden. Nach der Zentrifugation durch den kontinuierlichen Dichtegradienten ist das radioaktive Maximum, und damit die neugebildete i-RNA, in den Fraktionen 4-6 des Fraktionssammlers.
• c) Der letzte Reinigungsschritt der RNA-Präparation erfolgt über einer Sephadex-G25M-Säule. Durch die schnellere Eluierung langkettiger Moleküle befindet sich die RNA in den zuerst geschnittenen Fraktionen und wird nochmals von Bruchstücken und nichtverwendeten Bausteinen der Nukleinsäuresynthese getrennt.

Die Stufe b und gegebenenfalls die Stufe a und/oder c kann durch eine Ultrafiltration ersetzt werden.

Die Syntheserate der i-RNA im zellfreien System kann aus der Zählrate einer Probe errechnet werden:
9000 cpm in 1 ml Probe entsprechen 0,083 pmol eingebautem ³H-UTP (spezifische Aktivität des Nukleotids von 50 Ci/mmol). Bei Gleichverteilung der Nukleotide ergibt sich daraus eine Anzahl von 0,083 × 10^-12 × 6.03 × 10²³ oder 0.5 × 10¹¹ Molekülen radioaktiv-markiertem UTP. Insgesamt werden viermal so viele Nukleotide in die RNA eingebaut, also 2 × 10¹¹ Nukleotide.

Es hat sich gezeigt, daß sich bei einer Inkubationszeit von 180 Sekunden ein theoretischer Wert von 2,7 × 10⁷ eingebauter Nukleotide als theoretische Syntheserate ergibt. Die gefundene, viermal so hohe Syntheserate läßt sich durch die Existenz einer RNA abhängigen "RNA-Polymerase" erklären. Dieses Enzym benutzt ein doppelsträngiges RNA-Molekül als Matrize für eine weitere i-RNA-Synthese.

Die biologische Wirkung einer auf diese Weise synthetisierten i-RNA wird in vivo durch den Nachweis neugebildeter Antikörper, z. B. gegen die TST-Antigene der Prostatakarzinomzellen überprüft. Als Applicationsform der RNA-Präparation wurde die i.v.-Injektion in die Kubitalvene von Patienten gewählt unter der Vorstellung, daß eine Aufnahme der RNA-Moleküle in die immunkompetenten Zellen erfolgt, bevor sie durch die RNasen des Blutes abgebaut werden.

Untersuchungen der Toxizität der hergestellten i-RNA-Präparationen wurden an NMRI-Mäusen durchgeführt. Keines der Tiere, die eine RNA-Injektion erhielten, zeigten Anzeichen einer toxischen Wirkung der Präparation.

Der Antikörpernachweis wird mit dem Immunfluoreszenztest geführt, eine Methode, die über die Antigen-Antikörperreaktion hinaus noch eine Lokalisation des Antigens möglich macht. Das Prinzip dieses Tests besteht in der Inkubation der Tumorzellen mit dem Antiserum, das Antikörper gegen tumorspezifische Antigene enthält. Eine nachfolgende Inkubation mit einem fluoreszenzfarbstoffmarkierten Antiserum gegen Immunglobuline zeigt die Bindung an Gammaglobuline an, also der im Serum befindlichen Antikörper-Menge an der Zelle. Bei der Verwendung lebender, nichtfixierter Tumorzellen werden membranantigene dargestellt.

Mit der indirekten Immunfluoreszenzmethode gelingt nur der Nachweis von Antikörpern, die in der Lage sind, sich an TST-Antigene der Karzinomzellen zu binden. Aussagen über bestimmte Eigenschaften, wie die Fähigkeit, Komplemente zu fixieren und cytotoxisch zu wirken, können so nicht gemacht werden.

Der Nachweis membrangebundener Antigene kann durch die Existenz von IGG-Rezeptoren erschwert werden, da sich diese Zellen schon vor der Inkubation mit dem zu untersuchenden Serum mit dem fluoreszierenden Farbkörper verbinden.

