ES2317846T3 - Antigeno transmembranal de lectina tipo c en el cancer de prostata humano y usos del mismo. - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido que codifica un polipéptido de la PC-LECTINA, en el que el polinucleótido se selecciona de entre el grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que comprende el Id. de Sec. Nº 1, en el que T puede también ser U; (b) un polinucleótido que comprende el Id. de Sec. Nº 1, desde el residuo de nucleótido número 201 hasta el residuo de nucleótido número 2378, en el que T puede también ser U; y (c) un polinucleótido que codifica una proteína PC-LECTINA que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. Nº

Description

Antígeno transmembranal de LECTINA tipo C en el cáncer de próstata humano y usos del mismo.

Campo de la invención

La invención aquí descrita está relacionada con un nuevo gen y la proteína que codifica, denominada PC-LECTINA, y con los métodos y composiciones diagnósticas y terapéuticas útiles en la gestión de diferentes cánceres que expresan la PC-LECTINA, en particular los cánceres de próstata.

Antecedentes de la invención

El cáncer es la segunda causa de muerte en humanos, después de las enfermedades coronarias. A nivel mundial, millones de personas mueren de cáncer cada año. Sólo en los Estados Unidos, el cáncer causa la muerte de más de medio millón de personas anuales, con alrededor de 1,4 millones de nuevos casos diagnosticados cada año. Mientras las muertes por enfermedades coronarias han disminuido significativamente, las resultantes de cáncer en general están aumentando. En la primera parte del próximo siglo, se prevé que el cáncer se convertirá en la principal causa de muerte.

A nivel mundial, varios cánceres destacan como los más mortíferos. En particular, los carcinomas de pulmón, próstata, mama, colon, páncreas y ovario representan las causas principales de muerte por cáncer. Estos, y virtualmente todos los demás carcinomas, comparten la característica común de la letalidad. Con muy pocas excepciones, la enfermedad metastática originada a partir de un carcinoma es fatal. Además, incluso en los pacientes de cáncer que inicialmente sobreviven a sus tumores primarios, la experiencia general demuestra que sus vidas se ven alteradas de forma dramática. Muchos pacientes de cáncer experimentan una gran ansiedad causada por el hecho de ser conscientes de una posible recidiva o fallo del tratamiento. Muchos pacientes de cáncer experimentan una debilitación física tras el tratamiento. Muchos pacientes de cáncer experimentan una recidiva.

A nivel mundial, el cáncer de próstata es el cuarto cáncer más prevalente en los hombres. En América del norte y Europa del norte, es de lejos el más común de los cánceres en los hombres y es la segunda causa de muerte por cáncer en los hombres. Sólo en los Estados Unidos, mueren más de 40.000 hombres anualmente de esta enfermedad, detrás sólo del cáncer de pulmón. A pesar de la magnitud de estos datos, no existe aún un tratamiento efectivo para el cáncer de próstata metastático. La prostatectomía quirúrgica, la terapia de radiación, la terapia de ablación hormonal y la quimioterapia continúan siendo las principales modalidades de tratamiento. Desgraciadamente, estos tratamientos no son efectivos para muchos y a menudo se asocian con consecuencias no deseadas.

En el frente diagnóstico, la falta de un marcador de tumor de próstata que pueda detectar de forma precisa tumores en fase temprana localizados sigue siendo una limitación significativa en el manejo de esta enfermedad. Aunque el ensayo de PSA en suero ha sido una herramienta muy útil, se considera en general que su especificidad y utilidad general tienen carencias en varios aspectos importantes.

El progreso en la identificación de marcadores específicos adicionales del cáncer de próstata ha mejorado gracias a la generación de xenoinjertos de cáncer de próstata que pueden recapitular diferentes fases de la enfermedad en ratones. Los xenoinjertos LAPC (Cáncer de próstata de Los Angeles) son xenoinjertos de cáncer de próstata que han sobrevivido al pase en varios ratones con deficiencia inmune combinada severa (SCID) y muestran la capacidad de mimetizar la progresión de la enfermedad, lo que incluye la transición de dependencia de los andrógenos a independencia de los andrógenos y el desarrollo de lesiones metastáticas (Klein et al., 1997, Nat. Med. 3:402). Los marcadores de cáncer de próstata identificados más recientemente incluyen PCTA-1 (Su et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7252), antígeno de células madre de próstata (PSCA) (Reiter et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1735), y STEAP (Hubert et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:14523).

Aunque los marcadores identificados previamente, como PSA, PSM, PCTA y PSCA han facilitado los esfuerzos para diagnosticar y tratar el cáncer de próstata, sigue siendo necesaria la identificación de marcadores adicionales y dianas terapéuticas del cáncer de próstata y otros relacionados para mejorar aún más su diagnóstico y terapia.

Su et al. (PNAS Vol. 93 págs.7252-7257) describe el gen de un antígeno tumoral del carcinoma de próstata humano PCTA-1, que es miembro de la familia de genes de la galectina.

La Publicación PCT Nº WO 00/39296 describe un polipéptido denominado "ss3939" y los ácidos nucleicos que codifican dichos polipéptidos, que puede utilizarse para identificar proteínas portadoras de un dominio lectina de tipo C.

La Publicación PCT Nº WO 00/56889 describe la identificación y caracterización de un polipéptido que posee homología con una proteína lectina y que se denomina "PRO1890"

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Resumen de la invención

La presente invención en general está relacionada con un nuevo antígeno transmembranal sobreexpresado en el cáncer de próstata humano, denominado PC-LECTINA. El antígeno PC-LECTINA está relacionado estructuralmente con la layilina de hámster (Borowsky y Hynes, J. Cell Biol. 143:429-42, 1998), un miembro de la familia de las proteínas lectina tipo C. No obstante, la PC-LECTINA no contiene el dominio funcional de asociación a talina hallado en la layilina, y por lo tanto probablemente posee una función diferente o modificada. Las características estructurales de la PC-LECTINA la identifican como una proteína transmembranal de tipo 1ª, con un extremo extracelular y un extremo C-terminal intracelular. Además, el producto génico de la PC-LECTINA contiene una secuencia señal en N-terminal. La topología transmembranal de la proteína PC-LECTINA también se ha determinado experimentalmente.

La distribución de la expresión génica de PC-LECTINA en tejidos humanos normales está altamente restringida a los testículos normales. En el cáncer de próstata humano, el gen de la PC-LECTINA está altamente sobreexpresado, pero no se detecta expresión de este gen en próstata normal. El gen de la PC-LECTINA codifica por lo tanto un antígeno de tumor de próstata, que es útil como marcador diagnóstico y/o pronóstico, y/o que puede servir como una diana excelente para diferentes aproximaciones terapéuticas como terapias con anticuerpos, vacunas y terapias con moléculas pequeñas.

Funcionalmente, la PC-LECTINA puede estar involucrada en la invasión, adhesión o migración. El antígeno de PC-LECTINA, como la propia lectina, se une a porciones azúcar, lo que proporciona otra oportunidad para las aproximaciones terapéuticas. En una aproximación, se pueden utilizar moléculas de carbohidrato para inhibir la actividad biológica de la PC-LECTINA. La expresión limitada de la PC-LECTINA al tejido inmunoprivilegiado de los testículos (en el que existe una barrera hemato-testicular) sugiere que los efectos colaterales negativos de las estrategias terapéuticas inmunológicas y otras estrategias específicas de la PC-LECTINA (por ejemplo, inhibición mediante carbohidratos) serán mínimos. Dado el elevado nivel de expresión observado en el cáncer de próstata, es posible que la PC-LECTINA también se exprese en otros cánceres humanos, y por lo tanto, del mismo modo puede ser útil como marcador diagnóstico y/o pronóstico de estos otros cánceres, y/o puede utilizarse como diana antigénica del tumor en el tratamiento de estos otros cánceres. La PC-LECTINA también puede liberarse al suero tras su unión a ligando o activación, tal como se ha observado con varios receptores conocidos, lo que incluye la L-selectina (para una revisión, véase: Tedder et al., 1991, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 5:305-306), lo que proporciona la posibilidad de utilizar la detección en suero y métodos diagnósticos relacionados. Los niveles basales de PC-LECTINA se espera que sean bajos o nulos a causa de la barrera hemato-testicular y de la ausencia de expresión en otros tejidos normales, lo que sugiere que la detección de PC-LECTINA en suero correlacionaría de forma específica con la presencia de un tumor.

La invención proporciona polinucleótidos que corresponden o son complementarios con todo o parte de los genes, mRNA, y/o secuencias codificantes de PC-LECTINA, preferiblemente en forma aislada, lo que incluye los polinucleótidos que codifican las proteínas PC-LECTINA y fragmentos de las mismas, DNA, RNA, híbridos DNA/RNA y moléculas relacionadas, polinucleótidos u oligonucleótidos complementarios a los genes de PC-LECTINA o secuencias de mRNA o partes de las mismas, y polinucleótidos u oligonucleótidos que hibridan con los genes de o mRNA de PC-LECTINA, o con polinucleótidos que codifican PC-LECTINA. También se describen los medios para aislar los cDNA y genes que codifican la PC-LECTINA. También se describen las moléculas de DNA recombinante que contienen polinucleótidos de PC-LECTINA, las células transformadas o transducidas con tales moléculas y los sistemas de vectores huésped para la expresión de los productos génicos de PC-LECTINA.

La invención también describe las proteínas PC-LECTINA y fragmentos de polipéptido de las mismas, así como anticuerpos que se unen a las proteínas PC-LECTINA y los fragmentos de polipéptido de las mismas. Los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos murinos y de otros mamíferos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y totalmente humanos, anticuerpos marcados con un marcador detectable, y anticuerpos conjugados con radionúcleos, toxinas u otras composiciones terapéuticas.

La invención también describe los métodos para detectar la presencia de polinucleótidos y proteínas PC-LECTINA en varias muestras biológicas, así como métodos para la identificación de células que expresan PC-LECTINA. La invención también describe varias composiciones y estrategias terapéuticas, para el tratamiento del cáncer de próstata, lo que incluye particularmente, terapias con anticuerpos, vacunas y terapia con moléculas pequeñas.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1A-1D. Secuencias de nucleótidos (Id. de Sec. Nº 1) y aminoácidos deducidos (Id. de Sec. Nº 2) del cDNA completo que codifica el gen de la PC-LECTINA. La metionina inicial y la presunta secuencia Kozak se indican en negrita, la secuencia señal N-terminal se encuentra enmarcada, los dominios de lectina tipo-C están enmarcados y sombreados y el dominio transmembrana está subrayado.

Fig. 2A. Alineamiento de las secuencias de aminoácidos de la PC-LECTINA humana (Id. de Sec. Nº 2) con la secuencia descrita de la layilina de hámster (Id. de Sec. Nº 3; Borowsky y Hynes, J. Cell Biol.. 143:42-42,1998).

Fig. 2B-2C. Alineamiento de la secuencia de nucleótidos del cDNA de PC-LECTINA humana (Id. de Sec. Nº 4) con la secuencia de cDNA descrita de la layilina de hámster (Id. de Sec. Nº 5; Borowsky y Hynes, J. Cell Biol. 143:42-42,1998) (utilizando LALIGN del BCM Search Launcher).

Fig. 3A Análisis RT-PCR de la expresión génica de PC-LECTINA en xenoinjertos de cáncer de próstata, próstata normal, y otros tejidos y líneas celulares, mostrando expresión en xenoinjertos de cáncer de próstata. Carril 1 es cerebro, el carril 2 es próstata, el carril 3 es LAPC-4 AD, el carril 4 es LAPC-4 AI, el carril 5 es LAPC-9 AD, el carril 6 es LAPC-9 AI, el carril 7 es células HeLa; y carril 8 es un control negativo.

Fig. 3B. Análisis RT-PCR de la expresión génica de PC-LECTINA en varios tejidos, mostrando el nivel de expresión en placenta tras 30 ciclos. El carril 1 es cerebro, el carril 2 es corazón, el carril 3 es riñón, el carril 4 es hígado, el carril 5 es pulmón, el carril 6 es páncreas, el carril 7 es placenta y el carril 8 es músculo esquelético.

Fig. 3C. Análisis RT-PCR de la expresión génica de PC-LECTINA en próstata normal y otros tejidos, que muestra una expresión en testículos normales sólo tras 25 ciclos de amplificación, y un bajo nivel de expresión en próstata y bazo tras 30 ciclos. El carril 1 es colon, el carril 2 es ovario, el carril 3 es leucocitos, el carril 4 es próstata, el carril 5 es intestino delgado, el carril 6 es bazo, el carril 7 testículos y el carril 8 es timo.

Fig. 4A Análisis de Northern blot de la expresión de PC-LECTINA en diferentes tejidos humanos normales, que no muestra expresión de la PC-LECTINA en estos tejidos normales. El carril 1 es corazón, el carril 2 es cerebro, el carril 3 es placenta, el carril 4 es pulmón, el carril 5 es hígado, carril 6 es músculo esquelético, el carril 7 es riñón y el carril 8 es páncreas.

Fig. 4B. Análisis de Northern blot de la expresión de la PC-LECTINA en diferentes tejidos humanos normales, que muestra una expresión específica de testículos de la PC-LECTINA en tejidos normales. El carril 1 es bazo, el carril 2 es timo, el carril 3 es próstata, el carril 4 es testículo, el carril 5 es ovario, el carril 6 es intestino delgado, el carril 7 es colon y el carril 8 leucocitos.

Fig. 4C. Análisis de Northern blot de la expresión de PC-LECTINA en xenoinjertos de cáncer de próstata, mostrando alto nivel de expresión en todos los xenoinjertos de cáncer de próstata, con niveles de expresión extremadamente altos en el xenoinjerto de tumor de próstata metastático avanzado LAPC-9 AD. El carril 1 es LAPG-4 AD, el carril 2 es LAPC-4 AI, el carril 3 es LAPC-9 AD y el carril 4 es LAPC-9 AI.

Fig. 5. Análisis de Northern blot de PC-LECTINA en xenoinjertos de cáncer de próstata utilizando una sonda de fragmento de SSH. Los resultados muestran que la PC-LECTINA está altamente expresada en tumores que se desarrollan tanto subcutáneamente (sc) como intratibialmente (it) dentro del hueso de ratón. Los carriles 1-3 son LAPC-9 AD sc y los carriles 4-6 son LAPC-9AD it.

Fig. 6. Análisis de Northern blot de la expresión de PC-LECTINA/58P1D12 en tumores en machos 28 días tras la castración (carril 2) comparada con la expresión en tumores de machos intactos (carril 1). La expresión está dramáticamente reducida en los tumores de machos castrados. Como control, se utilizó la expresión de un gen conocido regulado por andrógenos, TMPRSS2, que también se encuentra infraexpresado tras la castración. Estos datos sugieren que la expresión de PC-LECTINA en los tumores de próstata depende de la presencia de andrógenos.

Fig. 7. Localización del antígeno PC-LECTINA en la superficie celular. Se muestra una fotografía de un análisis de western blot expuesto de células 293T con la superficie celular biotinilada, purificadas con sefarosa-estreptavidina, transfectadas con un vector que contiene cDNA que codifica una PC-LECTINA con una cola de 6-His (carril 2) utilizando un anticuerpo monoclonal anti-His. La proteína PC-LECTINA no se detectó en los precipitados de estreptavidina de las células no biotiniladas transfectadas con el mismo vector (carril 1). Los marcadores de peso molecular se indican en kilodalton (kD).

Fig. 8A. Análisis de Western blot que muestra que los anticuerpos anti-HIS reconocen la proteína de fusión recombinante PC-LECTINA/58P1D12-FA secretada en medio acondicionado. Los carriles contienen 20 \mul de medio acondicionado de células 293T no modificadas o células 293T transfectadas con PC-LECTINA/58P1D12-FA recogido 4 horas después de un cambio de medio.

Fig. 8B. Análisis de Western blot que muestra que los anticuerpos anti-fosfatasa alcalina también reconocen la proteína de fusión recombinante PCLECTIN/58P1D12-FA secretada en medio acondicionado. Los carriles contienen 20 \mul de medio acondicionado de células 293T no modificadas o células 293T transfectadas con PC-LECTINA/58P1D12-FA recogido 4 horas después de un cambio de medio, como en la Fig. 8A.

Fig. 9A Expresión y purificación del dominio extracelular de la PC-LECTINA. Las células 293T se transfectaron con un vector de expresión de secreción Tag5 que codifica el dominio extracelular de PC-LECTINA con una cola C-terminal 6X His. El medio acondicionado se sometió a una cromatografía de afinidad con metal inmovilizado utilizando agarosa Ni-NTA (Qiagen). El medio acondicionado de partida, el filtrado, y el material purificado eluido se sometieron a una electroforesis en un gel de SDS-PAGE al 10-20% y se tiñó con tinción de plata.

Fig. 9B. Medio acondicionado de células 293T transfectadas, como el que se describe en la Fig. 9ª, se cargó en un gel SDS-PAGE al 10-20%, se transfirió a una membrana de nitrocelulosa y se sometió a un análisis de western blot utilizando un pAb anti-His.

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Fig. 10A. Inmunoprecipitación de PC-LECTINA a partir de células Rat1-PC-LECTINA. Las células Rat1 infectadas de forma estable con virus control neo o virus que codifican la PC-LECTINA se sometieron a una inmunoprecipitación con suero de ratones inmunizados con proteína purificada Tag5-PC-LECTINA. El análisis de Western blot se llevó a cabo con un pAb de conejo purificado por afinidad frente al péptido PC-LECTINA.

Fig. 10B. Inmunoprecipitación de PC-LECTINA a partir de células Rat1-PC-LECTINA, como se describe en la Fig. 10A, con la excepción de que el análisis de Western blot se realizó con una dilución 1:1000 de suero de ratón inmunizado.

Fig. 11. Expresión de la PC-LECTINA en líneas celulares recombinantes y testículos. Los lisados celulares de células 293T transfectadas de forma transitoria con pCDNA3.1 Myc/His PC-LECTINA o vector vacío, de células Rat1 infectadas de forma estable con control neo o retrovirus PC-LECTINA y de testículos normales se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa para un análisis de western. Se indican con flechas la banda de 47 kD que representa la PC-LECTINA completa, el dominio extracelular de 40 kD y la proteína con una cola de Myc/His de 55 kD.

Fig. 12. Reconocimiento en la superficie celular de la PC-LECTINA en células Rat1 con suero de ratón inmunizado con Tag5 PC-LECTINA utilizando citometría de flujo. Se incubaron las células Rat1-neo (área clara) o las células Rat1-PC-LECTINA (5 X 10^{5}; área sombreada) con una dilución 1:2000 de suero de ratón inmunizado con Tag5 PC-LECTINA. Se analizó la tinción de la superficie celular con PC-LECTINA en 3.000 células de cada muestra mediante citometría de flujo. El número de eventos se representa en función de la fluorescencia relativa.

Fig. 13. Análisis inmumohistoquímico de células 293T transfectadas con PC-LECTINA marcadas con anticuerpo policlonal de conejo, que muestra expresión de PC-LECTINA en la superficie celular. El anticuerpo no tiñe las células 293T parentales.

Fig. 14. Expresión de PC-LECTINA analizada utilizando un dot blot de RNA multitejido (50 muestras). Los resultados muestran una expresión significativa de 58P1D12 sólo en testículos. También se detectó una menor expresión en glándulas salivales, riñón fetal y bazo fetal. El análisis también muestra señales extrañas en otras áreas, que son probablemente inespecíficas ya que aparecen entre las filas y columnas de las señales especificas. Las posiciones representan los siguientes tejidos: A1 cerebro; A2 amígdala; A3 núcleo caudal; A4 cerebelo; A5 córtex cerebral; A6 lóbulo frontal; A7 hipocampo; A8 medulla oblongata; B1 lóbulo occipital; B2 putamen; B3 substantia nigra; B4 lóbulo temporal; B5 tálamo; B6 núcleo subtalámico; B7 médula espinal; C1 corazón; C2 aorta; C3 músculo esquelético; C4 colon; C5 vejiga, C6 útero; C7 próstata; C8 estómago; D1 testículos; D2 ovario; D3 páncreas; D4 glándula pituitaria; D5 glándula adrenal; D6 glándula tiroides; D7 glándula salival; D8 glándula mamaria; E1 riñón; E2 hígado, E3 intestino delgado; E4 bazo; E5 timo; E6 leucocitos periféricos; E7 nódulo linfático; E8 médula ósea; F1 apéndice; F2 pulmón; F3 tráquea; F4 placenta; G1 cerebro fetal; G2 corazón fetal; G3 riñón fetal, G4 hígado fetal, G5 bazo fetal; G6 timo fetal y G7 pulmón fetal.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona un nuevo antígeno transmembranal, denominado PC-LECTINA, que se sobreexpresa en el cáncer de próstata y es un miembro de la familia de proteínas lectina de tipo C. La expresión en tejidos adultos normales está limitada a los testículos. Se encontró expresión en xenoinjertos de cáncer de próstata, con niveles superiores en los xenoinjertos de cáncer de próstata dependiente de andrógeno y niveles inferiores en los xenoinjertos independientes de andrógenos. Este patrón de expresión sugiere que la expresión de PC-LECTINA en los tumores de próstata es dependiente de la presencia de andrógenos. La PC-LECTINA también muestra una especificidad de unión a carbohidratos similar a la observada para la lectina Concanavalina A.

A no ser que se defina de otro modo, todos los términos de la materia, notaciones y otra terminología científica utilizada aquí pretende tener el significado que comúnmente entiende un experto en la materia en la que esta invención se engloba. En algunos casos, los términos con un significado que comúnmente se entiende, se definen aquí para mayor claridad y/o como rápida referencia, y la inclusión de tales definiciones no necesariamente debe constituir una diferencia sustancial frente a lo que generalmente se entiende en la materia. Las técnicas y procedimientos descritos o referenciados aquí son bien conocidas en general y son comúnmente utilizadas por los expertos en la materia utilizando metodología convencional, como, por ejemplo, las metodologías de clonaje molecular ampliamente utilizadas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2ª edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Según sea apropiado, los procedimientos que implican la utilización de equipos y reactivos disponibles comercialmente se realizan generalmente de acuerdo con los protocolos y/o parámetros definidos por el fabricante a no ser que se indique de otro modo.

Como se utilizan aquí, los términos "cáncer de próstata avanzado", "cáncer de próstata localmente avanzado", "enfermedad avanzada" y "enfermedad localmente avanzada" significan cánceres de próstata que se han extendido a través de la cápsula de la próstata, y pretenden incluir enfermedad en estadío C según el sistema de la American Urological Association (AUA), enfermedad en estadío C1 C2 según el sistema Whitmore-Jewett, y enfermedad en estadío T3-T4 y N+ según el sistema TNM (tumor, nodo, metástasis). En general, la cirugía no está recomendada para los pacientes con enfermedad localmente avanzada, y estos pacientes tienen evoluciones sustancialmente menos favorables comparado con los pacientes con cáncer de próstata clínicamente localizado (confinado a un órgano). La enfermedad localmente avanzada se identifica clínicamente mediante la evidencia palpable de induración tras el borde lateral de la próstata, o de asimetría o induración por encima de la base de la próstata. El cáncer de próstata localmente avanzado se diagnostica en la actualidad patológicamente tras una prostatectomía radical si el tumor invade o penetra en la cápsula prostática, se extiende al margen quirúrgico o invade las vesículas seminales.

Como se utilizan aquí, los términos "cáncer de próstata metastático" y "enfermedad metastática" significan cánceres de próstata que se han extendido a nódulos linfáticos regionales o a puntos distantes, y pretenden incluir la enfermedad en estadío D según el sistema de la AUA y en estadío TxNxM+ según el sistema TNM. Como en el caso del cáncer de próstata localmente avanzado, la cirugía generalmente no está indicada para los pacientes con enfermedad metastática, y la terapia hormonal (ablación de andrógenos) es la modalidad de tratamiento preferible. Los pacientes con cáncer de próstata metastático finalmente desarrollan un estado refractario a los andrógenos entre 12 y 18 meses tras la iniciación del tratamiento, y aproximadamente la mitad de estos pacientes mueren dentro de los 6 meses siguientes. El punto más frecuente de metástasis del cáncer de próstata es el hueso. Las metástasis en hueso del cáncer de próstata son, en balance, característicamente osteoblásticas en lugar de osteolíticas (es decir, resultan en una formación neta de hueso). Las metástasis en hueso se encuentran más frecuentemente en la columna vertebral, seguido del fémur, pelvis, caja torácica, cráneo y húmero. Otros puntos comunes de metástasis incluyen los nódulos linfáticos, pulmón, hígado y cerebro. El cáncer de próstata metastático normalmente se diagnostica mediante una linfadenectomía pélvica abierta o laparoscópica, escaneo con radionúcleos de cuerpo completo, radiografía esquelética y/o biopsia de una lesión ósea.

Como se utiliza aquí, el término "polinucleótido" significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases o pares de bases de longitud, tanto ribonucleótidos como desoxinucleótidos, o una forma modificada de cada tipo de nucleótido, y pretende incluir formas de DNA de cadena sencilla y doble.

Como se utiliza aquí, el término "polipéptido" significa un polímero de al menos 10 aminoácidos. A lo largo de la especificación, se utilizan las designaciones estándar de tres letras o de una letra para los aminoácidos.

Como se utiliza aquí, los términos "hibridar", "hibridación", "hibrida" y similares, utilizados en el contexto de polinucleótidos, pretenden significar las condiciones de hibridación convencionales, preferiblemente como la hibridación en formamida 50%/6X SSC/SDS 0,1%/ssDNA 100 \mug/ml, en las que las temperaturas de hibridación están por encima de 37ºC y las temperaturas de lavado en 0,1X SSC/SDS 0,1% están por encima de 55ºC, y más preferiblemente a condiciones de hibridación astringentes.

