ES2323407T3 - Nuevo antigeno tumoral util en el diagnostico y terapia del cancer de vejiga, ovario, pulmon y riñon. - Google Patents

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Abstract

Un método para detectar el cáncer de vejiga en un individuo que comprende: evaluar el nivel de expresión de un producto génico 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica; evaluar el nivel de expresión de un producto génico 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra normal correspondiente; comparar el nivel de expresión del producto génico en la muestra biológica respecto del de la muestra normal correspondiente, en donde el producto génico es una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:2 o un ARNm que codifica la secuencia de aminoácidos, y en donde un incremento en los niveles de expresión del producto génico en la muestra biológica en comparación con la correspondiente muestra normal es indicativo de cáncer de vejiga.

Description

Nuevo antígeno tumoral útil en el diagnóstico y terapia del cáncer de vejiga, ovario, pulmón y riñón.
Antecedentes de la invención
El cáncer de próstata es el cáncer diagnosticado más frecuentemente y la segunda principal causa de muerte por cáncer en hombres. Unos 45.000 hombres mueren anualmente a causa de esta enfermedad. Solamente el cáncer de pulmón tiene una mayor mortalidad. La probabilidad de que un hombre desarrolle cáncer de próstata invasivo durante su vida es 1 en 6. A la edad de 50, un hombre posee una probabilidad mayor del 40% de desarrollar cáncer de próstata y una probabilidad de casi el 3% de morir a causa de esta enfermedad. A pesar de que se han logrado algunos avances en el tratamiento de tumores confinados localmente, el cáncer de próstata es incurable una vez que el mismo produjo metástasis. Los pacientes con cáncer de próstata metastásico son tratados mediante terapia de ablación hormonal, pero solamente con éxito a corto plazo. A la larga, estos pacientes desarrollan un estado refractario a los andrógenos que conduce a un avance de la enfermedad y a la muerte.
Un problema persistente y fundamental en el control del cáncer de próstata es la ausencia de marcadores diagnósticos y pronósticos confiables capaces de detectar exactamente los tumores localizados en la etapa temprana y/o predecir la sensibilidad y avance de la enfermedad. La detección y diagnóstico precoces del cáncer de próstata actualmente se basa en el examen digital rectal (DRE), mediciones del antígeno específico de próstata (PSA), la ultrasonografía transrectal (TRUS) y la biopsia transrectal por aguja (TRNB). Las mediciones del PSA sérico en combinación con DRE representan el principal abordaje de diagnóstico en la actualidad. Sin embargo, este abordaje tiene importantes limitaciones que han estimulado la investigación intensiva para descubrir mejores marcadores de diagnóstico de esta enfermedad. Se han identificado una serie de marcadores y al menos uno, el PSA, tiene uso clínico generalizado. Sin embargo, los marcadores ideales del tumor de próstata han sido extremadamente fugaces y aún ningún marcador ha probado ser confiable para predecir el avance de la enfermedad. De este modo, existe la necesidad de métodos diagnósticos y pronósticos más confiables e informativos en el manejo del cáncer de próstata.
Además, también existe gran interés en identificar las proteínas específicas de la próstata que pudieran ser apropiadas como blancos terapéuticos, ya que no existe tratamiento eficaz para los pacientes que desarrollan la enfermedad recurrente o a quienes se les ha diagnosticado enfermedad metastásica. Aunque la terapia de ablación de hormonas puede aliviar a estos pacientes, la mayoría inevitablemente avanza hasta desarrollar una enfermedad andrógeno-independiente incurable (Lalani et al., 1997, Cancer Metastasis Rev. 16: 29-66).
El PSA es actualmente el marcador tumoral más ampliamente utilizado para detectar, diagnosticar, y monitorear el cáncer de próstata. En particular, varios inmunoensayos para la detección del PSA sérico tienen uso clínico generalizado. Recientemente, se ha desarrollado un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa (RT-PCR) para ARNm de PSA en suero. Sin embargo, el PSA no es un marcador específico de la enfermedad, ya que niveles elevados de PSA son detectables en un gran porcentaje de pacientes con BPH y prostatitis (25-86%)(Gao et al., 1997, Prostate 31: 264-281), así como en otros trastornos no malignos y en algunos hombres normales, un factor que limita significativamente la especificidad diagnóstica de este marcador. Por ejemplo, se observan elevaciones en el PSA sérico de entre 4 a 10 ng/ml en BPH, y aún se observan valores más altos en prostatitis, particularmente prostatitis aguda. BPH es una enfermedad extremadamente común en hombres. El hecho de que las elevaciones del PSA sérico pueden observarse sin ninguna indicación de la enfermedad a partir del DRE, y viceversa, confunde más la situación. Es más, ahora se reconoce que el PSA no es específico de la próstata y que posee una variedad de actividades biológicas complejas (Véase, p. ej., Fortier et al., J. Natl. Cancer Inst. 1999, 91(19):1635-40).
Se han descrito varios métodos diseñados para mejorar la especificidad de detección en función del PSA, tal como medir la densidad del PSA y la relación PSA libre vs. complejado. Sin embargo, ninguna de estas metodologías ha sido capaz de distinguir reproduciblemente la enfermedad prostática maligna de la benigna. Además, los diagnósticos de PSA poseen sensibilidades de entre 57-79% (Cupp & Osterling, 1993, Mayo Clin Proc 68:297-306), y de este modo no identifican el cáncer de próstata en una significativa población de hombres con la enfermedad.
El antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) es un marcador de superficie celular de cáncer de próstata recientemente descrito que ha sido el objeto de varios estudios que evalúan su uso como marcador terapéutico y diagnóstico. La expresión del PSMA se limita mayormente a tejidos prostáticos, pero se han observado niveles detectables de ARNm de PSMA ARNmen carcinoma de cerebro, glándula salival, intestino delgado y células renales (Israeli et al., 1993, Cancer Res 53: 227-230). La proteína PSMA se expresa mayormente en la mayoría de los cánceres de próstata primarios y metastásicos, pero también se expresa en la mayoría de los especímenes neoplásicos intraepiteliales (Gao et al., supra). Los resultados preliminares que usan un anticuerpo monoclonal anti-PSMA marcado con Indio-111 para detectar por imágenes el cáncer de próstata recurrente muestran alguna promesa (Sodee et al., 1996, Clin Nuc Med 21: 759-766). El PSMA es un antígeno dependiente de hormonas que requiere la presencia de un receptor funcional de andrógenos. Debido a que no todas las células de cáncer de próstata expresan el receptor de andrógenos, la utilidad clínica del PSMA como blanco terapéutico puede estar intrínsecamente limitada. También se están llevando a cabo ensayos clínicos diseñados para examinar la efectividad de la Inmunoterapia
con PSMA.
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El Antígeno de Células Madre Prostáticas (PSCA) es otro marcador de superficie celular de cáncer de próstata recientemente descrito (Reiter et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1735-1740). Se ha demostrado que la expresión del PSCA es predominantemente específica de la próstata y que se sobreexpresa ampliamente a lo largo de todas las etapas del cáncer de próstata, incluyendo la neoplasia intraepitelial prostática de alto grado (PIN), tumores de próstata dependientes de andrógenos e independientes de andrógenos. El gen del PSCA se ha mapeado en el cromosoma 8q24.2, una región de ganancia alélica en más del 80% de los cánceres de próstata. El PSCA parece ser prometedor como blanco diagnóstico y terapéutico en vista de su localización de la superficie celular, especificidad prostática y expresión sumamente regulada por aumento en las células del cáncer de próstata.
El avance en la identificación de marcadores específicos ha sido lento debido a la falta de sistemas de modelos de animales experimentales que recapitulan la enfermedad clínica. Las soluciones tentativas de este problema han incluido la generación de líneas celulares de cáncer de próstata (Horoszewicz et al., 1983, Cancer Res. 43, 1809) y xenoinjertos de cáncer de próstata (Pretlow et al., 1991, Cáncer Res. 51, 3814; van Weerden et al., 1996, Am. J. Pathol. 149, 1055; Klein et al., 1997, Nature Med. 3, 402). Sin embargo, estos abordajes han tenido éxito limitado. Por ejemplo, los xenoinjertos en general han producido bajas tasas de supervivencia a largo plazo. Además, se ha demostrado que ninguna de las líneas celulares de cáncer de próstata humano más ampliamente usadas - PC-3, DU-145, y LNCaP - ha dado lugar en forma reproducible a lesiones osteoblásticas típicas del cáncer de próstata. Otra limitación de las líneas celulares DU-145 y PC-3 es que estas células no expresan el antígeno específico de la próstata (PSA) o el receptor de andrógenos (AR) (Kaighn et al., 1979, Invest. Ural. 17: 16-23; Gleave et al., 1992, Cancer Res. 52: 1598-1605), cuestionando su relevancia respecto del cáncer de próstata clínico. La línea celular LNCaP es sensible a los andrógenos y expresa el PSA, pero contiene una mutación en el receptor de andrógenos que altera la especificidad del ligando.
Recientemente, sin embargo, se ha descrito una serie de xenoinjertos de cáncer de próstata (obtenidos a partir de tumores de pacientes) que demuestran características genéticas y fenotípicas que son estrechamente análogas a la situación clínica humana (Klein et al., 1997, Nature Med. 3:402). Estos xenoinjertos de LAPC (Los Angeles Prostate Cancer) has sobrevivido el pasaje a ratones con síndrome de inmunodeficiencia severa combinada (SCID) por un período mayor que un año. Los sistemas modelo de xenoinjertos LAPC-4 tienen la capacidad de imitar la transición de la dependencia de andrógenos a la independencia de andrógenos y el desarrollo de lesiones metatásicas (Klein et al., 1997, supra). Los tumores LAPC-4 experimentan una regresión en ratones macho después de la castración, pero recrecen dentro de los 2-3 meses como tumores independientes de andrógenos. Ambos tumores de xenoinjertos de LAPC-4 dependientes de andrógenos (AD) e independientes de andrógenos (AI) expresan iguales niveles de los marcadores específicos de la próstata PSA, PSMA y PSCA (antígeno de células madre prostáticas), lo que se identificó utilizando análi-
sis de diferencias representativas de los ADNc obtenidos a partir de las variantes AD y Al del xenoinjerto LAPC-4.
La patente WO 00/23111 describe métodos para detectar, diagnosticar, monitorear, clasificar en estadios, pronosticar, detectar por imágenes y tratar el cáncer de próstata. La patente de EEUU 6.043.033 describe una proteasa asociada a la próstata humana (HUPAP) y polinucleótidos que identifican y codifican la HUPAP. Se descubrió que la HUPAP se expresa en el tejido de la próstata de pacientes con cáncer, indicando una utilidad de esta proteína en la detección y tratamiento del cáncer de próstata. La patente WO 00/18961 describe el descubrimiento de una serie de genes que son inducibles por andrógenos en células de cáncer de próstata dependientes de andrógenos y constitutivamente expresados en células de cáncer de próstata independientes de andrógenos y por ello son útiles en el diagnóstico y tratamiento del cáncer de próstata.
Compendio de la invención
La presente invención se refiere a métodos y composiciones para el diagnóstico y terapia del cáncer de vejiga, obtenidos a partir de o basados en una serina-proteasa normalmente específica de la próstata, regulada por andrógenos, denominada 20P1F12/TMPRSS2 descrita en la presente memoria. Se describe un ADNc de longitud completa que comprende la secuencia codificadora entera del gen 20P1F12/TMPRSS2 (también denominado en la presente memoria 20P1F12-GTC1) (Figura 1). Este ADNc codifica una proteína que está sumamente relacionada con, pero estructuralmente se distingue de, el TMPRSS2 recientemente publicado (Paoloni-Giacobino et al., 1997, Genomics 44: 309-320). El gen 20P1F12/TMPRSS2 también muestra un patrón de expresión muy diferente respecto del perfil de expresión del TMPRSS2.
La invención proporciona un método para detectar cáncer de vejiga en un individuo, que comprende:
evaluar el nivel de expresión de un producto génico 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica;
evaluar el nivel de expresión de un producto génico 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra normal correspondiente; y
comparar el nivel de expresión del producto génico en la muestra biológica respecto del de la correspondiente muestra normal, en donde el producto génico es una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO.:2 o un ARNm que codifica la secuencia de aminoácidos, y en donde un incremento en los niveles de expresión del producto génico en la muestra biológica en comparación con la correspondiente muestra normal es indicativo de cáncer de vejiga.
La invención además proporciona:
- una composición inmunogén para utilizar en la inhibición del crecimiento de un cáncer de vejiga, comprendiendo la composición inmunogén la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO.: 2 o una porción inmunogén de la misma, o un vector que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la SEC ID NO.: 2;
y un vehículo fisiológicamente aceptable, en donde la composición inmunogén es capaz de provocar una respuesta inmune de un mamífero;
- un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que específicamente se une a la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO.: 2 acoplado a un agente citotóxico para su uso en el tratamiento del cáncer de vejiga.
- un método para inhibir el crecimiento de una célula neoplásica de vejiga in vitro que comprende poner en contacto la célula neoplásica de vejiga con un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que específicamente se une a la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO.: 2 acoplado a un agente citotóxico.
Más específicamente, la invención se refiere a polinucleótidos correspondientes a o complementarios de todo o parte del gen 20P1F12/TMPRSS2, ARNm, y/o secuencia codificadora, preferiblemente en forma aislada, incluyendo los polinucleótidos que codifican las proteínas 20P1F12/TMPRSS2 y fragmentos de los mismos, ADN, ARN, híbrido de ADN/ARN y moléculas relacionadas, polinucleótidos u oligonucleótidos complementarios de los genes 20P1F12/TMPRSS2 o secuencias del ARNm o partes del mismo, y polinucleótidos u oligonucleótidos que hibridizan a los genes 20P1F12/TMPRSS2, a ARNm, o a polinucleótidos que codifican 20P1F12/TMPRSS2. La invención también se refiere a medios para aislar los ADNc y los genes que codifican 20P1F12/TMPRSS2. También se describen moléculas de ADN recombinante que contienen polinucleótidos de 20P1F12/TMPRSS2, células transformadas o transducidas con tales moléculas, y sistemas hospedante-vector para la expresión de los productos génicos 20P1F12/TMPRSS2. La invención además se refiere a proteínas 20P1F12/TMPRSS2 y a fragmentos polipeptídicos de las mismas.
Se describen métodos para detectar la presencia de polinucleótidos y proteínas 20P1F12/TMPRSS2 en diversas muestras biológicas, así como métodos para identificar células que expresan 20P1F12/TMPRSS2. También se describen métodos diagnósticos por imágenes para el manejo de cánceres de próstata, colon, vejiga, pulmón, de ovario y riñón, y cáncer metatásico.
La invención además proporciona diversas composiciones terapéuticas y estrategias para tratar el cáncer de vejiga, incluyendo particularmente el polipéptido 20P1F12/TMPRSS2 y métodos de terapia con anticuerpos anti-20P1F12/
TMPRSS2 y composiciones, vacunas para el cáncer y terapia con moléculas pequeñas.
La invención proporciona anticuerpos que se unen a las proteínas 20P1F12/TMPRSS2 y a fragmentos polipeptídicos de las mismas, incluyendo anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos murinos y de otros mamíferos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y completamente humanos, acoplados a un agente citotóxico. En la presente memoria también se describen varios anticuerpos monoclonales específicamente reactivos con 20P1F12/TMPRSS2.
Breve descripción de las figuras
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Figura 1. Nucleótido (SEC ID NO.: 1) y secuencias deducidas de aminoácidos (SEC ID NO.: 2) del ADNc clon 20P1F12-GTC1 (Ejemplo 3) (según lo presentado ante ATCC; Acceso Núm. 207097.)
Figura 2. Nucleótido (SEC ID NO.: 3) y secuencias deducidas de aminoácidos (SEC ID NO.: 4) de la secuencia del gen TMPRSS2 según lo publicado en Paoloni-Giacobino et al., 1997, Genomics 44: 309-320.
Figura 3A-B. La Figura 3A muestra una alineamiento de secuencias de aminoácidos que compara el ADNc 20P1P12-GTC1 (Ejemplo 3) con la secuencia anteriormente publicada de TMPRSS2 (Paoloni-Giacobino et al., 1997, Genomics 44: 309-320). Las diferencias de aminoácidos se muestran en tipo negrita. La Figura 3B muestra una representación esquemática de la estructura de dominio de 20P1F12/TMPRSS2.
Figura 4. Secuencia nucleotídica del clon 20P1F12 de SSH inicialmente aislado (SEC ID NO.: 5).
Figura 5A-D. Análisis RT-PCR de la expresión del gen 20P1F12/TMPRSS2 en xenoinjertos de cáncer de próstata, próstata normal y otros tejidos y líneas celulares, que muestra niveles de expresión aproximadamente iguales en próstata normal y tres xenoinjertos de cáncer de próstata (Figura 5A); y que muestran en gran parte expresión específica de la próstata en tejidos humanos normales, con niveles de expresión significativamente más bajos detectables en colon, páncreas, riñón y pulmón (Fig. 5B y C). También se demuestra que 20P1F12/TMPRSS2 se expresa en tejidos de cáncer de vejiga (Figura 5D).
Figura 6. Análisis de transferencia Northern de la expresión del gen 20P1F12/TMPRSS2 en tejidos humanos normales y xenoinjertos de cáncer de próstata utilizando sonda de ADNc marcada del clon 20P1F12. La expresión en 16 tejidos normales se limitó en su mayor parte a la próstata, mostrando el riñón, páncreas y pulmón niveles de expresión 10 a 20 veces más bajos.
Figura 7A y 7B. Expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en líneas celulares de cáncer de próstata y colon (Figura 7A). Se prepararon filtros de xenoinjertos y líneas celulares con 10 \mug de ARN total por calle. Se analizaron las transferenciasas utilizando una sonda de fragmento de gen derivada de 20P1F12/TMPRSS2. Todas las Muestras de ARN se normalizaron mediante tinción con bromuro de etidio. Kilobases= kb. Excepto por LAPC-9 AI, la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en los xenoinjertos fue comparable a los niveles observados en las muestras de próstata normal. Además, se observó expresión de menor nivel en la línea A431 de carcinoma epidermoide. 20P1F12/TMPRSS2 también se expresa en los tejidos de cáncer de vejiga, pulmón y ovario, así como en un conjunto de cánceres metatásicos (colon a pulmón, colon a hígado, ovario a trompas de Falopio) (Figura 7B). Sin embargo, el patrón de expresión se invierte para riñón normal/cáncer de riñón: 20P1F12 se expresa en riñón normal, pero se expresa a niveles mucho menores en cáncer de riñón (Figura 7B) (el conjunto de cáncer de riñón se obtuvo a partir de dos cánceres de riñón de grado 2 y un cáncer de riñón de grado 3).
Figura 8. Caracterización de anticuerpos monoclonales dirigidos contra 20P1F12/TMPRSS2. Se generaron anticuerpos monoclonales hacia 20P1F12/TMPRSS2 utilizando una proteína de fusión purificada GST-20P1F12/
TMPRSS2 según se describe en el Ejemplo 5. Se examinaron los anticuerpos monoclonales mediante transferencia western contra lisados obtenidos a partir de células 293T transfectadas con un vector PADNc 3.1 que codifica myc His-20P1F12/TMPRSS2. (A) Se utilizaron seis mAbs: 1F9 (IgG1, K), 2D10 (IgG1, K), 2F8, (IgG1, K) 6B11 (IgG1, K), 8C6 (IgG1, K) y 9G8 (IgG2a, K) que específicamente reconocen 20P1F12/TMPRSS2 para sondear las transferencias western de lisados celulares obtenidos a partir de células 293T transfectadas con 20P1F12/TMPRSS2 (calle 1) o neo (como control, calle 2). (B) Lisados celulares provenientes de células 293T transfectadas con 20P1F12/TMPRSS2 (calle 1) o neo (como control, calle 2), LAPC-9 AD y LNCaP se sondearon con 1F9 anti-TMPRSS2 mAb. Los estándares de peso molecular se indican en un lateral en kilodaltons (KD).
Figura 9. Biotinilación de 20P1F12/TMPRSS2. (A) Se transfectaron 20P1F12/TMPRSS2 marcada con His o neo (como control) a células 293T. Se incubaron células intactas con biotina para biotinilar las proteínas celulares. Los lisados celulares se analizaron mediante transferencia western directamente (calles 1 y 2, o se incubaron con estreptoavidina para purificar por afinidad todas las proteínas celulares marcadas). Se analizaron las proteínas celulares purificadas con estreptoavidina mediante transferencia western utilizando anticuerpos anti-His (calles 3 y 4). Sólo se detectó proteína biotinilada en las células transfectadas con 20P1F12/TMPRSS2. (B) Se incubaron PC-3 biotinilada (calle 2) y LNCaP (calle 4) y PC-3 no marcada (calle 1) y LNCaP (calle 3) con gel de estreptoavidina y después se analizaron mediante transferencia western utilizando 1F9 mAb. Sólo se detectó 20P1F12/TMPRSS2 en las muestras biotiniladas. Los estándares de peso molecular se indican en un lateral en kilodaltons (KD).
Figura 10. Desglicosilación de 20P1F12/TMPRSS2 en células 293T transfectadas. 20P1F12/TMPRSS2 marcada con His transfectada a células 293T se purificó utilizando Níquel-agarosa. Después se desglicosiló la proteína 20P1F12/TMPRSS2 utilizando N-glicosidasa F. Se analizaron 20P1F12/TMPRSS2 no tratada (calle 1) y la proteína desglicosilada (calle 2) mediante transferencia western utilizando anticuerpos anti-His. Se detecta un cambio en el peso molecular con la desglicosilación. Los estándares de peso molecular se indican en el lateral en kilodaltons (KD).
Figura 11. Regulación por andrógenos de la proteasa de la superficie celular 20P1F12/TMPRSS2. Células LNCaP fueron privadas de andrógenos haciendo crecer células en suero fetal bovino al 2% tratado con carbón vegetal durante 1 semana (calle 1), o 24 horas (calle 3). Se determinó la regulación por andrógenos estimulando células privadas de nutrientes durante 24 horas con mibolerona 10 nM (análogo de andrógenos) durante 9 horas (calle 4). Se comparó la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 con los niveles de 20P1F12/TMPRSS2 en células LNCaP que crecieron en un medio completo (calle 2) mediante transferencia northern de 10 \mug de ARN/calle sondeado con una sonda de 20P1F12/TMPRSS2. Se determinó la carga igual de ARN mediante tinción con bromuro de etidio y posterior sondeo con una sonda de \beta-actina. Se determinaron los niveles de PSA como control para la regulación por andrógenos. Los estándares de peso molecular se indican en el lateral en kilobases (kb).
Figura 12. Regulación por andrógenos de 20P1F12/TMPRSS2 en LNCaP. Células LNCaP fueron privadas de andrógenos haciendo crecer células en suero fetal bovino 2% tratado con carbón vegetal durante 1 semana. Se determinó la regulación por andrógenos estimulando células con mibolerona (Mib) para varios puntos de tiempo. Se determinó la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 mediante transferencia western de los lisados celulares utilizando mAb anti-1F9. Como controles adicionales se utilizaron lisados celulares de células PC-3 infectadas con neo (como control) o 20P1F12/TMPRSS2. Se determinó la carga igual de proteínas mediante el sondeo de la transferencia western con anticuerpos anti-Grb-2 (Transduction Laboratories). La expresión proteica de 20P1F12/TMPRSS2 se comparó con los niveles de ARN mediante transferencia northern de 10 \mug ARN/calle sondeado con una sonda de 20P1F12/TMPRSS2. Se determinó la carga igual de ARN sondeando la transferencia northern con una sonda de \beta-actina.
Figura 13. Efecto de la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en células NIH 3T3. Se infectaron células NIH 3T3 con retrovirus que codifica neo (como control) o 20P1F12/TMPRSS2. Se analizaron las células cuarenta y ocho horas después de la infección mediante microscopía luminosa. Las células que parecieron acumular un gran número de vacuolas se indican con flechas.
Figura 14. Altos niveles de expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en células de próstata, cáncer de próstata y cáncer de colon. Se sondearon transferencias northern que contenían ARN obtenido a partir de tejidos normales, xenoinjertos de cáncer de próstata y líneas celulares, y líneas celulares de cáncer de colon utilizando un fragmento de ADNc de 20P1F12/TMPRSS2. Las muestras son: 1. próstata, 2. LAPC-4 AD, 3. LAPC-4 Ax, 4. LAPC-9 AD, 5. LAPC-9 Al, 6. LNCaP, 7. PC-3, 8. DU145, 9. CaCo-2, 10. LoVo, 11. T84, 12. Colo-205. Todas las muestras de ARN se normalizaron con una sonda de \beta-actina. Los estándares de tamaño en kilobases (kb) se indican en el lateral.
Figura 15. La proteína 20P1F12/TMPRSS2 se expresa como una forma de longitud completa y escindida por acción proteolítica en tejidos y líneas celulares. Se prepararon lisados celulares y tisulares (20 \mug de proteína) en tampón de muestra y se sondearon en transferencias western utilizando el MAb 1F9 anti-20P1F12/TMPRSS2. Se obtuvieron tejidos tumorales de próstata (T) con tejidos adyacentes correspondientes(N) a partir de pacientes con puntaje de Gleason de 7, 9 y 7, respectivamente. Se utilizaron como controles negativo y positivo, respectivamente, Lisados de células 293T transfectadas con vector de control o con vector que expresa 20P1F12/TMPRSS2.
Figura 16. La proteasa de20P1F12/TMPRSS2 es regulada por andrógenos y secretada al medio de células de cáncer de próstata. (A) Se hicieron crecer células LNCaP en un medio que contenía suero fetal bovino al 10% (NT) o en suero tratado con carbón vegetal al 2% (CSS) durante 1 semana. Las células que crecieron en CSS se dejaron posteriormente sin tratamiento (-) o se estimularon (+) con mibolerona (10 nM) durante 9 o 24 horas. Las células PC-3 y Células PC-3 que expresaban el receptor de andrógenos (AR) se estimularon con mibolerona durante 9 horas. Se sondearon los lisados con MAb 1F9. (B) Células LNCaP fueron privadas de andrógenos (-) y después se trataron con mibolerona 1 nM o 10 nM durante 36 horas. Se recolectaron los extractos celulares y el medio de las células para transferencia western con anti-1F9. Se analizó el medio después de la inmunoprecipitación (i.p.) con MAb 1F9 o tal cual (20 \mul). Los estándares de peso molecular se indican en el lateral en kilodaltons (KD).
Figura 17. Análisis inmunohistoquímico de muestras de pacientes con cáncer de próstata y colon con MAb anti-20P1F12/TMPRSS2. Las muestras incluyen: (a) células LNCaP desarrolladas en un medio que contenía CSS al 2% durante 1 semana, (b) células LNCaP desarrolladas en un medio que contenía CSS al 2% durante 1 semana y estimuladas con mibolerona (10 nM) durante 9 horas, (c) tejido de próstata normal, (d) carcinoma de próstata grado 3, (e) tejido normal de próstata teñido con 1F9 (aumento x 1000), (f) tejido normal de próstata teñido con anticuerpos anti-PSA (aumento x 1000), (g) colon normal, (h) cáncer de colon. La tinción de proteínas secretadas dentro del lumen glandular de la próstata se indica mediante las flechas. Todas las fotos tienen un aumento de 400x, excepto donde se indica de manera diferente. Las observaciones comparativas de, por ejemplo, la localización de tinción de 20P1F12/TMPRSS2 en colon normal y cáncer de colon, muestran distintas diferencias en la acumulación de 20P1F12/TMPRSS2, un descubrimiento que proporciona evidencia confirmatoria del uso de 20P1F12/TMPRSS2 como blanco diagnóstico y terapéutico.
Figura 18. El análisis mutagénico de 20P1F12/TMPRSS2 revela la actividad auto-catalítica y el sitio de ruptura proteolítica. Se transfectaron células 293T con las diferentes mutantes puntuales de 20P1P12/TMPRSS2 según se describe en el Ejemplo 10. Se sondearon los lisados celulares (20 \mug de proteína) con MAb 1F9. Los estándares de peso molecular se indican en el lateral en kilodaltons (KD).
Figura 19. Expresión aumentada de 20P1F12/TMPRSS2 y del producto de ruptura auto-proteolítica de 32 kD en células LAPC4 con estimulación de andrógenos. Células LAPC4 confluentes al 70% en placas de 10 cm fueron privadas de andrógenos mediante incubación en medio RPMI que contenía 2% de FBS tratado con carbón vegetal-dextrano (CD-FBS) durante 4 días. El medio después se aspiró y se reemplazó con RPMI CD-FBS 2% fresco en presencia o ausencia del análogo de andrógenos milberona de concentración 5 nM. En el momento indicado, las células se cosecharon y se lisaron en tampón RIPA que contenía inhibidores de proteasas. A modo de comparación, en el análisis se incluyeron lisados de LNCaP y células LAPC4 desarrolladas en RPMI + FBS al 5% y de un lisado de tejido completo de un xenoinjerto de ratón LAPC4 SCID. Se separaron 25 \mug/calle del lisado celular indicado mediante SDS-PAGE en gradiente al 10-20%, se transfirieron a nitrocelulosa y se sometieron a análisis Western utilizando el mAb 1F9 anti-TMPRSS2 de la siguiente manera. Primero se bloqueó la transferencia durante 2 horas en TRIS 25 mM pH 7,5 y NaCl 150 mM (TBS) que contenía 3% de leche descremada. Después se incubó la transferencia durante toda la noche a 4ºC con 2 \mug/ml de mAb 1F9 en TBS de elevada salinidad (NaCl 500 mM + 0,15% de Tween-20 (hTBS-T) que contenía 1% de Leche. Se lavó la transferencia con hTBS-T y después se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con una dilución 1:4.000 del anticuerpo secundario conjugado IgGI-HRP anti-ratón de cabra (Southern Biotechnology) I hTBS-T + 1% de leche. Tras el lavado, se visualizaron bandas inmunorreactivas anti-TMPRSS2 mediante quimioluminiscencia aumentada y exposición a película autorradiográfica. Las flechas indican la proteína de longitud completa 20P1F12/TMPRSS2 de 70 kD y el producto de ruptura auto-proteolítica de 32 kD.
Figura 20. 20P1F12/TMPRSS2 se expresa en xenoinjertos de cáncer de próstata, en líneas celulares de cáncer de próstata, en fluido seminal normal y en tejidos clínicos. Se realizó el análisis de la expresión de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 mediante transferencia western utilizando el mAb 1F9 anti-TMPRSS2 según se indica en la Figura 19. Las muestras de 293T provenían de células transfectadas transitoriamente con un vector vacío o con un plásmido de expresión retroviral que codifica 20P1F12/TMPRSS2 de tipo salvaje o con una mutante puntual de 20P1F12/TMPRSS2 deficiente en proteasa. Los lisados de proteínas de la línea celular LAPC4 (LAPC4CL), células LNCaP, xenoinjertos LAPC4 y LAPC9 9, y tejidos clínicos combinados se obtuvieron mediante la solubilización de pellets celulares, xenoinjertos y tejidos en tampón de muestra 2X SDS-PAGE y calentamiento. La normalización de la carga de lisados se verificó mediante tinción con Ponceau S de membranas de nitrocelulosa después de la transferencia. El fluido seminal de un donante masculino normal se centrifugó durante 5 minutos a 14.000 G para paletizar las células y el material coagulado y el sobrenadante se diluyeron 4 veces en tampón RIPA. Se mezclaron 2 \mul de este fluido en tampón de muestra de SDS-PAGE y se corrieron en la calle indicada. Las flechas indican la proteína 20P1F12/TMPRSS2 de longitud completa de 70 kD, el producto de ruptura de 32 kD, y una banda inmunorreactiva nueva anti-TMPRSS2 de 90 kD en plasma seminal normal.
Figura 21. Inducción por andrógenos y liberación del fragmento auto-proteolítico de 32 kD en los sobrenadantes de células LAPC4 y LNCaP y la aparición de un complejo nuevo de proteínas inmunorreactivas anti-TMPRSS2 de 103 kD. Células LAPC4 y LNCaP (placas de 10 cm confluentes al 70%) fueron privadas de andrógenos por incubación en medio RPMI que contenía CD-FBS al 2% durante 5 días. El medio se aspiró y se reemplazó con 4 ml de medio fresco RPMI + CD-FBS al 2% con o sin mibolerona 1 o 10 nM y se incubó durante otras 48 horas. Los lisados celulares enteros ("WCL", 25 \mug/calle) o sobrenadantes de cultivo de tejido acondicionado (25 \mul, esterilizado con filtro de 0,22 \muM) después se sometieron a SDS-PAGE y análisis Western anti-TMPRSS2 con mAb 1F9 según se describe en la Figura 19. Las flechas indican el fragmento auto-proteolítico de 32 kD y el complejo inmunorreactivo anti-TMPRSS2 de 103 kD en medio acondicionado. Las concentraciones de PSA de los sobrenadantes, determinadas por un ELISA (Anogen) comercial, se indican a modo de comparación con una conocida proteína secretada inducida por andrógenos.
Figura 22. Liberación del fragmento proteolítico de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 en el sobrenadante de los cultivos de células LNCaP y en el suero de ratones SCID portadores de xenoinjertos de LNCaP. Los lisados celulares enteros del tampón RIPA y los sobrenadantes de cultivo de tejido acondicionado de células LNCaP tratadas según se describe en la Figura 21 o desarrolladas en RPMI + FBS al 5% o suero de ratones SCID portadores de xenoinjertos de LNCaP se inmunoprecipitaron con mAb anti-TMPRSS2 acoplado covalentemente a cuentas de proteína G de la siguiente manera. 1 ml de lisados celulares enteros de RIPA (600 \mug de proteína total), 2,5 ml de acondicionado diluido con un volumen igual de tampón RIPA, y 340 \mul (15 mg de proteína total) de suero SCID diluido hasta 1 ml con tampón RIPA primero se preclarificaron durante 3 horas a 4ºC mediante incubación con 50 \mul de una suspensión de cuentas de proteína G al 50% en tampón RIPA. Se acopló covalentemente mAb 1F9 anti-TMPRSS2 a cuentas de proteína G utilizando el reactivo de entrecruzamiento homobifuncional pimelimidato de dimetilo (DMP) según se describe en "Using Antibodies, a Laboratory Manual", Harlow y Lane, 1999, pág. 323. Después se añadieron 50 \mul de una suspensión al 50% de IF9/cuentas de proteína G (\sim50 \mug de mAb) a cada muestra y se incubaron durante toda la noche a 4ºC. Los inmunoprecipitados se lavaron 4 veces en tampón RIPA y los complejos inmunes se disociaron mediante la adición de 35 \mul de tampón de muestra 3X SDS-PAGE y calentamiento. Después se sometieron 25 \mul de cada muestra a SDS-PAGE y transferencia Western con mAb 1F9 según se describe en la Figura 19. Se sometieron los lisados de tampón RIPA de células 293T (293T wcl) y CD-FBS RPMI al 2% (medio) al protocolo IP/Western como controles negativos. Las flechas indican la proteína 20P1F12/TMPRSS2 de longitud completa de 70 kD, el fragmento de ruptura de 32 kD, y el complejo inmunorreactivo novedoso anti-TMPRSS2 de 103 kD en sobrenadantes estimulados por andrógenos y suero SCID.
Figura 23. Expresión del fragmento de ruptura de 20P1F12/TMPRSS2 de 32 kD y un complejo inmunorreactivo novedoso de 20P1F12/TMPRSS2 de 103 kD en pacientes con cáncer de próstata y colon y muestras de suero de ratones SCID portadores del tumor LNCaP. 100 \mul de suero de ratón SCID portador del tumor LNCaP o sin tratamiento previo (A) o 1 ml de las muestras séricas clínicas humanas indicadas (B) se inmunoprecipitaron con anticuerpos monoclonales 1F9 anti-TMPRSS2 covalentemente acoplados/cuentas de agarosa de proteína G de la siguiente manera. Sueros de ratón SCID y sueros humanos se ajustaron a 1 ml y 2 ml, respectivamente, con tampón RIPA (TRIS 25 mM, pH7,5, NaCl 150 mM, Triton-X-100 al 1%, desoxicolato de sodio al 0,5%, SDS al 0,1%, EDTA 0,5 mM) y se preclarificaron con cuentas de agarosa de proteína G durante 3 horas a 4ºC. Se acopló mAb lF9 anti-TMPRSS2 covalentemente a cuentas de proteína G utilizando el reactivo de entrecruzamiento homobifuncional pimelimidato de dimetilo (DMP) según se descrito en "Using Antibodies, a Laboratory Manual", Harlow y Lane, 1999, pág. 323. Después se añadieron 50 \mul de una suspensión al 50% de 1F9/cuentas de proteína G (\sim50 \mug de mAb) a cada muestra y se incubaron durante toda la noche a 4ºC. Los inmunoprecipitados se lavaron 4 veces en tampón RIPA y los complejos inmunes se disociaron mediante la adición de 40 \mul del tampón de muestra 3X SDS-PAGE y calentamiento. Se separaron 25 \mul/calle del inmunoprecipitado indicado o del medio de cultivo de tejido acondicionado de LNCaP o (C) se separaron mediante SDS-PAGE los volúmenes indicados del lisado tisular entero de la próstata de una víctima de accidente masculina normal de 28 años, se transfirieron a nitrocelulosa y se sometieron a análisis Western anti-TMPRSS2 con mAb IF9 según se describe en la Figura 19. Las flechas indican el fragmento de ruptura de 20P1F12/TMPRSS2 de 32 kD y la banda inmunorreactiva novedosa anti-TMPRSS2 de 103 kD. Se presenta una exposición más oscura de la porción inferior del panel A para visualizar mejor el fragmento de 32 kD en suero de ratón portador de tumor LNCaP.
Figura 24. Expresión del fragmento de clivaje de 20P1F12/TMPRSS2 de 32 kD y un complejo inmunorreactivo novedoso de 20P1F12/TMPRSS2 de 90 kD en plasma seminal normal. Panel A. Se sometieron lisados tisulares de xenoinjertos de LAPC4 y LAPC9 de ratón SCID y cultivos de líneas celulares de LNCaP y LAPC4 o plasma seminal normal a análisis Western con mAb 1F9 anti-TMPRSS2. Panel B. Se sometieron plasma seminal normal o lisados celulares y sobrenadantes acondicionados de células LNCaP incubadas durante 4 días en FBS al 2% tratado con carbón vegetal/dextrano y después incubados en presencia (+) o ausencia (-) de mibolerona 10 nM durante 8 horas, se sometieron a inmunoprecipitación y análisis Western con mAb 1F9. Las flechas indican el fragmento de clivaje de 32 kD, la proteína 20P1F12/TMPRSS2 de longitud completa de 70 kD, y los complejos inmunorreactivos novedosos de 20P1F12/TMPRSS2 de 103 kD y 90 kD presentes en sobrenadante de LNCaP acondicionado y plasma seminal, respectivamente.
Figura 25. Detección de expresión de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 en xenoinjerto de cáncer de próstata de LAPC9, línea celular de cáncer de próstata LNCaP y fluido seminal normal mediante 7 anticuerpos monoclonales anti-TMPRSS2. Se separaron lisados tisulares del xenoinjerto de ratón SCID de LAPC9, de células LNCaP estimuladas con mibolerona (10 nM durante 48 horas) y de plasma seminal humano normal mediante SDS-PAGE en gel con gradiente al 10-20%, se transfirieron a nitrocelulosa y se sometieron a análisis Western con sobrenadantes de cultivo de tejido libre de suero condicionado de 7 hibridomas de anticuerpos monoclonales anti-TMPRSS2 de la siguiente manera. Primero se bloquearon las transferencias durante 2 horas a temperatura ambiente con TBS (Tris 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM) + 3% de leche descremada. Después se incubaron las transferencias durante toda la noche a 4ºC con una dilución 1 a 6 de sobrenadantes de hibridomas acondicionados libres de suero en TBS de elevada salinidad (hTBS; Tris 25 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM) que contenía Tween 20 al 0,15% (hTBS-T) y 1% de leche descremada. Se lavaron las transferencias 3X con hTBS-T y después se incubaron con una dilución 1:4.000 de conjugado IgG-HRP anti-ratón de cabra en hTBS-T + 1% de leche durante 1 hora a TA. Después se lavaron las transferencias 3X con hTBS-T. Después se visualizaron las bandas inmunorreactivas anti-TMPRSS2 mediante quimioluminiscencia aumentada y exposición a película auto-radiográfica. Las flechas indican la proteína 20P1F12/TMPRSS2 de longitud completa de 70 kD, el fragmento auto-catalítico de 32 kD y la banda de plasma seminal de 90 kD.
Figura 26. Elevada expresión del fragmento de ruptura de 20P1F12/TMPRSS2 de 32 kD en líneas celulares de cáncer de colon y muestras de tejido de cáncer de colon en comparación con tejido de colon normal. Los lisados de especímenes clínicos que representaban tejido combinado de cáncer de colon o tejido adyacente normal (lado izquierdo de la transferencia) y de líneas celulares de cáncer de colon (lado derecho de la transferencia) y de xenoinjertos de cáncer de próstata de LAPC4 y LAPC9, se sometieron a análisis de transferencia Western anti-TMPRSS2 utilizando mAb 1F9. Las flechas indican la posición del fragmento auto-catalítico de 32 kD y de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 de longitud completa de 70 kD. Se observa mayor expresión del fragmento de 32 kD en el tejido de cáncer de colon que en el tejido adyacente normal correspondiente. También, la especie inmunorreactiva predominante presente en las líneas celulares de cáncer de colon también es el fragmento de 32 kD. Resulta interesante destacar que existe muy poca expresión de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 de longitud completa en las muestras de colon pero existe una fuerte expresión de una banda inmunorreactiva anti-TMPRSS2 de \sim90 kD en los tejidos de colon que puede representar un complejo del fragmento de 32 kD.
Figs. 27A-C. Se anlizaron células PC3 progenitoras y células PC3 que expresan de manera estable 20P1F12/
TMPRSS2 para determinar su potencial invasivo utilizando un sistema Transwell Insert System (Becton Dickinson). Las células se cargaron con un colorante fluorescente, en particular calceína, y se implantaron en el pocillo superior de la inserción Transwell. Se determinó la invasión midiendo la fluorescencia de células en la cámara inferior en relación con la fluorescencia de la población entera de células. El ensayo se realizó por triplicado.
Figura 28. Actividad de proteasa de 20P1F12/TMPRSS2. Se analizó GST-20P1F12/TMPRSS2 recombinante purificada (aa255-492) para determinar la actividad de proteasa utilizando caseína (FTC) marcada con tiocarbamoílo fluorescente como sustrato (Molecular Probes). Se incubaron diferentes dosis de GST-20P1F12/TMPRSS2 a 37ºC con FTC-caseína durante un período de 6 horas. Se leyó la fluorescencia a intervalos de 10 minutos utilizando un fluorómetro. Se detecta la ruptura de la caseína por parte de la 20P1F12/TMPRSS2 a través del aumento de la fluorescencia. El ensayo se realizó por triplicado.
Figura 29. Efectos de la proteína de fusión 20P1F12/TMPRSS2 recombinante purificada sobre la invasión. Células PC3 cargadas con calceína se implantaron en la cámara de invasión solas en medio solo o en presencia de proteína de fusión recombinante purificada que contenía el dominio de proteasa de 20P1F12/TMPRSS2, es decir GST-TMPRSS2 (aa 255-492). Se utilizó GST purificada como control. Se determinó la invasión midiendo la fluorescencia de células en la cámara inferior en relación con la fluorescencia de la población entera de células. El ensayo se realizó por triplicado.
Figura 30. Se implantaron células PC3 cargadas con calceína en la cámara de invasión en medio solo o en presencia de 1 ng/ml de proteína de fusión 20P1F12/TMPRSS2 purificada recombinante, es decir GST-TMPRSS2 (aa 255-492). Se añadieron control o mAb (1F9) anti-TMPRSS2 a las muestras indicadas. Se determinó la invasión midiendo la fluorescencia de células en la cámara inferior en relación con la fluorescencia de la población entera de células. El ensayo se realizó por triplicado.
Figura 31. Oligonucleótidos antisentido de 20P1F12/TMPRSS2. Se cargaron por raspado células LNCaP con morfolino-oligonucleótidos de concentración 10 o 30 \muM marcados con FITC. Se hicieron crecer las células durante 24 horas y se evaluó la fluorescencia utilizando citometría de flujo. Este histograma muestra que el 100% de las células expuestas a morfolino-oligonucleótidos retienen estos oligonucleótidos 24 horas después de la carga.
Figura 32. Los oligonucleótidos antisentido de 20P1F12/TMPRSS2 reducen los niveles de proteína 20P1F12/
TMPRSS2. Se cargaron por raspado células LNCaP con morfolino-oligonucleótidos de concentración 10 o 30 \muM. Se hicieron crecer las células durante 48 horas y se evaluó la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 mediante transferencia western utilizando el anticuerpo 1F9 anti-TMPRSS2. Los oligonucleótidos antisentido de 20P1F12/TMPRSS2 reducen específicamente la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 de longitud completa en células LNCaP (calles 3 y 4).
Figura 33. Expresión de TMPRSS2 en Especímenes de Cáncer en Pacientes. Se realizó un ensayo de la expresión de TMPRSS2 en un panel de cánceres de riñón humano (T) y sus respectivos tejidos normales correspondientes (N) (el tejido normal se tomó de regiones normales adyacentes al tumor) en las transferencias de puntos de ARN. En los tejidos de riñón, la expresión de TMPRSS2 mayormente se detecta en tejidos normales en comparación con tejidos tumorales. En un caso, TMPRSS2 aparece regulada por aumento en el tejido tumoral en comparación con el tejido normal.
Fig. 34. Reconocimiento del fragmento del dominio de TMPRSS2 LDLRA/SRCR tras la ruptura del dominio de proteasa. Se generó un anticuerpo policlonal de ratón (pAb) dirigido a la región extracelular de TMPRSS2 que carece del dominio de proteasa mediante inmunización con proteína Tag5 purificada por afinidad con quelato metálico, que codifica los dominios LDLRA y SRCR (aminoácidos 111-255). Se utilizó este suero en análisis de transferencia Western de células LNCaP de cáncer de próstata que fueron privadas de andrógeno durante 3 días (-A) mediante la incubación en medio RPMI que contenía FBS tratado con carbón vegetal/dextrano al 2%, o fueron privadas y se re-estimularon con andrógeno durante 48 horas (+A) mediante incubación con mibolerona 20 nM. Se prepararon lisados celulares y se sometieron a transferencia Western con una dilución 1:500 de suero de ratón anti-LDLRA/SRCR o con 2 \mug/ml de MAb IF9 que reconoce el dominio de proteasa de TMPRSS2 (Figura 34B). Se indican con flechas TMPRSS2 de longitud completa de 70 kD y el dominio de proteasa de 32 kD reconocido mediante mAb 1F9 y el fragmento de longitud completa posterior a la ruptura de 40 kD que contenía los dominios LDLRA/SRCR reconocidos mediante el pAb de ratón. Estos dominios también se ilustran en forma esquemática en la Figura 34A.
