ES2349679T3 - Antígeno tumoral secretado. - Google Patents

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Abstract

Un método para detectar la presencia de cáncer de próstata en un individuo, cuyo método comprende determinar el nivel de expresión de la proteína de SEQ ID NO: 2 en una muestra biológica de ensayo procedente de un individuo y comparar el nivel así determinado con el nivel de dicha expresión que es evidenciada en la correspondiente muestra normal, en el que la expresión elevada de dicha proteína evidenciada en la muestra de ensayo con relación a la muestra normal, es una indicación de la presencia de dicho cáncer en el individuo.

Description

El cáncer es la segunda causa principal de muerte humana próxima a las enfermedades coronarias. En todo el mundo millones de personas mueren de cáncer todos los años. Sólo en los Estados Unidos el cáncer ocasiona la muerte de más de medio millón de personas todos los años, diagnosticándose cada año unos 1,4 millones de nuevos casos. Aun cuando las muertes como consecuencia de enfermedades cardiacas han ido disminuyendo significativamente, las que resultan de cáncer generalmente van en aumento. Se ha pronosticado que en la primera parte del siglo próximo, el cáncer llegará a ser la causa principal de muerte.
En todo el mundo diversos cánceres sobresalen como los asesinos principales. En particular, los carcinomas de pulmón, de próstata, de mama, de colon, de páncreas y de ovario representan las causas primordiales de muerte por cáncer. Estos, y virtualmente todos los otros carcinomas, comparten una faceta letal común. Con muy pocas excepciones, la enfermedad metastásica procedente de un carcinoma, es fatal. Además, incluso para aquellos pacientes de cáncer que inicialmente sobreviven a sus cánceres primarios, la experiencia común ha puesto de manifiesto que sus vidas resultan alteradas espectacularmente. Muchos pacientes de cáncer experimentan ansiedades fuertes ocasionadas por el conocimiento del potencial de recurrencia o de fallo del tratamiento. Muchos pacientes de cáncer experimentan debilitaciones físicas después del tratamiento. Muchos pacientes de cáncer experimentan recurrencias.
Hablando en términos generales, el problema fundamental existente en la gestión de la letalidad de los cánceres es la carencia de terapias sistémicas eficaces y no tóxicas. La medicina molecular, todavía muy en su infancia, promete redefinir los caminos en que estos cánceres son gestionados.. Incuestionablemente, existe un esfuerzo intenso a nivel mundial dirigido al desarrollo de nuevos enfoques moleculares para la diagnosis y el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, existe un gran interés en identificar verdaderamente genes y proteínas específicos de tumores que pudieran utilizarse como marcadores de diagnóstico y prognósticos y/o dianas o agentes terapéuticos. Los esfuerzos de investigación en estos campos son alentadores y la disponibilidad creciente de tecnologías moleculares útiles ha acelerado la adquisición de un conocimiento válido acerca del cáncer. No obstante, el progreso es lento y, en general, desigual.
Como se discute más adelante, la gestión del cáncer de próstata sirve de buen ejemplo de la extensión limitada a la que la biología molecular ha traducido en progreso real la experiencia clínica. Con limitadas excepciones, la situación es más o menos la misma para los otros carcinomas principales anteriormente citados.
En todo el mundo, el cáncer de próstata es el cuarto tipo de cáncer que más prevalece en el hombre. En Norteamérica y en Europa Septentrional es, con mucho, el cáncer masculino más común y es la segunda causa importante de muerte por cáncer en los hombres. Solo en los Estados Unidos más de
40.000 hombres mueren anualmente por esta enfermedad – en segundo lugar solamente con respecto al cáncer de pulmón. A pesar de la magnitud de estas cifras, no existe todavía un tratamiento eficaz del cáncer de próstata metastásico. La prostatectomía quirúrgica, la radioterapia, la terapia hormonal de ablación y la quimioterapia, permanecen fijas como las modalidades fundamentales de tratamiento. Desgraciadamente, estos tratamientos son ineficaces para muchos y con frecuencia están asociados con consecuencias indeseables importantes.
En lo referente al diagnóstico, la carencia de un marcador tumoral prostático que pueda detectar con exactitud tumores localizados en fase precoz, permanece como una limitación importante en el tratamiento de esta enfermedad. Aun cuando el ensayo del PSA sérico ha sido una herramienta muy útil, su especificidad y utilidad general es considerada ampliamente como que adolece en varios aspectos importantes, como se discute más adelante. La mayor parte de los cánceres de próstata ocurren en la zona periférica de la glándula prostática, fuera de los uréteres. Los tumores existentes dentro de esta zona pueden no producir síntoma alguno y, como resultado, la mayoría de los hombres con cáncer de próstata en fase precoz no presentan síntomas clínicos de la enfermedad hasta que ha tenido lugar un progreso importante. La progresión tumoral en la zona de transición de la próstata puede conducir a obstrucción uretral, produciéndose así los primeros síntomas de la enfermedad. Sin embargo, estos síntomas clínicos no pueden distinguirse del estado común, no maligno, de la hiperplasia prostática benigna (BPH). La detección y el diagnóstico precoz del cáncer de próstata se basa actualmente en exámenes rectales digitales (DRE), medidas del antígeno prostático específico (PSA), ultrasonografía transrectal (TRUS) y biopsia transrectal por medio de aguja (TRNB). Actualmente, la medida del PSA sérico combinada con DRE representan la herramienta principal utilizada para detectar y diagnosticar el cáncer de próstata. Ambos poseen limitaciones importantes que han estimulado una investigación intensa para descubrir mejores marcadores de diagnóstico de esta enfermedad.
De modo semejante, no existe un marcador disponible que pueda predecir la emergencia de la fase metastásica, típicamente fatal, del cáncer de próstata. El diagnóstico de la fase metastásica se consigue actualmente mediante cirugía abierta o linfadenectomía pélvica laparoscópica, exploraciones de la totalidad del cuerpo con radioisótopos, radiografía del esqueleto y/o análisis de biopsias de lesiones óseas. Claramente, mejores procedimientos de producción de imágenes y otros métodos de diagnóstico menos invasivos, ofrecen la promesa de aliviar las dificultades que tales procedimientos imponen a un paciente, así como mejorar la exactitud de los diagnósticos y la apertura de opciones terapéuticas. Un problema semejante es la carencia de un marcador prognóstico eficaz para determinar que cánceres son indolentes y cuales son o pueden ser agresivos. El PSA, por ejemplo, falla en discriminar con exactitud entre cánceres indolentes y agresivos. Hasta que existan marcadores tumorales prostáticos capaces de identificar de modo fidedigno la enfermedad en fase precoz, predecir la susceptibilidad a las metástasis y formar con precisión imágenes de tumores, la gestión del cáncer de próstata continuará siendo sumamente difícil.
El PSA es el marcador tumoral utilizado más ampliamente para seleccionar, diagnosticar y monitorizar hoy en día el cáncer de próstata. En particular, varios inmunoensayos para la detección del PSA sérico están en uso clínico de amplia difusión. Recientemente, ha sido desarrollado un ensayo de reacción de cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa (RT-PCR) para el mRNA del PSA en el suero. Sin embargo el PSA no es un marcador específico de la enfermedad, ya que niveles elevados de PSA pueden detectarse en un gran porcentaje de pacientes con BPH y prostatitis (25-86%) (Gao et al., 1997, Prostate 31:264-281), así como en otros trastornos no malignos y en algunos hombres normales, un factor que limita significativamente la especificidad de diagnóstico del marcador. Por ejemplo, elevaciones del PSA sérico de entre 4 a 10 ng/ml son observadas en la BPH e incluso valores más altos son observados en las prostatitis, en particular en las prostatitis agudas. La BPH es un estado sumamente común en el hombre. Una confusión adicional de la situación consiste en el hecho de que pueden observarse elevaciones del PSA sérico sin indicación alguna de enfermedad por DRE, y viceversa. Además, está reconocido ahora que el PSA no es específico de la próstata (Gao et al., referencia citada pata una revisión).
Han sido descritos diversos métodos diseñados para mejorar la especificidad de la detección basada en el PSA, tales como la medida de la densidad del PSA y la relación del PSA libre frente al PSA complejado. Sin embargo, ninguna de estas metodologías han sido capaces de distinguir reproduciblemente entre enfermedad prostática benigna y maligna. Además, los diagnósticos de PSA tienen sensibilidades de entre 57-79% (Cupp y Osterling, 1993, Mayo Clin. Proc. 68:297-306) y por tanto fallan en identificar cánceres de próstata en una población importante de hombres con esta enfermedad.
Existen algunos marcadores conocidos que son expresados principalmente en la próstata, tales como el antígeno de membrana específico de la próstata (PSM), una hidrolasa con identidad de 85% con una neuropeptidasa de la rata (Carter et al, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:749; Bzdega et al., 1997, J. Neurochem, 69:2270). No obstante, la expresión de PSM en el intestino delgado y en el cerebro (Israeli et al., 1994, Cancer Res. 54:1807), así como su papel potencial en el catabolismo de neuropéptidos del cerebro, eleva el concepto de neurotoxicidad potencial con terapias anti-PSM. Resultados preliminares usando un anticuerpo monoclonal anti-PSM marcado con indio 111 pata obtener imágenes de cánceres de próstata recurrentes, manifiestan alguna promesa (Sodee et al., 1996, Clin. Nuc. Med. 21: 759-766). Más recientemente marcadores identificados de cáncer de próstata incluyen el PCTA-1 (Su et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93-7252) y el antígeno prostático de células pluripotenciales (PSCA) (Reiter et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1735) El PCTA-1, una nueva galectina, es secretado en gran medida en los medios de expresión de células y pueden ser prometedores como marcadores séricos de diagnóstico para el cáncer de próstata (Su et al., 1996). El PSCA, una molécula de la superficie celular ligada a GPI, fue clonado a partir de cDNA de LAPC-4 y es único en que es expresado principalmente en células basales de tejido prostático normal y en epitelios de cáncer (Reiter et al., 1998). Vacunas para el cáncer de próstata también están siendo exploradas activamente con una diversidad de antígenos, que incluyen PSM y PSA.
La Publicación de la Solicitud de Patente Internacional No. WO 99/18209. identifica moléculas de polinucleótidos y de polipéptidos para z219a, un miembro de la familia de la proteína 2 – 19 humana. Los polipéptidos y los polinucleótidos que le codifican pueden ser usados para detectar anomalías cromosómicas.
La Publicación de la Solicitud de Patente Internacional No. WO 99/18209 describe un polipéptido y polinucleótidos codificantes procedentes del miembro 2-21 de la familia de las citoquinas y su uso para identificar compuestos que pueden ser agonistas, antagonistas y/o inhibidores potencialmente útiles de terapia. Además, se describe la producción de tales polipéptidos y polinucleótidos.
Aun cuando los marcadores identificados previamente tales como PSA, PSM, PCTA y PSCA han facilitado los esfuerzos para diagnosticar y tratar el cáncer de próstata, existe la necesidad de identificar marcadores y dianas terapéuticas adicionales para el cáncer de próstata y cánceres afines con objeto de mejorar adicionalmente la diagnosis y la terapia.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un gen y una proteína designados 36P6D5. En individuos normales la proteína 36P6D5 aparece expresada predominantemente en el páncreas con niveles inferiores de expresión detectados en la próstata y en el intestino delgado. El gen 36P6D5 es expresado también en diversos xenotrasplantes de cánceres humanos y en líneas celulares derivadas de cánceres de próstata, de mama, ováricos y de colon, en algunos casos en niveles altos. Sobreexpresiones de 36P6D5 con relación a las normales, se observan en xenotrasplantes de cánceres de próstata derivados inicialmente desde una metástasis en un ganglio linfático de un cáncer de próstata y pasado intratibialmente y subcutáneamente en ratones SCID Una expresión de 36P6D5 de nivel sumamente alto ha sido detectada en la línea celular de cáncer de mama DU4475, una línea celular que inicialmente había sido derivada desde un carcinoma de glándula mamaria (Langlois et al., 1979, Cancer Res. 39:2604). El gen 36P6D5 es expresado también en muestras de pacientes con tumores derivados de cánceres de vejiga, riñón, colon y pulmón, en algunos casos en niveles altos.
Un cDNA de 36P6D5 de longitud total, de 931 bp (SEQ ID NO:1) proporcionado en esta memoria, codifica un marco de lectura abierto de 235 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) con homología importante con el precursor de la proteína 2-19 (Genbank P98173) así como un gen previamente clonado procedente de osteoblastos humanos (Q92520). La proteína 36P6D5 de 235 aminoácidos predicha contiene también una secuencia señal del extremo N-terminal, lo que indica que la proteína 36P6D5 es secretada. Por consiguiente, el gen 36P6D5 codifica un antígeno tumoral secretado que puede ser útil como marcador de diagnóstico, de armazón y/o prognóstico, y /o puede servir como diana para diversos enfoques para el tratamiento de cánceres de próstata, colon, páncreas y ovarios que expresan 36P6D5. El peso molecular predicho de la proteína 36P6D5 es, aproximadamente, 26 kD y su pI es 8,97.
El análisis de la expresión demuestra niveles altos de expresión de 36P6D5 en diversas líneas celulares de cánceres de próstata y otros cánceres así como en muestras de pacientes aquejados de cáncer de próstata y xenotrasplantes de tumores. El perfil de expresión de 36P6D5 en tejidos normales de adultos, combinado con la sobreexpresión observada en células cancerosas tales como líneas celulares de cánceres de vejiga, colon, riñón, mama, pulmón, ovarios y próstata, y/o en muestras de pacientes cancerosos, proporciona evidencia de que la proteína 36P6D5 es expresada, aberrantemente, en algunos cánceres, por lo menos, y puede servir como medio útil de diagnóstico y/o de diana terapéutica para tales cánceres.
La invención proporciona polinucleótidos que corresponden o que son complementarios de la totalidad o parte de los genes 36P6D5, mRNAs, y/o secuencias codificantes, preferiblemente en forma aislada, incluyendo polinucleótidos que codifican proteínas 36P6D5 y fragmentos de las mismas, DNA, RNA, híbrido de DNA/RNA y moléculas afines, polinucleótidos u oligonucleótidos complementarios de los genes 36P6D5 o secuencias de mRNA o sus partes, y polinucleótidos u oligonucleótidos que se hibridan con los genes 36P6D5, mRNAs o con polinucleótidos que codifican 36P6D5. También se proporcionan medios para aislar cDNAs y los genes que codifican 36P6D5. También se proporcionan moléculas de DNA recombinante que contienen polinucleótidos de 36P6D5, células transformadas o transducidas con tales moléculas y sistemas de vectores hospedadores para la expresión de productos génicos 36P6D5. La invención proporciona, además, proteínas 36P6D5 y fragmentos de polipéptidos de las mismas. La invención proporciona, además, anticuerpos que se unen a las proteínas 36P6D5 y sus fragmentos de polipéptidos, que incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos murinos y de otros mamíferos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y totalmente humanos, y anticuerpos marcados con un marcador detectable.
La invención proporciona, además, métodos para detectar la presencia y el estado de polinucleótidos y proteínas 36P6D5 en diversas muestras biológicas, así como también métodos para identificar células que expresan 36P6D5. Una realización típica de esta invención proporciona métodos para monitorizar producto génicos 36P6D5 en una muestra de un tejido que tiene o que se sospecha que tiene alguna forma de regulación anormal de crecimiento tal como cáncer.
La invención proporciona, además, diversas composiciones y estrategias terapéuticas para tratar cánceres que expresan 36P6D5 tales como cánceres de próstata, con inclusión de terapias destinadas a inhibir la transcripción, traducción, procesamiento o función de 36P6D5, así como vacunas de cáncer.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS
FIGS 1A-1B. Nucleótido (SEQ ID NO: 1) y secuencias de aminoácidos deducidas (SEQ ID NO:2) de cDNA de 36P6D5. La metionina inicial y la secuencia de consenso Kozak están indicadas en negrita y la secuencia señal putativa del extremo N-terminal está subrayada.
FIGS 2A-2B. Alineación de la secuencia de aminoácidos del ORF de 36P6D5 con el precursor de la proteína 2-19 (2A)(SEQ ID NO: 15) y la proteína GS3786 (proteína osteoblástica) (2B) (SEQ ID NO: 16) Los tantos por ciento de identidades de las secuencias están indicados sobre la figura.
FIG. 3 Análisis de transferencia Northern de la expresión de 36P6D5 humana en varios tejidos normales que muestran expresión predominante en el páncreas y un nivel bajo de expresión en la próstata y en el intestino delgado.
FIGS. 4A-4B. Análisis de transferencia Northern de la expresión de mRNA de 36P6D5 humana en una lista de xenotrasplantes de cánceres de próstata y otras diversas líneas de células cancerosas humanas.
FIGS. 5A-5B. Secreción de la proteína 36P6D5 desde células 293T transfectadas y detección con un anticuerpo policlonal anti-36P6D5. Las células 293T fueron transfectadas transitoriamente con uno de los dos pCDNA 3.1 MYC/HIS 36P6D5, pTag5 36P6D5, en que la secuencia señal natural de 36P6D5 ha sido reemplazada con una secuencia señal de inmunoglobulina, o pAPTag5 36P6 D5 que codifica una proteína de fusión compuesta de 36P6D5 y fosfatasa alcalina (conteniendo también la secuencia señal de Ig). Medios acondicionados o lisados de células totales fueron sometidos a transferencia Western o bien con pAb de conejo anti-His (Santa Cruz, Biotechnology Inc., dilución 1:2.500, lista izquierda), o con pAb de conejo purificado por afinidad, anti-36P6D5 (1 ug/ml, lista derecha). Las bandas reactivas de pAb anti-His y anti-36P6D5 fueron visualizadas por incubación de las transferencias con anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con HRP seguido de detección intensificada por quimiluminiscencia..
FIG. 6. Expresión de 36P6D5 en tumores de pacientes cancerosos. Análisis por RT-PCR de la expresión de mRNA de 36P6D5 en tumores de pacientes aquejados de cáncer de vejiga, cáncer de riñón, cáncer de colon y cáncer de pulmón.
FIG. 7. La expresión de 36P6D5 en cáncer de vejiga y sus tejidos normales equiparados fue ensayada por análisis de transferencia Northern. Para esta figura. 10 µg de RNA total fueron cargados para cada una de las muestras. Se detectó sobreexpresión de 36P6D5 en 3 de 4 cánceres ensayados (calles 3,5,7 y 8). No se observó expresión en tejido de vejiga aislado desde un individuo normal (calle 1).
FIG. 8. Unión de 36P6D5 a LAPC9 AD. Una suspensión de células de xenotrasplante LAPC9 AD se dejó adherir durante la noche a una placa de 6 pocillos. Las células fueron incubadas en presencia de proteína de fusión testigo o 36P6D5-AP. Se utilizó para la detección un sustrato de fosfato alcalino, púrpura BM.
FIGS. 9A-9B. Células cancerosas humanas expresan y secretan la proteína 36P6D5. Medios acondicionados y/o lisados de células procedentes de una diversidad de líneas de células cancerosas que representaban cánceres derivados de tejido prostático (xenotrasplante LAPC4), de colon (Colo 205, CaCo-1), de mama (D-4475) y pancreático (Capan 1), así como células de cáncer de próstata PC3 manipuladas para sobreexpresar la proteína 36P6D5, fueron sometidas a análisis Western usando un pAb murino anti-36P6D5. Las bandas inmunorreactivas, específicas, anti-36P6D5 que representan la proteína 36P6D5 endógena., están indicadas con flechas y están comprendidas, aproximadamente, entre 35 y 40 kD. El peso molecular de 36P6D5 calculado desde la secuencia de aminoácidos es 26 kD, lo que sugiere que la proteína 36P6D5 endógena ha sido modificada después de la traducción, posiblemente por glicosilación-
FIG. 10. Un ensayo ELISA de captura sensible y específico detecta la proteína 36P6D5 en sobrenadantes de líneas de células cancerosas humanas. El ensayo ELISA de captura fue desarrollado usando pAb murino, purificado de proteína G, anti-36P6D5, como Ab de captura y una forma biotinilada del mismo pAB como Ab de detección. Se muestra la curva estándar generada usando la proteína Tag5-36P6D5 y detección específica y cuantificación de 36P6D5 presente en sobrenadantes derivados de células transfectadas con PC-3-Neo (D.O. = 0,023, concentración de la proteína 36P6D5 en ng/ml = N.D.). Células PC-3 que sobreexpresan 36P6D5 (D.O. = 0,186, concentración de la proteína 36P6D5 en ng/ml = 1,48) y proteína 36P6D5 endógena secretada por células de cáncer de mama Du4475 (D.O. = 0,085, concentración de la proteína 36P6D5 en ng/ml = 0,50).
FIGS. 11A-11B. Detección de la expresión de 36P6D5 en cánceres humanos. Lisados de células procedentes de tejidos de cánceres de colon, mama y riñón (Ca) así como sus tejidos adyacentes normales equiparados (N) fueron sometidos a análisis Western usando un anticuerpo anti-36P6D5. Las bandas inmunorreactivas específicas anti-36P6D5 representan una forma monómera de la proteína 36P6D5, que está comprendida, aproximadamente, entre 35 y 40 kD, y formas multímeras de la proteína, comprendidas, aproximadamente, entre 90 y 120 kD.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
A menos que se defina de otro modo, todos los términos y expresiones de la técnica, notaciones y otra terminología científica que se utiliza en esta memoria, están destinados a tener los significados comúnmente entendidos por los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. En algunos casos términos y expresiones con los significados comúnmente entendidos son definidos en esta memoria para claridad y/o para una referencia rápida, y la inclusión de tales definiciones en esta memoria no debe ser interpretada, necesariamente, como que representa una diferencia sustancial con respecto a lo que se entiende generalmente en la técnica. Los métodos y los procedimientos operatorios descritos o referenciados aquí están generalmente bien entendidos y son empleados comúnmente usando metodología convencional para los expertos en la técnica, tales como, por ejemplo, las metodologías de clonación molecular, ampliamente utilizada, descritas en la publicación de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Según sea apropiado, los procedimientos operatorios que implican el uso de kits y reactivos de que se dispone en el comercio, son llevados a cabo, generalmente, según los protocolos y/o los parámetros definidos por el fabricante, a menos que se haga notar de otro modo.
Tal como se usa en esta memoria, las expresiones “cáncer de próstata avanzado”, “cáncer de próstata avanzado localmente”, “enfermedad avanzada” y “enfermedad avanzada localmente” significan cánceres de próstata que se han extendido a través de la cápsula prostática y se entiende que incluyen enfermedad en fase C según el sistema de la American Urological Association (AUA), enfermedad en fase C1-C2 según el sistema de Whitmore-Jewett, y enfermedad en fase T3-T4 y N+ según el sistema TNM (tumor, ganglio, metástasis). En general, la cirugía no está recomendada para pacientes con enfermedad avanzada localmente. y estos pacientes tienen consecuencias sustancialmente menos favorables en comparación con pacientes que tienen cáncer de próstata localizado clínicamente (confinado en el órgano). La enfermedad avanzada localmente es identificada clínicamente por la evidencia palpable de induración más allá del borde lateral de la próstata, o asimetría o induración por encima de la base de la próstata. El cáncer de próstata avanzado localmente es diagnosticado en la actualidad patológicamente después de prostatectomía radical si el tumor invade o penetra la cápsula prostática, que se extiende en el margen quirúrgico o invade las vesículas seminales.
Tal como se usa aquí, las expresiones “cáncer de próstata metastásico” y “enfermedad metastásica” significa cánceres de próstata que se han extendido hasta los ganglios linfáticos regionales o hasta sitios distantes, y se entiende que incluyen enfermedad en la fase D según el sistema de AUA y la fase TxNxM+ según en sistema TNM. Como en el caso con el cáncer de próstata avanzado localmente, la cirugía no está indicada, en general, para pacientes con enfermedad metastásica, y la modalidad de tratamiento preferida es la terapia hormonal (ablación androgénica). Los pacientes con cáncer de próstata metastásico desarrollan finalmente un estado refractario a los andrógenos, al cabo de 12 a 18 meses de iniciación del tratamiento y aproximadamente la mitad de estos pacientes mueren al cabo de 6 meses después. El sitio más común de la metástasis del cáncer de próstata es el hueso. Las metástasis óseas de los cánceres de próstata son, en equilibrio, característicamente osteoblásticas en vez de osteolíticas (es decir, resultante de formación ósea neta) Las metástasis óseas se encuentran con la máxima frecuencia en la columna vertebral, seguida por el fémur, la pelvis, el tórax, el cráneo y el húmero. Otros sitios comunes de las metástasis incluyen los ganglios linfáticos, los pulmones, el hígado y el cerebro. El cáncer de próstata metastásico es diagnosticado típicamente mediante linfadenectomía pélvica abierta o laparoscópica, barridos con isótopos radiactivos de la totalidad del cuerpo, radiografía del esqueleto, y/o biopsia de lesiones óseas.
Tal como se emplea aquí, el término “polinucleótido” significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos una longitud de 10 bases o pares de bases, o bien ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquiera de los dos tipos de nucleótidos, y se entiende que incluye formas de DNA monocatenarias o bicatenarias.
Tal como se usa en esta memoria, el término “polipéptido” significa un polímero de aproximadamente 6 aminoácidos al menos. En toda la memoria descriptiva se usan las designaciones estándar de tres letras o de una sola letra para los aminoácidos.
Tal como se usan aquí, los términos “hibridar”, “hibridación”, híbridos” y semejantes, usados en el contexto de polinucleótidos, se entiende que se refieren a las condiciones convencionales de hibridación, preferiblemente tales como hibridación en formamida al 50%/6XSSC/SDS al 0,1%/ssDNA 100 µg/ml, en las que las temperaturas de hibridación están por encima de 37ºC y las temperaturas de lavado en 0,1X SSC/SDS al 0,1% están por encima de 55ºC, y lo más preferible, a condiciones rigurosas de hibridación
La “rigurosidad” de. las condiciones de hibridación puede determinarse con facilidad por expertos de habilidad ordinaria en la técnica, y, en general, es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentración salina. En general, sondas más largas requieren temperaturas más altas para la hibridación apropiada de los extremos complementarios, mientras que sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación depende, en general, de la aptitud del DNA desnaturalizado para el reanillamiento cuando se encuentran presentas hebras complementarias en un medio ambiente por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor es el grado deseado de homología entre la sonda y la secuencia que puede hibridarse, mayor será la temperatura relativa que puede emplearse .Como resultado, se deduce que temperaturas relativas superiores tenderían a hacer más rigurosas las condiciones de la reacción, mientras que las temperaturas inferiores las harían menos. Para detalles adicionales y explicación de la rigurosidad de las reacción de hibridación, véase la publicación de Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
“Condiciones rigurosas” o “condiciones de alta rigurosidad”, como se define en esta memoria, pueden ser identificadas por aquellos que: (1) emplean baja resistencia iónica y alta temperatura para lavar, por ejemplo, cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 /dodecil sulfato sódico al 0,1%, a 50ºC; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante tal como la formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/ solución tampón de fosfato sódico 50 mM, a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM, a 42ºC; o (3) emplean formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, solución de Denhardt 5 x, DNA de esperma de salmón sonicado (50 µg/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10%, a 42ºC, con lavados a 42ºC en SSC 0,2 x (cloruro sódico/citrato sódico) y formamida al 50%, a 55ºC, seguido de un lavado de alta rigurosidad consistente en SSC 0,1 x conteniendo EDTA, a 55ºC
“Condiciones moderadamente rigurosas” pueden ser identificadas según se describe en la publicación de Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York, Cold Spring Harbor Press, e incluyen el uso de una solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos rigurosas que las descritas anteriormente.
Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es la incubación durante la noche a 37ºC en una solución que comprende formamida al 20%, SSC 5 x (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5 x, sulfato de dextrano al 10% y DNA de esperma de salmón desnaturalizado 20 mg/ml, seguida de lavado de los filtros con SSC 1 x a 37-50ºC, aproximadamente. El técnico experimentado puede reconocer como ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc., según sea necesario para acomodar factores tales como la longitud de la sonda, y semejantes.
En el contexto de comparaciones de secuencias de aminoácidos el término “identidad” se usa para expresar el porcentaje de restos de aminoácidos en las mismas posiciones relativas que son iguales. Asimismo, en este contexto, el término “homología” se usa para expresar el porcentaje de restos de aminoácidos situados en las mismas posiciones relativas que son o bien idénticos o bien similares, usando los criterios de aminoácidos conservados del análisis BLAST, según se entiende, en general, en la técnica. Por ejemplo, valores de % de identidad pueden ser generados mediante WUBLAST-2 (Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266:460-480; http//blast.wustl/edu/blast/README.html). Otros detalles adicionales referentes a sustituciones de aminoácidos que se consideran conservativas bajo estos criterios, se proporcionan más adelante. En todas las subsecciones que siguen se proporcionan definiciones adicionales.
BIOLOGÍA MOLECULAR Y USOS DE 36P6D5
Como se describe adicionalmente en los Ejemplos que figuran más adelante, el gen y la proteína 36P6D5 han sido caracterizados usando varios enfoques analíticos. Por ejemplo, los análisis de secuencias codificantes de nucleótidos y de aminoácidos fueron llevados a cabo con objeto de identificar moléculas potencialmente afines, así como dominios estructurales reconocibles, características topológicas y otros elementos situados dentro del mRNA de 36P6D5 y de la estructura de la proteína. Se llevaron a cabo análisis de transferencia Northern de la expresión de mRNA de 36P6D5 con objeto de establecer la gama de tejidos normales y cancerosos que expresan el mensaje de 36P6D5.
Se ha pronosticado que la proteína 36P6D5 es traducida inicialmente en un precursor de 235 aminoácidos que contiene una secuencia señal que, durante el tratamiento posterior a la traducción, es escindida dando lugar a una proteína madura secretada de 211 ó 212 aminoácidos (FIG. 1). La proteína 36P6D5 tiene un peso molecular predicho = 25,9 y pI = 8,97. Se ha predicho que la 36P6D5 es una proteína asociada a la membrana, siendo intracelulares los primeros 28 aminoácidos. Basándose en el algoritmo de Péptido Señal, la parte intracelular de la proteína parece haber sido escindida entre los aa 29 y 30, quedando libre el resto de la molécula como una proteína soluble. El gen 36P6D5 es expresado normalmente, principalmente en el páncreas (FIG. 3), pero también es expresado o sobreexpresado en diversos cánceres humanos, incluyendo los cánceres de próstata, de mama, de páncreas, de colon, de pulmón, de vejiga, de riñón y de ovarios (FIGS. 4, 6 y 7). La estructura de la proteína 36P6D5 muestra una homología importante con dos secuencias proteínicas previamente descritas, el precursor de la proteína 2-19 (Genbank P98173 (SEQ ID NO. 15) y una proteína de los osteoblastos designada GS3786 (Q92520)(SEQ ID NO. 16)(FIG. 2) La proteína 36P6D5 tiene semejanzas con una proteína osteoblástica predicha, NP-055703.1, con una identidad de 36% a lo largo de toda su secuencia, teniendo lugar más del 54% de homología entre el aa 74 y el aa 235. También es débilmente similar a la proteína GS3786. El hecho de que la proteína 36P6D5 tenga semejanzas con proteínas derivadas del hueso no es sorprendente ya que se descubrió usando SSH comparando RNA de LAPC4AD(IT) y LAPC4AD/SQ). Dada su homología con la proteína de los osteoblastos, es posible que la proteína 36P6D5 pueda actuar como un factor secretado que estimula la proliferación de células cancerosas (tales como las células cancerosas de 36P6D5 mostradas en las figuras 4, 6 y 7) en el hueso.
Tal como se describe en esta memoria, la proteína 36P6D5 manifiesta propiedades específicas análogas a las encontradas en una familia de genes cuyos polinucleótidos, polipéptidos y anticuerpos anti-polipéptidos se emplean en ensayos diagnósticos bien conocidos dirigidos a examinar estados asociados con un crecimiento celular desordenado tal como el cáncer, en particular el cáncer de próstata (véase, por ejemplo, tanto su alto patrón específico de expresión en tejidos como su sobreexpresión en los cánceres de próstata, según se describe por ejemplo en el Ejemplo 3). El miembro mejor conocido de esta clase es el PSA, el marcador arquetípico que ha sido usado por los médicos especialistas durante años para identificar y monitorizar la presencia de cáncer de próstata (véase, por ejemplo, la publicación de Merrill et al., J. Urol. 163(2): 503-5120 (2000): Polascik et al., J. Urol. Aug: 162(2):293-306 (1999) y Fortier et al., J. Nat. Cancer Inst. 91(19:1635-1640 (1999)). Una diversidad de otros marcadores de diagnóstico son utilizados también a este respecto, incluyendo p53 y K-ras (véase, por ejemplo, Tulchinsky et al., Int. J. Mol. Med. 1999 Jul; 4(1):99.102 y Minimoto et al., Cancer Detect. Prev. 2000; 24(1):1-12). Por consiguiente, esta descripción de los polinucleótidos y polipéptidos de 36P6D5 (así como también las sondas de polinucleótidos de 36P6D5 y anticuerpos anti-36P6D5 que se usan para identificar la presencia de estas moléculas) y sus propiedades, permite a los expertos en la materia utilizar estas moléculas en métodos que son análogos a los utilizados, por ejemplo, en diversos ensayos diagnósticos dirigidos a examinar condiciones asociadas con el cáncer.
Las realizaciones típicas de métodos de diagnóstico que utilizan los polinucleótidos, polipéptidos y anticuerpos de 36P6D5, descritos en esta memoria, son análogos a los métodos de ensayos diagnósticos bien establecidos que emplean polinucleótidos, polipéptidos y anticuerpos del PSA. Por ejemplo, justamente como los polinucleótidos del PSA, son usados como sondas (por ejemplo en análisis de transferencia Northern, véase, por ejemplo, la publicación de Sharief et al., Biochem. Mol. Biol. Int. 33(3):567-74 (1994) y cebadores (por ejemplo en análisis de PCR, véase, por ejemplo, la publicación de Okegawa et al., J. Urol. 163(4): 1189-1190 (2000)) para observar la presencia y/o el nivel de mRNAs del PSA en métodos de verificación de la sobreexpresión del PSA o la metástasis de cánceres de próstata, los polinucleótidos de 36P6D5 descritos en esta memoria pueden ser utilizados del mismo modo para detectar la sobreexpresión de 36P6D5 o las metástasis de cánceres de próstata y de otros cánceres que expresan este gen. Alternativamente, del mismo modo que los polipéptidos del PSA se usan para generar anticuerpos específicos para el PSA que pueden ser usados luego para observar la presencia y/o el nivel de proteínas del PSA en métodos de verificación de la sobreexpresión de la proteína del PSA (véase, por ejemplo, la publicación de Stephan et al., Urology 55(4):560-3 (2000) o las metástasis de células prostáticas (véase, por ejemplo, la publicación de Alanen et al., Pathol. Res. Pract. 192(3):233-7 (1996)), los polipéptidos de 36P6D5 aquí descritos pueden ser utilizados para generar anticuerpos para usar en la detección de sobreexpresión de 36P6D5 o las metástasis de células prostáticas y de células de otros cánceres que expresan este gen-Específicamente, debido a que las metástasis llevan consigo el movimiento de células cancerosas desde un órgano de origen (tal como la vejiga, los riñones, o la glándula prostática, etc.) a una zona diferente del cuerpo (tal como un ganglio linfático) pueden emplearse ensayos que examinan una muestra biológica para detectar la presencia de células que expresan polinucleótidos y/o polipéptidos de 36P6D5, y proporcionar evidencia de metástasis, por ejemplo, cuando se encuentra que una muestra biológica procedente de un tejido que no contiene normalmente células que expresan 36P6D5 (ganglios linfáticos) contiene células que expresan 36P6D5. Alternativamente pueden usarse polinucleótidos y/o polipéptidos de 36P6D5 para proporcionar evidencia de cáncer, por ejemplo, cuando en una muestra biológica que no expresa normalmente 36P6D5 o que expresa 36P6D5 en un nivel diferente (tal como células de riñón, de vejiga, de pulmón y de próstata, etc.) se encuentra que expresa 36P6D5 o que posee una expresión aumentada de 36P6D5. En tales ensayos, los técnicos pueden desear, además, generar una evidencia suplementaria de metástasis ensayando la muestra biológica para detectar la presencia de un segundo marcador tisular restringido (además de 36P6D5) tal como PSA, PSCA, etc. (véase, por ejemplo, la publicación de Alanen et al., Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-237 (1996)).
Del mismo modo que fragmentos de polinucleótidos y variantes de polinucleótidos del PSA son empleados por los técnicos experimentados para usar en métodos de verificación de esta molécula, también pueden usarse fragmentos de polinucleótidos y variantes de polinucleótidos de 36P6D5 de un modo análogo. En particular, los polinucleótidos de PSA típicos usados en los métodos de verificación de esta molécula, son sondas o cebadores que consisten en fragmentos de la secuencia de cDNA del PSA. Como ilustración de esto, los cebadores utilizados para amplificar por PCR un polinucleótido del PSA deben incluir menos de la secuencia completa del PSA para actuar en la reacción en cadena de la polimerasa. En el contexto de tales reacciones PCR, los técnicos experimentados crean generalmente una diversidad de diferentes fragmentos de polinucleótidos que pueden ser usados como cebadores con objeto de amplificar diferentes partes de un polinucleótido de interés u optimizar reacciones de amplificación (véase, por ejemplo, la publicación de Caetano Anolles G. Biotechniques 25(3): 472-476, 478-480 (1998); y la de Robertson et al., Methods Mol. Biol. 98:121-154 (1998)). Una ilustración adicional de la utilidad de tales fragmentos se proporciona en el Ejemplo 3, en el que se usa un fragmento de polinucleótidos de 36P6D5 como sonda para poner de manifiesto la sobreexpresión de mRNAs de 36P6D5 en células cancerosas. Además, con objeto de facilitar su uso por los médicos especialistas , se usan típicamente, secuencias variantes de polinucleótidos como cebadores y sondas para los mRNAs correspondientes en PCR y análisis Northern (véase, por ejemplo, la publicación de Sawai et al., Fetal Diagn. Ther. 1996, Nov-Dec. 11(6):407-13 y Currents Protocols in Molecular Ciology, Volumen 2, Unidad 2, Frederick M. Ausubul et al., compiladores, 1995). Los fragmentos y variantes de polinucleótidos son, típicamente, útiles a este respecto en tanto posean el atributo común o la característica común de ser capaces de unirse a una secuencia de polinucleótidos diana (por ejemplo, el polinucleótido de 36P6D5 indicado en SEQ ID NO: 1) en condiciones de rigurosidad relativamente alta.
Justamente como los fragmentos de polipéptidos y variantes de polipéptidos del PSA son empleados por los técnicos experimentados para usar en métodos de monitorización de esta molécula, los fragmentos de polipéptidos y variantes de polipéptidos de 36P6D5 pueden ser usados, asimismo, de un modo análogo. En particular, los polipéptidos de PSA típicos usados en los métodos de monitorización de esta molécula, son fragmentos de la proteína de PSA que contienen un epítopo que puede ser reconocido por un anticuerpo que se una específicamente a la proteína del PSA. Esta práctica de usar fragmentos de polipéptidos o variantes de polipéptidos utilizados para genera anticuerpos (tales como anticuerpos anti-PSA) es típica en la técnica con una amplia variedad de sistemas tales como proteínas de fusión usados por los técnicos experimentados (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 2, Unidad 16, Frederick M. Ausubul et al. compiladores, 1995). En este contexto, cada una de las variedades de epítopos de una proteína de interés, actúa proporcionando el entramado sobre el que es generado el anticuerpo. Típicamente, los técnicos experimentados crean, en general, una diversidad de diferentes fragmentos de polipéptidos que pueden usarse con objeto de generar anticuerpos específicos para diferentes partes de un polipéptido de interés (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. No.
5.840.501 y la patente de EE.UU. No. 5.939.533). Por ejemplo, puede ser preferible utilizar un polipéptido que comprende uno de los motivos biológicos de 36P6D5 discutidos más adelante. Los fragmentos y variantes de polipéptidos son útiles, típicamente, en este contexto en tanto posean el atributo o característica común de poseer un epítopo capaz de generar un anticuerpo específico para una secuencia de un polipéptido diana (por ejemplo, el polipéptido de 36P6D5 indicado en SEQ ID NO:2).
Como se muestra en esta memoria, los polinucleótidos y polipéptidos de 36P6D5 (así como las sondas de polinucleótidos de 36P6D5 y anticuerpos anti-36P6D5 que se emplean para identificar la presencia de estas moléculas) exhiben propiedades especificas que les hacen útiles para diagnosticar cánceres de la próstata. Los ensayos diagnósticos descritos que miden la presencia de productos génicos de 36P6D5, con objeto de evaluar la presencia
o comienzo de las condiciones particulares de la enfermedad aquí descritas tales como un cáncer de próstata, son especialmente útiles para identificar candidatos potenciales para tomar medidas preventivas o monitorizar adicionalmente, como ha sido hecho con tanto éxito con el PSA. Además, estos materiales satisfacen la necesidad de la técnica de moléculas que tienen características similares a las del PSA en situaciones en que, por ejemplo, un diagnóstico definido de metástasis de origen prostático no puede realizarse en base a un ensayo del PSA solo (véase, por ejemplo, la publicación de Alanen et al., Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-237 (1006)), y, por consiguiente, deben emplearse para confirmar metástasis de origen prostático, materiales tales como polinucleótidos y polipéptidos de 36P6D5 (así como las sondas de polinucleótidos de 36P6D5 y anticuerpos anti-36P6D5 que se usan para identificar la presencia de esas moléculas).
Finalmente, además de su uso en ensayos diagnósticos, los polinucleótidos de 36P6D5 descritos en esta memoria poseen otras diversas utilidades específicas tales como su uso para la identificación de anomalías oncogenéticas asociadas a cromosomas en 21q22.2-22.3. Todavía, además de su uso en ensayos de diagnóstico, los polipéptidos y polinucleótidos de 36P6D5 aquí descritos poseen otras utilidades tales como su uso en los análisis forenses de tejidos de origen desconocido (véase, por ejemplo, la publicación de Takahama K en Forensic Sci. Int. 1996, Jun 28:80(1-2):63-9).
Como se describe con detalle más adelante, la función de 36P6D5 puede ser determinada en células de mamífero utilizando una diversidad de procedimientos bien conocidos en la técnica. Para su expresión en mamíferos puede clonarse 36P6D5 en varios vectores, que incluyen el pcDNA 3.1 mycHis-tag (Invitrogen) y el vector retroviral pSR�tkneo (Muller et al., 1991, MCB 11:1785). Usando estos vectores de expresión puede expresarse 36P6D5 en varias líneas celulares que incluyen PC-3, NIH 3T3, LNCaP y 293T. La expresión de 36P6D5 puede verificarse usando análisis de transferencia Northern. Las líneas de células de mamífero que expresan 36P6D5 pueden ser analizadas en diversos ensayos in vitro e in vivo, que incluyen la proliferación celular en cultivo de tejidos, la activación de señales apoptóticas, la formación de tumores en ratones SCID, y la invasión in vivo usando un sistema de cultivo de invasión de membranas (MICS) (Welch et al., Int. J. Cancer 43:449-457). El fenotipo de células de 36P6D5 puede ser comparado con el fenotipo de células que carecen de la expresión de 36P6D5.
POLINUCLEÓTIDOS DE 36P6D5
Un aspecto de la invención proporciona polinucleótidos que corresponden o que son complementarios de la totalidad o parte de un gen, mRNA y/o secuencia codificante de 36P6D5, de preferencia en forma aislada, con inclusión de polinucleótidos que codifican una proteína 36P6D5 y sus fragmentos, DNA, RNA, híbrido de DNA/RNA, y moléculas afines, polinucleótidos y oligonucleótidos complementarios de un gen o una secuencia de mRNA de 36P6D5 o una de sus partes, y polinucleótidos u oligonucleótidos que se hibridan a un gen 36P6D5, mRNA , o a un polinucleótido que codifica 36P6D5 (colectivamente “polinucleótidos de 36P6D5”). Tal como se usa aquí, se entiende que el gen y la proteína 36P6D5 incluyen los genes y proteínas 36P6D5 descritos específicamente en esta memoria y los genes y proteínas que corresponden a otras proteínas 36P6D5 y variantes estructuralmente similares de lo anterior. Tales otras proteínas y variantes de 36P6D5 poseen, por lo general, secuencias codificantes que son altamente homólogas con la secuencia codificante de 36P6D5 y, de preferencia, pueden compartir una identidad de aminoácidos de aproximadamente 50% por lo menos y una homología de aminoácidos de aproximadamente 60% por lo menos (usando los criterios de BLAST), compartiendo más preferiblemente una homología de 70%
o mayor (usando los criterios de BLAST).
Un polinucleótido de 36P6D5 puede comprender un polinucleótido que posee la secuencia de nucleótidos de 36P6D5 humana indicada en la FIG. 1 (SEQ ID NO:1) en la que T puede ser también U, un polinucleótido que codifica la totalidad o parte de la proteína 36P6D5, una secuencia complementaria de la anterior, o un fragmento de polinucleótido de cualquiera de lo anterior. Otra realización comprende un polinucleótido que posee la secuencia indicada en la FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) desde el resto del nucleótido número 59 hasta el resto del nucleótido número 763 ó 766, en la que T puede ser también U. Otra realización comprende un polinucleótido que pose la secuencia indicada en la FIG. 1(/SEQ ID NO: 1), desde el resto del nucleótido número 131 hasta el resto del nucleótido 763 ó 766, en la que T puede ser también U. Otra realización comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de 36P6D5 cuya secuencia está codificada por el cDNA contenido en el plásmido depositado el 9 de Abril de 1999 en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, EE.UU. (ATCC) como No. de Registro 207197. Otra realización comprende un polinucleótido que es capaz de hibridación en condiciones rigurosas de hibridación con el cDNA de 36P6D5 humano indicado en la FIG. 1 (SEQ ID NO: 1).
Las realizaciones típicas de la invención descrita en esta memoria incluyen polinucleótidos de 36P6D5 que contienen partes específicas de la secuencia de mRNA de 36P6D5 ( y aquellas que son complementarias de tales secuencias) tales como aquellas que codifican la proteína y sus fragmentos. Por ejemplo, las realizaciones representativas de la invención aquí descrita incluyen polinucleótidos que codifican aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 10 de la proteína 36P6D5 indicada en SEQ ID NO: 2, polinucleótidos que codifican aproximadamente el aminoácido 20 hasta aproximadamente el aminoácido 30 de la proteína 36P6D5, indicado en SEQ ID NO: 2, polinucleótidos que codifican aproximadamente el aminoácido 30 hasta aproximadamente el aminoácido 40 de la proteína 36P6D5, indicado en SEQ ID NO. 2, polinucleótidos que codifican aproximadamente el aminoácido 40 hasta aproximadamente el aminoácido 50 de la proteína 36P6D5, indicado en SEQ ID NO: 2, polinucleótidos que codifican aproximadamente el aminoácido 50 hasta aproximadamente el aminoácido 60 de la proteína 36P6D5, indicado en SEQ ID NO: 2, polinucleótidos que codifican aproximadamente el aminoácido 60 hasta aproximadamente el aminoácido 70 de la proteína 36P6D5 indicada en SEQ ID NO: 2, polinucleótidos que codifican aproximadamente el aminoácido 70 hasta aproximadamente el aminoácido 80 de la proteína 36P6D5, indicado en SEQ ID NO: 2, polinucleótidos que codifican aproximadamente el aminoácido 80 hasta aproximadamente el aminoácido 90 de la proteína 36P6D5, indicado en SEQ ID NO: 2 y polinucleótidos que codifican aproximadamente el aminoácido 90 hasta aproximadamente el aminoácido 100 de la proteína 36P6D5, indicado en SEQ ID NO: 2, etc. .Siguiendo el esquema, los polinucleótidos que codifican partes de la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 100-235 de la proteína 36P6D5 son realizaciones típicas de la invención. Polinucleótidos que codifican partes mayores de la proteína 36P6D5 también con contemplados. Por ejemplo, polinucleótidos que codifican desde aproximadamente el aminoácido 1 (ó 20, ó 30, ó 40, etc.) hasta aproximadamente el aminoácido 20 (ó 30, ó 40, ó 50, etc.) de la proteína 36P6D5, indicado en SEQ ID NO: 2, pueden ser generados mediante una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica.
Realizaciones ilustrativas adicionales de polinucleótidos de 36P6D5 incluyen realizaciones que consisten en un polinucleótido que posee la secuencia indicada en la FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) desde aproximadamente el resto del nucleótido número 1 hasta aproximadamente el resto del nucleótido número 250 inclusive, desde aproximadamente el resto del nucleótido 250 hasta aproximadamente el resto del nucleótido número 500, inclusive, y desde aproximadamente el resto del nucleótido número 500 hasta aproximadamente el resto del nucleótido número 750, inclusive, y desde aproximadamente el resto del nucleótido número 750 hasta aproximadamente el resto del nucleótido número 913, inclusive. Estos fragmentos de polinucleótidos pueden incluir cualquier parte de la secuencia de 36P6D5 tal como está indicado en la FIG.1 (SEQ ID NO: 1), por ejemplo, un polinucleótido que tiene el ORF de 235 aminoácidos dentro de la secuencia de polinucleótidos indicada en la FIG. 1 (SEQ ID NO: 1), por ejemplo, desde aproximadamente el resto del nucleótido número 59 hasta aproximadamente el resto del nucleótido número 763, inclusive.
Las realizaciones ilustrativas adicionales de la invención descrita en esta memoria incluyen fragmentos de polinucleótidos de 36P6D5 que codifican uno
o más de los motivos biológicos contenidos dentro de la secuencia de la proteína 36P6D5. Los fragmentos de polinucleótidos típicos, de la invención, incluyen aquellos que codifican uno o más de los sitios de N-glicosilación de 36P6D5, sitios fosforilación de la caseína quinasa II, los sitios de fosforilación de la proteína quinasa c, la signatura de permeasas de aminoácidos o sitios de n-miristoilación según se describe con mayor detalle en el texto que discute la proteína y polipéptidos de 36P6D5, más adelante.
Los polinucleótidos de los párrafos anteriores poseen varios usos específicos diferentes. Por ejemplo, debido a que el gen 36P6D5 mapea hacia el cromosoma 21q22.2-22.3, los polinucleótidos que codifican regiones diferentes de la proteína 36P6D5 puede ser utilizados para caracterizar anomalías citogenéticas existentes en el cromosoma 21, bandas q22.2-22.3 que han sido identificadas como asociadas con varios cánceres. En particular, una diversidad de anomalías cromosómicas en 21q22.2-22.3 han sido identificadas como anomalías citogenéticas frecuentes en diversos cánceres diferentes (véase, por ejemplo, la publicación de Babu et al., Cancer Genet. Cytogenet, 1989, Mar; 38(1):127-9 y la de Ho et al., en Blood, 1996, Jun. 15; 87(12)5218-24). Por consiguiente, los polinucleótidos que codifican regiones específicas de la proteína 36P6D5 proporcionan nuevas herramientas que pueden ser usadas para delinear con mayor precisión que la posible anteriormente, la naturaleza específica de las anomalías citogenéticas de esta región del cromosoma 21 que pueden contribuir al fenotipo de malignidad. En este contexto, estos polinucleótidos satisfacen la necesidad de la técnica de expansionar la sensibilidad de exploración cromosómica con objeto de identificar anomalías cromosómicas más sutiles y menos comunes (véase, por ejemplo, la publicación de Evans et al., 1994, Am. J. Obstet. Gynecol. 171(4):1055-1057).
Alternativamente, ya que se ha puesto de manifiesto que la proteína 36P6D5 es expresada altamente en cánceres de próstata (véase, por ejemplo la FIG. 4), estos polinucleótidos pueden ser usados en métodos de exploración del estado de productos génicos 36P6D5 en tejidos cancerosos frente a tejidos normales. Típicamente, los polinucleótidos que codifican regiones específicas de la proteína 36P6D5 pueden ser utilizados para determinar la presencia de perturbaciones (tales como deleciones, inserciones, mutaciones puntuales, etc.) existentes en regiones específicas (tales como regiones que contienen las secuencias de unión de RNA) de los productos génicos 36P6D5. Como ensayos ejemplares se incluyen ambos ensayos RT-PCR así como análisis de polimorfismos de conformación de una sola cadena (SSCP) (véase, por ejemplo, la referencia de Marrogi et al., 1999, J. Cutan. Pathol. 26(8):369-376) ambas de las cuales utilizan polinucleótidos que codifican regiones específicas de una proteína para examinar esas regiones del interior de la proteína.