Deshalb ist der Ansatz des Leerwertes, bei dem Carzinomzellen direkt mit dem markierten Antiserum inkubiert werden, notwenig.

In vorliegenden Patientenseren werden nur Antikörper der Klasse IGG erfaßt, weil cytotoxisch-wirkende Antikörper dieser Klasse angehören. Als fluoreszenzfarbstoff-markiertes Antiserum findet deshalb ein Anti-Human-IGG-Serum Verwendung.

Die Prostatakarzinomzellen eines Patienten tragen beispielsweise keine IGG-Rezeptoren. Die Leerwerte zeigen daher keine fluoreszierenden Zellen.

Die Anzahl von 10% fluoreszierenden Zellen am 20. Tag nach der i-RNA-Injektion weist auf die Bildung von Antikörper der Klasse IGG hin, die in der Lage sind, sich mit den membrangebundenen Antigenen der Karzinomzellen zu verbinden.

Voraussetzung für eine erfolgreiche RNA-Synthese ist die Verwendung einer intakten DNA, da diese als Template für die RNA-Synthese dient.

Bei der Reinigung und Isolierung der neugebildeten RNA muß auf eine weitgehende RNase-Freiheit geachtet werden. Alle Versuchsschritte werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt, es dürfen nur autoklavierte und steril-filtrierte Lösungen verwendet werden, es ist immer auf eine völlige RNase-Freiheit zu achten.

Tierexperimentelle Versuche mit chemisch induzierten Tumoren bei BALBc-Mäusen zeigten nach intravenöser Injektion einer RNA-Präparation eine 50%ige Tumor-Regression gegenüber unbehandelten Tieren innerhalb der ersten 8 Tage.

Andere Applikationsweisen, wie die intrakutane oder die subkutane Injektion, sind wegen zu hoher lokaler RNase-Konzentrationen und einer zu geringeren Anzahl immunkompetenter Zellen am Injektionsort nicht geeignet.

Die Toxizität von Immun-RNA-Extraten wurde in klinischen Versuchen untersucht. Nach intradermalen Injektionen wurden weder lokale Reizungen, noch eine systemische Toxizität beobachtet.

Gesamtdosen von 600 mg in einem Zeitraum von 35 Monaten und Einzeldosen bis zu 60 mg zeigten keine signifikanten Nebenwirkungen bei intravenöser Applikation.

Die Vorteile der Immuntherapie mit i-RNA gegenüber anderen adoptiven Immuntherapieformen sind vielfältig.

Selbst bei der Verwendung exogener RNA von sensibilisierten Tieren mit allogenen i-RNA-Präparaten, gewonnen aus Lymphozyten "geheilter" Patienten, konnte keine Sensibilisierung des Empfängers gegen fremde Histocompatibilitäts-Antigene festgetellt werden.

Eine GvH-Reaktion kann ausgeschlossen werden. Allergische und anaphylaktische Reaktionen sind wegen der fehlenden immunogenen Wirkung der i-RNA-Präparation nicht zu erwarten. Durch die Verwendung eines zellfreien Systems, als Quelle der tumorspezifischen i-RNA, ist die Gefahr der Verunreinigung der Präparation mit Fremdprotein ausgeschlossen. Es konnte außerdem nachgewiesen werden, daß Immun-RNA-Extrakte keine Immunantworten gegen körpereigene Antigene vermitteln. Sie sind nur gegen tumorspezifische, virale oder bakterielle Antigene gerichtet und veranlassen Lymphozyten zu einer spezifischen Immunantwort.

Folgende i-RNA-Chargen wurden hergestellt und getestet.