La Figura 35 ilustra la inhibición de la formación de tubos por TMPRSS2 en células HUVEC en diversas condiciones.
La Figura 36 ilustra la inhibición de la proliferación de HUVEC mediante TMPRSS2.
Figura 37. La Expresión Constitutiva de TMPRSS2 en Células PC3 Produce un Aumento en la Formación de Tumores Subcutáneos. Se manipularon genéticamente células PC3 para expresar el ADNc de TMPRSS2 mediante infección utilizando transferencia estándar de genes retrovirales. Ratones SCID machos fueron inyectados con células tumorales o de control. Las mediciones de tumores comenzaron el día 21 y se realizaron dos veces por semana durante las siguientes 3 1/2 semanas.
Figura 38. Aumento en la Formación del Tumor LAPC-9 por el MAb 1F9 Anti-TMPRSS2. A., efecto del anticuerpo sobre el crecimiento tumoral. B., efecto del anticuerpo sobre el PSA sérico.
Fig. 39. Reconocimiento del dominio TMPRSS2 LDLRA/SRCR en células LNCaP mediante anticuerpos policlonales de ratón.
Fig. 40. Títulos relativos de anticuerpos LDLRA/SRCR anti-TMPRSS2 en suero humano.
Descripción detallada de la invención
A menos que se defina lo contrario, todos los términos de la técnica, notaciones y otra terminología científica utilizada en la presente memoria tienen por objeto tener los significados comúnmente comprendidos por aquellos expertos en la técnica a quienes pertenece esta invención. En algunos casos, los términos con significados comúnmente comprendidos se definen en la presente memoria por razones de claridad y/o para una rápida referencia, y no debe necesariamente interpretarse que la inclusión de tales definiciones en la presente memoria representa una diferencia sustancial sobre lo que en general se entiende en la técnica. Las técnicas y procedimientos descritos o a los que se hace referencia en la presente memoria en general son bien comprendidos y comúnmente se emplean utilizando la metodología convencional por parte de aquellos expertos en la técnica, tales como, por ejemplo, las metodologías de clonación molecular muy utilizadas descritas en Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2º edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Si corresponde, los procedimientos que involucran el uso de kits y reactivos disponibles en el comercio en general se llevan a cabo de conformidad con protocolos y/o parámetros definidos por el fabricante a menos que se indique lo contrario.
Según se utiliza en la presente memoria, el término "polinucleótido" significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases o pares de base de longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido, y tiene como objeto incluir formas de ADN mono- y bicatenarias.
Según se utiliza en la presente memoria, el término "polipéptido" significa un polímero de al menos 6 aminoácidos. A lo largo de la especificación, se utilizan designaciones estándar de tres letras o una única letra para los aminoácidos. En este contexto un "polipéptido 20P1F12/TMPRSS2" incluye, por ejemplo, una proteína que posee la proteína de secuencia de 492 aminoácidos que se muestra en la Figura 1 así como el dominio de proteasa de 32 kD que contiene el fragmento que se muestra, por ejemplo, en la Figura 8.
Según se utiliza en la presente memoria, los términos "hibridizar", "hibridizante", "hibridiza" y similares, utilizados en el contexto de los polinucleótidos, tienen por objeto referirse a las condiciones convencionales de hibridización, preferiblemente tales como hibridización en formamida al 50%/6XSSC/SDS al 0,1%/100 \mug/ml ssADN, en los que las temperaturas para la hibridización están por encima de los 37 grados C y las temperaturas para el lavado en 0,1X SSC/SDS al 0,1% están por encima de los 55 grados C y, más preferiblemente, a las condiciones rigurosas de hibridización.
La "rigurosidad" de las reacciones de hibridización es fácilmente determinable por un experto en la técnica, y en general es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentración salina. En general, las sondas más largas requieren mayores temperaturas para una alineación apropiada, mientras que las sondas más pequeñas necesitan temperaturas más bajas. La hibridización en general depende de la capacidad del ADN desnaturalizado para realinearse cuando están presentes hebras complementarias en el entorno por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor es el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridizable, mayor es la temperatura relativa que puede utilizarse. Como resultado, se obtiene que las temperaturas relativas mayores tenderían a hacer que las condiciones de reacción sean más rigurosas, mientras que las temperaturas más bajas reducen esta tendencia. Para detalles adicionales y una explicación de la rigurosidad de las reacciones de hibridización; véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
Las "condiciones rigurosas" o "condiciones de elevada rigurosidad", según se define en la presente memoria, pueden identificarse por aquellas que: (1) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/dodecil sulfato de sodio al 0,1% a 50ºC; (2) emplean durante la hibridización un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo formamida al 50% (v/v) con albúmina sérica bovina al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón fosfato de sodio 50mM a pH 6,5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42ºC; o (3) emplean formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio al 0,1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), SDS al 0,1%, y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y formamida al 50% a 55ºC, seguido por un lavado de alta rigurosidad que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.
Las "condiciones moderadamente rigurosas" pueden identificarse según lo descrito por Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridización (p. ej., temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos rigurosas que las descritas más arriba. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es la incubación durante toda la noche a 37ºC en una solución que comprende: formamida al 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x Solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado por cizallamiento, seguido por lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50ºC. El técnico experto reconocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc., según sea necesario para acomodar factores tales como longitud de sondas y similares.
En el contexto de las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el término "identidad" se utiliza para expresar el porcentaje de restos de aminoácidos en las mismas posiciones relativas que son iguales. También en este contexto, el término "homología" se utiliza para expresar el porcentaje de restos de aminoácidos en las mismas posiciones relativas que son o bien idénticos o similares, utilizando los criterios de aminoácidos conservados del análisis de BLAST, según lo que en general se entiende en la técnica. Por ejemplo, los valores de % de identidad pueden generarse mediante WU-BLAST-2 (Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266:460-480; http://blast.wustl/edu/blast/README.html). Más abajo se proporcionan más detalles con respecto a las sustituciones de aminoácidos, que se consideran conservadoras conforme a dichos criterios.
A lo largo de las subsecciones que siguen se proporcionan definiciones adicionales.
La presente invención se refiere a métodos y composiciones para el diagnóstico y terapia de ciertos cánceres utilizando polinucleótidos aislados correspondientes al gen 20P1F12/TMPRSS2, proteínas codificadas por el gen 20P1F12/TMPRSS2 y fragmentos del mismo, y anticuerpos capaces de reconocer y unirse específicamente a las proteínas 20P1F12/TMPRSS2. A lo largo de esta Solicitud, los métodos y composiciones típicamente se describen para el uso en el contexto de los cánceres de próstata y colon. Sin embargo, como los datos presentados en la presente memoria muestran que 20P1F12/TMPRSS2 se expresa en tumores que surgen de otros linajes celulares (véase, p. ej., la Figura 5D que muestra la expresión de 20F1F12/TMPRSS2 en cánceres de vejiga, y la Figura 7B que muestra la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en cáncer de riñón, pulmón y ovario, así como ciertos cánceres metatásicos), el técnico experto entenderá que las descripciones diagnósticas y terapéuticas también son aplicables a cánceres de estos linajes. Los datos de la Figura 7B y la Figura 33 indican que 20P1F12/TMPRSS2 se expresa en cánceres de vejiga, pulmón y ovario y ciertos cánceres metatásicos, pero no se expresa en los tejidos normales de este tipo, y de este modo puede servir como marcador de cáncer. Los datos presentados en la Figura 7B y la Figura 33 indican que 20P1F12/TMRPSS2 se expresa en tejido de riñón normal, pero no se expresa en cáncer de riñón, un patrón opuesto al observado en los otros tejidos. (En una de las muestras ilustradas en la Figura 7B, 20P1F12/TMPRSS2 está regulada por aumento en el tejido tumoral en comparación con el tejido normal.)
La administración de TMPRSS2, por lo tanto, puede ser terapéuticamente beneficiosa en el contexto del cáncer de riñón. Como diagnóstico para el cáncer de riñón se utiliza el análisis del gen que codifica TMPRSS2, por lo cual una mutación del gen se correlaciona con la existencia de, o la probabilidad de estar sometido a, cáncer de riñón. La administración del dominio serina-proteasa de TMPRSS2 también puede ser terapéuticamente beneficiosa en el tratamiento de ciertos cánceres, tales como el cáncer de riñón, donde el dominio serina-proteasa de TMPRSS2 inhibe el crecimiento o formación del tumor.
El gen 20P1F12/TMPRSS2 codifica una proteína prevista de 492 aminoácidos que contiene múltiples dominios, incluyendo un dominio serina-proteasa, un dominio receptor de barredores rico en cisteína, un dominio clase A receptor de LDL, y un dominio transmembrana previsto según se ha descrito para TMPRSS2 (Paoloni-Giacobino et al., 1997, Genomics 44: 309-320). Paoloni-Giacobino et al. descubrieron que el gen TMPRSS2 se expresa fuertemente en intestino delgado y sólo débilmente en varios otros tejidos y también han mapeado el gen TMPRSS2 en el cromosoma 21. Se desconoce el papel fisiológico de TMPRSS2. Los solicitantes han clonado un ADNc de longitud completa que comprende la región codificadora entera del gen 20P1F12/TMPRSS2, pero contiene varias diferencias de secuencias nucleotídicas en relación con la secuencia publicada de TMPRSS2. Seis de estas diferencias de secuencia dan como resultado diferencias de aminoácidos. No se conocen actualmente la naturaleza y significación específicas de estos cambios. Sin embargo, una cantidad de diferencias de aminoácidos entre la proteína descrita por Paoloni-Giacobino et al. y la proteína 20P1F12/TMPRSS2 descrita en la presente memoria son cambios no conservadores que caen dentro del dominio de proteasa de la proteína (véase, p. ej., la Figura 3). En consecuencia, una proteína que posee la secuencia descrita en Paoloni-Giacobino et al. puede tener una actividad funcional significativamente diferente de la proteína descrita en la presente memoria. Por otra parte, se sabe en la técnica que los genes poseen una cierta proporción de variabilidad y que esta variabilidad puede afectar a varios aspectos de la fisiología celular, incluyendo aquellos asociados con la oncogénesis (véase, p. ej., Rebbeck et al., J. Natl. Cancer Inst. 90(16): 1225-1229 (1998) y Tonin et al., Semin. Surg. Oncol. 18(4): 281-286 (2000)). Además, el nuevo 20P1F12/TMPRSS2 de los solicitantes posee un patrón de expresión completamente diferente en comparación con lo que se ha conocido para el TMPRSS2 informado previamente.
Debido a que 20P1F12/TMPRSS2 se expresa en las células cancerosas descritas y contiene un dominio de proteasa, es posible que funcione en el desarrollo, invasión y/o avance de estos cánceres, particularmente en el desarrollo de la enfermedad metastásica. Al respecto, se sabe que las proteasas están involucradas en la invasión y metástasis de las células cancerosas (Henriet et al., 1999, APMIS 107(1):111-9; Rochefort et al., 1999, APMIS 107(1):86-95; Webber et al., 1995, Clin Cancer Res 1(10):1089-94; Duffy, 1996, Clin Cancer Res 2(4):613-8; Webber y Waghray, 1995 Clin Cancer Res 1(7):755-61). Por ejemplo, se cree que el activador de plasminógenos tipo uroquinasa (u-PA), la catepsina D y PSA modulan la capacidad de las células del cáncer de próstata para formar metástasis (véase, p. ej., Fortier et al., J. Nat. Cancer Inst. 91(19): 1635-1640(1999)). La participación potencial de la función de 20P1F12/TMPRSS2 en el cáncer de próstata y colon, y particularmente en metástasis, puede evaluarse según se describe en los Ejemplos de más abajo.
Es interesante destacar que la estructura primaria de 20P1F12/TMPRSS2 y TMPRSS2 contiene dominios de interacción proteína-proteína y un dominio de proteasa y se encuentra que forma un complejo proteico (véase, p. ej., la Figura 21). No está clara la función de 20P1F12/TMPRSS2 y TMPRSS2. La función de 20P1F12/TMPRSS2 y TMPRSS2 puede involucrar la unión con proteínas sustrato en el medio extracelular a través de sus dominios SRCR y/o LDLA. Ejemplos de proteínas que exhiben dominios SRCR incluyen: CD6, una molécula de adhesión que se une a ALCAM (molécula de adhesión celular a leucocitos activados) y media la unión celular timocito-epitelio tímico (Whitney et al., 1995, J Biol Chem 270:18187); CD5 (Ly-1), una proteína de células T que se une a CD72 en las células B y puede estar involucrada en la comunicación de células T-B (Luo et al., 1992, J Immunol. 148:1630); BSSP-3, una serina-proteasa específica del cerebro con una estructura similar a una rosquilla y tres motivos receptores barredores ricos en cisteína (Yamamura et al., 1997, Biochem Biophys Res Commun 239:386). Los dominios LDLR se han vinculado con la unión y reciclado de complejos inhibidores de proteasa tales como los complejos uPA-activador 1 del plasminógeno (PAI-1) (véase, p. ej., Strickl et al., FASEB J. 9: 890-898 (1995); Moestrup Biochim. Biophys. Acta 1197: 337-360 (1994)).
El tejido de la próstata expresa una serie de proteasas reguladas por andrógenos, incluyendo el PSA, la calicreína glandular humana (hK2) y la prostasa/KLK-L1 (Wolf et al., 1992, Mol Endocrinol 6:753-762; Nelson et al., 1999 PNAS 96:3114-3119; Yousef et al., 1999, Cancer Res 59:4252-4256). 20P1F12/TMPRSS2 es único entre estas proteasas debido a sus características estructurales. Esta es una proteasa transmembrana tipo II putativa con un dominio receptor barredor rico en cisteína (SRCR) y un dominio receptor A (LDLA) de lipoproteínas de baja densidad (Paoloni-Giacobino et al., 1997). El dominio proteasa se localiza en el extremo carboxilo terminal, que es secretado según se describe en la presente memoria. Estas características proporcionaron evidencia de que la proteína 20P1F12/TMPRSS2 puede expresarse en la membrana celular y podría funcionar como receptor para otras proteínas o moléculas pequeñas. El dominio proteasa de 20P1F12/TMPRSS2 es sumamente homólogo respecto de la hepsina, también una proteasa transmembrana tipo II (Leytus et al., 1988, Biochemistry 27:1067), que es regulada por aumento en el cáncer ovárico (Yan et al., 1997, Cancer Res 57:2884). Los estudios de fraccionamiento sub-celular localizaron la Hepsina en la fracción membranosa de las células HepG2 cultivadas (Tsuji et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:16948-16953). Los estudios provistos en la presente memoria muestran que en los cánceres de próstata y colon, la mayor parte de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 se escinde proteolíticamente y es secretada. Las regiones restantes, incluyendo los dominios LDLA y SRCR, aún es posible que estén asociadas a la membrana y podrían funcionar como receptores para los componentes intracelulares independientes del dominio proteasa que podría estar involucrado, por ejemplo, en la unión de barrido y reciclado de complejos proteasa-inhibidor (véase, p. ej., Takeuchi et al., PNAS: 96: 11054-11061 (1999)).
La inactivación mutacional de la proteasa 20P1F12/TMPRSS2 demuestra que la ruptura y liberación del dominio de proteasa es una consecuencia de su propia actividad catalítica, demostrando que 20P1F12/TMPRSS2 es su propio sustrato (véase, p. ej., el Ejemplo 10). También se ha observado una similar ruptura auto-catalítica para la pepsina (Thien-Khai et al.,1997, J. Biol. Chem. 272(50):31315-31320). La auto-escisión de 20P1F12/TMPRSS2 se produce en Arg 255 y resulta en la liberación del dominio de proteasa. Los estudios de tinción de tejidos que utilizan Mab anti-20P1P12/TMPRSS2 proporcionan evidencia de que la proteína se concentra en estructuras vesiculares y es secretada en el lumen glandular de tejido de próstata normal y canceroso. El análisis del medio de cultivo celular y sueros de ratones portadores de tumores confirmó que la proteasa de 20P1F12/TMPRSS2 es secretada por células de cáncer de próstata. Estos datos proporcionan evidencia de que la proteasa de 20P1F12/TMPRSS2 liberada puede ser útil como marcador sérico potencial de diagnóstico o pronóstico para el cáncer de próstata y posiblemente cáncer de colon y que la ruptura del dominio de proteasa está involucrada en el crecimiento e invasión tumorales. La proliferación y metástasis de células cancerosas, así como la destrucción de la arquitectura del tejido normal puede, como el PSA, causar un incremento en los niveles séricos de 20P1F12/TMPRSS2 que significaría la presencia de células cancerígenas. Datos adicionales indican que 20P1F12/TMPRSS2 también puede ser útil como marcador sérico de diagnóstico o pronóstico para el cáncer de vejiga, pulmón y ovario, y cánceres metatásicos.
Describimos anticuerpos que específicamente reconocen 20P1F12/TMPRSS2 funcional expresada en tejidos cancerosos, junto con métodos de detección en tejidos cancerosos. La proteína 20P1F12/TMPRSS2 expresada en cánceres de próstata, colon, vejiga, pulmón y ovario presenta ruptura autocatalítica. En consecuencia la actividad de serina-proteasa y el sitio de ruptura parecen mostrar actividad normal (véase la Figura 34); aquellas áreas de la proteína aparentemente no tienen mutaciones que alteren la actividad normal. De este modo, en estos cánceres la proteína TMPRSS2 parece no estar mutada, sino que tiene su configuración nativa.
La proteasa de 20P1F12/TMPRSS2S secretada puede estar involucrada en el procesamiento y posiblemente en la activación de los factores de modulación del crecimiento presentes en el espacio extracelular. Trabajos recientes con PSA y hK2 han demostrado que pueden desempeñar un papel en la activación de los factores de modulación de crecimiento importantes en la respuesta osteoblástica del cáncer de próstata con metástasis en hueso (Koeneman et al., 1999, Prostate 39:246-261). Uno de estos factores, la proteína relacionada con la hormona paratiroidea (PTHrP), ha demostrado incrementar el porcentaje de crecimiento de tumores en próstata in vivo y proteger las células LNCaP de la apoptosis (Dougherty et al., 1999, Cancer Res. 59:6015-6022). Queda por ver si 20P1F12/TMPRSS2 es capaz de activar PTHrP y/u otros factores que pudieran influir en el crecimiento del cáncer de próstata y/o cáncer de colon. El patrón de expresión y la localización de 20P1F12/TNTPRSS2 la convierten en un blanco previamente no apreciado para la terapia en cánceres de próstata y colon.
La invención se basa, en parte, en el aislamiento de un fragmento de ADNc correspondiente al gen 20P1F12/
TMPRSS2 mediante la clonación por Hibridación Sustractiva por Supresión y en los estudios detallados de caracterización molecular y bioquímica descritos en los Ejemplos. El fragmento de ADNc inicialmente aislado, el clon 20P1F12, mostró identidad en una parte superpuesta de la secuencia no traducida 3' del ADNc de longitud completa recientemente descrito que codifica TMPRSS2. Los cebadores diseñados para amplificar específicamente el gen correspondiente a 20P1F12 después se utilizaron para caracterizar la expresión 20P1F12/TMPRSS2 en xenoinjertos de cáncer de próstata, en próstata normal y en una variedad de tejidos normales y cancerosos adicionales. Los ADNc de longitud completa que comprenden el gen 20P1F12/TMPRSS2 completo se asilaron independientemente de bibliotecas separadas y en la presente memoria se proporciona la secuencia codificadora entera identificada a partir de estos clones (véase, p. ej., la Figura 1).
El nucleótido y las secuencias deducidas de aminoácidos del nuevo gen 20P1F12/TMPRSS2 (también denominado 20P1F12-GTC1 en la presente memoria) se muestran en la Figura 1. Existen diferencias significativas en las secuencia de aminoácidos codificadas por el gen 20P1F12-GTC1/TMPRSS2 en comparación con la secuencia previamente informada de TMPRSS2 (véase la alineación de aminoácidos de la Figura 3). Por ejemplo, cuatro de las diferencias de aminoácidos están en el dominio de proteasa, tres de las cuales son diferencias de aminoácidos no conservativas y que podrían afectar la función y/o especificidad de la proteasa. La nueva proteína 20P1F12/TMPRSS2 de los solicitantes ha sido caracterizada extensivamente, según se describe además en los Ejemplos de la presente memoria. La proteína 20P1F12/TMPRSS2 es una proteína transmembrana tipo II glicosilada con un dominio de proteasa C-terminal secretado.
El gen 20P1F12/TMPRSS2 es regulado por andrógenos. Resulta interesante destacar que, en el cáncer de próstata, la regulación de andrógenos y el desarrollo de un estado refractario a los andrógenos es un aspecto significativo del avance neoplásico y el crecimiento independiente de andrógenos está asociado a la enfermedad metastásica. Además, se sabe que la amplificación del gen receptor de andrógenos incrementa la expresión de la proteína PSA tisular en carcinomas de próstata refractarios a hormonas (véase, p. ej., Koivisto et al., J. Patholo. 189(2): 219-223 (1999); Koivisto et al., Am. J. Pathol. 152(1): 1-9 (1998)). La proteína 20P1F12/TMPRSS2 es detectable en la superficie celular. También se observa la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en el cáncer de próstata, incluyendo expresión de alto nivel en la enfermedad avanzada y metastásica. Además, 20P1F12 parece estar sobreexpresada en el cáncer de colon y también puede estar expresado en otros cánceres (véase, p. ej., la Figura 5D).
Además de las diferencias en la estructura entre el gen 20P1F12-GTC1/TMPRSS2 de los solicitantes (Figura 1) y la secuencia previamente informada (Figura 2), los resultados del análisis de expresión de los solicitantes son contrarios a los informados por Paoloni-Giacobino et al. Más aún, para los cánceres de próstata, colon, vejiga, ovario y pulmón, así como los cánceres metatásicos, los datos descritos en la presente memoria son contrarios a las afirmaciones de Wong et al. (Patente Estadounidense Núm. 6.166.194, otorgada el 26 de Diciembre de 2000) en e sentido de que la proteína TMPRSS2 sigue expresándose en tejidos malignos. Además, sobre la base de su función continua como proteasa, TMPRSS2 parece haber mantenido su configuración nativa. En particular, el análisis de los solicitantes de la expresión del gen 20P1F12/TMPRSS2 mediante RT-PCR en 16 tejidos normales muestra el nivel más alto de expresión en próstata, con niveles sustancialmente menores detectados en colon, páncreas, riñón, hígado y pulmón y expresión no detectable en intestino delgado (Figura 5, Paneles B y C). Se obtuvieron resultados similares en el análisis de transferencia Northern, aunque el nivel de expresión detectado en próstata mediante transferencia Northern es extremadamente alto en relación con estos otros tejidos en los que solamente se detecta expresión de muy bajo nivel (Figura 6). Más aún, según se muestra en la Tabla 1, el análisis inmunohistoquímico muestra expresión de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 en próstata y páncreas. Además, el patrón de expresión de 20P1F12/TMPRSS2 (tal como los datos presentados en la Figura 6) ha sido corroborado por otros investigadores (véase, p. ej., Lin et al., Cancer Res. 1999, 59(17): 4180-4184).
El análisis de expresión también muestra alto nivel de expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en todos los xenoinjertos de cáncer de próstata probados, en aproximadamente los mismos niveles observados en próstata normal (Figura 5, Panel A). El análisis de transferencia Northern muestra resultados similares, con un nivel de expresión algo más bajo detectado en el xenoinjerto LAPC-9 en relación con los xenoinjertos LAPC-4 y próstata normal; también se detecta expresión en algunos de las líneas celulares de cáncer de próstata analizadas (Figura 7). El gen 20P1F12/TMPRSS2 también se expresa en una serie de líneas celulares de cáncer de próstata (Figura 7). Estos resultados indican que el gen 20P1F12/TMPRSS2 es un gen predominantemente específico de la próstata que puede estar involucrado en el desarrollo y/o avance del cáncer de próstata. Más aún, se detectó un alto nivel de expresión de 20P1F12/TMPRSS2 mediante transferencia Northern en una serie de líneas celulares de carcinoma de colon (Figura 7). Además, se detectó un alto nivel de expresión de 20P1F12/TMPRSS2 mediante análisis inmunohistoquímico en una serie de muestras de cáncer de próstata y colon (véase, p. ej., la Figura 17 y la Tabla 1). La Tabla 1 además muestra que puede utilizarse un anti-20P1P12/TMPRSS2 para identificar las diferencias en la localización por tinción predominante de 20P1F12/TMPRSS2 en tejidos cancerosos y no cancerosos. Estos datos de la Tabla 1 son consistentes con otros datos presentados en la presente memoria que indican que 20P1F12/TMPRSS2 es una molécula secretada que posee un papel fisiológico en la invasión y metástasis. En consecuencia, estos datos proporcionan evidencia de que la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en cánceres de próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon, y en cánceres metatásicos, puede proporcionar una base molecular para detectar, diagnosticar, pronosticar y/o tratar estos cánceres.
De este modo, describimos un gen (y una proteína) 20P1F12/TMPRSS2 únicos y útiles, que poseen las secuencias nucleotídica y codificada de aminoácidos que se muestran en la Figura 1. Las sondas nucleotídicas correspondientes a todas o parte de las secuencias de ADNc de 20P1F12/TMPRSS2 descritas en la presente memoria pueden utilizarse para aislar o identificar otros ADNc que codifican toda o parte de la secuencia del gen 20P1F12/TMPRSS2. Existen cebadores relacionados con la invención, capaces de amplificar específicamente el gen 20P1F12/TMPRSS2 o sus ARN transcriptos. También se describen polinucleótidos aislados que contienen secuencias codificadoras del/de los producto(s) del gen 20P1F12/TMPRSS2. Tales polinucleótidos pueden utilizarse para expresar proteínas y péptidos codificados por 20P1F12/TMPRSS2 que poseen una cantidad de usos adicionales. También pueden utilizarse sondas y cebadores del gen 20P1F12/TMRSS2 para detectar la presencia o ausencia del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 en diversas muestras biológicas, para detectar células cancerosas y otras células que expresan 20P1F12/TMPRSS2, para generar vacunas para tumores y en ensayos moleculares de diagnóstico y pronóstico para cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon, y cánceres metatásicos. Los polinucleótidos correspondientes a o complementarios del gen 20P1F12/TMPRSS2 pueden ser útiles en métodos para tratar el cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón, riñón y colon, y cánceres metatásicos, tales como, por ejemplo, en la modulación de la actividad biológica de 20P1F12/TMPRSS2.
Más específicamente, un polinucleótido 20P1F12/TMPRSS2 útil en la práctica de la invención puede comprender un polinucleótido que posee la secuencia nucleotídica de 20P1 F12/TMPRSS2 humano según se muestra en la Figura 1 (SEC ID NO.: 1) o la secuencia nucleotídica del TMPRSS2 previamente informado según se muestra en la Figura 2 (SEC ID NO.: 3), una secuencia complementaria de cualquiera de los anteriores, o un fragmento de polinucleótido de cualquiera de los anteriores. Otro ejemplo comprende un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 según se muestra en la Figura 1 (SEC ID NO.: 2), una secuencia complementaria de la misma, o un fragmento de polinucleótido del mismo. Otro ejemplo comprende un polinucleótido que es capaz de hibridizarse en condiciones rigurosas de hibridización al ADNc 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1 (SEC ID NO.: 1) o un fragmento de polinucleótido del mismo.
Un típico ejemplo de un polinucleótido 20P1F12/TMPRSS2 es un polinucleótido 20P1F12/TMPRSS2 que posee la secuencia que se muestra en la Figura 1. Un polinucleótido 20P1F12/TMPRSS2 puede comprender un polinucleótido que posee la secuencia nucleotídica de 20P1F12/TMPRSS2 humano según se muestra en la Figura 1, en donde T también puede ser U; un polinucleótido que codifica todo o parte de la proteína 20P1F12/TMPRSS2; una secuencia complementaria a la anterior; o un fragmento de polinucleótido de cualquiera de los anteriores. Otro ejemplo comprende un polinucleótido que posee la secuencia que se muestra en la Figura 1, desde el residuo del nucleótido número 114 hasta el residuo del nucleótido número 1589, en donde T también puede ser U. Otro ejemplo comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido 20P1F12/TMPRSS2 cuya secuencia está codificada por el ADNc contenido en el plásmido según depositado ante la American Type Culture Collection con el Número de Designación ATCC otorgado 207097.
Los ejemplos típicos relacionados con la invención descrita en la presente memoria incluyen polinucleótidos de 20P1F12/TMPRSS2 que contienen porciones específicas de la secuencia de ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 (y aquellas que son complementarias con dichas secuencias) tales como las que codifican la proteína y fragmentos de la misma. Por ejemplo, los ejemplos representativos descritos en la presente memoria incluyen: polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 1 hasta alrededor del aminoácido 10 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 20 hasta alrededor del aminoácido 30 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 30 hasta alrededor del aminoácido 40 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 40 hasta alrededor del aminoácido 50 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 50 hasta alrededor del aminoácido 60 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 60 hasta alrededor del aminoácido 70 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 mostrada en la Figura 1, polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 70 hasta alrededor del aminoácido 80 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 80 hasta alrededor del aminoácido 90 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1 y polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 90 hasta alrededor del aminoácido 100 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, etc. Siguiendo este esquema, los polinucleótidos que codifican porciones de la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 100-492 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 también son ejemplos típicos descritos en la presente memoria. También se contemplan polinucleótidos que codifican porciones mayores de la proteína 20P1F12/TMPRSS2. Por ejemplo, polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 1 (o 20 o 30 o 40, etc.) hasta alrededor del aminoácido 20 (o 30 o 40 o 50, etc.) de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1 pueden generarse mediante una variedad de técnicas bien conocidas en la técnica.
Ejemplos ilustrativos adicionales de polinucleótidos de 20P1F12/TMPRSS2 incluyen aquellos que consisten en un polinucleótido que posee la secuencia que se muestra en la Figura 1 desde alrededor del residuo del nucleótido número 1 hasta alrededor del residuo del nucleótido número 500, desde alrededor del residuo del nucleótido número 500 hasta alrededor del residuo del nucleótido número 1000, desde alrededor del residuo del nucleótido número 1000 hasta alrededor del residuo del nucleótido número 1500, desde alrededor del residuo del nucleótido número 1500 hasta alrededor del resto del nucleótido número 1740. Ejemplos ilustrativos adicionales descritos en la presente memoria incluyen los fragmentos del polinucleótido 20P1F12/TMPRSS2 que codifica uno o más de los motivos biológicos contenidos dentro de la secuencia de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 y tratados más abajo.
Además de la detección del crecimiento celular desregulado, los polinucleótidos de los párrafos anteriores poseen una serie de usos específicos diferentes. Por ejemplo, debido a que el gen 20P1F12/TMPRSS2 humano mapea el cromosoma 21q22, los polinucleótidos que codifican diferentes regiones de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 pueden utilizarse para caracterizar anormalidades citogenéticas en el cromosoma 21, banda q22 que se ha identificado por estar asociado a diversos cánceres. En particular, han sido identificadas una variedad de anormalidades cromosómicas en 21q22, incluyendo reordenamientos, como anormalidades citogenéticas frecuentes en una serie de diferentes cánceres (véase, p. ej., Simpson et al., 1997, Oncogene, 14(18): 2149-2157; Desmaze et al., 1997, Cancer Genet. Cytogenet. 97(1): 1249). En consecuencia, los polinucleótidos que codifican regiones específicas de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 proporcionan nuevas herramientas que pueden utilizarse para delinear con una mayor precisión que la previamente posible, la naturaleza específica de las anormalidades citogenéticas en esta región del cromosoma 21 que pueden contribuir al fenotipo maligno. En este contexto, estos polinucleótidos satisfacen una necesidad en la técnica de expandir la sensibilidad del examen cromosómico a fin de identificar anormalidades cromosómicas más sutiles y menos comunes (véase, p. ej., Evans et al., 1994, Am. J. Obstet. Gynecol. 171(4):1055-1057).
Por ello, los polinucleótidos útiles son ADN genómico, ADNc, ribozimas, y moléculas antisentido, así como moléculas de ácido nucleico basadas en un esqueleto alternativo o incluyendo bases alternativas, ya sea obtenidas a partir de fuentes naturales o sintetizadas. Por ejemplo, las moléculas antisentido pueden ser ARN u otras moléculas, incluyendo ácidos nucleicos de péptidos (PNAs) o moléculas distintas de ácidos nucleicos tales como derivados de foforotioato, que específicamente se unen al ADN o ARN de una manera dependiente de los pares de bases. Un técnico experto puede obtener fácilmente estas clases de moléculas de ácido nucleico utilizando los polinucleótidos y secuencias de polinucleótidos de 20P1F12/TMPRSS2 descritas en la presente memoria. Por ejemplo, la tecnología antisentido supone la administración de oligonucleótidos exógenos que se unen a un polinucleótido blanco localizado dentro de las células. El término "antisentido" se refiere al hecho de que tales oligonucleótidos son complementarios de sus blancos intracelulares, p. ej., 20P1F12/TMPRSS2. Véase, por ejemplo, Jack Cohen, 1988, OLIGODEOXYNUCLEOTIDES, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press; and Synthesis I:1-5 (1988). Los oligonucleótidos antisentido de 20P1F12/TMPRSS2 descritos en la presente memoria incluyen derivados tales como S-oilgonucleótidos (derivados de fosforotioato o S-oligos, véase, Jack Cohen, supra), que exhiben acción inhibidora aumentada del crecimiento celular del cáncer. Los S-oligos (nucleósido fosforotioatos) son análogos isoelectrónicos de un oligonucleótido (O-oligo) en los que un átomo de oxígeno no formador de puente del grupo fosfato se reemplaza por un átomo de azufre. Los S-oligos pueden prepararse por tratamiento de los O-oligos correspondientes con 3H-1,2-benzoditiol-3-ona-1,1-dioxido, que es un reactivo de transferencia de azufre. Véase Iyer, R. P. et al, 1990, J. Org. Chem. 55:4693-4698; e Iyer, R. P. et al., 1990, J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254. Según se describe en el Ejemplo 14 y se muestra en las Figuras 30 y 31, los oligonucleótidos antisentido adicionales de 20P1F12/TMPRSS2 pueden incluir morfolino-oligonucleótidos antisentido conocidos en la técnica (véase, p. ej., Partridge et al., 1996, Antisense & Nucleic Acid Drug Development 6: 169-175).
Además existen cebadores y pares de cebadores relacionados con la invención que permiten la amplificación específica de los polinucleótidos descritos o de cualesquier partes específicas del mismo, y sondas que selectivamente o específicamente se hibridizan a las moléculas de ácido nucleico descritas o cualquier parte de las mismas. Las sondas pueden marcarse con un marcador detectable, tal como, por ejemplo, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un agente quelante metálico o enzima. Dichas sondas y cebadores pueden utilizarse para detectar la presencia de un polinucleótido 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra y como un medio para detectar una célula que expresa una proteína 20P1F12/TMPRSS2. Un ejemplo de dicha sonda es un polinucleótido que comprende toda o parte de la secuencia de ADNc de 20P1F12/TMPRSS2 humano de que se muestra en la Figura 1 (SEC ID NO.: 1). Ejemplos de pares de cebadores capaces de amplificar específicamente los ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 también se describen en los Ejemplos que siguen. Tal como será comprendido por el técnico experto, pueden prepararse muchos cebadores y sondas diferentes basados en las secuencias provistas en la presente memoria y utilizados eficazmente para amplificar, clonar y/o detectar un ARNm de 20P1F12/TMPRSS2.
Los polinucleótidos de 20P1F12/TMPRSS2 son útiles para una variedad de fines, incluyendo, sin limitación, su uso como sondas y cebadores para la amplificación y/o detección del gen 20P1F12/TMPRSS2, ARNm, o fragmentos del mismo; como reactivos para el diagnóstico y/o pronóstico de cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón, riñón y colon, y cánceres metastásicos; como secuencias codificadoras capaces de dirigir la expresión de los polipéptidos de 20P1F12/TMPRSS2; como herramientas para modular o inhibir la expresión del gen 20P1F12/TMPRSS2 y/o la traducción del transcripto de 20P1F121/TMPRSS2; y como agentes terapéuticos.
Existen proteínas y polipéptidos de 20P1F12/TMPRSS2 relacionados con la invención que pueden utilizarse, por ejemplo, para generar anticuerpos contra varias porciones de 20P1F12/TMPRSS2 tales como fragmentos asociados a membrana y secretados. Pueden utilizarse pruebas de selección de anticuerpos y otras pruebas de selección para estos fragmentos asociados a membrana o secretados para el diagnóstico y clasificación por estadios de cánceres, o para evaluar la eficacia del tratamiento. Existen proteínas y polipéptidos de 20P1F12/TMPRSS2 relacionados con la invención que pueden utilizarse, por ejemplo, como vacunas para el cáncer. Aquellos expertos en la técnica comprenden que los anticuerpos que reconocen proteínas se unen a los epitopos de tamaño variable, y una agrupación del orden de alrededor de seis aminoácidos, contiguos o no, se considera un número típico de aminoácidos en un epitopo mínimo. Véase, p. ej. Hebbes et al., Mol Inmunol septiembre de 1989; 26(9):865-73; Schwartz et al., J Immunol octubre de 1985,135(4):2598-648. Efectuando un barrido a lo largo de la secuencia del polipéptido que se muestra en la Figura 1, los polipéptidos ilustrativos que pueden utilizarse para generar anticuerpos contra cualquier porción de las proteínas 20P1F12/TMPRSS2 incluyendo, por ejemplo: un polipéptido que contiene al menos alrededor de 6 aminoácidos de la secuencia de 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1.
Los polipéptidos que pueden utilizarse (p. ej. como inmunógenos o como moduladores de invasión) típicamente consisten en un polipéptido que contiene al menos alrededor de 6 aminoácidos de la secuencia de 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, incluyendo la valina en la posición 165; un polipéptido que contiene al menos alrededor de 6 aminoácidos de la secuencia de 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1 incluyendo la isoleucina en la posición 242; un polipéptido que contiene al menos alrededor de 6 aminoácidos de la secuencia de 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1 incluyendo el ácido glutámico en la posición 329; un polipéptido que contiene al menos alrededor de 6 aminoácidos de la secuencia de 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1 incluyendo la lisina en la posición 449; un polipéptido que contiene al menos alrededor de 6 aminoácidos de la secuencia de 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1 incluyendo la arginina en la posición 489; y/o un polipéptido que contiene al menos alrededor de 6 aminoácidos de la secuencia de 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1 incluyendo el ácido aspártico en la posición 491. Opcionalmente, dichos polipéptidos ilustrativos incluyen cualquiera de los otros aminoácidos que se muestran en la Figura 1, por ejemplo la metionina en la posición 1.
Ejemplos adicionales estrechamente relacionados incluyen: un polinucleótido aislado que codifica al menos alrededor de 6 aminoácidos de la secuencia de 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1 incluyendo la valina en la posición 165; un polinucleótido que codifica al menos alrededor de 6 aminoácidos de la secuencia de 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1 incluyendo la isoleucina en la posición 242; un polinucleótido que codifica al menos alrededor de 6 aminoácidos de la secuencia de 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1 incluyendo el ácido glutámico en la posición 329; un polinucleótido que codifica al menos alrededor de 6 aminoácidos de la secuencia de 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1 incluyendo la lisina en la posición 449; un polinucleótido que codifica al menos alrededor de 6 aminoácidos de la secuencia 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1 incluyendo la arginina en la posición 489 y/o un polinucleótido que codifica al menos alrededor de 6 aminoácidos de la secuencia de 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1 incluyendo el ácido aspártico en la posición 491. Opcionalmente, dichos polinucleótidos ilustrativos codifican cualquiera de los otros aminoácidos que se muestran en la Figura 1, por ejemplo la metionina en la posición 1.
Los ejemplos descritos en la presente memoria incluyen una amplia variedad de variantes de proteínas 20P1F12/
TMPRSS2 aceptadas en la técnica tales como polipéptidos que poseen inserciones, supresiones y sustituciones de aminoácidos. Las variantes de 20P1F12/TMPRSS2 pueden realizarse utilizando métodos conocidos en la técnica tales como mutagénesis dirigida al sitio, barrido con alanina, y mutagénesis por FCR. La mutagénesis dirigida al sitio (Carter et al., 1986, Nucl. Acids Res. 13:4331; Zoller et al., 1987, Nucl. Acids Res. I0:6487), la mutagénesis por casete (Wells et al., 1985, gen 34:315), la mutagénesis de selección por restricción (Wells et al., 1986, Philos. Trans. R. Soc. London Ser. A, 317:415) o pueden realizarse otras técnicas conocidas sobre el ADN clonado para producir la variante de ADN de 20P1F12/TMPRSS2. El análisis de aminoácidos por barrido también puede emplearse para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos preferidos del barrido están los aminoácidos neutros relativamente pequeños. Dichos aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es típicamente un aminoácido de barrido preferido entre este grupo porque elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos factible que altere la conformación de la cadena principal de la variante. La alanina también es típicamente preferida porque es el aminoácido más común. Además, frecuentemente se encuentra en posiciones tanto ocultas como expuestas (Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, 1976, J. Mol. Biol.,150:1). Si la sustitución con alanina no rinde las cantidades adecuadas de la variante, puede utilizarse un aminoácido isostérico.
También se describen polipéptidos que contienen una secuencia menor de 492 aminoácidos de la proteína 20P1F12/
TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1 (y los polinucleótidos que codifican tales polipéptidos). Por ejemplo, los ejemplos representativos descritos en la presente memoria incluyen polipéptidos que consisten en desde alrededor del aminoácido 1 hasta alrededor del aminoácido 10 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, polipéptidos que consisten en desde alrededor del aminoácido 20 hasta alrededor del aminoácido 30 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, polipéptidos que consisten en desde alrededor del aminoácido 30 hasta alrededor del aminoácido 40 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, polipéptidos que consisten en desde alrededor del aminoácido 40 hasta alrededor del aminoácido 50 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, polipéptidos que consisten en desde alrededor del aminoácido 50 hasta alrededor del aminoácido 60 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, polipéptidos que consisten en desde alrededor del aminoácido 60 hasta alrededor del aminoácido 70 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, polipéptidos que consisten en desde alrededor del aminoácido 70 hasta alrededor del aminoácido 80 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, polipéptidos que consisten en desde alrededor del aminoácido 80 hasta alrededor del aminoácido 90 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1 y polipéptidos que consisten en desde alrededor del aminoácido 90 hasta alrededor del aminoácido 100 de la proteína de 220P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, etc. Siguiendo este esquema, los polipéptidos que consisten en porciones de la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 100-492 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 son ejemplos típicos. También se contemplan los polipéptidos que consisten en porciones mayores de la proteína 20P1F12/TMPRSS2. Por ejemplo los polipéptidos que consisten en desde alrededor del aminoácido 1 (o 20 o 30 o 40, etc.) hasta alrededor del aminoácido 20 (o 30, o 40 o 50, etc.) de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1 pueden generarse mediante una variedad de técnicas bien conocidas en la técnica.
Ejemplos ilustrativos adicionales descritos en la presente memoria incluyen polipéptidos de 20P1F12/TMPRSS2 que contienen los residuos de aminoácidos de uno o más de los dominios contenidos dentro de la secuencia del polipéptido de 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra, por ejemplo, en la Figura 3B (y los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos). En un ejemplo, los polipéptidos típicos pueden contener el dominio citoplasmático, desde alrededor del aminoácido 1 hasta alrededor del aminoácido 84. En otro ejemplo, los polipéptidos típicos pueden contener el dominio transmembrana, desde alrededor del aminoácido 84 hasta alrededor del aminoácido 106. En otro ejemplo, los polipéptidos típicos pueden contener el dominio LDLRA, desde alrededor del aminoácido 113 hasta alrededor del aminoácido 148. En otro ejemplo, los polipéptidos típicos pueden contener el dominio SRCR, desde alrededor del aminoácido 149 hasta alrededor del aminoácido 242. En otro ejemplo, los polipéptidos típicos relacionados con la invención pueden contener el dominio de proteasa, desde alrededor del aminoácido 255 hasta alrededor del aminoácido 492.
Los ejemplos ilustrativos adicionales descritos en la presente memoria incluyen polipéptidos de 20P1F12/
TMPRSS2 que contienen los residuos de aminoácidos de uno o más de los motivos biológicos contenidos dentro de la secuencia del polipéptido de 20P1F12/TMPRSS2 según se muestra en la Figura 1 (y los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos). En un ejemplo, los polipéptidos típicos pueden contener uno o más de los sitios de glicosilación de 20P1F12/TMPRSS2 tales como NTSA en los residuos 213-216 y/o NSSR en los residuos 249-252. En otro ejemplo, los polipéptidos típicos pueden contener uno o más de los sitios de fosforilación de la proteína Quinasa C de 20P1F12/TMPRSS2 tales como TSK en los residuos 78-80, TSK en los residuos 447-449, TKK en los residuos 81-83, SQR en los residuos 163-165, SSK en los residuos 232-234, SLR en los residuos 238-240, SSR en los residuos 250-252 y/o TQR en los residuos 407-409. En otro ejemplo, los polipéptidos típicos pueden contener uno o más de los sitios de fosforilación de la caseína quinasa II de 20P1F12/TMPRSS2 tales como TVYE en los residuos 35-38, SGlE en los residuos 116-119 y/o TFND en los residuos 356-359. En otro ejemplo, los polipéptidos típicos pueden contener uno o más de los sitios de N-miristoilación N tales como GSPPAI en los residuos 6-11, GTVCTS en los residuos 74-79, GAALAA en los residuos 97-102, GSKCSN en los residuos 110-115, GVNLNS en los residuos 245-250, GGESAL en los residuos 258-263, GNVDSC en los residuos 432-437, GSGCAK en los residuos 462-467, GCAKAY en los residuos 464-469 y/o GVYGN en los residuos 472-477. En otro ejemplo, los polipéptidos típicos pueden contener el motivo A del sitio de unión al ATP/GTP (bucle P), ATEEKGKT en los residuos 386-393. En otro ejemplo, los polipéptidos típicos pueden contener la firma del dominio clase A del receptor de LDL (LDLRA), CINPSNWCDGVSHCPGGEDENRC, en los residuos 126-148. En otro ejemplo, los polipéptidos típicos pueden contener las serina-proteasas, familia de la tripsina, sitio activo de histidina VTAAHC en los residuos 292-297. En otro ejemplo, los polipéptidos típicos pueden contener las serina-proteasas, familia de la tripsina, sitio activo de la serina DSCQGDSGGPLV en los residuos 435-446. Los ejemplos relacionados incluyen polipéptidos que contienen combinaciones de los diferentes motivos tratados más arriba, siendo los ejemplos preferidos aquellos que no contienen ninguna inserción, supresión o sustitución ya sea dentro de los motivos o las secuencias intervinientes de estos polipéptidos.