Otras realizaciones de la invención contempladas específicamente, descritas en esta memoria, son DNA genómico, cDNAs, ribozimas y moléculas antisentido, así como moléculas de ácidos nucleicos basadas en una cadena fundamental alternativa o que incluyen bases alternativas, tanto si han sido derivadas de fuentes naturales como si han sido sintetizadas. Por ejemplo, las moléculas antisentido pueden ser RNAs u otras moléculas con inclusión de ácidos nucleicos peptídicos (PNAs) o moléculas de ácidos no nucleicos tales como derivados de fosforotioato, que unen específicamente DNA o RNA de un modo dependiente de los pares de bases. Los técnicos experimentados pueden obtener fácilmente estas clases de moléculas de ácidos nucleicos que usan los polinucleótidos y secuencias de polinucleótidos de 36P6D5 que aquí se describen
La tecnología antisentido impone la administración de oligonucleótidos exógenos que se unen a un polinucleótido diana situado dentro de las células. El término “antisentido” se refiere al hecho de que tales oligonucleótidos son complementarios de sus dianas intracelulares, por ejemplo, 36P6D5. Véase, por ejemplo, la publicación de Jack Cohen, 1988, OLIGODEOXYNUCLEOTIDES, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press and Synthesis 1:1-5 (1988). Los oligonucleótidos antisentido de 36P6D5 de la presente invención, incluyen derivados tales como S-oligonucleótidos (derivados de fosforotioato o S-oligos, véase, por ejemplo, la publicación de Jack Cohen citada) que manifiestan una acción inhibidora intensificada del crecimiento de células cancerosas. Los S-oligos (fosforotioatos de nucleósidos) son análogos isoelectrónicos de un oligonucleótido (O-oligo) en los que un átomo de oxígeno del grupo fosfato que no forma puente, ha sido reemplazado por un átomo de azufre. Los S-oligos de la presente invención pueden ser preparados por tratamiento de los O-oligos correspondientes con 3H-1,2benzoditiol-3-ona-1,1-dióxido, que es un reactivo de transferencia de azufre. Véase la publicación de Iyer, R.P. et al., 1990, J. Org. Chem. 55:4693-4698; y la de Iyer et al., 1990, J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254, cuyas descripciones son incorporadas totalmente, por referencia, en esta memoria. Los oligonucleótidos antisentido de 36P6D5 adicionales, de la presente invención, incluyen oligonucleótidos antisentido morfolinos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la publicación de Partridge et al., 1996, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 6: 169-175).
Los oligonucleótidos antisentido de 36P6D5 de la presente invención, pueden ser, típicamente, RNA o DNA complementario de y que se hibrida de modo estable con los primeros 100 codones del extremo N-terminal o los últimos 100 codones del extremo C-terminal de la secuencia genómica de 36P6D5 o el mRNA correspondiente. Si bien no se requiere una complementariedad absoluta, se prefieren grados elevados de complementariedad. El uso un oligonucleótido complementario de esta región permite la hibridación selectiva a mRNA de 36P6D5 y no a mRNA que especifica otras subunidades reguladoras de proteína quinasa. Preferiblemente, los oligonucleótidos antisentido de 36P6D5, de la presente invención, son un fragmento 15-a 30-mero de la molécula de DNA antisentido que tiene una secuencia que se hibrida con el mRNA de 36P6D5. Opcionalmente, el oligonucleótido antisentido de 36P6D5 es un oligonucleótido 30-mero que es complementario de una región de los primeros 10 codones del extremo N-terminal y los últimos 10 codones del extremo C-terminal de 36P6D5. Alternativamente, las moléculas antisentido son modificadas empleando ribozimas en la inhibición de la expresión de 36P6D5 (L. A. Couture and D.T. Stinchcomb, 1996, Trends Genet. 12:510-515).
Otras realizaciones específicas de este aspecto de la invención incluyen cebadores y pares de cebadores que permiten la amplificación específica de los polinucleótidos de la invención o de cualesquiera partes específicas de los mismos, y sondas que selectiva o específicamente se hibridan con moléculas de ácidos nucleicos de la invención o a cualquiera de sus partes. Las sondas pueden ser marcadas con un marcador detectable, tal como, por ejemplo, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimiluminiscente, un agente de formación de quelatos metálico o una enzima. Tales sondas y cebadores pueden usarse para detectar la presencia de un polinucleótido de 36P6D5 en una muestra y como medios para detectar una célula que expresa una proteína 36P6D5.
Ejemplos de tales sondas incluyen polinucleótidos que comprenden la totalidad o parte de las secuencias de cDNA de 36P6D5 humano mostradas en SEQ ID NO: 1. Ejemplos de pares de cebadores capaces de amplificar específicamente mRNAs de 36P6D5 están descritos también en los Ejemplos que siguen. Como podrá comprenderse por los técnicos experimentados, pueden prepararse un gran número de cebadores y sondas diferentes, basándose en las secuencias que se proporcionan en esta memoria, y pueden usarse eficazmente para amplificar y (o detectar un mRNA de 36P6D5.
Tal como aquí se emplea se dice que un polinucleótido está “aislado” cuando está separado sustancialmente de polinucleótidos contaminantes que se corresponden o son complementarios de genes distintos del gen 36P6D5 o que codifican polipéptidos diferentes del producto génico 36P6D5 o de sus fragmentos. Un técnico experimentado puede emplear fácilmente procedimientos operatorios de aislamiento de ácidos nucleicos para obtener un polinucleótido de 36P6D5 aislado.
Los polinucleótidos de 36P6D5, de la invención, son útiles para una diversidad de fines, que incluyen, aun cuando no se limita a ellos, su uso como sondas y cebadores para la amplificación y/o detección del gen o genes 36P6D5, mRNAs o sus fragmentos, como reactivos para la diagnosis y/o la prognosis del cáncer de próstata y otros cánceres; como secuencias codificantes capaces de dirigir la expresión de polipéptidos de 36P6D5; como herramientas para modular o inhibir la expresión del gen o genes 36P6D5 y/o la traducción del transcrito o transcritos de 36P6D5; y como agentes terapéuticos.
AISLAMIENTO DE MOLÉCULAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN 36P6D5
Las secuencias de cDNA de 36P6D5 aquí descritas permiten el aislamiento de otros polinucleótidos que codifican el producto o productos génicos 36P6D5, así como el aislamiento de polinucleótidos que codifican homólogos de productos génicos 36P6D5, alternativamente isoformas de corte y empalme, variantes alélicas y formas mutantes del producto génico 36P6D5. Diversos métodos de clonación molecular que pueden ser empleados para aislar cDNAs de longitud total que codifican un gen 36P6D5, son bien conocidos (Véase, por ejemplo, la publicación de Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Press, Nueva York, Ausubel et al., compiladores, 1995, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons). Por ejemplo, metodologías de clonación del fago lambda pueden emplearse convenientemente, usando sistemas de clonación de que se dispone en el comercio (por ejemplo, Lambda ZAP Express, Strategene)-Los clones de fagos que contienen cDNAs del gen 36P6D5 pueden ser identificados utilizando como sondas un cDNA de 36P6D5 marcado. o uno de sus fragmentos. Por ejemplo, en una realización el cDNA de 36P6D5 (SEQ ID NO: 1) o una de sus partes, puede sintetizarse y usarse como sonda para recuperar cDNAs de solapamiento y de longitud total correspondientes a un gen 36P6D5. El propio gen 36P6D5 puede ser aislado por exploración de colecciones genómicas de DNA, colecciones de cromosomas artificiales bacterianos (BACs), colecciones de cromosomas artificiales de levaduras (YACs) y colecciones semejantes, con sondas o cebadores de DNA de 36P6D5.
MOLÉCULAS DE DNA RECOMBINANTE Y SISTEMAS DE VECTORHOSPEDADOR
La invención proporciona también moléculas recombinantes de DNA o RNA que contienen un polinucleótido de 36P6D5, que incluye, pero no se limita a ellos, fagos, plásmidos, fagémidos, cósmidos, YACs y BACs, así como diversos vectores virales y no virales bien conocidos en la técnica, y células transformadas o transfectadas con tales moléculas recombinantes de DNA o RNA. Tal como se utiliza en esta memoria, una molécula de DNA o RNA recombinante es una moléculas de DNA o RNA que ha sido sometida a manipulación molecular, in vitro. Métodos para generar tales moléculas son bien conocidos (véase, por ejemplo, la referencia anterior de Sambrook et al., 1989).
La invención proporciona además un sistema de vector-hospedador que comprende una molécula de DNA recombinante que contiene un polinucleótido de 36P6D5 dentro de una célula huésped procariótica o eucariótica adecuada. Los ejemplos de células huésped eucarióticas adecuadas incluyen una célula de levadura, una célula vegetal, o una célula animal, tal como una célula de mamífero o una célula de insecto (por ejemplo, una célula capaz de infección por baculovirus tal como una célula Sf9 o HighFive). Ejemplos de células de mamífero adecuadas incluyen diversas líneas de células de cáncer de próstata tales como PrEC, LNCaP y TsuPr1, otras líneas de células de cáncer de próstata transfectables o transducibles, así como diversas células de mamífero utilizadas rutinariamente para la expresión de proteínas recombinantes (por ejemplo, células COS, CHO, 293 y 293T). Más particularmente, puede emplearse un polinucleótido que comprende la secuencia codificante de 36P6D5 para generar proteínas 36P6D5 o fragmentos de las mismas, usando un número de sistemas vector-hospedador empleados rutinariamente y muy conocidos en la técnica.
Una amplia variedad de sistemas vector-hospedador, adecuados para la expresión de proteínas 36P6D5 o sus fragmentos, se encuentran disponibles (véase, por ejemplo, la referencia de Sambrook et al, 1989, supra; Current Protocols in Molecular Biology, 1995, supra). Los vectores preferidos para expresión en mamíferos incluyen, aun cuando no se limita a ellos, el pcDNA 3.1 myc-His-tag (Invitrogen) y el vector retroviral pSR�tkneo (Muller et al., 1991, MCB 11:1785). Usando estos vectores de expresión, la proteína 36P6D5 puede ser expresada, preferiblemente, en diversos cánceres de próstata y diversas líneas celulares no prostáticas, que incluyen, por ejemplo, las células 293, 293T, rat-1, NIH 3T3 y TsuPr1. Los sistemas vector-hospedador de la invención son útiles para producir una proteína 36P6D5 o sus fragmentos. Tales sistemas vector-hospedador pueden ser empleados para estudiar las propiedades funcionales de 36P6D5 y las mutaciones de 36P6D5.
La proteína 36P6D5 humana, recombinante, puede ser producida por células de mamífero transfectadas con una construcción que codifica 36P6D5. En una realización ilustrativa descrita en los Ejemplos, células 293T pueden ser transfectadas con un plásmido de expresión que codifica 36P6D5, la proteína 36P6D5 es expresada en las células 293T y la proteína 36P6D5 recombinante puede ser aislada usando métodos estándar de purificación (por ejemplo, purificación por afinidad usando anticuerpos anti-36P6D5). En otra realización, descrita también en los Ejemplos en esta memoria, la secuencia codificante de 36P6D5 es subclonada en el vector retroviral pSR�MSVtkneo y usada para infectar varias líneas celulares de mamífero, tales como NIH 3T3, TsuPr1, 293 y rat-1, con objeto de establecer líneas celulares que expresan 36P6D5. Otros diversos sistemas de expresión bien conocidos en la técnica, pueden emplearse asimismo. Construcciones de expresión que codifican un péptido conductor unido en el marco de lectura a la secuencia codificante de 36P6D5 pueden ser usados para generar una forma secretada de proteína 36P6D5 recombinante.
Las proteínas codificadas por los genes 36P6D5 o por sus fragmentos, pueden tener una variedad de usos que incluyen, aun cuando no se limita a ellos, generar anticuerpos y en métodos de identificación de ligandos y otros agentes y constituyentes celulares que se unen al producto génico 36P6D5. Los anticuerpos producidos contra una proteína 36P6D5 (al igual que polinucleótidos de 36P6D5) o sus fragmentos, pueden ser útiles en ensayos de diagnóstico y prognósticos, y en metodologías de formación de imágenes en el tratamiento de cánceres humanos caracterizados por expresión de la proteína 36P6D5, que incluyen pero no se limita, a cánceres del riñón, colon y próstata, cerebro, vejiga, páncreas, ovarios, pulmón y mama (véanse, por ejemplo, las Figs. 4, 6 y 7). Tales anticuerpos pueden ser expresados intracelularmente y usados en métodos de tratamiento de pacientes con tales cánceres. Diversos ensayos inmunológicos útiles para detectar proteínas 36P6D5 son contemplados, que incluyen, aun cuando no se limita a ellos, análisis FACS, diversos tipos de radioinmunoensayos, ensayos inmunoabsorbentes con enzimas ligadas (ELISA), ensayos inmunofluorescentes con enzimas ligadas (ELIFA), métodos inmunocitoquímicos, y semejantes. Tales anticuerpos pueden ser marcados y usados como reactivos inmunológicos de formación de imágenes capaces de detectar células que expresan 36P6D5 (por ejemplo, métodos de formación de imágenes radiográficas por centelleo). Las proteínas 36P6D5 pueden ser también particularmente útiles para generar vacunas de cáncer, como se describe adicionalmente más adelante.
POLIPÉPTIDOS DE 36P6D5
Otro aspecto de la presente invención proporciona proteínas 36P6D5 y sus fragmentos polipeptídicos. Las proteínas 36P6D5 de la invención incluyen aquellas identificadas específicamente en esta memoria, así como variantes alélicas, variantes y homólogos de sustitución conservativos que pueden ser aislados/generados y caracterizados sin experimentación indebida siguiendo los métodos esbozados más adelante. También se incluyen proteínas de fusión que combinan partes de diferentes proteínas 36P6D5 o sus fragmentos, así como proteínas de fusión de una proteína 36P6D5 y un polipéptido heterólogo. A tales proteínas 36P6D5 se hace referencia, colectivamente, como proteínas 36P6D5, las proteínas de la invención, o 36P6D5. Tal como se usa aquí, la expresión “polipéptido de 36P6D5” se refiere a un fragmento de un polipéptido
o una proteína 36P6D5 de al menos 6 aminoácidos, preferiblemente al menos 15 aminoácidos
Las realizaciones específicas de las proteínas 36P6D5 comprenden un polipéptido que posee la secuencia de aminoácidos de 36P6D5 humana indicada en SEQ ID NO: 2. Alternativamente, las realizaciones de proteínas 36P6D5 comprenden polipéptidos variantes que tienen alteraciones en la secuencia de aminoácidos de 36P6D5 humana, como se indica en SEQ ID NO:
2.
En general, las variantes alélicas naturales de 36P6D5 humana comparten un alto grado de identidad estructural y homología (por ejemplo, una identidad de 90% o más). Típicamente, las variantes alélicas de las proteínas 36P6D5 contienen sustituciones conservativas de aminoácidos dentro de las secuencias de 36P6D5 aquí descritas o pueden contener una sustitución de un aminoácido desde una posición correspondiente en un homólogo de 36P6D5. Una clase de variantes alélicas de 36P6D5 pueden ser proteínas que comparten un alto grado de homología con al menos una región pequeña de una secuencia de aminoácidos particular de 36P6D5, pero pueden contener, además, una salida radical desde la secuencia, tal como una sustitución, truncación, inserción o desplazamiento del marco de lectura, no conservativos..
Sustituciones conservativas de aminoácidos pueden realizarse frecuentemente en una proteína sin alterar ni la conformación ni la función de la proteína. Tales cambios incluyen sustituir con isoleucina (I), valina (V) y leucina
(L)
cualquier otro de estos aminoácidos hidrófobos; ácido glutámico (E) por ácido aspártico (D) y viceversa; asparagina (N) por glutamina (Q) y viceversa; y treonina (T) por serina (S) y viceversa. Otras sustituciones pueden ser consideradas también conservativas, dependiendo del entorno del aminoácido articular y de su papel en la estructura tridimensional de la proteína. Por ejemplo, la glicocola (G) y la alanina (A) frecuentemente pueden ser intercambiadas, como lo pueden ser la alanina (A) y la valina (V). La metionina
(M)
que es relativamente hidrófoba, puede ser intercambiada frecuentemente con leucina e isoleucina, y a veces con valina. La lisina (K) y la arginina (R) se intercambian con frecuencia en posiciones en las que la característica importante del resto de aminoácido es su carga y los diferentes pKs de estos dos restos de aminoácidos no son importantes. Todavía otros cambios pueden ser considerados “conservativos” en entornos particulares.
Las realizaciones de la invención aquí descritas incluyen una amplia diversidad de variantes de proteínas 36P6D5 aceptadas en la técnica, tales como polipéptidos que poseen inserciones, deleciones y sustituciones de aminoácidos. Pueden obtenerse variantes de 36P6D5 usando métodos conocidos en la técnica tales como mutagénesis dirigida al sitio, exploración de alanina y mutagénesis por PCR. Mutagénesis dirigida al sitio (Carter et al., 1986, Nucl. Acids. Res. 13:4331; Zoller et al., 1987, Nucl. Acids. Res. 10:6487; mutagénesis de casetes (Wells et al., 1985, Gene 34:315), mutagénesis de selección de restricción (Wells et al., 1986, Philos. Trans. R. Soc. London Ser. A, 317:415) u otras técnicas conocidas pueden llevarse a cabo sobre el DNA clonado para producir el DNA variante de 36P6D5. La exploración del análisis de aminoácidos puede emplearse también para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre la selección de aminoácidos preferidos están aminoácidos neutros relativamente pequeños. Tales aminoácidos incluyen alanina, glicocola, serina y cisteína. La alanina es típicamente, un aminoácido de selección preferido entre este grupo debido a que elimina la cadena lateral situada más allá del carbono en posición beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante. La alanina es preferida también, típicamente, debido a que es el aminoácido más común. Además, se encuentra frecuentemente en posiciones tanto ocultas como expuestas (Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman and Co., N.Y.); Chothia, 1976, J. Mol. Biol. 150:1). Si la sustitución de alanina no produce cantidades adecuadas de variante, puede usarse un aminoácido isostérico.
Según se ha definido en esta memoria, las variantes de 36P6D5 poseen el atributo distintivo de tener al menos un epítopo común con una proteína 36P6D5 que posee la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, de modo que un anticuerpo que se una específicamente a una variante de 36P6D5 se une también específicamente a la proteína 36P6D5 que posee la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Un polipéptido cesa en ser una variante de la proteína indicada en SEQ ID NO: 2 cuando no contiene un epítopo capaz de ser reconocidos por un anticuerpo que se una específicamente a una proteína 36P6D5. Los expertos en la técnica han de entender que los anticuerpos que reconocen proteínas que se unen a epítopos de tamaño variable, y un agrupamiento del orden de seis aminoácidos aproximadamente, contiguos o no, se considera como el número típico de aminoácidos existentes en un epítopo mínimo. Véase, por ejemplo, la publicación de Hebbes et al., Mol. Immunol. (1989) 26(9):865-73; Schwartz et al., J. Immunol. (1985), 135(4):2598-608. Como hay, aproximadamente, 20 aminoácidos que pueden ser incluidos en una posición dada dentro del epítopo mínimo de 6 aminoácidos, una aproximación de los accidentes de un epítopo tal que ocurren por azar, son, aproximadamente, 206 o, aproximadamente, 1 en 64 millones. Otra clase específica de variantes de proteínas 36P6D5 comparte una identidad de 90% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Otra clase específica de variantes de proteínas 36P6D5 comprende uno o más de los motivos biológicos de 36P6D5 que se describen más adelante.
Tal como se ha discutido anteriormente, las realizaciones de la invención reivindicada incluyen polipéptidos que contienen menos que la secuencia de 235 aminoácidos de la proteína 36P6D5 que se indica en SEQ ID NO: 2 (y los polinucleótidos que codifican tales polipéptidos). Por ejemplo, las realizaciones representativas de la invención que aquí se describe incluyen polipéptidos que consisten en , aproximadamente, el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 10 de la proteína 36P6D5 que se indica en SEQ ID NO: 2, polipéptidos que consisten en, aproximadamente, el aminoácido 20 hasta aproximadamente el aminoácido 30 de la proteína 36P6D5 que se indica en SEQ ID NO: 2, polipéptidos que consisten en, aproximadamente, el aminoácido 30 hasta aproximadamente el aminoácido 40 de la proteína 36P6D5 que se indica en SEQ ID NO: 2, polipéptidos que consisten en, aproximadamente el aminoácido 40 hasta aproximadamente el aminoácido 50 de la proteína 36P6D5 que se indica en SEQ ID NO: 2, polipéptidos que consisten en, aproximadamente, el aminoácido 50 hasta aproximadamente el aminoácido 60 de la proteína que se indica en SEQ ID NO: 2 , polipéptidos que consisten en, aproximadamente, el aminoácido 60 hasta aproximadamente el aminoácido 70 de la proteína 36P6D5 que se indica en SEQ ID NO: 2, polipéptidos que consisten en, aproximadamente, el aminoácido 70 hasta aproximadamente el aminoácido 80 de la proteína 36P6D5 que se indica en SEQ ID NO: 2, polipéptidos que consisten en, aproximadamente, el aminoácido 80 hasta aproximadamente el aminoácido 90 de la proteína 36P6D5 que se indica en SEQ ID NO: 2, y polipéptidos que consisten en, aproximadamente, el aminoácido 90 hasta aproximadamente el aminoácido 100 de la proteína 36P6D5 que se indica en SEQ ID NO: 2, etc. Siguiendo este esquema, son realizaciones típicas de la invención los polipéptidos que consisten en partes de la secuencia de los aminoácidos 100-235 de la proteína 36P6D5. También son contemplados polipéptidos que consisten en partes más largas de la proteína 36P6D5. Por ejemplo, polipéptidos que consisten, aproximadamente, en el aminoácido 1 (ó 20 ó 30 ó 40, etc.) hasta aproximadamente el aminoácido 20 (ó 30, ó 40, ó 50. etc.) de la proteína 36P6D5 que se indica en SEQ ID NO: 2, pueden ser generados mediante una diversidad de procedimientos bien conocidos en la técnica.
Realizaciones ilustrativas adicionales de la invención que aquí se describe, incluyen polipéptidos de 36P6D5 que consisten en los restos de aminoácidos de uno o más de los motivos biológicos contenidos dentro de la secuencia de polipéptidos de 36P6D5 como se indica en SEQ ID NO: 2. En una realización, los polipéptidos típicos de la invención pueden contener uno o más de los sitios de N-glicosilación de 36P6D5 tales como el NVTA en los restos 120-123 y/o el NHSD en los restos 208-211 (SEQ ID NO: 2). En otra realización, los polipéptidos típicos de la invención pueden contener uno o más de los sitios de fosforilación de proteína quinasa C de 36P6D5, tales como el SIR en los restos 43-45 y/o el STR en los restos 160-162 (SEQ ID NO: 2). En otra realización, los polipéptidos típicos de la invención pueden contener un o más de los sitios de fosforilación de caseína quinasa II de 36P6D5 tales como el SIGE en los restos 46-49 y/o TYDD en los restos 155-158 (SEQ ID NO: 2). En otra realización, los polipéptidos típicos de la invención pueden contener uno o más de los sitios de N-miristoilación tales como el GGGRSK en los restos 81-86, el GINIAI en los restos 108-113 y/o el GNVTAT en los restos 119-124 (SEQ ID NO: 2). En otra realización, los polipéptidos típicos de la invención pueden contener la signatura de permeasa de aminoácidos AGGLLKVVFVVFASLCAWYSGYLLAELIPDAP en los restos 5-36 (SEQ ID NO: 2). En otra realización los polipéptidos típicos de la invención pueden contener la secuencia señal indicada en la Figura 1. Todavía, en otra realización, los polipéptidos típicos de la invención pueden contener uno o más de los epítopos inmunógenos identificados mediante un procedimiento descrito en esta memoria, tal como los indicados en la Tabla 1. Realizaciones afines de esta invención incluyen polipéptidos que contienen combinaciones de motivos diferentes anteriormente descritos siendo realizaciones preferibles aquellas que no contienen inserciones, deleciones o sustituciones o bien dentro de los motivos o bien en las secuencias de estos polipéptidos que intervienen. Además, las realizaciones que incluyen varios restos de aminoácidos o bien del extremo N-terminal y/o del extremo C-terminal sobre uno de los dos lados de estos motivos, pueden ser deseables (para, por ejemplo, incluir una parte mayor de la estructura del polipéptido en la que está situado el motivo). Típicamente, el número de restos de aminoácidos del extremo N-terminal y/o del extremo C-terminal sobre uno de los dos lados de un motivo, está entre aproximadamente 5 y aproximadamente 50 restos de aminoácidos.
Como ejemplos ilustrativos de tales realizaciones se incluye un polipéptido que tiene uno o más motivos seleccionados entre el grupo que consiste en SIR y/o SIGE y/o NHSD (SEQ ID NO: 2). Alternativamente, también son contemplados los polipéptidos que poseen otras combinaciones de los motivos biológicos descritos en esta memoria, tales como un polipéptido que posee el motivo SIR y uno cualquiera de los otros motivos biológicos tales como el SIGE, o un polipéptido que tiene TYDD y uno cualquiera de los otros motivos biológicos tales como GGGRSK, etc.. (SEQ ID NO: 2).
Los polipéptidos que consisten en uno o más de los motivos de 36P6D5 antes descritos, son útiles para esclarecer las características específicas de un fenotipo maligno a la vista de la observación de que los motivos de 36P6D5 antes discutidos están asociados con una irregularidad del crecimiento y debido a que la proteína 36P6D5 está sobreexpresada en cánceres (FIGS. 4, 6 y 7). La caseína quinasa II y la proteína quinasa C, por ejemplo, son enzimas que se sabe que están asociadas con el desarrollo del fenotipo maligno (véase, por ejemplo, la publicación de Chen et al., 1998, Lab. Invest., 78(2):165-174; de Gaiddon et al., 1994, Endocrinology 136(10):4331-4338; de Hall et al., 1996, Nucleic Acids Research, 24(6):1119-1126; de Peterziel et al., 1999, Oncogene 18(46):6322-6329; y de O’Brian, 1998, Oncol. Reo. 5(2):305-309). Además, tanto la glicosilación como la miristoilación son modificaciones proteínicas asociadas asimismo con el cáncer y con la progresión del cáncer (véase, por ejemplo, Dennis et al., 1999, Biochem. Biophys. Acta 1473(1):21-34; Raju et al., 1997, Exp. Cell Res. 235(1):145-154).