• 1) Tierexperimentelle Vieren
  • a) Aujesky-ADV
  • b) Coxsackie-B4
  • c) EMC-PV 21
  • d) MHV-H1
  • e) VSV-Indiana in BMK 21-Zellen
  • f) REO-Stamm 118
  • g) Maul- und Klauenseuche
  • h) Schweinerotlauf (Tierärzt. Hochschule, Hannover)
  • i) Influenza A/1/PR 301 (Meerschweinchen)
  • k) Poliovirus Typ 2 (MEF₁) (Rhesusaffen)
  • l) Mastozytom P 815 (Tumortransplantation an Mäusen)
• 2) Viren - i-RNA am Menschen angewandt
  • a) Herpes simplex Typ II (Hautklinik MHH, Hannover)
  • b) Herpes Zoster (Hautklinik MHH, Hannover)
  • c) Hepatitis-B (1. Selbstversuch an Prof. Dr. Lamprecht, 1982)
  • d) Herpes simplex Typ I
• 3) i-RNA-Chargen hergestellt und getestet auf Antikörperbildung
  • a) Zellwandantigene von Escheria coli
  • b) Blasentumor
  • c) Prostata-Tumor
  • d) Mamma-Ca
  • e) Collum-Ca, Typ II

Material und Methoden

Die Synthese der informatorischen Ribonukleinsäure (i-RNA) erfolgt in einem zellfreien System, das aus zwei Hauptkomponenten besteht:

• 1. Dem "S-100-System"
• 2. Einer DNA-Präparation

Zur Herstellung von i-RNA sind ferner notwendig

• 3. Reinigung der i-RNA über dem CsCl₂-Saccharose-Gradienten oder Ultrafiltration, ggf.
• 4. Reinigung der isolierten i-RNA über einer Sephadex-Säule
• 5. Messung der Radioaktivität durch Flüssigkeits-Scintigraphie
• 6. Antikörperinduktion
• 7. Indirekte Immunfluoreszenz-Messung
• 8. Sterile Ampullierung der lyophilisierten i-RNA

Zur Therapie mit i-RNA

Nach intravenöser Injektion von i-RNA in die Armvene des Tumor-Patienten (Kubitalvene) wird zu verschiedenen Zeitpunkten Blut entnommen und die synthetisierten tumorspezifischen Antikörper in einem Immunfluoreszenztest nachgewiesen.

Die Gewinnung des Gewebes und die Injektion von i-RNA-Präparationen erfolgt nach Aufklärung und mit Einwilligung des Patienten.

1. Isolierung des "S-100-Systems"

Das "S-100-System" wird aus Milzgewebe gesunder Mäuse, Meerschweinchen oder peripheren menschlichen Leukozyten gewonnen. Man stellt größere Ansätze für sehr zahlreiche Herstellungs-Verfahren für gleiche oder verschiedene i-RNA-Präparate her. Schon aus wirtschaftlichen und zeitsparenden Gründen ist die Herstellung größerer Mengen an "S-100-System" zu empfehlen.

Das frischentnommene Milzgewebe wird mit flüssigem Stickstoff in einen Mörser gegeben und zu Pulver zerstoßen. Das Pulver wird in ein "Kahnröhrchen" mit 2 ml Tris-Puffer A-Lösung überführt und, wenn nötig, mit einer Pipette weiter homogenisiert. Die Zelltrümmer werden dann in ein Zentrifugenglas gegeben und in einer BECKMANN-Zentrifuge in einem auf 4°C vorgekühlten Rotor bei 17 000 Upm und 30 Min. lang zentrifugiert. Das Sediment wird verworfen. Da. 1,5 ml des Überstandes werden auf einen diskontinuierlichen Saccharose-Gradienten geschichtet. Der Gradient besteht aus 1 ml 60%iger Saccharose, aufgelöst in Tris-Puffer A-Lösung, über der sich 2,75 ml 30%ige Saccharoselösung in Tris-Puffer A-Lösung befindet.

Es schließt sich eine 4stündige Zentrifugation mit 40 000 Upm und bei 4°C in einer SORVALL-Zentrifuge (Firma DUPONT-INSTRUMENTS) an. Nach der Zentrifugation erhält man eine rote Fraktion, die das "S-100-System" darstellt.