Los anticuerpos capaces de unirse específicamente a e identificar las proteínas o polipéptidos de 20P1F12/
TMPRSS2 pueden utilizarse para detectar la presencia de 20P1F12/TMPRSS2 secretado y/o células que expresan 20P1F12/TMPRSS2 en cualquier muestra biológica, para determinar su localización subcelular, detectar y registrar por imágenes células de cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon y células de cáncer metastásico y tumores de próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon y tumores metastásicos, y modular o inhibir la actividad biológica de 20P1F12/TMPRSS2. Los anticuerpos también pueden utilizarse terapéuticamente según se describe más abajo. Los métodos para la generación de anticuerpos policlonales y monoclonales son bien conocidos en la técnica.
La invención también se refiere a moléculas recombinantes de ADN o ARN que contienen un polinucleótido 20P1F12/TMPRSS2, incluyendo sin limitación, fagos, plásmidos, fagémidos, cósmidos, YACs, BACs, así como diversos vectores virales y no virales bien conocidos en la técnica, y células transformadas o transfectadas con tales moléculas recombinantes de ADN o ARN. Según se utiliza en la presente memoria, una molécula recombinante de ADN o ARN es una molécula de ADN o ARN que se ha sometido a una manipulación molecular in vitro. Los métodos para generar tales moléculas son bien conocidos (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).
También se describe un sistema -hospedante-vector que comprende una molécula recombinante de ADN que contiene un polinucleótido 20P1F12/TMPRSS2 dentro de una célula hospedante procariota o eucariota apropiada. Los ejemplos de células hospedantes eucariotas incluyen una célula de levadura, una célula vegetal o una célula animal, tal como una célula de mamífero o una célula de insecto (p. ej., una célula infectable con baculovirus tal como una célula Sf9). Los ejemplos de células de mamíferos apropiadas incluyen diversas líneas celulares de cáncer de próstata tales como LnCaP, PC-3, DU145, LAPC-4, TsuPr 1, otras líneas celulares transfectables o transducibles de cáncer de próstata, así como una serie de células de mamíferos utilizadas rutinariamente para la expresión de proteínas recombinantes (p. ej., células COS, CHO, 293, 293T). Más particularmente, un polinucleótido que comprende la secuencia codificadora de una 20P1F12/TMPRSS2 puede utilizarse para generar proteínas 20PLF12/TMPRSS2 o fragmentos de las mismas utilizando cualquier cantidad de sistemas hospedante-vector-rutinariamente utilizados y ampliamente conocidos en la técnica.
Está disponible una amplia variedad de sistemas hospedante-vector apropiados para la expresión de las proteínas 20P1F12/TMPRSS2 o fragmentos de las mismas; véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, 1995, supra. Los vectores preferidos para la expresión en mamíferos incluyen, sin limitación, pcDNA 3.1 myc-His-tag (Invitrogen), el vector retroviral pSR\alphatkneo (Muller et al., 1991, MCB 11:1785) y/o el vector Tag5 (GenHunter Corporation, Nashville TN). El vector Tag5 es un vector preferido y proporciona una señal de secreción de IgGK que puede utilizarse para facilitar la producción de una proteína 20P1F12/TMPRSS2 secretada en células transfectadas. Utilizando estos vectores de expresión, 20P1F12/T MPRSS2 puede expresarse preferiblemente en diversas líneas celulares de cáncer de próstata y de no próstata, incluyendo, por ejemplo 3T3, 293, 293TPC-3, LNCaP y TsuPr1. Los sistemas hospedante-vector son útiles para la producción de una proteína 20P1F12/TMPRSS2 o fragmento de la misma. Tales sistemas hospedante-vector pueden emplearse para estudiar las propiedades funcionales de 20P1F12/TMPRSS2 y mutaciones de 20P1F12/TMPRSS2.
La redundancia en el código genético permite variación en las secuencias del gen 20P1F12/TMPRSS2. En particular, un experto en la técnica reconocerá las preferencias específicas de codones por una especie hospedante específica y puede adaptar la secuencia descrita como sea preferible para un hospedante deseado. Por ejemplo, a las secuencias de codones preferidas típicamente se les reemplazan los codones poco comunes (es decir, codones que poseen una frecuencia de uso menor que alrededor del 20% en secuencias conocidas del hospedante deseado) por codones de mayor frecuencia. Las preferencias de codones para un organismo específico pueden calcularse, por ejemplo, utilizando las tablas de uso de codones disponibles en Internet en la siguiente dirección: http://www.dna.affrc.go.jp/-nakamura/codon.html. En la presente memoria, las secuencias nucleotídicas que han sido optimizadas para una especie hospedante particular reemplazando cualquier codón que posea una frecuencia de uso menor que alrededor del 20%, se denominan "secuencias de codones optimizadas".
Además de la detección de crecimiento celular desregulado, las proteínas codificadas por los genes 20P1F12/
TMPRSS2, o por fragmentos de los mismos, tendrán una variedad de usos, incluyendo, sin limitación, generar anticuerpos y en métodos para identificar ligandos y otros agentes y constituyentes celulares que se unen a un producto génico 20P1F12/TMPRSS2. Dichas proteínas también pueden utilizarse como vacunas para el cáncer. Los anticuerpos producidos contra una proteína 20P1F121/TMPRSS2 o fragmento de la misma pueden ser útiles en ensayos diagnósticos y pronósticos, en metodologías de detección por imágenes (incluyendo, particularmente, detección por imágenes del cáncer) y en métodos terapéuticos en el manejo de cánceres humanos caracterizados por la expresión de una proteína 20P1F12/TMPRSS2, tales como cánceres de próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon y cánceres metastásicos. Se contemplan diversos ensayos inmunológicos útiles para la detección de las proteínas 20P1F12/TMPRSS2, incluyendo, sin limitación, varios tipos de radioinmunoensayos, ensayos de inmunosorción ligados a enzimas (ELISA), ensayos inmunofluorescentes ligados a enzimas (ELIFA), métodos inmunocitoquímicos y similares. Dichos anticuerpos pueden marcarse y utilizarse como reactivos inmunológicos de detección por imágenes capaces de detectar células de cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón y/o colon, y/o células de cáncer metastásico (p. ej., en métodos radiocentellográficos de representación por imágenes).
En un ejemplo específico, una nueva proteína 20P1F12/TMPRSS2 que posee la secuencia de aminoácidos de la 20P1F12/TMPRSS2 humana se da en la Figura 1 (SEC ID NO.: 2). También se contemplan proteínas de fusión que combinan todo o parte de 20P1F12/TMPRSS2 con un polipéptido heterólogo y una realización representativa donde el polipéptido heterólogo es glutatión-s-sintetasa tranferasa se muestra en el Ejemplo 5. En otro ejemplo típico la molécula quimérica puede comprender una fusión de 20P1F12/TMPRSS2 con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también denominada "inmunoadhesina"), dicha fusión podría ser a la región Fe región de una molécula de IgG. Las fusiones con Ig preferiblemente incluyen la sustitución de una forma soluble (dominio transmembrana suprimido o inactivado) de un polipéptido de 20P1F12/TMPRSS2 en lugar de al menos una región variable dentro de una molécula de Ig. En un ejemplo particularmente preferido la función con la inmunoglubilina incluye las regiones bisagra, CH2 y CH3, o bisagra, CH1, CH2 y CH3 de una molécula de IgGI. Para la producción de fusiones de inmunoglobulinas véase también la Patente Estadounidense No. 5.428.130 emitida el 27 de junio de 1995. Se conoce bien en la técnica una variedad de polipéptidos de fusión y las realizaciones típicas se describen en Current Protocols In Molecular Biology, Unidades 9 y 16, Frederick M. Ausubul et al. eds., 1995.
La proteína 20P1F12/TMPRSS2 relacionada con la invención puede utilizarse en muchas formas, preferiblemente en forma aislada. Según se utiliza en la presente memoria, se dice que la proteína es "aislada" cuando se emplean métodos físicos, mecánicos o químicos para retirar la proteína 20P1F12/TMPRSS2 de los constituyentes celulares que normalmente están asociados a la proteína. Un técnico experto puede emplear fácilmente métodos estándar de purificación para obtener una proteína 20P1F12/TMPRSS2 aislada. Una molécula de proteína 20P1F12/TMPRSS2 purificada estará sustancialmente libre de otras proteínas o moléculas que perjudican la unión de 20P1F12/TMPRSS2 al anticuerpo u otro ligando. La naturaleza y grado de aislamiento y purificación dependerá del uso previsto. Los ejemplos de una proteína 20P1F12/TMPRSS2 incluyen una proteína 20P1F12/TMPRSS2 purificada y una proteína 20P1F12/TMPRSS2 funcional y soluble. En una forma, dichas proteínas 20P1F12/TMPRSS2 funcionales y solubles o fragmentos de las mismas retienen la capacidad de unirse a un anticuerpo, a una sustancia asociada de unión a un ligando y/o a un sustrato (p. ej., un blanco proteolítico).
Los ácidos nucleicos que codifican 20P1F12/TMPRSS2 o sus formas modificadas también pueden utilizarse para generar animales transgénicos o animales "knock out" (o líneas celulares) que, a su vez, son útiles en el desarrollo y selección de reactivos terapéuticamente útiles. Un animal transgénico (p. ej., un ratón o rata) es un animal que posee células que contienen un transgén, transgén que se introdujo en el animal o un ancestro del animal en un estadío prenatal, p. ej. una etapa embrionaria. Un transgén es un ADN que está integrado en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico. En un ejemplo puede utilizarse un ADNc que codifica 20P1F12/TMPRSS2 para clonar un ADN genómico que codifica 20P1F12/TMPRSS2 de conformidad con técnicas establecidas y las secuencias genómicas utilizadas para generar animales transgénicos que contienen células que expresan ADN que codifica 20P1F12/TMPRSS2. Los métodos para generar animales transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas, se han vuelto convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en la Patente Estadounidense No. 4.736.866 y 4.870.009. Típicamente, células particulares serían localizadas para la incorporación del transgén de 20P1F12/TMPRSS2 con mejoradores específicos del tejido. Pueden utilizarse animales transgénicos que incluyen una copia de un transgén que codifica 20P1F12/TVIPRSS2 introducido en la línea germinal del animal en una etapa embrionaria para examinar el efecto de la expresión aumentada del ADN que codifica 20P1F12/TMPRSS2. Dichos animales pueden utilizarse como animales de prueba para reactivos que se considera confieren protección, por ejemplo, contra afecciones s patológicas asociadas con su sobreexpresión. De conformidad con esta faceta de la descripción, se trata un animal con el reactivo y una reducida incidencia de la afección patológica, en comparación con animales no tratados portadores del transgén, indicaría una potencial intervención terapéutica para la afección patológica.
Alternativamente, pueden utilizarse homólogos no humanos de 20P1F12/TMPRSS2 para construir un animal "knock out" de 20P1F12/TMPRSS2 que posee un gen defectuoso o alterado que codifica 20P1F12/TMPRSS2 como resultado de recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica 20P1P12/TMPRSS2 y ADN genómico alterado que codifica 20P1F12/TMPRSS2 introducido en una célula embrionaria del animal. Por ejemplo, puede utilizarse ADNc que codifica 20P1F12/TMPRSS2 para clonar ADN genómico que codifica 20P1F12/TMPRSS2 de conformidad con técnicas establecidas. Una porción del ADN genómico que codifica 20P1F12/TMPRSS2 puede suprimirse o reemplazarse con otro gen, tal como un gen que codifica un marcador seleccionable que puede utilizarse para monitorear la integración. Típicamente, varias kilobases de ADN flanqueante inalterado (en ambos extremos 5' y 3') se incluyen en el vector (véase, p. ej., Thomas y Capecchi, 1987, Cell 51:503, para una descripción de los vectores de recombinación homóloga). El vector se introduce en una línea de células madre embrionarias (p. ej., por electroporación) y se seleccionan las células en las que el ADN introducido se ha recombinado homólogamente con el ADN endógeno (véase, p. ej., Li et al., 1992. Cell 69:915). Después, las células seleccionadas se inyectan en un blastocito de un animal (p. ej., un ratón o rata) para formar quimeras de agregación (véase, p. ej., Bradley, en Robertson, ed., 1987, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, (IRL, Oxford), pp. 113-152). Después puede implantarse un embrión quimérico en un animal hembra adoptivo seudo-preñado apropiado y el embrión se lleva a término para crear un animal "knock out". La progenie que alberga el ADN homólogamente recombinado en sus células germinales puede identificarse mediante técnicas estándar y se utiliza para reproducir animales en los que todas las células del animal contienen el ADN homólogamente recombinado. Los animales knock out pueden caracterizarse, por ejemplo, por su capacidad para defenderse de ciertas afecciones patológicas y por su desarrollo de afecciones patológicas debido a la ausencia del polipéptido 20P1F12/TMPRSS2.
Pueden utilizarse métodos recombinantes para generar moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína 20P1F12/TMPRSS2. Al respecto, las moléculas de ácido nucleico que codifican 20P1F12/TMPRSS2 descritas en la presente memoria proporcionan los medios para generar fragmentos definidos de la proteína 20P1F12/TMPRSS2. Dichos polipéptidos 20P1F12/TMFRSS2 son particularmente útiles en generar anticuerpos específicos del dominio (p. ej., anticuerpos que reconocen un epitopo predominantemente secretado o predominantemente asociado a la membrana de la proteína 20P1F12/TMPRSS2), que identifican agentes o factores celulares que se unen a un dominio particular de 20P1F12/TMPRSS2, y en varios contextos terapéuticos, incluyendo, sin limitación, vacunas para el cáncer. Los polipéptidos de 20P1F12/TMPRSS2 que contienen estructuras particularmente interesantes pueden predecirse y/o identificarse utilizando diversas técnicas analíticas bien conocidas en la técnica, incluyendo, por ejemplo, los métodos de Chou-Fasman, Gamier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o el análisis de Jameson-Wolf, o sobre la base de la inmunogenicidad.
Otro aspecto de la invención se refiere a anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a la proteína 20P1F12/
TMPRSS2 y a fragmentos polipeptídicos de la misma. Los anticuerpos más preferidos se unirán selectivamente a una proteína 20P1F12/TMPRSS2 y no se unirán (o se unirán débilmente) a proteínas y polipéptidos que no sean 20P1F12/TMPRSS2. Los anticuerpos anti-20P1F12/TMPRSS2 que están particularmente contemplados incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales así como fragmentos que contienen el dominio de unión al antígeno y/o una o más regiones determinantes de complementariedad de estos anticuerpos. Según se utiliza en la presente memoria, un fragmento de anticuerpo se define como al menos una porción de la región variable de la molécula de inmunoglobulina que se une a su blanco, es decir la región de unión al antígeno.
Para algunas aplicaciones, puede ser deseable generar anticuerpos que reaccionen específicamente con una proteína 20P1P12/TMPRSS2 particular y/o un epitopo dentro de un dominio estructural particular. Por ejemplo, los anticuerpos preferidos útiles para fines de detección por imágenes en el diagnóstico del cáncer son aquellos que reaccionan con un epitopo en una región asociada a membrana de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 expresada en células cancerosas. Dichos anticuerpos pueden generarse utilizando la proteína 20P1F12/TMPRSS2 o utilizando péptidos obtenidos a partir de dominios secretados u otros dominios de 20P1F12/TMPRSS2, y utilizarse como un inmunógeno.
Los anticuerpos de 20P1F12/TMPRSS2 pueden ser particularmente útiles en los ensayos diagnósticos y pronósticos, metodologías de obtención de imágenes y estrategias terapéuticas para el cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer ovárico, cáncer de riñón y cánceres metastásicos. La invención proporciona diversos ensayos inmunológicos útiles para la detección y cuantificación de 20P1F12/TMPRSS2. Tales ensayos en general comprenden uno o más anticuerpos de 20P1F12/TMPRSS2 capaces de reconocer y unirse a 20P1F12/TMPRSS2, y pueden realizarse dentro de diversos formatos de ensayos inmunológicos bien conocidos en la técnica, incluyendo, sin limitación, a varios tipos de radioinmunoensayos, ensayos de inmunosorción ligados a enzimas (ELISA), ensayos inmunofluorescentes ligados a enzimas (ELIFA) y similares. Además, también se proporcionan métodos inmunológicos de obtención de imágenes capaces de detectar cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon y cáncer metastásico, incluyendo, y limitándose, a métodos de obtención de imágenes radiocentellográficas utilizando anticuerpos de 20P1F12/TMPRSS2 marcados. Tales ensayos pueden ser clínicamente útiles en la detección, monitoreo y pronóstico del cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon, y cáncer metastásico, particularmente el cáncer avanzado. Debido a que la expresión de TMPRSS2 es reducida en cáncer de riñón, la detección, monitoreo y pronóstico de este cáncer se lleva a cabo evaluando la regulación por disminución o el cese de la expresión.
Los anticuerpos de 20P1F12/TMPRSS2 también pueden utilizarse en métodos para purificar las proteínas y polipéptidos de 20P1F12/TMPRSS2 y para aislar moléculas homólogas y relacionadas con 20P1F12/TMPRSS2. Por ejemplo, el método para purificar una proteína 20P1F12/TMPRSS2 comprende incubar un anticuerpo de 20P1F12/
TMPRSS2, que se ha acoplado a una matriz sólida, con un lisado u otra solución que contiene 20P1F12/TMPRSS2 en condiciones que permitan que el anticuerpo de 20P1F12/TMPRSS2 se una a 20P1F12/TMPRSS2, lavar la matriz sólida para eliminar impureza y eluir el 20P1F12/TMPRSS2 del anticuerpo acoplado. Otros usos de los anticuerpos de 20P1F12/TMPRSS2 incluyen generar anticuerpos anti-idiotípicos que imitan a la proteína 20P1F12/TMPRSS2.
Los anticuerpos de 20P1F12/TMPRSS2 también pueden utilizarse para, por ejemplo, modular o inhibir la actividad biológica de una proteína 20P1F12/TMPRSS2 o para localizar y destruir células (tales como células de cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon, o células de cáncer metatásico) que expresan una proteína 20P1F12/TMPRSS2. La terapia con anticuerpos del cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon, y del cáncer metastásico, se describe en mayor detalle más abajo. Un ejemplo típico en este contexto consiste en un método para inhibir el crecimiento de una célula precancerosa o cancerosa que expresa 20P1F12/TMPRSS2, que comprende poner en contacto la 20P1F12/TMPRSS2 expresada por la célula neoplásica con una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-20P1F12/TMPRSS2 de modo que el crecimiento de la célula neoplásica sea inhibido. Preferiblemente un anticuerpo utilizado en este método reconoce un epitopo de 20P1F12/TMPRSS2 que está predominantemente asociado a la superficie celular. Los métodos para la inhibición mediada por anticuerpos y lisis celular son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, citotoxicidad celular mediada por complementos o dependiente de anticuerpos (ADCC). Un ejemplo alternativo en este contexto consiste en un método para modular la actividad biológica de 20P1F12/TMPRSS2 secretada que comprende poner en contacto la 20P1F12/TMPRSS2 secretada con una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-20PJF12/TMPRSS2 de modo que se module la actividad de la 20P1F12/TMPRSS2 secretada. Preferiblemente un anticuerpo utilizado en este método reconoce a un epitopo de 20P1F12/TMPRSS2 que es secretado predominantemente.
Son bien conocidos en la técnica diversos métodos para la preparación de anticuerpos. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos inmunizando un huésped mamífero apropiado utilizando una proteína péptido o fragmento de 20P1F12/TMPRSS2,, en forma aislada o inmunoconjugada. (Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Eds., Harlow, y Lane (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). Además, también pueden utilizarse proteínas de fusión de 20P1F12/TMRRSS2, tal como una proteína de fusión con GST de 20P1F12/TMPRSS2. En un ejemplo particular, una proteína de fusión con GST que comprende toda o la mayor parte de la secuencia de aminoácidos del marco de lectura abierto de la Figura 1 puede producirse y utilizarse como inmunógeno para generar anticuerpos adecuados. Según se describe en el Ejemplo 5, dicha fusión con GST se utilizó para generar diversos anticuerpos monoclonales que reaccionan inmunoespecíficamente con 20P1F12/TMPRSS2. También pueden utilizarse células que expresan o sobreexpresan 20P1F12/TMPRSS2 para inmunizaciones. De manera similar, puede utilizarse cualquier célula manipulada genéticamente para expresar 20P1F12/TMPRSS2. Esta estrategia puede resultar en la producción de anticuerpos monoclonales con capacidades aumentadas para reconocer 20P1F12/TMPRSS2 endógena. Se describen estrategias adicionales para generar anticuerpos de 20P1F12/TMPRSS2 en el Ejemplo 5 en la presente memoria.
La secuencia de aminoácidos de 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1 (SEC ID NO.: 2) puede utilizarse para seleccionar regiones específicas de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 para generar inmunógenos. Por ejemplo, pueden utilizarse análisis de hidrofobicidad e hidrofilicidad de la secuencia de aminoácidos de 20P1F12/TMPRSS2 para identificar regiones hidrofílicas en la estructura de 20P1F12/TMPRSS2. Las regiones de la proteína 20P1F12/
TMPRSS2 que muestran estructura inmunogén, así como otras regiones y dominios, pueden identificarse fácilmente utilizando otros diversos métodos conocidos en la técnica, tales como análisis de Chou-Fasman, Gamier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson Wolf. Por ejemplo, pueden generarse anticuerpos que preferencialmente se dirigen a una especie de 20P1F12/TMPRSS2 especifica (tal como la especies secretada de 32 kD que contiene el dominio de proteasa o una especie asociada a membrana; véase, p. ej., las Figs. 17 y 22) por métodos tratados más abajo.
Se conocen bien en la técnica métodos para preparar una proteína o polipéptido para su uso como inmunógeno y para preparar conjugados inmunogenes de una proteína con un vehículo tal como BSA, KLH u otras proteínas de transporte. En algunas circunstancias, puede utilizarse la conjugación directa que utiliza, por ejemplo, reactivos de carbodiimida; en otros casos pueden ser efectivos reactivos conectores tales como los proporcionados por Pierce Chemical Co., Rockford, IL. La administración de un inmunogen de 20P1F12/TMPRSS2 en general se realiza mediante inyección en un período de tiempo apropiado y con el uso de un adyuvante apropiado, como en general se entiende en la técnica. Durante el programa de inmunización, pueden medirse títulos de anticuerpos para determinar la adecuación de la formación del anticuerpo.
Se prefieren los anticuerpos monoclonales anti-20P1F12/TMPRSS2 y pueden producirse mediante varios medios bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden prepararse líneas celulares inmortalizadas que segregan un anticuerpo monoclonal deseado utilizando el método estándar de Kohler y Milstein o modificaciones que producen la inmortalización de linfocitos o células esplénicas, como se conoce en general. Las líneas celulares inmortalizadas que secretan los anticuerpos deseados se examinan mediante un inmunoensayo en el que el antígeno es la proteína 20P1F12/TMPRSS2 o fragmento de 20P1F12/TMPRSS2. Cuando se identifica el cultivo apropiado de células inmortalizadas que secretan el anticuerpo deseado, las células pueden expandirse y los anticuerpos pueden producirse ya sea a partir de cultivos in vitro o a partir de líquido de ascitis.
Los anticuerpos o fragmentos también pueden producirse utilizando tecnología actual, por medios recombinantes. Las regiones que se unen específicamente a las regiones deseadas de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 también pueden producirse en el contexto de anticuerpos quiméricos o de CDR injertadas originados en múltiples especies. También pueden producirse anticuerpos humanizados o humanos de 20P1F12/TMPRSS2 y se prefieren. Se conocen diversos abordajes para producir tales anticuerpos humanizados, e incluyen métodos quiméricos y de injerto de CDR; los métodos para producir anticuerpos monoclonales completamente humanos incluyen métodos de despliegue de fagos y transgénicos (a modo de revisión, véase Vaughan et al., 1998, Nature Biotechnology 16: 535-539).
Pueden generarse anticuerpos monoclonales completamente humanos de 20P1F12/TMPRSS2 utilizando tecnologías de clonación empleando grandes bibliotecas combinatorias de genes de Ig humanos (p. ej., despliegue de fagos)(Griffiths y Hoogenboom, Building an in vitro immune system: human antibodies from phage display libraries. En: Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man. Clark, M. (Ed.), Nottingham Academic, pp 45-64 (1993); Burton y Barbas, Human Antibodies from combinatorial libraries. Id., pp 65-82). También pueden producirse anticuerpos monoclonales completamente humanos de 20P1F12/TMPRSS2 utilizando ratones transgénicos manipulados genéticamente para que contengan loci genéticos de inmunoblogina humana según se describe en la Solicitud de Patente PCT WO98/24893 concedida a Kucherlapati et al., publicada el 3 de diciembre de 1997 (véase también Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4): 607414). Este método evita la manipulación in vitro requerida con tecnología de despliegue de fagos y produce de manera eficaz anticuerpos humanos auténticos de alta afinidad.
La reactividad de los anticuerpos de 20P1F12/TMPRSS2 con una proteína 20P1F12/TMPRSS2 puede establecerse por una serie de medios bien conocidos, incluyendo transferencia Western, inmunoprecipitación, ELISA y análisis FACS utilizando, según corresponda, proteínas 20P1F12/TMPRSS2, péptidos, células que expresan 20P1F12/
TMPRSS2 o extractos de las mismas.
Un anticuerpo de 20P1F12/TMPRSS2 o fragmento del mismo puede marcarse con un marcador detectable o conjugado a una segunda molécula, tal como un agente citotóxico o terapéutico, y utilizarse para localizar una célula positiva para 20P1F12/TMPRSS2 (Vitetta, E.S. et al., 1993, Immunotoxin therapy, en DeVita, Ir., V.T. et al., eds., Cancer Principles and Practice of Oncology, 4ta. edición, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 2624-2636). Se conocen bien en la técnica una variedad de conjugados terapéuticos y diagnósticos apropiados e incluyen, sin limitación, un radioisótopo tal como un emisor de partículas \alpha, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un agente quelante metálico o un polipéptido tal como una enzima. Se describen conjugados típicos, por ejemplo, en Current Protocols In Molecular Biology, Unidades 11 y 17, Frederick M. Ausubul et al. eds., 1995. En realizaciones preferidas de la invención, se acoplan conjugados terapéuticos a un anticuerpo que reconoce un epitopo de 20P1F12/TMPRSS2 que está predominantemente asociado a la superficie celular.
Se describen ejemplos específicos típicos de los anticuerpos relacionados con la invención en el Ejemplo 5 más abajo. Tal como se describe en el Ejemplo 5, utilizando los métodos descritos en la presente memoria se generaron hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales denominados 1F9 (IgGl, K), 2D10 (IgG1, K), 2F8 (IgGl, K), 6B11 (IgGl, K), 3G3 (IgG1, K), 8C6 (IgGI, K) y 9G8 (IgG2a, K). Por ello los ejemplos específicos de anticuerpos incluyen un anticuerpo monoclonal, cuyo sitio de combinación con el epitopo inhibe competitivamente esencialmente toda la unión al epitopo del anticuerpo monoclonal 1F9, 2D10, 2F8, 6B11, 3G3, 8C6 y/o 9G8. Los ejemplos específicos relacionados incluyen un inmunoconjugado que comprende una molécula que contiene la región de unión al antígeno del anticuerpo monoclonal 1F9, 2D10, 2F8, 6B11, 3G3, 8C6 y/o 9G8 unido a un agente diagnóstico o terapéutico.
Ejemplos específicos adicionales relacionados con la invención que utilizan los anticuerpos monoclonales denominados 1F9, 2D10, 2F8, 6B11, 3G3, 8C6 y 9G8 incluyen métodos para detectar el crecimiento celular desregulado tal como el cáncer determinando la presencia del epitopo de 20P1F12/TMPRSS2 presente en una muestra de un mamífero, que comprende la utilización de un anticuerpo monoclonal para reaccionar con el epitopo de 20P1F12/TMPRSS2 presente en la muestra, el anticuerpo caracterizado por la unión inmunológica a un epitopo de 20P1F12/TEMPRSS2, teniendo dicho anticuerpo un sitio de combinación con el antígeno que inhibe competitivamente la unión inmunoespecífica de un anticuerpo denominado 1F9, 2D10, 2F8, 6B11, 3G3, 8C6 y 9G8, respectivamente a su antígeno blanco. Otros ejemplos específicos relacionados con la invención que utilizan los anticuerpos monoclonales denominados 1F9, 2D10, 2F8, 6B11, 3G3, 8C6 y 9G8 incluyen métodos para inhibir el avance del crecimiento celular desregulado tal como cáncer, que comprenden poner en contacto un epitopo de 20P1F12/TMPRSS2 con un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno de modo que el avance del cáncer sea inhibido, en donde dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno posee una región de unión al antígeno del anticuerpo monoclonal murino 1F9, 2D10, 2F8, 6B11, 3G3, 8C6 y/o 9G8.
Ejemplos específicos adicionales relacionados con la invención que utilizan los anticuerpos monoclonales denominados 1F9, 2D10, 2F8, 6B11, 3G3, 8C6 y 9G8 incluyen métodos para determinar la presencia de crecimiento celular desregulado tal como cáncer en una muestra biológica, que comprenden poner en contacto un espécimen de dicha muestra con un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo que específicamente se enlaza a un epitopo de 20P1F12/TMPRSS2, en donde dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno posee una región de unión al antígeno del anticuerpo monoclonal murino 1F9, 2D10, 2F8, 6B11, 3G3, 8C6 y/o 9G8, y detectar la unión de dicho anticuerpo o fragmento a dicha muestra biológica.
Tal como se describe en detalle más abajo, ejemplos específicos adicionales relacionados con la invención que utilizan los anticuerpos monoclonales denominados 1F9, 2D10, 2F8, 6B11, 3G3, 8C6 y 9G8 incluyen métodos para inhibir el crecimiento celular desregulado tal como cáncer en una muestra biológica, que comprenden poner en contacto un espécimen de dicha muestra con un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo que específicamente se une a un epitopo de 20P1F12/TMPRSS2, en donde dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno posee una región de unión al antígeno del anticuerpo monoclonal murino 1F9, 2D10, 2F8, 6B11, 3G3, 8C6 y/o 9G8, respectivamente, de modo que el crecimiento celular desregulado sea inhibido.
Los datos ilustrados en la Figura 7B y la Figura 33 indican que 20TP1F12/TMPRSS2 se expresa en tejido de riñón normal, pero está regulado por disminución o se expresa a niveles menores en la mayoría de los tejidos de cáncer de riñón. En un caso en los experimentos ilustrados en la Figura 33, la expresión en cáncer de riñón está aumentada en comparación con el tejido normal. La regulación por disminución de 20P1F12/TMPRSS2 puede de este modo predisponer a un paciente a desarrollar cáncer de riñón. Por consiguiente, los métodos terapéuticos para el tratamiento del cáncer de riñón pueden comprender administrar 20P1F12/TMPRSS2 o fragmentos funcionales de la misma a pacientes con cáncer de riñón, o transfectar las células cancerosas con una construcción genética que expresa 20P1F12/TMPRSS2 (p. ej., terapia génica, mediante métodos de administración virales o liposomales u otros métodos de administración conocidos por los expertos en la técnica).
Se proporcionan más abajo métodos terapéuticos y diagnósticos ilustrativos adicionales relacionados con la invención. Estos métodos simplemente representan ejemplos típicos descritos en la presente memoria y de ninguna manera limitan la invención.
Métodos terapéuticos ilustrativos de la invención
La proteína 20P1F12/TMPRSS2 es una serina-proteasa que puede encontrarse tanto en las formas secretadas como en las formas asociadas a la superficie celular y puede estar involucrada en la invasión y metástasis de cánceres de próstata, vejiga, ovario, pulmón, colon y otros cánceres. Por consiguiente, 20P1F12/TMFRSS2 puede ser un blanco ideal para la intervención terapéutica. Según se destaca en la presente memoria, se descubre que 20P1F12/TMFRSS2 aparece en una variedad de formas o especies que incluyen especies secretadas y asociadas a células. Sus especies de proteasa secretada son, por ejemplo, blancos potenciales de fármacos y anticuerpos, mientras que las especies asociadas a membrana son, por ejemplo, blancos de anticuerpos terapéuticos. Por lo tanto, describimos varias composiciones inmunoterapéuticas y métodos para tratar el cáncer de próstata, colon, vejiga, pulmón y ovárico y cánceres metastásicos incluyendo terapia de anticuerpos, vacunas in vivo, y abordajes de inmunoterapias ex vivo, que utilizan polinucleótidos y polipéptidos correspondientes a 20P1F12/TMPRSS2 y anticuerpos anti-20P1F12/TMPRSS2. Un ejemplo típico en este contexto consiste en un método para inhibir el crecimiento de una célula neoplásica que expresa 20P1F12/TMPRSS2, que comprende poner en contacto 20P1F12/TMPRSS2 expresada por la célula neoplásica con una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-20P1F12/TMRSS2 de modo que el crecimiento de la célula neoplásica sea inhibido.
En un abordaje, pueden utilizarse anticuerpos anti-20P1F12/TMPRSS2 para tratar cánceres tales como cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon y cánceres metastásicos. Por ejemplo, el anticuerpo anti-20P1F12/TMPRSS2 puede introducirse en un paciente de modo tal que el anticuerpo se una a20P1F12/TMPRSS2 libre y module su actividad biológica, conduciendo de ese modo a la inhibición de la invasión del tumor. Alternativamente, el anticuerpo anti-20P1F12/TMPRSS2 puede introducirse en un paciente de modo tal que el anticuerpo se una a 20P1F12/TMPRSS2 en las células de cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón o colon o células de cáncer metastásico y medie la destrucción de las células y el tumor. El mecanismo terapéutico de acción puede incluir citólisis mediada por el complemento, citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo, alteración de la función fisiológica de 20P1F12/TMPRSS2 y/o la inhibición de unión al ligando o vías de transducción de señales. Anticuerpos anti-20P1F12/TMPRSS2 conjugados a agentes tóxicos tales como ricina, o a agentes terapéuticos, también pueden utilizarse terapéuticamente para administrar el agente tóxico o agente terapéutico directamente a las células tumorales portadoras de 20P1F12/TMPRSS2 y de ese modo destruir el tumor.
La inmunoterapia para el cáncer que utiliza anticuerpos anti-20P1F12/TMPRSS2 puede seguir las enseñanzas generadas a partir de diversos abordajes que se han empleado exitosamente con respecto a otros tipos de cáncer, incluyendo, sin limitación, el cáncer de colon (Arlen et al., 1998, Crit Rev Immunol 18: 133-138), mieloma múltiple (Ozaki et al., 1997, Blood 90: 3179-3186; Tsunenari et al., 1997, Blood 90: 2437-2444), cáncer gastrico (Kaspizyk et al., 1992, Cancer Res 52: 2771-2776), linfoma de células B (Funakoshi et al., 1996, J Immunther Emphasis Tumor Immunol 19: 93-101), leucemia (Thong et al., 1996, Leuk Res 20: 581-589), cáncer colorrectal (Moun et al., 1994, Cancer Res 54: 6160-6166); Velders et al., 1995, Cancer Res 55: 4398-4403) y cáncer de mama (Shepard et al., 1991, J Clin Immunol 11: 117-127).
Los anticuerpos de 20P1F12/TMPRSS2 pueden introducirse en un paciente de modo tal que el anticuerpo se una a 20P1F12/TM'RSS2 en las células cancerosas y medie la destrucción de las células y el tumor y/o inhiba el crecimiento de las células o el tumor. Los mecanismos por medio de los cuales los anticuerpos ejercen un efecto terapéutico pueden incluir citólisis mediada por el complemento, citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo, modulación de la función fisiológica de 20P1F12/TMPRSS2, inhibición de la unión del ligando o vías de transducción de señales, modulación de la diferenciación de células tumorales, alteración de los perfiles de factores angiogénicos tumorales y/o inducción de la apoptosis. Los anticuerpos de 20P1F12/TMPRSS2 conjugados a agentes tóxicos o terapéuticos también pueden utilizarse terapéuticamente para administrar el agente tóxico o terapéutico directamente a las células tumorales portadoras de 20P1F12/TMPRSS2.
Aunque la terapia con anticuerpos de 20P1F12TTMPRSS2 puede ser útil para todos los estadios de los cánceres anteriores, la terapia con anticuerpos puede ser particularmente apropiada en cánceres de próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon avanzados o metastásicos y/u otros cánceres metastásicos. La combinación del método de la terapia con anticuerpos con un régimen de terapia hormonal o quimioterapéutica puede ser preferible en los pacientes que no han recibido tratamiento quimioterapéutico, mientras que el tratamiento con la terapia de anticuerpos puede indicarse a pacientes que hayan recibido uno o más tratamientos quimioterapéuticos. Además, la terapia con anticuerpos también puede permitir el uso de dosificaciones reducidas de hormona concomitante o quimioterapia, particularmente en pacientes que no toleran muy bien la toxicidad del agente quimioterapéutico.
Puede desearse que los pacientes sean evaluados en cuanto a la presencia y nivel de 20P1F12/TMPRSS2, preferiblemente utilizando evaluaciones inmunohistoquímicas de tejido tumoral, la detección cuantitativa por imágenes de 20P1F12TMPRSS2 u otras técnicas capaces de indicar de manera segura la presencia y grado de expresión. El análisis inmunohistoquímico de biopsias tumorales o especímenes quirúrgicos puede preferirse para este fin. Se conocen bien en la técnica métodos para el análisis inmunohistoquímico de tejidos tumorales.
Los anticuerpos anti-20P1F12/TMPRSS2 útiles en el tratamiento de cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon y otros cánceres incluyen aquellos que son capaces de iniciar una respuesta inmune potente contra el tumor y aquellos que son capaces de dirigir la citotoxicidad. Al respecto, los mAb anti-20P1F12/TMPRSS2 tales como los descritos en el Ejemplo 5 pueden provocar lisis de las células tumorales ya sea por mecanismos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos o mediada por complementos (ADCC), en donde ambas requieren una porción intacta de Fc de la molécula de la inmunoglobulina para la interacción con los sitios del receptor Fc de las células efectoras o proteínas del complemento. Además, los mAb anti-20P1F12/TMPRSS2 que ejercen un efecto biológico directo sobre el crecimiento tumoral son útiles en la práctica de la invención. Los mecanismos potenciales por medio de los cuales dichos mAb citotóxicos directamente pueden actuar incluyen la inhibición del crecimiento celular, modulación de la diferenciación celular, modulación de perfiles de factores angiogénicos tumorales y la inducción de la apoptosis. El mecanismo por el cual un mAb particular anti-20P1F12/TMPRSS2 ejerce un efecto anti-tumoral puede evaluarse utilizando cualquier cantidad de ensayos in vitro diseñados para determinar ADCC y lisis celular mediada por el complemento, así como inhibición del crecimiento, modulación de la apoptosis e inhibición de la diferenciación, y/o inhibición de la angiogénesis, tal como se conoce en general en la técnica.
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Un mecanismo potencial adicional por el cual los anticuerpos tales como 1F9, 2D10, 2F8, 6B11, 3G3, 8C6 y 9G8 pueden inhibir el avance de los cánceres tales como cánceres de próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon y cánceres metastásicos es por modulación de la actividad de proteasa de, por ejemplo, la especie 20P1F12/TMPRSS2 de 32 kD hallada en el suero de individuos que sufren de cáncer de próstata y colon (véase, p. ej., las Figs. 23 y 25). Este descubrimiento de que una forma secretada de 20P1F12/TMPRSS2 se encuentra en los sueros de individuos que sufren de cáncer de próstata y colon proporciona evidencia de que esta molécula puede localizarse mediante métodos terapéuticos extracelulares. En este contexto, se ha demostrado que el uso de anticuerpos para inhibir la función de la proteasa asociada a procesos oncogénicos inhibe procesos oncogénicos tales como metástasis (véase, p. ej., Mueller et al., P.N.A.S. 89(24): 11832-11836 (1992); Waghray et al., Clin. Cancer Res. 1(7): 747-753 (1995)). Además de los anticuerpos, las moléculas pequeñas que modulan la actividad de proteasa también pueden inhibir el avance de los procesos oncogénicos y pueden ser útiles para, por ejemplo, la terapia anti-metastásica en pacientes con diversos cánceres (véase, p. ej., McMillan et al., Int. J. Cancer 67(4): 523-531 (1996); Morikawa et al., Nippon Ika Daigaku Zasshi 62(4): 320-328 (1995)). El diseño racional de los inhibidores de proteasa es conocido en la técnica (véase, p. ej., Wagner et al., J. Med. Chem. 41(19): 3664-3674 (1998); LaLonde et al, J. Med. Chem. 41(23): 4567-4576 (1998)). Además, la ruptura auto-catalítica observada (véase el Ejemplo 10 más abajo) puede explotarse para identificar moléculas pequeñas que inhiben la actividad de 20P1F12/TMPRSS2. Específicamente, las células pueden hacerse crecer en presencia o ausencia de inhibidores de moléculas pequeñas para buscar específicamente la inhibición de la ruptura. Es más, la identificación de moléculas que pueden interactuar con 20P1F12/TMFRSS2 se trata en detalle más abajo.
La actividad anti-tumoral de un anticuerpo anti-20P1F12/TMPRSS2 particular, molécula pequeña, o combinación de tales moléculas, puede evaluarse in vivo utilizando un modelo animal apropiado. Por ejemplo, los modelos xenogénicos de cáncer de próstata en donde los explantes humanos de cáncer de próstata o los tejidos de xenoinjertos pasados se introducen en animales inmunocomprometidos, tales como ratones lampiños o SCID, son apropiados en relación con el cáncer de próstata y han sido descritos (Klein et al., 1997, Nature Medicine 3: 402408). Por ejemplo, la Solicitud de Patente PCT WO98/16628, Sawyers et al, publicada el 23 de abril de 1998, describe varios modelos de xenoinjertos de cáncer de próstata humana capaces de recapitular el desarrollo de tumores primarios, micrometástasis y la formación de metástasis osteoblástica característica de la enfermedad en estadío tardío. La eficacia puede predecirse utilizando la inhibición de la formación tumoral, regresión tumoral, metástasis y similares.
Se debe observar que el uso de anticuerpos monoclonales murinos u otros anticuerpos monoclonales no humanos, los mAb quiméricos de humano/ratón, puede inducir respuestas inmunes moderadas a fuertes en algunos pacientes. En los casos más graves, dicha respuesta inmune puede llevar a la formación extensiva de complejos inmunes que, potencialmente, pueden causar insuficiencia renal. Por consiguiente, los anticuerpos monoclonales preferidos utilizados en la práctica de los métodos terapéuticos son aquellos que son completamente humanos o humanizados y que se unen específicamente al antígeno 20P1F12/TMPRSS2 blanco con alta afinidad pero exhiben baja o ninguna antigenicidad en el paciente.
Los métodos descritos contemplan la administración de mAb anti-20P1F12/TMPRSS2 únicos así como combinaciones, o "cóteles", de diferentes mAb. Tales cócteles de mAb pueden tener ciertas ventajas en la medida que los mismos contengan mAbs que exploten especificidad de diferentes epitopos, diferentes mecanismos efectores o combinen directamente los mAb citotóxicos con mAb que dependen de la funcionalidad efectora inmune . Dichos mAb en combinación pueden exhibir efectos terapéuticos sinérgicos. Además, la administración de mAb anti-20P1F12/TMPRSS2 puede combinarse con otros agentes terapéuticos o terapia radiante, incluyendo, sin limitación, varios agentes quimioterapéuticos, bloqueadores de andrógenos y moduladores inmunes (p. ej., IL-2, GM-CSF). Los mAb anti-20P1F12/TMPRSS2 pueden administrarse en su forma "desnuda" o no conjugada o pueden tener agentes terapéuticos o tóxicos conjugados a ellos.
Los anticuerpos monoclonales anti-20P1F12/TMPRSS2 utilizados en la práctica de los métodos descritos pueden formularse en composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo apropiado para el método de administración deseado. Los vehículos apropiados incluyen cualquier material que cuando se combina con los mAb anti-20P1F12/TMPRSS2 retiene la especificidad y la función anti-tumoral del anticuerpo y no es reactivo con los sistemas inmunes del sujeto. Los ejemplos incluyen, sin limitación, uno cualquiera de un número de vehículos farmacéuticos estándar tales como soluciones salinas estériles tamponadas con fosfato, agua bacteriostática y similares.
Las formulaciones de anticuerpos anti-20P1F12/TMPRSS2 pueden administrarse a través de cualquier vía capaz de aplicar los anticuerpos al sitio tumoral. Las vías de administración potencialmente efectivas incluyen, sin limitación, la intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica y similares. La vía de administración preferida es mediante inyección intravenosa. Una formulación preferida para la inyección intravenosa comprende los mAb anti-20P1F12/TMPRSS2 en una solución de agua bacteriostática con preservadores, agua estéril sin preservadores y/o diluida en bolsas de cloruro de polivinilo o de polietileno que contienen Cloruro de Sodio estéril al 0,9% para inyección, USP. La preparación de mAb anti-20P1F12/TMPRSS2 puede liofilizarse y conservarse como un polvo estéril, preferiblemente al vacío, y después puede reconstituirse en agua bacteriostática que contiene, por ejemplo, alcohol bencílico como preservador, o en agua estéril previo a la inyección.