La "astringencia" de las reacciones de hibridación puede determinarla fácilmente un experto en la materia, y generalmente es un calculo empírico que depende de la longitud de la sonda, temperatura de lavado y concentración de sales. En general, las sondas de mayor longitud requieren temperaturas superiores para una hibridación adecuada, mientras las sondas de menor longitud necesitan temperaturas más bajas. La hibridación generalmente depende de la capacidad del DNA desnaturalizado de rehibridar cuando están presentes cadenas complementarias en un ambiente por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor es el grado de homología deseado entre la sonda y la secuencia a la que se hibrida, mayor es la temperatura relativa que puede utilizarse. Como resultado, se deduce que las temperaturas relativas mayores tenderán a generar unas condiciones de reacción más astringentes, mientras temperaturas menores lo serán menos. Para más detalles y una explicación de la astringencia de las reacciones de hibridación, véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

Las "condiciones astringentes" o "condiciones de elevada astringencia", como se define aquí, pueden identificarse con aquellas que: (1) utilizan una baja fuerza iónica y elevada temperatura de lavado, por ejemplo cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/dodecilsulfato sódico al 0,1% a 50ºC; (2) utilizan durante la hibridación un agente desnaturalizante, como la formamida, por ejemplo, 50% (v/v) formamida con albúmina sérica bovina al 0,1%/Ficoll 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC; o (3) utilizan formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), 50 mM fosfato sódico (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, solución de Denhardt 5 x, DNA de esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), SDS 0,1% y 10% dextransulfato a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro sódico/citrato sódico) y formamida al 50% a 55ºC, seguido de lavado de alta astringencia que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.

Las "condiciones moderadamente astringentes" pueden identificarse como se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen la utilización de solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos astringentes que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente astringentes es la incubación durante toda la noche a 37ºC en una solución que comprende: formamida al 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5 x, dextransulfato al 10%, y 20 mg/ml DNA de esperma de salmón desnaturalizado mecánicamente, seguido de lavado de los filtros en 1 x SSC a alrededor de 37-50ºC. El experto en la materia sabrá como modificar la temperatura, fuerza iónica, etc. según sea necesario para ajustarse a factores como la longitud de la sonda y similares.

En el contexto de las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el término "identidad" se utiliza para expresar el porcentaje de residuos aminoacídicos que son los mismos en las mismas posiciones relativas. También en este contexto, el término "homología" se utiliza para expresar el porcentaje de residuos aminoacídicos que son idénticos o similares en las mismas posiciones relativas, utilizando los criterios de los aminoácidos conservados del análisis de BLAST, como generalmente se entiende en la materia. Por ejemplo, pueden generarse valores de % de identidad mediante WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996), http://blast.wustl/edu/blast/README.html). A continuación se proporcionan más detalles respecto a las sustituciones de aminoácidos que se consideran conservativas bajo tales criterios.

A lo largo de las siguientes subsecciones se proporcionan definiciones adicionales.

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Polinucleótidos PC-LECTINA

Un aspecto de la invención proporciona polinucleótidos que corresponden o son complementarios de la totalidad o una parte de un gen, mRNA y/o secuencia codificante de PC-LECTINA, preferiblemente en forma aislada, lo que incluye polinucleótidos que codifican una proteína PC-LECTINA y fragmentos de las mismas, DNA, RNA, híbridos DNA/RNA, y moléculas relacionadas, polinucleótidos u oligonucleótidos complementarios a una secuencia génica o de mRNA de PC-LECTINA o una parte de la misma, y polinucleótidos u oligonucleótidos que hibridan con un gen o mRNA de PC-LECTINA, o con un polinucleótido que codifica PC-LECTINA (en conjunto "polinucleótidos PC-LECTINA"). Como se utiliza aquí, gen y proteína PC-LECTINA pretende incluir los genes y proteínas PC-LECTINA que se describen específicamente aquí, y los genes y proteínas que corresponden a otras proteínas PC-LECTINA y variantes estructuralmente similares a las anteriores. Estas otras proteínas PC-LECTINA y sus variantes generalmente tendrán secuencias codificantes que son altamente homólogas a la secuencia codificante de PC-LECTINA, y preferiblemente compartirán al menos alrededor de un 50% de aminoácidos idénticos y al menos alrededor de un 60% de aminoácidos homólogos (utilizando los criterios de BLAST), más preferiblemente tendrán una homología del 70% o superior (utilizando los criterios de BLAST).

Una realización de polinucleótido PC-LECTINA es un polinucleótido PC-LECTINA con la secuencia que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 1). Un polinucleótido PC-LECTINA puede comprender un polinucleótido con la secuencia de nucleótidos de PC-LECTINA humano como el que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 1), en el que T también puede ser U; un polinucleótido que codifica la totalidad o una parte de la proteína PC-LECTINA; una secuencia complementaria a la anterior; o un fragmento de polinucleótido de cualquiera de los anteriores. Otra realización comprende un polinucleótido con la secuencia como la que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 1), del residuo nucleotídico número 380 hasta el residuo nucleotídico número 1201, del residuo nucleotídico número 443 hasta el residuo nucleotídico número 1018, o del residuo nucleotídico número 443 hasta el residuo nucleotídico número 1201, en la que T también puede ser U. Otra realización comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido PC-LECTINA cuya secuencia está codificada por el cDNA que contiene el plásmido p58P1D12-2 depositado en la American Type Culture Collection el 10 de Marzo de 1999 con el Nº de registro 207152. Otra realización comprende un polinucleótido que es capaz de hibridar bajo condiciones de hibridación astringentes al cDNA de PC-LECTINA humano que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 1) o a un fragmento de polinucleótidos del mismo.

Las realizaciones típicas de la invención aquí descritas incluyen los polinucleótidos PC-LECTINA que codifican porciones específicas de la secuencia de mRNA de PC-LECTINA, como las que codifican la proteína y los fragmentos de la misma. Por ejemplo, realizaciones representativas de la invención aquí descritas incluyen: polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 1 a alrededor del aminoácido 10 de la proteína PC-LECTINA que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2), polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 20 a alrededor del aminoácido 30 de la proteína PC-LECTINA que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2), polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 30 a alrededor del aminoácido 40 de la proteína PC-LECTINA que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2), polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 40 a alrededor del aminoácido 50 de la proteína PC-LECTINA que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2), polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 50 a alrededor del aminoácido 60 de la proteína PC-LECTINA que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2), polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 60 a alrededor del aminoácidos 70 de la proteína PC-LECTINA que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2), polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácidos 70 a alrededor del aminoácido 80 de la proteína PC-LECTINA que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2), polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 80 a alrededor del aminoácido 90 de la proteína PC-LECTINA que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2) y polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 90 a alrededor del aminoácido 100 de la proteína PC-LECTINA que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2), etc. Siguiendo ese esquema, los polinucleótidos (de al menos 10 aminoácidos) que codifican porciones de la secuencia aminoacídica de los aminoácidos 100-317 de la proteína PC-LECTINA que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2) son realizaciones típicas de la invención. También se contemplan polinucleótidos que codifican porciones mayores de la proteína PC-LECTINA. Por ejemplo los polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 1 (o 20 o 30 o 40, etc.) a alrededor del aminoácido 20, (o 30 o 40 o 50, etc.) de la proteína PC-LECTINA que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2) pueden generarse mediante una serie de técnicas bien conocidas en la materia.

Otras realizaciones ilustrativas de la invención aquí descritas incluyen los fragmentos de polinucleótido de PC-LECTINA que codifican uno o más de los motivos biológicos que contienen la secuencia de la proteína PC-LECTINA. En una realización, los fragmentos de polinucleótido típicos de la invención pueden codificar una o más de las regiones de PC-LECTINA que presentan homología con la layilina de hámster. En otra realización de la invención, los fragmentos de polinucleótidos típicos pueden codificar uno o más dominios de la lectina de tipo C, PC-LECTINA o el dominio transmembrana, tal como se describe en mayor detalle en el texto que describe la proteína y polipéptidos de la PC-LECTINA, más adelante. En otra realización de la invención, los fragmentos de polinucleótidos típicos pueden codificar secuencias que son exclusivas de una o más variantes de corte y empalme de la PC-LECTINA.

Los polinucleótidos de los anteriores párrafos tienen una serie de usos específicos diferentes. Como se ha detectado que PC-LECTINA se sobreexpresa en cáncer de próstata y en otros cánceres, estos polinucleótidos pueden utilizarse en métodos de evaluación del estado de los productos génicos de PC-LECTINA en tejidos normales frente a cancerosos. Normalmente, los polinucleótidos que codifican regiones específicas de la proteína PC-LECTINA pueden utilizarse para evaluar la presencia de alteraciones (como deleciones, inserciones, mutaciones puntuales, etc.) en regiones específicas (como las regiones que contienen un dominio transmembrana) de los productos génicos de PC-LECTINA. Ejemplos de ensayo incluyen tanto ensayos de RT-PCR como análisis de polimorfismos de conformación de la cadena sencilla (SSCP) (véase por ejemplo Marrogi et al., J. Cutan. Pathol. 26(8):369-378 (1999), en ambos se utilizan polinucleótidos que codifican regiones específicas de una proteína para examinar estas regiones en la proteína.

Otras realizaciones de la invención aquí descritas y que se contemplan específicamente son los DNA genómicos, cDNA, ribozimas y moléculas antisentido, lo que incluye las moléculas antisentido morfolino, así como las moléculas de ácido nucleico basadas en un armazón alternativo o que incluye bases alternativas, tanto si se deriva de fuentes naturales o sintéticas. Por ejemplo, las moléculas antisentido pueden ser RNA u otras moléculas, lo que incluye los ácidos nucleicos peptídicos (PNA) o moléculas diferentes de los ácidos nucleicos como los derivados fosforotioato, que se unen específicamente a DNA o RNA de forma dependiente de par de bases. Un experto puede obtener fácilmente estos tipos de moléculas de ácido nucleico utilizando los polinucleótidos y secuencias de polinucleótido de PC-LECTINA descritas aquí.

La tecnología antisentido implica la administración de oligonucleótidos exógenos que se unen a un polinucleótido diana que se localiza dentro de las células. El término "antisentido" se refiere al hecho de que tales oligonucleótidos son complementarios a sus dianas intracelulares, por ejemplo, la PC-LECTINA. Véase por ejemplo, Jack Cohen, OLIGODEOXYNUCLEOTIDES, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, 1989; y Synthesis 1:1-5 (1988). Los oligonucleótidos antisentido de la PC-LECTINA de la presente invención incluyen derivados como los S-oligonucleótidos (derivados fosforotioato o S-oligos, véase, Jack Cohen, anteriormente), que muestran una mayor acción inhibitoria del crecimiento de las células cancerosas. Los S-oligos (nucleósidos fosforotioato) son análogos isoelectrónicos de un oligonucleótido (O-oligo) en el que un átomo de oxígeno no enlazante del grupo fosfato está reemplazado por un átomo de azufre. Los S-oligos de la presente invención pueden prepararse mediante un tratamiento de los correspondientes O-oligos con 1,1-dióxido de 3H-1,2-benzoditiol-3-ona, que es un reactivo de transferencia de azufre. Véase Iyer, R. P. et al, J. Org. Chem. 55:4693-4698 (1990); y Iyer, R. P. et al., J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254 (1990), estas descripciones se incorporan en su totalidad como referencia aquí. Los oligonucleótidos antisentido de PC-LECTINA de la presente invención incluyen adicionalmente los oligonucleótidos antisentido morfolino conocidos en la materia (véase por ejemplo Partridge et al., 1996, Antisense & Nucleic acid Drug Development 6:169-175).

Los oligonucleótidos antisentido de PC-LECTINA de la presente invención normalmente pueden ser RNA o DNA que es complementario y que hibrida de forma estable con los primeros 100 codones en N-terminal o los últimos 100 codones en C-terminal, del genoma de PC-LECTINA o del correspondiente mRNA. Aunque no es necesaria una complementariedad absoluta, es preferible un alto grado de complementariedad. La utilización de un oligonucleótido complementario a esta región permite la hibridación selectiva al mRNA de PC-LECTINA y no a mRNA específicos de otras subunidades reguladoras de las quinasas de proteína. Preferiblemente, los oligonucleótidos antisentido de PC-LECTINA de la presente invención son fragmentos entre 15 y 30-meros de la molécula de DNA antisentido, con una secuencia que hibrida con el mRNA de PC-LECTINA. Opcionalmente, un oligonucleótido antisentido de PC-LECTINA es un oligonucleótido 30-mero que es complementario de una región en los 10 codones iniciales en N-terminal y los 10 codones finales en C-terminal de PC-LECTINA. Alternativamente, las moléculas antisentido se modifican para utilizar ribozimas en la inhibición de la expresión de PC-LECTINA. L. A. Couture & D. T. Stinchcomb; Trends Genet 12: 510-515 (1996).

Otras realizaciones específicas de este aspecto de la invención incluyen cebadores y pares de cebadores, que permiten la amplificación específica de los polinucleótidos de la invención o de cualquier parte específica de los mismos, y sondas que hibridar selectivamente o específicamente con las moléculas de ácido nucleico de la invención o con cualquier parte de las mismas. Las sondas pueden estar marcadas con un marcador detectable, como por ejemplo, un radioisótopo, compuesto fluorescente, compuesto bioluminiscente, compuesto quimioluminiscente, quelante de metales o enzima. Tales sondas y cebadores pueden utilizarse para detectar la presencia de un polinucleótido PC-LECTINA en una muestra y como medio para detectar una célula que expresa una proteína PC-LECTINA.

Ejemplos de tales sondas incluyen polipéptidos que comprenden la totalidad o una parte de la secuencia del cDNA de PC-LECTINA humano, que se muestra en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 1). Ejemplos de pares de cebadores capaces de amplificar específicamente los mRNA de PC-LECTINA también se describen en los Ejemplos que siguen. Como entenderá un experto en la materia, pueden prepararse una gran cantidad de cebadores y sondas diferentes en base a las secuencias que aquí se proporcionan y utilizarse de forma efectiva para amplificar y/o detectar un mRNA de PC-LECTINA.

Como se utiliza aquí, se dice que un polinucleótido está "aislado" cuando se ha separado sustancialmente de polinucleótidos contaminantes que corresponden o son complementarios de genes diferentes del gen PC-LECTINA o que codifican polipéptidos diferentes del producto génico de PC-LECTINA o los fragmentos del mismo. Un experto puede utilizar fácilmente los procedimientos de aislamiento de ácidos nucleicos para obtener un polinucleótido de PC-LECTINA aislado.

Los polinucleótidos de PC-LECTINA de la invención son útiles para una serie de propósitos, lo que incluye pero no se limita a su utilización como sondas y cebadores para la amplificación y/o detección del (de los) gen(es), mRNA o fragmentos de los mismos de la PC-LECTINA; como reactivos para el diagnóstico y/o pronóstico del cáncer de próstata y otros cánceres; como herramientas para la identificación de moléculas que inhiben específicamente la entrada de calcio en las células de la próstata; como secuencias codificantes capaces de dirigir la expresión de los polipéptidos PC-LECTINA; como herramientas para modular o inhibir la expresión del (de los) gen(es) de la PC-LECTINA y/o traducción del (de los) transcrito(s) de PC-LECTINA y como agentes terapéuticos.

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Características moleculares y bioquímicas de PC-LECTINA

Como se describe en detalle en los Ejemplos a continuación, el gen y la proteína PC-LECTINA se han caracterizado de varias formas. Por ejemplo, se han realizado análisis de la codificación de los nucleótidos y las secuencias de aminoácidos para identificar los elementos estructurales conservados de la secuencia de PC-LECTINA, las características topológicas, modificaciones post-traduccionales y las moléculas potencialmente relacionadas. Se han realizado análisis de RT-PCR y Northern blot de la expresión del mRNA de PC-LECTINA para establecer el rango de expresión de los diferentes mensajeros de PC-LECTINA en los tejidos normales y cancerosos. Se han realizado análisis de Western blot de la expresión de la proteína PC-LECTINA en células transfectadas de forma experimental para determinar la localización en la superficie celular.

La proteína PC-LECTINA es una proteína de superficie celular transmembranal de tipo 1a de aproximadamente 252 aminoácidos (expresados inicialmente como una proteína precursora que contiene una secuencia señal de 273 aminoácidos) con homología a la proteína de hámster llamada "layilina", que a su vez comparte homología con las lectinas de tipo C (Borowsky y Hynes, J.C II Biol.. 143:429-42, 1998). La PC-LECTINA también muestra homología con los dominios lectina de la proteína de unión a galactosa que se purificó inicialmente de la hemolinfa de la larva de Sarcophaga peregrina tras un daño de la pared corporal, denominada lectina Sarcophaga (Komano et al., 980, J. BioL Chem. 255:2919-2924), y que se clonó posteriormente (Takahashi et al., 1885, J. Biol. Chem. 22:12228-12233; Kobayashi et al, 1989, Biochimica et Biophysica Acta 009:244-250). La localización de la proteína PC-LECTINA en la superficie celular se confirmó de forma experimental tal y como se describe más profundamente en las secciones de Ejemplos que siguen a continuación.

Las secuencias de nucleótidos del cDNA y de aminoácidos deducida de la PC-LECTINA humana se muestran en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 1 y 2). En la Fig. 2 se muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos del antígeno de PC-LECTINA (Id. de Sec. Nº 2) con la secuencia descrita para la layilina de hámster (Id. de Sec. Nº 3). Aunque la PC-LECTINA posee una fuerte homología con la layilina de hámster (aproximadamente 44,9% de identidad en un solapamiento de 265 residuos), difiere significativamente en un dominio funcional clave propuesto para la proteína layilina. Específicamente, la proteína PC-LECTINA no posee una secuencia de aproximadamente 10 aminoácidos que se encuentra en la estructura de la layilina, y que representa un dominio que se cree es responsable de la asociación de la proteína layilina con la proteína talina del citoesqueleto en los pliegues de la membrana (Borowsky y Hynes, J. Cell Biol. 143:429-42, 1998; Critchley et al., Biochem Soc Symp 65:79-99, 1999). A nivel génico, el alineamiento del cDNA de 2550 pb de la PC-LECTINA con el cDNA de 1747 pb de la layilina de hámster, muestra homología en una región de 591 pb. El resto de la región de la PC-LECTINA es significativamente diferente de la layilina, lo que se refleja en las diferencias en la secuencia de aminoácidos de la mitad c-terminal del dominio extracelular y el dominio citoplasmático completo. Esto sugiere que aunque la PC-LECTINA y la layilina están relacionadas y probablemente constituyen una subfamilia de lectinas, no es probable que la PC-LECTINA sea la forma humana de la layilina.

La asociación de la layilina con la talina se cree tiene una función en la motilidad celular. La ausencia del dominio de asociación a talina en la estructura de la PC-LECTINA sugiere que la PC-LECTINA puede no interaccionar con la talina o el citoesqueleto de la misma forma que la layilina, al menos. Además de la ausencia del dominio de asociación a la talina, la estructura de la PC-LECTINA contiene tramos de secuencia insertados y delecionados en relación con la estructura de layilina. El perfil de expresión de la PC-LECTINA también difiere de la descrita para la layilina. Aunque se ha descrito que la layilina se expresa en muchos otros tejidos de ratón (por ejemplo, ovarios, pulmones, bazo, corazón, hígado, vejiga, nódulos linfáticos, glándula mamaria, cerebro, tiroides y riñones) y en líneas celulares, la PC-LECTINA parece muy específica de los testículos, entre los tejidos normales humanos, y está sobreexpresada en el cáncer de próstata. Esto sugiere que la PC-LECTINA puede funcionar como una molécula de adhesión celular en la metástasis y en la invasión en el cáncer de próstata, y potencialmente en otros cánceres. Dada su relación estructural con la layilina y otras lectinas tipo C, se espera que la PC-LECTINA se una a porciones de carbohidrato, tal como se ha confirmado. De acuerdo con esto, las estrategias terapéuticas que utilizan las moléculas de carbohidrato de unión a PC-LECTINA para interferir con la actividad de la PC-LECTINA pueden ser terapéuticamente útiles en el tratamiento de los cánceres que expresan PC-LECTINA.

La expresión de PC-LECTINA es esencialmente específica de testículo en tejidos humanos adultos normales, como se ha podido determinar mediante análisis de RT-PCR y Northern blot. En el cáncer, el mRNA de la PC-LECTINA se sobreexpresa en los xenoinjertos tumorales de próstata humana que se han desarrollado en ratones SCID, y en algunos casos, se observa un nivel muy alto de expresión. Por lo tanto, dada esta localización en la superficie celular y su alto nivel de expresión en el cáncer de próstata, la PC-LECTINA posee todas las características principales de una diana terapéutica excelente para el tratamiento del cáncer de próstata. Por estas mismas razones, la PC-LECTINA puede también representar un marcador diagnóstico ideal, particularmente en relación con el diagnóstico por imagen. De forma adicional, es posible que la expresión de PC-LECTINA aumente junto con la progresión de la enfermedad y/o en conexión con la emergencia de tumores altamente agresivos. Respecto a esto, el xenoinjerto de tumor de próstata LAPC-9, en el que se detectó un nivel de expresión de PC-LECTINA muy alto, deriva de una metástasis ósea osteoblástica altamente agresiva de un cáncer de próstata.

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Aislamiento de moléculas de ácido nucleico que codifican PC-LECTINA

Las secuencias de cDNA de PC-LECTINA descritas aquí permiten el aislamiento de otros polinucleótidos que codifican productos génicos de la PC-LECTINA, así como el aislamiento de polinucleótidos que codifican homólogos del producto génico de la PC-LECTINA, isoformas de corte y empalme alternativo, variantes alélicas y formas mutantes del producto génico de la PC-LECTINA. Se conocen varios métodos de clonaje molecular que puede utilizarse para aislar los cDNA completos que codifican un gen PC-LECTINA (véase, por ejemplo, Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel et al., Ed., Wiley and Sons, 995). Por ejemplo, pueden utilizarse convenientemente las metodologías de clonaje en fago lambda, usando sistemas de clonaje comercialmente disponibles (por ejemplo, Lambda ZAP Express de Stratagene). Los clones fágicos que contienen los cDNA del gen de la PC-LECTINA pueden identificarse mediante su hibridación con el cDNA de la PC-LECTINA o un fragmento del mismo marcado. Por ejemplo, en una realización, puede sintetizarse el cDNA de la PC-LECTINA (Fig. 1A-D; Id. de Sec. Nº 1) o una porción del mismo y utilizarse como sonda para detectar los cDNA que se solapan y los cDNA completos correspondientes a un gen de la PC-LECTINA. El gen de la PC-LECTINA puede aislarse mediante el cribado de bibliotecas de DNA genómico, bibliotecas de cromosomas artificiales bacterianos (BAC), bibliotecas de cromosomas artificiales de levaduras (YAC) y similares, con sondas o cebadores del DNA de la PC-LECTINA.

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Moléculas de dna recombinante y sistemas de huésped-vector

La invención también proporciona moléculas recombinantes de DNA o RNA que contienen un polinucleótido PC-LECTINA, lo que incluye pero no se limita a fagos, plásmidos, fagémidos, cósmidos, YAC, BAC, así como varios vectores virales y no virales bien conocidos en la materia, y células transformadas o transfectadas con tales moléculas de DNA o RNA recombinantes. Como se utiliza aquí, una molécula de DNA o RNA recombinante es una molécula de DNA o RNA que se ha sometido a manipulación molecular in vitro. Los métodos para generar tales moléculas son bien conocidos (véase, por ejemplo, Sambrook et al, 1989, anteriormente).

La invención además proporciona un sistema de huésped-vector que comprende una molécula de DNA recombinante que contiene un polinucleótido PC-LECTINA en una célula procariota o eucariota huésped adecuada. Ejemplos de células huésped eucariotas adecuadas incluyen una célula de levadura, una célula vegetal o una célula animal, como una célula de mamífero o una célula de insecto (por ejemplo, una célula infectable por un baculovirus, como la célula Sf9). Ejemplos de células huésped de mamífero adecuadas incluyen varias líneas celulares de cáncer de próstata como LNCaP, PC-3, DU145, LAPC-4, TsuPr1, otras líneas celulares transfectables o transducibles de cáncer de próstata, así como una serie de células de mamífero que se utilizan de forma rutinaria para la expresión de proteínas recombinantes (por ejemplo, células COS, CHO, 293, 293T). Más concretamente, puede utilizarse un polinucleótido que comprende la secuencia codificante de PC-LECTINA para generar proteínas PC-LECTINA o fragmentos de las mismas utilizando cualquier número de los sistemas de huésped-vector que se utilizan de forma rutinaria y ampliamente conocidos en la materia.

Se encuentran disponibles un amplio rango de sistemas de huésped-vector adecuados para la expresión de las proteínas PC-LECTINA o de los fragmentos de las mismas, véase por ejemplo, Sambrook et al., 1989, anteriormente; Current Protocols in Molecular Biology, 1995, anteriormente). Los vectores preferibles para la expresión en mamíferos incluyen, pero no se limitan a, pcDNA 3.1 myc-His-tag (Invitrogen) y el vector retroviral pSRatkneo (Muller et al., 1991, MCB 11:1785). Utilizando estos vectores de expresión, PC-LECTINA puede expresarse preferiblemente en varias líneas celulares de cáncer de próstata y diferentes de próstata, lo que incluye por ejemplo las líneas 293, 293T, rat-1, 3T3, PC-3, LNCaP y TsuPr1. Los sistemas huésped-vector de la invención son útiles para la producción de una proteína PC-LECTINA o un fragmento de la misma. Tales sistemas huésped-vector pueden utilizarse para estudiar las propiedades funcionales de PC-LECTINA y de mutaciones en PC-LECTINA.