Los polipéptidos de los párrafos anteriores poseen cierto número de usos diferentes, específicos. Como se ha indicado que la proteína 36P6D5 es expresada en una diversidad de cánceres que incluyen líneas de células cancerosas y/o muestras de pacientes aquejados de cáncer de riñón, próstata, vejiga, ovarios, mama, páncreas, colon y pulmón (véanse, por ejemplo, las FIGS. 4, 6 y 7), estos polipéptidos pueden ser usados en métodos de determinación del estado de productos génicos 36P6D5 en tejidos normales frente a tejidos cancerosos, y el esclarecimiento del fenotipo maligno. Típicamente, pueden utilizarse polipéptidos que incluyen regiones específicas de la proteína 36P6D5 para apreciar la presencia de perturbaciones (tales como deleciones, inserciones, mutaciones puntuales, etc.) existentes en regiones específicas de los productos génicos 36P6D5 (tales como regiones que contienen los motivos de unión de RNA). Los ensayos que pueden servir de ejemplo utilizan anticuerpos que toman como objetivo un polipéptido de 36P6D5 que contienen los restos de aminoácidos de uno o más de los motivos biológicos contenidos dentro de la secuencia de polipéptidos de 36P6D5 con objeto de evaluar las características de esta región en tejidos normales frente a tejidos cancerosos. Alternativamente, los polipéptidos de 36P6D5 que contienen los restos de aminoácidos de uno o más de los motivos biológicos contenidos dentro de la secuencia de polipéptidos de 36P6D5, pueden ser usados para explorar factores que interaccionan con tal región de 36P6D5.
Como se ha discutido anteriormente, la redundancia del código genético permite variación de las secuencias génicas de 36P6D5. En particular, los expertos en la técnica reconocerán preferencias específicas de codones por una especie específica de hospedador y podrán adaptar la secuencia descrita según se prefiera, para el hospedador deseado. Por ejemplo, las secuencias de codones preferidas poseen, típicamente, codones raros (es decir, codones que tienen una frecuencia de uso menor que, aproximadamente, el 20% de las secuencias conocidas del hospedador deseado) reemplazadas con codones de mayores frecuencias. Las preferencias de los codones para un organismo específico pueden calcularse, por ejemplo, utilizando tablas de usos de codones de que se dispone en Internet en la dirección siguiente: http//www.dna.affrc.go.jp/αnakamura/codon.html. A las secuencias de nucleótidos que han sido optimizadas para una especie particular de un hospedador reemplazando cualesquiera codones que tienen una frecuencia de utilización menor que, aproximadamente, 20%, se hace referencia en esta memoria como “secuencias optimizadas de codones”.
Se conocen modificaciones adicionales de las secuencias para intensificar la expresión de proteínas en un hospedador celular. Estas modificaciones incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales espurias de poliadenilación, señales de sitios de corte y empalme de exón/intrón, repeticiones tales como transposones, y/u otras de tales secuencias bien conocidas que pueden ser perjudiciales para la expresión génica. El contenido GC de la secuencia puede ser ajustado a niveles medios para un hospedador celular dado, calculado por referencia a genes conocidos expresados en la célula huésped. Cuando es posible, la secuencia puede ser modificada también para evitar estructuras de mRNA secundarias, en horquilla, predichas. Otras modificaciones útiles incluyen la adición de una secuencia de consenso de iniciación de la traducción en el comienzo del marco de lectura abierto, según ha sido descrito por Kozak en Mol. Cell Biol., 9:5073-5080, 1989. A las secuencias de nucleótidos que han sido optimizadas para su expresión en una especie de hospedador dado mediante eliminación de secuencias espurias de poliadenilación, eliminación de señales de corte y empalme de exón/intrón, eliminación de repeticiones tales como transposones y/o optimización del contenido de GC además de la optimización de codones, se hace referencia en esta memoria como una “secuencia de expresión intensificada”.
Las proteínas 36P6D5 pueden ser incorporadas de muchas formas, preferiblemente en forma aislada. Tal como se usa aquí, se dice que una proteína está “aislada” cuando se emplean métodos físicos, mecánicos o químicos para separar la proteína 36P6D5 desde los constituyentes celulares que están normalmente asociados con la proteína. Los técnicos experimentados pueden emplear fácilmente métodos estándar de purificación para obtener una proteína 36P6D5 aislada. Una molécula de una proteína 36P6D5 purificada estará sustancialmente desprovista de otras proteínas u otras moléculas que perjudican la unión de 36P6D5 a un anticuerpo u otro ligando. La naturaleza y el grado de aislamiento y de purificación dependerán del uso a que se destine. Las realizaciones de una proteína 36P6D5 incluyen una proteína 36P6D5 purificada y una proteína 36P6D5 soluble, funcional. En una forma, tales proteínas 36P6D5 solubles, funcionales, o sus fragmentos, retienen la aptitud de unión a anticuerpos u otros ligandos.
La invención proporciona, asimismo, polipéptidos de 36P6D5 que comprenden fragmentos biológicamente activos de la secuencia de aminoácidos de 36P6D5, tales como un polipéptido que corresponde a parte de la secuencia de aminoácidos de 36P6D5 tal como se indica en SEQ ID NO: 2. Tales polipéptidos de la invención manifiestan propiedades de la proteína 36P6D5, tales como la capacidad de atraer la generación de anticuerpos que se unen específicamente a un epítopo asociado con la proteína 36P6D5.
Los polipéptidos de 36P6D5 pueden ser generados utilizando tecnología estándar de síntesis de polipéptidos o usando métodos químicos de desdoblamiento bien conocidos en la técnica, basándose en las secuencias de aminoácidos de las proteínas 36P6D5 humanas descritas en esta memoria. Alternativamente, pueden usarse métodos recombinantes para generar moléculas de ácidos nucleicos que codifican un fragmento de polipéptido de una proteína 36P6D5. A este respecto, las moléculas de ácidos nucleicos que codifican 36P6D5, aquí descritas, proporcionan medios para generar fragmentos definidos de proteínas 36P6D5. Los polipéptidos de 36P6D5 son particularmente útiles para generar y caracterizar anticuerpos específicos de dominios (por ejemplo, anticuerpos que reconocen un epítopo extracelular o intracelular de una proteína 36P6D5), para identificar agentes o factores celulares que se unen a 36P6D5 o uno de sus dominios estructurales particulares, y en diversos contextos terapéuticos, que incluyen, aun cuando no se limita a ello, vacunas del cáncer.
Los polipéptidos de 36P6D5 que contienen estructuras particularmente interesantes, pueden ser predichos y/o identificados usando diversos métodos analíticos conocidas en la técnica, que incluyen, por ejemplo, los métodos de análisis de Chou-Fasman, Gamier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf, o sobre la base de inmunogenicidad. Los fragmentos que contienen tales estructuras son especialmente útiles para generar anticuerpos anti-36P6D5 específicos, subunitarios, o para identificar factores celulares que se unen a la proteína 36P6D5.
En una realización descrita en los ejemplos que siguen, la proteína 36P6D5 puede expresarse convenientemente en células (tales como células 293T) transfectadas con un vector de expresión de que se dispone en el comercio tal como un vector de expresión conducido por CMV, que codifica 36P6D5 con 6XHis en el extremo C-terminal y la marca MYC (pcDNA3.1/mycHIS, Invitrogen o Tag 5, GenHunter Corporation, Nashville TN). El vector Tag 5 proporciona una señal de secreción de IgGK que puede usarse para facilitar la producción de una proteína 36P6D5 secretada en células transfectadas. La proteína 36P6D5, con la marca HIS, secretada existente en los medios de cultivo puede ser purificada empleando una columna de níquel usando técnicas estándar.
Modificaciones de 36P6D5 tales como modificaciones covalentes están incluidas dentro del alcance de esta invención. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar restos de aminoácidos marcados de un polipéptido de 36P6D5, con un agente orgánico de derivatización, capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los restos de los extremos N-terminal o C-terminal de la 36P6D5. Otro tipo de modificación covalente del polipéptido de 36P6D5 incluida dentro del alcance de la invención, comprende alterar el esquema nativo de glicosilación del polipéptido. Se entiende para los fines de la invención, que “alterar el esquema nativo de glicosilación” significa mutar por deleción uno o más restos de carbohidratos encontrados en la secuencia de 36P6D5 nativa (o bien separando el sitio de glicosilación subyacente o por deleción de la glicosilación por medios químicos y/o enzimáticos), y/o la adición de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en la secuencia nativa de 36P6D5. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glicosilación de proteínas nativas, que llevan consigo un cambio en la naturaleza y proporciones de los diversos restos de carbohidratos presentes. Otro tipo de modificación covalente de 36P6D5 comprende ligar el polipéptido de 36P6D5 a uno de una diversidad de polímeros no proteínicos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquilenos, del modo establecido en las Patentes de EE.UU. Nos. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ó 4.179.337.
La proteína 36P6D5 de la presente invención puede ser modificada también de modo que forme una molécula quimérica que comprende 36P6D5 fusionada a otra secuencia heteróloga de un polipéptido o de aminoácidos. En una realización, una molécula quimérica tal comprende una fusión de 36P6D5 con una marca de polihistidina de un epítopo, que proporciona un epítopo al que puede unirse selectivamente níquel inmovilizado. La marca del epítopo está colocada, en general, en el extremo amino-terminal o carboxilo-terminal de 36P6D5. En una realización alternativa la molécula quimérica puede comprender una fusión de 36P6D5 con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (a lo que se alude también como una “inmunoadhesión”), tal fusión podría ser con la región Fc de una molécula de IgG. Las fusiones de Ig incluyen, preferiblemente, la sustitución de una forma soluble (dominio transmembranal delecionado, inactivado) de un polipéptido de 36P6D5 en lugar de al menos una región variable dentro de una molécula de Ig. En una realización particularmente preferida, la fusión de inmunoglobulina incluye las regiones de la rótula CH2 y CH3, o las regiones de la rótula CH1, CH2 y CH3 de una molécula de IgG1. Para la producción de fusiones de inmunoglobulinas véase también la Patente de EE.UU. No. 5.428.130 expedida el 27 de Junio de 1995.
ANTICUERPOS DE 36P6D5
El término “anticuerpo” se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales sencillos anti-36P6D5 (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas y de neutralización) y composiciones de anticuerpos anti-36P6D5 con especificidad poliepitópica. La expresión “anticuerpo monoclonal” (mAb) como se emplea aquí, alude a un anticuerpo obtenido partiendo de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos que comprenden la población individual son idénticos excepto la mutaciones naturales posibles que pueden encontrarse presentes en cantidades menores.
Otro aspecto de la invención proporciona anticuerpos que se unen a proteínas 36P6D5 y polipéptidos de éstas. Los anticuerpos más preferidos se unen específicamente a una proteína 36P6D5 y no se unen (o se unen débilmente) a proteínas y polipéptidos no 36P6D5. Los anticuerpos anti36P6D5 particularmente contemplados, incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales así como fragmentos que contienen el dominio de unión antigénica y/o una o más regiones determinantes complementarias de estos anticuerpos.
Tal como se usa en esta memoria, se define un fragmento de un anticuerpo como una parte al menos de la región variable de la molécula de inmunoglobulina que se fija a su diana, es decir la región de unión antigénica.
Los anticuerpos de 36P6D5 de la invención pueden ser particularmente útiles en ensayos de diagnóstico y prognósticos de cáncer de próstata, y en metodologías de formación de imágenes. Los anticuerpos expresados intracelularmente (es decir, anticuerpos de cadenas sencillas) pueden ser terapéuticamente útiles para tratar cánceres en los que está implicada la expresión de 36P6D5, tales como, por ejemplo, cánceres de próstata avanzados y metastásicos. Tales anticuerpos pueden ser útiles para el tratamiento, diagnosis y/o prognosis de otros cánceres hasta el punto de que la 36P6D5 se expresa o sobreexpresa también en otros tipos de cánceres tales como cánceres de próstata, de riñón, de vejiga, de ovarios, de mama, de páncreas, de colon y de pulmón.
Los anticuerpos de 36P6D5 pueden ser usados también terapéuticamente por ejemplo modulando o inhibiendo la actividad biológica de una proteína 36P6D5 o haciendo diana y destruyendo células cancerosas que expresan una proteína 36P6D5 o un compañero de unión de 36P6D5. Debido a que la proteína 36P6D5 es una proteína secretada, los anticuerpos pueden ser terapéuticamente útiles para bloquear la aptitud de 36P6D5 para unirse a su receptor o interaccionar con otras proteínas a través de lo cual ejerce su actividad biológica.
La invención proporciona también diversos ensayos inmunológicos para la unión, detección y cuantificación de 36P6D5 y proteínas y polipéptidos de 36P6D5 mutantes. Tales métodos y tales ensayos comprenden, generalmente, uno o más anticuerpos de 36P6D5 capaces de reconocer y unirse a una proteína 36P6D5 o una proteína 36P6D5 mutante, según sea apropiado, y pueden llevarse a cabo dentro de varios formatos de ensayos inmunológicos bien conocidos en la técnica, que incluyen, aun cuando no se limita a ellos, diversos tipos de radioinmunoensayos, ensayos inmunoabsorbentes con enzimas ligadas (ELISA), ensayos inmunofluorescentes con enzimas ligadas (ELIPA), y semejantes. Además, métodos inmunológicos de formación de imágenes capaces de detectar cáncer de próstata y otros cánceres que expresan 36P6D5, son proporcionados también por la invención, incluyendo, aun cuando no se limita a ellos, métodos gráficos de formación de imágenes por radio-centelleo usando anticuerpos de 36P6D5 marcados. Tales ensayos pueden ser clínicamente útiles para la detección, monitorización y prognosis de cánceres que expresan 36P6D5 tales como líneas celulares de cánceres de próstata, mama, páncreas, colon y ovarios.
Los anticuerpos de 36P6D5 pueden ser utilizados también en métodos de purificación de proteínas y polipéptidos de 36P6D5 y proteínas y polipéptidos de 36P6D5 mutantes, y para aislar homólogos de 36P6D5 y moléculas afines. Por ejemplo, en una realización, el método de purificación de una proteína 36P6D5 comprende incubar un anticuerpo de 36P6D5, que ha sido asociado a una matriz sólida, con un lisado u otra disolución que contiene 36P6D5 en condiciones que permiten al anticuerpo de 36P6D5 unirse a 36P6D5; lavar la matriz sólida para eliminar impurezas y eluir la 36P6D5 desde el anticuerpo asociado. Otros usos de los anticuerpos de 36P6D5 de la invención, incluyen generar anticuerpos anti-idiotípicos que imitan la proteína 36P6D5.
Diversos métodos de preparación de anticuerpos son conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos inmunizando un hospedador mamífero adecuado usando una proteína 36P6D5 o un péptido o un fragmento de 36P6D5, en forma aislada o inmunoconjugada (Hadow y Lane, compiladores, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Harlow, 1989, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY). Además, también pueden usarse proteínas de fusión de 36P6D5, tales como una proteína de fusión GST 36P6D5. En una realización particular una proteína de fusión GST que comprende la totalidad o la mayor parte de la secuencia de aminoácidos del marco de lectura abierto de SEQ ID NO: 2 puede ser producida y usada como inmunógeno para generar anticuerpos apropiados. En otra realización puede sintetizarse un péptido de 36P6D5 y emplearse como inmunógeno.
Además técnicas de inmunización de DNA desnudo, conocidas en la técnica, pueden usarse (con o sin proteína 36P6D5 purificada o células que expresan 36P6D5) para generar una respuesta inmunitaria para el inmunógeno codificado (para una revisión, véase la publicación de Donnelly et al., 1997, Ann. Rev. Immunol. 15:617-648.
La secuencia de aminoácidos de 36P6D5 indicada en SEQ ID NO: 2, puede ser usada para seleccionar regiones específicas de la proteína 36P6D5 para generar anticuerpos. Por ejemplo, pueden usarse análisis de hidrofobicidad e hidrofilicidad de la secuencia de aminoácidos de 36P6D5 para identificar regiones hidrófilas de la estructura de 36P6D5. Regiones de la proteína 36P6D5 que manifiestan estructura inmunógena, así como otras regiones y dominios, pueden identificarse con facilidad usando otros diversos métodos conocidos en la técnica, tales como los análisis de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf.
Como ilustración de esto, la unión de péptidos procedentes de proteínas 36P6D5 a la molécula HLA-A2 de clase I de MHC está predicha e indicada en la Tabla 1 que figura más adelante. Específicamente, las secuencias completas de aminoácidos de proteínas 36P6D5 fueron entradas en el algoritmo de Búsqueda de Motivos Peptídicos de HLA que se encuentra en la Sección de Análisis Bioinformáticos y Moleculares (BIMAS), sitio web (http//bimas.dcrt.nih.gov/). el algoritmo de Búsqueda de Motivos Peptídicos de HLA ha sido desarrollado por el Dr. Ken Parker basándose en la unión de secuencias peptídicas específicas existentes en el surco de moléculas de Clase I HLA y específicamente HLA-A2 (véase, por ejemplo, la publicación de Falk et al., en Nature 351:290-6 (1991); Hunt et al., Science 255:1261-3 (1992); Parker et al., J. Immunol. 149:3580-7 (1992); Parker et al., J. Immunol. 152:163-75 (1994)). Este algoritmo permite la localización y la calificación de péptidos 8-meros, 9-meros, y 10-meros, procedentes de una secuencia proteínica completa para la unión predicha a HLA-A2 así como otras moléculas de Clase I HLA. La mayor parte de los péptidos que se unen a HLA-A2 son 9-meros que contienen, favorablemente, una leucina (L) en posición 2 y una valina (V) o leucina (L) en la posición 9 (Parker et al., J. Immunol. 149:3580-7 (1992). Los resultados de péptidos predichos que se unen a 36P6D5 se muestran en la Tabla 1 que figura más adelante. En la Tabla 1, los 10 mejores candidatos de la clasificación de cada miembro de la familia son mostrados juntos con su localización, la secuencia de aminoácidos de cada péptido específico y una puntuación estimada para la unión. La puntuación para la unión corresponde al semi-tiempo estimado de disociación de complejos que contienen el péptido, a 37ºC, a pH 6,5. Se predice que los péptidos con la máxima puntuación de unión son los unidos más firmemente a la Clase I de HLA sobre la superficie celular y representan, por tanto, las mejores dianas inmunógenas para el reconocimiento de células T, La unión real de péptidos a HLA-A2 puede evaluarse por estabilización de la expresión de HLA-A2 sobre la línea celular defectuosa del tratamiento de antígenos, T2 (véase, por ejemplo la publicación de Xue et al., Prostate 30:73-8 (1993) y de Peshwa et al., Prostate 36:129-38 (1998)). La inmunogenicidad de péptidos específicos puede ser evaluada in vitro por estimulación de linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL) en presencia de células dendríticas.
Métodos de preparación de una proteína o un polipéptido para usar como inmunógeno y para preparar conjugados inmunógenos de una proteína con un portador tal como BSA, KLH u otras proteínas portadoras, son bien conocidos en la técnica. En algunos casos, puede usarse la conjugación directa utilizando, por ejemplo, reactivos de carbodiimida; en otros casos pueden ser eficaces reactivos de enlace tales como los suministrados por Pierce Chemical Co., Rockford, IL. La administración de un inmunógeno de 36P6D5 se lleva a cabo, generalmente, por inyección durante un período de tiempo adecuado y con el uso de un adyuvante adecuado, como se entiende generalmente en la técnica. Durante el plan de inmunización, pueden obtenerse los títulos de los anticuerpos para determinar la adecuación de la formación de anticuerpos.
Se prefieren anticuerpos monoclonales de 36P6D5 y pueden producirse mediante diversos medios bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, líneas celulares inmortalizadas que secretan un anticuerpo monoclonal deseado pueden ser preparadas usando la tecnología estándar de Kohler y Milstein de hibridoma, o modificaciones que inmortalizan la producción de células B, como es conocido en general. Las líneas celulares inmortalizadas que secretan los anticuerpos deseados son seleccionadas mediante inmunoensayo en el que el antígeno es la proteína 36P6D5 o un fragmento de 36P6D5. Cuando es identificado el cultivo apropiado de células inmortalizadas que secretan el anticuerpo deseado, las células pueden ser expandidas y los anticuerpos producidos o bien desde cultivos in vitro o desde fluido ascítico.
Los anticuerpos o fragmentos pueden ser producidos también usando la tecnología actual, por medios recombinantes, Las regiones que se unen específicamente a las regiones deseadas de la proteína 36P6D5 pueden ser producidas asimismo en el contexto de anticuerpos quiméricos o anticuerpos injertados en CDR de origen de múltiples especies. También pueden producirse anticuerpos de 36P6D5 humanos o humanizados y son preferidos para usar en contextos terapéuticos. Métodos para humanizar anticuerpos murinos y otros anticuerpos no humanos por sustitución de una o más de las regiones de complementariedad (CDRs) de anticuerpos no humanos por las correspondientes secuencias de anticuerpos humanos, son bien conocidos (véase, por ejemplo, la publicación de Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; de Riechmann et al., 1988, Nature 332:323.327; de Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536). Véanse también las publicaciones de Carter et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285, y de Sims et al., 1993, J. Immunol. 151:2296. Métodos para producir anticuerpos monoclonales totalmente humanos incluyen métodos de presentación de fagos y métodos transgénicos (para una revisión véase Vaughan et al., 1998, Nature Biotechnology 16-535539).
Pueden generarse anticuerpos monoclonales de 36P6D5 totalmente humanos usando tecnologías de clonación que emplean genotecas combinatorias extensas de Ig humana (es decir, presentación fágica) (Griffiths y Hoogenboom, Building an in vitro immune systems: human antibodies from phage display libraries. En: Clark, M, compilador, 1993, Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man, Nottingham Academic, págs, 45-64; Burton y Barbas, Human Antibodies from combinatorial libraries. Id. pág.-65-82). Anticuerpos monoclonales de 36P6D5 totalmente humanos puede ser obtenidos también usando ratones transgénicos producidos para que contengan lugares génicos de inmunoglobulina humana según se describe en la Solicitud de Patente PCT WO98/24893, Kucherlapan y Jakobovits et al., publicada el 3 de Diciembre de 1997 (véase también Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs, 7(4) 607-614. Este método evita la manipulación in vitro que se requiere con la tecnología de presentación fágica y produce eficazmente anticuerpos humanos auténticos de alta afinidad.
La reactividad de anticuerpos de 36P6D5 con una proteína 36P6D5 puede ser establecida mediante diversos medios bien conocidos, que incluyen transferencia Western, inmunoprecipitación, ensayo ELISA, y análisis de FACS usando, según sea apropiado, proteínas 36P6D5, péptidos, células que expresan 36P6D5 o sus extractos.
Un anticuerpo de 36P6D5 o uno de sus fragmentos, de la invención, puede marcarse con un marcador detectable o conjugarse a una segunda molécula. Los marcadores detectables adecuados incluyen aun cuando no se limita a ellos, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimiluminiscente, un agente metálico que forma quelatos o una enzima. Una segunda molécula para conjugar con el anticuerpo de 36P6D5 puede ser seleccionada según el uso pretendido. Por ejemplo, para uso terapéutico, la segunda molécula puede ser una toxina o un agente terapéutico. Además, pueden generarse anticuerpos biespecíficos para dos o más epítopos de 36P6D5 usando métodos conocidos en general en la técnica. Anticuerpos homodiméricos pueden ser generados también mediante procedimientos de reticulación bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la publicación de Wolff et al., 1993, Cancer Res, 53: 2560-2565).
ANIMALES TRANSGÉNICOS DE 36P6D5
También pueden usarse ácidos nucleicos que codifican 36P6D5 o sus formas modificadas para generar o bien animales transgénicos o bien animales “noqueados” que, a su vez, son útiles para el desarrollo y selección de reactivos útiles desde el punto de vista terapéutico. Un animal transgénico (por ejemplo, un ratón o una rata) es un animal que posee células que contienen un transgeno, cuyo transgeno ha sido introducido en el animal o en un ancestro del animal en una fase prenatal, por ejemplo, en una fase embriónica. Un transgeno es un DNA que está integrado en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico. En una realización, puede usarse cDNA que codifica 36P6D5 para clonar DNA genómico que codifica 36P6D5 según técnicas establecidas, y usarse las secuencias genómicas para generar animales transgénicos que contienen células que expresan DNA que codifica 36P6D5, Métodos de generación de animales transgénicos, en particular animales tales como ratones o ratas, han llegado a ser convencionales en la técnica y están descritos, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. Nos. 4.736.866 y 4.870.009. Típicamente, células particulares podrían ser consideradas dianas para incorporar transgenos de 36P6D5 con intensificadores específicos de tejidos. Pueden utilizarse animales transgénicos que incluyen una copia de un transgeno que codifica 36P6D5 introducida en la línea germinal del animal en una fase embriónica, para examinar el efecto de expresión aumentada de DNA que codifica 36P6D5. Tales animales pueden ser utilizados como animales de ensayo de reactivos destinados a comunicar protección desde, por ejemplo, estados patológicos asociados con su sobreexpresión. Según esta característica de la invención, un animal se trata con el reactivo y una incidencia reducida del estado patológico, en comparación con animales sin tratar que llevan en transgeno, podría indicar una intervención terapéutica potencial para el estado patológico.
Alternativamente, pueden usarse homólogos no humanos de 36P6D5 para construir un animal “noqueado” de 36P6D5 que tiene un gen defectuoso o alterado que codifica 36P6D5, como resultado de recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica 36P6D5 y el DNA genómico alterado que codifica 36P6D5, introducido en una célula embriónica del animal, Por ejemplo, puede usarse cDNA que codifica 36P6D5 para clonar DNA genómico que codifica 36P6D5 según técnicas establecidas. Una parte del DNA genómico que codifica 36P6D5 puede ser delecionada o reemplazada con otro gen, tal como un gen que codifica una marcador seleccionable que puede ser usado para verificar la integración. Típicamente, varias kilobases de DNA de flanqueo, inalterado, (tanto en el extremo 5’ como en el 3’) son incluidas en el vector (véase, por ejemplo, Thomas y Capecchi, 1987, Cell 51:503) para una descripción de vectores homólogos de recombinación. El vector es introducido en una línea de células pluripotentes embriónicas (por ejemplo, por electroporación) y se seleccionan células en las que el DNA introducido se ha recombinado homólogamente con el DNA endógeno (véase, por ejemplo, Li et al., 1992, Cell, 69:915). Las células seleccionadas son inyectadas luego en un blastocisto de un animal (por ejemplo, un ratón o una rata) para formar quimeras de agregación (véase, por ejemplo, la publicación de Bradley, en Robertson, compilador, 1987, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, (IRL, Oxford) págs. 113-152). Después un embrión quimérico puede ser implantado en un animal criado, hembra, sin preñar, adecuado, y el embrión llevado a término para crear un animal “noqueado”. La progenie que hospeda en sus células germinales el DNA recombinado homólogamente puede identificarse mediante técnicas estándar, y utilizarse para criar animales en los que todas las células del animal contienen el DNA recombinado homólogamente. Los animales “noqueados” pueden caracterizarse, por ejemplo, por su capacidad de defensa contra ciertos estados patológicos y por su desarrollo de estados patológicos debidos a la ausencia del polipéptido de 36P6D5.