El tratamiento en general involucrará la administración repetida de la preparación de anticuerpos anti-20P1F12/
TMPRSS2 a través de una vía de administración aceptable tal como inyección intravenosa (IV), típicamente en una dosis en el intervalo de alrededor de 0,1 a alrededor de 10 mg/kg de peso corporal. Las dosis en el intervalo de 10-500 mg de mAb por semana pueden ser efectivas y bien toleradas. Sobre la base de la experiencia clínica con el mAb de herceptina en el tratamiento del cáncer de mama metastásico, una dosis de carga inicial IV de aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal del paciente seguida de dosis semanales IV de alrededor de 2 mg/kg de la preparación del mAb anti-20P1F12/TMPRSS2 puede representar un régimen de dosificación aceptable. Preferiblemente, la dosis de carga inicial se administra como una infusión de 90 minutos o más. La dosis de mantenimiento periódica puede administrarse como una infusión de 30 minutos o más, siempre que la dosis inicial haya sido bien tolerada. Sin embargo, tal como el experto en la técnica entenderá, diversos factores influirán sobre el régimen de dosis ideal en un caso particular. Tales factores pueden incluir, por ejemplo, la afinidad de unión y vida útil del mAb o mAbs utilizados, el grado de sobreexpresión de 20P1F12/TMPRSS2 en el paciente, el grado de circulación del antígeno 20P1F12/TMPRSS2 liberado, el nivel deseado de concentración del anticuerpo en estado estacionario, la frecuencia del tratamiento y la influencia de agentes quimioterapéuticos utilizados en combinación con los métodos de tratamiento descritos.
De manera óptima, los pacientes deben ser evaluados con respecto al nivel de antígeno 20P1F12TTMPRSS2 liberado circulante en suero con el fin de contribuir a la determinación del régimen de dosificación más efectivo y factores relacionados. Tales evaluaciones también pueden utilizarse con fines de monitoreo a lo largo de la terapia, y pueden ser útiles para medir el éxito terapéutico en combinación con la evaluación de otros parámetros (tales como niveles séricos de PSA en la terapia del cáncer de próstata).
La invención además se refiere a vacunas para el cáncer que comprenden una proteína 20P1F12/TMPRSS2 o fragmento de la misma. El uso de un antígeno tumoral en una vacuna para generar inmunidad humoral y mediada por células para el uso en terapia anti-cáncer es bien conocido en la técnica y se ha empleado en el cáncer de próstata utilizando PSMA humano e inmunógenos PAP de roedores (Hodge et al., 1995, Int. J. Cancer 63: 231-237; Fong et al., 1997; J. Immunol. 159: 3113-3117). Tales métodos pueden llevarse a la práctica fácilmente empleando una proteína 20P1F12/TMPRSS2 o fragmento de la misma, o una molécula de ácido nucleico que codifica 20P1F12/TMPRSS2 y vectores recombinantes capaces de expresar y presentar adecuadamente el inmunógeno 20P1F12/TMPRSS2. En este contexto, puede utilizarse una variedad de polipéptidos de 20P1F12/TMPRSS2 como inmunógenos incluyendo aquellos que se dirigen a un dominio específico (tales como el dominio proteasa en la especie 20P1F12/TMPRSS2 secretada de 32 kD) o uno de los motivos biológicos tratados más arriba. Según se muestra en el Ejemplo 5 y la Tabla 2, los inmunógenos de 20P1F12/TMPRSS2 pueden generar una respuesta inmune a una variedad de epitopos de 20P1F12/TMPRSS2.
Pueden utilizarse sistemas de administración de genes virales para administrar una molécula de ácido nucleico que codifica 20P1F12/TMPRSS2. Diversos sistemas de administración de genes virales que pueden utilizarse en la práctica de este aspecto de la invención incluyen, sin limitación, virus vacuna, virus de la viruela aviar, viruela de los canarios, adenovirus, virus de la gripe, poliovirus, virus adeno-asociados, lentivirus y virus sindbus (Restifo, 1996, Curr. Opin. immunol. 8: 658-663). También pueden emplearse sistemas de administración no virales utilizando ADN desnudo que codifica una proteína 20P1F12/TMPRSS2 o fragmento de la misma introducido en el paciente (p. ej., por vía intramuscular) para inducir una respuesta anti-tumoral. En un ejemplo puede emplearse el ADNc humano de 20P1F12/TMPRSS2 de longitud completa. En otro ejemplo pueden emplearse moléculas de ácido nucleico de 20P1F12/TMPRSS2 que codifican epitopos de linfocitos T citotóxicos específicos (CTL). Los epitopos de CTL pueden determinarse utilizando algoritmos específicos (p. ej., Epimer, Brown University) para identificar péptidos dentro de una proteína 20P1F12/TMPRSS2 que es capaz de unirse de manera óptima a alelos HLA especificados.
También pueden emplearse diversas estrategias ex vivo. Un abordaje incluye el uso de células dendríticas para presentar el antígeno de 20P1F12/TMPRSS2 al sistema inmune de un paciente. Las células dendríticas expresan MHC clase I y II, coestimulador B7 e 1L-12, y de este modo son células presentadoras del antígeno altamente especializadas. En el cáncer de próstata, se están utilizando células dendríticas autólogas pulsadas con péptidos del antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) en un ensayo clínico de Fase I para estimular los sistemas inmunes de los pacientes con cáncer de próstata (Tjoa et al., 1996, Prostate 28: 65-69; Murphy et al., 1996, Prostate 29: 371-380). Pueden utilizarse células dendríticas para presentar los péptidos 20P1F12/TMPRSS2 a células T en el contexto de moléculas MHC clase I y II. En un ejemplo, las células dendríticas autólogas son pulsadas con péptidos de 20P1F12/TMPRSS2 capaces de unirse a las moléculas MHC. En otro ejemplo, las células dendríticas son pulsadas con la proteína completa 20P1F12/TMPRSS2. Inclusive otro ejemplo incluye manipular genéticamente la sobreexpresión del gen 20P1F12/TMPRSS2 en células dendríticas utilizando diversos vectores de implementación conocidos en la técnica, tales como adenovirus (Arthur et al., 1997, Cancer Gene Ther. 4: 17-25), retrovirus (Henderson et al., 1996, Cancer Res. 56: 3763-3770), lentivirus, virus adeno-asociados, transfección de ADN (Ribas et al., 1997, Cancer Res. 57: 2865-2869) y transfección de ARN obtenido de tumores (Ashley et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 1177-1182).
También pueden utilizarse anticuerpos anti-idiotípicos anti-20P1F12/TMPRSS2 en la terapia anti-cáncer como vacuna para inducir una respuesta inmune a células que expresan una proteína 20P1F12/TMPRSS2. Específicamente, la generación de anticuerpos anti-idiotípicos es bien conocida en la técnica y puede adaptarse fácilmente para generar anticuerpos anti-idiotípicos anti-20P1F12/TMPRSS2 que imitan un epitopo en una proteína 20P1F12/TMPRSS2 (véase, por ejemplo, Wagner et al., 1997, Hybridoma 16: 33-40; Foon et al., 1995, J Clin Invest 96: 334-342; Herlyn et al., 1996, Cancer Immunol Immunother 43: 65-76). Tal anticuerpo anti-idiotípico puede utilizarse en terapia anti-idiotípica tal como se practica actualmente con otros anticuerpos anti-idiotípicos dirigidos contra antígenos tumorales.
Pueden emplearse métodos de inmunización genética para generar respuestas inmunes celulares y humorales profilácticas o terapéuticas dirigidas contra células cancerosas que expresan 20P1F12/TMPRSS2, particularmente células de cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon y células de cáncer metastásico. Construcciones que comprenden ADN que codifica una proteína/inmunógeno de 20P1F12/TMPRSS2 y secuencias reguladoras apropiadas pueden inyectarse directamente en el músculo o piel de un individuo, de manera tal que las células del músculo o piel capten la construcción y expresen la proteína/inmunogén de 20P1F12/TMPRSS2 codificado. La proteína/inmunógeno de 20P1F12/TMPRSS2 puede expresarse como una proteína de superficie celular o puede secretarse. La expresión de la proteína/inmunogén de 20P1F12/TMPRSS2 da lugar a la generación de inmunidad celular y humoral profiláctica o terapéutica contra el cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon y cáncer metastásico. Pueden utilizarse diversas técnicas de inmunización genética profilácticas o terapéuticas conocidas en la técnica (a modo de revisión, véase la información y referencias publicadas en la dirección de Internet www.genweb.com).
Los ejemplos típicos relacionados con la invención consisten en una composición para vacuna para el tratamiento de un cáncer que expresa 20P1F12/TMPRSS2, que comprende una porción inmunogén de un polipéptido de 20P1F12/TMPRSS2 y un vehículo fisiológicamente aceptable. Un aspecto relacionado consiste en el método para modular el crecimiento de una célula que expresa 20P1F12/TMPRSS2 en un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de la vacuna.
La descripción además incluye diversos métodos y composiciones para inhibir la unión de 20P1F12/TMPRSS2 a su pareja de unión o ligando, o su asociación con otra(s) proteína(s) así como métodos para inhibir la función de 20P1F12/TMPRSS2. En un abordaje, los vectores recombinantes que codifican anticuerpos de cadena única que específicamente se unen a 20P1F12/TMPRSS2 pueden introducirse en células que expresan 20P1F12/TMPRSS2 a través de tecnologías de transferencia génica, en donde el anticuerpo anti-20P1F12/TMPRSS2 codificado de cadena única se expresa intracelularmente, se une a la proteína 20P1F12/TMPRSS2, y de ese modo inhibe su función. Se conocen bien métodos para manipular genéticamente dichos anticuerpos intracelulares de cadena única. Dichos anticuerpos intracelulares, también conocidos como "intracuerpos", pueden dirigirse específicamente a un compartimiento particular dentro de la célula, proporcionado control sobre dónde se focalizará la actividad inhibidora del tratamiento. Esta tecnología se ha aplicado exitosamente en la técnica (a modo de revisión, véase Richardson y Marasco, 1995, TIBTECH vol. 13). Se ha demostrado que los intracuerpos eliminan virtualmente la expresión de receptores de la superficie celular de otro modo abundantes. Véase, por ejemplo, Richardson et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3137-3141; Beerli et al., 1994, J. Biol. Chem. 289: 23931-23936; Deshane et al., 1994, Gene Ther. 1: 332-337.
Los anticuerpos de cadena única comprenden los dominios variables de la cadena pesada y liviana unidos por un polipéptido conectorflexible, y se expresan como un único polipéptido. Opcionalmente, los anticuerpos de cadena única pueden expresarse como un fragmento de región variable de cadena única unido a la región constante de cadena liviana. Pueden manipularse señales de tráfico intracelular bien conocidas en vectores de polinucleótidos recombinantes que codifican dichos anticuerpos de cadena única a fin de localizar con precisión el intracuerpo expresado en el compartimiento intracelular deseado. Por ejemplo, los intracuerpos dirigidos al retículo endoplasmático (RE) pueden manipularse genéticamente para incorporar un péptido líder y, opcionalmente, una señal de retención del RE C-terminal, tal como el motivo de los aminoácidos KDEL. Los intracuerpos que tienen el objeto de ejercer una actividad en el núcleo pueden manipularse genéticamente para incluir una señal de localización nuclear. Restos de lípidos pueden unirse a los intracuerpos con el fin de sondear el intracuerpo al lado citosólico de la membrana plasmática. Los intracuerpos también pueden dirigirse para ejercer su función en el citosol. Por ejemplo, los intracuerpos citosólicos pueden utilizarse secuestrar factores dentro del citosol, evitando de ese modo que sean transportados a su destino celular natural.
En un ejemplo, los intracuerpos pueden utilizarse para capturar 20P1F12/TMPRSS2 en el núcleo, evitando de ese modo su actividad dentro del núcleo. Pueden manipularse genéticamente señales de localización nuclear en dichos intracuerpos de 20P1F12/TMPRSS2 con el fin de lograr la localización deseada. Dichos intracuerpos de 20P1F12/TMPRSS2 pueden diseñase para unirse específicamente a un dominio particular de 20P1F12/TMPRSS2. En otro ejemplo, los intracuerpos citosólicos que se unen específicamente a la proteína 20P1F12/TMPRSS2 pueden utilizarse para evitar que 20P1F12/TMPRSS2 gane acceso al núcleo, evitando de ese modo que el mismo ejerza cualquier actividad biológica dentro del núcleo (p. ej., evitando que 20P1F12/TMPRSS2 forme complejos de transcripción con otros factores).
Con el fin de dirigir específicamente la expresión de dichos intracuerpos a células tumorales particulares, la transcripción del intracuerpo puede ubicarse bajo el control regulador de un promotor y/o mejorador apropiado específico del tumor. Con el fin de dirigir la expresión del intracuerpo específicamente a la próstata, por ejemplo, puede utilizarse el promotor y/o el promotor/mejorador del PSA (Véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5.919.652).
En otro abordaje, se utilizan moléculas recombinantes que son capaces de unirse a 20P1F12/TMPRSS2, evitando de ese modo que 20P1F12/TMPRSS2 acceda/se una a su(s) pareja(s) de unión o se asocie a otra(s) proteína(s), para inhibir la función de 20P1F12/TMPRSS2. Dichas moléculas recombinantes pueden, por ejemplo, contener la(s) parte(s)
reactiva(s) de una molécula específica del anticuerpo de 20P1F12/TMPRSS2. En un ejemplo particular, el dominio de unión de 20P1F12/TMPRSS2 de una pareja de unión de 20P1F12/TMPRSS2 puede manipularse genéticamente en una proteína de fusión dimérica que comprende dos dominios de unión al ligando de 20P1F12/TMPRSS2 unidos a la porción Fc de una IgG humana, tal como la lgG1 humana. Dicha porción de IgG puede contener, por ejemplo, los dominios C_{H}2 y C_{H}3 y la región bisagra, pero no el dominio C_{H}1. Dichas proteínas de fusión diméricas pueden administrarse en forma soluble a pacientes que sufren de un cáncer asociado a la expresión de 20P1F12/TMPRSS2, incluyendo, sin limitación, cánceres de próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon, y cánceres metastásicos, donde la proteína de fusión dimérica específicamente se une a 20P1F12/TMPRSS2, bloqueando de ese modo la interacción de 20P1F12/TMPRSS2 con una pareja de unión. Dichas proteínas de fusión diméricas además pueden combinarse para dar proteínas multiméricas utilizando conocidas tecnologías de enlace de anticuerpos.
Dentro de otra clase de abordajes terapéuticos, describimos diversos métodos y composiciones para inhibir la transcripción del gen 20P1F12/TMPRSS2. De manera similar, la descripción también proporciona métodos y composiciones para inhibir la traducción del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 a proteína.
En un abordaje, un método para inhibir la transcripción del gen 20P1F12/TMPRSS2 comprende poner en contacto el gen 20P1F12/TMPRSS2 con un polinucleótido antisentido de 20P1F12/TMPRSS2 según se ilustra en el Ejemplo 14. En otro abordaje, un método para inhibir la traducción del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 comprende poner en contacto el ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 con un polinucleótido antisentido. En otro abordaje, puede utilizarse una ribozima específica de 20P1F12/TMPRSS2 para escindir el mensaje de 20P1F12/TMPRSS2, inhibiendo de ese modo la traducción. Dichos métodos antisentido y basados en ribozimas también pueden dirigirse a regiones reguladoras del gen 20P1F12/TMPRSS2, tales como el promotor y/o elementos mejoradores de 20P1F12/TMPRSS2. De manera similar, pueden utilizarse proteínas capaces de inhibir un factor de transcripción del gen 20P1F12/TMPRSS2 para inhibir la transcripción del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2. Los diversos polinucleótidos y composiciones útiles en los métodos antes mencionados se han descrito más arriba. El uso de moléculas antisentido y ribozimas para inhibir transcripción y traducción es bien conocido en la técnica.
Otros factores que inhiben la transcripción de 20P1F12/TMPRSS2 a través de la interferencia con la activación transcripcional de 20P1F12/TMPRSS2 también pueden ser útiles para el tratamiento de cánceres que expresan 20P1F12/TMPRSS2. De manera similar, los factores que son capaces de interferir con el procesamiento de 20P1F12/TMPRSS2 pueden ser útiles para el tratamiento de cánceres que expresan 20P1F12/TMPRSS2. Se prevén métodos de tratamiento del cáncer que utilizan dichos factores.
Pueden utilizarse tecnologías de transferencia génica y terapia génica para administrar moléculas terapéuticas del polinucléotido a células tumorales que sintetizan 20P1F12/'TMPRSS2 (es decir, moléculas antisentido, ribozimas, polinucleótidos que codifican intracuerpos y otras moléculas inhibidoras de 20P1F12/TMPRSS2). En la técnica se conoce una serie de abordajes de terapia génica. Los vectores recombinantes que codifican polinucleótidos antisentido de 20P1F12/TMPRSS2, ribozimas, factores capaces de interferir con la transcripción de 20P1F12/TMPRSS2, etcétera, pueden administrarse a células tumorales blanco utilizando dichos abordajes de terapia génica.
Los abordajes terapéuticos anteriores pueden combinarse con uno cualquiera de una amplia variedad de regímenes de quimioterapia o terapia radiante. Estos abordajes terapéuticos también pueden permitir el uso de dosificaciones reducidas de quimioterapia y/o administración menos frecuente, particularmente en pacientes que no toleran bien la toxicidad del agente quimioterapéutico.
La actividad anti-tumoral de una composición particular (p. ej., antisentido, ribozima, intracuerpo), o una combinación de tales composiciones, puede evaluarse utilizando diversos sistemas de ensayo in vitro e in vivo. Los ensayos in vitro para evaluar el potencial terapéutico incluyen ensayos de crecimiento celular, ensayos de agar blando, ensayos de invasión y angiogénicos y otros ensayos indicativos de actividad promotora de tumores, ensayos de unión capaces de determinar en qué medida una composición terapéutica inhibirá la unión de 20P1F12/TMPRSS2 a una pareja de unión, etc.
In vivo, el efecto de una composición terapéutica de 20P1F12/TMPRSS2 puede evaluarse en un modelo animal apropiado, Por ejemplo, los modelos de cáncer de próstata xenogénico en donde los explantes humanos de cáncer de próstata o tejidos de xenoinjertos pasados se introducen en animales inmunocomprometidos, tales como ratones lampiños o SCID, son apropiados con relación al cáncer de próstata y han sido descritos (Klein et al., 1997, Nature Medicine 3:4021408). Por ejemplo, la Solicitud de Patente PCT W098116628, Sawyers et al., publicada el 23 de abril de 1998, describe varios modelos de xenoinjertos de cáncer de próstata humano capaces de recapitular el desarrollo de tumores primarios, micrometástasis y la formación de metástasis osteoblástica característica de la enfermedad en estadío tardío. La eficacia puede predecirse utilizando ensayos que miden la inhibición de formación tumoral, regresión del tumor o metástasis, y similares. Véase, también, los Ejemplos de más abajo.
Los ensayos in vivo que califican la promoción de apoptosis también pueden ser útiles en la evaluación de potenciales composiciones terapéuticas. En un ejemplo, xenoinjertos de ratones portadores tratados con la composición terapéutica pueden examinarse para determinar la presencia de focos apoptóticos y compararse con ratones control portadores de xenoinjertos no tratados. El grado en el que se encuentran los focos apoptóticos en los tumores de los ratones no tratados proporciona una indicación de la eficacia terapéutica de la composición.
Las composiciones terapéuticas utilizadas en la práctica de los métodos precedentes pueden formularse para dar composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo apropiado para el método de administración deseado. Los vehículos apropiados incluyen cualquier material que al combinarse con la composición terapéutica retiene la función anti-tumoral de la composición terapéutica y es no reactivo con el sistema inmune del paciente. Los ejemplos incluyen, sin limitación, cualquiera de una serie de vehículos farmacéuticos estándar tales como soluciones salinas estériles tamponadas con fosfato, agua bacteriostática y similares (véase, en general, Remington's Pharmaceutical Sciences 16ta. edición., A. Osal., Ed., 1980).
Las formulaciones terapéuticas pueden solubilizarse y administrarse a través de cualquier vía capaz de administrar la composición terapéutica al sitio tumoral. Las vías potencialmente efectivas de administración incluyen, sin limitación, intravenosa, parenteral, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica, intraorgánica, ortotópica y similares. Una formulación preferida para la inyección intravenosa comprende la composición terapéutica en una solución en agua bacteriostática con preservador, agua estéril sin preservador y/o diluida en bolsas de cloruro de polivinilo o polietileno que contienen cloruro de sodio estéril al 0,9% para inyección, USP. Las preparaciones de proteínas terapéuticas pueden liofilizarse y conservarse como polvos estériles, preferiblemente al vacío, y después pueden reconstituirse en agua bacteriostática que contiene, por ejemplo, alcohol bencílico como preservador, o en agua estéril antes de la inyección.
Los protocolos de dosificación y administración para el tratamiento de cánceres utilizando los métodos precedentes variará con el método y el cáncer a tratar y en general dependerá de una serie de otros factores apreciados en la técnica.
Motivos peptídicos y diseño de vacunas
Un "motivo", como en el motivo biológico de una proteína relacionada con 20P1F12/TMPRSS2, se refiere a cualquier patrón de aminoácidos que forma parte de la secuencia primaria de una proteína, que está asociada a una función particular (p. ej., interacción proteína-proteína, interacción proteína-ADN, etc) o modificación (p. ej., que es fosforilada, glicosilada o amidada), o localización (p. ej., secuencia secretora, secuencia de localización nuclear, etc.) o una secuencia que se correlaciona con ser inmunogén, ya sea a nivel humoral o celular. Un motivo puede ser o contiguo o capaz de alinearse a ciertas posiciones que en general se correlacionan con una cierta función o propiedad. En el contexto de los motivos HLA, "motivo" se refiere al patrón de residuos en un péptido de longitud definida, usualmente un péptido de aproximadamente 8 a aproximadamente 13 aminoácidos para un motivo HLA de clase I y de aproximadamente 6 a aproximadamente 25 aminoácidos para un motivo HLA de clase II, que es reconocido por una molécula HLA particular. Los motivos peptídicos para la unión de HLA son típicamente diferentes para cada proteína codificada por cada alelo HLA humano y difieren en el patrón de los residuos de anclaje primario y secundario.
Un "residuo de anclaje primario" a HLA es un aminoácido en una posición específica a lo largo de una secuencia de péptido que se entiende que proporciona un punto de contacto entre el péptido inmunogén y la molécula HLA. Uno a tres, usualmente dos, residuos de anclaje primario dentro de un péptido de longitud definida en general definen un "motivo" para un péptido inmunogén. Estos residuos se entiende que encajan en estrecho contacto con el surco de unión al péptido de una molécula HLA, con sus cadenas laterales ocultas en bolsillos específicos del surco de unión. En un ejemplo, los residuos de anclaje primario para una molécula HLA clase I se ubican en la posición 2 (desde la posición amino terminal) y en la posición carboxilo terminal de un epitopo de un péptido de 8, 9, 10, 11, o 12 residuos. En otro ejemplo, los residuos de anclaje primario de un péptido que se une a una molécula HLA clase II están espaciados uno con respecto al otro, en lugar de a los extremos de un péptido, donde el péptido en general tiene al menos 9 aminoácidos de longitud. Las posiciones de anclaje primario para cada motivo y supermotivo se exponen en la Tabla IV. Por ejemplo, pueden crearse péptidos análogos alterando la presencia o ausencia de restos particulares en las posiciones de anclaje primario y/o secundario que se muestran en la Tabla IV. Dichos análogos se utilizan para modular la afinidad
de unión y/o la cobertura de población de un péptido que comprende un motivo o supermotivo HLA particular.
Un "supermotivo" HLA es una especificidad de unión a péptidos compartida por moléculas HLA codificadas por dos o más alelos HLA.
Según se utiliza en la presente memoria, una "vacuna" de respuesta inmune HLA o celular es una composición que contiene o codifica uno o más péptidos relacionados con la invención. Existen numerosos ejemplos de tales vacunas, tales como un cóctel de uno o más péptidos individuales; uno o más péptidos relacionados con la invención compuestos por un péptido poliepitópico; o ácidos nucleicos que codifican dichos péptidos individuales o polipéptidos, p. ej. un minigen que codifica un péptido poliepitópico. El término "uno o más péptidos" puede incluir cualquier número de unidades enteras de 1-150 o más, p. ej. al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 o 150 o más péptidos relacionados con la invención. Los péptidos o polipéptidos opcionalmente pueden modificarse, tal como por lipidación, adición de secuencias de localización u otras. Los péptidos HLA clase I de la invención pueden mezclarse con, o conectarse a, péptidos HLA clase II, para facilitar la activación tanto de los linfocitos T citotóxicos como de los linfocitos T ayudantes. Las vacunas HLA también pueden comprender células presentadoras de antígenos pulsadas por péptidos, p. ej. células dendríticas.
Según se define en la presente memoria, las variantes, análogos u homólogos de 20P1F12/TMPRSS2 poseen el atributo distintivo de poseer al menos un epitopo que tiene "reacción cruzada" con una proteína 20P1F12/TMPRSS2. Según se utiliza en esta oración, "reacción cruzada" significa que un anticuerpo o célula T que se une específicamente a una variante de 20P1F12/TMPRSS2 también se une específicamente a la proteína 20P1F12/TMPRSS2. Un polipéptido deja de ser una variante de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 cuando ya no contiene ningún epitopo capaz de ser reconocido por un anticuerpo o célula T que se une específicamente a la proteína 20P1F12/TMPRSS2. Aquellos expertos en la técnica comprenden que los anticuerpos que reconocen proteínas se unen a epitopos de tamaño variable, y una agrupación del orden de aproximadamente cuatro o cinco aminoácidos, contiguos o no, se considera un número típico de aminoácidos en un epitopo mínimo. Véase, p. ej., Nair et al., J. Immunol 2000165(12): 6949-6955; Hebbes et al., Mol Immunol. (1989) 26(9):865-73; Schwartz et al., 7 Immunol (1985) 135(4)2598-608.
Los ejemplos ilustrativos adicionales descritos en la presente memoria incluyen polipéptidos de 20P1F12/
TMPRSS2 que comprenden los restos de aminoácidos de uno o más de los motivos biológicos contenidos dentro de la secuencia polipeptídica de 20P1F12/TMPRSS2. En la técnica se conocen diversos motivos, y una proteína puede evaluarse para determinarla presencia de dichos motivos mediante una serie de sitios de Internet públicamente disponibles (véase, p. ej., direcciones URL: pfam.wustl.edu/; searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/struc-predict.htmlpsort.ims.u-tokyo.ac.ip/; www.cbs.dtu.dk/; www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html; www.expasy.ch/tools/
scnpsit1.html; Epimatrix^{TM} y Epimer^{TM}, Brown University, www.brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/
epimatrix.html; y BIMAS, bimas.dert.nih.gov/.).
Los polipéptidos que comprenden uno o más de los motivos de 20P1F12/TMPRSS2 tratados más arriba son útiles para dilucidar las características específicas de un fenotipo maligno en vista de la observación de que la regulación de 20P1F12/TMPRSS2 está alterada en ciertos cánceres. La caseína quinasa II, el AMPc y la proteína quinasa dependiente del AMPc, y la Proteína Quinasa C, por ejemplo, son enzimas que se sabe están asociadas al desarrollo del fenotipo maligno (véase, p. ej., Chen et at, Lab Invest., 78(2): 165-174 (1998); Gaiddon et al., Endocrinology 136(10): 4331-4338 (1995); Hall et at, Ácidos nucleicos Research 24(6): 1119-1126 (1996); Peterziel et al., Oncogene 18(46): 6322-6319 (1999) y O'Brian, Oncol. Rep. 5(2): 305-309 (1998)). Es más, tanto la glicosilación como la miristoilación son modificaciones de proteínas también asociadas al cáncer y al avance del cáncer (véase, p. ej., Dennis et at, Biochem. Biophys. Acta 1473(1):21-34 (1999); Raju et al., Exp. Cell Res. 235(1): 145-154 (1997)). La amidación es otra modificación de la proteína también asociada al cáncer y al avance del cáncer (véase, p. ej., Treston et al., J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 13): 169-175 (1992)).
En otro ejemplo, las proteínas comprenden uno o más de los epitopos inmunorreactivos identificados de conformidad con métodos aceptados por la técnica. Los epitopos CTL pueden determinarse utilizando algoritmos específicos para identificar péptidos dentro de una proteína 20P1F12/TMPRSS2 que es capaz de unirse a alelos HLA especificados de manera óptima (Epimatrix^{TM} y Epimer^{TM}, Brown University, URL www.brown.edri/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html; y BIMAS, URL bimas.dert.nib.gov/.) Más aún, los procesos para identificar péptidos que poseen suficiente afinidad de unión para las moléculas HLA y que se correlacionan con ser epitopos inmunogenes, son bien conocidos en la técnica, y se llevan a cabo sin experimentación indebida. Además, los procesos para identificar péptidos que son epitopos inmunogenes, son bien conocidos en la técnica, y se llevan a cabo sin experimentación indebida ya sea in vitro o in vivo.
También se conocen en la técnica los principios para crear análogos de dichos epitopos con el fin de modular la inmunogenicidad. Por ejemplo, se comienza con un epitopo que posee un motivo CTL o HTL (véase, p. ej., los motivos/supermotivos HLA clase I y HLA clase II de la Tabla IV). El epitopo se convierte en análogo sustituyendo un aminoácido en una de las posiciones especificadas, y reemplazándolo con otro aminoácido especificado para esa posición.
Una variedad de referencias reflejan la técnica con respecto a la identificación y generación de epitopos en una proteína de interés así como análogos de los mismos. Véase, por ejemplo, WO 9733602 para Chesnut et al.; Sette, Immunogenetics 1999 50(3-4): 201-212; Sette et al., J. Immunol. 2001 166(2): 1389-1397; Sidney et al., Hum.. Immunol. 1997 58(1): 12-20; Kondo et al., Immunogenetics 1997 45(4): 249-258; Sidney et al., J. Immunol. 1996 157(8): 3480-90; y Falk et al., Nature 351: 290-6 (1991); Hunt et al., Science 255:1261-3 (1992); Parker et al., J. Immunol. 149:3580-7 (1992); Parker et al., J. Immunol. 152:163-75 (1994)); Kast et al., 1994 152(8): 3904-12; Borras-Cuesta et al., Hum. Immunol. 2000 61(3):266-278; Alexander et al., J. Immunol. 2000 164(3);164(3): 1625-1633; Alexander et al., PMID: 7895164, UI: 95202582; O'Sullivan et al., J. Immunol. 1991 147(8): 2663-2669; Alexander et al., Immunity 1994 1(9): 751-761 y Alexander et al., Immunol. Res. 1998 18(2): 79-92.
Los ejemplos relacionados incluyen polipéptidos que comprenden combinaciones de los diferentes motivos conforme a lo determinado por los procedimientos arriba referenciados, y/o uno o más de los epitopos CTL previstos conforme a lo determinado por los procedimientos arriba referenciados, y/o uno o más de los motivos de unión a células T conocidos en la técnica. Los ejemplos preferidos no contienen ninguna inserción, supresión o sustitución ya sea dentro de los motivos o las secuencias intervinientes de los polipéptidos. Además, pueden ser deseables ejemplos que incluyen una serie de residuos de aminoácidos ya sea N- terminales y/o C-terminales en cualquier lado de estos motivos (para, por ejemplo, incluir una mayor porción de la arquitectura polipeptídica en la que se ubica el motivo). Típicamente, el número de residuos de aminoácido N-terminales N y/o C-terminales en cualquier lado de un motivo está entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 residuos de aminoácidos, preferiblemente 5 a aproximadamente 50 residuos de aminoácidos.
Las proteínas relacionadas con 20P1F12/TMPRSS2 se ejemplifican en muchas formas, preferiblemente en forma aislada. Una molécula de proteína 20P1F12/TMPRSS2 purificada sustancialmente estará libre de otras proteínas o moléculas que perjudiquen la unión de 200P1F12/TMPRSS2 con un anticuerpo, célula T u otro ligando. La naturaleza y grado de aislamiento y purificación dependerá del uso previsto. Los ejemplos de proteínas relacionadas con 20P1F12/TMPRSS2 incluyen proteínas purificadas relacionadas con 20P1F12/TMPRSS2 y proteínas funcionales y solubles relacionadas con 20P1F12/TMPRSS2. En un ejemplo, una proteína 20P1F12/TMPRSS2 funcional y soluble o fragmento de la misma retiene la capacidad de unirse a un anticuerpo, célula T u otro ligando.
La descripción también proporciona proteínas 20P1F12/TMPRSS2 que comprenden fragmentos biológicamente activos de la secuencia de aminoácidos de 20P1F12/TMPRSS2. Dichas proteínas exhiben propiedades de la proteína 20P1F12/TMPRSS2, tales como la capacidad para provocar la generación de anticuerpos que específicamente se unen a un epitopo asociado a la proteína 20P1F12/TMPRSS2; para unirse con dichos anticuerpos; para provocar la activación de HTL o CTL; y/o para ser reconocida por HTL o CTL.
Los polipéptidos relacionados con 20P1F12/TMPRSS2 que contienen estructuras particularmente interesantes pueden predecirse y/o identificarse utilizando diversas técnicas analíticas bien conocidas en la técnica, incluyendo, por ejemplo, los métodos de análisis de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf, o sobre la base de la inmunogenicidad. Los fragmentos que contienen dichas estructuras son particularmente útiles en generar anticuerpos anti-20P1F12/TMPRSS2 específicos de la sub-unidad o células T, o en identificar factores celulares que se unen a 20P1F12/TMPRSS2.
Los epitopos CTL pueden determinarse utilizando algoritmos específicos para identificar péptidos dentro de una proteína 20P1F12/TMPRSS2 que son capaces de unirse de manera óptima a alelos HLA especificados (p. ej., utilizando el sitio SYFPEITHI en la Red Global Mundial URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/; Epimatrix^{TM} y Epimer^{TM}, Brown University, URL (www.brown.edu/Research/TB-HIV_ Lab/epimatrix/epimatrix.html); y BIMAS, URL bimas.dcrt.nih.gov/). A modo de ilustración, pueden predecirse los epitopos de péptidos de 20P1F12/TMPRSS2 que se presentan en el contexto de moléculas MHC humanas clase I HLA-A1, A2, A3, A11, A24, B7 y B35. Específicamente, la secuencia completa de aminoácidos de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 se ingresa en el algoritmo de Búsqueda de Motivos de Péptidos HLA que se encuentra en el sitio web de Bioinformatics and Molecular Analysis Section (BIMAS) detallado más arriba. El algoritmo de búsqueda de motivo a de Péptidos HLA fue desarrollado por el Dr. Ken Parker sobre la base de la unión de secuencias peptídicas específicas en el surco de las moléculas HLA Clase I, en particular HLA-A2, (véase, p. ej., Falk et al., Nature 351: 290-6 (1991); Hunt et al., Science 255:1261-3 (1992); Parker et al., J. Immunol. 149:3580-7 (1992); Parker et al:, J. Inmunol. 152:163-75 (1994)). Este algoritmo permite la ubicación y clasificación de péptidos octaméricos, nonaméricos y decaméricos a partir de una secuencia proteica completa para la unión prevista a HLA-A2 así como numerosas otras moléculas HLA Clase I. Muchos péptidos de unión a HLA clase I son octa-, nona-, deca- o undecámeros. Por ejemplo, para HLA-A2 clase I, los epitopos preferiblemente contienen una leucina (L) o metionina (M) en la posición 2 y una valina (V) o leucina (L) en el extremo C-terminal (véase, p. ej., Parker et al., J. Inmunol. 149:3580-7 (1992)). Los resultados de péptidos de unión predichos de 20P1F12/TMPRSS2 pueden clasificarse por puntaje de unión estimado. El puntaje de unión corresponde a la vida media estimada de disociación de complejos que contienen el péptido a 37ºC, a pH 6,5. Se prevé que los péptidos con puntaje de unión más alto son los que se unen más estrechamente a HLA Clase I en la superficie celular durante el mayor período de tiempo y de este modo representan los mejores blancos inmunogenes para el reconocimiento de células T.
La unión real de los péptidos a un alelo HLA puede evaluarse mediante estabilización de la expresión de HLA en la línea celular T2 defectuosa en el procesamiento de antígenos (véase, p. ej., Xue et al., Prostate 30:73-8 (1997) y Peshwa et al., Prostate 36:129-38 (1998)). La inmunogenicidad de péptidos específicos puede evaluarse in vitro por estimulación de linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL) en presencia de células presentadoras de antígenos tales como células dendríticas.
Se debe apreciar que epitopo predicho por el sitio BIMAS, sitios de Epimer^{TM} y Epimatrix^{TM}, o especificado por los motivos HLA clase I o clase II disponibles en la técnica o que se vuelvan parte de la técnica, tal como se determina utilizando el sitio de Red Global Mundial URL syfpeithi.brniheidelberg.com/, debe ser "aplicado" a la proteína 20P1F12/TMPRSS2. Según se utiliza en este contexto, "aplicado" significa que la proteína 20P1F12/TMPRSS2 se evalúa, p. ej., visualmente o por métodos de descubrimiento de patrones sobre basados en la computadora, tal como es apreciado por los expertos en la técnica relevante. Se contempla cada subsecuencia de 20P1F12/TMPRSS2 de 8, 9, 10 u 11 residuos de aminoácidos que posee un motivo HLA Clase I, o una subsecuencia de 9 o más residuos de aminoácidos que posee un motivo HLA Clase II.
El mecanismo mediante el cual las células T reconocen antígenos ha sido delineado. Composiciones eficaces de vacuna de epitopo de péptido de la invención inducen respuestas inmunes terapéuticas o profilácticas en segmentos muy amplios de la población global mundial. Para una comprensión del valor y eficacia de las composiciones de la invención que inducen respuestas inmunes celulares, se proporciona una breve revisión de tecnología relacionada con la inmunología.
Un complejo de una molécula HLA y un antígeno peptídico actúa como ligando reconocido por células T restringidas a HLA (Buns, S. et al., Cell 47:1071, 1986; Babbitt, B. P. et al., Nature 317:359, 1985; Townsend, A. y Bodmer, H., Annu. Rev. Immunol. 7:601, 1989; Germain, R. N., Annu. Rev. Immunol. 11:403, 1993). A través del estudio de análogos de antígenos sustituidos por un único aminoácido y la secuenciación de péptidos procesados naturalmente, unidos endógenamente, se han identificado los residuos críticos que corresponden a los motivos requeridos para la unión específica a las moléculas de antígenos HLA y se exponen en la Tabla IV (véase también, p. ej., Southwood, et al., J. Immunol. 160:3363, 1998; Rammensee, et al, Immumogenetics 41:178, 1995; Rammensee et al., SYFPEXTHI, acceso a través de la Red Global Mundial en URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/; Sette, A. y Sidney, J. Curr. Opus. immunol. 10:478, 1998; Engelhard, V. H., Curr. Opin. Immunol. 6:13. 1994; Sette, A. y Grey, H. M., Curr Opin. Immunol. 4:79, 1992; Sinigaglia, F. y Hammer, J. Curr. Biol. 6:52, 1994; Ruppert et al., Cell 74:929-937, 1993; Kondo et al., Immunol. 155:4307-4312, 1995; Sidney et al., J. Zemmol. 157:3480-3490, 1996; Sidney et al., Human Immunol. 45:79-93, 1996; Sette, A. y Sidney, J. Immunogenetics noviembre de 1999; 50(34):201-12, Review).
Además, los análisis cristalográficos de rayos x de los complejos HLA-péptido han revelado bolsillos dentro del hueco/hendidura de unión al péptido de las moléculas HLA que acomodan, de un modo específico del alelo, los residuos transportados por los ligandos del péptido; estos residuos a su vez determinan la capacidad de unión a HLA de los péptidos en los que están presentes. (Véase, p. ej., Madden, D.R. Anne. Rev. Immunol. 13:587. 1995; Smith, et al, Immunity 4:203, 1996; Fremont et al., Immunity 8:305, 1998; Stern et al., Structure 2:245, 1994; Jones, E.Y. Curr. Opin, Immunol. 9:75, 1997; Brown, J. H. et al., Nature 364:33, 1993; Guo, H. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8053, 1993; Guo, H. C. et al., Nature 360:364, 1992; Silver, M. L. et al., Nature 360:367.1992; Matsumura, M. et al., Science 257:927, 1992; Madden et al., Cell 70:1035, 1992; Fremont, D. H. et al., Science 257:919, 1992; Saper, M. A., Bjorkman, P. J. y Wiley, D. C., J. Mol. Biol. 219:277,1991.)
Por consiguiente, la definición de motivos de unión a HLA específicos del alelo clase I y clase II, o supermotivos clase I o clase II permite la identificación de regiones dentro de una proteína que se correlacionan con la unión a (un) antígeno(s) HLA particular(es).
De este modo, mediante un proceso de identificación de motivos HLA, se han identificado candidatos para vacunas basadas en epitopos; dichos candidatos además pueden evaluarse mediante ensayos de unión al péptido HLA para determinar la afinidad de unión y/o el período de tiempo de asociación del epitopo y su molécula HLA correspondiente. Puede realizarse trabajo adicional confirmatorio para seleccionar, entre estos candidatos a vacuna, epitopos con características preferidas en términos de cobertura de población y/o inmunogenicidad.
Se pueden utilizar diversas estrategias para evaluar la inmunogenicidad celular, incluyendo:
1) Evaluación de cultivos de células T primarias de individuos normales (véase, p. ej., Wentworth, P. A et al., Mol. Immunol. 32:603, 1995; Celis, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2105,1994; Tsai, V. et al., J. Immunol. 155:1796,1997; Kawashima, I. et al., Human Immunol. 59:1,1998). Este procedimiento implica la estimulación de linfocitos sanguíneos periféricos (PBL) de sujetos normales con un péptido de prueba en presencia de células presentadoras de antígenos in vitro por un período de varias semanas. Las células T específicas para el péptido se activan durante este período y se detectan utilizando, p. ej., ensayo de liberación de linfoquina o de ^{51}Cr que involucra a células blanco sensibilizadas con el péptido.
2) Inmunización de ratones transgénicos HLA (véase, p. ej., Wentworth, P. A. et al., J. Immunol. 26:97, 1996; Wentworth, P. A. et al., Int. Immunol. 8:651, 1996; Alexander, J. et al., J. Immunol. 159:4753, 1997). Por ejemplo, en dichos métodos se administran en forma subcutánea péptidos en adyuvante incompleto de Freund a ratones transgénicos HLA. Varias semanas después de la inmunización, se extraen esplenocitos y se cultivan in vitro en presencia del péptido de prueba durante aproximadamente una semana. Las células T específicas del péptido se detectan utilizando, p. ej., un ensayo de liberación de ^{51}Cr que involucra células blanco sensibilizadas con el péptido y células blanco que expresan el antígeno generado en forma endógena.
3) Demostración de las respuestas de células T de memoria de individuos inmunes que hayan sido efectivamente vacunados y/o de pacientes enfermos crónicos (véase, p. ej., Rehermann, B. et al., J. Exp. Med. 181:1047, 1995; Nolan, D. L. et al., Immunity 7:97,1997; Bertoni, R. et al., J. Clin. Invest 100:503, 1997; Threlkeld, S. C. et al., J. Immunol. 159:1648, 1997; Diepolder, H. M. et al., J. Virol.71:6011, 1997). Por consiguiente, las respuestas de memoria se detectan cultivando PBL de sujetos que se han expuesto al antígeno debido a enfermedad y de este modo han generado una respuesta inmune "naturalmente", o de pacientes que fueron vacunados contra el antígeno. Los PBL de sujetos se cultivan in vitro durante 1-2 semanas en presencia del péptido de prueba más células presentadoras del antígeno (APC) para permitir activación de las células T de "memoria", en comparación con las células T no tratadas previamente ("naive"). Al final del período de cultivo, la actividad de las células T se detecta utilizando ensayos que incluyen la liberación de ^{51}Cr que involucran los blancos sensibilizados por el péptido, proliferación de células T, o liberación de la linfoquina.
La invención además se refiera a vacunas para el cáncer que comprenden una proteína relacionada con 20P1F12/
TMPRSS2 o un ácido nucleico relacionado con 20P1F12/TMPRSS2. En vista de la expresión de 20P1F12/TMPRSS2, las vacunas para el cáncer previenen y/o tratan los cánceres que expresan 20P1F12/TMPRSS2 con efectos mínimos o nulos sobre los tejidos a los que no van dirigidas. El uso de un antígeno tumoral en una vacuna que genera respuestas inmunes humorales y/o mediadas por células como terapia anti-cáncer es bien conocido en la técnica y se ha empleado en cáncer de próstata utilizando inmunógenos de PSMA humano y PAP de roedor (Hodge et al., 1995, Int. J. Cancer 63:231-237; Fong et al., 1997, J. Immune). 159:3113-3117).
Tales métodos pueden llevarse fácilmente a la práctica empleando una proteína relacionada con 20P1F12/
TMPRSS2, o una molécula de ácido nucleico que codifica 20P1F12TTMPRSS2 y vectores recombinantes capaces de expresar y presentar el inmunógeno de 20P1F12/TMPRSS2 (que típicamente comprende una serie de anticuerpos o epitopos de células T). Los técnicos expertos comprenden que se conoce en la técnica una amplia variedad de sistemas de vacunas para la administración de epitopos inmunorreactivos (véase, p. ej., Heryln et al., Ann Med febrero de 1999 31(1):66-78; Maruyama et al., Cancer Immunol Immunother junio de 2000 49(3):123-32) En resumen, dichos métodos para generar una respuesta inmune (p. ej. humoral y/o mediada por células) en un mamífero, comprenden las etapas de: exponer al sistema inmune del mamífero a un epitopo inmunorreactivo (p. ej. un epitopo presente en la proteína 20P1F12/TMPRSS2 o análogo u homólogo de la misma) de modo que el mamífero genere una respuesta inmune que sea específica para ese epitopo (p. ej. genere anticuerpos que específicamente reconocen ese epitopo). En un método preferido, el inmunógeno de 20P1F12/TMPRSS2 contiene un motivo biológico, véase p. ej., Tablas V-XVIlI, o un péptido dentro de un intervalo de tamaño de 20P1F12/TMPRSS2 indicado en la Figura 14, Figura 15, Figura 16, Figura 17 y Figura 18.