Las proteínas codificadas por los genes PC-LECTINA, o por los fragmentos de las mismas, tendrán una variedad de usos, que incluyen pero no se limitan a la generación de anticuerpos y métodos para la identificación de ligandos, de otros agentes y constituyentes celulares que se unen a un producto génico de PC-LECTINA. Los anticuerpos obtenidos frente a la proteína PC-LECTINA o fragmentos de la misma pueden ser útiles en ensayos de diagnóstico y pronóstico, metodologías de imagen (lo que incluye, en particular, imagen del cáncer) y métodos terapéuticos en la gestión de los cánceres humanos caracterizados por la expresión de una proteína PC-LECTINA, lo que incluye pero no se limita al cáncer de próstata. Se contemplan varios ensayos inmunológicos útiles para la detección de las proteínas PC-LECTINA, lo que incluye pero no se limita a varios tipos de radioinmunoensayos, ensayos inmunosorbentes ligados a enzima (ELISA), ensayos inmunofluorescentes ligados a enzima (ELIFA), métodos inmunocitoquímicos y similares. Tales anticuerpos pueden estar marcados y utilizarse como reactivos inmunológicos para la imagen capaces de detectar las células de próstata (por ejemplo, en métodos de imagen radiográficos de centelleo). Las proteínas PC-LECTINA también pueden ser particularmente útiles en la generación de vacunas contra el cáncer, como se describe en detalle a continuación.

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Proteínas PC-LECTINA

Otro aspecto de la presente invención proporciona las proteínas PC-LECTINA y los fragmentos polipeptídicos de las mismas. Las proteínas PC-LECTINA de la invención incluyen las que se identifican aquí específicamente, así como las variantes alélicas, variantes con sustitución conservativa y homólogos, siempre que tales variantes y homólogos puedan aislarse/generarse y caracterizarse sin una experimentación indebida siguiendo los métodos que se destacan a continuación. También se incluyen las proteínas de fusión que combinan partes de diferentes proteínas PC-LECTINA o fragmentos de las mismas, así como las proteínas de fusión de una proteína PC-LECTINA y un polipéptido heterólogo. Tales proteínas PC-LECTINA se denominarán de forma colectiva proteínas PC-LECTINA, proteínas de la invención o PC-LECTINA. Como se utiliza aquí, el término "polipéptidos PC-LECTINA" se refiere a un fragmento polipeptídico o una proteína PC-LECTINA de al menos 10 aminoácidos, preferiblemente al menos 15 aminoácidos.

Una realización específica de una proteína PC-LECTINA comprende un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de la PC-LECTINA humana como la que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2), desde el residuo aminoacídico número 1 hasta alrededor del residuo aminoacídico número 273, como se muestra. Otra realización específica de una proteína PC-LECTINA comprende un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de la PC-LECTINA humana como la que se muestra en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2), desde el residuo aminoacídico número 22 hasta alrededor del residuo aminoacídico número 273, como se muestra. Una realización específica de un fragmento de PC-LECTINA comprende un péptido seleccionado de entre el grupo que comprende WIGFTYKTA, ATGEHQAFT, FGNCVELQA, NCVELQASA y DNHGFGNCV (Id. de Sec. Nº 6 a 10, respectivamente), o de entre el grupo que comprende GLWRNGDGQTSGAC (Id. de Sec. Nº 25), GGPYLYQWNDDRCNM (Id. de Sec. Nº 26), EARLACESEGGVLL (Id. de Sec. Nº 27), y el dominio extracelular de PC-LECTINA (aminoácidos 22-213 de Id. de Sec. Nº 2). Otras realizaciones específicas incluyen uno o ambos dominios de lectina de tipo C y/o el dominio transmembrana identificados en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2).

En general, las variantes alélicas que aparecen de forma natural de la PC-LECTINA humana compartirán un elevado grado de identidad estructural y homología (por ejemplo, un 90% o más de identidad). Normalmente, las variantes alélicas de las proteínas PC-LECTINA contendrán sustituciones conservativas de aminoácidos en las secuencias de PC-LECTINA descritas aquí o contendrán una sustitución con un aminoácido de la posición correspondiente en un homólogo de PC-LECTINA. Una clase de variantes alélicas de la PC-LECTINA son las proteínas que comparten un elevado grado de homología con al menos una pequeña región de una secuencia de aminoácidos particular de PC-LECTINA, pero que además contienen partes radicalmente diferentes de la secuencia, como sustituciones no conservativas, truncación, inserción o cambio de marco de lectura.

Las sustituciones conservativas de aminoácidos frecuentemente pueden realizarse en una proteína sin alterar la conformación o la función de la proteína. Tales cambios incluyen la sustitución de cualquier isoleucina (I), valina (V) y leucina (L) por cualquiera de estos aminoácidos hidrofóbicos; ácido aspártico (D) por ácido glutámico (E) y viceversa; glutamina (Q) por asparagina (N) y viceversa; y serina (S) por treonina (T) y viceversa. Otras sustituciones también pueden considerarse conservativas, dependiendo del ambiente particular de los aminoácidos y su papel en la estructura tridimensional de la proteína. Por ejemplo, la glicina (G) y alanina (A) frecuentemente pueden ser intercambiables, así como la alanina (A) y valina (V). La metionina (M), que es relativamente hidrofóbica, frecuentemente puede intercambiarse por leucina y isoleucina, y en ocasiones con valina. La lisina (K) y arginina (R) son frecuentemente intercambiables en posiciones en las que la característica significativa del residuo aminoacídico es su carga y los diferentes pK de estos dos residuos aminoacídicos no son significativos. Otros cambios pueden considerarse "conservativos" en ambientes particulares.

Las proteínas PC-LECTINA, lo que incluye las variantes, comprenden al menos un epítopo en común con una proteína PC-LECTINA con la secuencia de aminoácidos de la Fig. 1 (Id. de Sec. Nº 2), de forma que un anticuerpo que se une específicamente a una proteína PC-LECTINA o una variante también se unirá específicamente a la proteína PC-LECTINA con la secuencia de aminoácidos de la Fig. 1 (Id. de Sec. Nº 2). Una clase de variantes de la proteína PC-LECTINA comparte un 90% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de la Fig. 1 (Id. de Sec. Nº 2). Una clase más específica de variantes de la proteína PC-LECTINA comprende un dominio de lectina de tipo C. Las variantes preferibles de la proteína PC-LECTINA son capaces de unirse a porciones de carbohidratos, particularmente con especificidad para residuos de alta manosa y/o N-acetilglucosamina.

Las proteínas PC-LECTINA pueden realizarse de muchas formas, preferiblemente en forma aislada. Como se utiliza aquí, se dice que una proteína está "aislada" cuando se utilizan métodos físicos, mecánicos o químicos para eliminar la proteína PC-LECTINA de los constituyentes celulares que normalmente están asociados con la proteína. Un experto puede utilizar fácilmente los métodos de purificación estándar para obtener una proteína PC-LECTINA aislada. Una molécula de proteína PC-LECTINA purificada estará sustancialmente libre de otras proteínas o moléculas que impiden la unión de PC-LECTINA a un anticuerpo u otro ligando. La naturaleza y grado de aislamiento y purificación dependerá del uso previsto. Las realizaciones de una proteína PC-LECTINA incluyen una proteína PC-LECTINA purificada y una proteína PC-LECTINA funcional soluble. En una forma, tales proteínas PC-LECTINA funcionales solubles o los fragmentos de las mismas retienen la capacidad de unirse a un anticuerpo u otro ligando.

La invención también proporciona polipéptidos PC-LECTINA que comprenden fragmentos biológicamente activos de la secuencia de aminoácidos de PC-LECTINA, como un polipéptido que corresponde en parte a las secuencias de aminoácidos de PC-LECTINA que se muestran en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2). Tales polipéptidos de la invención muestran propiedades de la proteína PC-LECTINA, como la capacidad de facilitar la generación de anticuerpos que se unen específicamente a un epítopo asociado con la proteína PC-LECTINA.

Las realizaciones de la invención aquí descritas incluyen una amplia diversidad de variantes aceptadas en la materia de las proteínas PC-LECTINA, como los polipéptidos con inserciones, deleciones y sustituciones de aminoácidos. Las variantes de PC-LECTINA pueden obtenerse utilizando métodos conocidos en la materia como la mutagénesis dirigida, escaneo de alaninas y mutagénesis mediante PCR. Puede realizarse una mutagénesis dirigida [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], mutagénesis en cassette [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], mutagénesis por selección de restricción [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas en el DNA clonado para producir el DNA variante de PC-LECTINA. También puede utilizarse el análisis de escaneo de aminoácidos para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de escaneo preferibles están los aminoácidos relativamente pequeños neutrales. Tales aminoácidos incluyen la alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina normalmente es el aminoácido de escaneo preferible entre este grupo ya que elimina la cadena lateral tras el carbono beta y es menos probable alterar la conformación de la cadena principal de la variante. Normalmente, la alanina es también preferible porque es el aminoácido más común. Además, se encuentra frecuentemente tanto en posiciones ocultas como expuestas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la sustitución de alanina no resulta en cantidades adecuadas de la variante pueden utilizarse aminoácidos isoestéricos.

Como se ha discutido anteriormente, las realizaciones de la invención que se reivindica incluyen polipéptidos que contienen una secuencia de la proteína PC-LECTINA menor a la de 273 aminoácidos que se muestra en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2). Por ejemplo, realizaciones representativas de la invención aquí descrita incluyen polipéptidos que consisten desde alrededor del aminoácido 1 hasta alrededor del aminoácido 10 de la proteína PC-LECTINA que se muestra en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2), polipéptidos que consisten desde alrededor del aminoácido 20 hasta alrededor del aminoácido 30 de la proteína PC-LECTINA que se muestra en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2), polipéptidos que consisten desde alrededor del aminoácido 30 hasta alrededor del aminoácido 40 de la proteína PC-LECTINA que se muestra en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2), polipéptidos que consisten desde alrededor del aminoácido 40 hasta alrededor del aminoácido 50 de la proteína PC-LECTINA que se muestra en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2), polipéptidos que consisten desde alrededor del aminoácido 50 hasta alrededor del aminoácido 60 de la proteína PC-LECTINA que se muestra en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2), polipéptidos que consisten desde alrededor del aminoácido 60 hasta alrededor del aminoácido 70 de la proteína PC-LECTINA que se muestra en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2), polipéptidos que consisten desde alrededor del aminoácido 70 hasta alrededor del aminoácido 80 de la proteína PC-LECTINA que se muestra en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2), polipéptidos que consisten desde alrededor del aminoácido 80 hasta alrededor del aminoácido 90 de la proteína PC-LECTINA que se muestra en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2) y polipéptidos que consisten desde alrededor del aminoácido 90 hasta alrededor del aminoácido 100 de la proteína PC-LECTINA que se muestra en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2), etc. Siguiendo este esquema, los polipéptidos que consisten en porciones de la secuencia de aminoácidos de la proteína PC-LECTINA, de los aminoácidos 100-273, son realizaciones típicas de la invención. Los polipéptidos que consisten en porciones mayores de la proteína PC-LECTINA también se contemplan. Por ejemplo, los polipéptidos que consisten desde alrededor del aminoácido 1 (o 20, o 30, o 40, etc.) hasta alrededor del aminoácido 20, (o 30, o 40, o 50, etc.) de la proteína PC-LECTINA que se muestra en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2) pueden generarse mediante una serie de técnicas bien conocidas en la materia.

Otras realizaciones ilustrativas de la invención aquí descrita incluyen los polipéptidos de la PC-LECTINA que contienen los residuos aminoacídicos de uno o más de los motivos biológicos que contiene la secuencia polipeptídica de PC-LECTINA, como la que se muestra en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2). En una realización, los polipéptidos típicos de la invención pueden contener una o más de las regiones de la PC-LECTINA que presentan homología con layilina de hámster, y/o uno o más de los dominios de las lectinas transmembranales o de tipo C identificadas en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2). En otra realización, los polipéptidos típicos de la invención pueden contener uno o más de los puntos de N-glucosilación de la PC-LECTINA, como NLTK (Id. de Sec. Nº 33) en los residuos 86-89 (numeración desde el primer residuo aminoacídico que se muestra en la Figura 1), y/o NQST en los residuos 255-258 (Id. de Sec. Nº 34). En otra realización, los polipéptidos típicos de la invención pueden contener uno o más de los puntos de fosforilación de proteínas quinasa dependientes de cAMP/cGMP como RKES en los residuos 266-269 (Id. de Sec. Nº 35). En otra realización, los polipéptidos típicos de la invención pueden contener uno o más de los puntos de fosforilación de la proteína quinasa C como SSR en los residuos 49-51, SEK en los residuos 141-143, STR en los residuos 264-266, y/o TRK en los residuos 264-267. En otra realización, los polipéptidos típicos de la invención pueden contener uno o más de los puntos de fosforilación de la caseína quinasa II de la PC-LECTINA como SFQE en los residuos 53-56 (Id. de Sec. Nº 36), SDGD en los residuos 95-98 (Id. de Sec. Nº 37), TRKE en los residuos 265-268 (Id. de Sec. Nº 38), y/o SGME en los residuos 269-272 (Id. de Sec. Nº 39). En otra realización, los polipéptidos típicos de la invención pueden contener uno o más de los puntos de N-miristoilación, como GQKVCF en los residuos 27-32 (Id. de Sec. Nº 40), GVLLSL en los residuos 66-71 (Id. de Sec. Nº 71), GTGISD en los residuos 91-96 (Id. de Sec. Nº 42), GISDGD en los residuos 93-98 (Id. de Sec. Nº 43), GLWRNG en los residuos 102-107 (Id. de Sec. Nº 44), GQTSGA en los residuos 109-114 (Id. de Sec. Nº 45), GSEKCV en los residuos 140-145 (Id. de Sec. Nº 46), y/o GIIPNL en los residuos 212-217 (Id. de Sec. Nº 47). Las realizaciones relacionadas con esta invención incluyen los polipéptidos que contienen combinaciones de los diferentes motivos que se han discutido anteriormente, siendo las realizaciones preferibles las que no contienen inserciones, deleciones o sustituciones en los motivos o las secuencias intermedias de estos polipéptidos.

Los polipéptidos de PC-LECTINA pueden generarse utilizando la tecnología de síntesis de péptidos estándar o utilizando métodos de escisión química bien conocidos en la materia y basados en las secuencias de aminoácido de las proteínas PC-LECTINA humanas descritas aquí. Alternativamente, pueden utilizarse métodos recombinantes para generar moléculas de ácido nucleico que codifican un fragmento de polipéptido de una proteína PC-LECTINA. Respecto a esto, las moléculas de ácido nucleico que codifican PC-LECTINA descritas aquí proporcionan un medio para la generación de fragmentos definidos de las proteínas PC-LECTINA. Los polipéptidos de PC-LECTINA son particularmente útiles en la generación y caracterización de anticuerpos específicos de dominio (por ejemplo, anticuerpos que reconocen un epítopo extracelular o intracelular de una proteína PC-LECTINA), en la identificación de agentes o factores celulares que se unen a PC-LECTINA o a un dominio estructural particular de la misma, y en diferentes contextos terapéuticos, lo que incluye pero no se limita a las vacunas contra el cáncer. Los polipéptidos de PC-LECTINA que contienen estructuras particularmente interesantes pueden predecirse y/o identificarse utilizando varias técnicas analíticas bien conocidas en la materia, lo que incluye, por ejemplo, los métodos de análisis de Chou-Fasman, Gamier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf, o en base a la inmunogenicidad. Los fragmentos que contienen tales estructuras son particularmente útiles en la generación de anticuerpos anti-PC-LECTINA específicos de subunidad o en la identificación de factores celulares que se unen a PC-LECTINA.

En una realización específica descrita en los ejemplos a continuación, una forma secretada de PC-LECTINA puede expresarse convenientemente en células 293T transfectadas con un vector de expresión dirigido por CMV que codifica PC-LECTINA con una cola de 6 X His y MYC en el extremo C-terminal (pcDNA3.1/mycHIS, Invitrogen). La PC-LECTINA con cola de HIS secretada al medio de cultivo puede purificarse utilizando una columna de níquel y técnicas estándar. Alternativamente, puede utilizarse un sistema de cola de AP. (véase Ejemplo 7).

Las modificaciones de PC-LECTINA, como las modificaciones covalentes, se incluyen dentro del alcance de esta invención. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar los residuos aminoacídicos diana de un polipéptido PC-LECTINA con un agente orgánico de derivatización que es capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o los residuos del extremo N- o C-terminal de PC-LECTINA. Otro tipo de modificación covalente del polipéptido PC-LECTINA incluida en el alcance de esta invención comprende la alteración del patrón de glucosilación nativa del polipéptido. La "alteración del patrón de glucosilación nativa" pretende significar para los propósitos aquí descritos, la deleción de una o más porciones carbohidrato que se encuentran en la secuencia nativa de PC-LECTINA (eliminando el punto de glucosilación subyacente o delecionando la glucosilación mediante métodos químicos y/o enzimáticos), y/o añadiendo uno o más puntos de glucosilación que no están presentes en la secuencia nativa de PC-LECTINA. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glucosilación de las proteínas nativas, lo que implica un cambio en la naturaleza y proporciones de las diferentes porciones de carbohidrato presentes. Otro tipo de modificación covalente de PC-LECTINA comprende la unión del polipéptido PC-LECTINA a uno de entre una serie de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquilenos, del modo en el que indica en las patentes estadounidenses Nº 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.

La PC-LECTINA de la presente invención también puede modificarse de forma que se obtenga una molécula quimérica que comprenda PC-LECTINA fusionada a otra secuencia de aminoácidos o polipéptido heterólogo. En una realización, tal molécula quimérica comprende una fusión de PC-LECTINA con una cola de un epítopo de poli-histidina, lo que proporciona un epítopo al que puede unirse selectivamente níquel inmovilizado. La cola con el epítopo generalmente se localiza en el extremo amino- o carboxi-terminal de la PC-LECTINA. En una realización alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión de PC-LECTINA con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para obtener una forma bivalente de la molécula quimérica (también denominada "inmunoadhesina"), tal fusión puede hacerse a la región Fc de una molécula de IgG. Las fusiones de Ig preferiblemente incluyen la substitución de una forma soluble (con el dominio transmembrana delecionado o inactivado) de un polipéptido PC-LECTINA en lugar de al menos una región variable de una molécula de Ig. En una realización particularmente preferible, la fusión de inmunoglobulina incluye las regiones bisagra, CH2 y CH3, o las regiones bisagra, CH1, CH2 y CH3 de una molécula de IgG1. Para la producción de fusiones de inmunoglobulina véase también la patente estadounidense Nº 5.428.130 registrada el 27 de junio de 1995.

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Anticuerpos anti-PC-LECTINA

Otro aspecto de la invención proporciona anticuerpos que se unen a las proteínas y polipéptidos PC-LECTINA. Los anticuerpos más preferibles se unirán de forma selectiva a la proteína PC-LECTINA y no se unirán (o lo harán débilmente) a las proteínas y polipéptidos diferentes de PC-LECTINA. Los anticuerpos anti-PC-LECTINA que se contemplan particularmente incluyen los anticuerpos monoclonales y policlonales, así como los fragmentos que contienen el dominio de unión al antígeno y/o uno o más regiones determinantes de complementariedad de estos anticuerpos. Como se utiliza aquí, un fragmento de anticuerpo se define como al menos una porción de la región variable de la molécula de inmunoglobulina que se une a la diana, es decir, la región de unión al antígeno.

Para algunas aplicaciones, puede ser deseable generar anticuerpos que reaccionan específicamente con una proteína PC-LECTINA particular y/o un epítopo en un dominio estructural particular. Por ejemplo, los anticuerpos preferibles útiles para la terapia del cáncer y para propósitos de diagnóstico por imagen son los que reaccionan con un epítopo en una región extracelular de la proteína PC-LECTINA como se expresa en la células cancerosa. Tales anticuerpos pueden generarse utilizando como inmunogéno las proteínas PC-LECTINA descritas aquí, o utilizando péptidos predecibles derivados de dominios extracelulares de las mismas. Respecto a esto, y en referencia a la secuencia de la proteína PC-LECTINA que se muestra en la Fig. 1, pueden seleccionarse las regiones de la secuencia aminoterminales al dominio transmembrana y utilizarse para diseñar inmunógenos adecuados y reactivos de cribado para obtener y seleccionar anticuerpos específicos de PC-LECTINA extracelular.

Los anticuerpos PC-LECTINA de la invención pueden ser particularmente útiles en las estrategias terapéuticas contra el cáncer de próstata, ensayos diagnósticos y pronósticos, y metodologías de imagen. De forma similar, tales anticuerpos pueden ser útiles en el tratamiento, diagnóstico y/o pronóstico de otros cánceres, ya que PC-LECTINA también se expresa o sobreexpresa en otros tipos de cáncer. La invención proporciona varios ensayos inmunológicos útiles para la detección y cuantificación de PC-LECTINA, y proteínas y polipéptidos mutantes de PC-LECTINA. Tales ensayos generalmente comprenden uno o más anticuerpos PC-LECTINA capaces de reconocer y unirse a PC-LECTINA o una proteína mutante PC-LECTINA, según sea adecuado, y pueden realizarse utilizando varios formatos de ensayo inmunológico bien conocidos en la materia, lo que incluye pero no se limita a varios tipos de radioinmunoensayos, ensayos inmunosorbentes acoplados a enzima (ELISA), ensayos inmunofluorescentes acoplados a enzima (ELIFA) y similares. Además, la invención también proporciona métodos de imagen inmunológicos capaces de detectar el cáncer de próstata, lo que incluye pero no se limita a los métodos de imagen de radiografía de centelleo utilizando anticuerpos PC-LECTINA marcados. Tales ensayos pueden utilizarse clínicamente en la detección, monitorización y pronóstico del cáncer de próstata, en particular cáncer de próstata avanzado.

Los anticuerpos PC-LECTINA también pueden utilizarse en métodos para purificar PC-LECTINA, y proteínas y polipéptidos mutantes de PC-LECTINA, y para aislar homólogos de PC-LECTINA y moléculas relacionadas. Por ejemplo, en una realización, el método para purificar una proteína PC-LECTINA comprende la incubación de un anticuerpo anti-PC-LECTINA, que se ha acoplado a una matriz sólida, con un lisado u otra solución que contiene PC-LECTINA bajo condiciones que permiten que el anticuerpo anti-PC-LECTINA se una a la PC-LECTINA; el lavado de la matriz sólida para eliminar impurezas; y la elución de PC-LECTINA del anticuerpo acoplado. Otros usos de los anticuerpos PC-LECTINA de la invención incluyen la generación de anticuerpos anti-idiotípicos que mimetizan la proteína PC-LECTINA.

Los anticuerpos PC-LECTINA también pueden utilizarse terapéuticamente, por ejemplo, modulando o inhibiendo la actividad biológica de una proteína PC-LECTINA o uniéndose y destruyendo las células cancerosas que expresan la proteína PC-LECTINA. La terapia de anticuerpos del cáncer de próstata y otros cánceres se describe más específicamente en una subsección separada a continuación.

Varios métodos para la obtención de anticuerpos son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos inmunizando huéspedes mamíferos adecuados utilizando una proteína, péptido o fragmento de PC-LECTINA, en forma aislada o inmunoconjugada (Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Eds., Harlow, and Lane (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). Ejemplos de inmunogénos proteicos incluyen una PC-LECTINA recombinante (expresada en un sistema de baculovirus, sistema de mamíferos, etc.), dominio extracelular de PC-LECTINA, PC-LECTINA con una cola de AP, etc. Además, las proteínas de fusión de PC-LECTINA también pueden utilizarse como una fusión de PC-LECTINA con GST. En una realización particular, puede producirse una proteína de fusión GST que comprende la totalidad o la mayor parte de la secuencia de aminoácidos del marco abierto de lectura de las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2) y utilizarse como inmunógeno para generar anticuerpos apropiados. Las células que expresan o sobreexpresan PC-LECTINA también pueden utilizarse para las inmunizaciones. De forma similar, puede utilizarse cualquier célula diseñada para expresar PC-LECTINA. Tales estrategias pueden resultar en la producción de anticuerpos monoclonales con la capacidad de reconocer la PC-LECTINA endógena. Otro inmunógeno útil comprende péptidos PC-LECTINA unidos a la membrana plasmática de glóbulos rojos de sangre de oveja.

La secuencia de aminoácidos de PC-LECTINA, como la que se muestra en las Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2), puede utilizarse para seleccionar regiones específicas de la proteína PC-LECTINA para generar anticuerpos. Por ejemplo, los análisis de hidrofobicidad e hidrofilicidad de la secuencia de aminoácidos de PC-LECTINA pueden utilizarse para identificar las regiones hidrofílicas en la estructura de PC-LECTINA. Las regiones de la proteína PC-LECTINA que muestran una estructura inmunogénica, así como otras regiones y dominios, pueden identificarse fácilmente utilizando otros métodos conocidos en la materia, como los análisis de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf. Los péptidos de PC-LECTINA que se prevé pueden unirse a HLA-A2, como WIGFTYKTA (Id. de Sec. Nº 6), ATGEHQAFT (Id. de Sec. Nº 7), FGNCVELQA (Id. de Sec. Nº 8), NCVELQASA (Id. de Sec. Nº 9), y DNHGFGNCV (Id. de Sec. Nº 10), pueden seleccionarse para la generación de anticuerpos. Como se discute en los ejemplos a continuación, se ha demostrado la inmunogenicidad de los péptidos GLWRNGDGQTS
GAC (Id. de Sec. Nº 25), GGPYLYQWNDDRCNM (Id. de Sec. Nº 26), EARLACESEGGVLL (SEQ ID NO 27), y el dominio extracelular de PC-LECTINA (aminoácidos 22-213 de Id. de Sec. Nº 2), que se utilizaron para generar anticuerpos policlonales y monoclonales utilizando conejos y ratones, respectivamente.

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Los métodos para preparar una proteína o polipéptido para su utilización como inmunógeno y para la preparación de conjugados inmunogénicos de una proteína con un transportador como BSA, KLH u otras proteínas transportadoras son bien conocidos en la materia. En algunas circunstancias, puede utilizarse la conjugación directa usando, por ejemplo, reactivos de carbodiimida; en otras ocasiones pueden ser efectivos reactivos de unión como los que suministra Pierce Chemical Co., Rockford, IL. La administración de un inmunógeno de PC-LECTINA se realiza generalmente mediante inyección a lo largo de un periodo adecuado y utilizando un adyuvante adecuado, como generalmente se entiende en la materia. Durante el programa de inmunización, puede medirse el título de anticuerpos para determinar la adecuada formación del anticuerpo.