MÉTODOS DE DETECCIÓN DE 36P6D5
Otro aspecto de la presente invención se refiere a métodos para detectar polinucleótidos de 36P6D5 y proteínas 36P6D5 así como sus variantes, y también métodos para identificar una célula que expresa 36P6D5. El perfil de expresión de 36P6D5 le hace un marcador potencial de diagnóstico de una enfermedad localizada y/o metastasizada. El análisis de transferencia Northern sugiere que tejidos diferentes expresan isoformas diferentes de 36P6D5. Las isoformas de 36P6D5 en el cáncer de próstata aparecen como diferentes de la isoforma expresada en la próstata normal. A este respecto, el estado de productos génicos 36P6D5 puede proporcionar información útil para predecir una diversidad de factores que incluyen susceptibilidad a la enfermedad en fase avanzada, velocidad de progresión y/o agresividad de un tumor. Como se discute más adelante con detalle, el estado de productos génicos de 36P6D5 en muestras de pacientes, puede ser analizado mediante diversos protocolos que son bien conocidos en la técnica, que incluyen análisis inmunohistoquímico, la variedad de técnicas de transferencia Northern, con inclusión de hibridación in situ, análisis de RT-PCR (por ejemplo en muestras microdiseccionadas de captura por láser), análisis de transferencia Western y análisis de disposiciones de tejidos.
Más particularmente, la invención proporciona ensayos para la detección de polinucleótidos de 36P6D5 en una muestra biológica, tal como suero, hueso, próstata y otros tejidos,. orina, semen, preparaciones celulares, y semejantes. Los polinucleótidos de 36P6D5 detectables incluyen, por ejemplo, un gen 36P6D5 o uno de sus fragmentos, mRNA de 36P6D5, mRNAs de 36P6D5 variantes de corte y empalme alternativos, y moléculas de DNA o RNA recombinantes que contienen un polinucleótido de 36P6D5. Varios métodos para amplificar y/o detectar la presencia de polinucleótidos de 36P6D5 son bien conocidos en la técnica y pueden ser empleados en la práctica de este aspecto de la invención.
En una realización, un método para detectar un mRNA de 36P6D5 en una muestra biológica, comprende producir cDNA partiendo de la muestra mediante transcripción inversa usando, por lo menos, un cebador; amplificar el cDNA así producido usando polinucleótidos de 36P6D5 como cebadores de sentido y antisentido, para amplificar los cDNAs de 36P6D5 de ellos, y detectar la presencia del cDNA de 36P6D5 amplificado. Opcionalmente, puede determinarse la secuencia del cDNA de 36P6D5 amplificado. En otra realización, un método de detección de un gen de 36P6D5 en una muestra biológica, comprende aislar primeramente DNA genómico desde la muestra, amplificar el DNA genómico aislado usando polinucleótidos de 36P6D5 como cebadores de sentido y antisentido para amplificar el gen de 36P6D5 de ellos; y detectar la presencia del gen de 36P6D5 amplificado. Varias combinaciones apropiadas de sondas de sentido y antisentido pueden ser diseñadas a partir de las secuencias de nucleótidos proporcionadas para la proteína 36P6D5 (SEQ ID NO: 1) y usarse para este fin.
La invención proporciona también ensayos para detectar la presencia de una proteína 36P6D5 en un tejido de otra muestra biológica tal como suero, hueso, próstata, y otros tejidos, orina, preparaciones celulares, y semejantes. Asimismo son bien conocidos métodos para detectar una proteína 36P6D5, e incluyen, por ejemplo, inmunoprecipitación, análisis inmunohistoquímicos, análisis de transferencia Western, ensayos de uniones moleculares, ensayos ELISA, ELIFA, y semejantes. Por ejemplo, en una realización, un método para detectar la presencia de una proteína 36P6D5 en una muestra biológica, comprende poner en contacto primeramente la muestra con un anticuerpo de 36P6D5, uno de sus fragmentos reactivos con 36P6D5, o una proteína recombinante que contiene una región de unión antigénica de un anticuerpo de 36P6D5; y detectar después la unión a ellos de la proteína 36P6D5 de la muestra.
También se proporcionan métodos para identificar una célula que expresa 36P6D5. En una realización, un ensayo para identificar una célula que expresa un gen 36P6D5 comprende detectar la presencia de mRNA de 36P6D5 existente en la célula. Métodos de detección de mRNAs particulares en células, son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, ensayos de hibridación usando sondas de DNA complementarias (tales como hibridación in situ usando ribosondas de 36P6D5 marcadas, transferencia Northern y técnicas afines) y diversos ensayos de amplificación de los ácidos nucleicos (tales como RT-PCR usando cebadores complementarios específicos para 36P6D5, y otros métodos de detección del tipo de amplificación, tales como, por ejemplo, DNA ramificado, SISBA, TMA, y semejantes. Alternativamente, un ensayo para identificar una célula que expresa un gen de 36P6D5 comprende detectar la presencia de proteína 36P6D5 en la célula o secretada por la célula. En la técnica son bien conocidos diversos métodos para detectar proteínas, y pueden emplearse para detectar proteínas 36P6D5 y células que expresan 36P6D5.
Los análisis de la expresión de 36P6D5 pueden ser útiles también como herramienta para identificar y evaluar agentes que modulan la expresión génica de 36P6D5. Por ejemplo, la expresión de 36P6D5 está regulada en ascenso, de modo importante, en el cáncer de próstata, y también puede expresarse en otros cánceres. La identificación de una molécula o un agente biológico que pudiera inhibir la expresión o sobreexpresión de 36P6D5 en células cancerosas, puede tener valor terapéutico. Tal agente puede ser identificado utilizando una exploración que cuantifique la expresión de 36P6D5 mediante RT-PCR, hibridación de los ácidos nucleicos o unión de anticuerpos.
ENSAYOS DE 36P6D5 EN CIRCULACIÓN Y EXCRETADA
La proteína 36P6D5 madura posee una secuencia señal en el extremo N-terminal del marco de lectura abierto codificado por cDNA. Debido a que la proteína 36P6D5 es una proteína secretada expresada en cánceres de próstata, riñón, vejiga, mama, colon, ovarios, páncreas y posiblemente otros cánceres, sería de esperar que los tumores que expresan 36P6D5 secretaran 36P6D5 en la vasculatura, y/o se excretara en orina o semen, donde la proteína puede ser detectada y cuantificada usando ensayos y técnicas bien conocidas en el campo de diagnósticos moleculares. Es de esperar que la detección y cuantificación de los niveles de 36P6D5 en circulación o excretados tenga muchos usos en el diagnóstico, estadio y prognosis de cánceres que expresan 36P6D5, que incluyen, aun cuando no se limita a ellos, cánceres de próstata, riñón, vejiga, mama, colon, ovarios y páncreas. Diversos diferentes enfoques técnicos para detectar y cuantificar proteínas en suero, orina o semen, son conocidos en la técnica.
Debido a que la proteína 36P6D5 es una proteína secretada expresada en cánceres de próstata, riñón, vejiga, mama, colon, ovarios, páncreas y, posiblemente, otros cánceres, es de esperar que los ensayos para detectar y cuantificar 36P6D5 en sangre o suero sean útiles para la detección, el diagnóstico, la prognosis y/o la determinación del estadio de un tumor que expresa 36P6D5, en un individuo. Por ejemplo, la expresión de 36P6D5 en tejidos normales se encuentra, predominantemente, en el páncreas (FIG. 3), con niveles inferiores de expresión detectados en la próstata y en el intestino delgado. Sin embargo, se detecta una expresión de nivel alto en xenotrasplantes derivados desde cánceres de próstata así como en líneas celulares derivadas de cánceres de mama, colon, páncreas y ovarios (FIG. 4). Por consiguiente, la detección de 36P6D5 en suero puede proporcionar una indicación de la presencia de un tumor de próstata, mama, colon, ovárico o pancreático. El diagnóstico de cáncer puede realizarse sobre la base de esta información y/u otra información. En lo que respecta al cáncer de próstata, por ejemplo, tal otra información puede incluir medidas del PSA sérico, DRE y/o ultrasonografía. Además, el nivel de 36P6D5 detectado en el suero puede proporcionar información útil para determinar el estadio o en la prognosis. Por ejemplo, como es apoyado por los datos presentados en la Figura 9 y 10, a medida que la población celular se expande y crece a través del estroma y de la microvasculatura es de esperar la observación de niveles más altos de 36P6D5 en el suero. A este respecto, niveles muy altos de proteína 36P6D5 en el suero, pueden sugerir tumores mayores y/o más agresivos.
Además, la sangre periférica y la médula ósea pueden ser analizadas convenientemente para detectar la presencia de proteína 36P6D5 y/o de células cancerosas que expresan 36P6D5, que incluyen, aun cuando no se limita a ellos, cánceres de próstata, vejiga, colon, páncreas, riñón y ovarios, usando RT-PCR para detectar la expresión de 36P6D5 La presencia de mRNA de 36P6D5 amplificable por RT-PCR, proporciona una indicación de la presencia de cáncer. Ensayos de detección por RT-PCR de células tumorales en sangre periférica, son evaluados actualmente para usar en la diagnosis y el tratamiento de diversos tumores sólidos humanos. En el campo del cáncer de próstata, estos ensayos incluyen ensayos por RT-PCR para detectar células que expresan PSA y PSM (Verkaik et al., 1997, Urol. Res. 25:373-384; Ghossein et al., 1995, J. Clin. Oncol. 13: 1195-2000; Heston et al., 1995, Clin. Chem. 41: 1687-1688). Los ensayos por RT-PCR son bien conocidos en la técnica.
En una realización, se usa un ensayo ELISA de captura para detectar y cuantificar 36P6D5 en suero, orina o semen. El ensayo ELISA de captura para detectar 36P6D5 comprende, generalmente, al menos dos anticuerpos monoclonales de isotipos diferentes que reconocen epítopos distintos de la proteína 36P6D5, o un anticuerpo monoclonal anti-36P6D5 y un suero policlonal específico derivado desde una especie diferente (por ejemplo, conejo, cabra, oveja, hámster, etc.). En este ensayo un reactivo sirve como anticuerpo de captura (o recubrimiento) y el otro como anticuerpo de detección. Como indica la Tabla 2, muestras clínicas de suero procedentes de pacientes con cáncer pancreático, y muestras de individuos masculinos normales, fueron examinadas para determinar la proteína 36P6D5 usando un ensayo ELISA de captura según se ha descrito y según la Figura 10. Los sobrenadantes procedentes de células PC-3-36P6D5 y células Du4475, y procedentes de células PC-3-neo, sirvieron de testigos positivo y negativo, respectivamente, para detectar la proteína 36P6D5. ND: no detectado o por debajo de la sensibilidad de detección. Se detecto proteína 36P6D5 en 7/10 pacientes con cáncer de colon y 6/10 pacientes con cáncer pancreático, uno de los cuales tenía niveles relativamente altos (29,70 ng/ml), pero solo en 1/6 de donantes masculinos normales. En un experimento relacionado, se utilizó análisis FACS para detectar células que expresan la proteína 36P6D5, por ejemplo, aquellas que han escapado del sitio local de la enfermedad y han emigrado hacia otros sitios tales como el sistema linfático.
Como se discute con detalle más adelante, los niveles de 36P6D5 con inclusión de los niveles séricos de 36P6D5 pueden ser usados para proporcionar indicación de la presencia, extensión y agresividad de un tumor que expresa 36P6D5. Como se ha indicado anteriormente, la proteína 36P6D5 comparte muchas características con el PSA que es el marcador bioquímico de la próstata más importante, exacto y útil desde el punto de vista clínico. Cualquier proceso que interrumpa la arquitectura normal de la próstata permite la difusión de PSA hacia el estroma y la microvasculatura. Por consiguiente, aumentos importantes desde el punto de vista clínico de los niveles del PSA sérico son observados en cánceres prostáticos. En particular, el mayor número de células malignas y la disrupción estromal asociada con el cáncer, justifican el nivel aumentado del antígeno específico de la próstata en el suero. A este respecto, los niveles séricos del antígeno específico de la próstata se correlacionan positivamente con la fase clínica, el volumen del tumor, el grado histológico y la presencia de perforación capsular y de invasión de la vesícula seminal. Véase, por ejemplo, la publicación de Bostwick, D.G. Am. J. Clin. Pathol. 102 (4 Suppl 1):S31-S37 (1994).
El uso del PSA como una molécula análoga, es probablemente porque debido a que la proteína 36P6D5 es también una molécula secretada que pone de manifiesto un esquema restringido de expresión tisular (con inclusión de la próstata), la carga creciente de células malignas y de la desorganización estromal que ocurre con el cáncer, hace que los niveles séricos de antígeno de 36P6D5 se correlacionen positivamente con uno o más factores clínicamente relevantes tales como la fase clínica, el volumen tumoral, el grado histológico y la presencia de perforación capsular y la invasión de la vesícula seminal. Es de esperar que las medidas de 36P6D5 en el suero a lo largo del tiempo proporcionaran información adicional, en donde sería de esperar que un aumento de 36P6D5 reflejara la progresión y sería de esperar que la velocidad de aumento estuviera correlacionada con la agresividad. Similarmente, sería de esperar que una disminución de la 36P6D5 sérica reflejara un crecimiento más lento o una regresión del tumor. La identificación de 36P6D5 en el suero puede ser útil para detectar la iniciación de un tumor y de la enfermedad en una fase precoz. En pacientes que ha sido sometidos a cirugía o a tratamiento terapéutico, los niveles de 36P6D5 séricos podrían ser útiles para monitorizar la respuesta al tratamiento y la recurrencia potencial.
MONITORIZACIÓN DEL ESTADO DE 36P6D5 Y SUS PRODUCTOS
Los ensayos que evalúan el estado del gen 36P6D5 y de productos génicos de 36P6D5 de un individuo, pueden proporcionar información sobre el crecimiento o el potencial oncogénico de una muestra biológica procedente de este individuo. Por ejemplo, debido a que el mRNA de 36P6D5 es expresado tan altamente en los cánceres de próstata en comparación con el tejido prostático normal, pueden usarse ensayos que evalúen los niveles relativos de transcritos de mRNA de 36P6D5 o de proteínas 36P6D5 de una muestra biológica, para diagnosticar una enfermedad asociada con la falta de regulación de 36P6D5 tal como el cáncer, y puede proporcionar información prognóstica, útil para definir opciones terapéuticas apropiadas.
Debido a que la proteína 36P6D5 es expresada, por ejemplo, en diversos tejidos de xenotrasplantes de cánceres de próstata y diversas líneas de células cancerosas, y en muestras de pacientes de cáncer, el “status” de expresión de 36P6D5 puede proporcionar información útil para determinar información que incluye la presencia, fase y situación de células displásicas, precancerosas y cancerosas, predecir la susceptibilidad a diversas fases de la enfermedad, y/o calibrar la agresividad tumoral. Además, el perfil de expresión le hace un reactivo potencial para formar imágenes de la enfermedad metastasizada. Por consiguiente, un aspecto importante de la invención está dirigido a los diversos métodos moleculares, prognósticos y de diagnóstico, para examinar el “status” de 36P6D5 en muestras biológicas tales como las procedentes de individuos aquejados de una patología (o que se sospecha aquejados) caracterizada por una alteración del crecimiento celular tal como el cáncer.
Se sabe que la oncogénesis es un proceso de varias etapas en el que el crecimiento celular se hace progresivamente alterado y las células progresan desde un estado fisiológico normal hacia estados precancerosos y después cancerosos (véase, por ejemplo, la publicación de Alers et al., Lab. Invest. 77(5): 437-438 (1997) y de Isaacs et al., Cancer Surv. 23: 19-32 (1995)) A este respecto, el examinar una muestra biológica para poner de manifiesto un crecimiento celular alterado (tal como una expresión aberrante de 36P6D5 en cánceres de próstata) puede permitir la detección precoz de tal fisiología celular aberrante antes de que una patología tal como el cáncer haya progresado hasta un estado en el que las opciones terapéuticas estén más limitadas. En tales exámenes, el “status” de 36P6D5 en una muestra biológica de interés (tal como una que se sospecha o que tiene un crecimiento celular alterado) puede compararse, por ejemplo, con el “status” de 36P6D5 en la muestra normal correspondiente (por ejemplo, una muestra procedente de un individuo (o, alternativamente, otro individuo) que no esté afectado por una patología, por ejemplo, uno que no se sospecha o que no tiene un crecimiento celular alterado) con alteraciones en el “status” de 36P6D5 en la muestra biológica de interés (en comparación con la muestra normal) lo que proporciona evidencia de un crecimiento celular alterado. Además, usando como muestra normal una muestra biológica que no esté afectada por una patología, puede usarse también un valor normativo determinado previamente, tal como un nivel normal predeterminado de expresión de mRNA (véase, por ejemplo, Grever et al., J. Com. Neurol. 1996, Dic. 9:376(2): 306-14 y la patente de EE.UU. No. 5.837.501) para comparar 36P6D5 en muestras normales frente a muestras sospechosas.
El término “status” en este contexto se utiliza según sus significado aceptado en la técnica y alude a la condición o estado de un gen y sus productos. Como se ha descrito específicamente en esta memoria, el “status” de 36P6D5 puede evaluarse mediante cierto número de parámetros conocidos en la técnica. Típicamente, una alteración del “status” de 36P6D5 comprende un cambio en la situación de células que expresan 36P6D5 y/o un aumento de la expresión de mRNA de 36P6D5 y/o de la proteína.
Típicamente, los técnicos experimentados utilizan varios parámetros para evaluar la condición o el estado de un gen y sus productos. Estos parámetros incluyen, aun cuando no se limita a ellos, la situación de productos génicos expresados (incluyendo la situación de células que expresan 36P6D5) así como el nivel, y actividad biológica de los productos génicos expresados (tales como polinucleótidos y polipéptidos de mRNA de 36P6D5). Las alteraciones en el “status” de 36P6D5 pueden evaluarse mediante una amplia variedad de metodologías bien conocidas en la técnica, típicamente los descritos más adelante. Típicamente, una alteración del “status” de 36P6D5 comprende un cambio en la situación de 36P6D5 y/o de células que expresan 36P6D5 y/o un aumento de la expresión de mRNA de 36P6D5 y/o de la expresión de la proteína.
Tal como aquí se discute con detalle, con objeto de identificar una condición o un fenómeno asociado con un crecimiento celular alterado, el “status” de 36P6D5 de una muestra biológica puede ser evaluado mediante diversos métodos utilizados por los técnicos experimentados que incluyen, aun cuando no se limita a ellos, análisis genómico Southern (para examinar, por ejemplo, perturbaciones existentes en el gen 36P6D5) análisis Northerns y/o análisis por PCR de mRNA de 36P6D5 (para examinar, por ejemplo, alteraciones en las secuencias de polinucleótidos o en los niveles de expresión de mRNAs de 36P6D5) y análisis de transferencia Western y/o análisis inmunohistoquímicos (para examinar, por ejemplo, alteraciones en las secuencias de polipéptidos, alteraciones en la posición de polipéptidos dentro sde una muestra, alteraciones en los niveles de expresión de proteínas 36P6D5 y/o asociaciones de proteínas 36P6D5 con compañeros de unión de polipéptidos). Los polinucleótidos de 36P6D5 detectables incluyen, por ejemplo, un gen 36P6D5 o uno de sus fragmentos, mRNA de 36P6D5, variantes alternativas de corte y empalme de mRNAs de 36P6D5 y moléculas recombinantes de DNA o RNA que contienen un polinucleótido de 36P6D5.
El perfil de expresión de 36P6D5 le hace un marcador de diagnóstico potencial para detectar una enfermedad localizada y/o metastasizada. En particular el “status” de 36P6D5 puede proporcionar información útil para predecir susceptibilidad a fases particulares de una enfermedad, progresión y/o agresividad de un tumor. La invención proporciona métodos y ensayos para determinar el “status” de 36P6D5 y diagnosticar cánceres que expresan 36P6D5, tales como cánceres de próstata, vejiga, riñón, ovarios, mama, páncreas , colon y pulmón. El “status” de 36P6D5 en muestras de pacientes puede ser analizado por diversos medios conocidos en la técnica, que incluyen, sin limitación, análisis inmunohistoquímicos, hibridación in situ, análisis por RTPCR sobre muestras microdiseccionadas de captura láser, análisis de transferencia Western de muestras clínicas y líneas celulares, y análisis de series de tejidos. Protocolos típicos para evaluar el “status” del gen y productos génicos de 36P6D5 pueden encontrarse, por ejemplo en la publicación de Ausubul et al., compiladores, 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Unidades 2 [Transferencia Northern], 4 [Transferencia Southern], 15 [Inmunotransferencia] y 18 [Análisis por PCR].
Según se ha descrito antes, el “status” de 36P6D5 de una muestra biológica puede ser examinado mediante varios procedimientos operatorios bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el “status” de 36P6D5 de una muestra biológica tomada desde una situación específica en el cuerpo, puede ser examinado evaluando la muestra para determinar la presencia o ausencia de células que expresan 36P6D5 (por ejemplo, las que expresan mRNAs de 36P6D5 ó proteínas 36P6D5). Este examen puede proporcionar evidencia de crecimiento celular alterado por ejemplo, cuando se encuentran células que expresan 36P6D5 en una muestra biológica que no contiene normalmente tales células (tal como un ganglio linfático). Tales alteraciones del “status” de 36P6D5 de una muestra biológica están asociadas, frecuentemente, con un crecimiento celular desordenado. Específicamente, un indicador de crecimiento celular desordenado es la metástasis de células cancerosas desde un órgano de origen (tal como la vejiga, los riñones, o la glándula prostática) hasta una zona del cuerpo diferente (tal como un ganglio linfático), A este respecto, la evidencia de un crecimiento celular desordenado es importante, por ejemplo, debido a que pueden detectarse metástasis ocultas en los ganglios linfáticos en una proporción importante de pacientes con cáncer de próstata, y dichas metástasis están asociadas con pronosticadores conocidos de progresión de la enfermedad (véase, por ejemplo, J. Urol., 1995, Ago:154(2 Pt 1):474-8).
En un aspecto, la invención proporciona métodos de monitorización de productos génicos de 36P6D5, por determinación del “status” de productos génicos de 36P6D5 expresados por células de una muestra de un tejido de ensayo procedente de un individuo del que se sospecha que esta aquejado de una enfermedad asociada con un crecimiento celular desordenado (tal como hiperplasia o cáncer) y comparación luego el “status” así determinado con el “status” de productos génicos de 36P6D5 de una muestra normal correspondiente, proporcionando la presencia de productos génicos de 36P6D5 aberrantes de la muestra de ensayo con relación a la muestra normal, una indicación de la presencia de un crecimiento celular desordenado existente dentro de las células del individuo.
En otro aspecto, la invención proporciona ensayos útiles para determinar la presencia de cáncer en un individuo, que comprende detectar un aumento importante de la expresión de mRNA de 36P6D5 o una proteína 36P6D5 en una célula de ensayo o en una muestra de tejido con relación a los niveles de expresión de la célula normal o el tejido correspondientes. La presencia de mRNA de 36P6D5 puede evaluarse, por ejemplo, en muestras de tejidos que incluye, aun cuando no se limita a ellos, tejidos de próstata, riñón, vejiga, ovarios, páncreas y pulmón (véanse, por ejemplo, las FIGS. 4, 6 y 7). La presencia de expresión importante de 36P6D5 en cualquiera de estos tejidos, puede ser útil para indicar la emergencia, presencia y/o gravedad de estos cánceres, dado que los tejidos normales correspondientes no expresan mRNA de 36P6D5 o le expresan en niveles más bajos.
En una realización afín, el “status” de 36P6D5 puede ser determinado al nivel de proteína en vez de al nivel de los ácidos nucleicos. Por ejemplo, un método o ensayo tal, podría comprender determinar el nivel de proteína 36P6D5 expresado por células en una muestra de un tejido de ensayo y comparar el nivel así determinado con el nivel de 36P6D5 expresado en la correspondiente muestra normal. En una realización, se evalúa la presencia de una proteína 36P6D5, por ejemplo, utilizando métodos inmunohistoquímicos. Pueden usarse anticuerpos de 36P6D5 o compañeros de unión capaces de detectar la expresión de la proteína 36P6D5 en una diversidad de formatos de ensayo conocidos en la técnica con esta finalidad.
En otras realizaciones afines, puede evaluarse la integridad de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de 36P6D5 de una muestra biológica, con objeto de identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas, tales como inserciones, deleciones, sustituciones y semejantes. Tales realizaciones son útiles debido a que se observan perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos en un gran número de proteínas asociadas con un fenotipo desordenado de crecimiento (véase, por ejemplo ,la publicación de Marrogi et al, en J. Cutan. Pathol. 26(8):369-378, 1999. A este respecto, una amplia variedad de ensayos para observar perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos son conocidos en la técnica. Por ejemplo, el tamaño y la estructura de las secuencias de los ácidos nucleicos y de los aminoácidos de productos génicos de 36P6D5, pueden observarse mediante los protocolos de transferencias Northern, Southern, Western, PCR y secuenciación de DNA, discutidos en esta memoria. Además, otros métodos para observar perturbaciones existentes en las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos, tales como el análisis de polimorfismos de conformación de una sola cadena, son bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. Nos. 5.382.510 y 5.932.170).
En otra realización, puede examinarse el “status” de metilación del gen 36P6D5 en una muestra biológica. La desmetilación y/o hipermetilación aberrantes de islotes de CpG en regiones génicas reguladoras de 5’, ocurren frecuentemente en células inmortalizadas y transformadas y pueden dar por resultado una expresión alterada de diversos genes. Por ejemplo, el promotor de hipermetilación de la glutation S-transferasa de clase pi (una proteína expresada en la próstata normal pero no expresada en >90% de los carcinomas de próstata) aparece silenciando permanentemente la transcripción de este gen y es la alteración genómica detectada con la máxima frecuencia en los carcinomas de próstata (De Marzo et al., Am. J. Pathol. 155(6): 19851992, (1999)). Además, esta alteración está presente en al menos el 70% de casos de neoplasia intraepitelial prostática de alto grado (PIN) (Brooks et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 7:531-536, (1998)). En otro ejemplo, la expresión del gen específico de tumores LAGE-1 (que no es expresado en la próstata normal pero que es expresado en el 25-50% de los cánceres de próstata) es inducido por desoxi-azacitidina en células linfoblásticas, lo que sugiere que la expresión tumoral es debida a desmetilación (Lethe et al., Int. J. Cancer 76(6): 903-908 (1998)). En este contexto, una diversidad de ensayos para examinar el “status” de metilación de un gen, son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden utilizarse en enfoques de hibridación Southern con enzimas de restricción sensibles a la metilación que no pueden escindir secuencias que contienen sitios de CpG metilados con objeto de verificar el ”status” global de la metilación de islotes de CpG. Además, MSP (PCR específica de metilación) puede obtener rápidamente el perfil del ”status” de metilación de todos los sitios CpG presentes en un islote de CpG de un gen dado. Este procedimiento operatorio implica la modificación inicial de DNA mediante bisulfito sódico (que puede convertir todas las citosinas sin metilar en uracilo) seguido de amplificación usando cebadores específicos para DNA metilado frente a DNA sin metilar. Protocolos que implican interferencia de la metilación pueden encontrarse también en Current Protocols in Molecular Biology, Unidades 12, Frederick M. Ausubul et al., compiladores, 1995.