Unter der Sterilbank wird diese S-100-Fraktion mit einer gekühlten Pipette entnommen und mit Tris-Puffer A-Lösung im Verhältnis 1 : 1 verdünnt.

Zur Bestimmung der Konzentration wird ein Aliquot dieser Lösung im Verhältnis 1 : 50 mit Tris-Puffer A-Lösung verdünnt und das Absorptionsspektrum zwischen 200 und 300 nm aufgenommen.

Die "Gebrauchslösung" des S-100-Systems wird zu Portionen von je 0,2 ml bei -90°C eingefroren.

2. Synthese der informatorischen RNA (i-RNA)

In einem Eisbad werden 6 "Kahnröhrchen" vorgekühlt, 4 für die Stimulation mit den Karzinomzellen und 2 für die Kontrollproben. In die ersten 4 Röhrchen werden 0,2 ml der Karzinomzellsuspension pipettiert, in die beiden letzten je 0,2 ml 0,5%ige Triton-Lösung.

Das zellfreie System wird in einem Erlenmeyerkolben hergestellt. Es besteht aus folgenden Komponenten, die Konzentrationen folgen in der folgenden Zusammenstellung:

9,0 ml Tris-Puffer vom p_H = 7,2
0,1 ml einer Mischung der Nukleotide ATP, GTP, UTP und CTP
0,2 ml DNA-Lösung
0,1 ml "S-100-System-Lösung"
1,0 ml ³H-UTP-Lösung

Die ³H-UTP-Lösung wird vor Gebrauch lyophylisiert und dann in 1 ml Tris-Puffer-Lösung vom p_H = 7,2 aufgenommen. Das S-100-System und das zellfreie System werden mit gekühlten Pipetten pipettiert.

Die optimale Konzentration der Komponenten im zellfreien System, schon bei früheren Versuchsreihen bestimmt, ist wie folgt:

S-100-System7 µg/ml Protein DNA-Lösung2 × 10^-2 µg/ml ATP-, GTP-, UTP- und CTP-Lösung5 × 10^-9 Mol/l ³H-UTP-Lösung5 × 10^-9 Mol/l

In jedes der 6 Kahnröhrchen pipettiert man 1,6 ml des zellfreien Systems ein und inkubiert die Stimulationsansätze 3 Min. lang bei 37°C im Wasserbad.

Danach wird die i-RNA-Synthese durch Zugabe von 1,2 ml 1%iger wäßrige Phenol-Lösung (oder SDS Na-Dodecylhydrogensulfat) gestoppt.

Während die Proben 15 Min. lang im Wasserbad stehen, bildet sich ein weißer Niederschlag, der in einer Tischzentrifuge (Firma HERAEUS-CHRIST) bei 1290 g abzentrifugiert wird.

Die synthetisierte i-RNA befindet sich im Überstand.

3. Reinigung der i-RNA über dem CsCl₂-Saccharose-Gradienten

Die Isolierung und Reinigung der gebildeten i-RNA erfolgt über einem CsCl₂-Saccharose-Gradienten.

Dafür werden in 6 Zentrifugenröhrchen jeweils 1 ml CsCl₂-Lösung der Dichte d = 1,91 g/ml mit 0,7 ml 30%iger Saccharose in Tris-Puffer-Lösung vom p_H = 7,2 überschichtet. Danach pipettiert man 2 ml jeder Probe auf die Saccharoseschicht und verschließt das Zentrifugenröhrchen mit Paraffin. Es schließt sich eine 4stündige Zentrifugation in einer SORVALL-Zentrifuge bei 16°C und mit 130 000 g an.

Danach werden die Röhrchen mit einer Spritze am Boden angestochen und die CsCl₂-Schicht und die i-RNA-Lösung (Fraktion) abgezogen.