Los anticuerpos monoclonales PC-LECTINA son preferibles y pueden producirse mediante varios métodos bien conocidos en la materia. Por ejemplo, líneas celulares inmortalizadas que secretan un anticuerpo monoclonal deseado pueden prepararse utilizando la tecnología de hibridoma estándar de Kohler y Milstein, o modificaciones que inmortalizan células B productoras, como se conoce generalmente. Las líneas celulares inmortalizadas que secretan los anticuerpos deseados se criban mediante un inmunoensayo en el que el antígeno es la proteína PC-LECTINA o un fragmento de PC-LECTINA. Cuando se identifica el cultivo celular inmortalizado apropiado que secreta el anticuerpo deseado, las células pueden expandirse y los anticuerpos producirse a partir de cultivos in vitro o de fluido de ascites.

Los anticuerpos o fragmentos también pueden producirse utilizando la tecnología actual mediante métodos recombinantes. Las regiones que se unen específicamente a las regiones deseadas de la proteína PC-LECTINA también pueden producirse en el contexto de anticuerpos quiméricos o con injertos de CDR con origen en varias especies. También pueden producirse anticuerpos PC-LECTINA humanizados o humanos y son preferibles para su utilización en contextos terapéuticos. Los métodos para humanizar anticuerpos murinos y otros anticuerpos no humanos sustituyendo uno o más de los CDR del anticuerpo no humano por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano son bien conocidos (véase por ejemplo, Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann et aL, 1988, Nature 332: 323-327; Verhoeyen et aL, 1988, Science 239:1534-1536). Véase también, Carter et al., 1993, Proc. Natl Acad. Sci. USA 89: 4285 y Sims et al., 1993, J. ImmunoL 151: 2296. Los métodos para la producción de anticuerpos monoclonales humanos completos incluyen las tecnologías de presentación en fagos y los animales transgénicos (para una revisión, véase Vaughan et aL, 1998, Nature Biotechnology 16: 535-539).

Los anticuerpos monoclonales humanos completos PC-LECTINA pueden generarse utilizando tecnologías de clonaje que usan grandes bibliotecas combinatoriales de los genes de las Ig humanas (es decir, presentación en fagos) (Griffiths y Hoogenboom, Building an in vitro immune system: human antibodies from phage display libraries. En: Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications en Man. Clark, M. (Ed.), Nottingham Academic, págs. 45-64 (1993); Burton y Barbas, Human Antibodies from combinatorial libraries. Idem, págs. 65-82). Los anticuerpos monoclonales humanos completos PC-LECTINA también pueden producirse utilizando ratones transgénicos diseñados para que contengan los locus de los genes de las inmunoglobulinas humanas como se describe en la solicitud de patente PCT W098/24893, Kucherlapati y Jakobovits et al., publicada el 3 de diciembre de 1997 (véase también, Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7 (4):607-614). Este método evita la manipulación in vitro necesaria con la tecnología de presentación en fagos y produce de forma eficiente anticuerpos humanos auténticos de alta afinidad.

La reactividad de los anticuerpos PC-LECTINA con una proteína PC-LECTINA puede establecerse mediante una serie de métodos bien conocidos, lo que incluye los análisis de Western blot, inmunoprecipitación, ELISA y FACS utilizando, según sea apropiado, las proteínas y péptidos PC-LECTINA, células que expresan PC-LECTINA o extractos de las mismas.

Un anticuerpo PC-LECTINA o fragmento del mismo de la invención puede estar marcado con un marcador detectable o conjugado con una segunda molécula, como un agente citotóxico, y utilizarse para localizar la segunda molécula en una célula positiva para PC-LECTINA (Vitetta, E.S. et aL, 1993, Immunotoxin therapy, en DeVita, Jr., V.T. et aL, eds., Cancer: Principles and Practice of Oncology, 4ª ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 2624-2636). Ejemplos de agentes citotóxicos incluyen pero no se limitan a ricina, cadena A de la ricina, doxorubicina, daunorubicina, taxol, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidroxiantracinodiona, actinomicina, toxina de la difteria, exotoxina de Pseudomonas A (PE), PE40, abrina, cadena A de la abrina, cadena A de la modecina, alfa-sarcina, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, calicheamicina, inhibidor de saponaria officinalis, y glucocorticoides y otros agentes quimioterapéuticos, así como radioisótopos como ^{212}Bi, ^{131}I, ^{131}In, ^{90}Y y ^{186}Re. Los marcadores detectables adecuados incluyen pero no se limitan a un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelante de metales o una enzima. Los anticuerpos también pueden conjugarse a una enzima activadora de un profármaco anticanceroso,
capaz de convertir el profármaco en su forma activa. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense Nº 4.975.287.

Además, los anticuerpos específicos biespecíficos de dos o más epítopos PC-LECTINA pueden generarse utilizando métodos generalmente conocidos en la materia. Además, pueden modificarse las funciones efectoras del anticuerpo para potenciar el efecto terapéutico de los anticuerpos PC-LECTINA sobre las células cancerosas. Por ejemplo, pueden introducirse residuos de cisteína en la región Fc, lo que permite la formación de puentes disulfuro entre cadenas y la generación de homodímeros que pueden tener una mejor capacidad de internalización, ADCC y/o muerte celular mediada por complemento (véase por ejemplo, Caron et al., 1992, J. Exp. Med. 176:1191-1195; Shopes, 1992, J. Immunol. 148:2918-2922). Los anticuerpos homodiméricos también pueden generarse mediante técnicas de entrecruzamiento conocidas en la materia (por ejemplo, Wolff et al., Cancer Res. 53:2560-2565).

Animales transgénicos de PC-LECTINA

Los ácidos nucleicos que codifican la PC-LECTINA o sus formas modificadas también pueden utilizarse para generar los animales transgénicos o animales "knock out" que, a su vez, son útiles en el desarrollo y cribado de reactivos de uso terapéutico. Un animal transgénico (por ejemplo, un ratón o rata) es un animal con células que contienen un transgén, que se ha introducido en el animal o un ancestro del animal en un estado prenatal, por ejemplo, embrionario. Un transgén es un DNA que se ha integrado en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico. En una realización, el cDNA que codifica PC-LECTINA puede utilizarse para clonar el DNA genómico que codifica PC-LECTINA de acuerdo con las técnicas establecidas y las secuencias genómicas pueden utilizarse para generar animales transgénicos que contienen células que expresan el DNA que codifica PC-LECTINA.

Los métodos para generar animales transgénicos, en particular animales como ratones o ratas, se ha convertido en convencionales en la materia y se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidense Nº 4.736.866 y 4.870.009. Normalmente, células concretas serán elegidas para la incorporación del transgén de PC-LECTINA con potenciadores específicos de tejido. Los animales transgénicos que incluyen una copia de un transgén que codifica PC-LECTINA introducido en la línea germinal del animal en un estadío embrionario pueden utilizarse para examinar el efecto de un aumento de la expresión del DNA que codifica PC-LECTINA. Tales animales pueden utilizarse como animales de prueba para los reactivos ideados para conferir protección de, por ejemplo, estados patológicos asociados con su sobreexpresión. De acuerdo con esta faceta de la invención, un animal se trata con el reactivo y la aparición de una incidencia reducida del estado patológico, comparado con los animales no tratados que poseen el transgén, indicaría una potencial intervención terapéutica en el estado patológico.

Alternativamente, los homólogos no humanos de PC-LECTINA pueden utilizarse para obtener un animal "knock out" de PC-LECTINA, que tiene un gen que codifica PC-LECTINA defectivo o alterado como resultado de una recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica PC-LECTINA y un DNA genómico alterado que codifica PC-LECTINA introducido en una célula embrionaria del animal. Por ejemplo, el cDNA que codifica PC-LECTINA puede utilizarse para clonar el DNA genómico que codifica PC-LECTINA de acuerdo con técnicas establecidas. Una porción del DNA genómico que codifica PC-LECTINA puede delecionarse o reemplazarse por otro gen, como un gen que codifica un marcador seleccionable que puede utilizarse para monitorizar la integración.

Normalmente, se incluyen varias kilobases de DNA flanqueante inalterado (tanto en el extremo 5' como 3') en el vector (véase por ejemplo, Thomas y Capecchi, 1987, Cell 51:503 para una descripción de los vectores de recombinación homóloga). El vector se introduce en una línea de células madre embrionarias (por ejemplo, mediante electroporación) y las células en las que el DNA introducido se ha recombinado de forma homóloga con el DNA endógeno se seleccionan (véase por ejemplo, Li et al., 1992, Cell 69:915). Las células seleccionadas se inyectan entonces en un blastocisto de un animal (por ejemplo, un ratón o rata) para formar quimeras de agregación (véase por ejemplo, Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, Ed., IRL, Oxford, 1987, págs. 113-152).

Un embrión quimérico puede implantarse entonces en un animal receptor hembra pseudoembarazada adecuada y el embrión se lleva a término para obtener el animal "knock out". La progenie que posee el DNA recombinado de forma homóloga en sus células germinales puede identificarse mediante técnicas estándar y utilizarse para la cría de animales en los que todas las células del animal contienen el DNA recombinado de forma homóloga. Los animales "knock out" pueden caracterizarse por ejemplo, por su capacidad de defenderse frente a ciertos estados patológicos y por su desarrollo de estados patológicos debido a la ausencia del polipéptido PC-LECTINA.

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Métodos para la detección de PC-LECTINA

Otro aspecto de la presente invención está relacionado con los métodos para detectar polinucleótidos de PC-LECTINA, proteínas PC-LECTINA y variantes de las mismas, así como métodos para identificar una célula que expresa PC-LECTINA. La PC-LECTINA parece expresarse en los xenoinjertos LAPC que derivan de la metástasis en nódulos linfáticos y hueso de un tumor de próstata, y el perfil de expresión de PC-LECTINA la convierte en un marcador diagnóstico potencial para la enfermedad metastatizada. En este contexto, el estado de los productos génicos de PC-LECTINA puede proporcionar información útil para predecir una serie de factores lo que incluye susceptibilidad a estadíos avanzados de la enfermedad, tasa de progresión, y/o agresividad del tumor. Tal como se discute en detalle más adelante, el estado de los productos génicos de PC-LECTINA en muestras de pacientes pueden analizarse mediante una serie de protocolos que son bien conocidos en la materia lo que incluye análisis inmunohistoquímico, la variedad de técnicas de Northern blot lo que incluye hibridación in situ, análisis por RT-PCR (por ejemplo en muestras microdiseccionadas por captura por láser), análisis Western blot y análisis de microchips de tejidos.

Más en particular, la invención proporciona ensayos para la detección de polinucleótidos de PC-LECTINA en una muestra biológica, como suero, tejido óseo, tejido de próstata, y otros tejidos, orina, semen, preparaciones celulares, y similares. Los polinucleótidos de PC-LECTINA detectables incluyen, por ejemplo, un gen de PC-LECTINA o los fragmentos del mismo, mRNA de PC-LECTINA, variante de corte y empalme alternativo de los mRNA de PC-LECTINA, y moléculas de DNA o RNA recombinante que contienen un polinucleótido de PC-LECTINA. Son bien conocidos en la materia los métodos para amplificar y/o detectar la presencia de polinucleótidos de PC-LECTINA y pueden emplearse en la práctica de este aspecto de la invención.

En una realización, un método para detectar un mRNA de PC-LECTINA en una muestra biológica comprende la producción de cDNA a partir de la muestra mediante transcripción reversa utilizando al menos un cebador; la amplificación del cDNA así producido utilizando polinucleótidos de PC-LECTINA como cebadores directos y reversos para amplificar el cDNA de PC-LECTINA; y la detección de la presencia del cDNA de PC-LECTINA amplificado. De forma opcional, puede determinarse la secuencia del cDNA de PC-LECTINA amplificado. En otra realización, un método para detectar un gen de PC-LECTINA en una muestra biológica comprende primero aislar el DNA genómico de la muestra; amplificar el DNA genómico aislado utilizando polinucleótidos de PC-LECTINA como cebadores directos y reversos para amplificar el gen de PC-LECTINA; y detectar la presencia del gen PC-LECTINA amplificado. Cualquier número de combinaciones de sondas directas y reversas adecuadas puede diseñarse a partir de las secuencias de nucleótidos proporcionadas para PC-LECTINA (Fig. 1A-D; Id. de Sec. Nº 1) y utilizarlas para este propósito.

La invención también proporciona ensayos para detectar la presencia de una proteína de PC-LECTINA en un tejido de otra muestra biológica como suero, hueso, próstata, y otros tejidos, orina, preparaciones celulares, y similares. Los métodos para detectar una proteína PC-LECTINA son también conocidos e incluyen, por ejemplo, inmunoprecipitación, análisis inmunohistoquímico, análisis de Western blot, ensayos de unión molecular y celular, ELISA, ELIFA y similares. Por ejemplo, en una realización, un método para detectar la presencia de una proteína PC-LECTINA en una muestra biológica comprende primero poner en contacto la muestra con un anticuerpo frente a PC-LECTINA, un fragmento reactivo de PC-LECTINA del mismo, o una proteína recombinante que contenga una región de unión a antígeno de un anticuerpo de PC-LECTINA; y después detectar la unión de la proteína PC-LECTINA en la muestra.

También se proporcionan los métodos para identificar una célula que expresa PC-LECTINA. En una realización, un ensayo para identificar una célula que expresa un gen de PC-LECTINA comprende detectar la presencia de mRNA de PC-LECTINA en la célula. Los métodos para la detección de mRNA concretos en células son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, ensayos de hibridación utilizando sondas de DNA complementarias (como hibridación in situ utilizando ribosondas marcadas de PC-LECTINA, Northern blot y técnicas relacionadas) y varios ensayos de amplificación de ácidos nucleicos (como RT-PCR utilizando cebadores complementarios específicos de PC-LECTINA, y otro tipo de métodos de detección de amplificación, como, por ejemplo, DNA ramificado, SISBA, TMA y similares). Alternativamente, un ensayo para identificar una célula que expresa un gen de PC-LECTINA comprende la detección de la presencia de proteína PC-LECTINA en la célula o secretada por la célula. Varios métodos para la detección de proteínas son bien conocidos en la materia y pueden utilizarse para la detección de proteínas PC-LECTINA y células que expresan PC-LECTINA.

El análisis de la expresión de PC-LECTINA puede también ser útil como una herramienta para identificar y evaluar los agentes que modulan la expresión génica de PC-LECTINA. Por ejemplo, la expresión de PC-LECTINA está restringida a testículos normales, así como en cáncer de próstata, y PC-LECTINA puede también expresarse en otro tipo de cáncer. La identificación de una molécula o agente biológico que puede inhibir la expresión de PC-LECTINA o la sobreexpresión en células cancerígenas puede tener un valor terapéutico. Dicho agente puede identificarse utilizando un cribado que cuantifique la expresión de PC-LECTINA mediante RT-PCR, hibridación de ácidos nucleicos o unión de anticuerpos.

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Monitorización del estado de la PC-LECTINA y sus productos

Los ensayos que evalúan el estado del gen PC-LECTINA y los productos génicos de PC-LECTINA en un individuo pueden proporcionar información sobre el crecimiento o potencial oncogénico de una muestra biológica de este individuo. Por ejemplo, ya que el mRNA de PC-LECTINA está altamente expresado en el cáncer de próstata, y no en la mayoría de tejido normal, pueden utilizarse los ensayos que evalúan los niveles relativos de transcritos de mRNA de PC-LECTINA o proteínas de PC-LECTINA en una muestra biológica para diagnosticar una enfermedad asociada con la desregulación de PC-LECTINA, como el cáncer, y pueden proporcionar información pronóstica útil para definir opciones terapéuticas adecuadas. De forma similar, los ensayos que evalúan la integridad de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de PC-LECTINA en una muestra biológica, pueden también utilizarse en este contexto.

El descubrimiento de que el mRNA de PC-LECTINA está tan altamente expresado en el cáncer de próstata, y no en la mayoría de tejidos normales, proporciona evidencias de que este gen está asociado con crecimiento celular desregulado y por lo tanto identifica este gen y sus productos como dianas que puede utilizar el experto en la materia para evaluar las muestras biológicas de individuos sospechosos de padecer una enfermedad asociada con la desregulación de PC-LECTINA. En otro ejemplo, debido a que la expresión de PC-LECTINA está normalmente restringida a los testículos, también se pueden evaluar muestras biológicas cogidas de otros tejidos para detectar la expresión de PC-LECTINA como indicador de metástasis. En este contexto, la evaluación del estado de expresión del gen PC-LECTINA y sus productos, puede utilizarse para obtener información sobre el potencial de enfermedad de una muestra de tejido. El término "estado de expresión" en este contexto se utiliza para referirse ampliamente a la variedad de factores involucrados en la expresión, función y regulación de un gen y sus productos, como el nivel de expresión de mRNA, la integridad de los productos génicos expresados (como las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos) y las modificaciones transcripcionales y traduccionales a estas moléculas.

El estado de expresión de PC-LECTINA puede proporcionar información útil para predecir la susceptibilidad a un estadío particular de la enfermedad, progresión, y/o agresividad del tumor. La invención proporciona métodos y ensayos para determinar el estado de expresión de PC-LECTINA y diagnosticar cánceres que expresan PC-LECTINA, como cáncer de próstata, mama, vejiga, pulmón, hueso, colon, páncreas, testículos, cérvix y ovarios. El estado de expresión de PC-LECTINA en muestras de pacientes puede analizarse mediante una serie de métodos bien conocidos en la materia, lo que incluye sin limitarse, análisis inmunohistoquímico, hibridación in situ, análisis RT-PCR en muestras microdiseccionadas por captura por láser, análisis de Western blot de muestras clínicas y líneas celulares, y análisis de microchip de tejidos. Los protocolos típicos para evaluar el estado de expresión del gen PC-LECTINA y los productos génicos puede encontrarse, por ejemplo en Current Protocols In Molecular Biology, Unidades 2 [Northern Blot], 4 [Southern Blot], 15 [Inmunoblot] y 18 [análisis por PCR], Frederick M. Ausubul et al. eds., 1995.

En un aspecto, la invención proporciona métodos para monitorizar los productos génicos de PC-LECTINA determinando el estado de los productos génicos de PC-LECTINA expresados por las células en una muestra de tejido de prueba de un individuo sospechoso de padecer una enfermedad asociada con crecimiento celular desregulado (como hiperplasia o cáncer) y después comparar el estado así determinado con el estado de los productos génicos de PC-LECTINA en la correspondiente muestra normal, la presencia de productos génicos de PC-LECTINA aberrantes en la muestra prueba en relación con la muestra normal proporciona un indicio de la presencia de crecimiento celular desregulado en las células del individuo.

En otro aspecto, la invención proporciona ensayos útiles para determinar la presencia de cáncer en un individuo, que comprende la detección de un aumento significativo en el mRNA de PC-LECTINA o expresión de la proteína en una célula prueba o muestra de tejido en relación con los niveles de expresión de la correspondiente célula normal o tejido. La presencia de mRNA de PC-LECTINA puede, por ejemplo, evaluarse en muestras de tejido lo que incluye pero no se limita a cáncer de colon, pulmón, próstata, páncreas, vejiga, mama, ovario, cérvix, testículos, cabeza y cuello, cerebro, estómago, huesos, etc. La presencia de expresión de PC-LECTINA significativa en cualquiera de estos tejidos puede ser útil para indicar la emergencia, presencia y/o gravedad de estos cánceres o una metástasis del cáncer originado en otro tejido, ya que los correspondientes tejidos normales no expresan el mRNA de PC-LECTINA o lo hacen en niveles bajos.

En una realización relacionada, el estado de la expresión de PC-LECTINA puede determinarse a nivel de proteína en lugar de a nivel del ácido nucleico. Por ejemplo, dicho método o ensayo comprenderá la determinación del nivel de proteína PC-LECTINA expresada por las células en una muestra de tejido de prueba y comparar el nivel así determinado con el nivel de PC-LECTINA expresado en la correspondiente muestra normal. En una realización, se evalúa la presencia de proteína PC-LECTINA, por ejemplo, utilizando métodos inmunohistoquímicos. Los anticuerpos PC-LECTINA o las parejas de unión capaces de detectar la expresión de proteína PC-LECTINA pueden utilizarse en una serie de formatos de ensayo bien conocidos en la materia para este propósito.

En otras realizaciones relacionadas, se puede evaluar la integridad de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de PC-LECTINA en una muestra biológica para poder identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas como inserciones, deleciones, sustituciones y similares. Dichas realizaciones son útiles porque las perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos se observan en un gran número de proteínas asociadas con un fenotipo de crecimiento desregulado (véase por ejemplo, Marrogi et al., J. Cutan. Pathol. 26(8): 369-378 (1999)). En este contexto, una amplia variedad de ensayos para observar perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, el tamaño y la estructura de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de los productos génicos de PC-LECTINA pueden observarse por los protocolos de Northern, Southern, Western, PCR y secuenciación de DNA discutidos aquí. Además, otros métodos para observar perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos como análisis del polimorfismo de conformación de cadena sencilla son bien conocidos en la materia (véase por ejemplo Patentes Estadounidenses Nº 5.382.510 y 5.952.170).

En otra realización, se puede examinar el estado de metilación del gen PC-LECTINA en una muestra biológica. La desmetilación y/o hipermetilación aberrante de las islas CpG en las regiones reguladoras en 5' del gen, suceden de forma frecuente en células inmortalizadas y transformadas y pueden resultar en la expresión alterada de varios genes. Por ejemplo, la hipermetilación del promotor de la glutatión S-transferasa de la clase pi (una proteína expresada en próstata normal pero no en >90% de carcinomas de próstata) aparece silenciada permanentemente la transcripción de este gen y es la alteración genómica detectada más frecuentemente en los carcinomas de próstata (De Marzo et al., Am. J. Pathol. 155(6): 1985-1992 (1999)). Además, esta alteración está presente en al menos el 70% de los casos de neoplasia intraepitelial prostática de grado alto (PIN) (Brooks et al, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998, 7:531-536).

En otro ejemplo, la expresión del gen específico de tumor LAGE-I (que no se expresa en próstata normal pero sí se expresa en el 25-50% de los cánceres de próstata) está inducida por la desoxiazacitidina en las células linfoblastoides, lo que sugiere que la expresión tumoral se debe a la desmetilación (Lethe et al., 1998, Int. J. Cancer 76(6): 903-908). En este contexto, una serie de ensayos para examinar el estado de metilación de un gen son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, se pueden utilizar enzimas de restricción sensibles a la metilación en aproximaciones de hibridación Southern que no pueden cortar secuencias que contienen sitios CpG metilados para poder evaluar el estado general de metilación de las islas CpG.

Además, la MSP (PCR específica de metilación) puede perfilar rápidamente el estado de metilación de todas los sitios CpG presentes en una isla CpG de un gen determinado. Este procedimiento implica la modificación inicial del DNA mediante bisulfito sódico (que convertirá todas las citosinas no metiladas a uracilo) seguido de la amplificación utilizando cebadores específicos para el DNA metilado frente al no metilado. Los protocolos que implican interferencia en la metilación pueden también encontrarse por ejemplo en Current Protocols In Molecular Biology, Unidades 12, Frederick M. Ausubel et al. eds., 1995.

En otra realización relacionada, la invención proporciona ensayos útiles en la determinación de la presencia de cáncer en un individuo, que comprende la detección de un cambio significativo en las variantes de corte y empalme alternativas de PC-LECTINA expresado en una célula de prueba o tejido muestra en relación con los niveles de expresión en las correspondientes células normales o tejido. La monitorización de las variantes de corte y empalme alternativas de PC-LECTINA es útil ya que los cambios en el corte y empalme alternativo de proteínas se sugiere como uno de los pasos en una serie de eventos que conducen a la progresión del cáncer (véase por ejemplo, Carstens et al., Oncogene 15(250: 3059-3065 (1997)).

La amplificación génica proporciona un método adicional para evaluar el estado de PC-LECTINA. La amplificación génica puede medirse en una muestra directamente, por ejemplo, mediante Southern blot convencional, Northern blot para cuantificar la transcripción de mRNA [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], dot blot (análisis de DNA), o hibridación in situ, utilizando una sonda marcada adecuadamente, en base a las secuencias proporcionadas aquí. Alternativamente, pueden emplearse los anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, lo que incluye dúplex de DNA, dúplex de RNA, y dúplex híbridos de DNA-RNA o dúplex DNA-proteína. Los anticuerpos a su vez pueden marcarse y el ensayo puede llevarse a cabo cuando el dúplex está unido a una superficie, por lo que tras la formación del dúplex en una superficie, puede detectarse la presencia de anticuerpo unido al dúplex.

Además de los tejidos descritos anteriormente, puede investigarse convenientemente la presencia de células cancerígenas en sangre periférica, lo que incluye pero no se limita a cáncer de próstata, utilizando RT-PCR para detectar la expresión de PC-LECTINA. La presencia de mRNA de PC-LECTINA amplificable por RT-PCR proporciona una indicación de la presencia de cáncer. Los ensayos por detección de RT-PCR para células tumorales en sangre periférica se están evaluando actualmente para utilizarse en el diagnóstico y manejo de una serie de tumores sólidos humanos. En el campo del cáncer de próstata, estos incluyen ensayos de RT-PCR para la detección de células que expresan PSA y PSM (Verkaik et al., 1997, Urol. Res. 25: 373-384; Ghossein et al., 1995, J. Clin. Oncol. 13: 1195-2000; Heston et al., 1995, Clin. Chem. 41: 1687-1688). Los ensayos de RT-PCR son bien conocidos en la materia.