La proteína 20P1F12/TMPRSS2 entera, regiones inmunogenes o epitopos de la misma pueden combinarse y administrarse por diversos medios. Dichas composiciones de vacuna pueden incluir, por ejemplo, lipopéptidos (p. ej., Vitiello, A. et al., J. CIin. Invest. 95:341, 1995), composiciones de péptido encapsuladas en microesferas de poli(DL-lactida-co-glicolida) ("PLG") (véase, p. ej., Eldridge, et al., Malec. Immunol. 28:287-294, 1991: Alamo et al., Vaccine 12:299-306, 1994; Jones et al., Vaccine 13:675-681, 1995), composiciones de péptido contenidas en complejos de estimulación inmune (ISCOMS) (véase, p. ej., Takahashi et al., Nature 344:873-875, 1990; Hu et al., Clin Exp Immunol. 113:235-243, 1998), sistemas múltiples de péptido antigénico (MAPs) (véase p. ej., Tam, J. P., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5409-5413, 1988; Tam, J.P., J. Immunol Methods 196:17-32, 1996), péptidos formulados como péptidos multivalentes; péptidos para el uso en sistemas balísticos de administración, péptidos típicamente cristalizados, vectores de administración viral (Perkus, M. E. et al., En: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S. H. E., ed., p. 379, 1996; Chakrabarti, S. et al., Nature 320:535, 1986; Hu, S. L. et al., Nature 320:537, 1986; Kieny, M.-P. et al., AIDS Bits/Technology 4:790, 1986; Top, F. H. et al., J. Infect. Die. 124:148, 1971; Chanda, P. K.. et al., Virology 175:535, 1990), partículas de origen viral o sintético (p. ej., Kofler, N. et al., J. Immunol. Methods. 192:25, 1996; Eldridge, J. H. et al., Sent. Hematol. 30:16, 1993; Falo, L. D., Jr. et al., Nature Med 7:649, 1995), adyuvantes (Warren, H. S., Vogel, F. R., y Chedid, L. A. Anna. Rev. Immunol.. 4:369, 1986; Gupta, R. K. et al., Vaccine 11:293, 1993), liposomas (Reddy, R. et al., J. Immunol. 148:1585, 1992; Rock, K. L., Immunol. Today 17:131, 1996), o ADNc desnudo o absorbido en partículas (Ulmer, J. B. et al., Science 259:1745, 1993; Robinson, H. L., Hunt, L. A., y Webster, R. G., Vaccine 11:957, 1993; Shiver, J. W. et al., In: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S. H. E., ed., p. 423, 1996; Cease, K. B., y Berzofsky, J. A., Anne. Rev. Immunol. 12:923, 1994 y Eldridge, J. H. et al., San. Immunol 30:16, 1993). También pueden utilizarse tecnologías de administración dirigidas a toxinas, también conocidas como localización mediada por receptores, tales como las de Avant Immunotherapeutics, Inc. (Needham, Massachusetts).
En pacientes con cáncer asociado a 20P1F12/TMPRSS2, las composiciones de vacunas de la descripción también pueden utilizarse en conjunción con otros tratamientos utilizados para el cáncer, p. ej. cirugía, quimioterapia, terapias de fármacos, terapias radiantes, etc., incluyendo su uso en combinación con adyuvantes inmunes tales como IL-2, IL-12, GM-CSF y similares.
Vacunas celulares: los epitopos CTL pueden determinarse utilizando algoritmos específicos para identificar péptidos dentro de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se unen a los alelos HLA correspondientes (véase, p. ej., Tabla IV; Epimer^{TM} y Epimatrix^{TM}, Brown University (UAL www.brown.edulResearch/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html); y BIMAS, (URL bimas.dcrt.nih.gov/; SYFPEITHI en URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/). En un ejemplo preferido el inmunógeno de 20P1F12/TMPRSS2 contiene una o más secuencias de aminoácidos identificadas utilizando técnicas bien conocidas en la técnica, por ejemplo un péptido de 8, 9, 10 o 11 aminoácidos especificados por un motivo/supermotivo HLA Clase I (p. ej., Tabla IV (A), Tabla IV (D) o Tabla IV (E)) y/o un péptido de al menos 9 aminoácidos que comprende un motivo/supermotivo HLA Clase II (p. ej., Tabla IV (B) o Tabla IV (C)). Tal como se aprecia en la técnica, el surco de unión HLA Clase I está esencialmente cerrado en el extremo de manera que los péptidos sólo de un intervalo de tamaño particular pueden encajar en el hueco y unirse, en general los epitopos HLA Clase I son de 8, 9, 10 u 11 aminoácidos de largo. En oposición, el surco de unión HLA Clase II está esencialmente abierto en el extremo; por ello un péptido de alrededor de 9 o más aminoácidos puede unirse mediante una molécula HLA Clase II. Debido a las diferencias entre el surco de unión HLA Clase I y II, los motivos HLA Clase I son específicos en longitud, es decir, la posición dos de un motivo Clase I es el segundo aminoácido en una dirección amino a carboxilo del péptido. Las posiciones de aminoácidos en un motivo Clase II son relativas solamente entre sí, no respecto del péptido global, es decir, aminoácidos adicionales pueden adherirse a los extremos amino y/o carboxilo terminales de una secuencia portadora de un motivo. Los epitopos HLA Clase II a menudo tienen 9, 10, 11,12, 15, 16. 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos de largo, o más de 25 aminoácidos.
Vacunas basadas en Anticuerpos: Se conoce en la técnica una amplia variedad de métodos para generar una respuesta inmune en un mamífero (por ejemplo como la primer etapa en la generación de hibridomas). Los métodos para generar una respuesta inmune en un mamífero comprenden exponer el sistema inmune del mamífero a un epitopo inmunogén en una proteína (p. ej., la proteína 20P1F12/TMPRSS2) de manera que se genere una respuesta inmune. Un ejemplo típico consiste en un método para generar una respuesta inmune con respecto a 20P1F12/TMPRSS2 en un hospedante, poniendo en contacto el hospedante con una cantidad suficiente de al menos una célula B de 20P1F12/TMPRSS2 o epitopo de células T citotóxicas o análogo del mismo; y al menos un intervalo periódico a partir de entonces ponga en contacto nuevamente el hospedante con la célula B de 20P1F12/TMPRSS2 o el epitopo de células T citotóxicas o análogo del mismo. Un ejemplo específico consiste en un método para generar una respuesta inmune contra una proteína relacionada con 20P1F12/TMPRSS2 o un péptido multiepitópico hecho por el hombre que comprende: administrar el inmunógeno de 20P1F12/TMPRSS2 (p. ej. la proteína 20P1F12/TMPRSS2 o un fragmento peptídico del mismo, una proteína de fusión 20P1F12/TMPRSS2 o análogo etc.) en una preparación de vacuna para un humano u otro mamífero. Típicamente, dichas preparaciones de vacuna además contienen un adyuvante apropiado (véase, p. ej., Patente Estadounidense No. 6.146.635) o un epitopo auxiliar universal tal como un péptido PADRE^{TM} (Epimmune Inc., San Diego, CA; véase, p. ej., Alexander et al., J. Immunol. 2000 164(3); 164(3): 1625-1633; Alexander et al., Immunity 1994 1(9): 751-761 y Alexander et al., Inmunol. Res. 1998 18(2):79-92). Un método alternativo comprende generar una respuesta inmune en un individuo contra un inmunógeno de 20P1F12/TMPRSS2: administrar in vivo al músculo o piel del cuerpo de un individuo una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un inmunógeno de 20P1F12/TMPRSS2, la secuencia de ADN operativamente acoplada a secuencias reguladoras que controlan la expresión de la secuencia de ADN; en donde la molécula de ADN es captada por las células, la secuencia de ADN se expresa en las células y se genera una respuesta inmune contra el inmunógeno (véase, p. ej., la Patente Estadounidense No. 5.962.428). Opcionalmente también se administra un facilitador genético de vacuna tal como lípidos aniónicos, saponinas, lectinas, compuestos estrogénicos, alquilos inferiores hidroxilados, sufóxido de dimetilo y urea.
Vacunas de ácido nucleico: las composiciones de vacunas incluyen modalidades mediadas por ácido nucleico. Pueden administrarse ADN o ARN que codifican las(s) proteína(s) relacionada(s) con la invención a un paciente. Pueden emplearse métodos de inmunización genética para generar respuestas inmunes celulares y humorales profilácticas o terapéuticas dirigidas contra células cancerosas que expresan 20P1F12/TMPRSS2. Pueden inyectarse construcciones que comprenden ADN que codifica una proteína/inmunógeno relacionado con 20P1F12/TMPRSS2 y secuencias reguladoras apropiadas directamente en el músculo o piel de un individuo, de manera tal que las células del músculo o piel capten la construcción y expresen la proteína/inmunógeno de 20P1F12/TMPRSS2 codificado. Alternativamente, una vacuna comprende una proteína relacionada con 201F12/TMPRSS2. La expresión de la proteína inmunógeno relacionada con 20P1F12/TMPRSS2 resulta en la generación de inmunidad celular y humoral profiláctica o terapéutica contra las células portadoras de la proteína 20P1F12/TMPRSS2. Pueden utilizarse diversas técnicas de inmunización genética profilácticas o terapéuticas conocidas en la técnica (a modo de revisión, véase la información y referencias publicadas en la dirección de Internet www.genweb.com). La administración basada en ácidos nucleicos se describe, por ejemplo, en Wolff et. al., Science 247:1465 (1990) así como las Patentes Estadounidenses Nos. 5.580.859, 5.589.466, 5.804.566, 5.739.118, 5.736.524, 5.679.647, WO 98/04720. Los ejemplos de tecnologías de administración basadas en ADN incluyen "ADN desnudo", administración facilitada (mediada por bupivicaína, polímeros, péptidos), complejos de lípidos catiónicos y administración mediada por partículas ("pistola de genes") o mediada por presión (véase, p. ej., Patente Estadounidense No. 5.922.687).
Con fines de inmunización terapéutica o profiláctica, las proteínas relacionadas con la invención pueden ser expresadas por vectores virales o bacterianos. Diversos sistemas de administración de genes virales que pueden utilizarse en la práctica de la invención incluyen, sin limitación, virus vacuna, virus de la viruela aviar, viruela de los canarios, adenovirus, virus de la gripe, poliovirus, virus adeno-asociados, lentivirus y virus sindbis (véase, p. ej., Restifo, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8:658-663; Tsang et al., I. Natl. Cancer Inst. 87982990 (1995)). También pueden emplearse sistemas de administración no virales introduciendo ADN desnudo que codifica una proteína relacionada con 20P1F12/TMPRSS2 en el paciente (p. ej., por vía intramuscular o intradérmica) para inducir una respuesta anti-tumoral.
El virus vacuna, se utiliza, por ejemplo, como vector para expresar secuencias nucleotídicas que codifican los péptidos relacionados con la invención. Tras la introducción en un hospedante, el virus vacuna recombinante expresa el péptido inmunogén de la proteína, y de ese modo provoca una respuesta inmune del huésped. Se describen vectores de vacuna y métodos útiles en los protocolos de inmunización en, p. ej., Patente Estadounidense No. 4.722.848. Otro vector es el BCG (Bacille Calmette Guerin). Los vectores BCG se describen en Stover et al., Nature 351:456-460 (1991). Una amplia variedad de otros vectores útiles para administración o inmunización terapéutica de los péptidos de la invención, p. ej. vectores de adenovirus y adeno-asociados, vectores retrovirales, vectores de Salmonella typhi, vectores de toxina de ántrax detoxificada y similares, serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción de la presente memoria.
De este modo, se utilizan sistemas de administración de genes para administrar una molécula de ácido nucleico relacionada con 20P1F12/TMPRSS2. En un ejemplo, se emplea el ADNc humano de longitud completa de 20P1F12/
TMPRSS2. En otro ejemplo, se emplean las moléculas de ácido nucleico de 20P1F12/TMPRSS2 que codifican linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos y/o epitopos de anticuerpos.
Vacunas Ex Vivo: También pueden emplearse diversas estrategias ex vivo para generar una respuesta inmune. Un abordaje incluye el uso de células presentadoras del antígeno (APC) tales como células dendríticas (DC) para presentar el antígeno de 20P1P12/TMPRSS2 al sistema inmune de un paciente. Las células dendríticas expresan moléculas MHC Clase I y II, co-estimulador B7 e IL-12, y de este modo son células presentadoras de antígenos altamente especializadas. En el cáncer de próstata, se están utilizando células dendríticas autólogas pulsadas con péptidos del antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) en un ensayo clínico de Fase I para estimular sistemas inmunes de pacientes con cáncer de próstata (Tjoa et al., 1996, Prostate 28:65-69; Murphy et al., 1996, Prostate 29:371-380). De este modo, las células dendríticas pueden utilizarse para presentar péptidos de 20P1F12/TMPRSS2 a células T en el contexto de moléculas MHC Clase I o II. En un ejemplo, las células dendríticas autólogas son pulsadas con péptidos de 20P1F12/TMPRSS2 capaces de unirse a moléculas MHC Clase I y/o Clase II. En otro ejemplo, las células dendríticas son pulsadas con la proteína completa 20P1F12/TMPRSS2. Inclusive otro ejemplo incluye manipular genéticamente la sobreexpresión del gen 20P1F12/TMPRSS2 en células dendríticas utilizando diversos vectores de implementación conocidos en la técnica, tales como adenovirus (Arthur et al., 1997, Cancer Gene Ther. 4:17-25), retrovirus (Henderson et al., 1996, Cancer Res. 56:3763-3770), lentivirus, virus adeno-asociados, transfección de ADN (Ribas et al., 1997, Cancer Res. 57:2865-2869) o transfección de ARN obtenido de tumores (Ashley et al.,1997, J. Exp. Med. 186:11774182). Las células que expresan 20P1F12/TMPRSS2 también pueden manipularse genéticamente para expresar inmunomoduladores, tales como GM-CSF, y pueden utilizarse como agentes
inmunizantes.
Los perfiles de antigenicidad pueden determinarse utilizando el sitio web ProtScale (URL www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) en el servidor de biología molecular ExPasy, Hidrofilicidad, (Hopp T.P., Woods KR., 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 78:3824-3828), Hidropaticidad, (Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J. Mel. Biol. 157:105-132); Porcentaje de Residuos Accesibles (Janie J., 1979 Nature 277:491-492), Flexibilidad Media, (Bhaskaran R, y Ponnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255); Giro beta (Deleage, G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1:289-294); y opcionalmente otros métodos disponibles en la técnica, tales como en el sitio web ProtScale, pueden utilizarse para identificar regiones antigénicas de la proteína 20P1F12/TMPRSS2. Ejemplos no limitantes de los parámetros ProtScale para el análisis son: 1) Un tamaño de ventana de 9; 2) 100% del peso de los extremos de ventana en comparación con el centro de ventana; y 3) valores del perfil del aminoácido normalizados para estar entre 0 y 1.
Las regiones determinadas por estos métodos tienen mayor probabilidad de estar expuestas a la proteína y, de este modo, accesibles al reconocimiento inmune, tal como por anticuerpos. Las secuencias antigénicas de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 así indicadas se utilizan para preparar inmunógenos, ya sea péptidos o ácidos nucleicos que los codifican, para generar anticuerpos anti-20P1F12/TMPRSS2 terapéuticos y diagnósticos. El inmunógeno puede ser cualquiera de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 13, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más de 50 aminoácidos contiguos, o los ácidos nucleicos correspondientes que los codifican, de la proteína 20P1F12/TMPRSS2.
Modulación de la invasión por 20P1F12/TMPRSS2
Tal como se observó más arriba, PSA y 20P1F12/TMPRSS2 comparten una serie de características relacionadas, un descubrimiento que proporciona evidencia de que estas dos moléculas pueden tener papeles fisiológicos similares in vivo. En este contexto, las observaciones en la biología de PSA pueden proporcionar una perspectiva en la biología de 20P1F12/TMPRSS2. Resulta interesante que mientras que la medición de niveles séricos de PSA se utiliza ampliamente como herramienta de diagnóstico para el cáncer de próstata, con la excepción de los datos que indican un papel potencial como proteasa IGFBP-3 (Cohen et al., J. Endocrinol. 142: 407-415 (1994)), sorprendentemente se conoce poco acerca del papel de PSA en el cáncer.
Recientemente, un estudio que evalúa sistemáticamente los efectos de PSA sobre la proliferación, migración e invasión de células endoteliales, descubrió que PSA posee propiedades anti-invasivas/anti-angiogénicas in vivo (Fortier et al., J. Nat. Cancer Inst. 91(19): 16354640(1999)). Estos descubrimientos son consistentes con estudios anteriores que mostraron que los fármacos anti-angiogénicos talidomida y TNP470 inducen incrementos estadísticamente significativos en la producción de PSA por líneas celulares de próstata in vitro (Horti et al., Br. J. Cancer 79: 1588-1593 (1999) y que los pacientes con tumores de mama y altos niveles de PSA tenían un mejor pronóstico que aquellos pacientes cuyos tumores tenían niveles más bajos de PSA (Yu et al., Clin. Cancer Research, 4: 1489-1497 (1998)). Los efectos anti-tumorales de PSA descritos en Fortier et al. pueden provenir de sus acciones como serina-proteasa, ya que ACT bloqueó tanto su actividad enzimática como su actividad anti-angiogénica in vitro. Por otra parte, estos descubrimientos están respaldados por observaciones de que PSA es capaz de convertir Lys-plasminógeno en angiostatina biológicamente activa como fragmentos, y que estos fragmentos inhibieron la proliferación y formación tubular de células endoteliales de vena umbilical humana con la misma eficacia que la angiostatina (Heidtmann et al., Br. J. Cáncer 81(8): 1269-1273 (1999)). En términos globales, estos datos proporcionan evidencia de que las elevaciones de PSA en una variedad de tumores malignos son parte de un proceso normal homeostático para combatir el avance del cáncer y que la administración de PSA como fármaco para aumentar las concentraciones endógenas podría proporcionar un abordaje terapéutico racional en el tratamiento del cáncer. Además, los datos de 20P1F12/TMPRSS2 que se muestran en la Figura 35 y Figura 36 y presentados en los Ejemplos más abajo así como estos estudios sobre PSA demuestran que 20P1F12/TMPRSS2 también exhibe dicha actividad anti-invasiva. La Figura 35 muestra la inhibición de formación de tubos por parte de TMPRSS2. Se sembraron en placa células HUVEC en matrigel y se incubaron en presencia de FBS al 10%, 1 \mug/ml de GST-20P1F12/TMPRSS2 purificada recombinante (aa255-492), 0,3 \mug/ml de PSA purificado o 1 \mug/ml de proteína GST purificada. El tratamiento con VEGF recombinante se utilizó como control para la formación de tubos. El tratamiento con GST-20P1F12/TMPRSS2 purificada inhibió la formación de tubos inducida por FBS. Se observó una similar inhibición con PSA, un conocido inhibidor de la angiogénesis (J. Natl. Cancer Inst, 1999, 91:1635). La Figura 36 ilustra la inhibición de la proliferación de HUVEC por TMPRSS2. Se sembraron células HUVEC en placas de 96 pocillos en presencia o ausencia de FBS al 10%, 10 \mug/ml de GST-20P1F12/TMPRSS2 recombinante (aa 255-492) o PSA purificado. Las células se hicieron crecer durante 72 horas y se analizaron para determinar la proliferación utilizando reducción de Alamar Blue como lectura. El experimento se realizó por triplicado. El tratamiento con GST-20P1F12/TMPRSS2 purificada inhibió la proliferación de HUVEC mediante dosis bajas y altas de FBS. Se observó inhibición similar con PSA.
En el cáncer, el crecimiento del tumor depende del crecimiento angiogénico de nuevos vasos sanguíneos. La angiogénesis es un proceso estrechamente regulado, modulado por la interacción dinámica entre estimuladores e inhibidores agiogénicos que controlan la proliferación, migración e invasión de células endoteliales. Este concepto se refuerza por el descubrimiento anterior de estimuladores endógenos de la angiogénesis, tales como factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) y factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y, más recientemente, mediante el descubrimiento de inhibidores endógenos de la angiogénesis, incluyendo las proteínas Angostatin® y Endostatin^{TM} (O'Reilly et al., Cell, 79: 315-328 (1994); O'Reilly et al., Cell, 88: 277-285 (1997); Sim, Angiogenesis, 2: 37-48 (1998)). Los resultados preliminares indican que pueden aparecer concentraciones incrementadas de la proteína anti-angiogénica Endostatin^{TM} en animales y pacientes con tumores en crecimiento, lo que puede indicar que la angiogénesis está teniendo lugar (Paciotti et al., Proe. Am. Assoc. Cancer Res. 40: 66 (1999)). Estos descubrimientos, así como las observaciones con PSA, apuraron los estudios descritos en el Ejemplo 13, que proporcionan evidencia de que concentraciones crecientes de 20P1F12/TMPRSS2 pueden no ser un presagio de malas noticias y avance de cáncer sino, más precisamente, pueden indicar que el organismo está intentando luchar contra el cáncer produciendo sus propias proteínas anti-angiogénicas.
Según se muestra en las Figuras 27-30, al igual que PSA, 20P1F12/TMPRSS2 es una proteasa que es capaz de modular el crecimiento y la invasión tumoral. Las Figuras 27A-27C muestran las diferencias en el potencial invasivo de células PC3 en comparación con células PC3 transfectadas de manera estable con 20P1F12/TMPRSS2. Los datos de las Figuras 27A-27C muestran que las células que expresan 20P1F12/TMPRSS2 han reducido sus capacidades invasivas y proporcionan evidencias de que la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 inhibe la invasión de tumores in vivo. Además, estas figuras proporcionan datos comparativos con el activador uroquinasa-plasminógeno (véase p. ej. Rabbani et al., In Vivo., enero - febrero de 1998; 12(1):135-42 Evans et al., Cancer Res. agosto de 1997 15;57(16):3594-9 y Wilson et al., Anat Rec. 1997 Sep;249(1):63-73). La Figura 28 muestra la actividad proteolítica de 20P1F12/TMPRSS2. Específicamente, la Figura 28 ilustra la capacidad de un fragmento de 20P1F12/TMPRSS2 (GST-20P1F12/TMPRSS2 (aa255-492)) para escindir la caseína. La Figura 29 muestra los efectos de un fragmento purificado de proteasa de 20P1F12/TMPRSS2 sobre la invasión de PC3. Los datos en la Figura 29 demuestran cómo el fragmento de proteasa de 20P1F12/TMPRSS2 reduce la invasión de células PC3 a través de la matriz de membrana basal Matrigel^{TM} y proporciona evidencia de que el dominio de proteasa de 20P1P12/TMPRSS2 puede inhibir la invasión de tumores in vivo. La Figura 30 muestra cómo los efectos de un fragmento purificado de proteasa de 20P1F12/TMPRSS2 sobre la invasión de PC3 son modulados por el MAb 1F9 anti-20P1F12/TMPRSS2. Los datos de la Figura 30 demuestran cómo un anticuerpo anti-20P1F12/TMPRSS2 puede suprimir la actividad inhibidora de invasión de 20P1F12/TMPRSS2 y proporciona evidencia confirmatoria de que esta molécula puede inhibir la invasión de tumores en un modelo in vitro conocido por correlacionarse con procesos in vivo.
Los datos provistos en las Figuras 27-30 muestran que 20P1F12/TMPRSS2 es una proteasa y que esta proteasa reduce la invasión de células PC3 a través de la matriz extracelular y que los anticuerpos contra el dominio de proteasa aumenten la invasión tumoral. De este modo, estos datos proporcionan evidencia de que 20P1F12/TMPRSS2 es una proteasa que está involucrada en la modulación del crecimiento de tumores primarios así como en la formación de metástasis. Sin atarnos a una teoría científica específica, los datos presentados en la presente memoria proporcionan evidencia de que 20P1F12/TMPRSS2 puede inducir la proteólisis de un factor involucrado en el crecimiento, invasión o angiogénesis tumoral o puede actuar directamente sobre el tumor o sobre su entorno (p. ej., células endoteliales).
Los datos presentados en la presente memoria proporcionan evidencia de que, como el PSA, 20P1F12/TMPRSS2 puede servir tanto como indicador de cánceres tales como el cáncer de próstata, así como modulador del crecimiento y la invasión tumoral. Más aún, como la invasión es una de las etapas iniciales en la formación de metástasis, estos datos además proporcionan evidencia de que 20P1F12/TMPRSS2 puede afectar la angiogénesis. En consecuencia, los métodos que utilizan 20P1F12/TMPRSS2 pueden utilizarse para inhibir el crecimiento y la invasión tumoral. En este contexto, el efecto psicológico de 20P1F12/TMPRSS2 puede depender de su estado, p. ej. si está libre o complejada con uno o más de sus parejas de unión, tales como los observados en los complejos inmunorreactivos que se muestran, por ejemplo, en la Figura 24.
Son bien conocidas en la técnica una variedad de metodologías para utilizar y evaluar la actividad de moléculas que modulan la actividad invasiva y/o angiogénica de células. Por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 6.060.449 describe un inhibidor de la angiogénesis inducida por el crecimiento de las células endoteliales vasculares que comprende el Inhibidor de la Vía del Factor Tisular (TFPI) como principio activo. La Patente Estadounidense No. 6.057.122 describe los fragmentos kringle 5 de mamíferos y se describen proteínas de fusión kringle 5 como compuestos para tratar enfermedades angiogénicas. La Patente Estadounidense No. 6.025.331 describe composiciones farmacéuticas que contienen cantidades terapéuticamente efectivas de troponina C, I, o T, sub-unidades, fragmentos, o análogos para el tratamiento de enfermedades o trastornos que involucran angiogénesis anormal. La Patente Estadounidense No. 6.024.688 describe métodos para utilizar fragmentos de un inhibidor de proliferación celular endotelial obtenido a partir de plasminógeno, específicamente un fragmento de angiostatina. Además, la Patente Estadounidense No. 5.981.484 describe varios péptidos que inhiben la angiogénesis y son útiles en el tratamiento de estados de enfermedad tales como cáncer, artritis, degeneración macular y retinopatía diabética en las que la angiogénesis desempeña un papel.
Los polipéptidos de 20P1F12/TMPRSS2 relacionados con la invención además pueden caracterizarse por producir un efecto inhibidor sobre la invasión, angiogénesis, sobren la metástasis tumoral o sobre reacciones inflamatorias. Los polipéptidos de 20P1F12/TMPRSS2 son especialmente útiles para inhibir la invasión en un hospedante mamífero, preferiblemente humano, que alberga un tumor. El término "invasión" se utiliza conforme a su significado aceptado en la técnica como el proceso fisiológico por el cual una célula tal como una célula tumoral se mueve a través de una matriz extracelular o membrana basal. Se observa la invasión en una variedad de contextos específicos tales como ensayos de invasión del diafragma in vivo utilizando ratones SCID así como ensayos in vitro utilizando membranas basales reconstituidas específicamente diseñadas para imitar la matriz extracelular que las células tumorales diseminan durante la metástasis (véase, p. ej., Stearns et al., Cancer Res. 1992, 52(13): 3776-3781 y Knox et al., Prostate 1998, 35(4): 248-254). Además, la invasión puede cuantificarse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica tales como los que utilizan el sistema Transwell Insert (Becton Dickinson) descrito en el Ejemplo 13.
Las composiciones y métodos de tratamiento anti-invasivos y/o anti-angiogénicos precedentes son útiles para inhibir la migración celular e invasión o la proliferación celular inducida por la migración en un sujeto que posee una enfermedad o afección asociada con una invasión celular no deseada, la proliferación inducida por la migración, angiogénesis o metástasis. Dichas enfermedades o afecciones pueden incluir tumores de crecimiento primario o sólidos o leucemia y linfomas, metástasis, invasión y/o crecimiento de metástasis tumoral, arteriosclerosis, angiogénesis del miocardio, restenosis vascular pos-angioplastía con balón, formación de neoíntima tras un trauma vascular, restenosis de injerto vascular, formación de colaterales coronarias, trombosis venosa profunda, angiogénesis de miembro isquémico, telangiectasia, granuloma piogénico, enfermedades de la córnea, rubeosis, glaucoma neovascular, retinopatía diabética y otras retinopatías, fibroplasia retrolental, neovascularización diabética, degeneración macular, endometriosis, artritis, fibrosis asociada con afecciones inflamatorias crónicas incluyendo psoriasis escleroderma, fibrosis de pulmón, fibrosis inducida por quimioterapia, curación de herida con cicatriz y fibrosis; úlceras pépticas, fracturas, queloides y trastornos de vasculogénesis, hematopoyesis, ovulación, menstruación, embarazo y placentación, o cualquier otra enfermedad o afección en la que la invasión o angiogénesis sea patogénica.
Por consiguiente, este aspecto específico de la descripción incluye métodos para inhibir la invasión celular, principalmente por células tumorales, o angiogénesis, fundamentalmente inducida por células tumorales, en un sujeto. Al inhibir la invasión por parte de células o angiogénesis, el método produce inhibición de la metástasis tumoral. En este método, se administra a un sujeto vertebrado, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un humano, una cantidad de una molécula 20P1F12/TMPRSS2 que comprende típicamente un polipéptido que posee la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO.: 2 o es un fragmento biológicamente activo de la misma. El polipéptido 20P1F12/TMPRSS2 preferiblemente se administra en forma de composición farmacéutica según se describe más arriba.
Las dosis de las moléculas 20P1F12/TMPRSS2 preferiblemente incluyen unidades de dosificación farmacéutica que comprenden una cantidad efectiva de un polipéptido 20P1F12/TMPRSS2. Por cantidad efectiva se entiende una cantidad suficiente para lograr una concentración de estado estacionario in vivo que produce una reducción mensurable en cualquier parámetro relevante de la enfermedad y puede incluir invasión y/o crecimiento de tumores primarios o metastásicos, cualquier índice aceptado de reactividad inflamatoria, o una prolongación mensurable de intervalo libre de enfermedad o de supervivencia. Por ejemplo, una reducción en el crecimiento tumoral en el 20% de los pacientes se considera eficaz (Frei III, E., Cancer Journal 3:127-136 (1997)). Sin embargo, un efecto de esta magnitud no se considera que sea un requerimiento mínimo para que la dosis sea efectiva de conformidad con esta invención. Los rangos de dosis efectivas y dosis óptimas pueden determinarse utilizando los métodos conocidos en la técnica incluyendo aquellos descritos en la presente memoria.
Alternativamente, la amplia variedad de tecnologías de transferencia génica y terapia génica conocidas en la técnica pueden utilizarse para administrar moléculas terapéuticas de polinucléotidos a células (p. ej., un polinucleótido 20P1F12/TMPRSS2 que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO.: 2 o fragmentos anti-proliferativos de la misma). Se conocen en la técnica una cantidad de abordajes de terapia génica y se describen, por ejemplo, en las Patentes Estadounidenses Nos.: 5.830.880, 6.071.890 y 5.792.453. Utilizando tales métodos bien conocidos, vectores recombinantes que codifican dichas moléculas de 20P1F12/TMPRSS2 pueden administrarse a células blanco (p. ej., células tumorales y endoteliales) que posteriormente expresarán 20P1F12/TMPRSS2 como un medio de modulación del crecimiento, invasión y/o metástasis celular.
Se proporcionan en la presente memoria una serie de métodos representativos de uso de 20P1F12/TMPRSS2 para modular el crecimiento, invasión y/o` metástasis celular. En estos métodos la molécula de 20P1F12/TMPRSS2 típicamente comprende un polipéptido que posee la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 o es un fragmento biológicamente activo del mismo. Los ejemplos típicos incluyen un método para inhibir la invasión celular en un mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad inhibidora de la invasión celular de una molécula de 20P1F12/TMPRSS2 que posee una actividad anti-invasiva in vivo. Otro ejemplo relacionado consiste en un método para inhibir la invasión celular y/o angiogénesis en un mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad inhibidora de la invasión de una molécula de 20P1F12/TMPRSS2 que posee actividad anti-invasiva, en donde dicho fragmento contiene sustituciones y/o supresiones y/o adiciones de aminoácidos de la secuencia expuesta en la SEC ID NO.: 2, pero retiene la actividad anti-invasiva (p. ej., un fragmento de GST que comprende los aminoácidos 255-492 de la secuencia expuesta en la SEC ID NO.: 2).
Un ejemplo típico relacionado con la invención consiste en un método para inhibir la invasión por una célula tumoral que comprende introducir en el entorno de la célula un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO.: 2 o fragmentos anti-invasivos del mismo, por lo cual se inhibe la invasión. Por introducción en el entorno de la célula se entiende que se coloca el polipéptido en el medio de la célula de manera que el mismo pueda efectuar un proceso fisiológico de esa célula ya sea directa o indirectamente. Son bien conocidos en la técnica una variedad de métodos para introducir agentes terapéuticos tales como polipéptidos en el entorno de una célula, incluyendo los métodos típicos la inyección intravenosa o sitio-específica
Típicamente el fragmento anti-invasivo del polipéptido 20P1F12/TMPRSS2 comprende el dominio de proteasa del fragmento de proteasa de 32 KD que se muestra, por ejemplo, en la Figura 23. Otro ejemplo ilustrativo de semejante fragmento es el polipéptido que comprende los aminoácidos 255-492 de la secuencia expuesta en la SEC ID NO.: 2 que se utiliza en los ensayos anti-invasivos descritos en el Ejemplo 13. En ejemplos preferidos de este método, el polipéptido se introduce en el entorno de la célula por vía parenteral. En ejemplos típicos, el polipéptido se introduce en el entorno de la célula por inyección intravenosa.
Un ejemplo específico descrito consiste en un método para inhibir la invasión de la membrana basal por parte de una célula tumoral que comprende introducir en el entorno de la célula un polipéptido de SEC ID NO.: 2, mediante el que se inhibe la invasión de la membrana basal. Preferiblemente las células tumorales en estos métodos exhiben expresión o secreción aumentada de 20P1F12/TMPRSS2. Un ejemplo específico relacionado consiste en un método para inhibir la invasión de células tumorales en donde dichas células tumorales exhiben una síntesis o secreción aumentada de 20P1F12/TMPRSS2, que comprende administrar un polipéptido de SEC ID NO.: 2, mediante el que se inhibe la invasión de células tumorales. En ejemplos preferidos de estos métodos, el polipéptido de SEC ID NO.: 2 consiste en el fragmento de 32 kD que contiene el dominio de proteasa de 20P1F12/TMPRSS2.
Los ejemplos relacionados consisten en métodos para inhibir la expansión de células tumorales en un mamífero que comprenden administrar al mamífero una cantidad suficiente de una molécula de 20P1F12/TMPRSS2 para inhibir la expansión de células tumorales, tales como la expansión de tumores de próstata, vejiga, ovario, pulmón, riñón o colon, o tumores metastásicos, en donde la molécula de 20P1F12/TMPRSS2 posee una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO.: 2 o fragmentos anti-proliferativos de la misma. En un ejemplo específico la molécula de 20P1F12/TMPRSS2 contiene el dominio de proteasa o un fragmento anti-proliferativo del mismo.
El técnico experto entiende que la modificación de polipéptidos puede facilitar su uso en diversos contextos. En consecuencia, además de las modificaciones con polipéptidos heterólogos (véanse, p. ej., los polipéptidos de fusión de inmunoglobulinas tratados más arriba), la presente descripción además proporciona variantes de 20P1F12/TMPRSS2 unidas en forma covalente (de aquí en adelante "conjugadas") a uno o más grupos químicos. Tales variantes pueden ser particularmente útiles para usos in vivo. Los grupos químicos apropiados para el uso en un conjugado de la variante 20P1F12/TMPRSS2 de la presente descripción son preferiblemente significativamente no tóxicos o inmunogenes, es decir, cualquier toxicidad o inmunogenicidad observada con un conjugado de variante de 20P1F12/TMPRSS2 no es significativamente (p. ej., menor que el 50%) mayor que cualquier toxicidad o inmunogenicidad observada con la correspondiente variante no modificada de 20P1F12/TMPRSS2. Típicamente, se selecciona un grupo químico que reduce la toxicidad y/o inmunogenicidad asociada a la variante no modificada de 20P1F12/TMPRSS2. Además, el grupo químico se selecciona convenientemente para producir un conjugado de variante de 20P1F12/TMPRSS2 que puede conservarse y utilizarse en condiciones apropiadas para la conservación y uso de la variante no modificada de 20P1F12/TMPRSS2. Los grupos químicos que sirven de ejemplo incluyen carbohidratos, tales como, por ejemplo, los carbohidratos que aparecen naturalmente en las glicoproteínas, y polímeros no proteicos, tales como polioles.
Un poliol, por ejemplo, puede conjugarse con una molécula variante de 20P1F12/TMPRSS2 en uno o más residuos de aminoácidos, incluyendo residuos de lisina, según se describe en WO 93/00109. El poliol empleado puede ser cualquier polímero de poli(óxido de alquileno) soluble en agua y puede tener una cadena lineal o ramificada. Los polioles apropiados incluyen los sustituidos en una o más posiciones de hidroxilos con un grupo químico, tal como un grupo alquilo que posee entre uno y cuatro carbonos, Típicamente, el poliol es un poli(alquilenglicol), tal como polietilenglicol) (PEG) y, de este modo, para facilitar la descripción, el resto de la descripción se refiere a una realización a modo de ejemplo en donde el poliol empleado es PEG y el proceso de conjugar el poliol con una variante de 20P1F12/TMPRSS2 se denomina "pegilación". Sin embargo, los expertos en la técnica reconocen que pueden emplearse otros polioles, tales como, por ejemplo, polipropilenglicol y copolímeros polietileno-polipropilenglicol, utilizando las técnicas para conjugación descritas en la presente memoria para PEG. El grado de pegilación de una variante de 20P1F12/TMPRSS2 de la presente invención puede ajustarse para proporcionar una semivida in vivo deseablemente aumentada (de aquí en adelante "semivida"), en comparación con la proteína no pegilada correspondiente.
Se ha descrito una variedad de métodos para pegilar proteínas. Véase, p. ej., la Patente Estadounidense No. 4.179.337 (concedida a Davis et al.), que describe la conjugación de una serie de hormonas y enzimas con PEG y polipropilenglicol para producir composiciones no inmunogenes fisiológicamente activas. En general, un PEG que posee al menos un grupo hidroxi terminal se hace reaccionar con un agente de acoplamiento para formar un PEG activado que posee un grupo reactivo terminal. Este grupo reactivo después puede hacerse reaccionar con \alpha- y \varepsilon-aminas de proteínas para formar un enlace covalente. De manera conveniente, el otro extremo de la molécula de PEG puede "bloquearse" con un grupo químico no reactivo, tal como un grupo metoxi, para reducir la formación de complejos de moléculas de proteínas entrecruzados con PEG.
Métodos diagnósticos ilustrativos de la invención
Tal como se observó más arriba, los ensayos que evalúan el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 (p. ej. el estatus del gen 20P1F12/TMPRSS2 y productos génicos tales como ARNm y proteínas) en un individuo pueden utilizarse para proporcionar información acerca del crecimiento o potencial oncogénico de células del individuo. En particular, el descubrimiento de que el ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 se expresa en forma tan elevada en líneas de cáncer de próstata y colon identifica este gen y sus productos como blancos que el técnico experto puede utilizar para evaluar muestras biológicas de individuos de los que se sospecha poseen una enfermedad asociada con alteraciones en el estatus de 20P1F12/TMPRSS2.
Debido a que 20P1F12/TMPRSS2 se expresa en diversos tejidos y líneas celulares de xenoinjertos de cáncer de próstata, y también se expresa en algunas líneas celulares de cáncer de colon, el estatus de expresión de 20P1F12/
TMPRSS2 puede proporcionar información útil para determinar información, incluyendo la presencia, estadio y ubicación de las células displásicas, precancerosas y cancerosas, previendo la susceptibilidad a diversos estadios de la enfermedad, y/o para medir la agresividad del tumor. Más aún, el perfil de expresión y la localización en la superficie celular de 20P1F12/TN PRSS2 la convierte en un potencial reactivo para obtención de imágenes para la enfermedad metastásica. En consecuencia, un importante aspecto de la invención está relacionado con los diferentes métodos pronósticos y diagnósticos moleculares para examinar el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 en muestras biológicas tales como las de individuos que sufren, o se sospecha que sufren, una patología caracterizada por el crecimiento celular desregulado, tal como el cáncer.
Se sabe que la oncogénesis es un proceso de crecimiento de múltiples etapas donde el crecimiento celular se vuelve progresivamente desregulado y las células avanzan desde un estado fisiológico normal a estados precancerosos y después cancerosos (véase, p. ej., Alers et al., Lab Invest 77(5): 437-438 (1997) e Isaacs et al., Cancer Surv. 23: 19-32 (1995)). En este contexto, examinar una muestra biológica en busca de evidencia de crecimiento celular desregulado (tal como expresión anómala de 20P1F12/TMPRSS2 en cánceres de próstata, vejiga, ovario, pulmón, riñón o colon, o cánceres metastásicos) puede permitir la detección temprana de dicha fisiología celular aberrante antes de que una patología tal como el cáncer haya avanzado a un estadío en el que las opciones terapéuticas son más limitadas. En dichos exámenes, el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica de interés (tal como una que se sospecha que posee crecimiento celular desregulado) puede compararse, por ejemplo, con el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra normal correspondiente (p. ej. una muestra de ese individuo (o alternativamente otro individuo) que no esté afectada por una patología, por ejemplo una que se sospeche que no posee crecimiento celular desregulado) con alteraciones en el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 en la muestra biológica de interés (en comparación con la muestra normal), proporcionando evidencia del crecimiento celular desregulado. Además de utilizar una muestra biológica que no esté afectada por una patología como muestra normal, también se puede utilizar un valor normativo predeterminado tal como un nivel normal predeterminado de la expresión del ARNm (véase, p. ej., Grever et al., J. Comp. Neurol. diciembre de 1996 9;376(2):306-14 y Patente Estadounidense No. 5.837.501) para comparar 20P1F12/TMPRSS2 en muestras normales versus sospechosas.
El término "estatus" en este contexto se utiliza conforme a su significado aceptado en la técnica y se refiere a la condición o estado de un gen y sus productos. Tal como se describe específicamente en la presente memoria, el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 puede evaluarse mediante una serie de parámetros conocidos en la técnica. Por ejemplo, según se muestra en la Figura 3 y se describe en el Ejemplo 1, el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica puede evaluarse examinando las secuencias de los polinucleótidos y/o polipéptidos de 20P1F12/TMPRSS2 en esa muestra biológica. Alternativamente, según se muestra en las Figuras 5-7 y se describe en los Ejemplos 3 y 4, el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica puede evaluarse examinando los niveles de los productos génicos de 20P1F12/TMPRSS2 (p. ej. ARNm y/o proteínas) en esa muestra biológica. Alternativamente, según se muestra en las Figuras 17 y la Tabla 1, el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica puede evaluarse observando la localización de 20P1F12/TMPRSS2 en muestras biológicas normales y comparándola con la localización de 20P1F12/TMPRSS2 en muestras biológicas sospechadas de contener evidencia de crecimiento celular desregulado. Alternativamente, según se muestra en las Figuras 18 y se describe en el Ejemplo 10, el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica puede evaluarse examinando la presencia o ausencia de una especie de 20P1F12/TMPRSS2 específica tal como el fragmento de proteasa de 32 kD que resulta de la ruptura autocatalítica post-traduccional. Alternativamente, según se muestra en las Figuras 20-23 y se describe en el Ejemplo 11, el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica puede evaluarse buscando la presencia o ausencia de un complejo inmunorreactivo específico de 20P1F12/TMPRSS2 en la muestra biológica.
Típicamente, los técnicos expertos utilizan una serie de parámetros para evaluar la condición o estado de un gen y sus productos. Estos incluyen, sin limitación, la integridad y/o patrón de metilación de un gen, incluyendo sus secuencias reguladoras, la localización de los productos génicos expresados (incluyendo la ubicación de las células que expresan 20P1F12/TMPRSS2), la presencia, nivel y actividad biológica de los productos génicos expresados (tales como polinucleótidos y polipéptidos del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2), la presencia o ausencia de modificaciones transcripcionales y traduccionales a los productos génicos expresados así como asociaciones de productos génicos expresados con otras moléculas biológicas tales como parejas de unión a proteínas (p. ej., un complejo proteína-proteína como se muestra, por ejemplo, en la Figura 21).
Las alteraciones en el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 pueden evaluarse mediante una amplia variedad de metodologías bien conocidas en la técnica, típicamente aquellas tratadas más abajo. Típicamente una alteración en el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 comprende un cambio en la localización de 20P1F12/TMPRSS2 y/o las células que expresan 20P1F12/TMPRSS2, un incremento en el ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 y/o la expresión de la proteína y/o la asociación o disociación de 20P1F12/TMPRSS2 con una pareja de unión. Como los datos presentados en la presente memoria proporcionan evidencia de que las proteínas 20P1F12/TMPRSS2 son secretadas en los sueros tras la alteración de la arquitectura glandular (véase, p. ej., la Figura 17 y la Tabla 1), una alteración representativa específica en el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 incluye un cambio en los niveles de las proteínas 20P1F12/TMPRSS2 secretadas en el suero.
Tal como se trata en detalle en la presente memoria, a fin de identificar una afección o fenómeno asociado al crecimiento celular desregulado, el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica puede evaluarse mediante una serie de métodos utilizados por los técnicos expertos incluyendo, pero sin limitación, análisis genómico Southern (para examinar, por ejemplo, perturbaciones en el gen 20P1F12/TMPRSS2), análisis Northern y/o PCR del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 (para examinar, por ejemplo, alteraciones en las secuencias de polinucleótidos o niveles de expresión de los ARNm de 20P1F12/TMPRSS2), y análisis Western y/o inmunohistoquímico (para examinar, por ejemplo, las alteraciones en las secuencias de polipéptidos, las alteraciones en la localización de polipéptidos dentro de una muestra, alteraciones en los niveles de expresión de las proteínas 20P1F12/TMPRSS2 y/o asociaciones de proteínas 20P1F12/TMPRSS2 con parejas de unión a polipéptidos). Los polinucleótidos detectables de 20P1F12/TMPRSS2 incluyen, por ejemplo, un gen 20P1F12/TMPRSS2 o fragmentos del mismo, ARNm de 20P1F12/TMPRSS2, ARNms de 20P1F12/TMPRSS2 de variantes alternativas de empalme, y moléculas de ADN o ARN recombinantes que contienen un polinucleótido de 20P1F12/TMPRSS2.
Tal como se trata en los Ejemplos 6, 8, 9 y 11 y se muestra, por ejemplo, en las Figuras 20, 22, 23, 24 y 26, se observa una serie de diferentes especies de 20P1F12/TMPRSS2 en diversas muestras biológicas. En este contexto, la presencia, ausencia y/o niveles de polipéptidos detectables de 20P1F12/TMPRSS2 puede examinarse para obtener información acerca del estatus de una muestra. Los polipéptidos detectables de 20P1F12/TMPRSS2 incluyen, por ejemplo, el polipéptido de dominio de proteasa de 32 kD, la proteína 20P1F12/TMPRSS2 de longitud completa de 70 kD así como las especies de 90 kD y 103 kD que posiblemente representan complejos de un polipéptido 20P1F12/TMPRSS2 y una segunda molécula biológica (tal como se observa, por ejemplo con PSA). Es más, los técnicos expertos son conscientes de que las observaciones de polipéptidos y/o complejo(s) de proteínas similares y su relación pueden entonces aplicarse en el diagnóstico de pacientes con, por ejemplo, cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón o colon (véase, p. ej., 5.672.480, 5.939.533, 5.840.501 tratadas más abajo). Esto es particularmente relevante en el contexto de 20P1F12/TMPRSS2 porque, según se muestra, por ejemplo, en la Figura 23, en lisado tisular entero de la próstata de un individuo masculino normal de 28 años víctima de un accidente (panel C), la relación entre las especies de 70 kD y 32 kD de 20P1F12/TMPRSS2 parece ser diferente de la observada en el lisado tisular entero de las próstatas de individuos que sufren de cáncer (panel B).