Das so gewonnene Material wird in Kahnröhrchen überführt, 10 µl zum Zählen der Radioaktivität entnommen. Die Proben werden steril verschlossen und im Kühlschrank bei 4°C aufbewahrt.

Die Schichtung im Röhrchen vor und nach dem Zentrifugieren ist in den beigefügten Fig. 1a und 1b dargestellt.

Reinigung von i-RNA

Die Proben aus den Kahnröhrchen 1-4 werden vereinigt und das Volumen gemessen. Ein Aliquot dieser Probe wird in ein Zentrifugenglas pipettiert und mit Tris-Puffer-Lösung vom p_H = 7,2 im Verhältnis 1 : 2,5 überschichtet. Das Zentrifugenröhrchen wird wieder mit Paraffin verschlossen.

Als Vergleichssubstanz wird eine "kalte" RNA der Dichte d = 1,55 g/ml mitzentrifugiert. 1 ml dieser RNA wird in 1 ml Tris-Puffer-Lösung vom p_H 7,2 mit 0,6 ml Tris-Puffer verdünnt. In dieser Verdünnung wird die Vergleichslösung auf CsCl₂-Lösung mit der Dichte d = 1,73 g/ml geschichtet, und zwar ebenfalls im Verhältnis CsCl₂ : RNA = 2,5 : 1.

Es folgt eine 19stündige Zentrifugation in einer SORVALL-Zentrifuge bei 16°C und bei 130 000 g. Nach dem Lauf gewinnt man aus jedem Röhrchen 10 Fraktionen zu je 0,3 ml und gibt sie in vorbereitete Probengläser. 10 µl jeder Fraktion werden zum Bestimmen der Radioaktivität verwendet. Von jeder Fraktion wird außerdem in einem Refraktometer der Brechungsindex gemessen und die Dichte ermittelt. Von den Fraktionen der Vergleichs-RNA wird zusätzlich die Extinktion im Spektralphotometer (Firma HITACHI) bei 260 nm gemessen.

4. Reinigung der isolierten i-RNA über eine Sephadex-G-25M-Säule

Die Fraktionen mit "erhöhter Radioaktivität" aus der Fraktierungs-Methode (Fraktions-Sammler) werden über einer Sephadex-Säule gereinigt.

Die Säule wird zunächst mit ca. 20 ml einer 0,85%igen NaCl-Lösung gespült. Danach werden die Proben auf die Säule gegeben und sofort 10 Fraktionen zu je 0,5 ml in vorbereiteten Röhrchen aufgefangen. Damit die Säule nicht trocken läuft, wird wiederum mit ca. 20 ml 0,85%iger NaCl-Lösung nachgespült. 10 µl einer jeden Fraktion werden zum Auszählen der Radioaktivität entnommen.

Die Reinigung der i-RNA über dem Cäsiumchlorid-Saccharose-Graduenten gemäß Punkt 3 und ggf. auch die anschließend folgende Reinigung der isolierten i-RNA über eine Sephadex-G-25M-Säule gemäß Punkt 4 kann in der technischen Ausführungsweise durch eine Ultrafiltration ersetzt werden, wobei für ein Molekulargewicht bis 30 000 das MILLIPOR-Filter PTTK und für Molekulargewichte bis 100 000 das MILLIPOR-Filter OMP-04 verwendet wird. Man kann bei Verwendung dieser Ultra-MILLIPOR-Filter oder entsprechender Filter aus einer Charge von derzeit mindestens 1000 ml einer nichtgereinigten i-RNA-Lösung im Umlaufverfahren bei gewöhnlicher Temperatur die i-RNA unter sterilen Bedingungen von Bruchstücken der anfallenden Proteine oder Enzyme und Coenzyme in reinster Form gewinnen. Die i-RNA verbleibt nach einem ca. 20 Min. langen Umlauf aus der 1-Liter-Lösung als einzige Verbindung, und somit isoliert, auf dem Ultrafilter.