Un aspecto relacionado de la invención está dirigido hacia la predicción de la susceptibilidad de un individuo para desarrollar cáncer. En una realización, un método para predecir la susceptibilidad al cáncer comprende la detección de mRNA de PC-LECTINA o proteína PC-LECTINA en una muestra de tejido, su presencia indica susceptibilidad al cáncer, en el que el grado de expresión del mRNA de PC-LECTINA presente es proporcional al grado de susceptibilidad. En una realización específica, se examinó la presencia de PC-LECTINA en tejido de próstata, con la presencia de PC-LECTINA en la muestra proporcionando una indicación de susceptibilidad al cáncer de próstata (o la emergencia o existencia de un tumor de próstata). En una realización estrechamente relacionada, se puede evaluar la integridad de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de PC-LECTINA en una muestra biológica para poder identificar las perturbaciones en la estructura de estas moléculas como inserciones, deleciones, sustituciones y similares, la presencia de una o más perturbaciones en los productos génicos de PC-LECTINA en la muestra proporciona un indicio de susceptibilidad al cáncer (o la emergencia o existencia de un tumor).

Otro aspecto relacionado de la invención está dirigido hacia métodos para valorar la agresividad del tumor. En una realización, un método para valorar la agresividad del tumor comprende determinar el nivel de mRNA de PC-LECTINA o proteína PC-LECTINA expresada en las células de una muestra del tumor, en comparación con el nivel así determinado con el nivel de mRNA de PC-LECTINA o proteína PC-LECTINA expresada en el correspondiente tejido normal tomado del mismo individuo o muestra de referencia de tejido normal, en el que el grado de expresión de mRNA de PC-LECTINA o proteína PC-LECTINA en la muestra de tumor en relación con la muestra normal indica el grado de agresividad. En una realización específica, se evalúa la agresividad de los tumores de próstata determinando la extensión en la que PC-LECTINA se expresa en las células tumorales, cuanto mayor es el nivel de expresión indica mayor agresividad del tumor. En una realización estrechamente relacionada, se puede evaluar la integridad de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de PC-LECTINA en una muestra biológica para poder identificar las perturbaciones en la estructura de estas moléculas como inserciones, deleciones, sustituciones y similares, la presencia de una o más perturbaciones es indicio de tumores más agresivos.

Otro aspecto relacionado de la invención está dirigido hacia métodos para observar la progresión de un tumor en un individuo a lo largo del tiempo. En una realización, los métodos para observar la progresión de un tumor en un individuo a lo largo del tiempo comprende determinar el nivel de mRNA de PC-LECTINA o proteína PC-LECTINA expresada en las células de una muestra del tumor, en comparación con el nivel así determinado con el nivel de mRNA de PC-LECTINA o proteína PC-LECTINA expresada en la muestra de tejido equivalente tomado del mismo individuo en otro momento, en el que el grado de expresión de mRNA de PC-LECTINA o proteína PC-LECTINA en la muestra de tumor a lo largo del tiempo proporciona información sobre la progresión del cáncer. En una realización específica, se evalúa la progresión de un cáncer mediante la determinación de la extensión en que la expresión de PC-LECTINA en las células tumorales se altera durante el tiempo, cuanto mayor es el nivel de expresión indica mayor progresión del cáncer. En una realización estrechamente relacionada, se puede evaluar la integridad de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de PC-LECTINA en una muestra biológica para poder identificar las perturbaciones en la estructura de estas moléculas como inserciones, deleciones, sustituciones y similares, la presencia de una o más perturbaciones es indicio de progresión del cáncer.

Las aproximaciones diagnósticas anteriores pueden combinarse con cualquiera de una amplia variedad de protocolos de pronóstico y de diagnóstico conocidos en la materia. Por ejemplo, otra realización de la invención descrita aquí está dirigida a métodos para observar una coincidencia entre la expresión del gen PC-LECTINA y los productos génicos de PC-LECTINA (o perturbaciones en el gen de PC-LECTINA y productos génicos de PC-LECTINA) y un factor que está asociado con el tumor maligno como forma de diagnóstico y para pronosticar el estado de una muestra de tejido. En este contexto, puede utilizarse una amplia variedad de factores asociados con el cáncer como la expresión de genes asociados con el cáncer (lo que incluye expresión de PSA, PSCA y PSM) así como observaciones citológicas evidentes (véase por ejemplo Bocking et al., 1984, Anal. Quant. Cytol. 6(2):74-88; Eptsein, 1995, Hum. Pathol. 1995 Feb;26(2):223-9; Thorson et al., 1998, Mod. Pathol. 11(6):543-51; Baisden et al., 1999, Am. J. Surg. Pathol. 23(8):918-24). Los métodos para observar una coincidencia entre la expresión del gen PC-LECTINA y los productos génicos de PC-LECTINA (o perturbaciones en el gen de PC-LECTINA y productos génicos de PC-LECTINA) y un factor adicional que está asociado con el tumor es útil, por ejemplo, porque la presencia de un grupo o constelación de factores específicos que coinciden, proporcionan información crucial para el diagnóstico y pronóstico del estado de una muestra de tejido.

En una realización típica, los métodos para observar una coincidencia entre la expresión del gen de la PC-LECTINA y los productos génicos de PC-LECTINA (o perturbaciones en el gen de la PC-LECTINA y productos génicos de PC-LECTINA) y un factor que está asociado con la malignidad implica la detección de la sobreexpresión del mRNA o proteína PC-LECTINA en una muestra de tejido, la detección de la sobreexpresión de mRNA o proteína PSA en una muestra de tejido, y observar una coincidencia de la sobreexpresión de mRNA o proteína PC-LECTINA y el mRNA o proteína PSA. En una realización específica, se examina la expresión de los mRNA de PC-LECTINA y PSA en tejido de próstata. En una realización preferida, la coincidencia de la sobreexpresión del mRNA de PC-LECTINA y el mRNA de PSA en la muestra proporciona una indicación de cáncer de próstata, susceptibilidad al cáncer de próstata o la emergencia o existencia de un tumor de próstata.

Los métodos para detectar y cuantificar la expresión de mRNA o proteína PC-LECTINA se describen aquí y el uso de tecnologías estándar de detección y cuantificación de ácidos nucleicos y proteínas son bien conocidos en la materia. Los métodos estándar de detección y cuantificación de mRNA de PC-LECTINA incluyen la hibridación in situ utilizando ribosondas marcadas de PC-LECTINA, Northern blot y tecnologías relacionadas que utilizan sondas de polinucleótido de PC-LECTINA, análisis de RT-PCR utilizando cebadores específicos de PC-LECTINA, y otros métodos de detección de tipo amplificación, como, por ejemplo, DNA ramificado, SISBA, TMA y similares. En una realización específica, se puede utilizar la RT-PCR semicuantitativa para detectar y cuantificar la expresión de mRNA de PC-LECTINA, como se describe en los Ejemplos que siguen más adelante. Puede utilizarse cualquier número de cebadores capaces de amplificar la PC-LECTINA para este propósito, lo que incluye pero no se limita a los diferentes grupos de cebadores específicamente descritos aquí. Los métodos estándar de detección y cuantificación de proteínas pueden utilizarse para este propósito. En una realización específica, pueden utilizarse anticuerpos policlonales o monoclonales específicamente reactivos con la proteína PC-LECTINA de tipo salvaje en un ensayo inmunohistoquímico de tejido biopsiado.

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Identificación de moléculas que interactúan con PC-LECTINA

Las secuencias de proteína PC-LECTINA descritas aquí permiten al experto en la materia identificar moléculas que interaccionan con ellas mediante cualquiera de los protocolos aceptados en la materia. Por ejemplo puede utilizarse uno de los sistemas denominados sistemas de trampa de interacción (también referido como "ensayo de dos híbridos"). En tales sistemas, las moléculas que interaccionan reconstituyen un factor de transcripción y dirigen la expresión de un gen marcador, cuya expresión se investiga entonces. Los sistemas típicos para identificar las interacciones proteína-proteína in vivo a través de la reconstitución de un activador transcripcional eucariota se describen por ejemplo en las Patentes Estadounidenses Nº 5.955.280, 5.925.523, 5.846.722 y 6.004.746.

Alternativamente pueden identificarse moléculas que interaccionan con secuencias de proteína de PC-LECTINA mediante el cribado de bibliotecas de péptidos. En dichos métodos, los péptidos que se unen a las moléculas receptoras seleccionadas, como la PC-LECTINA, se identifican mediante el cribado de bibliotecas que codifican una colección de aminoácidos aleatoria o controlada. Los péptidos codificados por las bibliotecas se expresan como proteínas de fusión de proteínas de la cubierta de bacteriófagos, y las partículas de bacteriófagos se criban entonces frente a los receptores de interés. Los péptidos, que poseen una amplia variedad de usos como reactivos terapéuticos o de diagnóstico, pueden identificarse de esta manera sin una información previa de la estructura del ligando esperado o molécula receptora. Las bibliotecas de péptidos típicas y los métodos de cribado que se pueden utilizar para identificar moléculas que interaccionan con secuencias de la proteína PC-LECTINA se describen por ejemplo, en las Patentes Estadounidenses Nº 5.723.286 y 5.733.731.

Alternativamente, las líneas celulares que expresan PC-LECTINA pueden utilizarse para identificar las interacciones proteína-proteína mediadas por PC-LECTINA. Esta posibilidad puede examinarse utilizando técnicas de inmunoprecipitación como se muestra por otros (Hamilton BJ, et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999, 261:646-51). Normalmente la proteína PC-LECTINA puede inmunoprecipitarse a partir de líneas celulares de cáncer de próstata que expresan PC-LECTINA utilizando anticuerpos anti-PC-LECTINA. Alternativamente, pueden utilizarse anticuerpos frente a la cola de His en una línea celular diseñada para expresar PC-LECTINA (vectores mencionados anteriormente). El complejo imnmunoprecipitado puede analizarse por la asociación de proteínas mediante procedimientos como Western blot, marcaje de proteínas en la metionina 355, microsecuenciación de proteínas, tinción de plata y electroforesis bidimensional en gel.

En otras realizaciones relacionadas de estos ensayos de cribado se incluyen métodos para la identificación de moléculas pequeñas que interaccionan con PC-LECTINA. Por ejemplo, pueden identificarse moléculas pequeñas que interfieren con la unión de la lectina a las porciones carbohidrato de otras moléculas, como las glucoproteínas. Los métodos típicos se discuten por ejemplo en la Patente Estadounidense Nº 5.928.868 e incluyen métodos para formar ligandos híbridos en los que al menos un ligando es una molécula pequeña. En una realización ilustrativa, el ligando híbrido se introduce en células que a su vez contienen un primer y un segundo vector de expresión. Cada vector de expresión incluye DNA para expresar una proteína híbrida que codifica una proteína diana unida a una secuencia codificante para un módulo transcripcional. Las células además contienen un gen marcador, cuya expresión está condicionada a la proximidad de la primera y segunda proteínas híbridas entre ellas, un evento que ocurre sólo si el ligando híbrido se une a los sitios diana de ambas proteínas híbridas. Aquellas células que expresan el gen marcador se seleccionan y se identifica la molécula pequeña desconocida o la proteína híbrida desconocida.

Una realización típica de esta invención consiste en un método de cribado de una molécula que interacciona con una secuencia de aminoácidos de PC-LECTINA mostrada en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2), que comprende los pasos de poner en contacto una población de moléculas con la secuencia de aminoácidos de PC-LECTINA, permitiendo a la población de moléculas y la secuencia de aminoácidos de PC-LECTINA interaccionar bajo condiciones que facilitan una interacción, determinar la presencia de una molécula que interacciona con la secuencia de aminoácidos de PC-LECTINA y después separar las moléculas que no interaccionan con la secuencia de aminoácidos de PC-LECTINA de las moléculas que interaccionan con la secuencia de aminoácidos de PC-LECTINA. En una realización específica, el método incluye además purificar una molécula que interacciona con la secuencia de aminoácidos de PC-LECTINA. En una realización preferida, la secuencia de aminoácidos de PC-LECTINA se pone en contacto con una biblioteca de péptidos.

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Métodos y composiciones terapéuticas

La identificación de la PC-LECTINA como una proteína de cáncer de próstata, proporciona un abanico de aproximaciones terapéuticas para el tratamiento del cáncer de próstata. Tal como se discutió anteriormente, la PC-LECTINA se une a porciones azúcar y puede estar involucrada en la invasión, adhesión o migración. Además, la PC-LECTINA presenta epítopos en la superficie celular que pueden ser dianas para la terapia.

El perfil de expresión de la PC-LECTINA recuerda al de MAGE, PSA y PMSA, que son genes específicos de tejido que están sobreexpresados en melanomas y otros tipos de cáncer (Van den Eynde y Boon, Int J Clin Lab Res. 27:81-86, 1997). Debido a su expresión específica de tejido y los niveles elevados de expresión en cáncer, estas moléculas están siendo investigadas en la actualidad como dianas para vacunas contra el cáncer (Durrant, Anticancer Drugs 8:727-733, 1997; Reynolds et al., Int J Cancer 72:972-976, 1997). El patrón de expresión de la PC-LECTINA proporciona la evidencia de que además es una diana ideal para una aproximación a una vacuna contra el cáncer para el cáncer de próstata, ya que su expresión no se detecta en la mayoría de tejidos normales. Sus características estructurales como transportador potencial de calcio también proporcionan evidencias de que la PC-LECTINA puede ser una diana de molécula pequeña, así como una diana para estrategias terapéuticas basadas en anticuerpos. La estrategia terapéutica puede diseñarse para inhibir la función transportadora de calcio de la molécula o para dirigirse hacia la molécula de PC-LECTINA en sí.

De acuerdo con esto, las aproximaciones terapéuticas dirigidas contra las porciones extracelulares de PC-LECTINA, o que pretenden inhibir la actividad de la proteína PC-LECTINA, se espera que sean útiles para pacientes que padecen de cáncer de próstata y otros cánceres que expresan PC-LECTINA. Las aproximaciones terapéuticas que pretenden inhibir la actividad de la proteína PC-LECTINA generalmente son de dos clases. Una clase comprende diferentes métodos para inhibir la unión o asociación de la proteína PC-LECTINA con su pareja de unión o con otras proteínas. Otra clase comprende una serie de métodos para inhibir la transcripción del gen de la PC-LECTINA o traducción del mRNA de la PC-LECTINA.

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PC-LECTINA como diana de superficie celular para terapias basadas en anticuerpos

Las características estructurales de la PC-LECTINA indican que esta molécula es probablemente un antígeno de superficie celular, proporcionando una diana atractiva para las estrategias terapéuticas basadas en anticuerpos. Debido a que la PC-LECTINA se expresa en células cancerígenas y no en la mayoría de células normales, se espera que la administración sistémica de composiciones inmunoreactivas a PC-LECTINA presenten excelente sensibilidad sin efectos tóxicos, inespecíficos y/o no dirigidos provocados por la unión de la molécula inmunoterapéutica a los órganos y tejidos a los que no se dirige. Los anticuerpos específicamente reactivos con los dominios extracelulares de la PC-LECTINA pueden ser útiles para tratar cánceres que expresan la PC-LECTINA de forma sistémica, tanto conjugados con una toxina o con un agente terapéutico, o como anticuerpos desnudos capaces de inhibir la proliferación o función celular.

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Los anticuerpos anti-PC-LECTINA pueden introducirse en un paciente para que el anticuerpo se una a PC-LECTINA en las células cancerígenas y mediar así la destrucción de las células y el tumor y/o inhibir el crecimiento de las células o el tumor. Los mecanismos mediante los que los anticuerpos ejercen su efecto terapéutico puede incluir la citólisis mediada por el complemento, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, modulación de la función fisiológica de PC-LECTINA, inhibición de la unión a ligando o rutas de transducción de señales, modulación de la diferenciación de células tumorales, alteración de los perfiles del factor de angiogénesis tumoral, y/o mediante la inducción de apoptosis. Los anticuerpos frente a PC-LECTINA pueden conjugarse a agentes terapéuticos o tóxicos y utilizarse para liberar el agente terapéutico o tóxico directamente en las células tumorales portadoras de PC-LECTINA. Ejemplos de agentes tóxicos incluyen, pero no se limitan a, calchemicina, maitansinoides, radioisótopos como ^{131}I, itrio y bismuto.

La inmunoterapia del cáncer que utiliza anticuerpos anti-PC-LECTINA puede seguir las instrucciones generadas a partir de las diferentes aproximaciones que se han utilizado con éxito en el tratamiento de otros tipos de cáncer, lo que incluye pero no se limita al cáncer de colon (Arlen et al., 1998, Crit. Rev. Immunol. 18:133-138), mieloma múltiple (Ozaki et al., 1997, Blood 90: 3179-3186; Tsunenari et al., 1997, Blood 90:2437-2444), cáncer gástrico (Kasprzyk et al., 1992, Cancer Res. 52: 2771-2776), linfoma de células B (Funakoshi et al., 1996, J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19:93-101), leucemia (Zhong et al., 1996, Leuk. Res. 20:581-589), cáncer colorectal (Moun et al., 1994, Cancer Res. 54:6160-6166); Velders et al., 1995, Cancer Res. 55:4398-4403), y cáncer de mama (Shepard et al., 1991, J. Clin. Immunol. 11:117-127). Algunas aproximaciones terapéuticas implican la conjugación de anticuerpos desnudos a una toxina, como la conjugación de ^{131}I a anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, Rituxan^{TM}, IDEC Pharmaceuticals Corp.), mientras que otras implican la coadministración de anticuerpos y otros agentes terapéuticos, como Herceptin^{TM} (trastuzumab) con paclitaxel (Genentech, Inc.). Para el tratamiento del cáncer de próstata, por ejemplo, puede administrarse anticuerpos anti-PC-LECTINA junto con radiación, quimioterapia o ablación hormonal.

Aunque la terapia con anticuerpo anti-PC-LECTINA puede ser útil para todos los estadíos del cáncer, la terapia con anticuerpos será adecuada en particular en el cáncer avanzado o metastático. El tratamiento con terapia de anticuerpos de la invención puede estar indicado para pacientes que han recibido previamente una o más quimioterapias, mientras que es preferible la combinación de terapia con anticuerpos de la invención con un régimen de radiación o quimioterapia para pacientes que no han recibido tratamiento quimioterapéutico. Adicionalmente, la terapia con anticuerpos puede permitir el uso de dosificaciones reducidas de quimioterapia concomitante, en particular para pacientes que no toleran muy bien la toxicidad de los agentes quimioterapéuticos.

Será deseable para algunos pacientes de cáncer evaluar la presencia y el nivel de expresión de PC-LECTINA, preferiblemente utilizando evaluaciones inmunohistoquímicas de tejido tumoral, análisis cuantitativo por imágenes de PC-LECTINA, u otras técnicas capaces de indicar de forma fiable la presencia y el grado de expresión de PC-LECTINA. El análisis inmunohistoquímico de las biopsias de tumor o especímenes quirúrgicos pueden ser preferibles para este
propósito. Los métodos para el análisis inmunohistoquímico de tejidos tumorales son bien conocidos en la materia.

Los anticuerpos monoclonales anti-PC-LECTINA útiles en el tratamiento del cáncer de próstata y otros tipos de cáncer incluyen aquellos que no son capaces de iniciar una respuesta inmune potente frente al tumor y aquellos que son capaces de dirigir la citotoxicidad. Respecto a esto, los anticuerpos monoclonales (mAb) anti-PC-LECTINA pueden provocar la lisis de células tumorales mediante mecanismos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) o mediada por el complemento, requiriendo ambas una porción intacta de Fc de la molécula de inmunoglobulina para la interacción con sitios del receptor Fc de células efectoras o proteínas del complemento. Además, los mAb anti-PC-LECTINA que ejercen un efecto biológico directo sobre el crecimiento del tumor, son útiles en la práctica de la invención. Los mecanismos potenciales mediante los que tales mAb directamente citotóxicos pueden actuar incluyen la inhibición del crecimiento celular, modulación de la diferenciación celular, modulación de los perfiles del factor de angiogénesis tumoral, y la inducción de apoptosis. El mecanismo mediante el que un mAb anti-PC-LECTINA particular ejerce un efecto anti-tumoral podrá evaluarse utilizando cualquier número de ensayos in vitro diseñados para determinar ADCC, ADMMC, lisis celular mediada por el complemento, y similares, como se conoce generalmente en la materia.

El uso de anticuerpos monoclonales murinos u otros mAb no humanos, o quiméricos humano/ratón puede inducir respuestas inmunes moderadas a fuertes en algunos pacientes. En algunos casos, esto resultará en la eliminación del anticuerpo de la circulación y reducción de la eficacia. En los casos más graves, dicha respuesta inmune puede llevar a la formación extensiva de complejos inmunes que, potencialmente, pueden provocar fallo renal. De acuerdo con esto, los anticuerpos monoclonales preferibles utilizados en la practica de los métodos terapéuticos de la invención son aquellos que son totalmente humanos o humanizados y que se unen específicamente al antígeno diana de PC-LECTINA con alta afinidad pero que no presentan antigenicidad o ésta es muy baja en el paciente.

Los métodos terapéuticos de la invención contemplan la administración de mAb anti-PC-LECTINA únicos así como la combinación, o cócteles de diferentes mAb. Dichos cócteles de mAb pueden presentar ciertas ventajas considerando que contienen mAb dirigidos contra diferentes epítopos, explotan diferentes mecanismos efectores o combinan directamente mAb citotóxicos con mAb que confían en la funcionalidad inmunoefectora. Dichos mAb en combinación pueden presentar efectos terapéuticos sinérgicos. Además, la administración de mAb anti-PC-LECTINA puede combinarse con otros agentes terapéuticos, lo que incluye pero no se limita a varios agentes quimioterapéuticos, bloqueadores de andrógenos, e inmunomoduladores (por ejemplo, IL-2, GM-CSF). El mAb anti-PC-LECTINA puede administrarse en su forma "desnuda" o no conjugada, o puede tener agentes terapéuticos conjugados.

Las formulaciones de anticuerpo anti-PC-LECTINA pueden administrarse por medio de cualquier ruta capaz de liberar los anticuerpos al sitio del tumor. Las rutas de administración potencialmente efectivas incluyen, pero no se limitan, a la ruta intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica, y similares. El tratamiento involucrará generalmente la administración repetida de la preparación de anticuerpo anti-PC-LECTINA por medio de una ruta aceptable de administración como la inyección intravenosa (IV), normalmente a una dosis que está en el rango de alrededor de 0,1 a alrededor de 10 mg/kg de peso corporal. Las dosis de mAb en el rango de alrededor de 10-500 mg por semana serán efectivas y bien toleradas.

Basado en la experiencia clínica con el mAb de Herceptina en el tratamiento de cáncer de mama metastático, una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal del paciente por vía IV, seguido de dosis semanales de alrededor de 2 mg/kg IV de la preparación de mAb anti-PC-LECTINA puede representar un régimen de dosificación aceptable. Preferiblemente, la dosis de carga inicial se administra en una infusión de 90 minutos o más. La dosis de mantenimiento periódica puede administrarse como una infusión de 30 minutos o más, siempre que la dosis inicial sea bien tolerada. No obstante, un experto en la materia entenderá que varios factores pueden influir en el régimen de dosificación ideal en un caso en particular. Dichos factores puede incluir, por ejemplo, la afinidad de unión y la vida media del Ab o mAb utilizado, el grado de expresión de PC-LECTINA en el paciente, la cantidad de antígeno PC-LECTINA secretado circulante, el nivel de concentración del estado de equilibrio deseado del anticuerpo, frecuencia de tratamiento, y la influencia de agentes quimioterapéuticas utilizadas en combinación con el método de tratamiento de la invención.

De forma óptima, se evaluará el nivel en circulación del antígeno PC-LECTINA secretado en suero de pacientes, para ayudar en la determinación del régimen de dosis más efectiva y factores relacionados. Dichas evaluaciones pueden también utilizarse con el propósito de monitorizar durante la terapia, y serán útiles para evaluar el éxito terapéutico en combinación con la evaluación de otros parámetros (como los niveles en suero de PSA en la terapia del cáncer de próstata).

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Inhibición de la función de la proteína PC-LECTINA

La invención incluye varios métodos y composiciones para inhibir la unión de PC-LECTINA a su pareja de unión o ligando, o su asociación con otra(s) proteína(s) así como métodos para inhibir la función de PC-LECTINA.

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Inhibición de la PC-LECTINA con anticuerpos intracelulares

En una aproximación, los vectores recombinantes que codifican anticuerpos de cadena única que se unen de forma específica a PC-LECTINA pueden introducirse en células que expresan PC-LECTINA por medio de tecnologías de transferencia de genes, en las que la cadena única codificada del anticuerpo anti-PC-LECTINA se expresa intracelularmente, se une a la proteína PC-LECTINA, e inhibe por lo tanto su función. Los métodos para crear dichas cadenas únicas intracelulares de anticuerpos son bien conocidas. Dichos anticuerpos intracelulares, también conocidos como "intracuerpos", pueden dirigirse específicamente hacia un compartimiento particular dentro de la célula, proporcionando el control sobre la actividad inhibidora en la que se centra el tratamiento. Esta tecnología se ha aplicado con éxito en la materia (para revisión, véase Richardson y Marasco, 1995, TIBTECH vol. 13). Los intracuerpos han demostrado eliminar virtualmente la expresión de receptores de superficie que de otra manera serían abundantes. Véase, por ejemplo, Richardson et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3137-3141; Beerli et al., 1994, J. Biol. Chem. 289:23931-23936; Deshane et al., 1994, Gen Ther. 1:332-337.

Los anticuerpos de cadena única comprenden los dominios variables de la cadena pesada y ligera unidos por un polipéptido enlazante flexible, y se expresan como un polipéptido único. Opcionalmente, los anticuerpos de cadena única pueden expresarse como un fragmento de cadena única de la región variable unido a la región constante de la cadena ligera. Las señales de tráfico intracelular bien conocidas, pueden crearse en vectores de polinucleótidos recombinantes que codifican dichos anticuerpos de cadena única para localizar de forma precisa el intracuerpo expresado en el compartimiento intracelular deseado. Por ejemplo, los intracuerpos dirigidos hacia el retículo endoplasmático (RE), pueden diseñarse para que incorporen un péptido líder y, de forma opcional, una señal de retención en el RE en el extremo C-terminal, como el motivo de aminoácidos KDEL. Los intracuerpos que pretenden ejercer su actividad en el núcleo pueden diseñarse para que incluyan una señal de localización nuclear. Las porciones lipídicas pueden enlazarse a los intracuerpos para anclar el intracuerpo al lado citosólico de la membrana plasmática. Los intracuerpos pueden también dirigirse para que ejerzan su función en el citosol. Por ejemplo, los intracuerpos citosólicos pueden utilizarse para secuestrar factores del citosol, previniendo por lo tanto que sean transportados a su destino celular natural.