Se contempla una variedad de observaciones que examinan diversas especies de 20P1F12/TMPRSS2 y sus relaciones en el contexto de métodos diagnósticos. Se puede examinar, por ejemplo: la relación de la especie de 32 kD respecto de la especie de 70 kD, la especie de 90 kD y/o la especie de 103 kD; la relación de la especie de 70 kD respecto de la especie de 32 kD, la especie de 90 kD y/o la especie de 103 kD; la relación de la especie de 90 kD respecto de la especie de 32 kD, la especie de 70 kD y/o la especie de 103 kD; y la relación de la especie de 103 kD respecto de la especie de 32 kD, la especie de 70 kD y/o la especie de 90 kD, etc. Alternativamente, se puede examinar una relación de un subconjunto de especies de 20P1F12/TMPRSS2 y, además, la presencia de otra especie específica de 20P1F12/TMPRSS2. Se puede examinar, por ejemplo: la relación de la especie de 32 kD respecto de la especie de 70 kD y la presencia de la especie de 90 kD y/o la especie de 103 kD; la relación de la especie de 70 kD respecto de la especie de 90 kD y la presencia de la especie de 32 kD y/o la especie de 103 kD; la relación de la especie de 103 kD respecto de la especie de 32 kD y la presencia de la especie de 70 kD y/o la especie de 90 kD, etc. Alternativamente, se puede examinar una relación de un subconjunto de especies de 20P1F12/TMPRSS2 y, además, una relación de otro subconjunto de especies de 20P1F12/TMPRSS2. Se puede examinar, por ejemplo: la relación de la especie de 32 kD respecto de la especie de 70 kD y la relación de la especie de 32 kD respecto de la especie de 90 kD; la relación de la especie de 70 kD respecto de la especie de 103 kD y la relación de la especie de 90 kD respecto de la especie de 32 kD; la relación de la especie de 70 kD respecto de la especie de 90 kD y la relación de la especie de 103 kD respecto de la especie de 32 kD, etc.
Al examinar las diferentes especies de 20P1F12/TMPRSS2 y sus relaciones en el contexto de métodos diagnósticos, también se pueden tener en cuenta factores adicionales tales como su estatus normal en el tejido biológico específico que se está examinando (véase, p. ej., el tejido según se muestra en la Figura 17, líquido seminal según se muestra en la Figura 20 y suero según se muestra en la Figura 23). Por ejemplo, diversas parejas de unión que pueden complejarse con proteínas 20P1F12/TMPRSS2 pueden estar presentes en cantidades variables en diferentes linajes tisulares. En consecuencia, pueden analizarse los niveles relativos de las parejas de unión que pueden complejarse con las proteínas 20P1F12/TMPRSS2. Las calles 5-7 de la Figura 26 ilustran los diferentes niveles aparentes de tales parejas de unión en diferentes muestras proporcionando evidencia de que ciertas especies de 20P1F12/TMPRSS2 parecen darse predominantemente en muestras obtenidas de colon y no en próstata (véase, p. ej., la banda a aproximadamente 45-50 kD). Además, esta banda de 45-50 kD parece expresarse predominantemente en muestras de colon normal (véanse, p. ej., las calles 1 y 2), proporcionando respaldo adicional a las metodologías que utilizan la presencia, ausencia o niveles relativos de una o más especies de 20P1F12/TMPRSS2 y/o parejas de unión de 20P1F12/TMPRSS2 para proporcionar información diagnóstica acerca del estatus de una muestra.
Al examinar las diferentes especies de 20P1F12/TMPRSS2 y sus relaciones en el contexto de métodos diagnósticos, también pueden tenerse en cuenta factores tales como la localización de las especies de 20P1F12/TMPRSS2 ya sea dentro de una célula (véanse, p. ej., las especies de 20P1F12/TMPRSS2 asociadas a células que se muestran en la Figura 17) o fuera de una célula (véanse, p. ej., Las especies de 20P1F12/TMPRSS2 secretadas que se muestran en las Figuras 22 y 23). Tales observaciones son bien conocidas en la técnica y pueden tomarse por ejemplo utilizando anticuerpos específicamente dirigidos a un dominio dentro de una especie secretada (es decir, el dominio de proteasa) o anticuerpos específicamente dirigidos a un dominio asociado a la superficie celular.
Tal como se trata en detalle más abajo, 20P1F12/TMPRSS2 puede analizarse mediante cualquier técnica dentro de la amplia variedad de técnicas empleadas para tales fines, incluyendo: (i) análisis inmunohistoquímico, (ii) hibridización in situ, (iii) análisis RT-PCR, (iv) análisis de transferencia Western de muestras clínicas y líneas celulares, (v) análisis de matrices tisulares y (vi) obtención de imágenes in vivo. Los protocolos típicos ilustrativos para evaluar el estatus de un gen y sus productos puede encontrarse, por ejemplo, en Current Protocols In Molecular Biology, Unidades 2 [Northern Blotting], 4 [Southern Blotting], 15 [Immunoblotting] y 18 [PCR Analysis], Frederick M. Ausubul et al. eds., 1995. Diversos ensayos inmunológicos específicos útiles para la detección de proteínas 20P1F12/TMPRSS2 incluyen, sin limitación, varios tipos de radioinmunoensayos, ensayos de inmunosorción ligados a enzimas (ELISA), ensayos inmunofluorescentes acoplados a enzimas (ELIFA), métodos inmunocitoquímicos y similares. Como ejemplo, los anticuerpos contra 20P1F12/TMPRSS2 pueden marcarse y utilizarse como reactivos inmunológicos para obtención de imágenes capaces de detectar células de cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón, riñón o colon, o células de cáncer metastásico (p. ej., en métodos radiocentellográficos de obtención de imágenes). Para la obtención de imágenes radiocentellográficas in vivo, se prefieren los anticuerpos radiomarcados de 20P1F12/TMPRSS2 específicamente reactivos con epitopos secretados de 20P1F12/TMPRSS2.
Los ensayos para identificar trastornos asociados a la desregulación del crecimiento celular, tal como sucede en los cánceres de próstata, vejiga, ovario, pulmón, riñón o colon, o cánceres metastásicos, pueden comprender detectar los niveles de polipéptidos o polinucleótidos de 20P1F12/TMPRSS2 en cualquier muestra dentro de una amplia variedad de muestras biológicas utilizadas para evaluar estados patológicos, tales como orina, materia fecal o semen así como preparaciones celulares de tejidos que pueden estar afectados cuando el cáncer produce metástasis. Las muestras típicas incluyen sangre periférica y/o suero que pueden analizarse convenientemente para determinar la presencia de proteínas 20P1F12/TMPRSS2 o células cancerosas, incluyendo, sin limitación, cánceres de próstata, vejiga, ovario, pulmón, riñón o colon, o cánceres metastásicos. En este contexto, en la presente memoria se describen varias especies de 20P1F12/TMPRSS2 en una variedad de muestras biológicas que incluyen tejido (véase, p. ej., la Figura 17), suero (véase, p. ej., la Figura 23) y plasma seminal (véase, p. ej., la Figura 24).
La sangre periférica y suero pueden analizarse convenientemente para determinar la presencia de proteína
20P1F12/TMPRSS2 y/o de células de cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón, riñón o colon, o células de cáncer metastásico, utilizando, por ejemplo, análisis inmunológico o Northern o RT-PCR para detectar 20P1F12/TMPRSS2. Los ensayos de detección por RT-PCR para células tumorales en sangre periférica actualmente están siendo evaluados para el uso en el diagnóstico y manejo de una serie de tumores sólidos humanos. En el campo del cáncer de próstata, estos incluyen ensayos RT- PCR para la detección de células que expresan PSA y PSM (Verkaik et al., 1997, Urol. Res. 25: 373-384; Ghossein et al., 1995, J. Clin. Oncol. 13: 1195-2000; Heston et al., 1995, Clin. Chem. 41: 1687-1688). En otro abordaje, puede utilizarse un ensayo sensible descrito recientemente para detectar y caracterizar células de carcinomas en sangre (Racila et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 4589-4594). Este ensayo combina enriquecimiento inmunogenético con análisis inmunohistoquímico y citométrico de flujo de múltiples parámetros, y es sumamente sensible para la detección de células cancerosas en sangre, según se informa capaz de detectar una célula epitelial en 1 ml de sangre periférica.
20P1F12/TMPRSS2 comparte una serie de características con el antígeno específico de la próstata, incluyendo regulación de andrógenos, dominios funcionales similares, una presencia en suero, la capacidad para formar un complejo con una o más proteínas y niveles de expresión aumentados que están asociados al cáncer. En consecuencia, los diferentes ensayos conocidos en la técnica para evaluar PSA proporcionan ilustraciones de métodos típicos que también pueden utilizarse para evaluar 200P1F12/TIVPRSS2. Más abajo se proporciona una cantidad de ensayos representativos que incluyen el examen de PSA que contienen métodos que pueden adaptarse para el uso con 20P1F12/TMPRSS2. Tales ensayos también pueden utilizarse en combinación con ensayos para evaluar el estatus de 20P1F12/TMPRSS2.
La Patente Estadounidense No. 5.840.501 proporciona métodos típicos para examinar inmunológicamente PSA determinable en una muestra de sangre. En esta variación de dichos ensayos bien conocidos, el PSA se examina mediante un ensayo inmunométrico de dos sitios en el que la muestra de sangre se trata par liberar el PSA (PSAf) inmunológicamente no detectable. Se ha descubierto que la medición de los niveles sanguíneos de PSAc en este contexto proporciona un método para contribuir al diagnóstico y monitoreo del cáncer de próstata que es sumamente sensible y específico, y elimina la necesidad de que un número importante de pacientes se someta a una innecesaria biopsia de próstata. Un método de ensayo inmunométrico particularmente preferido descrito en la Patente Estadounidense No. 5.840.501 emplea tres anticuerpos anti-PSA: un anticuerpo que se une a ambos PSAc y PSAf (anti-tPSA), un segundo anticuerpo anti-PSAt que se caracteriza por su propiedad única de que la unión a PSAf se bloquea mediante la unión de anticuerpos específicos de PSAf, y un tercer anticuerpo que es un anticuerpo específico de PSAf. De este modo, la unión del anticuerpo específico de PSAf a PSA en la muestra sólo permite que se mida PSAc en el ensayo inmunométrico. Después de los métodos descritos en la Patente Estadounidense No. 5.840.501 el experto en la técnica podría emplear métodos análogos con, por ejemplo, tres anticuerpos anti-20P1F12/TMPRSS2: un anticuerpo que se une a ambas 20P1F12/TMPRSS2c y 20P1F12/TMPRSS2f (anti-20P1F12/TMPRSS2t), un segundo anticuerpo anti-20P1F12/TMPRSS2t que se caracteriza por su propiedad única de que la unión a 20P1F12/TMPRSS2f se bloquea mediante la unión a anticuerpos específicos de 20P1F12/TMPRSS2f, y un tercer anticuerpo que es un anticuerpo específico de 20P1F12/TMPRSS2f. De este modo, la unión del anticuerpo específico de 20P1F12/TMPRSS2f a 20P1F12/TMPRSS2 en la muestra permitiría que sólo 20P1F12/TMPRSS2c se mida en un ensayo inmunométrico.
La Patente Estadounidense No. 5.939.5331 proporciona inmunoensayos típicos adicionales para medir PSA libre así como un complejo inhibidor de proteinasa. En los métodos descritos en la Patente Estadounidense No. 5.939.533, el PSA libre y el complejo de PSA se miden mediante un inmunoensayo no competitivo que emplea al menos dos anticuerpos monoclonales diferentes. El método además se caracteriza porque el complejo PSA-inhibidor de la proteinasa de interés se forma ya sea con \alpha_{1-}antiquimotripsina, con el inhibidor de la \alpha_{1-}proteasa (API) o con \alpha_{2}-macroglobulina. Más aún, el método descrito en la Patente 5.939.533 se caracteriza por la observación de que el PSA libre, el complejo PSA-inhibidor de la proteinasa y su relación pueden aplicarse en el diagnóstico de pacientes con cáncer de próstata. Siguiendo los métodos descritos en la Patente Estadounidense No. 5.939.533, un experto en la técnica podría emplear métodos análogos para observar, por ejemplo, las especies de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestran en las Figuras 23, 24 y 26. En este contexto, pueden aplicarse entonces las observaciones de 20P1F12/TMPRSS2 libre y/o el/los complejo(s) 20P1F12/TMPRSS2-proteína y su relación en el diagnóstico de pacientes con, por ejemplo, cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón, riñón o colon, o cáncer metastásico.
La Patente Estadounidense No. 5.672.480 proporciona métodos de inmunoensayos típicos adicionales para el antígeno específico de la próstata (PSA). En los métodos descritos en 5.672.480 también se presenta un complejo que se asemeja a un complejo de PSA y \alpha_{1}-antiquimotripsina (ACT) que puede utilizarse como calibrador o control en un inmunoensayo para PSA. Además en la Patente 5.672.480 se presentan métodos para fraccionar anticuerpos policlonales contra PSA, en aquellos que se unen a epitopos que están enmascarados por la unión de PSA a ACT y aquellos que no se unen a dichos epitopos. Siguiendo los métodos descritos en los métodos expuestos en la patente 5.672.480 el experto en la técnica podría emplear métodos análogos para generar un complejo que se asemeje a un complejo de 20P1F12/TMPRSS2 y su pareja de unión que pueda utilizarse como calibrador o control en un inmunoensayo para 20P1F12/TMPRSS2. Además, el experto en la técnica podría emplear los métodos presentados en la patente 5.672.480 para fraccionar anticuerpos policlonales contra 20P1F12/TMPRSS2, en aquellos que se unen a epitopos que están enmascarados por la unión de 20P1F12/TMPRSS2 a su pareja de unión y aquellos que no se unen a dichos epitopos.
La Patente Estadounidense No. 5.614.372 describe otro ensayo de bioafinidad típico del antígeno específico de la próstata (PSA) que comprende o bien la medición de la concentración de PSA total (PSA-T), la concentración de la forma libre de PSA (PSA-F) o la concentración de PSA complejado con alfa-1-antiquimotripsina (PSA-.ACT), siendo PSA-T la suma de PSA-F y PSA-ACT. Conforme a la descripción de la Patente Estadounidense No. 5.614.372, se mide además la concentración de otra molécula, la calicreína glandular humana (hGK-1). Las concentraciones de PSA-T y hGK-1 pueden medirse en un único ensayo o en ensayos separados, utilizándose la suma de las concentraciones de PSA-T y hGK-1 para determinar la relación a) PSA F/(PSA-T+hGK-1:) y/o b) PSA-ACT/(PSA-T+hGK-1). En la descripción de la Patente Estadounidense No. 5.614.372 se demuestra que ambas relaciones poseen utilidad clínica para la discriminación del cáncer de próstata y la hiperplasia prostática benigna. Siguiendo los métodos descritos en la patente 5.614.372, el experto en la técnica podría emplear métodos análogos para analizar 20P1F12/TMPRSS2, que comprende la medición de ya sea la concentración de 20P1F12/TMPRSS2 total (20P1F12/TMPRSS2-T), la concentración de la forma libre de 20P1F12/TMPRSS2 (20P1F12/TMPRSS2-F) o la concentración de 20P1F12/TMPRSS2 complejada con su pareja de unión (20P1F12/TMPRSS2-BP), siendo 20P1F12/TMPRSS2-T la suma de 20P1F12/TMPRSS2-F y 20P1F12/TMPRSS2-BP. Además, la concentración de calicreína glandular humana (hGK-1) puede medirse y utilizarse para determinar la relación a) 20P1F12/TMPRSS2-F/(20P1F12/TMPRSS2-T+hGK-1) y/o b) 20PlF12/TMPRSS2-ACT/(20P1Fl2/TMPRSS2-T+hGK-1). Tal como en la descripción de la Patente Estadounidense No. 5.614.372, estas relaciones pueden emplearse para utilidad clínica.
La Patente Estadounidense No. 5.939.258 proporciona otros métodos típicos para diagnosticar micrometástasis de próstata mediante los que se aíslan ácidos nucleicos de una muestra tisular de un paciente, se amplifican los ácidos nucleicos de la muestra tisular específica para el cáncer de próstata, o se amplifica una señal generada por hibridización de una sonda específica de un ácido nucleico específico del cáncer de próstata; y la detección de ácidos nucleicos amplificados es indicativa de micrometástasis del cáncer de próstata. Según se ilustra en detalle más abajo, las sondas específicas para un ácido nucleico de 20P1F12/TMPRSS2 pueden amplificarse de manera similar; con la detección de ácidos nucleicos amplificados proporcionando evidencia de micrometástasis del cáncer de próstata o colon.
La Patente Estadounidense Núm. 5.972.615 proporciona otrastécnicas diagnósticas típicas para la detección de enfermedad prostáica humana. La invención se refiere particularmente a sondas y métodos para evaluar la presencia de especies de ARN que se expresan en forma diferencial en cáncer de próstata metastásico en comparación con próstata humana normal, hiperplasia prostática benigna, y cáncer de próstata no metastásico. La invención también se refiere a sondas y métodos para evaluar la presencia de especies de ARN que se expresan en forma diferencial en la sangre periférica de individuos con el estado de enfermedad en comparación con individuos saludables normales. Se describen métodos de uso terapéutico para los genes identificados como diferencialmente expresados en cáncer de próstata metastásico y medios para seleccionar productos farmacéuticos eficaces en el tratamiento del cáncer de próstata. De manera similar, la Patente Estadounidense Núm. 5.972.615 proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas de mamíferos que codifican antígeno de membrana específico de próstata (PSM) alternativamente empalmado , moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican secuencias promotoras del antígeno de membrana específico de próstata y métodos para detectar células tumorales micrometastásicas hematógenas de un individuo en el contexto de la determinación del avance del cáncer de próstata en un individuo. Según se ilustra en detalle más abajo, pueden utilizarse moléculas específicas para 20P1F12/TMPRSS2 para detectar células tumorales micrometastásicas hematógenas de un individuo en el contexto de la determinación del avance en un individuo del cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón y/o colon, y/u otros cánceres, incluyendo cánceres metastásicos.
Según se ilustra en los diferentes ejemplos típicos proporcionados más abajo, puede utilizarse una amplia variedad de métodos para determinar el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 en un individuo para proporcionar información pronóstica y/o diagnóstica. Tales métodos para determinar el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 pueden proporcionar información útil para predecir la susceptibilidad a una enfermedad particular, los estadíos y avance de la enfermedad y/o la agresividad tumoral. En este contexto se proporciona más abajo una variedad de aspectos ilustrativos relacionados con la invención como métodos y ensayos típicos para determinar el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 y evaluar síndromes que incluyen la desregulación del crecimiento celular.
Un ejemplo particularmente preferido relacionado con la invención consiste en un método para examinar o ensayar una muestra biológica de interés para hallar evidencia de crecimiento celular desregulado, que comprende comparar el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 en la muestra biológica de prueba con el estado de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra normal correspondiente, en donde las alteraciones en el estado de 20P1F12/TMPRSS2 en la muestra biológica están asociadas al crecimiento celular desregulado. Como la desregulación del crecimiento celular (es decir, la alteración de la proliferación celular normal que aparece en las células hiperplásicas, precancerosas y cancerosas, etc.) es un factor significativo en el proceso complejo de múltiples etapas de carcinogénesis y avance tumoral, los métodos para identificar una afección o fenómeno que es indicativo del crecimiento celular desregulado (es decir, una alteración en la biología normal de 20P1F12/TMPRSS2) son de particular interés para los médicos porque la detección temprana de patologías tales como cánceres tiene una profunda influencia sobre la morbilidad y la mortalidad.
Según se muestra, por ejemplo, en la Figura 5 y la Figura 7, se descubre que 20P1F12/TMPRSS2 está sobreexpresada en los tejidos o líneas celulares de cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón y cáncer ovárico, así como en un conjunto de tejidos de cáncer metastásico, mientras que está subexpresada en tejidos de cáncer de riñón (véase también la Figura 33, donde TMPRSS2 está subexpresada en tejidos tumorales en la mayoría de las muestras y sobreexpresada en una muestra). Más aún, tal como se trata en detalle más abajo, 20P1F12/TMPRSS2 exhibe una constelación de características que proporcionan fuerte evidencia de que está involucrada en procesos oncogénicos. En consecuencia, la identificación de alteraciones en el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra de prueba (p. ej. un incremento en la expresión del ARNm) en comparación con una muestra normal correspondiente de, por ejemplo, una localización proximal no afectada (p. ej. tejido de colon o próstata normal) o un individuo no afectado proporciona evidencia de crecimiento celular desregulado.
Según se describe en detalle más arriba, el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica puede examinarse mediante una serie de procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el estatus de 20P1F12/
TMPRSS2 en una muestra biológica puede examinarse comparando, por ejemplo, el nivel de expresión del polinucleótido o polipéptido de 20P1F12/TMPRSS2 que se sabe que aparece en muestras no cancerosas versus muestras precancerosas o cancerosas (con una sobreexpresión de polinucleótidos o polipéptidos de 20P1F12/TMPRSS2 proporcionando evidencia de crecimiento celular desregulado). En este contexto, la 20P1F12/TMPRSS2 que puede evaluarse incluye tanto la secuencia polinucleotídica 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la SEC ID NO.: 1 como la secuencia del polipéptido 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la SEC ID NO.: 2.
Una muestra biológica tomada de una localización específica en el organismo también puede examinarse evaluando la muestra para determinar la presencia o ausencia de células que expresan 20P1F12/TMPRSS2 (p. ej. las que expresan ARNm o proteínas 20P1F12/TMPRSS2). Este examen puede proporcionar evidencia del crecimiento celular desregulado, por ejemplo, cuando las células que expresan 20P1F12/TMPRSS2 se encuentran en una muestra biológica de una región del organismo que normalmente no contiene tales células (tal como un ganglio linfático, hueso o hígado, etc.). Tales alteraciones en el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica a menudo están asociadas al crecimiento celular desregulado. Específicamente, un indicador del crecimiento celular desregulado es la metástasis de células cancerosas desde un órgano de origen (tal como la glándula prostática o el colon) a un área diferente del organismo (tal como un ganglio linfático). Tal evidencia de crecimiento celular desregulado es importante en el contexto del cáncer de colon, por ejemplo, pues un entendimiento de la distribución de la metástasis nodal en los cánceres de colon hará posible reconocer la enfermedad nodal recurrente temprana (véase, p. ej., AJR Am J Roentgenol octubre de 1992;159(4):757-61). Tal evidencia de crecimiento celular desregulado es importante en el contexto del cáncer de próstata, por ejemplo, porque la metástasis oculta de los ganglios linfáticos puede detectarse en una proporción sustancial de pacientes con cáncer de próstata y semejantes metástasis están asociadas a predictores conocidos del avance de la enfermedad (véase, p. ej., J Urol agosto de 1995;154(2 Pt 1);474-8).
En un ejemplo específico relacionado con la invención, un método para detectar una alteración en el estatus del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica de interés (típicamente de un paciente que se sospecha que posee un síndrome patológico que exhibe una constelación de indicadores, uno de los cuales es elevada expresión de 20P1F12/TMPRSS2) comprende producir ADNc de la muestra mediante transcripción inversa utilizando al menos un cebador; amplificar el ADNc así producido utilizando polinucleótidos 20P1F12/TMPRSS2 como cebadores homosentido y antisentido para amplificar los ADNc de 20P1F12/TMPRSS2 en los mismos; y detectar la presencia del ADNc amplificado de 20P1F12/TMPRSS2. En un ejemplo típico, un método para detectar un gen 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica comprende primero asilar el ADN genómico de la muestra; amplificar el ADN genómico aislado utilizando polinucleótidos 20P1F12/TMPRSS2 como cebadores homosentido y antisentido para amplificar el gen 20P1F12/TMPRSS2 en los mismos; y detectar la presencia del gen 20P1F12/TMPRSS2 amplificado. Puede diseñase cualquier cantidad de combinaciones apropiadas de sondas homosentido y antisentido a partir de la secuencia nucleotídica provista para 20P1F12/TMPRSS2 (Figura 1; SEC ID NO.: 1) y utilizarse para este fin. En otro ejemplo, un método para detectar la presencia de una proteína 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica comprende primero poner en contacto la muestra con un anticuerpo de 20P1F12/TMPRSS2, un fragmento reactivo de 20P1F12/TMPRSS2 del mismo, o una proteína recombinante que contiene una región de unión al antígeno de un anticuerpo de 20P1F12/TMPRSS2; y detectar después la unión de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 de la muestra a los mismos.
También se proporcionan métodos para identificar una célula que expresa y/o exhibe una expresión aberrante de 20P1F12/TMPRSS2. En un ejemplo, un ensayo para identificar una célula que expresa un gen 20P1F12/TMPRSS2 comprende detectar la presencia del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 en la célula. Los métodos para la detección de ARNm particulares en células son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, ensayos de hibridización utilizando sondas de ADN complementario (tales como hibridización in situ utilizando ribosondas de 20P1F12/TMPRSS2 marcadas, transferencia Northern y técnicas relacionadas) y diversos ensayos de amplificación de ácidos nucleicos (tales como RT-PCR utilizando cebadores complementarios específicos para 20P1F12/TMPRSS2, y otros métodos de detección del tipo amplificación, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares). Alternativamente, un ensayo para identificar una célula que expresa un gen 20P1F12/TMPRSS2 comprende detectar la presencia de proteína 20P1F12/TMPRSS2 en la célula o secretada por la célula. Se conocen bien en la técnica diversos métodos para la detección de proteínas y pueden emplearse para la detección de proteínas de 20P1F12/TMPRSS2 y células que expresan 20P1F12/TMPRSS2.
Un ejemplo típico relacionado con la invención proporciona métodos para monitorear o evaluar productos génicos de 20P1F12/TMPRSS2 determinando el estatus de los productos génicos de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica de un individuo que se sospecha tiene una enfermedad asociada al crecimiento celular desregulado (tal como displasia, hiperplasia o cáncer) y después comparando el estatus así determinado con el estatus de los productos génicos de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica normal correspondiente, suministrando la presencia de productos génicos aberrantes de 20P1F12/TMPRSS2 en la muestra biológica de prueba en relación con la muestra biológica normal una indicación de la presencia de crecimiento celular desregulado dentro del individuo.
Un ejemplo típico relacionado con la invención proporciona ensayos útiles para determinar la presencia de cáncer en un individuo, que comprende detectar un aumento o reducción importante en la expresión del ARNm o proteína 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica en relación con los niveles de expresión de la muestra normal correspondiente. La presencia de ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 puede, por ejemplo, evaluarse en muestras biológicas incluyendo, sin limitación, sangre y suero así como muestras de tejido de próstata, colon, vejiga, riñón, ovario y pulmón, etc, y sitios metastásicos. Por otra parte, también pueden evaluarse muestras biológicas de tejidos y sitos asociados a la metástasis del cáncer. La presencia de niveles significativos de expresión de 20P1F12/TMPRSS2 y/o alteraciones en 20P1F12/TMPRSS2 en cualquiera de estos tejidos puede ser útil para indicar la emergencia, presencia; metástasis y/o gravedad de estos cánceres, debido a que los tejidos normales correspondientes no expresan el ARNm o proteína 20P1F12/TMPRSS2 o lo expresan a niveles más bajos.
Un ejemplo típico relacionado con la invención proporciona un ensayo útil para determinar la presencia de crecimiento celular desregulado (tal como ocurre en el cáncer) en un individuo, que comprende detectar un incremento significativo en la expresión del ARNm o proteína 20P1F12/TMPRSS2 en una célula de prueba o muestra tisular respecto de los niveles de expresión en la célula o tejido normal correspondiente. La presencia del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra de colon, por ejemplo, puede indicar la emergencia, presencia y/o gravedad del cáncer de colon. En un ejemplo relacionado, puede determinarse el estatus de los productos génicos de 20P1F12/TMPRSS2 a nivel de proteínas en lugar de a nivel de ácidos nucleicos. Por ejemplo, semejante método o ensayo comprendería determinar el nivel de proteína 20P1F12/TMPRSS2 expresada por las células en una muestra tisular de prueba y comparar el nivel así determinado respecto del nivel de 20P1F12/TMPRSS2 expresado en una muestra normal correspondiente. Puede evaluarse la presencia de la proteína 20P1F12/TMPRSS2, por ejemplo, utilizando métodos inmunohistoquímicos. Pueden utilizarse anticuerpos de 20P1F12/TMPRSS2 o parejas de unión capaces de detectar la expresión de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 en una variedad de formatos de ensayo bien conocidos en la técnica para este fin.
Tal como se observó más arriba, los métodos para detectar y cuantificar la expresión del ARNm o proteína 20P1P12/TMPRSS2 descritos en la presente memoria pueden utilizar cualquiera de una variedad de tecnologías estándar de cuantificación y detección de ácidos nucleicos y proteínas bien conocidas en la técnica. Los métodos estándar para la detección y cuantificación del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 incluyen hibridización in situ que utiliza ribosondas de 20P1F12/TMPRSS2 marcadas, transferencia Northern y técnicas relacionadas que utilizan sondas polinucleotídicas de 20P1F12/TMPRSS2, análisis RT-PCR que utiliza cebadores específicos para 20P1F12/TMPRSS2, y otros métodos de detección del tipo amplificación, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares. En un ejemplo específico puede utilizarse RT-PCR semi-cuantitativa para detectar y cuantificar la expresión del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 según se describe en los Ejemplos que siguen. Puede utilizarse cualquier cantidad de cebadores capaces de amplificar 20P1F12/TMPRSS2 para este fin, incluyendo, sin limitación, los diferentes conjuntos de cebadores específicamente descritos en la presente memoria. Pueden utilizarse métodos estándar para la detección y cuantificación de proteínas para este fin. En un ejemplo específico, pueden utilizarse anticuerpos monoclonales o policlonales específicamente reactivos con la proteína 20P1F12/TMPRSS2 en un ensayo inmunohistoquímico de tejido proveniente de biopsia.
En ejemplos relacionados de los métodos descritos más arriba, se puede evaluar la integridad de secuencias de nucleótidos y aminoácidos de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica con el fin de identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas tales como inserciones, supresiones, sustituciones y similares. Tales ejemplos son útiles porque las perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos se observan en un gran número de proteínas asociadas a un fenotipo desregulado de crecimiento (véase, p. ej., Marrogi et al., J. Cutan. Pathol. 26(8): 369-378 (1999)). En este contexto, se conocen bien en la técnica una amplia variedad de ensayos para observar perturbaciones en secuencias de nucleótidos y aminoácidos. Por ejemplo, puede observarse el tamaño y estructura de secuencias de ácido nucleicos o aminoácidos de productos génicos de 20P1F12/TMPRSS2 mediante protocolos de Northern, Southern, Western, PCR y secuenciación de ADN tratados en la presente memoria. Además, se conocen bien en la técnica otros métodos para observar las perturbaciones en secuencias de nucleótidos y aminoácidos tales como análisis de polimorfismo de conformación de cadena única (véanse, p. ej., las Patentes Estadounidenses Nos. 5.382.510 y 5.952.170).
En otro ejemplo, se puede examinar el estatus de metilación del gen 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica. La desmetilación y/o hipermetilación aberrantes de islas CpG en las regiones 5' reguladoras del gen frecuentemente sucede en células inmortalizadas y transformadas y puede dar lugar a expresión alterada de varios genes. Por ejemplo, la hipermetilación del promotor de la glutatión S-transferasa clase pi (una proteína expresada en próstata normal pero no expresada en >90% de los carcinomas de próstata) parece silenciar permanentemente la transcripción de este gen y es la alteración genómica más frecuentemente detectada en carcinomas de próstata (De Mario et al., Am. J. Pathol. 155(6): 1985-1992 (1999)). Además, esta alteración está presente en al menos 70% de los casos de neoplasia intraepitelial prostática (PIN) de alto grado (Brooks et al, Cáncer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998, 7:531-536). En otro ejemplo, la expresión del gen especifico de tumor LAGE-I (que no se expresa en próstata normal pero se expresa en el 25-50% de los cánceres de próstata) es inducida por la desoxi-azacitidina en células linfoblastoides, sugiriendo que la expresión tumoral se debe a la desmetilación (Lethe et al., Int. J. Cáncer 76(6): 903-908 (1998)). En este contexto, se conocen bien en la técnica una variedad de ensayos para examinar el estatus de metilación de un gen. Por ejemplo, se puede utilizar en abordajes de hibridización Southern enzimas de restricción sensibles a la metilación que no pueden escindir secuencias que contienen sitios CpG metilados con el fin de evaluar el estatus de metilación global de las islas CpG. Además, la MSP (PCR específica de la metilación) puede rápidamente determinar el perfil del estatus de metilación de todos los sitios CpG presentes en una isla CpG de un gen dado. Este procedimiento implica la modificación inicial del ADN mediante bisulfito de sodio (que convertirá todas las citosinas no metiladas en uracilos) seguido de amplificación utilizando cebadores específicos para el ADN no metilado versus metilado. También pueden encontrarse protocolos que implican interferencia de metilación, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, Unidades 12, Frederick M. Ausubul et al. eds., 1995.
Un examen de amplificación de genes proporciona un método adicional para evaluar el estatus de 20P1F12/
TMPRSS2. La amplificación de genes puede medirse en una muestra directamente, por ejemplo, mediante transferencia convencional Southern, transferencia Northern, para cuantificar la transcripción de ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), transferencia de puntos (análisis de ADN) o hibridización in situ, utilizando una sonda adecuadamente marcada, sobre la base de las secuencias provistas en la presente memoria. Alternativamente, pueden emplearse anticuerpos que pueden reconocer moléculas dobles específicas, incluyendo ADN dobles, ARN dobles e híbridos dobles de ADN-ARN o moléculas dobles ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez pueden marcarse y el ensayo puede realizarse donde la molécula doble se une a la superficie, de manera que tras la formación de la molécula doble en la superficie, se puede detectar la presencia de anticuerpo unido a la molécula doble.
Un aspecto relacionado de la descripción se dirige a predecir la susceptibilidad para desarrollar un síndrome asociado a la expresión desregulada de 20P1F12/TMPRSS2 (tal como cáncer) en un individuo. En un ejemplo, un método para predecir la susceptibilidad al cáncer comprende detectar el ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 o proteína 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica, indicando su presencia susceptibilidad al cáncer, en donde el grado de expresión del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 presente es proporcional al grado de susceptibilidad. En un ejemplo específico, se examina la presencia o cantidad de 20P1F12/TMPRSS2 en suero o tejido de próstata, vejiga, ovario, pulmón o colon, proporcionando la presencia de 20P1F12/TMPRSS2 en la muestra una indicación de susceptibilidad al cáncer (o la emergencia o existencia de un tumor). En otro ejemplo, se examina la presencia o cantidad de 20P1F12/TMPRSS2 en suero o lidney, suministrando una reducción en la cantidad en relación con un valor normal de 20P1F12/TMPRSS2 en la muestra una indicación de susceptibilidad al cáncer (o la emergencia o existencia de un tumor). En un ejemplo estrechamente relacionado, se puede evaluar la integridad de secuencias de nucleótidos y aminoácidos de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica con el fin de identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas, tales como inserciones, supresiones, sustituciones y similares, proporcionando la presencia de una o más perturbaciones en los productos génicos de 20P1F12/TMPRSS2 en la muestra una indicación de susceptibilidad al cáncer (o la emergencia, existencia o metástasis de un tumor).
Aun otro aspecto relacionado de la descripción está dirigido a métodos para medir la agresividad tumoral. En un ejemplo, un método para medir la agresividad de un tumor comprende determinar el nivel del ARNm de 20P1F12/
TMPRSS2 o proteína 20P1F12/TMPRSS2 expresada en suero, semen, orina, materia fecal, etc., o por células en una muestra del tumor, comparar el nivel así determinado respecto del nivel del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 o proteína 20P1F12/TMPRSS2 expresada en una muestra normal correspondiente tomada del mismo individuo o una muestra de referencia de tejido normal, en donde el grado de expresión del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 o proteína 20P1F12/TMPRSS2 en la muestra sospechosa en relación con la muestra normal indica el grado de agresividad. En un ejemplo específico, la agresividad de los tumores de próstata, vejiga, ovario, pulmón o colon, o tumores metastásicos, se evalúa determinando el grado en el que 20P1F12/TMPRSS2 se expresa en una muestra de un individuo, indicando los niveles de expresión más elevados tumores más agresivos. En un ejemplo estrechamente relacionado se puede evaluar la integridad de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica con el fin de identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas, tales como inserciones, supresiones, sustituciones y similares, indicando la presencia de una o más perturbaciones tumores más agresivos.
Aun otro aspecto relacionado de la descripción está dirigido a métodos para observar el avance de una enfermedad maligna en un individuo con el paso del tiempo. En un ejemplo, los métodos para observar el avance de la enfermedad maligna en un individuo con el paso del tiempo comprenden determinar el nivel del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 o proteína 20P1F12/TMPRSS2 expresada en una muestra biológica, comparar el nivel así determinado respecto del nivel del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 o proteína 20P1F12/TMPRSS2 expresada en una muestra biológica equivalente tomada del mismo individuo en un momento diferente, en donde el grado de expresión del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 o proteína 20P1F12/TMPRSS2 en la muestra con el paso del tiempo proporciona información acerca del avance del cáncer. En un ejemplo específico el avance del cáncer se evalúa determinando el grado en el que la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en las células tumorales se altera con el paso del tiempo, indicando los niveles de expresión más elevados un avance del cáncer. En un ejemplo alternativo, el avance del cáncer se evalúa determinando el grado en el que la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en suero se altera con el paso del tiempo, indicando concentraciones más elevadas un avance del cáncer. En un ejemplo estrechamente relacionado, se puede evaluar la integridad de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica con el fin de identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas tales como inserciones, supresiones, sustituciones y similares, indicando la presencia de una o más perturbaciones que avance del cáncer.
Los abordajes diagnósticos anteriores pueden combinarse con uno cualquiera de una amplia variedad de protocolos pronósticos y diagnósticos conocidos en la técnica. Por ejemplo, otro aspecto descrito en la presente memoria está dirigido a métodos para observar una coincidencia entre la expresión del gen 20P1F12/TMPRSS2 y productos génicos de 20P1F12/TMPRSS2 (o perturbaciones en el gen 20P1F12/TMPRSS2 y en los productos génicos de 20P1F12/TMPRSS2) y un factor que está asociado a malignidad como medio para diagnosticar y pronosticar el estado de una muestra tisular. En este contexto, puede utilizarse una amplia variedad de factores asociados a la malignidad, tales como la expresión de genes asociados de otra manera a la malignidad (incluyendo PSA, PSCA, PSM y expresión de calicreína glandular humana) así como observaciones citológicas groseras (véase, p. ej., Bocking et al., Anal Quant Cytol. 5(2):7488 (1984); Eptsein, Hum Patliol. 1995 Feb;26(2):223-9 (1995); Thorson et al., Mod Pathol. junio 1998;11(6):543-51; Baisclen et al., Am J Surg Pathol. 23(8)918-24 91999)). Los métodos para observar una coincidencia entre la expresión del gen 20P1F12/TMPRSS2 y productos génicos de 20P1F12/TMPRSS2 (o perturbaciones en el gen 20P1F12/TMPRSS2 y productos génicos de 20P1F12/TMPRSS2) y un factor adicional que está asociado a la malignidad, son útiles, por ejemplo, porque la presencia de un conjunto o constelación de factores específicos que coinciden proporciona información crucial para diagnosticar y pronosticar el estatus de una muestra tisular.
En un ejemplo típico, los métodos para observar una coincidencia entre la expresión del gen 20P1F12/TMPRSS2 y productos génicos de 20P1F12/TMPRSS2 (o perturbaciones en el gen 20P1F12/TMPRSS2 y productos génicos de 20P1F12/TMPRSS2) y un factor que está asociado a la malignidad permiten detectar la sobreexpresión del ARNm o proteína 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica, detectar la sobreexpresión del ARNm de PSA o proteína en una muestra biológica, y observar una coincidencia de la sobreexpresión del ARNm o proteína 20P1F12/TMPRSS2 y ARNm o proteína de PSA. En un ejemplo específico, se examina la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 y ARNm de PSA en suero o tejido de próstata, vejiga, ovario, pulmón, riñón o colon. En un ejemplo preferido la coincidencia de la sobreexpresión del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 y PSA en la muestra proporciona una indicación de cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón o colon, susceptibilidad al cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón o colon; o la emergencia, existencia o metástasis de dichos tumores, y lo contrario es válido para el cáncer de riñón.
En estos métodos, el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 puede examinarse en una amplia variedad de muestras biológicas, tales como orina, materia fecal, semen, así como preparaciones celulares de tejidos de próstata, vejiga, ovario, riñón, pulmón, colon y otros tejidos que pueden estar afectados, por ejemplo, cuando un cáncer produce metástasis. Además de estas muestras, puede analizarse convenientemente sangre periférica y/o suero para determinar la presencia de proteínas 20P1F12/TMPRSS2 o células cancerosas, incluyendo, sin límites, cánceres de próstata, vejiga, ovario, pulmón, riñón y colon, y cánceres metastásicos. El estatus de 20P1F12/TMPRSS2 en la muestra biológica se evalúa mediante cualquier método dentro de una gran variedad de métodos aceptados en la técnica tales como análisis Southern, análisis Northern, análisis de reacción en cadena de la polimerasa e inmunoensayo. Preferiblemente, la muestra biológica se evalúa examinando el nivel de la expresión del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 o la expresión de la proteína 20P1F12/TMPRSS2. En métodos especialmente preferidos, el crecimiento celular desregulado es indicativo de cáncer. En métodos alternativos preferidos, el crecimiento celular desregulado es indicativo de un cáncer de colon. Preferiblemente, el 20P1F12/TMPRSS2 evaluado en la muestra biológica es secretado a partir de células que exhiben crecimiento desregulado.
Un ejemplo alternativo de la descripción consiste en un método para identificar la evidencia de un neoplasma en un individuo examinando un nivel de expresión del gen 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica de prueba obtenida del individuo y comparando después el nivel de expresión del gen 20P1F12/TMPRSS2 en la muestra biológica de prueba (p. ej. una muestra sospechada de contener evidencia de un estado patológico) obtenida del individuo respecto del nivel de expresión del gen 20P1F12/TMPRSS2 encontrado en una muestra biológica normal comparable (p. ej. una muestra no sospechada de contener evidencia de un estado patológico) en donde las diferencias en el nivel de los productos génicos de 20P1F12/TMPRSS2 en la muestra biológica de prueba en relación con la muestra biológica normal están asociadas al neoplasma. Preferiblemente, la muestra biológica de prueba se evalúa examinando el nivel de expresión del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 o la expresión de la proteína 20P1F12/TMPRSS2. En los métodos especialmente preferidos, el neoplasma es un cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón, riñón o colon. En otro método preferido, el neoplasma es un cáncer metastásico.
Un ejemplo preferido típico de la descripción consiste en un método para detectar un cáncer en un individuo examinando la expresión del gen 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica de prueba obtenida del individuo y examinado después al individuo para determinar la presencia de un factor asociado al crecimiento celular desregulado, donde una coincidencia de la expresión del gen 20P1F12/TMPRSS2 en la muestra biológica de prueba obtenida del individuo y la presencia del factor asociado al crecimiento celular desregulado es indicativa del cáncer. En este contexto, puede utilizarse una amplia variedad de factores asociados al crecimiento celular desregulado como este otro factor tal como la expresión de genes asociados de otra manera al crecimiento celular desregulado (incluyendo expresión de mucina, laminina-5, PSA, PSCA y PSM) así como observaciones citológicas groseras (véase, p. ej., Pyke et al. Cancer Res. septiembre de 1995 15;55(18) 4132-9; Bocking et al., Anal Quant Cytol. 6(2):74-88 (1984); Eptsein, Hum Pathol. 1995 Feb;26(2):223-9 (1995); Thorson et al., Mod Pathol. Junio de 1998;11(6):543-51; Baisden et al., Am J Surg Pathol. 23(8):918-24 91999)). En métodos especialmente preferidos, el cáncer es un cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón, riñón o colon. En otro método preferido, el neoplasma es un cáncer metastásico. En los ejemplos específicos de este método, se utiliza análisis Southern, análisis Northern, análisis por reacción en cadena de la polimerasa o un inmunoensayo para examinar el nivel de expresión del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 o el nivel de expresión de la proteína 20P1F12/TMPRSS2. La 20P1F12/TMPRSS2 evaluada en la muestra biológica de prueba puede ser secretada a partir de células de cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón o colon, o células de cáncer metastásico.
Identificación de moléculas que interactúan con 20P1F12/TMPRSS2
Las secuencias de proteínas 20P1F12/TMPRSS2 descritas en la presente memoria permiten que el técnico experto identifique moléculas que interactúan con ellas a través de cualquier protocolo dentro de una variedad de protocolos aceptados en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar uno de la variedad de sistemas así llamados sistemas de trampas de interacción (también denominados "ensayo de doble híbrido"). En tales sistemas, las moléculas que interactúan reconstituyen un factor de transcripción y dirigen la expresión de un gen indicador, cuya expresión después se analiza. Los sistemas típicos identifican interacciones proteína-proteína in vivo a través de la reconstitución de un activador transcripcional eucariota y se describen, por ejemplo, en las Patentes Estadounidenses Nos. 5.955.280, 5.925.523, 5.846.722 y 6.004.746.