5. Flüssigkeits-Scintillations-Zählung

Für jede Einzelmessung werden je 10 µl der Proben mit je 5 ml Scintillators-Lösung (Nr.: 402 der Firma ZINSSER ANALYTIC) gemischt. Die Proben werden (automatisch) im PACKARK-TRI-CARB-Scintillations-Spektrometer (Modell 4530) ausgezählt.

6. Antikörperinduktions-Messung am Menschen

Je 2,5 ml einer i-RNA-Ampulle werden in die Kubitalvene des Tumor-Patienten injiziert. Die sofort neu synthetisierten Antikörper müssen im Serum nachgewiesen werden. Um bereits gebildete Antikörper gegen TST-Antigene des Carcinoms oder des Tumors zu identifizieren, wird vor der ersten i-RNA-Injektion eine Blutprobe entnommen, dieses Serum wird auf tumorspezifische Antikörper untersucht.

Am 6. und am 20. Tag nach der ersten i-RNA-Injektion wird jedesmal Serum gewonnen und damit der Patient erneut auf tumorspezifische Antikörper untersucht. Damit mißt man die Bildungs-Rate der tumorspezifischen Antikörper.

Also:Serum-Untersuchungen vor der 1. i-RNA-Injektion nach der 1. Woche nach der 1. i-RNA-Injektion nach der 2. Woche nach der 3. Woche

Es wurde beobachtet, daß nach 3 Wochen nach der ersten i-RNA-Injektion - bei fast allen Tumor-Patienten - ein leichtes Fieber für kurze Zeit auftritt. Hier kann man dann sicher sein, daß eine Antikörper-Bildung gegen den Tumor stattgefunden hat.

7. Indirekte Immunfluoreszens-Messung

Die tumorspezifische Antikörper-Bildung oder die Antikörper selbst werden mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz nachgewiesen.

Die kultivierten Karzinomzellen werden durch eine 10minütige Zentrifugation bei 1000 Upm in einer Zentrifuge (Firma HERAEUS-CHRIST) von ihrem Kulturmedium getrennt. Anschließend werden die Zellen 3mal mit ca. 2 ml PBS-Puffer gewaschen. Jeder Waschvorgang besteht aus einer 10minütigen Zentrifugation bei 1000 Upm. Der Überstand wird verworfen, das Sediment aufgerüttelt. Das gewonnene Patientenserum wird im Verhältnis 1 : 5 mit PBS-Puffer verdünnt.

Jeder Versuchsansatz besteht aus zwei Proben:
In der ersten Probe befinden sich 5 × 10⁵-Karzinomzellen und 100 µl des verdünnten Serums,
in der zweiten Probe befinden sich 5 × 10⁵-Zellen und 100 µl PBS-Puffer. Diese Probe wird zur Leerwertbestimmung benötigt.
Beide Proben werden anschließend 30 Min. lang bei 22°C und dann 30 Min. lang bei 37°C inkubiert und je 3mal mit mit PBS-Puffer gewaschen.

Anti-Human-IGG-Fitc wird im Verhältnis 1 : 10 mit PBS-Puffer verdünnt, 100 µl werden entnommen und zu den Proben gegeben.

Nach einer 30minütigen Inkubation bei 4°C werden die Proben wieder 3mal mit PBS-Puffer gewaschen. Die Zellen werden auf einem Objektträger ausgestrichen, mit Deckglas abgedeckt und in einem Fluoreszenzmikroskop (LEITZ-Orthoplan, Wetzlar) ausgezählt.

8. Ampullierung der i-RNA

Die durch Graduenten-Zentrifugation gewonnenen und aus den Röhrchen mit einer sterilen Spritze abgezogenen i-RNA-Fraktionen werden in sterile Ampullen (3-5 ml) überführt.