En una realización, los intracuerpos frente a PC-LECTINA se diseñan para que se unan de forma específica a un dominio particular de PC-LECTINA. Por ejemplo, los intracuerpos citosólicos que se unen de forma específica a la proteína PC-LECTINA pueden utilizarse para prevenir que PC-LECTINA tenga acceso al núcleo, previniendo de esta manera que ejerza cualquier actividad biológica dentro del núcleo (por ejemplo, previniendo que PC-LECTINA forme complejos de transcripción con otros factores).

Para poder dirigir la expresión de dichos intracuerpos de forma específica hacia células tumorales particulares, la transcripción del intracuerpo puede situarse bajo el control regulatorio de un promotor y/o potenciador adecuado específico de tumor. Para poder localizar la expresión del intracuerpo de forma específica en la próstata, por ejemplo, puede utilizarse el promotor de PSA y/o promotor/potenciador (véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense Nº 5.919.652).

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Inhibición de la PC-LECTINA con proteínas recombinantes

En otra aproximación, se utilizan las moléculas recombinantes que son capaces de unirse a PC-LECTINA, previniendo de esta manera que PC-LECTINA acceda o se una a su(s) pareja(s) de unión o se asocie con otra(s) proteína(s), para inhibir la función de PC-LECTINA. Dichas moléculas recombinantes pueden, por ejemplo, contener la(s) parte(s)
reactiva(s) de una molécula de anticuerpo específico de PC-LECTINA. En una realización particular, el dominio de unión a PC-LECTINA de una pareja de unión de PC-LECTINA puede crearse en una proteína de fusión dimérica que comprende dos dominios de unión al ligando PC-LECTINA unido a la porción Fc de una IgG humana, como la IgG1 humana. Dicha porción de IgG puede contener, por ejemplo, los dominios CH2 y CH3 y la región bisagra, pero no el dominio CH1. Dichas proteínas de fusión diméricas pueden administrarse en su forma soluble a pacientes que padecen de un cáncer asociado con la expresión de PC-LECTINA, lo que incluye pero no se limita a cáncer de próstata, mama, vejiga, pulmón, huesos, colon, páncreas, testículos, cérvix y ovarios, en los que la proteína de fusión dimérica se une de forma específica a PC-LECTINA bloqueando por lo tanto la interacción de PC-LECTINA con una pareja de unión. Dichas proteínas de fusión diméricas pueden combinarse además en proteínas multiméricas utilizando tecnologías de ligación de anticuerpos conocidas.

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Inhibición de la transcripción o traducción de PC-LECTINA

Dentro de otra clase de aproximaciones terapéuticas, la invención proporciona varios métodos y composiciones para inhibir la transcripción del gen de PC-LECTINA. De forma similar, la invención también proporciona métodos y composiciones para inhibir la traducción del mRNA de PC-LECTINA en proteína.

En una aproximación, un método para inhibir la transcripción del gen PC-LECTINA comprende el contacto del gen PC-LECTINA con un polinucleótido antisentido de PC-LECTINA. En otra aproximación, un método para inhibir la traducción del mRNA de PC-LECTINA comprende el contacto del mRNA de PC-LECTINA con un polinucleótido antisentido. En otra aproximación, se puede utilizar una ribozima específica de PC-LECTINA para romper el mensajero de PC-LECTINA, inhibiendo de esta manera la traducción. Dichos métodos basados en polinucleótidos antisentido y ribozimas pueden también dirigirse contra las regiones reguladoras del gen PC-LECTINA, como el promotor de PC-LECTINA y/o elementos potenciadores. De forma similar, pueden utilizarse las proteínas capaces de inhibir un factor de transcripción del gen PC-LECTINA para inhibir la transcripción del mRNA de PC-LECTINA. Los diferentes polinucleótidos y composiciones útiles en los métodos mencionados anteriormente se han descrito anteriormente. El uso de moléculas antisentido y ribozimas para inhibir la transcripción y traducción es bien conocido en la materia.

Otros factores que inhiben la transcripción de PC-LECTINA a través de la interferencia con la activación transcripcional de PC-LECTINA pueden también ser útiles para el tratamiento de cánceres que expresan PC-LECTINA. De forma similar, pueden ser útiles los factores que son capaces de interferir con el procesamiento de PC-LECTINA para el tratamiento de cánceres que expresan PC-LECTINA. Los métodos de tratamiento del cáncer que utilizan dichos factores están también dentro del alcance de la invención.

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Consideraciones generales para las estrategias terapéuticas

Las tecnologías de transferencia génica y terapia génica pueden utilizarse para la liberación de moléculas polinucleótido terapéuticas hacia las células tumorales que sintetizan PC-LECTINA (es decir, polinucleótidos antisentido, ribozimas, polinucleótidos que codifican intracuerpos y otras moléculas inhibidoras de PC-LECTINA). Se conocen varias aproximaciones en la materia sobre terapia génica. Los vectores recombinantes que codifican polinucleótidos antisentido de PC-LECTINA, ribozimas, factores capaces de interferir con la transcripción de PC-LECTINA, y demás, pueden liberarse en las células tumorales utilizando dichas aproximaciones de terapia génica.

Las estrategias terapéuticas pueden combinarse con cualquiera de entre una gran variedad de regímenes de quimioterapia o terapia de radiación. Estas estrategias terapéuticas también pueden permitir el uso de dosis reducidas de quimioterapia y/o una administración menos frecuente, en particular en pacientes que no toleran bien la toxicidad del agente quimioterapéutico.

La actividad antitumoral de una composición particular (por ejemplo, antisentido, ribozima, intracuerpo), o una combinación de dichas composiciones, puede evaluarse utilizando varios sistemas de ensayo in vitro e in vivo. Los ensayos in vitro para evaluar el potencial terapéutico incluyen los ensayos de crecimiento celular, ensayos de agar blando y otros ensayos indicativos de actividad promotora de tumores, ensayos de unión capaces de determinar la extensión en la que la composición terapéutica inhibirá la unión de la PC-LECTINA a una pareja de unión, etc.

In vivo, puede evaluarse el efecto de una composición terapéutica de PC-LECTINA en un modelo animal adecuado. Por ejemplo, los modelos xenogénicos de cáncer de próstata en los que se introducen explantes de cáncer de próstata humano o pases de xenoinjerto de tejidos en animales inmunocomprometidos, como ratones desnudos o SCID, son adecuados en relación con el cáncer de próstata y se han descrito en Klein et al., 1997, Nature Medicine 3:402-408. Por ejemplo, la Solicitud de Patente PCT WO98/16628, Sawyers et al., publicada el 23 de abril, 1998, describe varios modelos de xenoinjertos de cáncer de próstata humano capaces de recapitular el desarrollo de los tumores primarios, las micrometástasis, y la formación de una metástasis osteoblástica, característica del último estadío de la enfermedad. La eficacia puede predecirse utilizando ensayos que miden la inhibición de la formación de tumores, regresión tumoral o metástasis, y similares. Véase, también, los Ejemplos a continuación.

Los ensayos in vivo que valoran la promoción de la apoptosis también pueden ser útiles en la evaluación de potenciales composiciones terapéuticas. En una realización, los ratones portadores de xenoinjertos tratados con la composición terapéutica, pueden examinarse en busca de la presencia de focos apoptóticos y compararse con ratones portadores de xenoinjertos control no tratados. El alcance con el que se encuentran los focos apoptóticos en los tumores de los ratones tratados, proporciona una indicación de la eficacia terapéutica de la composición.

Las composiciones terapéuticas utilizadas en la práctica de los métodos anteriores puede formularse en composiciones farmacéuticas que comprenden un transportador adecuado para el método de liberación deseado. Los transportadores adecuados incluyen cualquier material que cuando se combina con la composición terapéutica retiene la función antitumoral de la composición terapéutica y no es reactivo con el sistema inmunitario del paciente. Como ejemplo se incluye, pero no se limita a, cualquier número de transportadores farmacéuticos estándar como soluciones salinas tamponadas con fostato estériles, agua bacteriostática, y similares (véase, en general, Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª Edición, A. Osal., Ed., 1980).

Las formulaciones terapéuticas pueden solubilizarse y administrarse por medio de cualquier ruta capaz de liberar la composición terapéutica hacia el sitio del tumor. Las rutas potencialmente efectivas de administración incluyen, pero no se limitan a, ruta intravenosa, parenteral, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica, intraorgánica, ortotópica, y similares. Una formulación preferible para la inyección intravenosa comprende la composición terapéutica en una solución de agua bacteriostática preservada, agua estéril no preservada, y/o diluida en cloruro de polivinilo o bolsas de polietileno que contienen cloruro sódico estéril para inyección al 0,9%, USP. Las preparaciones terapéuticas de proteína pueden estar liofilizadas y almacenadas como polvos estériles, preferiblemente al vacío, y después reconstituirse en agua bacteriostática que contiene, por ejemplo, el conservante alcohol bencílico, o en agua estéril antes de la inyección.

Las dosificaciones y protocolos de administración para el tratamiento del cáncer utilizando los métodos anteriores variarán según el método y el cáncer diana, y dependerán generalmente de una serie de otros factores conocidos en la materia.

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Vacunas contra el cáncer

La invención proporciona además vacunas contra el cáncer que comprenden una proteína PC-LECTINA o fragmento de la misma, así como vacunas basadas en el DNA. En vista de la expresión restringida de PC-LECTINA en tumores, se espera que las vacunas contra el cáncer de PC-LECTINA sean efectivas en la prevención específica y/o tratamiento de cánceres que expresan PC-LECTINA sin crear efectos inespecíficos sobre los tejidos no diana. Es bien conocido en la materia el uso de un antígeno tumoral en una vacuna para generar inmunidad humoral y mediada por células para utilizar en la terapia anticancerosa, y se ha empleado en el cáncer de próstata utilizando los inmunógenos de PSMA humano y PAP de roedores (Hodge et al., 1995, Int. J. Cancer 63: 231-237; Fong et al., 1997, J. Immunol. 159: 3113-3117). Dichos métodos pueden utilizarse fácilmente con una proteína PC-LECTINA, o fragmento de la misma, o una molécula de ácido nucleico que codifica la PC-LECTINA y vectores recombinantes capaces de expresar y presentar de forma apropiada el inmunógeno de PC-LECTINA.

Por ejemplo, los sistemas de liberación de genes virales pueden utilizarse para liberar una molécula de ácido nucleico que codifica la PC-LECTINA. Varios sistemas de liberación de genes virales que pueden utilizarse en la práctica de este aspecto de la invención incluyen, pero no se limitan a, virus de la viruela, viruela aviar, viruela del canario, adenovirus, virus de la gripe, virus de la polio, virus adenoasociado, lentivirus y virus sindbus (Restifo, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8: 658-663). También se pueden utilizar los sistemas de liberación no víricos utilizando DNA desnudo que codifica una proteína PC-LECTINA o fragmento de la misma introducida en el paciente (por ejemplo por vía intramuscular) para inducir una respuesta antitumoral. En una realización, puede utilizarse el cDNA de longitud completa de PC-LECTINA humano.

En una realización, una vacuna de PC-LECTINA contra el cáncer está basada en la identificación de péptidos inmunogénicos dentro de la secuencia de aminoácidos de PC-LECTINA mostrada en la Fig. 1A-D (Id. de Sec. Nº 2). Tal como se discute posteriormente en los ejemplos, se ha visto que porciones específicas de PC-LECTINA inducen respuestas en las células T y B. El dominio extracelular de PC-LECTINA (aminoácidos 22-213 de Fig. 1A-D; Id. de Sec. Nº 2) se utilizó para generar una respuesta inmune en ratones para la producción de anticuerpos monoclonales; y los péptidos dentro de este dominio, GLWRNGDGQTSGAC (Id. de Sec. Nº 25), GGPYLYQWNDDRCNM (Id. de Sec. Nº 26), EARLACESEGGVLL (Id. de Sec. Nº 27), se utilizaron para generar una respuesta inmune en conejos para la producción de anticuerpos policlonales. Así, estas porciones específicas de PC-LECTINA, y polinucleótidos que codifican estas porciones, pueden seleccionarse para la producción de una vacuna contra el cáncer.

En otra realización, pueden emplearse las moléculas de ácido nucleico de PC-LECTINA que codifican epítopos específicos de linfocitos T citotóxicos (CTL). Los epítopos CTL pueden determinarse utilizando algoritmos específicos (por ejemplo, Epimer, Universidad de Brown) para identificar péptidos dentro de una proteína PC-LECTINA que son capaces de unirse de forma óptima a alelos específicos de HLA. Un algoritmo adecuado es el algoritmo de búsqueda de motivos peptídicos de HLA disponible en la página web de la Sección de Análisis Molecular y Bioinformática (BIMAS) (http://bimas.dcrt.nih.gov/). Este algoritmo está basado en la unión de secuencias de péptido específicas en la hendidura de las moléculas de HLA de clase I y específicamente de HLA-A2 (Falk et al., 1991, Nature 351:290-6; Hunt et al., 1992, Science 255:1261-3; Parker et al., 1992, J. Immunol. 149:3580-7; Parker et al., 1994, J. Immunol. 152:163-75). El algoritmo de búsqueda de motivos peptídicos de HLA permite localizar y puntuar péptidos 8-meros, 9-meros, y 10-meros a partir de la predicción de unión a HLA-A2 de una secuencia completa de proteínas así como otras moléculas de clase I. La mayoría de péptidos que se unen a HLA-A2 son 9-meros, que contienen preferiblemente una leucina en la posición 2 y una valina o leucina en la posición 9 (Parker et al., 1992, J. Immunol. 149:3580-7).

Tal como se discute en los siguientes Ejemplos, los péptidos de unión predichos para la PC-LECTINA incluyen WIGFTYKTA, ATGEHQAFT, FGNCVELQA, NCVELQASA, y DNHGFGNCV (Id. de Sec. Nº 6-10, respectivamente). La unión real de péptidos a HLA-A2 puede evaluarse mediante estabilización de la expresión de HLA-A2 en la línea celular T2 defectuosa en el procesamiento de antígenos (Xue et al., 1997, Prostate 30:73-8; Peshwa et al., 1998, Prostate 36:129-38). La inmunogenicidad de péptidos específicos puede evaluarse in vitro mediante la estimulación de CTL CD8+ en presencia de células dendríticas (Xue et al.; Peshwa et al., supra).

También pueden emplearse varias estrategias ex vivo. Una aproximación implica el uso de células dendríticas para presentar el antígeno de PC-LECTINA a un sistema inmune de un paciente. Las células dendríticas que expresan MHC de clase I y II, coestimulador B7 e IL-12, son de esta manera células presentadoras de antígeno altamente especializadas. En el cáncer de próstata, se están utilizando células dendríticas autólogas pulsadas con péptidos del antígeno de membrana específico de próstata (PSMA) en un ensayo clínico de Fase I para estimular los sistemas inmunitarios de pacientes con cáncer de próstata (Tjoa et al., 1996, Prostate 28:65-69; Murphy et al., 1996, Prostate 29:371-380). Se pueden utilizar células dendríticas para presentar péptidos de PC-LECTINA a células T en el contexto de las moléculas de MHC de clase I y II. En una realización, se pulsan células dendríticas autólogas con péptidos de PC-LECTINA capaces de unirse a moléculas MHC. En otra realización, se pulsan células dendríticas autólogas con la proteína PC-LECTINA completa. Otra realización implica la sobreexpresión del gen PC-LECTINA en células dendríticas utilizando varios vectores de mejora conocidos en la materia, como adenovirus (Arthur et al., 1997, Cancer Gen Ther. 4:17-25), retrovirus (Henderson et al., 1996, Cancer Res. 56: 3763-3770), lentivirus, virus adenoasociado, transfección de DNA (Ribas et al., 1997, Cancer Res. 57: 2865-2869), y transfección de RNA derivado de tumores (Ashley et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 1177-1182). Las células que expresan PC-LECTINA pueden también crearse para expresar inmunomoduladores, como GM-CSF, y utilizarse como agentes inmunizantes.

Los anticuerpos anti-PC-LECTINA antiidiotípicos pueden también utilizarse en la terapia contra el cáncer como vacunas para inducir una respuesta inmune en células que expresan una proteína PC-LECTINA. De forma específica, la generación de anticuerpos antiidiotípicos es bien conocida en la materia y puede adaptarse fácilmente para generar anticuerpos anti-PC-LECTINA antiidiotípicos que imitan un epítopo en una proteína PC-LECTINA (véase, por ejemplo, Wagner et al., 1997, Hybridoma 16: 33-40; Foon et al., 1995, J Clin Invest 96: 334-342; Herlyn et al., 1996, Cancer Immunol Immunother 43: 65-76). Dicho anticuerpo antiidiotípico puede utilizarse en las estrategias de vacunas contra el cáncer.

Los métodos de inmunización genética pueden utilizarse para generar respuestas inmunes profilácticas o terapéuticas humorales y celulares dirigidas contra células de cáncer que expresan PC-LECTINA. Las construcciones que comprenden DNA que codifica una proteína/inmunógeno de PC-LECTINA y secuencias reguladoras adecuadas, pueden inyectarse directamente al músculo o en la piel de un individuo, de tal forma que las células del músculo o la piel incorporan la construcción y expresan la proteína/inmunógeno de PC-LECTINA codificada. La expresión de la proteína/inmunógeno de PC-LECTINA resulta en la generación de inmunidad humoral y celular profiláctica o terapéutica frente al cáncer de próstata, mama, vejiga, pulmón, huesos, colon, páncreas, testículos, cérvix y ovarios. Se pueden utilizar varias técnicas de inmunización genética profiláctica o terapéutica conocidas en la materia (para revisión, véase la información y referencias publicadas en la dirección de Internet www.genweb.com).

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Equipos

La invención también proporciona equipos para utilizar en las aplicaciones diagnósticas y terapéuticas descritas o sugeridas anteriormente. Dichos equipos pueden comprender un medio transportador compartimentalizado para recibir en un sitio cerrado uno o más contenedores como por ejemplo viales, tubos, y similares, que comprende cada uno de ellos uno de los elementos separados a utilizar en el método. Por ejemplo, uno de los contenedores puede comprender una sonda que está marcada o que puede marcarse para ser detectada. Dicha sonda puede ser un anticuerpo o un polinucleótido específico de una proteína PC-LECTINA o un gen o mensajero de PC-LECTINA, respectivamente. Cuando el equipo utiliza hibridación de ácidos nucleicos para detectar el ácido nucleico diana, el equipo puede también tener contenedores que contengan nucleótido(s) para la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana y/o un contenedor que comprenda una forma indicadora, como una proteína de unión a biotina, como avidina o estreptavidina, unida a una molécula marcadora, como una marca enzimática, fluorescente, o radioisótopo.

El equipo de la invención comprenderá normalmente el contenedor descrito antes y uno o más contenedores diferentes que comprendan materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, lo que incluye tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, y prospectos con instrucciones de uso. Puede haber presente una etiqueta en el contenedor para indicar que la composición se utiliza para una terapia específica o aplicación no terapéutica, y puede también indicar directrices para el uso in vivo o in vitro, como las descritas anteriormente.

EL cDNA de PC-LECTINA se depositó bajo los términos del tratado de Budapest el 10 de marzo de 1999, en la American Type Culture Collection (ATCC; 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA) como plásmido p58P1D12-2, y se le asignó el número de Registro 207152.

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Ejemplos

Varios aspectos de la invención se describen y se ilustran más profundamente por medio de varios ejemplos a continuación, ninguno de ellos pretende limitar el alcance de la invención.

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Ejemplo 1 Aislamiento generado por SSH del fragmento de cDNA del gen PC-LECTINA Materiales y Métodos Xenoinjertos LAPC

Los xenoinjertos LAPC se obtuvieron del Dr. Charles Sawyers (UCLA) y se generaron tal como se describe (Klein et al, 1997, Nature Med. 3: 402-408; Craft et al., 1999, Cancer Res. 59: 5030-5036). Los xenoinjertos LAPC-4 dependientes e independientes de andrógenos (LAPC-4 AD y AI, respectivamente) y los xenoinjertos LAPC-9 (LAPC-9 AD y AI, respectivamente) se cultivaron en ratones macho intactos SCID o en machos castrados, respectivamente, y se sometieron a pases como pequeños pedazos de tejido en machos receptores. Los xenoinjertos LAPC-4 AI derivan de tumores LAPC-4 AD y los xenoinjertos LAPC-9 AI derivan de tumores LAPC-9 AD. Para generar los xenoinjertos AI, los ratones macho portadores de los tumores LAPC AD se castraron y se mantuvieron durante 2-3 meses. Tras el recrecimiento de los tumores LAPC, los tumores se recogieron y se sometieron a pases en ratones macho castrados o en hembras SCID.

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Líneas celulares

Se obtuvieron líneas celulares humanas (por ejemplo, HeLa) a partir del ATCC y se mantuvieron en DMEM con un 10% de suero fetal bovino.

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Aislamiento de RNA

El tejido tumoral y las líneas celulares se homogeneizearon en reactivo de Trizol (Life Technologies, Gibco BRL) utilizando 10 ml/g de tejido o 10 ml/10^{8} células para aislar RNA total. El RNA poli A se purificó a partir de RNA total utilizando los equipos Oligotex mRNA Mini y Midi de Qiagen. Se cuantificaron los mRNA y RNA total mediante análisis espectrofotométrico (D.O. 260/280 nm) y se analizaron mediante electroforesis en gel.

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Oligonucleótidos

Se utilizaron los siguientes oligonucleótidos purificados por HPLC.

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DPNCDN (cebador de síntesis de cDNA) (Id. de Sec. Nº 11):

5'TTTTGATCAAGCTT303'

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Adaptador 1 (Id. de Sec. Nº 12 y 13, respectivamente):

1

\newpage

Adaptador 2 (Id. de Sec. Nº 14 y 15, respectivamente):

2

Cebador de PCR 1 (Id. de Sec. Nº 16):

5'CTAATACGACTCACTATAGGGC3'

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Cebador anidado (NP)1 (Id. de Sec. Nº 17):

5TCGAGCGGCCGGCCGGGCAGGA3'

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Cebador anidado (NP)2 (SEQ ID NO 18):

5'AGCGTGGTCGCGGCCGAGGA3'

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Hibridación sustractiva por supresión

Se utilizó la técnica de hibridación sustractiva por supresión (SSH) para identificar los cDNA que corresponden a los genes que pueden estar sobreexpresados en el cáncer de próstata dependiente de andrógenos en comparación con el cáncer independiente de andrógenos.

Los cDNA de doble cadena que corresponden al xenoinjerto LAPC-9 AD (probador) y el tejido LAPC-9 AI (conductor) se sintetizaron a partir de 2 \mug de RNA poli(A)+ aislado de los xenoinjertos, como se ha descrito antes, utilizando el equipo PCR-Select cDNA Subtraction Kit de CLONTECH y 1 ng de oligonucleótido DPNCDN como cebador. La síntesis de la primera y segunda cadena se llevó a cabo tal como se describe en el protocolo del manual del usuario del equipo (CLONTECH Nº de Protocolo PT1117-1, Nº de Catálogo K1804-1). El cDNA resultante se digirió con Dpn II durante 3 h a 37ºC. El cDNA digerido se extrajo con fenol/cloroformo (1:1) y se precipitó con etanol.

El cDNA conductor (LAPC-9AI) se generó mediante la combinación en una proporción 1:1 de cDNA de LAPC-9 AI digerido con Dpn II con una mezcla de cDNA digeridos que derivan de tejido de HBP, líneas celulares humanas HeLa, 293, A431, Colo 205, e hígado de ratón, para asegurar que los genes murinos se sustrajeron del cDNA probador (LAPC-9 AD).

El cDNA probador (LAPC-9 AD) se generó mediante la dilución de 1 \mul de cDNA de LAPC-9 AD digerido con Dpn II (400 ng) en 5 \mul de agua. El cDNA diluido (2 \mul, 160 ng) se ligó entonces a 2 \mul de Adaptador 1 y Adaptador 2 (10 \muM), en reacciones de ligación separadas, en un volumen total de 10 \mul a 16ºC durante la noche, utilizando 400 u de ligasa de DNA T4 (CLONTECH). La ligación terminó con 1 \mul de EDTA 0,2 M y se calentó a 72ºC durante 5 min.

La primera hibridación se realizó añadiendo 1,5 \mul (600 ng) del cDNA conductor a cada uno de los dos tubos que contienen 1,5 \mul (20 ng) de cDNA probador ligado al Adaptador 1 y Adaptador 2. En un volumen final de 4 \mul, las muestras se cubrieron con aceite mineral, se desnaturalizaron en un termociclador MJ Research a 98ºC durante 1,5 minutos, y después se dejó que hibridar durante 8 horas a 68ºC. Las dos hibridaciones se mezclaron entonces junto con 1 \mul adicional de cDNA conductor recién desnaturalizado y se dejaron hibridar durante la noche a 68ºC. La segunda hibridación se diluyó entonces en 200 \mul de Hepes 20 mM, pH 8,3, NaCl 50 mM, EDTA 0,2 mM, se calentó a 70ºC durante 7 minutos y se guardó a -20ºC.