Tal como se trata en el Ejemplo 12, se pueden detectar moléculas que interactúan con las secuencias de proteínas 20P1F12/TMPRSS2 examinando un panel conocido de moléculas que posiblemente interactúan con 20P1F12/
TMPRSS2 (sobre la base de observaciones con moléculas similares tales como PSA) tales como suero y serpinas de semen. Alternativamente, se pueden identificar moléculas que interactúan con secuencias de proteínas 20P1F12/
TMPRSS2 rastreando bibliotecas de péptidos. En tales métodos, los péptidos que se unen a moléculas receptoras seleccionadas tales como 20P1F12/TMPRSS2 se identifican rastreando bibliotecas que codifican una colección aleatoria o controlada de aminoácidos. Los péptidos codificados por las bibliotecas se expresan como proteínas de fusión de proteínas de envoltura de bacteriófagos, y las partículas de bacteriófagos después se examinan contra los receptores de interés. Péptidos que poseen una amplia variedad de usos, tales como reactivos terapéuticos o diagnósticos, pueden así identificarse sin ninguna información previa acerca de la estructura del ligando esperado o la molécula receptora. Se describen bibliotecas de péptidos típicas y métodos de selección que pueden utilizarse para identificar moléculas que interactúan con secuencias de proteínas 20P1F12/TMPRSS2, por ejemplo, en las Patentes Estadounidenses Nos. 5.723.286 y 5.733.731.
Alternativamente, pueden utilizarse líneas celulares que expresan 20P1F12/TMPRSS2 para identificar interacciones proteína-proteína mediadas por 20P1F12/TMPRSS2. Esta posibilidad puede examinarse utilizando técnicas de inmunoprecipitación conocidas en la técnica incluyendo las descritas como generadoras de los datos que se muestran en la Figura 22 (véase también Hamilton, B.J., et al., 1999. Biochern. Biophys. Res. Commun. 261:646-51). Típicamente, la proteína 20P1F12/TMPRSS2 puede inmunoprecipitarse a partir de 20P1F12/TMPRSS2 que expresa líneas celulares canceríosas utilizando anticuerpos anti-20P1F12/TMPRSS2. Alternativamente, pueden utilizarse anticuerpos contra colas de histidina en la línea celular manipulada genéticamente para expresar 20P1F12/TMPRSS2 (los vectores se mencionan más arriba). El complejo inmunoprecipitado puede examinarse para determinar la asociación de proteínas mediante procedimientos tales como transferencia Western, marcado de proteínas con ^{35}S-metionina, microsecuenciación de proteínas, tinción con plata y electroforesis en gel bidimensional.
Los ejemplos relacionados de tales ensayos de selección incluyen métodos para identificar moléculas pequeñas que interactúan con 20P1F12/TMPRSS2. Los métodos típicos se tratan, por ejemplo, en la Patente Estadounidense No. 5.928.868 e incluyen métodos para formar ligandos híbridos en los que al menos un ligando es una molécula pequeña. En un ejemplo ilustrativo, el ligando híbrido se introduce en células que a su vez contienen un primer y un segundo vector de expresión. Cada vector de expresión incluye ADN para expresar una proteína híbrida que codifica una proteína blanco unida a una secuencia codificadora para un módulo transcripcional. Las células además contienen un gen indicador, la expresión del cual está condicionada por la proximidad entre la primera y segunda proteínas híbridas, un evento que sucede solamente si el ligando híbrido se une a sitios blanco en ambas proteínas híbridas. Se seleccionan aquellas células que expresan el gen indicador y se identifica la molécula pequeña desconocida o la proteína híbrida desconocida.
Un ejemplo típico consiste en un método para seleccionar una molécula que interactúa con una secuencia de aminoácidos de 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, que comprende las etapas de poner en contacto una población de moléculas con la secuencia de aminoácidos de 20P1F12/TMPRSS2, permitiendo que la población de moléculas y la secuencia de aminoácidos de 20P1F12/TMPRSS2 interactúen en condiciones que faciliten una interacción, determinando la presencia de una molécula que interactúa con la secuencia de aminoácidos de 20P1F12/TMPRSS2 y separando después las moléculas que no interactúan con la secuencia de aminoácidos de 20P1F12/TMPRSS2 de las moléculas que sí interactúan con la secuencia de aminoácidos de 20P1F12/TMPRSS2. En un ejemplo específico, el método además incluye purificar una molécula que interactúa con la secuencia de aminoácidos de 20P1F12/TMPRSS2. En un ejemplo preferido, la secuencia de aminoácidos de 20P1F12/TMPRSS2 se pone en contacto con una biblioteca de péptidos.
Kits
La descripción además proporciona kits para las aplicaciones diagnósticas y terapéuticas descritas o sugeridas más arriba. Tales kits pueden comprender un medio portador que está compartimentalizado para recibir en apretado confinamiento uno o más medios contenedores tales como ampollas, tubos y similares, comprendiendo cada uno de los medios contenedores uno de los elementos separados a ser utilizado en el método. Por ejemplo, uno de los medios contenedores puede comprender un vector que codifica una proteína 20P1F12/TMPRSS2. Alternativamente, uno de los medios contenedores puede comprender una sonda que está o puede estar marcada de manera detectable. Dicha sonda puede ser un anticuerpo (por ejemplo, para usar en un ensayo ELISA) o polinucleótido específico para la proteína o gen/ARNm de 20P1F12/TMPRSS2, respectivamente. Cuando el kit utiliza hibridización de ácidos nucleicos para detectar el ácido nucleico blanco, el kit también puede contener envases que contienen nucleótidos) para la amplificación de la secuencia de ácido nucleico blanco y/o un envase que comprende un medio indicador, tal como una proteína de unión a la biotina, tal como avidina o estreptoavidina, unida a una molécula indicadora, tal como un marcador enzimático, fluorescente o radioisotópico.
El kit típicamente comprenderá el envase descrito más arriba y uno o más envases que comprende materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones para el uso. Puede estar presente una etiqueta en el envase para indicar que la composición se utiliza para una terapia específica o aplicación no terapéutica, y también puede indicar instrucciones para el uso in vivo o in vitro, tales como las descritas más arriba.
Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento del ADNc correspondiente al gen 20P1F12/TMPRSS2 mediante clonación SSH Y análisis de expresión Materiales y Métodos Líneas celulares y Tejidos Humanos
Todas las líneas celulares del cáncer humano utilizadas en este estudio se obtuvieron a partir de ATCC. Todas las líneas celulares se mantuvieron en DMEM con suero bovino fetal al 10%. Las PrEC (células epiteliales primarias de próstata) se obtuvieron de Clonetics y se hicieron crecer en medio PrEBM suplementado con factores de crecimiento (Clonetics).
Todos los xenoinjertos de cáncer de próstata humana originalmente fueron provistos por Charles Sawyers (UCLA) (Klein et al., 1997; Craft et al. Cancer Res. octubre 1 de 1999 1;59(19):5030-6). Rutinariamente se pasaron xenoinjertos de LAPC-4 AD y LAPC-9 AD como pequeños trozos de tejido en machos SCID receptores. Los xenoinjertos de LAPC-4 AI y LAPC-9 AI se obtuvieron tal como se describió previamente (Klein et al., 1997; Craft et al. Cancer Res. octubre 1 de 1999 1;59(19):5030-6) y se pasaron a machos castrados o a ratones SCID hembra.
Los tejidos humanos para ARN y los análisis de proteínas se obtuvieron del Human Tissue Resource Center (HTRC) en UCLA (Los Angeles, CA) y de QualTek, Inc. (Santa Barbara, CA). Una muestra de tejido de hiperplasia prostática benigna se obtuvo de un paciente.
Aislamiento de ARN
Se homogeneizaron tejido tumoral y líneas celulares en Reactivo Trizol (Life Technologies, Gibco BRL) utilizando 10 ml/g de tejido o 10 ml/10^{8} células para aislar el ARN total. El ARN Poli A se purificó a partir del ARN total utilizando el kit Qiagen's Oligotex ARNm Mini y Midi. El ARN total y el ARNm se cuantificaron mediante análisis espectrofotométrico (D.O. 260/280 nm) y se analizaron mediante electroforesis en gel.
Oligonucleótidos
Se utilizaron los siguientes oligonucleótidos purificados por HPLC.
RSACDN (cebador de síntesis de ADNc):
5'TTTTGTACAAGCTT_{30}3' (SEC ID NO.: 6) 
\newpage
Adaptador 1:
5'CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT3' (SEC ID NO.: 7)
3'GGCCCGTCCA5' (SEC ID NO.: 14) 
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Adaptador 2:
5'GTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT3' (SEC ID NO.: 8)
3'CGGCTCCA5' (SEC ID NO.: 15) 
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador 1 de PCR:
5'CTAATACGACTCACTATAGGGC3' (SEC ID NO.: 9) 
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Cebador anidado (NP)1:
5'TCGAGCOGCCGCCCGGGCAGGT3 (SEC ID NO.: 10) 
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador anidado (NP)2:
5'AGCGTGGT000GGCCGAGGT3' (SEC ID NO.: 11) 
\vskip1.000000\baselineskip
Hibridización Sustractiva por Supresión
La Hibridización Sustractiva por Supresión (SSH) se utilizó para identificar ADNc correspondientes a genes que pueden sufrir regulación por aumento en el cáncer de próstata dependiente de andrógenos en comparación con la hiperplasia prostática benigna.
Los ADNc de doble hebra correspondientes al xenoinjerto de LAPC-4 AD (problema) y el tejido BPH (control) se sintetizaron a partir de 2 \mug de poli(A)+ARN aislado de xenoinjerto y tejido BPH, según se describe más arriba, utilizando el kit de Sustracción de ADNc PCR-Select de CLONTECH y 1 ng de oligonucleótido RSACDN como cebador. La síntesis de la primera y segunda hebras se realizaron según se describe en el protocolo del manual para el usuario del kit (Protocolo No. PT1117-1 de CLONTECH, Catálogo Núm. K1804-1). El ADNc resultante se digirió con Rsa I durante 3 horas a 37ºC. El ADNc digerido se extrajo con fenol/cloroformo (1:1) y se precipitó con etanol.
El ADNc control (BPH) se generó combinando en una relación 4 a 1 ADNc de BPH digerido con Rsa I con ADNc digerido de hígado de ratón, con el fin de asegurar que los genes murinos se sustrajeron del ADNc problema (LAPC-4 AD).
El ADNc problema (LAPC-4 AD) se generó diluyendo 1 \mul de ADNc AD de LAPC-4 digerido con Rsa I (400 ng) en 5 \mul de agua. El ADNc diluido (2 \mul, 160 ng) después se ligó a 2 \mul del adaptador 1 y el adaptador 2 (10 \muM), en reacciones de ligación separadas, en un volumen total de 10 \mul a 16ºC durante toda la noche, utilizando 400 u de T4 ADN ligasa (CLONTECH). La ligación se completó con 1 \mul de EDTA 0,2 M y calentamiento a 72ºC durante 5 minutos.
La primera hibridización se realizó añadiendo 1,5 \mul (600 ng) del ADNc control a cada uno de dos tubos que contenían 1,5 \mul (20 ng) de ADNc problema ligado al adaptador 1 y al adaptador 2. En un volumen final de 4 \mul, las muestras se cubrieron con aceite mineral, se desnaturalizaron en un ciclador térmico MJ Research a 98ºC durante 1,5 minutos, y después se dejaron hibridizar durante 8 horas a 68ºC. Las dos hibridizaciones después se mezclaron juntas con 1 \mul adicional de ADNc control desnaturalizado fresco y se dejaron hibridizar durante toda la noche a 68ºC. La segunda hibridización después se diluyó en 200 \mul de Hepes 20 mm, pH 8,3, NaCl 50 mM, EDTA 0,2 mM, se calentó a 70ºC durante 7 minutos y se conservó a -20ºC.
Amplificación por PCR, Clonación y Secuenciación de Fragmentos Génicos Generados a partir de SSH
Para amplificar fragmentos génicos resultantes de reacciones a partir de SSH, se realizaron dos amplificaciones por PCR. En la reacción por PCR primaria se añadió 1 \mul de la mezcla de hibridización final diluida a 1 \mul del cebador 1 de PCR (10 \muM), 0,5 \mul de mezcla de dNTP (10 \muM), 2,5 \mul 10 x tampón de reacción (CLONTECH) y 0,5 \mul de 50 x Mezcla de polimerasa de ADNc Advantage (CLONTECH) en un volumen final de 25 \mul. Se efectuó la PCR 1 utilizando las siguientes condiciones: 75ºC durante 5 minutos, 94ºC durante 25 segundos, después 27 ciclos de 94ºC durante 10 segundos, 66ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1,5 minutos. Se realizaron cinco reacciones por PCR primarias separadas para cada experimento. Los productos se combinaron y se diluyeron con agua 1:10. Para la reacción por PCR secundaria, se añadió 1 \mul de la reacción por PCR primaria combinada y diluida a la misma mezcla de reacción utilizada para PCR 1, excepto que se utilizaron los cebadores NP1 y NP2 (10 pM) en vez del cebador 1 de PCR. Se realizó la PCR 2 utilizando 10-12 ciclos de 94ºC durante 10 segundos, 68ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1,5 minutos. Los productos de PCR se analizaron utilizando electroforesis en gel de agarosa al 2%.
Los productos de PCR se insertaron en pCR2.1 utilizando el kit de clonación del vector T/A (Invitrogen). E. Coli transformadas se sometieron a selección azul/blanca y por ampicilina. Se tomaron las colonias blancas y se arreglaron en placas de 96 pocillos y se hicieron crecer en cultivo líquido durante toda la noche. Para identificar los insertos, se realizó amplificación por PCR en 1 ml de cultivo bacteriano utilizando las condiciones de PCR1, y NP1 y NP2 como cebadores. Los productos de PCR se analizaron utilizando electroforesis en gel de agarosa al 2%.
Se conservaron los clones bacterianos en glicerol al 20% en un formato de 96 pocillos. Se preparó el ADN plásmido, se secuenció, y se sometió a búsquedas por homologías de ácidos nucleicos de las bases de datos de GenBank, dBest y NCI-CGAP.
Análisis de Expresión por RT-PCR
Se generaron ADNc de primera hebra a partir de 1 \mug de ARNm con cebado de oligonucleótidos (dT)12-18 utilizando el sistema Gibco-BRL Superscript Preamplification. Se utilizó el protocolo de los fabricantes y se incluyó una incubación durante 50 minutos a 42ºC con transcriptasa inversa seguida de tratamiento con ARNasa H a 37ºC durante 20 minutos Después de completar la reacción, el volumen se incrementó hasta 200 \mul con agua antes de la normalización. Se obtuvieron de Clontech ADNc de primera hebra de 16 tejidos humanos normales diferentes.
La normalización de los ADNc de primera hebra de tejidos múltiples se realizó utilizando los cebadores
5'ATATCGCCGCGCTCGTCGTCGACAA3' (SEC ID NO.: 28) y 5'AGCCACACGCAGCTCATTGTAGAAGG3' (SEC ID NO.: 29) para amplificar la \beta-actina. El ADNc de primera hebra (5 \mul) se amplificó en un volumen total de 50 \mul que contenía cebadores 0,4 \muM, 0,2 \muM de cada dNTPs, tampón 1XPCR (Clontech, Tris-HCl 10 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, KCl 50 mM, pH8,3) y ADN polimerasa 1X Klentaq (Clontech). Se extrajeron cinco \mul de la reacción por PCR a 18, 20 y 22 ciclos y se utilizaron para la electroforesis en gel de agarosa. Se realizó la PCR utilizando un ciclador térmico MJ Research en las siguientes condiciones: la desnaturalización inicial fue a 94ºC durante 15 segundos, seguida de 18, 20 y 22 ciclos de 94ºC durante 15, 65ºC durante 2 minutos, 72ºC durante 5 segundos. Se realizó una extensión final a 72ºC durante 2 minutos. Después de la electroforesis en gel de agarosa, las intensidades de banda de las bandas de \beta-actina de 283 pb de múltiples tejidos se compararon por inspección visual. Los factores de dilución para los ADNc de primera hebra se calcularon para dar intensidades de banda de \beta-actina iguales en todos los tejidos después de 22 ciclos de PCR. Se requirieron tres vueltas de normalización para lograr intensidades de banda iguales en todos los tejidos después de 22 ciclos de PCR.
Para determinar los niveles de expresión del gen 20P1F12, se analizaron 5 \mul del ADNc de primera hebra normalizado mediante PCR utilizando 25, 30 y 35 ciclos de amplificación utilizando los siguientes pares de cebadores, que fueron diseñados con la ayuda de (MIT; para más detalles, véase, www.genome.wi.mit.edu):
5' AGT CTT CCT GCT GAG TCC TTT CC 3' (SEC ID NO.: 12)
5' CAA GGG CAC TGT CTA TAT TCT CAC C 3' (SEC ID NO.: 13)
El análisis semicuantitativo de la expresión se logró comparando los productos de PCR en los números de ciclos que dan intensidades de banda suaves.
Resultados
Se realizaron varios experimentos de SSH según se describe en Materiales y Métodos, supra, y llevaron al aislamiento de numerosos clones de fragmentos génicos candidatos. Todos los clones candidatos se secuenciaron y se sometieron a análisis de homología contra todas las secuencias de las bases de datos públicas importantes de genes y EST con el fin de proporcionar información acerca de la identidad del gen correspondiente y para ayudar a guiar la decisión de analizar un gen particular para la expresión diferencial.
Uno de los clones de ADNc, denominado 20P1F12, mostró identidad con una serina-proteasa recientemente descrita: TMPRSS2 (Paoloni-Giacobino et al., 1997, Genomics 44: 309-320). El fragmento de ADNc de 20P1F12 aislado tiene 388 pb de longitud y posee la secuencia nucleotídica que se muestra en la Figura 4. El análisis de expresión diferencial por RT-PCR mostró que el gen 20P1F12 se expresa en aproximadamente iguales niveles en próstata normal y en los xenoinjertos de LAPC-4 y LAPC-9 (Figura 5, panel A). Otro análisis de expresión por RT-PCR de los ADNc de primera hebra de 16 tejidos normales mostró los más elevados niveles de expresión de 20P1F12 en próstata. Se observó un nivel de expresión sustancialmente más bajo en varios otros tejidos normales (p. eas, riñón, hígado y pulmón) (Figura 5, paneles B y C).
Ejemplo 2 Análisis por transferencia northern de la expresión del gen 20P1F12/TMPRSS2
Se realizaron análisis de transferencia Northern sobre un panel de 16 tejidos humanos normales utilizando una sonda marcada de 20P1F12/TMPRSS2 (correspondiente al ADNc 20P1F12 SSH de la Figura 4) para confirmar la especificidad prostática de la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 inicialmente establecida por el análisis de expresión por RT-PCR. Los resultados, que se muestran en la Figura 6, confirman y extienden el Análisis por RT-PCR y muestran que la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 es relativamente específica de la próstata, ya que la expresión en próstata es mayor que la expresión en pulmón, riñón, páncreas o colon. No se observó expresión detectable en ninguno de los otros 11 tejidos normales utilizados en este panel.
Además, los niveles de expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en los xenoinjertos de LAPC-4 y LAPC-9 también se examinaron mediante análisis de transferencia Northern. Se realizó la transferencia Northern en 10 \mug de ARN total preparado a partir de líneas celulares y xenoinjertos de LAPC utilizando ADNc de 20P1F12/TMPRSS2 marcado al azar con hexámeros (Boehringer Mannheim). Los resultados, que se muestran en las Figuras 6 y 7, indican niveles de expresión similares en los xenoinjertos y en tejido normal, observándose expresión de menor nivel sólo en el xenoinjerto de LAPC-9 AI. Otro análisis de transferencia Northern de la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en un gran panel de células cancerosas se describe en el Ejemplo 4, más abajo.
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Ejemplo 3 Clonacón de ADNc DE 20P1F12 de longitud completa
Se aisló un ADNc de longitud completa que codifica el gen 20P1F12/TMPRSS2 a partir de una biblioteca de próstata humana y se denominó 20P1F12-GTC1. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de 20P1F12-GTC1 se muestran en la Figura 1. Se depositó el plásmido p20P1F12-GTC1 (portador del ADNc 20P1F12-GTC1) en ATCC (Manassas, Virginia) el 12 de febrero de 1999 y se le otorgó el Número de Designación ATCC 207097. El ADNc 20P1F12-GTC1 de aproximadamente 3,5 kb codifica una proteína de 492 aminoácidos que es casi, pero no completamente, idéntica a la secuencia previamente descrita (Figura 2). Existen varias diferencias en la secuencia nucleotídica del ADNc 20P1F12-GTC1 en relación con la secuencia de TMPRSS2 publicada, seis de las cuales determinan aminoácidos codificados diferentes, según se muestra en la alineación de aminoácidos de la Figura 3. Específicamente, cuatro de las diferencias de aminoácidos están en el dominio de proteasa, tres de las cuales son diferencias no conservadoras de aminoácidos que podrían afectar la función y/o especificidad de la proteasa. Un examen minucioso de la secuencia muestra 8 diferencias en la secuencia nucleotídica que dan lugar a 6diferencias de aminoácidos en las posiciones 160, 242, 329, 449, 489 y 491 en comparación con la secuencia previamente publicada. Las seis diferencias se confirmaron mediante la secuenciación de clones adicionales de ADNc 20P1F12/TMPRSS2 y fragmentos génicos obtenidos a partir de bibliotecas de ADNc de próstata normal, LAPC-4 y LAPC-9. Todas estas diferencias ocurren en el dominio asociado a la membrana, dos de las cuales (aminoácidos 160 y 242) residen en el dominio rico en cisteína del receptor barredor (SRCR), mientras que las otras se localizan dentro del dominio de proteasa. No está claro cómo estas diferencias de secuencias de aminoácidos podrían afectar la actividad biológica. Sin embargo, es posible que 20P1F12/TMPRSS2 y TMPRSS2 se expresen de manera diferencial en vista de los datos de los solicitantes que muestran un patrón de expresión de ARNm divergente en tejidos humanos normales.
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Ejemplo 4 Expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en cáncer de próstata y colon
Para analizar la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en tejidos y líneas celulares de cáncer, se realizó transferencia Northern sobre ARN obtenido a partir de los xenoinjertos de LAPC y un panel de líneas celulares de cáncer de próstata y no próstata. Los resultados muestran altos niveles de expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en todos los xenoinjertos de LAPC y en las líneas celulares de cáncer de colon (Figura 7). Se detectaron niveles de expresión similares en próstata, LAPC-4 AD, LAPC-4 Al, LAPC-9 AD y LNCaP. Se observaron niveles inferiores de 20P1F12/TMPRSS2 en células LAPC-9 AI y AI PC-3, no observándose ninguna expresión en DU145. También se detectaron altos niveles de expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en tres de cuatro líneas celulares de cáncer de colon, incluyendo LoVo, T84 y Colo-205.
Tal como se observó más arriba, el primer informe acerca de 20P1F12/TMPRSS2 (Paoloni-Giacobino et al., 1997, Genomics 44: 309-320) identificó un ADNc que codifica una proteína que está sumamente relacionada con, pero es estructuralmente distinta de, la 20P1F12/TMPRSS2 descrita en la presente memoria. Por otra parte, el gen TMPRSS2 descrito por Paoloni-Giacobino et al. también mostró un patrón de expresión muy diferente en relación con el perfil de expresión de 20P1F12/TMPRSS2. Recientemente, sin embargo, se ha publicado un segundo informe que confirma este dato relacionado tanto con la secuencia como con el patrón de expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en varios tejidos (Lin et al., 1999 Cancer Res. septiembre 1;59(17):4180-4).
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Ejemplo 5 Caracterización de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 Generación de Anticuerpos Monoclonales de 20P1F12/TMPRSS2
TMPRSS2 representa un blanco terapéutico potencial para los cánceres de próstata y colon. Como antígeno asociado a la superficie celular así como fragmento de proteasa secretada, el mismo puede ser un blanco particularmente bueno para la terapia de anticuerpos. A fin de explorar esta posibilidad y además caracterizar la proteína 20P1F12/TMPRSS2, se generaron anticuerpos monoclonales dirigidos contra una proteína de fusión GST-20P1F12/TMPRSS2. Específicamente, se generaron MAb de ratón hacia una región carboxilo-terminal de la proteasa (residuos 362-440) fusionados a una glutatión-S-transferasa (GST) bacteriana. Se generó la proteína de fusión a GST por PCR utilizando los siguientes cebadores para amplificar la secuencia de 20P1F12/TMPRSS2: 5'-TTGAATTC
CAAACCAGTGTGTCTGCCC-3' (SEC ID NO.: 16), 5'-AAGCTCGAGTCGTCACCCTGGCAAGAAT-3' (SEC ID NO.: 17). El producto de PCR se insertó en pGEX-4T-3 utilizando los sitios de clonación EcoRI y XhoI. La proteína de fusión a GST se purificó y se utilizó para inmunizar ratones. El inmunógeno comprendió una región de aproximadamente 8 kD dentro del dominio de proteasa, específicamente los residuos de aminoácidos 362 hasta 440 (véase la Figura 1).
Se inmunizaron ratones con GST-TMPRSS2 purificada y se generaron hibridomas. Los sobrenadantes de hibridoma se examinaron para hallar anticuerpos específicos mediante transferencia Western utilizando lisados de células 293T transfectadas con 20P1F12/TMPRSS2. Se examinaron 1.205 pocillos mediante Transferencia Western utilizando conjuntos de 3-5 pocillos y equipo Western de calles múltiples (cada pocillo fue positivo respecto de la proteína de fusión a GST y el producto de ruptura por ELISA). Los subclones se obtuvieron por clonación por dilución limitante y análisis mediante transferencia Western. Se identificaron siete hibridomas que específicamente reconocen 20P1F12/TMPRSS2 mediante Transferencia Western y se designaron 1F9 (IgG1, K), 2D10 (IgG1, K), 2F8 (IgG1, K), 6B11 (IgG1, K), 3G3 (IgG1, K), 8C6 (IgG1, K) y 908 (IgG2a, K). Un clon, 1F9, se utilizó posteriormente para todos los estudios. Se realizó la transferencia Western de tejido, xenoinjerto y lisados de líneas celulares de cáncer sobre 20 \mug de proteína de lisados celulares. La normalización de extractos se logró sondeando extractos celulares con anticuerpos anti-GRB-2 (Transduction Laboratories) o mediante la visualización de las cantidades totales de proteína de las calles mediante tinción de membranas con Ponceau S.
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Mapeo de Epitopos de mAbs anti-TMPRSS2
Para los estudios de mapeo de epitopos, los mAb anti-TMPRSS2 1F9 2F8 y 8C6, se biotinilaron a razón de aproximadamente 4-7 moléculas de biotina por molécula de anticuerpo utilizando el kit "EZ-Link" Sulfo-NHS-LC-Biotinylaton kit (Pierce, Rockford, IL) conforme al protocolo del fabricante. Estos anticuerpos biotinilados se utilizaron en un ELISA competitivo en presencia y ausencia de un exceso de 50 veces cada uno de los otros 7 anticuerpos anti-TMPRSS2 no marcados (1F9, 2D10, 2F8, 303, 6B11, 8C6 y 9G8) utilizando el dominio de proteasa de GST-TMPRSS2 (AA 255-492) como antígeno blanco. Las placas de ELISA se revistieron con 100 ng/pocillo de dominio de proteasa de GST-TMPRSS2 y se bloquearon con FBS que contenía 3% de leche. Las placas después se incubaron con o sin mAb no marcado en exceso (12,5 \mug/ml) durante 1 hora a temperatura ambiente (TA). Las placas se lavaron y después se incubaron con 250 ng/ml de mAbs 2F8 o 8C6 biotinilado, o 100 ng/ml de mAb 1F9 durante 1,5 horas a TA. Las placas se lavaron y después se incubaron con una dilución 1:2000 del conjugado avidina-HRP (Neutralite, Fisher Scientific) durante 1 hora. Las placas se lavaron, se desarrollaron con sustrato TMB, se neutralizaron con H_{2}SO_{4} 1M y se obtuvieron las DO de los pocillos a 450 nm.
La Tabla 2 más abajo proporciona los resultados de estos estudios de mapeo de epitopos. Los datos de la Tabla 2 son el promedio \pm intervalo de determinaciones por duplicado. 1F9-B, 2F8-B, 8C6-B: formas biotiniladas de mAb. En la Tabla 2, los mAb no marcados que compiten por la unión de anticuerpos biotinilados se indican en negrita.
Los anticuerpos descriptos más arriba son útiles para analizar y caracterizar los polipéptidos 20P1F12/TMPRSS2. Se identifican dos bandas principales de proteína de aproximadamente 54 (el peso molecular (PM) previsto de
20P1F12/TMPRSS2) y aproximadamente 32 kilodaltons en ensayos de traducción in vitro utilizando el ADNc de 20P1F12/TMPRSS2 y 1F9. La transferencia Western de lisados celulares de LNCaP, LAPC-4 y LAPC-9 identifica dos bandas principales de proteínas de aproximadamente 70 y 32 kilodaltons (kD) (Figura 8b). Se determinaron los pesos moleculares de las bandas de proteínas de la transferencia Western utilizando la función de calculo de pesos moleculares del software de análisis de imágenes AlphaEase (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA) con marcadores de pesos moleculares pre-teñidos (BioRad) como calibradores. Dado que el peso molecular (PM) previsto de 20P1F12/TM2RSS2 es de 54 kD, este dato sugiere que la isoforma de 70 kD está modificada, posiblemente por glicosilación. La forma de 32 kD es un fragmento escindido proteolíticamente que contiene los epitopos carboxilo-terminales reconocidos por los anticuerpos.
Pueden generarse mAb adicionales de 20P1F12/TMPRSS2 mediante inmunización basada en células utilizando células LAPC-9 que expresan 20P1F12/TMPRSS2 como agente de selección para ELISAs basados en células. Además, pueden generarse mAb de 20P1F12/TMPRRSS2 utilizando una proteína 20P1F12/TMPRSS2 purificada tal como el fragmento del dominio de proteasa secretado como inmunógeno. Por ejemplo, 20P1F12/TMPRSS2 recombinante que posee una cola de histidina amino-terminal puede expresarse en un sistema de baculovirus utilizando pBlueBac4.5 (Invitrogen). 20P1F12/TMPRSS2 marcada con His después puede purificarse utilizando una columna de níquel, cuantificarse y utilizarse como inmunógeno. Alternativamente, el dominio de proteasa de 20P1F12/TMPRSS2 puede purificarse a partir de una muestra biológica (p. ej. plasma seminal) utilizando cromatografía de inmunoafinidad con un anticuerpo anti-20P1F12/TMPRSS2 tal como el anticuerpo 1F9 descrito en la presente memoria. La selección de monoclonales puede realizarse utilizando ELISAs basados en células con, por ejemplo, células LNCaP y PC-3/TMPRSS2.
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Tinción de tejidos
Se realizó el análisis inmunohistoquímico de tejidos fijados con formalina y embebidos en parafina con MAb 1F9 sobre secciones de tejido de 4 micrones. Después del tratamiento con vapor en citrato de sodio (10 mM, pH 6,0), se incubaron los portaobjetos con 10 \mug/ml de MAb 1F9 seguido de incubación con IgG biotinilada anti-ratón de conejo. Se llevaron a cabo estudios de inhibición competitiva en presencia de 50 \mug/ml de GST o proteína de fusión GST-20P1F12/TMPRSS2. Las reacciones se visualizaron utilizando peroxidasa de rábano conjugada con avidina (Vector Labs, Burlingame, CA).
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Localización Celular
Para estudiar las características de la proteína 20P1F12/TMPRSS2, se clonó el ADNc de 20P1F12 (Figura 1) en pADNc 3.1 Myc-His (Invitrogen), que proporciona una cola de 6 histidinas en el extremo carboxilo-terminal. La construcción se transfectó a células 293T y se analizó mediante biotinilación de la superficie celular. Las proteínas biotiniladas de la superficie celular se purificaron por afinidad utilizando estreptavidina-sefarosa. El análisis de transferencia Western de las proteínas purificadas por afinidad con estreptavidina utilizando un anticuerpo anti-His demostró la presencia de proteínas 20P1F12/TMPRSS2 en varias muestras biológicas (véase, p. ej., la Figura 9a y Figura 23). Por lo tanto, 20P1F12/TMPRSS2 puede encontrarse tanto en la superficie celular como ser secretada por las células.
Para examinar la 20P1F12/TMPRSS2 endógena localizada en la superficie de células LNCaP y PC-3 de cáncer de próstata, se purificaron por afinidad proteínas biotiniladas de la superficie celular con estreptavidina-sefarosa y se sondearon con anticuerpos anti-20P1F12/TMPRSS2. La Transferencia Western de proteínas purificadas con estreptavidina sugiere la biotinilación de la superficie celular de 20P1F12/TMPRSS2 endógena en ambas células LNCaP y PC-3 apareciendo como bandas de proteínas de 32 y 70 kD (Figura 9b). En controles adicionales, la proteína 20P1F12/TMPRSS2 no se detectó en precipitados con estreptavidina de células no biotiniladas (Figura 8b).
Resulta interesante que células 293T transfectadas con 20P1F12/TMPRSS2 marcada con His en el extremo carbo-
xilo-terminal expresan fundamentalmente la proteína de 70 kD (Figura 9a). Como el dominio de proteasa de 20P1F12/
TMPRSS2 se localiza en el extremo carboxilo-terminal, el fragmento de 32 kD es el resultado de la ruptura auto-catalítica (véase el Ejemplo 10 más abajo), y posiblemente es inhibido por la cola de histidina. La molécula relacionada, la hepsina (TMPRSSI), parece ser capaz de autoactivación de una manera dependiente de la concentración (Vu et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 31315-31320). Esta ruptura auto-catalítica puede explotarse para identificar moléculas pequeñas que inhiben la actividad de 20P1F12/TMPRSS2. Pueden hacerse crecer células en presencia o ausencia de inhibidores de moléculas pequeñas para buscar específicamente la inhibición de la ruptura. Tal como se trató más arriba, dichas moléculas pequeñas pueden emplearse como agentes terapéuticos del cáncer.
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Glicosilación de 20P1F12/TMPRSS2
El PM predicho de 20P1F12/TMPRSS2 es significativamente más pequeño que el PM aparente detectado por la Transferencia Western. Esto sugiere que 20P1F12/TMPRSS2 puede ser glicosilada. La secuencia GTC1 indica que existen tres sitios potenciales de glicosilación con la secuencia de consenso de NXSIT (residuos 128, 213, 249). Para explorar la posibilidad de que 20P1F12/TMPRSS2 sea glicosilada, 20P1F12/TMPRSS2 marcada con His se transfectó a células 293T y se purificó utilizando Níquel-agarosa (Invitrogen). La proteína purificada por afinidad se eluyó con EDTA 50 mM, pH 8,0, y se desglicosiló utilizando N-glicosidasa F (Boehringer Mannheim) de acuerdo con el protocolo de los fabricantes. La proteína no tratada y glicosilada se analizó mediante transferencia Western utilizando anticuerpos anti-His. Los resultados muestran un cambio de PM de 5-8 kD de 20P1F12/TMPRSS2 con el tratamiento con N-glicosidasa F (Fig 10), que indica que 20P1F12/TMPRSS2 es realmente una proteína glicosilada. La 20P1F12/TMPRSS2 desglicosilada aún exhibía un PM de al menos 5-10 kD mayor que el tamaño previsto, indicando que la reacción de desglicosilación no estaba completa (o que la glicosilación está unida a O), o que 20P1F12/
TMPRSS2 puede exhibir modificaciones pos-traduccionales adicionales (tales como fosforilación, sulfatación).
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Regulación por andrógenos
La transferencia Northern muestra que la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 parece reducirse en el xenoinjerto de LAPC-9 independiente de andrógenos y en las líneas celulares PC-3 y DU145 independientes de andrógenos (Figura 6), sugiriendo que 20P1F12/TMPRSS2 puede ser un gen regulado por andrógenos. Para explorar esta posibilidad, células LNCaP, que son dependientes de andrógenos y expresan niveles significativos de 20P1F12/TMPRSS2, se privaron de andrógenos durante una semana haciéndolas crecer en un medio que contenía suero fetal bovino (FBS) tratado con 2% de carbón vegetal. Las células después se estimularon con mibolerona, un análogo sintético de andrógenos, en varios puntos de tiempo. Las células se cosecharon para obtener ARN y realizar una transferencia Northern. Como control de carga, la misma transferencia también se sondeó con \beta-actina. Los resultados (Figura 11) muestran una clara reducción de la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 durante la privación de andrógenos (Figura 11). La adición de mibolerona incrementó la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 de manera significativa, indicando que es un gen sensible a los andrógenos. La expresión del antígeno específico de la próstata (PSA) en las mismas muestras se monitoreó como control positivo para la regulación por andrógenos (Figura 11).
Para determinar el tiempo óptimo de inducción de 20P1F12/TMPRSS2, células privadas de andrógenos se estimularon con mibolerona durante varios puntos de tiempo. Las células se cosecharon para el aislamiento de ARN y proteínas para realizar transferencia Northern y Western, respectivamente. Los resultados (Figura 12) muestran la inducción del mensaje de 20P1F12/TMPRSS2 dentro de las tres horas siguientes a la estimulación e incrementada a lo largo de las 24 horas posteriores a la adición de hormonas. Además, la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 parece reducirse levemente en los xenoinjertos de LAPC-4.
Para analizar los niveles de proteína, se realizó la transferencia Western de lisados celulares utilizando el mAb 1F9. Los controles adicionales de la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 incluyeron células PC-3 infectadas con un retrovirus que codifica tanto neo como 20P1F12/TMPRSS2. Las células PC-3 infectadas se seleccionaron en G418 durante 2-3 semanas y se cosecharon para la transferencia Western. Los resultados mostraron la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en las células infectadas con un virus de 20P1F12/TMPRSS2, y ninguna expresión detectable de 20P1F12/TMPRSS2 en las células neo.
Cuando se observan las células LNCaP privadas de andrógenos, la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 es aún detectable, pero visiblemente reducida cuando se compara con células estimuladas con andrógenos. Sin embargo, el primer punto de tiempo de expresión inducida aparece después de las 9 horas de estimulación, indicando que la expresión proteica de 20P1F12/TMPRSS2 queda a la zaga de la inducción por ARN (Figura 12). Por otra parte, la Figura 21 muestra la inducción por andrógenos y la liberación del fragmento auto-proteolítico de 32 kD a los sobrenadantes de células LAPC4 y LNCaP y la aparición de un nuevo complejo proteico inmunoreactivo anti-TMPRSS2 de 103 kD.
Estos resultados demuestran que 20P1F12/TMPRSS2 es un gen regulado por andrógenos, similar a otras proteasas específicas de la próstata, tales como PSA y hK2 (Young et al., 1995, S. Androl. 16:97).
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Efecto de 20P1F12/TMPRSS2 sobre la Morfología de NIH 3T3
20P1F12/TMPRSS2 exhibe expresión específica de la próstata y parece estar regulada por andrógenos. Para determinar el efecto de la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en una línea celular heteróloga de cáncer no prostático, se utilizó el retrovirus de 20P1F12/TMPRSS2 para infectar células NIH 3T3. La morfología de las células infectadas con retrovirus de 20P1F12/TMPRSS2 se comparó con la morfología de células de control (neo) infectadas con el virus. Una población de células infectadas exhibió un aspecto vacuolar distinto en comparación con las células de control (Figura 13), que parecen correlacionarse con altos niveles de expresión. Después del pasaje de esta población de células infectadas, las células portadoras de vacuolas gradualmente desaparecieron con expresión aparentemente reducida de 20P1F12/TMPRSS2.
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Evaluación de la Función de 20P1F12/TMPRSS2
La función de 20P1F12/TMPRSS2 se evaluó en células de mamíferos manipuladas genéticamente para expresar 20P1F12/TMPRSS2. Para este fin, 20P1F12/TMPRSS2 se clonó en diversos vectores, incluyendo pADNc 3.1 myc-His-tag (Invitrogen), el vector retroviral pSR\alphatkneo (Muller et al., 1991, MCB 11:1785), y pIND (Invitrogen), un sistema de expresión inducible por ecdisona. Al utilizar estos vectores de expresión, 20P1F12/TMPRSS2 se expresó en varias líneas celulares, incluyendo PC-3. La expresión de 20P1F12/TMPRSS2 se monitoreó utilizando anticuerpos anti-20P1F12TMt'RSS2 mediante Western y análisis FACS. La 20P1F12/TMPRSS2 purificada se utiliza para identificar el sustrato.
Dichas líneas celulares de mamíferos que expresan 20P1F12/TMPRSS2 pueden entonces probarse en diversos ensayos in vitro, incluyendo proliferación celular, adhesión celular, invasión celular utilizando un sistema de cultivo de invasión en membrana (MICS) (Welch et al., Int. I. Cáncer 43: 449-457) en el cultivo de tejidos, y ensayos in vivo, incluyendo formación de tumores en ratones SCID. El fenotipo celular de 20P1F12/TMPRSS2 se compara con el fenotipo de células que no expresan 20P1F12/TMPRSS2.
Para evaluar el papel funcional de los diferentes dominios en 20P1F12/TMPRSS2, se generan las siguientes mutantes de eliminación y mutantes puntuales: (i) ASRCR (supresión de 93 a.a.); (ii) dLDLRA (supresión de 35 a-a.); y (iii) mutante de la tríada catalítica: H296Q, D345N, S441A (mutantes puntuales únicas). Las mutantes de 20P1F12/TMPRSS2 se clonaron en vectores retrovirales psR\alphatkneo para la expresión en células de mamíferos. Las mutantes resultantes son útiles para elucidar la importancia de los diferentes dominios y residuos. (Véase, p. ej., el Ejemplo 10 más abajo). Además, estas mutantes son útiles para determinar si tales mutantes funcionan como moléculas negativas dominantes. La actividad negativa dominante puede manifestarse en células que expresan 20P1F12/TMPRSS2 endógena, tales como LNCaP. La actividad negativa dominante puede deberse a interacciones con sustratos a través del dominio de proteasa o a través de dominios de interacción proteína-proteína. Las moléculas mutantes de 20P1F12/TMPRSS2 se prueban en los mismos ensayos in vitro e in vivo que 20P1F12TTMPRSS2 de tipo salvaje (véase más arriba). Tales moléculas negativas dominantes de 20P1F12/TMPRSS2 pueden ser útiles terapéuticamente. Por ejemplo, una 20P1F12/TMPRSS2 dominante negativa puede introducirse en células cancerosas (tales como células de cáncer de vejiga, ovario, pulmón, riñón o colon, o células de cáncer metastásico) a través de vectores de terapia génica capaces de administrar y expresar la secuencia codificadora correspondiente en células de tumor de próstata.
Determinar las características de la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en tejidos de ratón normal y en ratones transgénicos proporciona información adicional acerca de la función de 20P1F12/TMPRSS2. El análisis de transferencia Northern que utiliza sondas diseñadas a partir de las secuencias de 20P1F12/TMPRSS2 provistas en la presente memoria pueden utilizarse para definir el patrón de expresión de la 20P1F12/TMPRSS2 murina. Además, puede analizarse la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 durante el desarrollo en el embrión del ratón. Los datos resultantes identificarán una fuente de tejido para clonar el gen del ratón y predecir qué tejidos serían afectados en un estudio de ratón knock-out transgénico.
Pueden generarse ratones transgénicos y utilizarse para definir el papel biológico de 20P1F12/TMPRSS2 en un ámbito in-vivo. En un enfoque, los genes 20P1F12/TMPRSS2 humanos o de ratón se utilizan para generar ratones transgénicos. La sobreexpresión de formación tumoral espontánea en ratones se puede estudiar utilizando ratones transgénicos. En otro enfoque, los knock-outs del gen 20P1F12/TMPRSS2 se generan en ratones. Dichos ratones también pueden cruzarse con otros modelos de ratón con cáncer de próstata, tales como el modelo TRAMP (Greenberg et al., 1995, PNAS 92:3439), para estudiar la influencia sobre la agresividad y la metástasis del cáncer de próstata y para observar cambios en el avance de la enfermedad.
Los experimentos que prueban la interacción funcional de 20P1F12/TMPRSS2 con inhibidores de la serina-proteasa también proporcionarán información acerca de la función de 20P1F12/TMPRSS2. Para este fin, la inhibición se logra utilizando inhibidores de molécula pequeña o inhibidores biológicos.
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Ejemplo 6 La proteína 20P1F12/TMPRSS2 sufre ruptura proteolítica en tejidos y líneas celulares
Se generaron MAbs de ratón contra el dominio de proteasa de 20P1F12/TMPRSS2. La transferencia Western de los extractos proteicos de células 293T utilizando el MAb 1F9, mostró igual expresión de dos especies de proteínas con pesos moleculares aparentes de 70 y 32 kilodaltons (kd) sólo en las células transfectadas con 20P1F12/TMPRSS2 y no en células de control transfectadas con el vector (Figura 15). El peso molecular (PM) predicho de 20P1F12/TMPRSS2 es de 54 kd, sugiriendo que la isoforma de 70 kd está modificada, posiblemente mediante glicosilación. La secuencia de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 contiene tres posibles sitios de glicosilación ligados a N en los residuos 128, 213 y 249. Estudios preliminares que utilizan proteína 20P1F12/TMPRSS2 tratada con endoglicosidasa F indican que la proteína está realmente glicosilada. La forma de 32 kd puede ser un fragmento de ruptura proteolítica que contiene los epitopos carboxilo-terminales reconocidos por el anticuerpo.
El análisis de tejido y líneas celulares humanas, que expresan niveles variables de 20P1F12/TMPRSS2 mediante transferencia Northern, mostró el mismo patrón de expresión de la proteína que en las células 293T transfectadas con 20P1F12/TMPRSS2. La expresión de 20P1F12/TMPRSS2 se detectó en los lisados proteicos de células LAPC-4 AD, LAPC-9 AD y LNCaP, pero no en las células PC-3 y DU145 independientes de andrógenos. El análisis de tres especímenes de cáncer de próstata combinado con tejido adyacente normal mostró una expresión significativa de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 en todas las muestras, incluyendo los tejidos de próstata normal. También se detectó alta expresión en la línea celular Colo-205 de cáncer de colon (Figura 14).
Resulta interesante que, según se muestra en la Figura 23, en el lisado tisular entero de la próstata de una víctima de accidente normal, masculina, de 28 años (panel C), la relación entre las especies de 70 kD y 32 kb de 20P1F12/TMPRSS2 parece ser diferente de la observada en el lisado tisular entero de próstatas de individuos que sufren de cáncer (panel B), proporcionando evidencia de que la inducción de la proteólisis puede correlacionarse con la enfermedad.