In entsprechender Weise wird das Eluat aus der Sephadex-Säule gemäß Stufe 4 oder das resuspendierte Ultrafiltrat auf dem Ultrafilter in sterile Ampullen überführt.

Die i-RNA-Lösungen in den Ampullen werden im Lyophilisator (Fa. LEYBOLD) bis zur Trockene gefriergetrocknet.

Die Ampullen werden nach der gesetzlichen Vorschrift mit sterilen Gummikappen verschlossen (durchstechbar) und mit einem Metallring (Gummikappe/Ampulle) vernietet (Zange).

Die folgenden Anwendungsbeispiele zeigen die klinischen Möglichkeiten der erhaltenen i-RNA.

Beispiel Nr.1

Ein zellfreies System aus Rhesusaffenmilz wurde hergestellt und mit gereinigtem Poliovirus Typ 2 (MEF₁) zur Synthese von i-RNA stimuliert. Nach entsprechender Inkubation wurde die i-RNA isoliert und in einem zweiten zellfreien System auf ihre Fähigkeit Antikörper zu bilden geprüft. Diejenige i-RNA-Präparation, die in der Lage war, im zellfreien System die Synthese von Antikörpern gegen das Poliovirus Typ 2 (MEF₁) zu steuern, wurde in der Konzentration von 10^-4 µg/ml 7 Affen in einer Dosis von je 1 × 1,0 ml intramuskulär injiziert. 6 weitere Affen erhielten die gleiche Dosis i-RNA 5 × je 1,0 ml und zwar jeden 2. Tag eine i. m. Injektion. In der Konzentration von 10^-3 µg/ml wurde die i-RNS 6 weiteren Affen je 1 × in einer Dosis von 1,0 ml injiziert. Als Kontrollen dienten 3 Affen, denen die i-RNA in der höheren Konzentration von 10^-3 µl/ml nach Behandlung mit RNase und weitere 6 Affen, denen keine RNS injiziert wurde. Am 71., 72. und 73. Tag nach Behandlung mit i-RNA wurden alle Tiere mit je 1,0 ml Virussuspension und 1 ml Cortison belastet. Die Virussuspension hatte entweder 10^5,8 TCID₅₀ oder 10^4,8 TCID₅₀ und wurde ebenfalls intramuskulär injiziert. Am 3., 8. und 15. Tag nach der Belastung wurde den Tieren Blut genommen und im Serum der Gehalt an neutralisierten Antikörpern bestimmt. Die in der Tabelle aufgeführten Werte entsprechen dem reziproken Wert derjenigen Serumverdünnung, die gerade noch in der Lage ist, eine signifikante Neutralisation des Poliovirus in der Gewebekultur zu bewirken. Das geometrische Mittel am 15. Tag nach der Belastung ist für die Tiere, die mit i-RNS behandelt wurden, 312 für die niedrigere und 231 für die höhere Belastungsdosis. Die geometrischen Mittel der Kontrollen dagegen sind 16,0 bzw, 31,9.

Dieses Beispiel zeigt, daß durch die i-RNS ein immunologisch spezifisches Gedächtnis etabliert wird.

Beispiel Nr. 2

Ein zellfreies System wurde aus peripheren menschlichen Leukozyten hergestellt und mit dem Herpes simplex Virus Typ I bzw. mit dem Herpes simplex Virus Typ II zur Synthese von i-RNS stimuliert. Nach entsprechender Inkubation wurde die i-RNS isoliert und in einem zweiten zellfreien System auf ihre Fähigkeit geprüft, Antikörper gegen das Herpes simplex Virus Typ I bzw. Typ II zu synthetisieren. Diejenige i-RNA-Präparation, die in der Lage war, im zellfreien System die Synthese von Antikörpern gegen Herpes simplex Virus zu steuern, wurde auf eine Konzentration von ca. 10⁶ Moleküle/ml verdünnt und in Einzeldosen von 1,0 ml in Ampullen abgefüllt. Nach Kontrolle der Sterilität und der Virusfreiheit wurde diese i-RNA Patienten, die an Herpes simplex-Infektionen litten, intravenös injiziert. Im Anschluß an die Injektion wurde geprüft, ob sich ein therapeutischer Effekt, d. h. beschleunigtes Abheilen bzw. Kupierung des Rezidivs oder ob sich ein prophylaktischer Effekt, d. h. Verlängerung des rezidivfreien Intervalls beobachten lassen.