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Amplificación por PCR, clonaje y secuenciación de fragmentos génicos generados a partir de SSH

Para amplificar los fragmentos génicos resultantes de las reacciones de SSH, se realizaron dos amplificaciones de PCR. En la reacción primaria de PCR, se añadió 1 \mul de la mezcla de hibridación final diluida a 1 \mul de Cebador de PCR 1 (10 \muM), 0,5 \mul de mezcla de dNTP (10 \muM), 2,5 \mul 10 x tampón de reacción (CLONTECH) y 0,5 \mul 50 x mezcla de polimerasa de cDNA Advantage (CLONTECH) en un volumen final de 25 \mul. La PCR 1 se realizó utilizando las siguientes condiciones: 75ºC durante 5 min., 94ºC durante 25 s., después 27 ciclos de 94ºC durante 10 s., 66ºC durante 30 s., 72ºC durante 1,5 min. Se realizaron cinco reacciones primarias de PCR separadas para cada experimento. Los productos se juntaron y se diluyeron 1:10 con agua. Para la reacción secundaria de PCR, se añadió 1 \mul de los productos juntados de la reacción primaria de PCR diluida a la misma mezcla de reacción tal como se utilizó para la PCR 1, excepto que se utilizaron los cebadores NP1 y NP2 (10 \muM) en lugar del Cebador de PCR 1. La PCR 2 se realizó utilizando 10-12 ciclos de 94ºC durante 10 s., 68ºC durante 30 s., 72ºC durante 1,5 minutos. Los productos de PCR se analizaron utilizando electroforesis en gel de agarosa al 2%.

Los productos de PCR se insertaron en pCR2.1 utilizando el equipo T/A vector cloning kit (Invitrogen). Las células de E. coli transformadas se sometieron a selección de colonias por color azul/blanca y por ampicilina. Las colonias blancas se picaron y distribuyeron en placas de 96 pocillos y se cultivaron en cultivo líquido durante la noche. Para identificar los insertos, se realizó la amplificación por PCR en 1 ml de cultivo bacteriano utilizando las condiciones de la PCR1 y NP1 y NP2 como cebadores. Los productos de PCR se analizaron utilizando electroforesis en gel de agarosa al 2%.

Los clones bacterianos se guardaron en glicerol al 20% en un formato de 96 pocillos. Se preparó el DNA plasmídico, se secuenció, y se sometió a búsquedas de homología de ácidos nucleicos en las bases de datos del GenBank, dBest, y NCI-CGAP.

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Análisis de la expresión por RT-PCR

Las primeras cadenas de cDNA se generaron a partir de 1 \mug de mRNA con cebadores oligo (dT)12-18 mediante el sistema de Preamplificación Gibco-BRL Superscript. Se utilizó el protocolo del fabricante y se incluyó una incubación de 50 minutos a 42ºC con la transcriptasa reversa seguida de un tratamiento de RNasa H a 37ºC durante 20 min. Tras completar la reacción, el volumen se incrementó a 200 \mul con agua antes de la normalización. Las primeras cadenas de cDNA de los 16 tejidos normales humanos diferentes se obtuvieron de Clontech.

La normalización de las primeras cadenas de cDNA de los diferentes tejidos se realizó utilizando los cebadores 5'atatcgccgcgctcgtcgtcgacaa3' (Id. de Sec. Nº 19) y 5'agccacacgcagctcatrgtagaagg 3' (Id. de Sec. Nº 20) para amplificar la \beta-actina. La primera cadena de cDNA (5 \mul) se amplificó en un volumen total de 50 \mul que contenía cebadores 0,4 \muM, 0,2 \muM de cada dNTP, 1X tampón de PCR (Clontech, Tris-HCL 10 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, KCl 50 mM, pH 8,3) y 1X polimerasa de DNA Klentaq (Clontech). Se tomaron 5 \mul de la reacción de PCR a los 18, 20, y 22 ciclos y se utilizaron para electroforesis en gel de agarosa. La PCR se realizó utilizando un termociclador MJ Research bajo las siguientes condiciones: la desnaturalización inicial fue a 94ºC durante 15 s., seguida de 18, 20, y 22 ciclos de 94ºC durante 15 s., 65ºC durante 2 min., 72ºC durante 5 s. Se llevó a cabo una extensión final a 72ºC durante 2 min. Tras la electroforesis en gel de agarosa, las intensidades de banda de las bandas de 283 pb de la \beta-actina de los diferentes tejidos se compararon mediante inspección visual. Los factores de dilución para las primeras cadenas de cDNA se calcularon para resultar en intensidades de banda iguales a las intensidades de banda de la \beta-actina en todos los tejidos tras 22 ciclos de PCR. Fueron necesarias tres rondas de normalización para lograr las mismas intensidades de banda en todos los tejidos tras 22 ciclos de PCR.

Para determinar los niveles de expresión del gen PC-LECTINA, se analizaron 5 \mul de primera cadena de cDNA normalizada mediante PCR utilizando 25, 30, y 35 ciclos de amplificación utilizando los siguientes pares de cebadores, que se diseñaron con la asistencia de (MIT; para más detalles, véase, www.genome.wi.mit.edu) (Id. de Sec. Nº 21 y 22, respectivamente):

58P1D12.1

\hskip0.3cm

5' CCTGCTTCAGTAACAACCACATTCT 3'

58P1D12.2

\hskip0.3cm

5' CTTTACCAGTGGAATGATGACAGG 3'

El análisis semicuantitativo de la expresión se logró comparando los productos de PCR en el número de ciclos que proporcionó intensidades de banda suaves.

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Resultados

Se llevaron a cabo varios experimentos de SSH tal como se describe en el apartado de Materiales y Métodos, supra, y llevaron al aislamiento de numerosos clones de fragmentos de genes candidatos. Todos los clones candidatos se secuenciaron y se sometieron a análisis de homología frente a todas las secuencias en las principales bases de datos génicas públicas y de EST para proporcionar información sobre la identidad del correspondiente gen y para ayudar a la decisión de analizar un gen particular para la expresión diferencial. En general, los fragmentos de genes que no tienen homología a ninguna secuencia conocida en ninguna de las bases de datos utilizadas, considerándose de esta manera que representan nuevos genes, así como los fragmentos de genes que muestran homología a las secuencias de expresión de colas (EST) previamente secuenciadas, se sometieron a análisis de expresión diferencial mediante RT-PCR y/o análisis de Northern.

Uno de los clones de cDNA, designado 58P1D12, tenía 427 pb de longitud y mostró una débil homología con un EST derivado de músculo de cerdo, así como una homología significativa con la layilina de hámster, una molécula de la superficie celular con homología a las lectinas de tipo C. El fragmento SSH contenía un ORF de 129 aminoácidos, que presentaron una homología significativa con la layilina. El ORF de este fragmento corresponde a la región central de la layilina y contiene el dominio transmembrana. El cDNA de longitud completa que codifica el gen 58P1D12 se aisló posteriormente utilizando este cDNA y se analizó estructuralmente (Ejemplo 2, a continuación) y se denominó PC-LECITNA.

\newpage

El análisis de expresión diferencial mediante RT PCR utilizando cebadores derivados del clon SSH de PC-LECTINA mostró que el gen 58P1D12/PC-LECTINA se expresa esencialmente en los testículos normales y en los xenoinjertos de tumor de próstata examinados (Fig. 3). Al realizar más ciclos de amplificación (es decir, 30 o más), se detectaron niveles bajos de expresión en próstata, bazo y placenta. El análisis de Northern blot utilizando el cDNA de PC-LECTINA de longitud completa como sonda (véase Ejemplo 3, a continuación) mostró una expresión de transcritos de 1,8 y 3,0 kb sólo en testículos normales y en RNA de LAPC9 AD (Fig. 4). Los niveles de expresión bajos se detectaron en LAPC-4AD, LAPC-4AI y LAPC-9 AI.

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Ejemplo 2 Aislamiento del cDNA que codifica PC-LECTINA de longitud completa

El fragmento génico de 427 pb 58P1D12/PC-LECTINA (Ejemplo 1) se utilizó para aislar 30 cDNA adicionales que codifican el gen de PC-LECTINA. Un clon de cDNA de longitud completa para la PC-LECTINA se aisló de una biblioteca de LAPC-9 AD. El cDNA (clon 2) es de 25510 pb de longitud y codifica un ORF de 273 aminoácidos. El análisis del ORF identifica una secuencia señal en N-terminal y un dominio transmembrana que indica que la PC-LECTINA es una proteína transmembrana 1a con el extremo N-terminal en la parte externa y un extremo C-terminal citoplasmático. El cDNA de longitud completa de la PC-LECTINA se depositó en el American Type Culture Collección ("ATCC") (Mannassas, VA) como el plásmido p58P1D12-2 el 10 de marzo de 1999 y con el número de registro de ATCC 207152. El clon del cDNA de la PC-LECTINA puede escindirse utilizando una doble digestión con EcoRII-XbaI (EcoRI en el extremo 5', XbaI en el extremo 3').

El alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la PC-LECTINA con la secuencia de la layilina de hámster indica una relación con la layilina (Fig. 2A). No obstante, la PC-LECTINA no presenta el dominio de asociación a talina, lo que sugiere que la PC-LECTINA no interacciona con el citoesqueleto de la misma forma que la layilina. Son evidentes otras diferencias estructurales (Fig. 2A). El alineamiento de los 2550 pb del cDNA de PC-LECTINA con los 1747 pb del cDNA de la layilina de hámster muestra una homología en una región de 591 pb (Fig. 2B). El resto de la región de la PC-LECTINA es significativamente diferente de la layilina, lo que se refleja en diferencias en la secuencia de aminoácidos de la mitad C-terminal del dominio extracelular y de la totalidad del dominio citoplasmático. Esto sugiere que aunque la PC-LECTINA y la layilina están relacionadas y probablemente constituyen una subfamilia de lectinas, no es probable que la PC-LECTINA sea la forma humana de la layilina.

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Ejemplo 3 Análisis de la expresión del gen PC-LECTINA

La expresión del mRNA de la PC-LECTINA en tejidos humanos normales se analizó inicialmente mediante Northern blot en dos membranas con múltiples tejidos (Clontech; Palo Alto, California), que comprenden un total de 16 tejidos humanos normales diferentes, utilizando el cDNA de la PC-LECTINA marcado como sonda. Las muestras de RNA se normalizaron cuantitativamente con una sonda de \beta-actina. Los resultados de este análisis se muestran en la Fig. 4 (Paneles A y B). Sólo se detectó expresión en testículos normales. Estos Northern blot mostraron dos tránscritos de aproximadamente 1,8 kb y 3,0 kb.

Este análisis inicial se extendió utilizando la sonda de la PC-LECTINA para analizar una matriz de dot blot de RNA de 50 tejidos humanos normales (Clontech, Palo Alto, CA; Human Master Blot^{TM}). Los resultados muestran una fuerte expresión de la PC-LECTINA sólo en testículos y bazo fetal (Fig. 14). Se detectaron niveles más bajos de expresión en glándula salival y riñón fetal. No se detectó expresión en los siguientes tejidos: cerebro, amígdala, núcleo caudal, cerebelo, córtex cerebral, lóbulo frontal, hipocampo, medulla oblongata, lóbulo occipital, putamen, substantia nigra, lóbulo temporal, tálamo, núcleo subtalámico, médula espinal, corazón, aorta, músculo esquelético, colon, vejiga, útero, próstata, estómago, ovario, páncreas, glándula pituitaria, glándula adrenal, glándula tiroides, glándula mamaria, riñón, hígado, intestino delgado, bazo, timo, leucocitos periféricos, nódulo linfático, médula ósea, apéndice, pulmón, tráquea, placenta, cerebro fetal, corazón fetal, hígado fetal, timo fetal y pulmón fetal.

Para analizar la expresión de PC-LECTINA en los tejidos de cáncer de próstata humano, también se analizaron los RNA derivados de los xenoinjertos de cáncer de próstata humano. Todas las muestras de RNA se normalizaron cuantitativamente mediante tinción con bromuro de etidio y el posterior análisis con una sonda marcada de \beta-actina. Los resultados (Fig. 4C) muestran un alto nivel de expresión de la PC-LECTINA, particularmente en el xenoinjerto LAPC-9 AD, y un nivel de expresión inferior pero significativo detectado en el resto de xenoinjertos.

El análisis de Northern blot utilizando una sonda del fragmento SSH de PC-LECTINA muestra que la PC-LECTINA está altamente expresada en tumores que se han desarrollado subcutáneamente (sc; Fig. 5; carril 2) o intratibialmente (it; Fig. 5; Carril 1) en hueso de ratón. Para investigar si la expresión de la PC-LECTINA es dependiente de la presencia de andrógenos, los tumores de LAPC-9 AD se cultivaron en ratones SCID macho. Los ratones se castraron y los tumores se recogieron 28 días después. La expresión de PC-LECTINA en los tumores de los machos 28 días tras la castración se comparó con la expresión en tumores de machos intactos. Los resultados muestran que la expresión de PC-LECTINA se reduce de forma dramática en los tumores de machos castrados (Fig. 6). Como control, también se muestra la expresión de un gen regulado por andrógenos conocido, TMPRSS2 (véase WO99/62942), infraexpresado tras la castración (Fig. 6). Estos datos sugieren que la expresión de PC-LECTINA en los tumores de próstata es dependiente de la presencia de andrógenos.

Además, puede utilizarse una RT-PCR para analizar la expresión de PC-LECTINA en diferentes tejidos, lo que incluye cánceres derivados de pacientes. Se generaron primeras cadenas de cDNA a partir de 1 \mug de mRNA con cebadores oligo(dT) 12-18 utilizando el sistema de preamplificación Gibco-BRL Superscript. Se puede utilizar el protocolo del fabricante que incluye una incubación de 50 min. a 42ºC con transcriptasa reversa seguida de un tratamiento con RNasa H a 37ºC durante 20 min. Tras completar la reacción, el volumen se incrementó a 200 \mul con agua antes de la normalización. Se prepararon primeras cadenas de cDNA a partir de varios tejidos de interés. La normalización puede realizarse mediante PCR utilizando cebadores para actina y GAPDH. Se realizó la PCR semicuantitativa utilizando cebadores para PC-LECTINA.

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Ejemplo 4 Caracterización bioquímica de la proteína PC-LECTINA

Para caracterizar inicialmente la proteína PC-LECTINA, se clonó el cDNA de PC-LECTINA en el plásmido pcDNA 3.1 Myc-His (Invitrogen), que codifica una cola de 6 His en el extremo carboxilo, se transfectó en células 293T, y se marcó con un reactivo de biotinilación soluble en agua que es excluido por las células vivas. Las proteínas de superficie celular biotiniladas se purificaron por afinidad con estreptavidina-sefarosa y se detectaron con anticuerpos anti-His. El Western blot de las proteínas purificadas con estreptavidina claramente mostró una biotinilación de la PC-LECTINA en la superficie celular de las células 293T transfectadas (Fig. 7). La proteína PC-LECTINA no se detectó en los precipitados de estreptavidina a partir de células transfectadas no biotiniladas (Fig. 7).

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Ejemplo 5 Expresión de proteína PC-LECTINA recombinante en sistemas de mamíferos

Para la expresión en mamíferos, la PC-LECTINA puede clonarse en un cierto número de vectores apropiados, lo que incluye pcDNA 3.1 myc-His-tag (Invitrogen) y el vector de expresión retroviral pSR\alphatkneo (Muller et al., 1991, MCB 11:1785). Utilizando dichos vectores de expresión, puede expresarse PC-LECTINA en varias líneas celulares, lo que incluye PC-3, NIH 3T3, fibroblastos L de ratón y 293T.

Los retrovirus recombinantes que codifican la proteína PC-LECTINA se generaron en células humanas 293T (Pear et al., 1993, PNAS 90:8392-8396) y se utilizaron para infectar células NIH 3T3, que se seleccionaron en G418 durante dos semanas para la generación de líneas estables. La expresión de la PC-LECTINA se confirmó mediante Northern blot utilizando una sonda del cDNA de la PC-LECTINA.

Las líneas celulares de mamífero que expresan la PC-LECTINA pueden utilizarse en varios ensayos in vitro e in vivo, lo que incluye la proliferación celular en cultivo de tejido, activación de señales apoptóticas, formación de tumores en ratones SCID, e invasión in vitro utilizando un sistema de cultivo por invasión de membrana (MICS; Welch et al. ,Int. J. Cancer 43:449-457).

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Ejemplo 6 Producción de PC-LECTINA recombinante en un sistema de Baculovirus

Para generar una proteína recombinante PC-LECTINA en un sistema de expresión de baculovirus, el cDNA de PC-LECTINA se clonó en el vector de transferencia a baculovirus pBlueBac 4.5 (Invitrogen), que proporciona una cola de His en el extremo N-terminal. Específicamente, el pBlueBac-PC-LECTINA se cotransfectó con un plásmido ayudante pBac-N-Blue (Invitrogen) en células de insecto SF9 (Spodoptera frugiperda) para generar baculovirus recombinantes (véase manual de instrucciones de Invitrogen para más detalle). Los baculovirus se recogieron entonces a partir del sobrenadante celular y se purificaron mediante ensayo en placa.

La proteína recombinante PC-LECTINA se generó entonces mediante infección de células de insecto HighFive (Invitrogen) con el baculovirus purificado. La proteína PC-LECTINA recombinante se puede detectar utilizando un anticuerpo anti-PC-LECTINA. La proteína PC-LECTINA se puede purificar y utilizar en varios ensayos basados en células o como inmunógeno para generar anticuerpos policlonales y monoclonales específicos de la PC-LECTINA.

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Ejemplo 7 Generación de una proteína de fusión PC-LECTINA-fosfatasa alcalina secretada recombinante

La identificación de proteínas que interaccionan con la PC-LECTINA puede ayudar en la asignación de su función y puede identificar nuevas dianas terapéuticas y marcadores diagnósticos para el cáncer de próstata. La construcción de una proteína de fusión fosfatasa alcalina-PC-LECTINA puede utilizarse para detectar y clonar proteínas que interaccionan con PC-LECTINA mientras también generan un inmunógeno para la producción de anticuerpos monoclonales y policlonales.

El sistema AP-TAG de GenHunter Corporation (Nashville, TN, Nº de Cat. Q202) se utilizó para construir la proteína de fusión y para la detección de la unión de PC-LECTINA. El cDNA de PC-LECTINA (Fig. 1A-D; Id. de Sec. Nº 1), sin la secuencia señal, se clonó en pAPtag-5 (GenHunter Corp. Nashville, TN). Los cebadores de PC-LECTINA.HindIII y PC-LECTINA.BamHI mostrados mas abajo se utilizaron para amplificar el marco abierto de lectura de PC-LECTINA de los aminoácidos 22 al 213 del plásmido molde de PC-LECTINA del clon 2. El producto de PCR digerido con HindIII y BamHI se ligó en pAPtag-5 digerido con HindIII y BglII, manteniendo la secuencia señal IgGK, el ORF de PC-LECTINA y la fosfatasa alcalina en marco de lectura. La proteína de fusión PC-LECTINA-FA contiene una secuencia señal IgGK que promueve la secreción junto con las colas de myc/His en el extremo carboxiterminal de la fosfatasa alcalina.

Cebador PC-LECTINA.HINDIII (Id. de Sec. Nº 23):

GTGTAAGCTTCCCGCCGCGTGGTCAGCGGC

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Cebador PC-LECTINA.BAMHI (Id. de Sec. Nº 24):

CACAGGATCCTATACCTGCTTCAGTAAC

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Esta construcción de proteína de fusión PC-LECTINA-FA se utilizó para transfectar células 293T, y la presencia de proteína de fusión secretada en el medio de cultivo se monitorizó mediante Western blot utilizando anticuerpos anti-fosfatasa alcalina y anti-HIS. Los resultados de este análisis, mostrado en la Fig. 8, muestra la detección de una proteína de fusión de aproximadamente 100 kDa en medio acondicionado de células 293T transfectadas.

Los aminoácidos 22 a 213 se clonaron también en el vector pAPTag-5 utilizando una PCR con cebadores que contienen las dianas de las enzimas de restricción HindIII y XhoI para producir una secuencia señal IgGK fusionada al extremo N-terminal y las colas myc/His en el extremo C-terminal de dominio extracelular de PC-LECTINA. Esta construcción es similar al 58P1D12pAPtag anterior pero sin la fusión de la FA.

La secuencia codificante completa de la PC-LECTINA (aa 1-273) se clonó en pSR\alpha. Mediante cebadores que codifican el ORF y los sitios de restricción EcoRI y XbaI se amplificó el inserto a partir del clon 2 de PC-LECTINA (pBK.CMV). El inserto se ligó al pSR\alpha tras la digestión de ambos con EcoR1 y XbaI. Esta construcción se utilizó para generar virus y lograr que las líneas celulares expresen de forma estable la proteína PC-LECTINA.

La secuencia codificante completa de la PC-LECTINA (aa 1-273) se clonó en pcDNA3.1/myc-HIS (Invitrogen). Mediante los cebadores que codifican el ORF y los sitios de restricción EcoRI y XbaI se amplificó el inserto a partir del clon 2 de PC-LECTINA (pBK.CMV). El inserto se ligó al pcDNA3.1/myc-HIS (Invitrogen) tras la digestión de ambos con EcoR1 y XbaI. El análisis de Western blot confirmó la expresión de la proteína de PC-LECTINA cuando las células 293T se transfectaron con esta construcción.

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Ejemplo 8 Detección y clonaje de la pareja de unión de PC-LECTINA

La PC-LECTINA es una proteína transmembrana con dominios lectina de tipo C que puede interaccionar con otra proteína de unión. Para detectar la unión del receptor de la PC-LECTINA, se incubaron varias líneas celulares, tejidos y placas recubiertas con glucoproteína (por ejemplo, IgG humana o murina, RNasa bovina, ovalbúmina, transferrina humana, glicoforina fetuína, sialoglicoforina) con la proteína de fusión PC-LECTINA-FA utilizando los procedimientos de Cheng y Flanagan, 1994, Cell 79:157-168. Tras lavar las células y añadir el sustrato de FA, BCIP, que forma un precipitado azul insoluble tras la desfosforilación, la unión de la PC-LECTINA al receptor de la superficie celular puede detectarse utilizando un microscopio para buscar células teñidas de azul. Las líneas celulares que pueden cribarse incluyen las líneas celulares LNCaP, PC-3, DU145, TSUPR, PREC, LAPC4, 293T, NIH 3T3 y otras líneas celulares cancerígenas. También pueden cribarse tejidos como los xenoinjertos de LAPC, tejido de próstata y carcinoma de próstata. Una vez observada la unión a la superficie celular de la PC-LECTINA-FA, se puede calcular una constante de la tasa de disociación en equilibrio para evaluar la fuerza de la interacción de la unión. Además, puede determinarse el número de receptores en la superficie celular por célula. La línea celular o tejido con mayor capacidad de unión de la PC-LECTINA puede utilizarse entonces para clonar el receptor. La unión de PC-LECTINA a una porción específica de carbohidrato puede confirmarse demostrando la inhibición de la unión mediante bajas concentraciones del monosácarido específico relacionado.

Pueden utilizarse las estrategias de clonaje y expresión como las descritas en Tartaglia et al., 1995, Cell 83:1263-1271, Cheng y Flanagan y otros para clonar el receptor de la PC-LECTINA. En una aproximación, se construye una biblioteca de expresión a partir de las células que muestran unión a la PC-LECTINA-FA. La biblioteca consta de grupos de aproximadamente 1000 clones y se criba mediante un procedimiento de selección recurrente de subfracciones (en inglés "sib selection"). La transfección transitoria de células COS con DNA de cada grupo y el posterior cribado por unión a PC-LECTINA-FA, lavado, y tinción por actividad de la FA identifica las células que se unen a la PC-LECTINA y consecuentemente la expresión de receptores de la PC-LECTINA. Tras rondas sucesivas de subdivisión de grupos y cribado, se identifican colonias únicas de unión a PC-LECTINA-FA.

Alternativamente, se genera una biblioteca de expresión en fagos utilizando la tecnología estándar (Stone J. en Current Protocols in Molecular Biology (1997):20.3.1-20.3.9). Las elevaciones de membrana se hibridaron utilizando como sonda la proteína de fusión PC-LECTINA-FA de acuerdo con el Ejemplo 6 y se utilizó para la detección un ensayo de fosfatasa alcalina con BCIP. Las placas que unen la PC-LECTINA-FA y que producen un precipitado azul se pican y se separan los plásmidos que contienen el gen para el receptor. Una ventaja importante de esta aproximación es que también se identifican las proteínas citoplasmáticas o secretadas que interaccionan con la PC-LECTINA.

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Ejemplo 9 Expresión y purificación del dominio extracelular de la PC-LECTINA

Las células 293T se transfectaron con un vector de expresión y secreción Tag5, que codifica el dominio extracelular (aminoácidos 22-213) de la PC-LECTINA con una cola C-terminal de 6 His. Se generó entonces una línea celular estable mediante selección con zeocina. La línea celular se cultivó en un cultivo con agitación centrífuga en un medio libre de suero 293 SFMII (Gibco) y el medio acondicionado se recogió para su purificación. El medio acondicionado se concentró y el tampón se intercambió con tampón de unión (tampón fosfato sódico 50 mM pH 8,0, NaCl 500 mM e imidazol 10 mM) y se sometió a cromatografía de afinidad con metal inmovilizado utilizando una agarosa Ni-NTA (Qiagen). El medio acondicionado de partida, el filtrado y el material purificado eluido se cargó en un gel SDS-PAGE al 10-20% y se tiñó con tinción de plata (Fig. 9A) o se transfirió a una membrana de nitrocelulosa y se sometió a Western blot utilizando un pAb anti-His (Fig. 9B).

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Ejemplo 10 Anticuerpos policlonales y monoclonales contra PC-LECTINA

Para generar anticuerpos policlonales frente a PC-LECTINA, se generaron tres péptidos diferentes frente al dominio extracelular de la PC-LECTINA. Las secuencias de los péptidos son:

GLWRNGDGQTSGAC

\hskip0.7cm

(14-mero; Id. de Sec. Nº 25),

GGPYLYQWNDDRCNM

\hskip0.3cm

(15-mero, Id. de Sec. Nº 26), y

EARLACESEGGVLL

\hskip0.9cm

(14-mero; Id. de Sec. Nº 27).