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Ejemplo 7 La expresión de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 Es dependiente de la señal del receptor de andrógenos
Nuestro análisis muestra que la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 es menor en el xenoinjerto de LAPC-9 independiente de andrógenos y las líneas celulares PC-3 y DU145 independientes de andrógenos, en comparación con los xenoinjertos y líneas celulares dependientes de andrógenos. La castración de ratones macho que albergan tumores LAPC-9 dependientes de andrógenos produce una reducción dramática de la expresión de 20P1F12/TMPRSS2. A fin de extender estos descubrimientos, células LNCaP, que son dependientes de andrógenos y expresan significativos niveles de 20P1F12/TMPRSS2, fueron privadas de andrógenos durante una semana. La expresión de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 en las células privadas de andrógenos se comparó con la expresión en células tratadas con mibolerona. Los resultados muestran que la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 fue significativamente reducida durante la privación de andrógenos (Figura 16A). La estimulación de células LNCaP privadas de andrógenos con mibolerona durante 9 y 24 horas produjo un incremento en la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 que es comparable con los niveles observados en células LNCaP no tratadas. Los niveles de proteína PSA se midieron en paralelo, mostrando una similar regulación.
Las células PC-3, que normalmente no expresan el receptor de andrógenos (Tilley et al., 1990, Cáncer Res. 1990, 50:5382-5386) y crecen de una manera independiente de los andrógenos, expresan poco o nada de 20P1F12/TMPRSS2. Sin embargo, las células PC-3 que se han manipulado genéticamente para expresar el receptor de andrógenos de tipo salvaje exhiben bajos niveles de expresión de 20P1F12/TMPRSS2 cuando son tratadas con mibolerona (Figura 16A). Esto indica que la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en células de cáncer de próstata depende de una señal del receptor de andrógenos y la restauración de esta vía en células de cáncer de próstata independientes de andrógenos reactiva la expresión de 20P1F12/TMPRSS2. La expresión de PSA en células PC-3 también puede serr inducida por la expresión heteróloga del receptor de andrógenos y la estimulación concomitante de andrógenos (Dal et al., 1996, Steroids 61:531-539). Estos estudios demuestran que, de manera similar a PSA, la expresión de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 es críticamente dependiente de la vía del receptor de andrógenos.
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Ejemplo 8 La proteasa de 20P1F12/TMPRSS2 se libera en el medio de células de cáncer de próstata
Las predicciones estructurales para 20P1F12/TMPRSS2 sugieren que esta es una proteína transmembrana de tipo II con un dominio de proteasa. El tamaño del fragmento de 20P1F12/TMPRSS2 escindido de 32 kD sugiere que contiene la región proteasa entera. La ruptura de este dominio por lo tanto produce la liberación de la proteasa al espacio extracelular. Para probar esta hipótesis, se recolectó el medio de células LNCaP y LAPC4 privadas de andrógenos y estimuladas con andrógenos. Después se analizó el medio para determinar la presencia de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 mediante inmunoprecipitación y transferencia Western utilizando MAb anti-20P1F12/TMPRSS2. Los resultados muestran clara detección de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 escindida en el medio de las células estimuladas con andrógenos, pero no en las células privadas de andrógenos (Figura 16B). La cantidad de proteasa presente en el medio se correlaciona directamente con la cantidad de proteína 20P1F12/TMPRSS2 presente en los extractos celulares, que se incrementa con el aumento de la dosis de mibolerona (Figura 16B). La proteasa de 20P1F12/TMPRSS2 secretada también se detecta en los sueros de ratones que albergan células LNCaP.
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Ejemplo 9 20P1F12/TMPRSS2 se expresa en el epitelio secretor de células de cáncer de próstata y colon
Se examinó la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en biopsias y muestras quirúrgicas de cáncer de próstata mediante análisis inmunohistoquímico. La tinción específica de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 se validó utilizando células LNCaP que fueron privadas de andrógenos durante una semana y después se dejaron o bien sin tratar, o se estimularon con mibolerona durante 9 horas. A continuación las células se fijaron, se embebieron en parafina y se tiñeron con el anticuerpo anti-20P1F12/TMPRSS2 1F9. La tinción de 20P1F12/TMPRSS2 de LNCaP privadas de andrógenos mostró muy escasa tinción de las células. Por el contrario, la mayoría de las células estimuladas con andrógenos mostraron fuerte tinción intracelular (Figura 17A, B). Las células LNCaP que crecieron en un medio regular exhibieron similar tinción que las células estimuladas con andrógenos. La mayor parte de la tinción apareció localizada en las estructuras granulares dentro de la célula.
El análisis de 20 especímenes clínicos mostró tinción moderada a fuerte en los epitelios glandulares de todas las muestras probadas de próstata normal, PIN y cáncer de próstata (Figura 17C y D, y Tabla 1 más abajo). La señal pareció ser la más fuerte en el lado apical de las células secretoras, y en algunos casos se vio tinción granular como se observó en LNCaP. La tinción del tejido prostático fue específica, ya que el inmunógeno GST-20P1F12/TMPRSS2 pudo inhibir competitivamente la tinción del tejido de cáncer de próstata, mientras que GST sola no pudo. De manera similar al PSA, se descubrió que la proteína 20P1F12/TMPRSS2 se acumula dentro del lumen de las glándulas epiteliales (Figura 17E, F), indicando que la proteína 20P1F12/TMPRSS2 es secretada por el epitelio secretor.
No se detectó ninguna expresión de la proteína en las capas de células basales de las muestras de próstata normal examinadas. Este patrón de tinción está en oposición al análisis de hibridización de ARN in situ, que mostró la expresión del ARN de 20P1F12/TMPRSS2 fundamentalmente en la capa celular basal de glándulas prostáticas normales (Lin et al., 1999).
El análisis de varios tejidos no prostáticos no mostró ninguna tinción en la mayoría de los tejidos (Tabla 1), incluyendo riñón y pulmón, que expresan algún mensaje de 20P1F12/TMPRSS2. La expresión de la proteína se detectó en muestras de páncreas normales, tejidos de colon normal y tejidos de cáncer de colon (Tabla 1). La tinción pancreática se limitó a las células acinares exocrinas piramidales. No se detectó tinción alguna en los islotes de Langerhans. La tinción en colon normal apareció fundamentalmente en la envoltura mucosa (Figura 17G). La tinción en el cáncer de colon fue en general más profunda que en los tejidos de colon normal. La acumulación significativa de 20P1F12/TMPRSS2 (como se muestra mediante la tinción con el anticuerpo directo al dominio de proteasa) también se detectó en las áreas luminales (Figura 17H), proporcionando evidencia de secreción del antígeno. Por otra parte, según se ilustra, por ejemplo, en la Figura 17H, en el cáncer la arquitectura tisular se ve afectada, lo que posiblemente produce la fuga de 20P1F12/TMPRSS2 al torrente sanguíneo de manera análoga al PSA.
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Ejemplo 10 La ruptura de 20P1F12/TMPRSS2 es una consecuencia de la actividad autocatalítica
Se generaron mutantes puntuales únicas de 20P1F12/TMPRSS2 utilizando un método de PCR de dos etapas. Los residuos de arginina 240, 252 y 255 se mutaron a glutaminas, y la serina 441 se mutó a alanina. Utilizando un clon de ADNc de longitud completa como molde, se generó un fragmento de PCR 5'-20P1F12/TWRSS2 utilizando un cebador mutagénico (5'-GGCCCTCCAGCGTCACCC-3' (SEC ID NO.: 18) para la mutante S441A, 5'-CCGCAGGC
TATACATTGTAAAGAAACC-3' (SEC ID NO: 19) para R240Q, 5'-TCCTGCTCTGTTGGCTTGAGTTCA-3' (SEC ID NO: 20) para R252Q y 5'-CCCACAATCTGGCTCTGGCG-3' (SEC ID NO: 21) para R255Q) y un cebador de 20P1F12/TMPRSS2 específico de 5' que contenía el codón de inicio, una secuencia kozak, y un sitio EcoRI para clonación (5'CGAATTCGCAAGATGGCTTTGAAC-3') (SEC ID NO: 22). El fragmento 3' se generó mediante PCR utilizando el complemento inverso del cebador mutagénico (5'-GGGTGACGCTGGAGGGCC-3' (SEC ID NO: 23) para S441A, 5'-GGTTTCTTTACAATGTATAGCCTGCGG-3' (SEC ID NO: 24) para R240Q, 5'-TGAACTCAAGC
CAACAGAGCAGGA-3' (SEC ID NO: 25) para la mutante R252Q y 5'-CGCCAGAGCCAGATTGTGGG-3' (SEC ID NO: 26) para R255Q) y un cebador de 20P1F12/TMPRSS2 específico de 3' que contenía el codón de detención y un sitio XbaI para clonación (5'CGTCTAGATTAGCCGTCTGCCCTCA-3') (SEC ID NO: 27). Para la segunda vuelta de PCR, los fragmentos 3' y 5' se utilizaron como moldes. El producto final de PCR se digirió con EcoRI y Xbal, y se clonó en pSR\alphaMSV-tkNeo. La expresión de la proteína se analizó después de la transfección en células 293T.
20P1F12/TMPRSS2 se expresa predominantemente como una proteína de 32 KD que es muy posiblemente el resultado de la ruptura proteolítica. Para determinar si esta ruptura se debe a la actividad catalítica de 20P1F12/
TMPRSS2, el residuo de serina 441 de la tríada catalítica del dominio de proteasa se mutó a alanina (S441A). El ADNc de 20P1F12/TMPRSS2 mutante se clonó en un vector retroviral para la expresión en células 293T. El análisis de transferencia Western de extractos celulares de células 293T transfectadas o bien con 24P1F12/TMPRSS2 de tipo salvaje o con la mutante de S441A mostró que en oposición a la proteína de tipo salvaje, 20P1F12/TMPRSS2 S441A apareció como una especie de proteína única con un peso molecular aparente de 70 kD. Resulta interesante que 20P1F12/TMPRSS2 con una myc-cola de histidina carboxilo-terminal también mostró la expresión predominante de la proteína marcada de longitud completa, aunque se detectó algún producto de ruptura. Esto sugiere que la myc-cola de histidina en el extremo carboxilo-terminal del dominio de proteasa ejerce alguna actividad inhibidora sobre la ruptura proteolítica (Figura 18). Estos resultados de estos experimentos demuestran que la ruptura proteolítica de 20P1F12/TMPRSS2 en células y tejidos es una consecuencia de la actividad auto-catalítica.
El dominio de proteasa de 20P1F12/TMPRSS2 pertenece a la familia S1 de serina-proteasas con actividad de ruptura después de los residuos de Arg o Lys. El examen de la secuencia proteica revela la presencia de tres residuos de Arg (aminoácidos 240, 252, 255) cerca de la región amino-terminal del dominio de proteasa de 20P1F12/TMPRSS2. Para identificar el sitio real de ruptura del dominio de proteasa, se mutaron los tres residuos de Arg a residuos de Gln. Las mutantes se expresaron en células 293T mediante transfección transitoria y se analizaron por transferencia Western. Solamente la mutación R255Q produjo una pérdida de la ruptura auto-catalítica, identificando la unión Arg 255 -Ile 256 como el sitio de ruptura proteolítica. Estos resultados se indican en la Figura 34.
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Ejemplo 11 Observación de distintas especies de 20P1F12/TMPRSS2 en diferentes muestras biológicas
Para determinar si la autocatálisis y la generación del fragmento de proteína 20P1F12/TMPRSS2 de 32kD pueden tener relevancia biológica y clínica en el cáncer de próstata y colon, se monitoreó la expresión de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 en muestras clínicas de suero humano de cáncer de colon y próstata y en suero de ratones portadores de xenoinjertos de LNCaP de cáncer de próstata. El análisis por inmunoprecipitación/Western de estas muestras de suero con mAb 1F9 anti-20P1F12/TMPRSS2 demuestra la expresión del fragmento de ruptura de 32 kD, en el suero de ratón con LNCaP y en muestras de cáncer de próstata y colon, pero no en 2 muestras de sueros masculinos normales analizadas (Figuras 23A y B). La banda que representa el fragmento de 32 kD en las muestras de suero humano corre a un peso molecular más bajo que el fragmento de los sobrenadantes de LNCaP debido a la presencia predominante de inmunoglobulina de cadena liviana del mismo peso molecular que se arrastró en la inmunoprecipitación. La presencia del fragmento proteolítico de 20P1F12/TMPRSS2 en las muestras de cáncer pero no en las de suero normal sugiere que 20P1F12/TMPRSS2 puede ser un marcador diagnóstico sérico para cáncer de próstata y colon, así como para cáncer de vejiga, ovario y pulmón y cáncer metastásico. Al igual que en los sobrenadantes del cultivo tisular de células LNCaP, se detectó un complejo inmunorreactivo anti-20P1F12/TMPRSS2 de 103 kD en muestras de suero en las que se expresó el fragmento de 32 kD. La descripción provista en la presente memoria proporciona evidencia de que el fragmento de 32 kD codifica una serina-proteasa biológicamente activa y que la banda nueva de 103 kD puede representar un complejo del dominio de proteasa de 20P1F12/TMPRSS2 de 32 kD y un inhibidor sérico de la serina-proteasa (serpina). Dichos complejos séricos se describen bien para las calicreínas específicas de próstata PSA y hK2, que están presentes, cada una, en suero tanto en forma libre como en complejos con la serpina alfa-1-antiquimotripsina (Véase, p. ej., Grauer, LS, et al. Detection of human glandularkallidrein, hK2, as its precursor form and in complex with protease inhibitors in prostate carcinoma serum. J. Androl. 19:407-411, 1998; Christensson A et al. FERUM prostate specific antigen complexed to alpha 1-antichymotrypsin as an indicator of prostate cancer. J. Urol. 150:100-105, 1993; Clements IA. The human kallikrein gene family: a diversity of expresión and function. Mol. Cell. Endocrinol. 99:C1-C6, 1994). Resulta interesante que el análisis de la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en el tejido de la próstata de un individuo de sexo masculino normal joven (28 años) muestra la expresión predominante del 20P1F12/TMPRSS2 de longitud completa en comparación con muestras de pacientes y líneas celulares de cáncer de próstata (Figura 23C). Esta observación proporciona evidencia de que la proporción relativa de fragmento de ruptura respecto de 20P1F12/TMPRSS2 de longitud completa puede aumentar en la enfermedad comparada con el tejido sano de próstata y colon.
Debido a las similitudes entre PSA y 20P1F12/TMPRSS2 en cuanto a ser serina-proteasas reguladas por andrógenos específicas de la próstata, investigamos si la función natural de 20P1F12/TMPRSS2, como PSA, puede ser la de una serina-proteasa secretada en el fluido seminal. El análisis Western de plasma seminal normal demuestra un alto nivel de expresión del fragmento de ruptura de 32 kD de 20P1F12/TMPRSS2 así como de un fragmento levemente más pequeño de 30 kD (Figura 24A). No se observa expresión detectable de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 de longitud completa de 70 kD en plasma seminal como se aprecia en lisados tisulares, sin embargo se observa una banda inmunorreactiva nueva de peso molecular más alto, 90 kD, que puede representar un complejo covalente del dominio de proteasa de 20P1F12/TMPRSS2 y una serpina de plasma seminal. La inmunoprecipitación/análisis Western de 20P1F12/TMPRSS2 en sobrenadantes de LNCaP y fluido seminal demuestra expresión del fragmento de 32 kD en ambos, pero complejos diferentes de mayor peso molecular en suero que contiene sobrenadantes (103 kD) en comparación con el plasma seminal (90 kD). Se encuentran PSA complejado con alfa-1-antiquimotripsina en suero pero con inhibidor de la proteína C en plasma seminal (España et al. Thromb. Res. 64:309-320, 1991; Christensson et al. Bur. J. Biochem. 220:45-53, 1994). Una situación similar puede existir para 20P1F12/TMPRSS2 en el sentido que la banda de suero de 103 kD y la banda de plasma seminal de 90 kD representan complejos con serpinas distintas y que la concentración relativa de serpinas en estos fluidos puede regir la formación del complejo. Resulta interesante que una banda más liviana de 90 kD también se observa en la inmunoprecipitación del sobrenadante de LNCaP (Figura 24B).
Además, según se muestra en la Figura 26, se aprecia un alto nivel de expresión del fragmento de ruptura de 20P1F12/TMPRSS2 de 32 kD en líneas celulares de cáncer de colon y muestras de tejido de cáncer de colon en comparación con tejido de colon normal. Específicamente, los lisados de especímenes clínicos que representan tejido de cáncer de colon combinado o tejido adyacente normal (lado izquierdo de la transferencia) y de líneas celulares de cáncer de colon (lado derecho de la transferencia), y de xenoinjertos de LAPC4 y LAPC9 de cáncer de próstata se sometieron a análisis de transferencia Western anti-TMPRSS2 utilizando mAb 1F9. Las flechas indican la posición del fragmento auto-catalítico de 32 kD y la proteína 20P1F12/TMPRSS2 de longitud completa de 70 kD. Se ve una mayor expresión del fragmento de 32 kD en el tejido de cáncer de colon que en el tejido adyacente normal combinado. Asimismo, la especie inmunorreactiva predominante presente en líneas celulares de cáncer de colon también es el fragmento de 32 kD. Resulta interesante que existe muy poca expresión de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 de longitud completa en las muestras de colon pero existe una fuerte expresión de bandas inmunorreactivas anti-TMPRSS2 de 90 kD y 50 kD en los tejidos de colon que pueden representar un complejo del fragmento de 32 kD.
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Ejemplo 12 Metodologías para determinar el uso de 20P1F12/TMPRSS2 como blanco diagnóstico y/o terapéutico para el cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón, riñón o colon
Puede utilizarse una variedad de metodologías bien conocidas en la técnica para examinar el uso de 20P1F12/
TMPRSS2 como blanco diagnóstico y/o terapéutico para el cáncer de próstata y colon y para caracterizar y cuantificar la proteína 20P1F12/TMPRSS2 en fluidos clínicos de pacientes con cáncer de próstata y colon. Por ejemplo, se puede además desarrollar ELISA de captura sensible utilizando el panel existente de mAbs según se describe en el Ejemplo 5 más arriba (6 IgG1, 1 IgG2a). Dichos protocolos de ELISA pueden encontrarse, por ejemplo, en Current Protocols In Molecular Biology, Unidad II, Frederick M. Ausubul et al. eds., 1995. Además, tal como se ilustra más arriba, el experto en la técnica puede analizar un espectro de muestras clínicas para evaluar la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 y la formación de complejos en diferentes contextos utilizando, por ejemplo, una estrategia Western. Dichas estrategias Western se describen, por ejemplo, en Current Protocols In Molecular Biology, Unidad 10, Frederick M. Ausubul et al. eds., 1995. Además, el experto en la técnica puede determinar el uso potencial de Abs contra el complejo 20P1F12/TMPRSS2-pareja de unión (de manera análoga a la observada con PSA y Abs anti-serpina) en el desarrollo de ELISA. Por otra parte, se pueden generar paneles de mAbs contra el dominio de proteasa así como contra dominios diferentes de la proteasa (SRCR, LDL, intracelular, etc.).
Además, puede utilizarse una variedad de metodologías bien conocidas en la técnica para identificar y caracterizar bandas nuevas inmunorreactivas de 20P1F12/TMPRSS2 de alto peso molecular en suero (103 kD) y semen (90 kD). Por ejemplo, el experto en la técnica puede detectar un panel conocido de moléculas que posiblemente interactúan con 20P1F12/TMPRSS2 (sobre la base de observaciones con moléculas similares tales como PSA) tales como serpinas de suero y semen para identificar la formación de complejos de 20P1F12/TMPRSS2. Dichas moléculas candidatas también incluyen alfa-1-antiquimotripsina (complejos de PSA y hK2 en suero), inhibidor de la proteína C (complejos de PSA y hK2 en semen), alfa-2-macroglobulina, alfa-1-antitripsina, alfa-2-antiplasmina, anti-trombina III y otras serpinas. Alternativamente, se puede aislar y secuenciar la pareja de unión utilizando técnicas conocidas de purificación y secuenciación de proteínas (tales como columnas de afinidad, etc.).
Además, puede utilizarse una variedad de metodologías bien conocidas en la técnica para identificar y caracterizar la actividad proteolítica y la especificidad de sustrato de 20P1F12/TMPRSS2. En particular, se pueden emplear ensayos de proteasa utilizando 20P1F12/TMPRSS2 purificada o recombinante (tanto la molécula de longitud completa como el fragmento del dominio de proteasa) para examinar, por ejemplo, los efectos de los polipéptidos 20P1F12/TMPRSS2 sobre el crecimiento tumoral in vitro e in vivo. Además, se pueden ensayar sustratos potenciales in vivo (que pueden ser blancos naturales en semen) tales como semenogelina I y II (blancos de PSA y hK2), fibronectina (blanco de PSA y hK2), PSA (blanco de hK2), kininógeno de alto peso molecular (blanco de hKl, hK2), la liberación de bradiquinina y la autocatálisis. Además, al utilizar técnicas conocidas en la técnica pueden utilizarse, sustratos peptídicos fluorescentes para determinar la especificidad de la ruptura.
Además, puede utilizarse una variedad de metodologías bien conocidas en la técnica para examinar los efectos in vivo e in vitro de mAb anti-20P1F12/TMPRSS2 sobre el crecimiento tumoral. Por ejemplo, se pueden examinar los efectos de dichas moléculas en la captación tumoral y metástasis en el modelo SCID (véase, p. ej., Sato et al., Cáncer Res. abril de 1997 15;57(8):1584-9).
Alternativamente, se pueden examinar los efectos de dichas moléculas sobre la proliferación/invasión/crecimiento de colonias in vitro, utilizando, por ejemplo, los ensayos en matrigel descritos más abajo y conocidos en la técnica como proveedores de modelos para sistemas de cáncer (véase, p. ej., Bae et al., Breast Cancer Res. Tret. 24(3): 241-55 (1993)).
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Ejemplo 13 Modulación de la invasión por 20P1F12/TMFRSS2
Tal como se describe en los datos proporcionados en este Ejemplo, 20P1F12/TMPRSS2 es una proteasa que exhibe actividades anti-invasivas que son análogas a las observadas con PSA.
A fin de comparar el potencial invasivo de las células tumorales expuestas a 20P1F12/TMPRSS2 en diversos contextos, estas poblaciones se ensayaron para determinar su potencial invasivo utilizando un sistema Transwell Insert System (Becton Dickinson). Siguiendo las instrucciones de los fabricantes, las células se cargaron con un colorante fluorescente, a saber calceína, y se sembraron en placa en el pocillo superior del inserto trans-pocillo. Después se determinó la invasión midiendo la fluorescencia de las células en la cámara inferior en relación con la fluorescencia de la población completa de células. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
En estos experimentos, se confió en los boletines informativos técnicos de Becton Dickinson que describen las cámaras de invasión y ensayo para facilitar el desempeño de los ensayos descritos. Dos boletines informativos relevantes son: (i) Technical Bulletin 427: an improved MATRIGEL Invasion Chamber y (ii) Technical Bulletin 428: A Fluorescence Blocking Membrane Insert Enhances Analysis of Cell Motility Assays, y la información de ambos boletines informativos se utilizó para optimizar nuestro sistema de ensayo. Los materiales comprados fueron (i) insertos FIuoroBlock de 8 micrones y (ii) Matrigel. Los insertos se revistieron con Matrigel, se secaron durante toda la noche y se rehidrataron por un mínimo de 2 horas. Después, por ejemplo según se muestra en la Figura 27, las células PC3 progenitoras y manipuladas genéticamente se marcaron con el indicador fluorescente, calceína, y se incubaron en los insertos revestidos con matrigel. La invasión se detectó midiendo la fluorescencia de las células que migraron desde la cámara superior a través del inserto revestido con matrigel, hasta la cámara inferior. Como control para "recuento total de células" o "invasión total", las células se sembraron en placa directamente en la cámara inferior. La invasión porcentual se calculó mediante la siguiente fórmula: (fluorescencia de las células que migraron al pocillo inferior/fluorescencia de células totales) x 100. Véanse también los procedimientos tratados en Cancer Res. diciembre de 1999 1;59(23):6010-4; Clin Exp Metastasis. Agosto de 1998;16(6):513-28 y J Urol. marzo de 2000;163(3):985-92.
Los ensayos en matrigel in vitro utilizados en la presente memoria son modelos bien conocidos para estudiar la invasión de células de cáncer que se reconoce guardan una correlación con la condición específica de la invasión de células de cáncer (p. ej., el movimiento de las células del cáncer de próstata desde la próstata a los ganglios linfáticos) que sucede en patologías que incluyen cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón, riñón y colon. En consecuencia, este modelo proporciona una herramienta particularmente útil para identificar los mecanismos involucrados en la invasión de células endoteliales y tumorales de membranas basales y para la selección de agentes anti-invasivos.(véase, p. ej., Albini, Pathol. Oncol. Res. 1998, 4(3): páginas 230-241; Hazan et al., J Cell Biol. 21 de febrero de 2000;148(4):779-90 y Xing et al, Endocrinology septiembre de 1999; 140(9):4056-64). En consecuencia este sistema se utiliza ampliamente para evaluar agentes terapéuticos en una gran variedad de cánceres (véase, p. ej., Festuccia et al., Clin. Exp. Metastasis 1998, 16(6): páginas 513-528, Festuccia et al., Oncol. Res. 1999, 11(1): páginas 17-31, Hiscox et al., Clin. Exp. Metastasis 1995, 13(5): páginas 396-404 y Rao et al., J. Neurooncol. 1994, 18(2): páginas 129-138).
En los resultados que se muestran en las Figuras 27A-27C, se ensayaron células PC3 progenitoras y células PC3 que expresan de manera estable 20P1F12/TMPRSS2 para determinar su potencial invasivo utilizando un sistema Transwell Insert System (Becton Dickinson). Las células se cargaron con un colorante fluorescente, a saber calceína, y se sembraron en placa en el pocillo superior del inserto trans-pocillo. La invasión se determinó midiendo la fluorescencia de células en la cámara inferior en relación con la fluorescencia de la población completa de células. Los datos de las Figuras 27A-27C muestran que las células que expresan 20P1F12/TMPRSS2 tienen capacidades invasivas reducidas y proporcionan evidencia de que la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 inhibe la invasión de tumores in vivo.
En los resultados que se muestran en la Figura 28, se muestra que 20P1F12/TMPRSS2 tiene actividad proteolítica. En particular, GST-20P1F12/TMPRSS2 recombinante purificada puede escindir un sustrato universal, a saber caseína, de una manera dependiente de la dosis. Utilizando un kit adquirido en Molecular Probes, (análisis de proteasas EnzChek, catalogo # E-6638) y siguiendo el protocolo del fabricante, se analizó GST-20P1F12/TMPRSS2 recombinante purificada (aa 2S5-492) para determinar la actividad de proteasa utilizando caseína fluorescente marcada con tiocarbamoílo (FTC) como sustrato (Molecular Probes). Se incubaron diferentes dosis de GST-20P1F12/TMPRSS2 a 37ºC con caseína FTC durante un período de 6 horas. Se leyó la fluorescencia a intervalos de 10 minutos utilizando un fluorómetro. Se detecta la ruptura de la caseína por parte de 20P1F12/TMPRSS2 por el aumento de la fluorescencia. El ensayo se realizó por triplicado y se corrió en un período de 6 horas, realizando la lectura cada 10 minutos.
En los resultados que se muestran en la Figura 29, se demuestran los efectos de la proteína de fusión 20P1F12/
TMPRSS2 recombinante purificada sobre la invasión. Células PC3 cargadas con calceína se sembraron en placa en la cámara de invasión en medio solo o en presencia de proteína de fusión de 20P1F12/TMPRSS2 recombinante purificada, p. ej. GST-TMPRSS2 (aa 255-492). Se utilizó GST purificada como control. La invasión se determinó midiendo la fluorescencia de células en la cámara inferior en relación con la fluorescencia de la población completa de células. Los datos de la Figura 29 demuestran cómo el fragmento proteasa de 20P1F12/TMPRSS2 reduce la invasión de células PC3 a través de la matriz extracelular y proporciona evidencia de que el dominio de proteasa de 20P1F12/TMPRSS2 puede inhibir la formación de tumores in vivo.
En los resultados que se muestran en la Figura 30, células PC3 cargadas con calceína se sembraron en placa en la cámara de invasión en medio solo o en presencia de 1 ng/ml de proteína de fusión de 20P1F12/TMPRSS2 recombinante purificada, p. ej. GST-20P1F12/TMPRSS2 (aa 255-492). Se añadió control o mAb anti-20P1F12/TMPRSS2 (1F9) a las muestras indicadas. La invasión se determinó midiendo la fluorescencia de células en la cámara inferior en relación con la fluorescencia de la población completa de células. El ensayo se realizó por triplicado. Los datos de la Figura 30 demuestran cómo un anticuerpo anti-20P1F12/TMPRSS2 puede suprimir la actividad inhibidora de la invasión de 20P1F12/TMPRSS2 y proporciona evidencia confirmatoria de que esta molécula puede inhibir la formación de tumores in vivo.
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Ejemplo 14 Efectos de oligonucleótidos antisentido sobre la expresión de 20P1F12/TMPRSS2
Tal como se observó más arriba, el técnico experto puede generar células knock out in vitro y comparar las células que expresan o carecen de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 con el fin de confirmar el papel de 20P1F12/TMPRSS2 en el avance, invasión y angiogénesis tumoral. Como las células LNCaP se expresan endógenamente y secretan importantes cantidades de proteína 20P1F12/TMPRSS2, se seleccionó esta línea como modelo experimental para los estudios preliminares confirmatorios utilizando morfolino-oligonucleótidos antisentido.
En un primer estudio confirmatorio, demostramos que el 100% de las células expuestas a morfolino-oligonucleótidos retienen estos oligonucleótidos 24 horas después de la carga (Figura 31). En un segundo estudio confirmatorio, demostramos la capacidad de eliminar específicamente la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 de longitud completa en células LNCaP utilizando estos morfolino-oligonucleótidos antisentido (Figura 32, calles 3 y 4).
Este sistema KO in vitro permite comparar directamente células KO antisentido y LNCaP progenitoras utilizando ensayos funcionales, y confirman los resultados generados utilizando otros sistemas modelos. En particular, pueden compararse células LNCaP deficientes en 20P1F12/TMPRSS2 progenitoras y antisentido utilizando el bien descrito sistema transwell por su capacidad para invadir el matrigel. En paralelo, estas células pueden compararse en su capacidad para formar tumores en ratones SCID. También pueden evaluarse utilizando un ensayo de angiogénesis in vitro que mide la proliferación de células endoteliales y la formación de tubos.
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Ejemplo 15 La Expresión Constitutiva de TMPRSS2 en células PC3 Produce un Aumento en la Formación de Tumores Subcutáneos
Métodos: se manipularon genéticamente células PC3 para que expresaran el ADNc de TMPRSS2 por infección utilizando transferencia estándar de genes retrovirales. Como control, se infectó una población separada de células PC3 con una construcción retroviral vacía que solamente contenía el gen de resistencia a la neomicina. Estas poblaciones celulares se seleccionaron para que tuvieran resistencia a fármacos utilizando el análogo de neomicina G418 y se denominan PC3-TMPRSS2 y PC3-neo, respectivamente. La expresión de la proteína TMPRSS2 en células PC3-TMPRSS2 se confirmó mediante análisis de transferencia Western.
Para las inyecciones de células, ambas poblaciones se hicieron crecer en cultivo hasta la fase logarítmica, se cosecharon mediante tripsinización y se re-suspendieron en medio y Matrigel con una dilución de 1:1 y una densidad de 1 x 10^{7} células/ml. Se dividieron ratones SCID machos en 2 grupos (n = 7 por grupo) y se inyectaron en el flanco subcutáneo derecho con 100 microlitros (1 x 10^{6}) de ambas poblaciones celulares. Cuando los tumores se hicieron palpa-
bles, se realizaron dos veces por semana mediciones con calibre que consistieron en longitud X ancho X altura (mm^{3}).
Resultados y Conclusiones: Las mediciones tumorales comenzaron en el día 21, y se realizaron dos veces por semana durante las siguientes 3 1/2 semanas (véase la Figura 37). En los puntos de tiempo iniciales (días 21 y 24) no existieron diferencias en el crecimiento entre los tumores PC3-TMPRSS2 y PC3-neo. Sin embargo, comenzando el día 28, los volúmenes medios tumorales fueron mayores en los ratones inyectados con PC3-TMPRSS2 y continuaron creciendo a mayor ritmo hasta la finalización del experimento (día 45). El incremento en el crecimiento para los ratones inyectados con PC3-TMPRSS2 fue del 25%, 76%, 81%, 100%, 156%, y 102% los días 28, 31, 35, 38, 42 y 45, respectivamente, en comparación con los ratones inyectados con PC3-neo.
El hecho de que el incremento en el porcentaje fue progresivamente mayor en cada punto de tiempo confirma que los tumores que expresan TMPRSS2 mostraron una tasa de crecimiento aumentada. Este experimento se repitió y nuevamente produjo tumores más grandes y una tasa aumentada del crecimiento de PC3-TMPRSS2 en comparación con los tumores PC3-neo.
Esto demuestra que la expresión constitutiva de TMPRSS2 da lugar a crecimiento aumentado y puede estar involucrada en la tumorigénesis en pacientes con cáncer de próstata. Es posible que TMPRSS2, funcionando como proteasa, pueda activar proteolíticamente las proteínas de la superficie celular, componentes de la matriz extracelular o factores de crecimiento, todo lo cual podría potencialmente estimular el crecimiento tumoral. También es posible que la porción de TMPRSS2 que queda sobre la superficie celular, que contiene el dominio LDLRA/SRCR, podría entregar una señal de crecimiento positivo ya sea por sí misma o después de la unión directa a un ligando extracelular. Si el fragmento serina-proteasa de TMRPSS2 facilita la formación tumoral o el crecimiento tumoral, la administración de inhibidores de serina-proteasa puede emplearse para el tratamiento terapéutico.
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Ejemplo 16 Aumento en la Formación de Tumores Subcutáneos LAPC-9 por el MAb 1F9 Anti-TMPRSS2
Métodos: Se ha demostrado previamente que el xenoinjerto de LAPC-9 expresa el ARN y la proteína TMPRSS2 mediante análisis de transferencia Northern y Western, respectivamente. Antes de la inyección de células tumorales LAPC-9 en ratones SCID, se preparó una suspensión de células únicas tal como se describió previamente (Craft et al, Cancer Research, 1999). Se cosecharon los tumores de los ratones SCID, se molieron en trozos muy pequeños utilizando tijeras y fórceps, se lavaron una vez en medio de Iscove, y se digirieron en una solución de pronasa al 1% durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de la digestión, la suspensión de células se lavó dos veces en medio de Iscove que contenía 10% de FBS, después se re-suspendió en medio PrEGM (Clonetics, Walkersville, MD). Después de la incubación durante toda la noche, las células se cosecharon, se lavaron una vez en PrEGM, y después se pasaron a través de un filtro de nylon de 100 micrones para eliminar grandes grumos y desechos. Las células que pasaron a través del filtro se recolectaron, se centrifugaron, se re-suspendieron en medio PrEGM y se contaron antes de la inyección.
Para la inyección subcutánea, se prepararon tumores LAPC-9 en células únicas según se describe más arriba y se mezclaron a una dilución de 1:1 con Matrigel (Collaborative Research, Bedford, MA). Ratones SCID machos recibieron una única inyección subcutánea de 0,5 x 10^{6} células en un volumen de 100 \mul en el flanco derecho. Para probar el efecto de MAb1F9 anti-TMPRSS2 en la formación de tumores, se administraron 500 \mug de anticuerpo purificado mediante inyección intraperitoneal comenzando el mismo día como inyecciones de células tumorales (día 0) y continuando los días 3, 5, 7, 9 y 12. Como control, los ratones inyectados con tumores se inyectaron con FBS (n = 8 para el grupo de FBS; n = 6 para el grupo de 1F9). Se tomaron los tamaños de los tumores sobre tumores palpables mediante mediciones de calibre vernier y se calculó el volumen medio de los tumores como longitud X ancho X altura. Las mediciones de volumen tumoral se registraron rutinariamente 1-2 veces por semana. Se extrajo sangre a los ratones en los puntos de tiempo indicados en la sección de Resultados y se determinaron los niveles medios de PSA circulante en el suero utilizando un kit de ELISA para PSA (Amgen, Toronto, Canadá).
Resultados y Conclusiones: En la Figura 38 se muestra el efecto del MAb 1F9 anti-TMPRSS2 sobre la formación de tumores LAPC-9 en ratones SCID machos inyectados con células tumorales LAPC-9 y 500 microgramos de 1F9. Tanto la tasa de crecimiento tumoral como el tamaño de los tumores LAPC-9 aumentaron en los ratones tratados con anticuerpo 1F9 en comparación con los ratones de control tratados con FBS (Figura 38A). Como correlato independiente del crecimiento tumoral, se determinaron los niveles de PSA circulante en ratones tratados y no tratados. Se observaron niveles de PSA circulante significativamente mayores en los ratones tratados con 1F9 versus los ratones tratados con FBS (Figura 38B). Este experimento se repitió 2 veces más con resultados similares, y sugiere que el tratamiento con 1F9 aumenta la formación de tumores LAPC-9 en ratones SCID.
Los mecanismos para el aumento del crecimiento tumoral mediado por anticuerpos podrían incluir, sin limitación, las siguientes posibilidades. En primer lugar, el anticuerpo puede unirse al dominio serina-proteasa de TMPRSS2 y activar su actividad catalítica, de manera tal que ahora promueve el crecimiento tumoral. En segundo lugar, el anticuerpo, uniéndose al dominio de serina-proteasa de TMPRSS2, podría inhibir posibles interacciones con un inhibidor de la serina-proteasa (p. ej., serpina) tornando de este modo a TMPRSS2 constitutivamente activa. En tercer lugar, el anticuerpo puede secuestrar el dominio de proteasa de TMPRSS2 en o cerca de la superficie de la célula tumoral, permitiéndole catalizar su sustrato (p. ej., un factor de crecimiento) que después estimule el crecimiento tumoral.
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Ejemplo 17 Reconocimiento del dominio TMPRSS2 LDLRA/SRCR en células LNCaP por anticuerpos policlonales de ratón
Se utilizó suero de tres ratones inmunizados con proteína del dominio Tag5 TMPRSS2 LDLRAISRCR (aminoácidos 111-255) para teñir células LNCaP que expresan TMPRSS2, y células 293T que carecen de expresión de TMPRSS2. Se incubaron las células LNCaP y 293T con dilución 1:50 de suero de ratón pre-inmune (línea clara) o suero anti-LDLRAISRCR (línea oscura), se lavaron y después se incubaron con una dilución 1:200 de anticuerpo secundario conjugado con IgG FITC anti-ratón de cabra. Después del lavado, se analizaron 5.000 células para tinción fluorescente en el citómetro de flujo Coulter Epics XL. Los cambios fluorescentes específicos de la población teñida con anti-LDLRAISRCR en Células LNCaP se indican con flechas en comparación con suero pre-inmune, pero no en células 293T.
Estos datos indican dos hallazgos: 1) que el dominio LDLRA/SRCR se expresa sobre la superficie de las células LNCaP y 2) que pAb LDLRA/SRCR anti-TMPRSS2 específicamente reconoce este dominio sobren la superficie de estas células.
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Ejemplo 18 Títulos relativos de anticuerpos LDLRA/SRCR anti-TMPRSS2 en suero humano
Se analizaron muestras clínicas de suero de 28 individuos normales y 40 pacientes con cáncer de próstata para determinar la presencia de anticuerpos reactivos ante dominios LDLRA/SRCR de TMPRSS2 mediante ELISA. En resumen, la proteína Tag5 purificada que codifica los aminoácidos 111-255 de TMPRSS2, que contiene los dominios LDLRA y SRCR, se diluyó en tampón de carbonato 50 mM (pH 9.6) y se utilizó para cubrir una placa de ELISA durante toda la noche a razón de 100 ng/pocillo. Los pocillos después se bloquearon durante 2 horas a 37ºC con FBS que contenía 2% de BSA. Después se añadieron 50 \muI de suero diluido 1:100 en FBS que contenía 1% de BSA por triplicado a los pocillos revestidos con la proteína Tag5 así como a pocillos bloqueados con BSA no revestidos y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Los pocillos se lavaron 4 veces con FBS que contenía Tween-20 al 0,2% (FBS-T) y se incubaron con 50 \mul de una dilución 1:5.000 de anticuerpo secundario Ig marcado con HRP anti-humano de cabra en FBS-T que contenía 1% de BSA. Los pocillos después se lavaron nuevamente 4 veces y después se desarrollaron con sustrato de TMB (200 ul/pocillo). La reacción se interrumpió mediante la adición de 50 \mul de (H_{2}SO_{4}) 1M y se determinó la densidad óptica (DO) de los pocillos a 450 nM. Se determinaron los títulos relativos (Figura zA) de las muestras de suero sustrayendo la DO media de los pocillos no revestidos (fondo) de los pocillos revestidos con la proteína Tag5 y después normalizando la DO a una curva estándar en cada placa obtenida utilizando varias diluciones de un pAb de ratón dirigido al dominio LDLRA/SRCR.
El título medio de la población de sueros de cáncer de próstata fue 4,27X10^{-5} \pm 2,80X10^{-5} (media\pmDE) que fue significativamente diferente del de la población normal, 2,58X10^{-5} \pm+ 3,08X10^{-5} (*P=0,0152, ensayo t de 2 colas), tal como se describe en la Figura zB. Como observación, los valores negativos del título surgieron del hecho de que la ordenada al origen de la curva estándar fue mayor que 0 y mayor que la DO de una muestra experimental.
Estos datos indican que la proteína TMPRSS2 es inmunogén. Por otra parte, los pacientes con cáncer de próstata expresan niveles incrementados de anticuerpos anti-dominio LDLRAISRCR en comparación con las personas normales. De este modo, los pacientes con cáncer de próstata pueden tener una respuesta inmune humoral elevada a la proteína TMPRSS2 expresada en el tejido canceroso. Por consiguiente, el dominio LDLRA/SRCR se utiliza como blanco terapéutico y/o diagnóstico para cánceres que expresan TMPRSS2, tales como cáncer de próstata. Por otra parte, los títulos séricos de anticuerpos anti-dominio LDLRA/SRCR se utilizan como modalidad diagnóstica para cánceres que expresan TMPRSS2, tales como cáncer de próstata.
Tablas 
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TABLA 1 Tinción inmunohistoquímica de tejidos humanos con anticuerpo monoclonal anti-TMPRSS2 
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1
TABLA 2 Mapeo de Epitopos de mAbs anti-TMPRSS2
2 
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Una reducción en la intensidad de la señal del anticuerpo biotinilado en presencia de un exceso de anticuerpo no marcado indica que el mAbs compite por los mismos sitios o sitios de unión superpuesta (se muestran en negrita). Tal como se indica en la Tabla 2, se observa una reducción en la intensidad de la señal del IF9 biotinilado (1F9-B) en presencia de los mAbs 2D10, 3G3 y 6B11, y él mismo, pero no por 2F8, 8C6 y 9G8. Estos resultados indican que los mAbs IF9, 2D10, 3G3, 6B11 comparten el mismo epitopo (o se superponen) que es distinto de los de 2F8, 8C6 y 9G8. MAb 2F8-B compite consigo mismo y con los mAbs 8C6 y 9G8 indicando que estos mAbs comparten el mismo epitopo o epitopos superpuestos. MAb 8C6-B compite consigo mismo y moderadamente con mAb 2F8. En resumen, estos resultados indican que el panel de anticuerpos anti-TMPRSS2 reconoce diferentes epitopos dentro del dominio de proteasa de TMPRSS2.
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TABLA III Abreviaturas de aminoácidos
3
4 
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TABLA IV (A)
5
Los residuos en negrita son los preferidos, los restos en cursiva son menos preferidos: Se considera que un péptido es portador de motivos si posee anclas primarias en cada posición de ancla primaria para un motivo o supermotivo según se especifica en la tabla anterior.
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TABLA IV (B) Supermotivo clase II HLA
6
TABLA IV (C)
7
TABLA IV D
8
TABLA IV (E)
9
TABLA IV (E) (continuación)
10
TABLA IV (E) (continuación)
11
TABLA IV (E) (continuación)
12
TABLA IV (E) (continuación)
13
A lo largo de la presente solicitud, se hace referencia a diversas publicaciones, sitios web, patentes y solicitudes de patentes. (Se hace referencia a los sitios web mediante sus direcciones de Localizador Uniforme de Recurso, o URL, en la Red Global Mundial.)

Claims (13)

1. Un método para detectar el cáncer de vejiga en un individuo que comprende:
evaluar el nivel de expresión de un producto génico 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica;
evaluar el nivel de expresión de un producto génico 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra normal correspondiente; y
comparar el nivel de expresión del producto génico en la muestra biológica respecto del de la muestra normal correspondiente, en donde el producto génico es una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:2 o un ARNm que codifica la secuencia de aminoácidos, y en donde un incremento en los niveles de expresión del producto génico en la muestra biológica en comparación con la correspondiente muestra normal es indicativo de cáncer de vejiga.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ARNm es complementario a la secuencia codificadora de SEC ID NO: 1.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde se evalúa el nivel de expresión de la proteína en la muestra biológica observando la presencia o ausencia de un complejo inmunorreactivo que comprende la proteína y un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo.
4. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde se evalúa el nivel de expresión del producto génico por un método seleccionado de análisis Southern, análisis Northern, análisis por reacción en cadena de la polimerasa e inmunoensayo.
5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde se evalúa el nivel de expresión de la proteína en la muestra biológica por un inmunoensayo que mide una concentración de una proteína libre, una concentración de la proteína complejada con un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, o una relación que compara una concentración de una proteína libre con una concentración de la proteína complejada con un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la muestra biológica se selecciona de sangre, suero, materia fecal, orina, semen y tejido biopsiado.
7. Una composición inmunogén para el uso en la inhibición del crecimiento de un cáncer de vejiga, en donde la composición inmunogén comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2 o una porción inmunogén de la misma, o un vector que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la SEC. ID NO: 2;
y un vehículo fisiológicamente aceptable, en donde la composición inmunogén es capaz de provocar una respuesta inmune de un mamífero.
8. La composición inmunogén de la reivindicación 7, en donde la porción inmunogén de la misma comprende los aminoácidos 255-492 de la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 2.
9. La composición inmunogén de una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, en donde el vector es un vector viral.
10. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2, acoplado a un agente citotóxico para el uso en el tratamiento del cáncer de vejiga.
11. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se une a un epitopo dentro de un dominio de la proteína predominantemente asociado a la superficie celular.
12. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el epitopo comprende los aminoácidos 255-492 de la secuencia expuesta en SEC ID NO: 2.
13. Un método para inhibir el crecimiento de una célula neoplásica de vejiga in vitro que comprende poner en contacto la célula neoplásica de vejiga con un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2, acoplada a un agente citotóxico.
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