Dabei wird unter "gut" eine wesentlich bessere Reaktion als mit den bisherigen Verfahren erzielt verstanden. Als "mäßig" wird immer noch eine bessere Reaktion als mit den bisher üblichen Verfahren erzielbar bezeichnet. Alle Patienten waren bisher erfolglos mit verschiedensten Verfahren, wie Immunisierung mit Lupidon, Chemotherapie oder Cortison, behandelt worden.

Dieses Beispiel zeigt, daß die i-RNA im Menschen sowohl eine prophylaktische als auch eine therapeutische Wirkung entfalten kann.

Beispiel Nr. 3

Ein zellfreies System aus peripheren menschlichen Leukozyten wurde hergestellt und mit gereinigtem Hepatitis B Oberflächenantigen (HBs AG) zur Synthese von i-RNA stimuliert. Nach entsprechender Inkubation wurde die i-RNA isoliert und in einem zweiten zellfreien System auf ihre Fähigkeit Antikörper zu synthetisieren geprüft. Diejenige i-RNA-Präparation, die in der Lage war, im zellfreien System die Synthese von Antikörpern gegen HBs-Antigen zu steuern, wurde auf eine Konzentration von ca. 10⁶ Moleküle/ml verdünnt und in Einzeldosen von 1,0 ml in Ampullen abgefüllt. Nach Kontrolle der Sterilität wurde die i-RNA zur Behandlung von Patienten verwendet, die an chronisch aggressiver Hepatitis litten. Eine Tabelle zeigt die nach der Applikation der i-RNS beobachteten Reaktionen in den einzelnen Patienten. Die Beobachtungen sind klassifiziert nach klinischer Besserung, biochemischer Besserung, histologischer Besserung und serologischer Besserung in bezug auf den Titer von HBs und HBe Antigen.

Die Anzahl der im positiven Sinne reagierenden Patienten ist wesentlich höher als mit der bisher üblichen Therapie mit Cortison und Immunsuppressiva. Nach den Angaben in der Literatur (Meyer zum Büschenfelde, DMW 103, 887-892, 1978) beträgt diese z. B. nur 4 von 22.

klinische Besserung10/12 biochemische Besserung 8/12 histologische Besserung12/12 HBs gesenkt oder Ø 8/11 HBe gesenkt oder Ø 9/12

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung einer hochgereinigten, gegen Antigene spezifische, bei Applikation bei Mensch und Tier verträgliche i-RNA durch Synthese in einem zellfreien System aus S-100-System und einer DNA-Präparation, Antikörperinduktion und Reinigung der i-RNA über einen Cäsiumsalz-Saccharosegradienten und eine Sephadex-Säule oder durch Ultrafiltration, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der zweiten Reinigungsstufe statt Cäsiumsulfatlösung von der Dichte d = 1,5 eine Cäsiumchloridlösung von der Dichte d = 1,73 anwendet oder die Cäsiumchloridzentrifugation und die Sephadexbehandlung durch eine Ultrafiltration mit einem Filter für ein Molekulargewicht bis 30 000 oder ein Molekulargewicht bis 100 000 ersetzt.

2. Hochgereinigte i-RNA, hergestellt durch das Verfahren gemäß Anspruch 1.

3. Verwendung der hochgereinigten i-RNA zur direkten Therapie, zur aktiven Immunisierung oder Gewinnung von Impfstoffen in vivo und in vitro.

4. Verwendung in vivo nach Anspruch 3 durch intravenöse Injektion.