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Los péptidos se conjugaron con KLH (hemocianina de lapa) y se utilizaron para inmunizar conejos. Se analizó la reactividad del suero de los conejos frente a la proteína PC-LECTINA utilizando Western blot de lisados celulares y utilizando FACS sobre células enteras (véase Ejemplo 11 a continuación). Se monitorizó el título del péptido mediante ELISA y mediante Western blot utilizando líneas celulares recombinantes que expresan el cDNA de la PC-LECTINA. Posteriormente se realizaron experimentos con los anticuerpos generados de los aminoácidos 204-217 de la proteína PC-LECTINA (GLWRNGDGQTSGAC; Id. de Sec. Nº 25).

Para generar anticuerpos monoclonales, el dominio extracelular de la PC-LECTINA se expresó eficientemente y se purificó a partir de medio acondicionado de células 293T que expresan el vector de secreción Tag5 PC-LECTINA tal y como se describe en el Ejemplo 9 anterior. La proteína purificada se utilizó para inmunizar a ratones Balb C. A los ratones se les inyectó inicialmente por vía intraperitoneal 50 \mug de proteína en adyuvante completo de Freund y 3 semanas después se les volvió a inyectar 50 \mug de proteína en adyuvante incompleto de Freund. Las inyecciones de refuerzo continuaron en un calendario de inmunización cada 2 semanas y se monitorizaron las titulaciones de los sueros de los ratones inmunizados mediante ELISA utilizando Tag5 PC-LECITNA como diana y la especificidad mediante análisis de Western blot de las líneas celulares y los lisados de tejido.

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Ejemplo 11 Expresión de PC-LECTINA en líneas celulares recombinantes y testículos

El suero de ratón inmunizado se utilizó para analizar la expresión de PC-LECTINA mediante Western blot y la inmunoprecipitación utilizando lisados celulares de líneas celulares recombinantes y testículos normales. Además, se analizó la expresión de PC-LECTINA en la superficie celular de las células Rat1-PC-LECTINA mediante citometría de flujo utilizando el suero de ratón inmunizado.

Las células Rat1 infectadas de forma estable con virus control neo o virus que codifica la PC-LECTINA se lisaron en tampón RIPA (Tris 25 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1%, desoxicolato sódico al 0,5%, SDS al 0,1%, EDTA 2 mM, PMSF 100 \mug/ml y leupeptina 2 \muM). Se sometieron entonces 200 \mug de lisado a una inmunoprecipitación con suero de ratones inmunizados con proteína purificada de Tag5-PC-LECTINA. Brevemente, 3 \mul de suero se incubaron con lisados (200 \mug de proteína en 1 ml) y se incubaron durante la noche a 4ºC. Se añadieron entonces 50 \mul de una solución al 50% de cuentas de Proteína G en tampón RIPA y se incubaron durante otra hora a temperatura ambiente. Los inmunoprecipitados se lavaron 4X con tampón RIPA y se solubilizaron en 40 \mul de tampón de muestras 3X SDS-PAGE se calentaron a 100ºC. Se separaron 25 \mul del inmunoprecipitado solubilizado o 25 \mug de lisado RIPA indicado en un gel SDS-PAGE al 10-20% y se transfirió a nitrocelulosa.

El análisis de Western blot se llevó a cabo con un pAb anti-péptido PC-LECTINA de conejo purificado por afinidad (2 \mug/ml, Fig. 10A) o con un suero 1:1000 de ratón inmunizado diluido en tampón Tris salino que contiene Tween-20 al 0,15% (TBS-T, pH 7,5) y leche descremada al 1% (Fig. 10B). Las membranas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con suero y después se lavaron 3X con TBS-T. Las bandas inmunoreactivas se desarrollaron por incubación con anticuerpos secundarios anti-Ig de conejo o anti-IgG de ratón conjugados con HRP y se visualizaron mediante incubación con un sustrato potenciado de quimioluminiscencia (ECL, Amersham) y se expusieron a una película autoradiográfica.

Los lisados celulares de las células 293T transfectadas de forma transitoria con pCDNA3.1 Myc/His PC-LECTINA o vector vacío, de células Rat1 infectadas de forma estable con control neo o retrovirus PC-LECTINA y de testículos normales se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa. El análisis de Western se llevó a cabo entonces tal y como se ha descrito anteriormente. Los resultados se muestran en la Fig. 11. Se indican con flechas las bandas de 47 kD de la PC-LECTINA completa, el dominio extracelular de 40 kD y la proteína con cola Myc/His de 55 kD.

El reconocimiento de la PC-LECTINA en la superficie celular de células Rat1 con suero de ratón inmunizado con Tag5 PC-LECTINA se analizó mediante citometría de flujo. Las células Rat1-neo o Rat1-PC-LECTINA (5 X 10^{5}) se incubaron con una dilución 1:2000 de suero de ratón inmunizado con Tag5 PC-LECTINA en PBS que contiene FBS al 1% y NaN_{3} al 0,02% (tampón de flujo) durante 1 hora en hielo. Las células se lavaron con tampón de flujo 2X enfriado con hielo y después se incubaron con una dilución 1:200 de conjugado anti-IgG-FITC de ratón en hielo durante 30 minutos. Las células se lavaron con tampón de flujo 2X y se resuspendieron en PBS que contenía paraformaldehído al 1%. Entonces se analizó la tinción en superficie celular de PC-LECTINA en 3.000 células de cada muestra mediante citometría de flujo. Los resultados se muestran en la Fig. 12.

La expresión de PC-LECTINA en la superficie celular se analizó más profundamente utilizando análisis inmunohistoquímico de botones celulares fijados en formol y embebidos en parafina. Las células 293T transfectadas con PC-LECTINA se marcaron con anticuerpo policlonal de conejo a 7,5 \mug/ml (pretratamiento con SHIER II). La expresión de la PC-LECTINA en la superficie celular se detectó tal como se muestra en la Fig. 13. El anticuerpo no tiñó las células 293T parentales.

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Ejemplo 12 Especificidad de unión a carbohidratos de la PC-LECTINA

Se analizó la especificidad de unión a carbohidratos de la PC-LECTINA utilizando un microensayo en 96 pocillos con el dominio extracelular Tag5 de la PC-LECTINA purificada a partir de medio acondicionado. El análisis de la capacidad de la PC-LECTINA de unirse a una serie de porciones de carbohidrato sobre preparaciones de proteína purificada demuestra una especificidad por residuos de alta manosa así como por N-acetilglucosamina. Esta especificidad es similar a la observada para la lectina Concanavalina A.

Los pocillos de una placa microtitulada de 96 pocillos se recubrieron con la glucoproteína apropiada a 1 \mug/pocillo en PBS y se incubaron toda la noche a 37ºC. Los pocillos se lavaron una vez con tampón salino Tris 1X (TBS) y después se bloquearon con BSA al 3% (Sigma) en PBS durante 1 hora con agitación. Los pocillos se incubaron con tampón control, o con 50 ng de PC-LECTINA o 50 ng de Concanavalina A (Con A) en 1 X TBS suplementado con CaCl_{2} 2 mM. Las placas se incubaron entonces durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación. Las placas se lavaron entonces 3X con TBS, CaCl_{2} 2 mM, Tween-20 al 0,05%, y una vez con TBS, CaCl_{2} 2 mM. Los pocillos se incubaron entonces durante 1 hora a temperatura ambiente con un pAb anti-His6 de conejo (para la detección de PC-LECTINA, Santa Cruz Biotechnology) o un pAb anti-Con A de conejo (para la detección de Con A, Vector Laboratories) ambos diluidos 1/1000 en TBS, CaCl_{2} 2 mM más BSA al 1%. Los pocillos se lavaron como anteriormente. Los pocillos se incubaron entonces con anticuerpo anti-Ig de conejo conjugado con HRP diluido 1/3000 con TBS, CaCl_{2} 2 mM más BSA al 1%. Los pocillos se lavaron de nuevo y se reveló utilizando TMB ELISA (GIBCO-BRL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se midió la densidad óptica a 450 nM. Los datos se muestran en la Tabla 1, y representan las medias de determinaciones por duplicado.

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TABLA 1 Especificidad de unión a carbohidratos de PC-LECTINA

3

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Ejemplo 13 Predicción de la unión de los péptidos de PC-LECTINA a HLA-A2

Para identificar los péptidos de PC-LECTINA que se predice se unen a la molécula de HLA A2 de MHC clase I humano, se introdujo la secuencia completa de aminoácidos de la proteína miembro de la familia 58P1D12(PC-LECTINA)-F3C4 en algoritmo de búsqueda de motivos peptídicos de HLA disponible en la página web de la Sección de Análisis Molecular y Bioinformática (BIMAS) (http://bimas.dcrt.nih.gov). Los resultados de los péptidos de unión predicha a 58P1D12-F3G4 se muestran en la Tabla 2. Los 5 mejores candidatos se muestran junto con su localización, la secuencia de aminoácidos de cada péptido específico y una puntuación de unión estimada. La puntuación de unión corresponde a la vida media estimada de disociación de los complejos que contienen el péptido a 37ºC a pH 6,5. Los péptidos con la puntuación de unión más alta se predice que se unen más estrechamente al HLA de clase I en la superficie celular y así representan las mejores dianas inmunogénicas para el reconocimiento de células T. La unión actual de los péptidos al HLA-A2 puede evaluarse mediante estabilización de la expresión de HLA-A2 en la línea celular T2 defectiva para el procesamiento de antígenos (Xue et al., 1997, Prostate 30:73-8; Peshwa et al., 1998, Prostate 36:129-38). La inmunogenicidad de los péptidos específicos puede evaluarse in vitro mediante estimulación de linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL) en presencia de células dendríticas (Xue et al., 1997, Prostate 30:73-8; Peshwa et al., 1998, Prostate 36:129-38).

TABLA 2 Puntuaciones de unión predicha a los péptidos

4

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Ejemplo 14 Identificación de rutas potenciales de transducción de señales

Para determinar si la PC-LECTINA activa directa o indirectamente las rutas de transducción de señales conocidas en células, se llevaron a cabo ensayos marcadores de la transcripción basados en la luciferasa (luc) en células que expresan PC-LECTINA. Estos marcadores transcripcionales contienen sitios de unión consenso para factores de transcripción conocidos que yacen corriente abajo en las rutas de transducción de señales conocidas. Los marcadores y ejemplos de sus factores de transcripción asociados, rutas de transducción de señales, y estímulos de activación se listan a continuación.

1. NFkB-luc, NFkB/Rel; quinasa Ik/SAPK; crecimiento/apoptosis/estrés

2. SRE-luc, SRF/TCF/ELK1; MAPK/SAPK; crecimiento/diferenciación

3. AP-1-luc, FOS/JUN; MAPK/SAPK/PKC; crecimiento/apoptosis/estrés

4. ARE-luc, receptor de andrógeno; esteroides/MAPK; crecimiento/diferenciación/apoptosis

5. p53-luc, p53; SAPK; crecimiento/diferenciación/apoptosis

6. CRE-luc, CREB/ATF2; PKA/p38; crecimiento/apoptosis/estrés

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Los efectos mediados por PC-LECTINA pueden investigarse en células que muestran expresión de mRNA. Pueden introducirse plásmidos marcadores de luciferasa mediante transfección mediada por lípidos (TFX-50, Promega). La actividad de la luciferasa, un indicador de la actividad transcripcional relativa, se mide mediante incubación de los extractos celulares con sustrato luciferina y la luminiscencia de la reacción se monitoriza en un luminómetro.

Ejemplo 15 Ensayos in vitro de la función de PC-LECTINA

La expresión de PC-LECTINA en cáncer de próstata proporciona evidencias de que este gen posee un papel funcional en la progresión tumoral y/o iniciación del tumor. Es posible que PC-LECTINA funcione como un receptor involucrado en la activación de las señales de proliferación. La función de PC-LECTINA puede investigarse en células de mamífero utilizando aproximaciones in vitro. Para la expresión en mamíferos, PC-LECTINA puede clonarse en un cierto número de vectores apropiados, lo que incluye pcDNA 3.1 myc-His-tag y el vector retroviral pSR\alphatkneo (Muller et al., 1991, MCB 11:1785). Utilizando dichos vectores de expresión, PC-LECTINA puede expresarse en varias líneas celulares, lo que incluye PC-3, NIH 3T3, LNCaP y 293T. La expresión de PC-LECTINA puede monitorizarse utilizando anticuerpos anti-PC-LECTINA y análisis de Northern blot.

Las líneas celulares de mamífero que expresan PC-LECTINA pueden analizarse en varios ensayos in vitro e in vivo, lo que incluye proliferación celular en cultivo de tejidos, activación de señales apoptóticas, formación de tumores en ratones SCID, e invasión in vitro utilizando un sistema de cultivo por invasión de membrana (MICS; Welch et al. ,Int. J. Cancer 43: 449-457). El fenotipo celular PC-LECTINA se compara con el fenotipo de células que carecen de expresión de PC-LECTINA.

Las líneas celulares que expresan PC-LECTINA pueden también investigarse para la alteración de propiedades invasivas y migratorias midiendo el pase de células a través de una cámara de membrana porosa cubierta de matrigel (Becton Dickinson). El pase de células a través de la membrana hacia el lado opuesto se monitoriza utilizando un ensayo fluorescente (Becton Dickinson Technical Bulletin #428) utilizando células indicadoras cargadas con calcein-Am (Molecular Probes). Las líneas celulares analizadas incluyen células parentales y células PC3, NIH 3T3 y LNCaP que sobreexpresan la PC-LECTINA. Para determinar si las células que expresan la PC-LECTINA poseen propiedades quimiotácticas, se monitorizan las células indicadoras por si pasan a través de la membrana porosa hacia un gradiente de medio acondicionado para PC-LECTINA en comparación con medio control. Este ensayo también puede utilizarse para cualificar y cuantificar la neutralización específica del efecto inducido por PC-LECTINA mediante composiciones terapéuticas candidatas para tratar el cáncer.

La función de la PC-LECTINA puede evaluarse utilizando tecnología de RNA antisentido acoplada a los diferentes ensayos funcionales descritos anteriormente, por ejemplo crecimiento, invasión y migración. Los oligonucleótidos de RNA antisentido pueden introducirse en células que expresan PC-LECTINA, previniendo así la expresión de PC-LECTINA. En las células que contienen control y antisentido puede analizarse la proliferación, invasión, migración y potencial apoptótico y transcripcional. Puede evaluarse el efecto local así como el efecto sistémico de la pérdida de expresión de PC-LECTINA.

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Ejemplo 16 Ensayo in vivo para la promoción de crecimiento tumoral por PC-LECTINA

El efecto de la proteína PC-LECTINA sobre el crecimiento de células tumorales se puede evaluar in vivo mediante sobreexpresión génica en ratones portadores de tumores. Por ejemplo, los ratones SCID pueden inyectarse por vía subcutánea en cada costado con 1 x 10^{6} de cada una de las células PC3, TSUPR1, o DU145 que contienen vector tkNeo vacío o con PC-LECTINA. Se pueden utilizar al menos dos estrategias: (1) expresión constitutiva de PC-LECTINA bajo regulación de un promotor como un promotor constitutivo obtenido de genomas de virus como el virus del polioma, virus de la viruela aviar (UK 2.211.504 publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus (como Adenovirus 2), virus de papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis-B y Virus 40 de simio (SV40), o de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de la actina o un promotor de la inmunoglobulina, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de la célula huésped, y (2) expresión regulada bajo el control de un sistema de vector inducible, como ecdisona, tet, etc., siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de la célula huésped. Se monitoriza entonces el volumen del tumor cuando aparecen tumores palpables y se sigue durante el tiempo para determinar si las células que expresan PC-LECTINA crecen a una tasa superior y si los tumores producidos por las células que expresan PC-LECTINA demuestran características de agresividad alterada (por ejemplo, aumento de la metástasis, vascularización, respuesta reducida a fármacos quimioterápicos). Adicionalmente, se les puede implantar a los ratones 1 x 10^{5} de las mismas células de forma ortotópica para determinar si PC-LECTINA posee un efecto en el crecimiento local en la próstata o en la capacidad de metástasis de las células, específicamente en los pulmones, nódulos linfáticos, y médula ósea.

El ensayo también es útil para determinar el efecto inhibidor sobre PC-LECTINA de las composiciones terapéuticas candidatas, como por ejemplo, intracuerpos frente a PC-LECTINA, moléculas antisentido de PC-LECTINA y ribozimas.

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Ejemplo 17 Análisis Western de la expresión de PC-LECTINA en fracciones subcelulares

El análisis de la secuencia de la PC-LECTINA reveló la presencia de dos dominios de lectina de tipo C y un dominio transmembrana. La localización celular de la PC-LECTINA puede evaluarse en profundidad utilizando técnicas de fraccionamiento subcelular ampliamente utilizadas en biología celular (Storrie B, et al. Methods Enzymol. 1990, 182:203-25). Las líneas celulares de próstata pueden separarse en fracciones nucleares, citosólicas y membranales. La expresión de la PC-LECTINA en las diferentes fracciones puede analizarse utilizando técnicas de Western blot.

Alternativamente, para determinar la localización subcelular de la PC-LECTINA, las células 293T pueden transfectarse con un vector de expresión que codifica la PC-LECTINA con una cola de HIS (PCDNA 3.1 MYC/HIS, Invitrogen). Las células transfectadas pueden recogerse y someterse a un protocolo de fraccionamiento subcelular diferencial tal y como se ha descrito anteriormente (Pemberton, P.A. et al, 1997, J. of Histochemistry and Cytochemistry, 45:1697-1706.) Este protocolo separa las células en fracciones enriquecidas con núcleos, membranas pesadas (lisosomas, peroxisomas y mitocondrias), membranas ligeras (membrana plasmática y retículo endoplasmático) y proteínas solubles.

<110> Daniel E.H. Afar, Rene S. Hubert, Aya Jakobovits, Arthur B. Raitano

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<120> NUEVO ANTÍGENO TRANSMEMBRANAL DE LECTINA TIPO C EXPRESADO EN EL CÁNCER DE PRÓSTATA HUMANO Y USOS DEL MISMO

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<130> 129.20WOU1

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<150> 60/148,935

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<151> 1999-08-12

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<160> 47

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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<210> 1

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<211> 2549

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<212> DNA

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<213> Homo Sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (379) ... (1200)

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<400> 1

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5

6

7

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<210> 2

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<211> 273

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 2

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8

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<210> 3

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<211> 260

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<212> PRT

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<213> Hámster

\newpage

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<400> 3

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9

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<210> 4

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<211> 585

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<212> DNA

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<213> Homo Sapiens

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<400> 4

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10

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<210> 5

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<211> 571

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<212> DNA

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<213> Hámster

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<400> 5

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11

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<210> 6

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 6

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\hskip1cm

12

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<210> 7

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 7

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\hskip1cm

13

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<210> 8

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<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttttgatcaa gctt

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctaatacgac tcactatagg gctcgagcgg ccgcccgggc ag

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcccgtcct ag

\hfill

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtaatacgac tcactatagg gcagcgtggt cgcggccgag

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggctcctag

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctaatacgac tcactatagg gc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcgagcggcc gcccgggcag ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcgtggtcg cggccgagga

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atatcgccgc gctcgtcgtc gacaa

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agccacacgc agctcattgt agaagg

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctgcttcag taacaaccac attct

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctttaccagt ggaatgatga cagg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgtaagctt cccgccgcgt ggtcagcggc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacaggatcc tatacctgct tcagtaac

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\hskip1cm

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

39

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

51

Claims (35)

1. Un polinucleótido que codifica un polipéptido de la PC-LECTINA, en el que el polinucleótido se selecciona de entre el grupo que consiste en:

(a) un polinucleótido que comprende el Id. de Sec. Nº 1, en el que T puede también ser U;

(b) un polinucleótido que comprende el Id. de Sec. Nº 1, desde el residuo de nucleótido número 201 hasta el residuo de nucleótido número 2378, en el que T puede también ser U; y

(c) un polinucleótido que codifica una proteína PC-LECTINA que comprende la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. Nº 2.

2. El polinucleótido de la reivindicación 1, en el que el polipéptido codifica una proteína con la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. Nº 2.

3. El polinucleótido de la reivindicación 1, en el que el polinucleótido comprende el Id. de Sec. Nº 1.

4. Un vector de expresión recombinante que contiene un polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. El vector de expresión de la reivindicación 4, en el que el vector es el plásmido designado p58PID12-2 depositado en la American Type Culture Collection con el número de depósito 207152.

6. Una célula huésped que contiene el vector de expresión de la reivindicación 4 o 5.

7. Un proceso para producir un polipéptido de la PC-LECTINA, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 6 bajo condiciones suficientes para la producción del polipéptido.

8. El proceso de la reivindicación 7, que comprende además la recuperación del polipéptido de la PC-LECTINA así producido.

9. Un polipéptido de la PC-LECTINA codificado por el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

10. El polipéptido de la reivindicación 9, en el que el polipéptido está codificado por el polinucleótido de la reivindicación 1(b).

11. Un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente al polipéptido de la PC-LECTINA de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10.

12. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 11, en el que el anticuerpo es un anticuerpo policlonal.

13. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 11, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

14. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 13, en el que el anticuerpo monoclonal es una proteína recombinante.

15. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 13 o 14, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo es un anticuerpo monoclonal de cadena única.

16. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 13, en el que el fragmento es un Fab, F(ab)2, Fv o fragmento sFv.

17. El anticuerpo o fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo es un anticuerpo humano o fragmento del mismo.

18. El anticuerpo o fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende residuos de la región de unión al antígeno murina y residuos de anticuerpo humano.

19. El anticuerpo o fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo está marcado con un marcaje detectable.

20. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 19, en el que el marcaje detectable se selecciona de entre el grupo que consiste en un radioisótopo, compuesto fluorescente, compuesto bioluminescente, compuesto quimioluminescente, quelante metálico y enzimas.

21. El anticuerpo o fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo está conjugado a una toxina o un agente terapéutico.

22. Un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal de la reivindicación 13.

23. Un ensayo para detectar la presencia de una proteína PC-LECTINA en una muestra biológica que comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo o fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 20, y detectar la unión de la proteína PC-LECTINA en esta muestra.

24. Un ensayo para detectar la presencia de un polinucleótido de la PC-LECTINA en una muestra biológica que comprende:

(a) poner en contacto la muestra con una sonda de polinucleótido que hibrida de forma específica con el polinucleótido de la reivindicación 1; y

(b) detectar la presencia de un complejo de hibridación formado por la hibridación de la sonda con el polinucleótido de la PC-LECTINA en la muestra, en el que la presencia del complejo de hibridación indica la presencia de polinucleótido de PC-LECTINA en la muestra.

25. Un ensayo para detectar la presencia de mRNA de la PC-LECTINA en una muestra biológica que comprende:

(a) producir el cDNA a partir de la muestra mediante transcripción reversa utilizando al menos un cebador;

(b) amplificar el cDNA así producido utilizando los polinucleótidos de la PC-LECTINA de la reivindicación 1 como cebadores sentido y antisentido para amplificar los cDNA de PC-LECTINA en la muestra; y

(c) detectar la presencia del cDNA de la PC-LECTINA amplificado, en el que los polinucleótidos de la PC-LECTINA utilizados como cebadores sentido y antisentido son capaces de amplificar el cDNA de PC-LECTINA contenidos en un plásmido control, y en el que el plásmido control comprende la secuencia de nucleótidos de Id. de Sec. Nº 1.

26. Un método de detección de la presencia de un cáncer que expresa la proteína PC-LECTINA como se reivindica en la reivindicación 9 que comprende:

determinar el nivel de proteína PC-LECTINA expresada por las células en una muestra de tejido prueba y en la correspondiente muestra normal; y

comparar los niveles así determinados; el cáncer se detecta cuando se observa la presencia de proteína PC-LECTINA elevada en la muestra prueba en relación con la muestra normal.

27. Un método para diagnosticar la presencia de cáncer en un individuo que comprende;

(a) determinar el nivel de mRNA de la PC-LECTINA como se reivindica en la reivindicación 1 expresado en un tejido prueba obtenido del individuo; y

(b) comparar el nivel así determinado con el nivel de mRNA de la PC-LECTINA expresado en una muestra conocida de tejido normal comparable. La presencia de expresión elevada de mRNA de la PC-LECTINA en la muestra prueba en relación con la muestra de tejido normal proporciona una indicación de la presencia de cáncer.

28. Un método para diagnosticar la presencia de cáncer en un individuo que comprende:

(a) determinar el nivel de proteína PC-LECTINA como se reivindica en la reivindicación 9 expresado en un tejido prueba obtenido del individuo; y

(b) comparar el nivel así determinado con el nivel de proteína PC-LECTINA expresado en una muestra conocida de tejido normal comparable. La elevada presencia de proteína PC-LECTINA en la muestra prueba en relación con la muestra de tejido normal proporciona una indicación de la presencia de cáncer.

29. El método de la reivindicación 27 o 28, en el que el cáncer es cáncer de próstata, y las muestras de tejido prueba y normales se seleccionan de entre el grupo que consiste en tejido de próstata, tejido óseo, tejido linfático, suero, sangre y semen.

30. La utilización del vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 para la preparación de una composición para tratar a un paciente con un cáncer que expresa PC-LECTINA.

31. La utilización de la reivindicación 30, en la que el cáncer se selecciona de entre el grupo que consiste en cáncer de próstata, mama, vejiga, pulmón, hueso, colon, páncreas, testículos, cérvix y ovarios.

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32. La utilización de polipéptido de la PC-LECTINA de la reivindicación 9 o 10 o una porción inmunogénica del mismo para la preparación de una composición inmunogénica para inducir una respuesta inmune.

33. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de la PC-LECTINA de la reivindicación 9 o 10 o una porción inmunogénica del mismo, o un anticuerpo o fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 11-21 y un transportador fisiológicamente aceptable.

34. Una composición de vacuna para el tratamiento de un cáncer que expresa la PC-LECTINA que comprende una porción inmunogénica del polipéptido de la PC-LECTINA de la reivindicación 9 o 10 y un transportador fisiológicamente aceptable.

35. Un polinucleótido que es totalmente complementario al polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1(a) a 1(c).