La amplificación génica proporciona un método adicional de verificación del “status” de 36P6D5, un locus que mapea a 21q22.2-22.3, una región que muestra que está perturbada en una diversidad de cánceres. Puede medirse amplificación génica en una muestra, directamente, por ejemplo, mediante métodos convencionales tales como transferencia Southern o transferencia Northern para cuantificar la transcripción de mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), hibridación puntual (análisis de DNA) o hibridación in situ, usando una sonda apropiadamente marcada, basándose en la secuencias proporcionadas en esta memoria. Alternativamente, pueden emplearse anticuerpos que pueden reconocer dúplexes específicos, con inclusión de dúplexes de DNA, dúplexes de RNA y dúplexes híbridos de DNARNA o dúplexes de proteínas-DNA. Los anticuerpos, a su vez, pueden estar marcados y el ensayo puede llevarse a cabo cuando el dúplex está unido a una superficie, por lo que después de la formación del dúplex sobre la superficie, puede detectarse la presencia del anticuerpo unido al dúplex .
Además de los tejidos anteriormente descritos, pueden analizarse convenientemente tejidos procedentes de biopsias o sangre periférica o médula ósea, para determinar la presencia de células cancerosas, incluyendo, pero sin limitación, cánceres de próstata, riñón, vejiga, ovarios, mama, páncreas, colon y pulmón, usando , por ejemplo, transferencia Northern, hibridación puntual o análisis por RT-PCR para detectar la expresión de 36P6D5 (véanse, por ejemplo, las FIGS 4, 6 y 7). La presencia de mRNA de 36P6D5 amplificable por RT-PCR, proporciona una indicación de la presencia del cáncer. Los ensayos de detección por RT-PCR de células tumorales en sangre periférica, se evalúan corrientemente para usar en la diagnosis y el tratamiento de diversos tumores sólidos humanos. En el campo del cáncer de próstata estos ensayos incluyen ensayos por RT-PCR para detectar células que expresan PSA y PSM (Verkaik et al, Urol. Res. 25:373-384 (1997); Ghossein et al., J. Clin. Oncol. 13:11952000, (1995); Heston et al., Clin. Chem. 41:1687-1688 (1995)). Los ensayos por RT-PCR son bien conocidos en la técnica.
Un aspecto de la invención relacionado se refiere a predecir la susceptibilidad de un individuo para desarrollar cáncer. En una realización, un método para predecir susceptibilidad a cáncer comprende detectar mRNA de 36P6D5 o proteína 36P6D5 en una muestra de un tejido, cuya presencia indica susceptibilidad a cáncer, en donde el grado de expresión de mRNA de 36P6D5 es proporcional al grado de susceptibilidad. En una realización específica, se examina la presencia de 36P6D5 en tejido prostático, proporcionando la presencia de 36P6D5 en la muestra una indicación de la susceptibilidad a cáncer de próstata (o la emergencia o existencia de un tumor prostático). En otra realización específica, se examina la presencia de 36P6D5 en un tejido, proporcionando la presencia de 36P6D5 en la muestra una indicación de la susceptibilidad a cáncer (o la emergencia o existencia de un tumor). En una realización estrechamente relacionada, puede evaluarse la integridad de secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de 36P6D5 en una muestra biológica, con objeto de identificar perturbaciones en la estructura de esas moléculas, tales como inserciones, deleciones, sustituciones y semejantes, proporcionando la presencia de una o más perturbaciones en los productos génicos de 36P6D5 de la muestra, una indicación de la susceptibilidad a cáncer (o la emergencia o existencia de un tumor).
Todavía, otro aspecto relacionado de la invención está dirigido a métodos para calibrar la agresividad de tumores. En una realización, un método para calibrar la agresividad de un tumor comprende determinar el nivel de mRNA de 36P6D5 o de proteína 36P6D5 expresado por células en una muestra del tumor, comparar el nivel determinado de este modo con el nivel de mRNA de 36P6D5 o de proteína 36P6D5 expresado en un tejido normal correspondiente, obtenido desde el mismo individuo, o una muestra de un tejido normal de referencia, en el que el grado de expresión de mRNA de 36P6D5 o de la proteína 36P6D5 de la muestra del tumor con respecto a la muestra normal, indica el grado de agresividad. En una realización específica, la agresividad de un tumor se evalúa determinando la extensión a la que es expresada 36P6D5 en las células tumorales, indicando los niveles de expresión superiores tumores más agresivos. En una realización estrechamente relacionada, puede evaluarse la integridad de secuencias de nucleótidos y aminoácidos de 36P6D5 de una muestra biológica con objeto de identificar perturbaciones existentes en la estructura de estas moléculas, tales como inserciones, deleciones, sustituciones y semejantes, indicando la presencia de una o más perturbaciones tumores más agresivos.
La invención proporciona, adicionalmente, métodos para examinar una muestra biológica y evidenciar un crecimiento celular desordenado. En una realización, el método comprende comparar el “status” de 36P6D5 de la muestra biológica con el “status” de 36P6D5 de una muestra normal correspondiente, en los que las alteraciones del “status” de 36P6D5 de la muestra biológica están asociados con un crecimiento celular desordenado. El “status” de 36P6D5 de la muestra biológica puede ser evaluado, por ejemplo, examinando los niveles de expresión de mRNA de 36P6D5 o los niveles de expresión de la proteína 36P6D5. En una realización, una alteración del “status” de 36P6D5 es identificado por la presencia de células que expresan 36P6D5 existentes en una muestra biológica procedente de un tejido en el que las células que expresan 36P6D5 están, normalmente, ausentes.
En otro aspecto, la invención proporciona ensayos útiles para determinar la presencia de cáncer en un individuo, que comprende detectar un aumento importante de expresión de mRNA de 36P6D5 o de expresión de una proteína 36P6D5 en una muestra de ensayo de células o de tejidos con respecto a los niveles de expresión de la células o tejidos normales correspondientes, La presencia de mRNA de 36P6D5 puede ser evaluada, por ejemplo, en muestras de tejidos que incluyen, sin limitar a ellos, tejidos de colon, pulmón, próstata, páncreas, vejiga, ovario, cérvix, testículos, cabeza y cuello, cerebro, estómago, huesos, etc. La presencia de una expresión importante de 36P6D5 en cualquiera de estos tejidos puede ser útil para indicar la emergencia, presencia y/o gravedad de estos cánceres o de una metástasis de cáncer originada en otro tejido, dado que los tejidos normales correspondientes no expresan el mRNA de 36P6D5 o lo expresan en niveles inferiores.
Todavía, otros aspecto de la invención relacionado se refiere a métodos para observar la progresión de una malignidad en un individuo a lo largo del tiempo. En una realización, los métodos para observar la progresión de una malignidad en un individuo a lo largo del tiempo, comprenden determinar el nivel de mRNA de 36P6D5 o de proteína 36P6D5 expresado por células en una muestra del tumor, comparar el nivel determinado de este modo con el nivel de mRNA de 36P6D5 o de proteína 36P6D5 expresado en una muestra equivalente de tejido tomada del mismo individuo en un momento diferente, en el que el grado de expresión del mRNA de 36P6D5 o de la proteína 36P6D5 en la muestra de tumor a lo largo del tiempo, proporciona información sobre la progresión del cáncer. En una realización específica, la progresión de un cáncer se evalúa determinando la extensión a la que la expresión de 36P6D5 en las células tumorales se altera a lo largo del tiempo, indicando los niveles de expresión superiores una progresión del cáncer. En una realización estrechamente relacionada, puede evaluarse la integridad de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de 36P6D5 de una muestra biológica con objeto de identificar perturbaciones existentes en la estructura de esas moléculas tales como inserciones, deleciones, sustituciones y semejantes, indicando la presencia de una o más perturbaciones una progresión del cáncer.
Los enfoque de diagnóstico anteriores pueden combinarse con uno cualquiera de una amplia variedad de protocolos de prognóstico y de diagnóstico conocidos en la técnica. Por ejemplo, otra realización de la invención aquí descrita está dirigida a métodos para observar la coincidencia entre la expresión de gen 36P6D5 y de productos génicos de 36P6D5 (o de perturbaciones en el gen 36P6D5 y en productos génicos de 36P6D5) y un factor que está asociado con malignidades, como medios de diagnóstico y prognóstico del “status” de una muestra de tejido. A este respecto, puede utilizarse una amplia variedad de factores asociados con la malignidad tales como la expresión de genes asociados por otra parte con la malignidad (que incluyen la expresión de PSA, PSCA y PSM), así como observaciones citológicas bastas (véanse, por ejemplo, las publicaciones de Bocking et al., en Anal. Quant. Cytol. 6(2):74-88, 1984; de Epstein, en Hum. Pathol. 26(2):223-9, 1995; de Thorson et al., en Mod. Pathol. 11(6):543-51, 1998; y de Baisden et al., en Am. J. Surg. Pathol, 23(8):918.24, 1999. Los métodos para observar una coincidencia entre la expresión del gen 36P6D5 y de productos génicos de 36P6D5 (o de perturbaciones en el gen 36P6D5 y productos génicos de 36P6D5) y un factor adicional que está asociado con la malignidad, son útiles, por ejemplo, debido a que la presencia de un conjunto o constelación de factores específicos que coincidan proporciona información crucial para el diagnóstico y el prognóstico del “status” de una muestra de un tejido.
En una realización típica, los métodos para observar una coincidencia entre la expresión del gen 36P6D5 y de productos génicos de 36P6D5 (o de perturbaciones en el gen 36P6D5 y productos génicos de 36P6D5) y un factor que está asociado con la malignidad, impone detectar la sobreexpresión de mRNA de 36P6D5 o de una proteína 36P6D5 en una muestra de tejido, detectar la sobreexpresión de mRNA del PSA o de la proteína de PSA en una muestra de tejido, y observar la coincidencia de sobreexpresión de mRNA de 36P6D5 o una proteína 36P6D5 y la sobreexpresión de mRNA del PSA o de la proteína de PSA. En una realización específica, se examina la expresión de mRNA de 36P6D5 y de PSA en tejido prostático. En una realización preferida, la coincidencia de la sobreexpresión de mRNA de 36P6D5 y de PSA en la muestra, proporciona una indicación de cáncer de próstata, susceptibilidad a cáncer de próstata o la emergencia o existencia de un tumor prostático.
Métodos para detectar y cuantificar la expresión de mRNA de 36P6D5 o de proteína 36P6D5 están descritos en esta memoria y el uso de tecnologías estandar para la detección y cuantificación de ácidos nucleicos y proteínas es bien conocido en la técnica. Los métodos estándar para la detección y cuantificación de mRNA de 36P6D5 incluyen hibridación in situ usando ribosondas de 36P6D5 marcadas, transferencia Northern y técnicas afines usando sondas de polinucleótidos de 36P6D5, análisis por RT-PCR usando cebadores específicos para 36P6D5, y otros métodos de detección del tipo de amplificación, tales como, por ejemplo, DNA ramificado, SISBA, TMA y semejantes. En una realización específica puede usarse RT-PCR semicuantitativa para detectar y cuantificar la expresión de mRNA de 36P6D5 según se describe en los Ejemplos que siguen. Para este fin puede usarse cualquier número de cebadores capaces de amplificar 36P6D5, que incluyen, sin limitarse a ellos, los diversos conjuntos de cebadores descritos específicamente en esta memoria. Para este fin pueden usarse métodos estándar para la detección y cuantificación de proteínas. En una realización específica pueden utilizarse anticuerpos policlonales o monoclonales específicamente reactivos con la proteína 36P6D5 de tipo salvaje, en un ensayo inmunohistoquímico de tejidos obtenidos de biopsias.
IDENTIFICACIÓN DE MOLÉCULAS QUE INTERACCIONAN CON 36P6D5
Las secuencias de las proteínas 36P6D5 aquí descritas permiten al técnico experimentado identificar proteínas, moléculas pequeñas y otros agentes que interaccionan con 36P6D5 y caminos activados por 36P6D5, por medio de una diversidad de protocolos aceptados por la técnica. Por ejemplo, puede utilizarse uno de la variedad de los sistemas denominados trampa de interacción (a los que se alude también como el ”ensayo doble híbrido”). En tales sistemas, las moléculas que interaccionan reconstituyen un factor de transcripción y dirigen la expresión de un gen informador, cuya expresión se ensaya luego. Los sistemas típicos identifican interacciones de proteína-proteína, in vivo, mediante reconstitución de un activador eucariótico de la transcripción y están descritos, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. Nos. 5.955.280, 5.925.523, 5.846.722 y 6.004.746.
Alternativamente, pueden identificarse moléculas que interaccionan con secuencias de las proteínas 36P6D5 explorando colecciones de péptidos. En tales métodos, se identifican péptidos que se unen a moléculas receptoras seleccionadas tales como 36P6D5, explorando colecciones que codifican una colección de aminoácidos aleatoria o controlada. Los péptidos codificados por las colecciones son expresados como proteínas de fusión de proteínas de cobertura de bacteriófagos y después son seleccionadas partículas de bacteriófagos frente a los receptores de interés.
De este modo pueden identificarse péptidos que posee una diversidad de usos, tales como reactivos terapéuticos o de diagnóstico, sin información previa sobre la estructura del ligando o molécula de receptor que se espera. Colecciones de péptidos y de métodos de exploración, típicos, que pueden ser utilizados para identificar moléculas que interaccionan con secuencias de proteínas 36P6D5, están descritos, por ejemplo, en las Patente de EE.UU. Nos.
5.723.286 y 5.733.731.
Alternativamente, pueden utilizarse para identificar interacciones de proteína-proteína mediadas por 36P6D5, líneas celulares que expresan 36P6D5. Esta posibilidad puede ser examinada utilizando técnica de inmunoprecipitación tales como las indicadas por otros (Hamilton, BJ. et al., en Biochem. Biophys. Res. Commun. 261:646-51, 1999) Típicamente, la proteína 36P6D5 puede ser inmunoprecipitada partiendo de líneas celulares de cáncer de próstata que expresan 36P6D5 usando anticuerpos anti-36P6D5. Alternativamente, pueden usarse anticuerpos contra His-tag en una línea celular obtenida para expresar 36P6D5 (vectores antes citados). El complejo inmunoprecipitado puede ser examinado para determinar la asociación de proteínas mediante procedimientos operatorios tales como transferencia Western, marcado de proteínas con 35S-metionina, microsecuenciación de proteínas. tinción con plata y electroforesis bidimensional en gel.
Moléculas pequeñas que interaccionan con 36P6D5 pueden ser identificadas por medio de realizaciones afines de tales ensayos de exploración. Por ejemplo, pueden identificarse moléculas pequeñas que interfieren con la función de proteínas, incluyendo moléculas que interfieren con la aptitud de 36P6D5 para mediar en la fosforilación y desfosforilación, señalización de segundo mensajero y tumorigénesis. Métodos típicos se discuten, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. No. 5.928.868 e incluyen métodos de formación de ligandos híbridos en los que al menos un ligando es una molécula pequeña. En una realización alternativa, el ligando híbrido es introducido en células que contienen, a su vez, un primer y un segundo vector de expresión. Cada vector de expresión incluye DNA para expresar una proteína híbrida que codifica una proteína diana ligada a una secuencia codificante de un módulo de la transcripción. Las células contienen, además, un gen informador, cuya expresión esta condicionada a la proximidad de la primera y segunda proteínas híbridas, una con otra, un acontecimiento que ocurre solamente si el ligando híbrido se une a sitios diana sobre ambas proteínas híbridas. Aquellas células que expresan en gen informador son seleccionadas e identificada la molécula pequeña desconocida o la proteína híbrida desconocida.
Una realización típica de la invención consiste en un método de selección de una molécula que interacciona con la secuencia de aminoácidos de 36P6D5, indicada en la FIG. 1 (SEQ ID NO:2), que comprende las etapas de poner en contacto una población de moléculas con la secuencia de aminoácidos de 36P6D5, dejar que la población de moléculas y la secuencia de aminoácidos de 36P6D5 interaccionen en condiciones que faciliten la interacción, determinar la presencia de una molécula que interacciona con la secuencia de aminoácidos de 36P6D5 y después separar las moléculas que no interaccionan con la secuencia de aminoácidos de 36P6D5, de las moléculas que interaccionan con la secuencia de aminoácidos de 36P6D5. En una realización específica, el método incluye, además, purificar una molécula que interacciona con la secuencia de aminoácidos de 36P6D5. En una realización preferida, la secuencia de aminoácidos de 36P6D5 se pone en contacto con una colección de péptidos.
USO DE 36P6D5 PARA MODULAR MICROAMBIENTES CELULARES
Se han descrito una diversidad de proteínas secretadas en el cáncer de próstata, muchas de las cuales se ha mostrado que participan en el proceso de formación y progresión de tumores. (Inoue K. en Clin. Cancer Res. 6:2104-19, 2000; Dow JK, de Vere White RW, Urology. 55:800-6, 2000). En el proceso de progresión tumoral, las células cancerosas secretan y expresan moléculas que las permiten crecer tanto en el microambiente de la próstata local, como en el microambiente óseo. Una característica única del cáncer de próstata es que en el proceso de progresión del tumor, las células cancerosas llegan a ser metastásicas en el hueso y estudios recientes sugieren que esta predilección para metastasizarse en el hueso está basada en la capacidad de las células del cáncer de próstata para secretar y expresar moléculas que las permiten crecer en el microambiente óseo (Koeneman KS, Young F, Chung LW. en Prostate 39:246, 1999). A este respecto, los datos que aquí se presentan (véanse, por ejemplo, las Figuras 8 y 9) sugieren que la proteína 36P6D5 desempeña un papel importante (1) en dirigir células prostáticas hacia el hueso; (2) permitir el crecimiento de células prostáticas en el microambiente óseo; (3) inducir la diferenciación de células tumorales prostáticas o células de la médula ósea en los osteoblastos; o (4) apoyar la interacción de estromas óseos con células de cánceres de próstata creando con ello un medio ambiente favorables para el crecimiento de células cancerosas. Por consiguiente, esta molécula puede ser usada en métodos para acondicionar medios y/o simular el microambiente en el que las células del cáncer de próstata pueden metastasizarse.
Con objeto de ensayar la posibilidad de que la proteína 36P6D5 interaccione con células situadas normalmente en la próstata y en microambientes óseos, la proteína 36P6D5 fue expresada en forma de una proteína recombinante (pTag5 36P6D5). La proteína 36P6D5 recombinante, purificada. fue incubada luego con una diversidad de tipos de células relevantes, con inclusión de células epiteliales prostáticas, líneas celulares de tumores de próstata, y células estromales de ósteosarcomas y óseas. La unión de 36P6D5 a células intactas es detectada mediante análisis FACS y mediante ensayo calorimétrico. Los estudios de los presentes inventores han indicado que, cuando la proteína de fusión AP 36P6D5 recombinante es incubada en presencia de células de cáncer de próstata derivadas de xenotrasplantes de LAPC4 y LAPC9, se une a células de xenotrasplantes de LAPC9 y LAPC4. La unión de 36P6D5 a la superficie celular fue detectada usando el cambio calorimétrico del sustrato AP (Figura 8). Por el contrario, no se observó conversión de color cuando las células fueron incubadas con el testigo apropiado. Este análisis es valioso, dado que identifica una población celular que se une y que puede responder a 36P6D5. Además, la identificación de una población de células diana puede proporcionar medios para aislar e identificar receptores de 36P6D5. Esta información puede usarse en una diversidad de aplicaciones terapéuticas y de diseño de moléculas pequeñas.
Utilizando los datos presentados en esta memoria (véase, por ejemplo, la Figura 8), pueden emplearse métodos para modular fenotipos de células cancerosas y analizar cuidadosamente las diferentes fases de metástasis reproduciendo el microambiente de la próstata local en el que se originan las células cancerosas, así como el microambiente celular metastásico, generando con ello un modelo de cáncer en el que los técnicos pueden experimentar nuevas composiciones y nuevos métodos terapéuticos y de diagnóstico. Un método ilustrativo consiste en modular el microambiente de una célula por exposición de la célula a un polipéptido de 36P6D5 de modo que el polipéptido se una a la célula, modulando con ello el microambiente de la célula. Un método relacionado en este contexto, consiste en modular el microambiente de una célula por exposición de la célula a una molécula que interacciona con un polipéptido de 36P6D5 (tal como un anticuerpo anti-36P6D5) que inhibe o facilita la unión del polipéptido a la célula, modulando con ello el microambiente de la célula. Tales métodos para generar o modular un medio microambiental específico satisfacen la necesidad existente en la técnica de generar una diversidad de microambientes basándose en observaciones de que las células cancerosas (incluyendo las células del cáncer de próstata) son reguladas diferencialmente dependiendo de los factores presentes en el microambiente celular (véase, por ejemplo, la publicación de Levesque et al., en Endocrinology, 139(5): 2375-2381 (1998)). Por consiguiente, la identificación de proteínas 36P6D5 como moléculas que son secretadas por las células y unidas a células del microambiente, permite a los técnicos experimentados usar esta información para incluir y/o manipular 36P6D5 en contextos que reproducen y modulan más fielmente los acontecimientos que ocurren en la progresión de cánceres.
Varios experimentos pueden designarse para investigar cómo la proteína 36P6D5 puede contribuir al crecimiento de células del cáncer de próstata. En un primer conjunto típico de experimentos, se incuban células epiteliales de cáncer de próstata, en presencia o ausencia de 36P6D5 recombinante, y se evalúan para determinar la proliferación usando un ensayo calorimétrico bien documentado. En paralelo, células PC3 obtenidas para expresar de modo estable 36P6D5 son evaluadas por el potencial de crecimiento celular. En un segundo conjunto, típico, de experimentos, células de cáncer de próstata consideradas diana, tales como células PC obtenidas para expresar la Proteína Fluorescente de Color Verde (GFP), son cultivadas en presencia de células estromales óseas. Las células son incubadas en presencia o ausencia de 36P6D5 recombinante y evaluadas para determinar el crecimiento celular, midiendo el aumento de GFP.
Usando la descripción aquí proporcionada, es posible examinar el papel de 36P6D5 en la metástasis ósea. Con objeto de determinar si la proteína 36P6D5 induce a las células prostáticas a llegar a ser osteomiméticas, células prostáticas primarias, así como también líneas celulares, pueden cultivarse en presencia o ausencia de 36P6D5 recombinante. Las células pueden ser examinadas después para determinar la expresión de marcadores precoces y tardíos de maduración ósea, con inclusión de ósteonectina, ósteopontina, fosfatasa alcalina y ósteocalcina. También puede determinarse si la proteína 36P6D5 induce la expresión de factores de crecimiento que soportan el crecimiento de células prostáticas en un microambiente tradicionalmente protector tal como el hueso. Las técnicas de PCR y de ensayo ELISA pueden ser utilizadas para investigar la expresión y secreción de FGF, HGF e IGF en células cultivadas en presencia o ausencia de 36P6D5 recombinante. Experimentos similares pueden ser llevados a cabo usando células de médula ósea para determinar si la proteína 36P6D5 induce la diferenciación de progenitores de condrocitos a osteocitos maduros.. Estos experimentos pueden tener valor para demostrar el papel de 36P6D5 para apoyar la creación de un medio ambiente favorable para el crecimiento del cáncer de próstata en el hueso, e identificar dianas para una intervención terapéutica.
Usando la descripción proporcionada en esta memoria, es posible examinar el papel de 36P6D5 en la interacción de Célula-Célula. Es posible que la proteína 36P6D5 desempeñe un papel en el reclutamiento de células prostáticas hacia el hueso, al intensificar la interacción de las células prostáticas con las células estromales o los osteocitos. Células de cáncer de próstata que expresan GFP pueden ser cultivadas en presencia o ausencia de la proteína 36P6D5 recombinante. Las células GFP pueden ser incubadas con un testigo o con células estromales tratadas con 36P6D5 y osteocitos, durante diversos períodos de tiempo. Las células no adheridas pueden ser separadas y la adherencia al estroma y a osteocitos puede ser evaluada midiendo la cantidad de GFP en el cultivo. Este resultado puede ser crítico en la consideración de inhibidores de factores que modulan el microambiente de la próstata local en el que se originan y crecen las células cancerosas, así como la colonización de sitios metastásicos por células cancerosas.
MÉTODOS TERAPÉUTICOS Y COMPOSICIONES TERAPÉUTICAS
La identificación de 36P6D5 como un gen que es altamente expresado en cánceres de la próstata (y posiblemente otros cánceres), abre muchos enfoques terapéuticos para el tratamiento de tales cánceres. Como se ha discutido antes, es posible que la proteína 36P6D5 sea secretada desde células cancerosas y de este modo module señales de proliferación. Su papel potencial como factor de transcripción y su alta expresión en el cáncer de próstata, la hace una diana potencial para el tratamiento terapéutico mediado por moléculas pequeñas.
Por consiguiente, los enfoques terapéuticos realizados con la intención de inhibir la actividad de la proteína 36P6D5, es de esperar que sean útiles para pacientes aquejados de cáncer de próstata y de otros cánceres que expresan 36P6D5. Estos enfoques terapéuticos realizados con la pretensión de inhibir la actividad de la proteína 36P6D5 están comprendidos, generalmente, en dos clases. Una clase comprende varios métodos de inhibición de la unión o asociación de la proteína 36P6D5 con su compañero de unión o con otras proteínas. Otra clase comprende una diversidad de métodos para inhibir la transcripción del gen 36P6D5 o la traducción del mRNA de 36P6D5.
36P6D5 como diana de una terapia basada en Anticuerpos
Las características estructurales de 36P6D5 indican que esta molécula es una diana interesante para estrategias terapéuticas a base de anticuerpos. Varias estrategias típicas con anticuerpos son conocidas en la técnica, para seleccionar como diana moléculas tanto extracelulares como intracelulares (véase, por ejemplo, muertes mediadas por complementos y ADCC así como el uso de intracuerpos que se discute más adelante). Debido a que la proteína 36P6D5 es expresada por células cancerosas de diversos linajes y no por las células normales correspondientes, pudiera esperarse que la administración sistémica de composiciones inmunorreactivas con 36P6D5 manifestaran una sensibilidad excelente sin efectos tóxicos, inespecíficos y/o efectos no-diana ocasionados por la unión de la molécula inmunoterapéutica a órganos y tejidos no diana. Anticuerpos específicamente reactivos con dominios de 36P6D5 pueden ser útiles para tratar sistémicamente cánceres que expresan 36P6D5, o bien como conjugados con una toxina o un agente terapéutico, o bien como anticuerpos desnudos capaces de inhibir la proliferación o la función celular.
Los anticuerpos de 36P6D5 pueden ser introducidos en un paciente de modo que el anticuerpo se una a 36P6D5 y module o perturbe una función tal como la interacción con un compañero de unión y, por consiguiente, media en la inhibición del crecimiento y/o la destrucción de las células y el tumor, y/o inhibe el crecimiento de las células o el tumor. Los mecanismos por los que tales anticuerpos ejercen un efecto terapéutico pueden incluir citólisis mediada por complementos, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, modulación de la función fisiológica de 36P6D5, inhibición de los caminos de unión de ligandos o de transducción de señales, modulación de diferenciación de células tumorales, alteración de los perfiles de factores de la angiogénesis tumoral, y/o por inducción de apoptosis. Los anticuerpos de 36P6D5 pueden ser conjugados a agentes tóxicos o terapéuticos y usarse para administrar el agente tóxico o terapéutico directamente a células tumorales que llevan 36P6D5. Como ejemplos de agentes tóxicos se incluyen, sin limitar a ellos, calchemicina, maitansinoides, radioisótopos tales como 131I, itrio y bismuto.
La inmunoterapia del cáncer usando anticuerpos anti-36P6D5 puede seguir las enseñanzas generadas partiendo de diversos enfoques que han sido empleados con éxito en el tratamiento de otros tipos de cáncer, que incluye, sin limitarse a ellos, el cáncer de colon. (Arlen et al., Crit. Rev. Immunol. 18:133138, 1998), el mieloma múltiple (Ozaki et al, Blood 90:3179-3186, 1997; Tsunenari et al., Blood 90:2437-2444, 1997), el cáncer gástrico (Kasprzyk et al., Cancer Res, 52:2771-2776, 1992), el linfoma de células B (Funakoshi et al., J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19:93-101, 1996), la leucemia (Zhong et al, Leuk. Res. 20:581-589, 1996), el cáncer colorrectal (Moun et al., Cancer Res. 54:6160-6166, 1994; Valders et al., Cancer Res. 55:4398-4403, 1995) y el cáncer de mama (Sheperd et al., J. Clin. Immunol. 11:117-127, 1991). Algunos enfoques terapéuticos implican conjugación de anticuerpo desnudo a una toxina, tal como la conjugación de 131I a anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, Rituxanϕ, IDEC Pharmaceuticals Corp.), si bien otros implican la administración conjunta de anticuerpos y otros agentes terapéuticos tales como Herceptinϕ (trastuzumab) con paclitaxel (Genentech, Inc.). Para el tratamiento del cáncer de próstata, por ejemplo, pueden administrarse anticuerpos de 36P6D5 en conjunción con radiación, quimioterapia o ablación hormonal.
Aun cuando la terapia con anticuerpos de 36P6D5 puede ser útil para todas las etapas del cáncer, la terapia con anticuerpos puede ser particularmente apropiada en cánceres avanzados o metastásicos. El tratamiento con la terapia de anticuerpos de la invención, puede estar indicada para pacientes que hayan recibido previamente uno o más tratamientos quimioterápicos, aun cuando puede preferirse la combinación de la terapia con anticuerpos, de la invención, con un régimen quimioterápico o de radiación, para pacientes que no hayan recibido tratamiento quimioterápico. Adicionalmente, la terapia con anticuerpos puede permitir el uso de dosis reducidas de quimioterapia simultánea, en particular para pacientes que no toleren muy bien la toxicidad del agente quimioterápico.
Puede ser deseable para algunos pacientes de cáncer ser evaluados para determinar la presencia y el nivel de expresión de 36P6D5, preferiblemente usando valoraciones inmunohistoquímicas de tejido tumoral, formación cuantitativa de imágenes de 36P6D5 u otras técnicas capaces de indicar de modo fidedigno la presencia y el grado de expresión de 36P6D5. El análisis inmunohistoquímico de biopsias de tumores o de muestras quirúrgicas puede ser preferido para esta finalidad. Métodos de análisis inmunohistoquímico de tejidos tumorales son bien conocidos en la técnica.
Los anticuerpos monoclonales anti-36P6D5, útiles para tratar el cáncer de próstata y otros cánceres, incluyen aquellos capaces de iniciar una respuesta inmunitaria potente contra el tumor y aquellos capaces de citotoxicidad directa. A este respecto, los anticuerpos monoclonales (mAbs) anti-36P6D5 pueden provocar lisis de las células tumorales o bien mediante mecanismos de citotoxicidad mediados por complemento o bien de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), ambos de los cuales requieren una parte Fc intacta de la molécula de inmunoglobulina para interacción con sitios de receptor Fc de células efectoras o proteínas de complemento. Además, los mAbs anti-36P6D5 que ejercen un efecto biológico directo sobre el crecimiento tumoral, son útiles en la práctica de la invención. Los mecanismos potenciales mediante los que tales mAbs directamente citotóxicos pueden actuar, incluyen inhibición del crecimiento celular, modulación de la diferenciación celular, modulación de perfiles de factores de angiogénesis tumoral y la inducción de apoptosis. El mecanismo mediante el que un mAb anti-36P6D5 particular ejerce un efecto anti-tumoral, puede ser evaluado usando diversos ensayos in vitro designados para determinar ADCC, ADMMC, lisis celular mediada por complementos, y así sucesivamente, como es conocido en general en la técnica.
El uso de anticuerpos monoclonales murinos u otros no humanos, o mAbs quiméricos humano/ratón, puede inducir en algunos pacientes respuestas inmunitarias de moderadas a fuertes. En algunos casos, esto puede dar como resultado la separación del anticuerpo desde la circulación y disminución de la eficacia. En los casos más graves, una respuesta inmunitaria tal puede llevar a una formación extensa de complejos inmunitarios que, potencialmente, pueden ocasionar fallo renal. Por consiguiente, los anticuerpos monoclonales preferidos usados en la práctica de los métodos terapéuticos de invención, son aquellos que o bien son totalmente humanos o bien han sido humanizados y que se unen específicamente al antígeno de 36P6D5 diana con alta afinidad pero que manifiesta baja antigenicidad o ninguna antigenicidad en el paciente.
Los métodos terapéuticos de la invención contemplan la administración de mAbs anti-36P6D5 sencillos y también combinaciones o “cócteles” de mAbs diferentes. Tales “cócteles” de mAbs pueden tener ciertas ventajas dado que contienen mAbs con diferentes epítopos diana, ejercen diferentes mecanismos efectores o combinan, directamente, mAbs citotóxicos con mAbs que se basan en una funcionalidad efectora inmunitaria. Tales mAbs, en combinación, pueden poner de manifiesto efectos terapéuticos sinérgicos. Además, la administración de mAbs anti-36P6D5 puede combinarse con otros agentes terapéuticos, que incluyen, pero sin limitar a ellos, diversos agentes quimioterápicos, bloqueantes androgénicos, y moduladores inmunitarios (por ejemplo, IL-2, GM-CSF). Los mAbs anti-36P6D5 pueden ser administrados en su forma “desnuda” o en su forma conjugada, o pueden tener conjugados con ellos agentes terapéuticos.
Las formulaciones de anticuerpos anti-36P6D5 pueden administrarse mediante cualquier vía capaz de distribuir los anticuerpos al sitio del tumor. Las vías de administración potencialmente eficaces incluye, pero sin limitar a ellas, las vías intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica, y semejantes. El tratamiento implica, en general, la administración repetida de la preparación del anticuerpo anti-36P6D5 mediante una vía de administración aceptable tal como por inyección intravenosa (IV), típicamente a una dosis en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg de peso. Las dosis en el intervalo de 10-500 mg de mAb por semana, pueden ser eficaces y bien toleradas.
Basándose en la experiencia clínica con el mAb Herceptin en el tratamiento de cáncer de mama metastásico, una dosis inicial de carga de aproximadamente 4 mg/kg de peso del paciente por vía IV, seguido de dosis semanales de aproximadamente 2 mg/kg IV de la preparación de mAb anti-36P6D5, puede representar un régimen de dosificación aceptable. Preferiblemente, la dosis de carga inicial se administra en forma de una infusión durante 90 minutos o más. Las dosis periódicas de mantenimiento pueden administrarse en forma de una infusión durante 30 minutos o más, con tal que la dosis inicial haya sido bien tolerada. No obstante, como entenderán los expertos en la técnica, factores diversos pueden influir en el régimen ideal de dosificación en un caso particular. Tales factores pueden incluir, por ejemplo, la afinidad de unión y la semivida del Ab o mAbs utilizado, el grado de expresión de 36P6D5 en el paciente, la extensión del antígeno de 36P6D5 vertido, en circulación, el nivel de concentración del anticuerpos en estado estacionario deseado, la frecuencia de tratamiento y la influencia de los agentes quimioterápicos usados en combinación con el método de tratamiento de la invención.
Optimamente, los pacientes podrían ser evaluados para determinar el nivel de antígeno de 36P6D5 vertido, en circulación, en el suero con objeto de ayudar a la determinación del régimen de dosificación de la máxima eficacia y de factores afines. Tales evaluaciones pueden usarse también con fines de monitorización durante toda la terapia, y pueden ser útiles para calibrar el éxito terapéutico en combinación con la evaluación de otros parámetros (tales como los niveles del PSA sérico en la terapia del cáncer de próstata).
Inhibición de la función de la proteína 36P6D5
La invención incluye diversos métodos y composiciones para inhibir la unión de 36P6D5 a su compañero o ligando de unión, o su asociación con otra u otras proteínas así como métodos para inhibir la función de 36P6D5.
Inhibición de 36P6D5 con anticuerpos intracelulares
En un enfoque, vectores recombinantes que codifican anticuerpos de una sola cadena que se unen específicamente a 36P6D5, pueden ser introducidos en células que expresan 36P6D5 mediante tecnologías de transferencia génica, en la que el anticuerpo anti-36P6D5 de una sola cadena codificado es expresado intracelularmente, se une a la proteína 36P6D5 y con ello inhibe su función. Métodos de preparación de tales anticuerpos de una sola cadena, intracelulares, son bien conocidos. Tales anticuerpos intracelulares, conocidos también como “intracuerpos”, pueden ser específicamente dirigidos hacia un compartimento particular dentro de la célula, proporcionando control sobre donde ha de enfocarse la actividad inhibitoria del tratamiento. Esta tecnología ha sido aplicada con éxito en la técnica (para una revisión, véase la publicación de Richardson y Marasco, en TIBTECH, vol. 13, 1995). Se han indicado intracuerpos que eliminan virtualmente la expresión de receptores de la superficie celular abundantes por otra parte. Véase, por ejemplo, la publicación de Richardson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3137-3141, 1995; y de Beeth et al., J. Biol. Chem. 289:23931-23936, 1994; y de Deshane et a., Gene Ther. 1:332-337, 1994.
Los anticuerpos de una sola cadena comprenden los dominios variables de la cadena pesada y ligera unidos por un polipéptido de enlace flexible, y son expresados como un polipéptido único. Opcionalmente, los anticuerpos de una sola cadena pueden ser expresados en forma de un fragmento de la región variable de una sola cadena, unido a la región constante de la cadena ligera. Señales de movimientos intracelulares bien conocidas pueden ser construidas en vectores de polinucleótidos recombinantes que codifican tales anticuerpos de una sola cadena con objeto de que el intracuerpo expresado haga diana, con precisión, en el compartimento intracelular deseado. Por ejemplo, intracuerpos destinados a alcanzar el retículo endoplásmico (ER) pueden ser obtenidos para incorporar un péptido conductor y, opcionalmente, una señal de retención de ER del extremo C-terminal, tal como el motivo de aminoácido KDEL. Los intracuerpos destinados a ejercer actividad en el núcleo, pueden ser obtenidos para incluir una señal de localización nuclear. Moléculas de lípidos pueden unirse a los intracuerpos con objeto de fijar el intracuerpo al lado citosólico de la membrana plasmática. También pueden obtenerse intracuerpos para ejercer su función en el citosol. Por ejemplo, pueden usarse intracuerpos citosólicos para secuestrar factores del interior del citosol, evitando con ello que sean transportados a su destino celular natural.
En una realización, pueden usarse intracuerpos para capturar 36P6D5 del el núcleo, evitando con ello su actividad dentro del núcleo. Pueden obtenerse señales dirigidas hacia el núcleo en tales intracuerpos de 36P6D5 con objeto de conseguir el alcance deseado. Tales intracuerpos de 36P6D5 pueden ser diseñados para que se unan específicamente a un dominio particular de 36P6D5. En otra realización, pueden usarse intracuerpos citosólicos que se unen específicamente a la proteína 36P6D5, para evitar que la proteína 36P6D5 gane acceso al núcleo, evitando con ello que ejerza actividad biológica dentro del núcleo (por ejemplo, evitando que la proteína 36P6D5 forme complejos de transcripción con otros factores).
Con objeto de dirigir específicamente la expresión de tales intracuerpos hacia células tumorales particulares, la transcripción del intracuerpo puede ser colocada bajo el control regulador de un promotor y/o un intensificador apropiado, específico de tumores. Con objeto de dirigir específicamente la expresión de anticuerpos hacia la próstata, puede utilizarse, por ejemplo, el promotor y/o promotor/intensificador del PSA. (Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. No. 5.919.652).
Inhibición de 36P6D5 con proteínas recombinantes
En otro enfoque, se usan moléculas recombinantes capaces de unirse a 36P6D5 evitando con ello que la proteína 36P6D5 acceda/se una a su acompañante o acompañantes de unión o se asocie a otra u otras proteínas, para inhibir la función de 36P6D5. Tales moléculas recombinantes pueden contener, por ejemplo, la parte o partes reactivas de una molécula de un anticuerpo de 36P6D5. En una realización particular, el dominio de unión de 36P6D5 de un acompañante de unión de 36P6D5 puede ser construido en un proteína de fusión dimérica que comprende dos dominios de unión de ligandos de 36P6D5 enlazados a la parte Fc de una IgG humana, tal como IgG1 humana. Tal parte de IgG puede contener, por ejemplo, los dominios CH2 y CH3 y la región de la rótula, pero no el dominio CH1. Tales proteínas de fusión diméricas pueden ser administradas en forma soluble a pacientes aquejados de un cáncer asociado con la expresión de 36P6D5, con inclusión pero sin limitar, a cánceres de próstata, vejiga, ovarios, mama, páncreas, colon y pulmón, en donde la proteína de fusión dimérica se une específicamente a 36P6D5 bloqueando con ello la interacción de 36P6D5 con un compañero de la unión. Tales proteínas de fusión diméricas pueden combinarse, además ,en proteína multiméricas usando tecnologías conocidas de unión de anticuerpos.
Inhibición de la transcripción o traducción de 36P6D5
Dentro de otra clase de enfoques terapéuticos, la invención proporciona varios métodos y composiciones para inhibir la transcripción del gen 36P6D5. De modo semejante, la invención proporciona también métodos y composiciones para inhibir la traducción de mRNA de 36P6D5 en proteína.
En un enfoque, un método de inhibición de la transcripción del gen de 36P6D5 comprende poner en contacto el gen 36P6D5 con un polinucleótido antisentido de 36P6D5. En otro enfoque, un método de inhibición de la traducción del mRNA de 36P6D5 comprende poner en contacto el mRNA de 36P6D5 con un polinucleótido antisentido. En otro enfoque, puede usarse una ribozima específica de 36P6D5, para hender el mensaje de 36P6D5, inhibiendo con ello la traducción. Tales métodos basados en antisentidos y ribozimas pueden dirigirse también a las regiones reguladoras del gen 36P6D5, tales como el sitio de iniciación de 36P6D5, o elementos promotores y/o intensificadores. De modo semejante, pueden usarse proteínas capaces de inhibir un factor de la transcripción génica de 36P6D5, para inhibir la transcripción de mRNA de 36P6D5. Los diversos polinucleótidos y composiciones útiles en los métodos anteriormente citados, han sido descritos anteriormente. En otro enfoque, puede inhibirse la traducción del gen 36P6D5 usando tecnología antisentido de morfolino. El uso de moléculas antisentido y de ribozimas para inhibir la transcripción y la traducción, es bien conocido en la técnica.
Otros factores que inhiben la transcripción de 36P6D5 mediante la interferencia con la activación de la transcripción de 36P6D5, pueden ser útiles también para el tratamiento de cánceres que expresan 36P6D5. De modo semejante, pueden ser útiles factores que son capaces de interferir con el procesamiento de 36P6D5, para el tratamiento de cánceres que expresan 36P6D5. Métodos de tratamiento de cánceres que utilizan tales factores están también dentro del alcance de la invención.
Consideraciones generales acerca de estrategias terapéuticas
Tecnologías de transferencia génicas y de terapia génica pueden usarse para distribuir moléculas de polinucleótidos terapéuticos a células tumorales que sintetizan 36P6D5 (es decir, moléculas antisentido, moléculas de ribozimas, de polinucleótidos que codifican intracuerpos, y otras moléculas inhibidoras de 36P6D5). Varios enfoques de terapia génica son conocidos en la técnica. Vectores recombinantes que codifican polinucleótidos antisentido de 36P6D5, ribozimas, factores capaces de interferir con la transcripción de 36P6D5, y así sucesivamente, pueden ser hechos llegar a células tumorales elegidas como diana usando tales enfoques de terapia génica.
Los enfoques terapéuticos anteriores pueden combinarse con uno cualquiera de una amplia variedad de regímenes terapéuticos de quimioterapia
o de radiaciones. Estos enfoques terapéuticos pueden permitir también el uso de dosis reducidas de quimioterapia y/o de administraciones menos frecuentes, en particular en pacientes que no toleran bien la toxicidad del agente quimioterápico.
La actividad antitumoral de una composición particular (por ejemplo, antisentido, ribozima, intracuerpo), o de una combinación de tales composiciones, puede evaluarse usando diversos sistemas de ensayo in vitro e in vivo. Los ensayos in vitro para evaluar el potencial terapéutico incluyen ensayos de crecimiento celular, ensayos en agar blando y otros ensayos indicativos de una actividad favorecedora de tumores, ensayos de unión capaces de determinar la extensión en que una composición terapéutica puede inhibir la unión de 36P6D5 a un compañero de unión, etc.
In vivo, el efecto de una composición terapéutica de 36P6D5 puede evaluarse en un modelo animal adecuado. Por ejemplo, modelos de cáncer de próstata xenógeno en los que en los que explantes de cánceres de próstata o tejidos de paso de xenotrasplantes, humanos, son introducidos en animales inmunes comprometidos, tales como ratones SCID desprovistos de sistema inmunitario, son apropiados con respecto al cáncer de próstata y han sido descritos (Klein et al., Nature Medicine 3:402-408, 1997). Por ejemplo, la Solicitud de Patente PCT WO98/16628 a Sawyer et al., publicada el 23 de Abril de 1998, describe varios modelos de xenotrasplantes de cáncer de próstata humano, capaces de recapitular el desarrollo de tumores primarios, micrometástasis y la formación de metástasis osteoblásticas características de una enfermedad en fase tardía. Su eficacia puede predecirse usando ensayos que miden la inhibición de formación de tumores, regresión o metástasis de tumores, y semejantes. Véanse también, los Ejemplos que figuran más adelante.
También pueden ser útiles para evaluar composiciones terapéuticas potenciales ensayos in vivo que califican la promoción de apoptosis. En una realización, xenotrasplantes procedentes de ratones portadores tratados con la composición terapéutica, pueden ser examinados para determinar la presencia de focos apoptósicos y comparados con ratones testigo que llevan xenotrasplantes, sin tratar. La extensión en que se encuentran los focos apoptósicos en los tumores de los ratones tratados proporciona una indicación de la eficacia terapéutica de la composición.
Las composiciones terapéuticas usadas en la práctica de los métodos anteriores pueden ser formuladas en forma de composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo o excipiente adecuado para el método de distribución deseado. Los vehículos o excipientes adecuados incluyen cualquier material que cuando se combina con la composición terapéutica retiene la función antitumoral de la composición terapéutica y que no es reactivo son el sistema inmunitario del paciente. Sus ejemplos incluyen, pero sin limitar, cualquiera de muchos vehículos o excipientes farmacéuticos estándar tales como soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua bacteriostática y semejantes (véase, en general, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16ª Ed., A. Osal., Compilador, 1980).
Las formulaciones terapéuticas pueden solubilizarse y administrarse por cualquier vía adecuada capaz de hacer llegar la composición terapéutica al sitio del tumor. Vías de administración potencialmente eficaces incluyen, pero sin limitación, las vías intravenosa, parenteral, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica, intraorgánica, ortoptópica y semejantes. Una formulación preferida para inyección intravenosa comprende la composición terapéutica en una disolución de agua bacteriostática preservada, agua estéril sin preservar, y/o diluida en bolsas de policloruro de vinilo o de polietileno que contienen Cloruro Sódico para Inyección, de la Farmacopea de EE.UU., al 0,9%. Las preparaciones terapéuticas de proteínas pueden ser liofilizadas y mantenidas como polvos estériles, preferiblemente en vacío, y reconstituidas luego con agua bacteriostática que contiene, por ejemplo, alcohol bencílico como conservante, o con agua estéril antes de la inyección.
Los protocolos de dosis y de administración para el tratamiento de cánceres usando los métodos anteriores, pueden variar con el método y el cáncer considerado objetivo, y, en general, dependerá de otros varios factores apreciados en la técnica.
VACUNAS DE CÁNCER
Como se ha indicado anteriormente, el perfil de la expresión de 36P6D5 indica que ésta es expresada altamente en el cáncer de próstata avanzado y metastasizado. Este esquema de expresión es reminiscente de los antígenos de Testículos Cancerosos (CT) o MAGEs, que son genes específicos de testículos que están regulados en ascenso en melanomas y otros cánceres (Van den Eynde y Boon, Int. J. Clin. Lab. Res. 27:81-86, 1997). Debido a su expresión específica del tejido, y los altos niveles de expresión en el cáncer, los MAGEs están siendo investigados actualmente como objetivos de vacunas del cáncer (Durrant, Anticancer Drugs, 8:727-733, 1997; Reynolds et al., Int. J. Cancer, 72:972-976, 1997).
La invención proporciona, además, vacunas de cáncer que comprenden una proteína 36P6D5 o uno de sus fragmentos, así como vacunas a base de DNA. A la vista de la expresión de 36P6D5 es de esperar que las vacunas de cáncer sean eficaces para prevenir y/o tratar, específicamente, cánceres que expresan 36P6D5 sin crear efectos inespecíficos sobre tejidos no considerados dianas. El uso de un antígeno tumoral en una vacuna para generar inmunidad humoral y mediada por células, para usar en la terapia anticancerosa, es bien conocido en la técnica y ha sido empleado en el cáncer de próstata usando inmunógenos de PSMA humano y de PAP de roedor (Hodge et al., Int. J. Cancer, 63:231-237, 1995; Fong et al., J. Immunol. 159-3113-3117, 1997). Tales métodos pueden ser puestos en práctica fácilmente empleando una proteína 36P6D5 o uno de sus fragmentos, o una molécula de ácido nucleico que codifica 36P6D5, y vectores recombinantes capaces de expresar y presentar apropiadamente el agente inmunógeno de 36P6D5. Un ejemplos ilustrativo de una técnica típica consiste en un método de generación de una respuesta inmunitaria (por ejemplo, una respuesta humoral) en un mamífero, que comprende las etapas de exponer el sistema inmunitario del mamífero a un epítopo inmunorreactivo) (por ejemplo, un epítopo de la proteína 36P6D5 indicada en SEQ ID NO:2) de modo que el mamífero genere una respuesta inmunitaria que es específica para la que es generado el epítopo (por ejemplo, anticuerpos que reconocen específicamente ese epítopo).
Por ejemplo, pueden usarse sistemas de distribución génica viral para suministrar una molécula de ácidos nucleicos que codifica 36P6D5. Varios sistemas de distribución génica viral que pueden ser usados en la práctica de este aspecto de la invención incluyen, pero sin limitación, vacunas, virus de enfermedades pustulosas aviares, virus de enfermedades pustulosas de canarios, adenovirus, influenza, poliovirus, virus adeno-asociados, lentivirus y virus “sindbus” (Restifo, Curr. Opin. Immunol. 8:658-663, 1996).. También pueden emplearse sistemas de distribución no virales usando DNA desnudo que codifica una proteína 36P6D5 o uno de sus fragmentos, introducido en el paciente (por ejemplo, intramuscularmente) para inducir una respuesta antitumoral. En una realización, puede emplearse cDNA de 36P6D5 humano de longitud total. En otra realización pueden emplearse moléculas de ácidos nucleicos de 36P6D5 que codifican epítopos de linfocitos T citotóxicos (CTL). Los epítopos de CTL pueden determinarse usando algoritmos específicos (por ejemplo, Epimer, Brown University) para identificar péptidos dentro de una proteína 36P6D5 que son capaces de unirse óptimamente a alelos HLA especificados.
También pueden emplearse estrategias diversas ex vivo. Un enfoque implica el uso de células dendríticas para presentar antígeno de 36P6D5 al sistema inmunitario de un paciente. Las células dendríticas expresan clase I y clase II de MHC, coestimulador B7 e IL-12 y, por tanto, son células que presentan antígeno altamente especializadas. En el cáncer de próstata, células dendríticas autólogas pulsadas con péptidos del antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), se usan en un ensayo clínico de Fase I para estimular los sistemas inmunitarios de pacientes aquejados de cáncer de próstata (Tjoa et al., Prostate 28:65-69, 1996; Murphy et al., Prostate, 29:371380, 1996). Pueden usarse células dendríticas para presentar péptidos de 36P6D5 a células T en el contexto de moléculas MHC de clases I y II. En una realización, células dendríticas autólogas son pulsadas con péptidos de 36P6D5 capaces de unirse a moléculas MHC. En otra realización células dendríticas son pulsadas con la proteína 36P6D5 completa. Todavía, otra realización implica producir la sobreexpresión del gen 36P6D5 en células dendríticas usando diversos vectores de implementación conocidos en la técnica, tales como adenovirus (Arthur et al., Cancer Gene Ther., 4:17-25, 1997), retrovirus (Henderson et al., Cancer Res., 56:3763-3770, 1996), lentivirus, virus adeno-asociados, transfección de DNA (Ribas et al., Cancer Res., 57:2865-2869, 1997), y transfección de RNA derivado de tumores (Ashley et al., J. Exp. Med., 186:1177-1182, 1997). También pueden producirse células que expresan 36P6D5 para expresar moduladores inmunitarios, tales como GM-CSF, y usarse como agentes de inmunización.
También pueden usarse en la terapia anticancerosa, anticuerpos antiidiotípicos anti-36P6D5, como una vacuna para inducir una respuesta inmunitaria a células que expresan una proteína 36P6D5. Específicamente, la generación de anticuerpos anti-idiotípicos es bien conocida en la técnica y puede adaptase fácilmente para generar anticuerpos anti-idiotípicos anti36P6D5 que simulan un epítopo sobre una proteína 36P6D5 (véanse, por ejemplo, las publicaciones de Wagner et al., Hybridoma 16:33-40, 1997; Foon et al., J. Clin. Invest., 96:344-342, 1995; Herlyn et al., Cancer Immunol. Immunother., 43:65-76, 1996). Un anticuerpo anti-idiotípico tal puede ser usado en estrategias de vacunas de cáncer.
Pueden emplearse métodos de inmunización genéticos para generar respuestas inmunitarias profilácticas, o humorales y celulares terapéuticas, dirigidas contra células cancerosas que expresan 36P6D5. Las construcciones que comprenden DNA que codifica una proteína 36P6D5/inmunógeno y secuencias reguladoras apropiadas, pueden ser inyectadas directamente en el músculo o en la piel de un individuo, de modo que las células del músculo o de la piel admitan la construcción y expresen la proteína 36P6D5/inmunógeno codificado. La expresión del inmunógeno de la proteína 36P6D5 da como resultado la generación de inmunidad profiláctica o humoral y celular terapéutica, contra cánceres óseos, de colon, pancreáticos, de próstata, de riñón, de vejiga y de ovarios. Varios procedimientos de inmunización genética, profiláctica o terapéutica, conocidos en la técnica, pueden ser usados (para una revisión, véanse la información y las referencias bibliográficas publicadas en Internet, www.genweb.com).
COMPOSICIONES Y KITS DE DIAGNÓSTICO
Para usar en las aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas descritas o sugeridas anteriormente, también se proporcionan kits por la invención. Tales kits pueden comprender medios de soporte compartimentalizados para recibir en confinamiento estrecho uno o más medios de recipientes tales como viales, tubos y semejantes, cada uno de cuyos medios de recipientes comprende uno de los elementos separados para usar en el método. Por ejemplo, uno de los medios de recipientes puede comprender una sonda que es o que puede ser marcada detectablemente. Tal sonda puede ser un anticuerpo o un polinucleótido específico de una proteína 36P6D5 o un gen 36P6D5 o un mensaje, respectivamente. Cuando el kit utiliza hibridación de ácidos nucleicos para detectar el ácido nucleico elegido como blanco, el kit puede tener también recipientes que contienen un nucleótido o nucleótidos para amplificar la secuencia del ácido nucleico diana y/o un recipiente que comprende medios informadores, tales como una proteína de unión a biotina. tal como avidina o estreptavidina, unida a una molécula informadora, tal como una marca enzimática o fluorescente, o un radioisótopo.
El kit de la invención comprenderá, típicamente, el recipiente antes descrito y uno o más de otros recipientes que comprenden materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario. incluyendo sustancias tampón, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas e inserciones en el envase con instrucciones de uso. Una etiqueta puede estar presente en el recipiente para indicar que la composición ha de usarse para una aplicación específica, terapéutica o no terapéutica, y también puede indicar instrucciones para uso o bien in vivo o bien in vitro, tal como las descritas anteriormente.
Por consiguiente, la invención proporciona asimismo composiciones de diagnóstico que comprenden moléculas afines a 36P6D5. Tales moléculas incluyen los diversos polinucleótidos de 36P6D5, cebadores, sondas, proteínas, fragmentos y anticuerpos descritos en esta memoria. Las moléculas incluidas en la composición de diagnóstico pueden estar marcadas, opcionalmente, con un marcador detectable. Las composiciones de diagnóstico de 36P6D5 pueden comprender, además, tampones, diluyentes y otros ingredientes apropiados, según se desee.
EJEMPLOS
Varios aspectos de la invención son descritos e ilustrados adicionalmente, por medio de los diversos ejemplos que siguen, ninguno de los cuales está destinado a limitar el alcance de la invención.
EJEMPLO 1 AISLAMIENTO GENERADO POR SSH DE FRAGMENTOS DE cDNA DEL GEN 36P6D5
MATERIALES Y MÉTODOS Xenotrasplantes LAPC
Xenotrasplantes LAPC fueron obtenidos del Dr. Charles Sawyers (UCLA) y generados como se ha descrito (Klein et al., Nature Med., 3:402-408, 1997). Xenotrasplantes LAPC-4 dependientes de andrógenos (LAPC-4 AD) fueron cultivados subcutáneamente en ratones SCID machos y fueron pasados en forma de trozos pequeños de tejidos a machos receptores. Los xenotrasplantes LAPC-4 AD fueron cultivados intratibialmente del modo siguiente. Tejido tumoral de xenotrasplantes LAPC-4 AD cultivado subcutáneamente, fue cortado en secciones de 1-2 mm3 mientras el tejido era bañado en medio Iscoves 1X, el tejido cortado fue centrifugado luego a 1,3 K rpm durante 4 minutos, el sobrenadante se volvió a suspender en 10 ml de medio Iscoves 1X enfriado con hielo y se centrifugó a 1,3 K rpm durante 4 minutos. El pelet se resuspendió luego en Iscoves 1X con pronasa E al 1% y se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente con agitación suave de balanceo seguido de incubación sobre hielo durante 2-4 minutos. El filtrado se centrifugó a 1,3K rmp durante 4 minutos y la pronasa se separó del pelet aspirado por resuspensión en 10 ml de Iscoves y nueva centrifugación. Los grupos de células fueron extendidos después en placas en medio PrEGM y cultivados durante la noche. Luego las células fueron recolectadas, filtradas, lavadas con RPMI 2X, y sometidas a recuento. Aproximadamente 50.000 células fueron mezcladas con un volumen igual de Matrigel enfriado con hielo, sobre hielo, e inyectadas quirúrgicamente en la metáfisis tibial proximal de ratones SCID mediante una aguja de calibre 27. Al cabo de 10-12 semanas fueron recuperados tumores LAPC-4 que crecieron en la médula ósea.
Líneas celulares
Se obtuvieron líneas celulares humanas (por ejemplo, HeLa) de la ATCC y se mantuvieron en medio DMEM con suero fetal de ternera al 5%.
Aislamiento de RNA
Tejido y líneas celulares tumorales se homogeneizaron en reactivo Trizol (Life Technologies, Gibco BRL) usando 10 ml/g de tejido ó 10 ml/108 células para aislar RNA total. RNA de poli A fue purificado partiendo de RNA total usando los kits Mini y Midi de mRNA de Qiagen’s Oligotex. El RNA total y el mRNA fueron cuantificados mediante análisis espectrofotométricos (D.O. 260/280 nm) y analizados por electroforesis en gel.
Oligonucleótidos
Se utilizaron los oligonucleótidos que siguen, purificados mediante HPLC DPNCDN (cebador de síntesis de cDNA): 5’TTTTGATCAAGCTT303’ (SEQ ID NO: 3)
Adaptador 1: 5’CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAG3’ (SEQ ID NO: 4)
3’GGCCCGTCCTAG5’ (SEQ ID NO: 5).
Adaptador 2: 5’GTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAG3’ (SEQ ID NO: 6
3’CGGCTCCTAG5’ (SEQ ID NO:7)
Cebador 1 de PCR: 5’CTAATACGACTCACTATAGGGC3’ (SEQ ID NO:8)
Cebador encajado (NP) 1:
5’TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGA3’ (SEQ ID NO:9)
Cebador encajado (NP)2:
5’AGCGTGGTCGCGGCCGAGGA3’ (SEQ ID NO:10) Hibridación Substractiva de Supresión
Se uso Hibridación Substractiva de Supresión (SSH) para identificar cDNAs que correspondían a genes que pueden ser expresados diferencialmente en el cáncer de próstata. La reacción SSH utilizó cDNA procedente de xenotrasplantes LAPC-4 AD cultivados en dos medios ambientes diferentes, a saber, los medios ambiente de crecimiento subcutáneo (“LAPC-4 AD SQ”) e intratibial (“LAPC-4 AD IT”), en donde el xenotrasplante LAPC-4 AD IT se usó como la fuente del cDNA “ensayador”, mientras que el xenotrasplante LAPC-4 AD SQ se usó como la fuente del cDNA “conductor”.
cDNAs bicatenarios que correspondían a los cDNAs ensayador y conductor fueron sintetizados partiendo de 2 µg de poli(A)+ RNA aislado desde el tejido de xenotrasplante relevante, según se ha descrito anteriormente, usando el Kit de Substracción de cDNA PCR-Select de CLONTECH y 1 ng del oligonucleótido DPNCDN como cebador. Las síntesis de la primera y la segunda cadenas fueron llevadas a cabo según se describía en el protocolo del manual de usuarios del Kit (CLONTECH, Protocolo No. PT1117-1, No. de Catálogo K1804-1). El cDNA resultante fue sometido a digestión con Dpn II durante 3 horas, a 37ºC. El cDNA digerido se extrajo con fenol/cloroformo (1:1) y precipitado con etanol
Se generó cDNA conductor combinando cDNA digerido con Dpn II, procedente de las líneas celulares humanas HeLa, 293, A431, Colo205, e hígado de ratón. El cDNA ensayador fue generado diluyendo 1 µl de cDNA digerido con Dpn II procedente de la fuente de xenotrasplante relevante (véase lo anterior) (400 ng) en 5 µl de agua. El cDNA diluido (2 µl, 160 ng) fue ligado luego a 2 µl de Adaptador 1 y Adaptador 2 (10 µM), en reacciones de ligación separadas, en un volumen total de 10 µl a 16ºC, durante la noche, usando 400 u de DNA ligasa T4 (CLONTECH). La ligación se terminó con 1 µl de EDTA 0,2 M y calentando a 72ºC durante 5 minutos.
La primera hibridación se llevó a cabo añadiendo 1,5 µl (600 ng) de cDNA conductor a cada uno de dos tubos que contenían 1,5 µl (20 ng) de cDNA ensayador ligado a Adaptador 1 y Adaptador 2. En un volumen final de 4 µl las muestras fueron cubiertas con aceite mineral, desnaturalizadas en un ciclador térmico de MJ Research a 98ºC durante 1,5 minutos, y después se dejaron hibridar durante 8 horas a 68ºC. Las dos hibridaciones fueron mezcladas luego junto con 1 µl adicional de cDNA conductor desnaturalizado, de nueva aportación, y se dejaron hibridar durante la noche a 68ºC. La segunda hibridación se diluyó después en 200 µl de Hepes 20 mM, pH 8,3, NaCl 50 mM, EDTA 0,2 mM, se calentó a 70ºC durante 7 minutos y se almacenó a –20ºC
Amplificación por PCR, clonación y secuenciación de fragmentos génicos generados a partir de SSH:
Para amplificar fragmentos génicos resultantes de reacciones SSH, se llevaron a cabo dos amplificaciones por PCR. En la reacción PCR primaria se añadió 1 µl de la mezcla final de hibridación diluida, a 1 µl de cebador 1 de PCR (10 µM), 0,5 µl de mezcla de dNTP (10 µM), 2,5 µl de tampón de reacción 10 x (CLONTECH) y 0,5 µl de Mezcla de cDNA polimerasa Advantage 50 x (CLONTECH) en un volumen final de 25 µl. Se llevó a cabo la PCR 1 usando las condiciones siguientes: 75ºC durante 5 minutos, 94ºC durante 25 segundos y luego 27 ciclos de 94ºC durante 10 segundos, 66ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1,5 minutos. Cinco reacciones PCR primaria separadas fueron efectuadas para cada experimento. Los productos fueron agrupados y diluidos con agua (1:10). Para la reacción PCR secundaria, se añadió 1 µl procedente de la reacción PCR primaria, agrupada y diluida, a la misma mezcla de reacción usada para la PCR 1, excepto que se usaron los cebadores NP1 y NP2 (10 µM) en lugar del cebador 1 de la PCR. Se llevó a cabo la PCR 2 usando 10-12 ciclos de 94ºC durante 10 segundos, 68ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1,5 minutos. Los productos de la PCR fueron analizados usando electroforesis en gel de agarosa al 2%.
Los productos de la PCR fueron insertados en pCR2.1 usando el kit de clonación de vectores T/A (Invitrogen). E. coli transformado fue sometido a selección azul/blanco y de ampicilina. Las colonias blancas fueron entresacadas y distribuidas en placas de 96 pocillos y se cultivaron en cultivo líquido durante la noche. Para identificar las inserciones, se llevó a cabo amplificación por PCR sobre 1 µl de cultivo bacteriano usando las condiciones de la PCR1 y de la PCR2, y NP1 y NP2 como cebadores. Los productos de la PCR fueron analizados usando electroforesis en gen de agarosa al 2%.
Los clones bacterianos fueron almacenados en glicerina al 20% en un formato de 96 pocillos. Se preparó DNA plasmídico, se secuenció y se sometió a investigaciones de homología de los ácidos nucleicos de las bases de datos GenBank, dBest y NCI-CGAP.
Análisis de la expresión por RT-PCR
Fueron generados cDNAs de primera cadena partiendo de 1 µg de mRNA con cebado con oligo (dT)12-18 usando el sistema de preamplificación Superscript de Gibco-BRL. Se usó el protocolo de los fabricantes y se incluyó una incubación durante 50 minutos a 42ºC con transcriptasa inversa seguido de tratamiento con RNAsa H a 37ºC durante 20 minutos. Una vez completada la reacción se aumentó el volumen a 200 µl con agua antes de realizar la normalización. Se obtuvieron de CLONTECH cDNAs de primera cadena de 16 tejidos humanos normales diferentes.
La normalización de los cDNAs de la primera cadena procedentes de múltiples tejidos se llevó a cabo usando los cebadores 5’atatcgccgcgctcgtcgtcgacaa3’(SEQ ID NO: 11)y 5’agccacacgcagctcattgtagagg3’ (SEQ ID NO: 12) para amplificar �-actina. El cDNA de la primera cadena (5 µl) fue amplificado en un volumen total de 50 µl que contenía cebadores 0,4 µM, 0,2 µM de cada dNTPs, tampón de PCR1X (Clontech, tris-HCl 10 mM, MgCl2 1,5 mM, KCl 50 mM, pH 8,3) y DNA polimerasa Klentaq 1X (Clontech). Cinco µl de la reacción PCR fueron retirados a 18, 20 y 22 ciclos y usados para electroforesis en gel de agarosa. Se llevó a cabo PCR usando un ciclador térmico MJ Research en las condiciones siguientes: la desnaturalización inicial se realizó a 94ºC durante 15 segundos, seguida por 18, 20 y 22 ciclos de 94ºC durante 15 segundos , 65ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 5 segundos. Se efectuó una extensión final a 72ºC durante 2 minutos. Después de electroforesis en gel de agarosa, las intensidades de banda de las bandas de
�-actina de 283 bp procedentes de varios tejidos, fueron comparadas mediante inspección visual. Se calcularon factores de dilución para los cDNAs de la primera cadena resultando intensidades iguales de las bandas de �-actina en todos los tejidos después de 22 ciclos de PCR. Se necesitaron tres rondas de normalización para conseguir intensidades de bandas iguales en todos los tejidos después de 22 ciclos de PCR.
Para determinar los niveles de expresión del gen 36P6D5, 5 µl de cDNA de la primera cadena, normalizado, fue analizado por PCR usando 25, 30 y 35 ciclos de amplificación usando los pares de cebadores siguientes:
36P6D5.1 GCATTCTTGGCATCGTTATTCAG (SEQ ID NO: 13) 36P6D5.2 TAACTGGGAATGTGACAGCAACAC (SEQ ID NO. 14)
Se consiguió un análisis semicuantitativo de la expresión comparando los productos de la PCR en números de ciclos que daban intensidades ligeras de bandas.
RESULTADOS
El experimento SSH descrito en el párrafo anterior de “Materiales y Métodos” llevó al aislamiento de numerosos clones de fragmentos génicos candidatos (clones de SSH). Todos los clones candidatos fueron secuenciados y sometidos a análisis de homología frente a todas las secuencias de las bases de datos de genes públicas, principales, y EST con objeto de proporcionar información acerca de la identidad del gen correspondiente y ayudar a guiar la decisión de analizar un gen particular para determinar la expresión diferencial. En general, los fragmentos génicos que no tenían homología con alguna secuencia conocida de cualquiera de las bases de datos investigadas y que, por tanto, se consideró que representaban genes nuevos, así como los fragmentos génicos que mostraban homología con marcas de secuencias expresadas (ESTs) previamente secuenciadas, fueron sometidos a análisis de expresión diferencial mediante RT-PCR y/o análisis Northern.
Uno de los clones de SHH que comprendía aproximadamente 423 bp, no mostró homología con ninguno de los genes conocidos, y fue designado 36P6D5. El análisis de expresión inicial de 36P6D5 mediante RT-PCR mostró la máxima expresión en LAPC-4 AD (IT) y en la próstata normal en comparación con las otras muestras. Este clon, por consiguiente, fue utilizado para obtener un cDNA de longitud total que codifica 36P6D5 según se describe en el Ejemplo 2 que figura seguidamente.
EJEMPLO 2 AISLAMIENTO DE cDNA COMPLETO QUE CODIFICA EL GEN 36P6D5
El fragmento del gen 36P6D5 de 423 bp se usó como sonda para identificar el cDNA completo para 36P6D5 en una colección de cDNA de próstata humana. Esto dio por resultado el aislamiento de un cDNA de 931 bp, clon 36P6D5-GTC4, que codifica un ORF de 235 aminoácidos con homología importante con dos secuencias que habían sido indicadas anteriormente, el precursor de la proteína 2-19 (Genbank P98173) y un gen aislado de osteoblastos humanos denominado GS3786 (Q92520).
Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducidos del clon de cDNA 36P6D5-GTC4, se muestran en la FIG. 1. La secuencia de aminoácidos codificada manifiesta una secuencia señal del extremo N-terminal que predice la proteína que ha de ser secretada (usando el programa PSORT). Las alineaciones de las secuencias de aminoácidos de la proteína 36P6D5 con el precursor de la proteína 2-19 y la proteína osteoblástica GS3786, se indican en la FIG. 2.
EJEMPLO 3 ANÁLISIS POR TRANSFERENCIA NORTHERN DE LA EXPRESIÓN DEL GEN 36P6D5
La expresión del mRNA de 36P6D5 en tejidos humanos normales, fue analizada primeramente por transferencia Northern usando dos transferencias de varios tejidos obtenidos de Clontech (Palo Alto, California)., que comprendían un total de 16 tejidos humanos normales diferentes, usando como sonda cDNA de 36P6D5 marcado. Muestras de RNA fueron normalizadas cuantitativamente con una sonda de �-actina. Los resultados se muestran en la FIG. 3 e indican que, dentro de los 16 tejidos ensayados, el gen 36P6D5 es expresado predominantemente en el páncreas, con un nivel de expresión muy bajo detectado también en la próstata y en el intestino delgado.
Además, con objeto de analizar la expresión de 36P6D5 en tejidos y líneas celulares de cánceres humanos, RNAs derivados de xenotrasplantes LAPC-4 de cánceres de próstata humanos y un panel de líneas celulares de cánceres no prostáticos, fueron analizados por transferencia Northern usando como sonda cDNA de 36P6D5. Todas las muestras de RNA fueron normalizadas cuantitativamente por tinción con bromuro de etidio y análisis subsiguiente con una sonda de �-actina marcada. Los resultados de este análisis están presentados en la FIG. 4, y muestran la expresión de 36P6D5 en xenotrasplantes LAPC-4 de cáncer de próstata que crecen subcutánea e intratibialmente, en todos los casos en niveles más altos con relación a la próstata normal. Adicionalmente, se detectó una expresión importante en varias líneas celulares de cánceres no prostáticos con inclusión de células de cánceres pancreáticos (Capan-1), de colon (CaCo-2, Colo-205), de mama (CAMA-1, DU4475) y de ovarios (SW626, CAOV-3, OV1063), asimismo en altos niveles en algunos casos. En particular, el máximo nivel de expresión se detectó en la línea celular de cáncer de mama DU4475
EJEMPLO 4 PRODUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DE 36P6D5 RECOMBINANTE
Para expresar 36P6D5 recombinante para usar en diversos contextos tales como analizar la localización subcelular de la proteína 36P6D5, un cDNA parcial o el completo. fue clonado en uno cualquiera de una variedad de vectores de expresión tales como aquellos que proporcionan una marca 6His en el extremo carboxilo terminal (por ejemplo, pCDNA 3.1 myc-His, InVitrogen).
En una realización típica, con objeto de conducir una expresión de alto nivel de la proteína 36P6D5, el cDNA de 36P6D5 que codifica los aminoácidos 30-235 (menos la secuencia señal del extremo N-terminal), fue clonado en el vector de secreción de mamífero pAPTag5 (GenHunter) con y sin fusión a la secuencia de cDNA con fosfatasa alcalina (AP) proporcionada. Este vector proporciona un extremo C-terminal 6XHis y la marca MYC para la purificación y detección, y una secuencia conductora de Ig del extremo N-terminal para conducir la secreción. Células 293T que expresan de modo estable o bien pAPTag5-36P6D5 o bien pTag5-36P6D5 (no fusionados a AP) sirven como fuente de proteína recombinante para purificación, como es visualizado mediante una transferencia Western anti-His de medios acondicionados procedentes de estas líneas celulares (FIG. 5). Las proteínas 36P6D5 marcadas con la marca HIS, presentes en los medios acondicionados, son purificadas usando el método siguiente. El medio acondicionado es concentrado 5-10 veces y simultáneamente el tampón es cambiado a un tampón de fosfato (pH 8,0) que contiene NaCl 500 mM e imidazol 20 mM (Tampón A) usando una unidad de ultrafiltración amicón con una membrana de corte de peso molecular de 10 kd. La preparación es unida por tandas a 0,1 a 0,5 ml de resina de afinidad de metal de níquel (Ni-NTA, Qiagen) y lavada extensamente con tampón A. La proteína SGP-28/CRISP-3 marcada con la marca HIS es eluída luego con un gradiente de imidazol de 0 a 400 mM en tampón de fosfato (pH 6,3) conteniendo NaCl 300 mM y después se dializó extensamente frente a PBS. La proteína purificada puede usarse luego para ensayos de crecimiento, estudios de unión a ligandos, o como inmunógeno para generar reactivos de anticuerpos.
Realizaciones adicionales de construcciones típicas se proporcionan seguidamente.
Construcción de pcDNA3.1/MycHis
Para expresar 36P6D5 en células de mamífero, el marco de lectura abierto de 36P6D5 de 705 bp (235 aminoácidos) fue clonado en el pcDNA3.1/MycHis, Versión A (Invitrogen, Carlsbad, CA). La expresión de la proteína es inducida a partir del promotor de citomegalovirus (CMV). La proteína recombinante tiene las marcas myc y seis histidina fusionadas al extremo C-terminal. El vector pcDNA3.1/MycHis contiene también la señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino (BGH) y la secuencia de terminación de la transcripción para intensificar la estabilidad del mRNA, junto con el origen de SV40 para la replicación episomal y el rescate sencillo del vector en líneas celulares que expresan el antígeno T grande. El gen de resistencia a la neomicina permite seleccionar células de mamífero que expresan la proteína y el gen de resistencia a la ampicilina y el origen ColE1 permite la selección y el mantenimiento del plásmido en E.coli.
pAPtag
La proteína 36P6D5 sin la secuencia señal (aminoácidos 30 a 235) fue clonada en pAPtag-5 (GenHunter Corp. Nashville, TN). Esta construcción genera una fusión de fosfatasa alcalina en el extremo C-terminal de la proteína 36P6D5 al tiempo que la fusión de la secuencia señal de IgGK en el extremo N-terminal. La proteína 36P6D5 recombinante que resulta es optimizada para secreción en el medio de células de mamífero transfectadas y puede usarse para identificar proteína tales como ligandos o receptores que interaccionan con la proteína 36P6D5. La expresión de la proteína es inducida desde el promotor CMV y la proteína recombinante contiene también las marcas myc y seis histidinas fusionadas al extremo C-terminal de fosfatasa alcalina. El gen de resistencia a zeosina permite seleccionar células de mamífero que expresan la proteína y el gen de resistencia a la ampicilina permite la selección del plásmido en E.coli.
ptag5
La proteína 36P6D5 sin la secuencia señal (aminoácidos 30 a 235) fue clonada también en la construcción pTag-5. El vector es similar al pAPTag pero sin la fusión de fosfatasa alcalina.
Construcciones pSRa
Para generar líneas de células de mamífero que expresan constitutivamente 36P6D5, el ORF de 705 bp (235 aminoácidos), fue clonado en construcciones pSRa. Retrovirus anfotrópicos y ecotrópicos son generados por transfección de construcciones pSRa en la línea de empaquetamiento 293T-10 A1, o cotransfección de pSRa y un plásmido cooperador (�� ) en 293 células, respectivamente. Los retrovirus pueden ser usados para infectar una diversidad de líneas de células de mamífero, dando por resultado la integración del gen clonado, 36P6D5, en las líneas de las células huésped. La expresión de la proteína es inducida a partir de una repetición terminal larga (LTR). El gen de resistencia a la neomicina permite seleccionar células de mamífero que expresan la proteína y el gen de resistencia a la ampicilina y el origen ColE1 permiten la selección y el mantenimiento del plásmido en E.coli. Se preparó una construcción pSRa adicional que fusionaba la marca FLAG al extremo C-terminal permitiendo la detección usando anticuerpos anti-FLAG. La secuencia de nucleótidos de FLAG se añadió al cebador de clonación en el extremo 3’ del ORF.
Pueden realizarse construcciones adicionales de pSRa para producir GFP del extremo N-terminal y del extremo C-terminal y proteínas de fusión myc/6 His de la proteína 36P6D5 completa.
EJEMPLO 5: PRODUCCIÓN DE 36P6D5 RECOMBINANTE EN UN SISTEMA DE BACULOVIRUS
Para generar la proteína 36P6D5 recombinante en un sistema de expresión de baculovirus, cDNA de 36P6D5 es clonado en el vector de transferencia de baculovirus pBlueBac 4.5 (Invitrogen) que proporciona una marca His en el extremo N-terminal. Específicamente, pBlueBac-36P6D5 es transfectado junto con el plásmido cooperador pBac-N-Blue (Invitrogen) en células de insecto SF9 (Spodoptera frugiperda) para generar baculovirus recombinantes (véase el manual de instrucciones de Invitrogen para apreciar detalles). El baculovirus es recogido luego desde el sobrenadante de las células y purificado mediante ensayo en placa.
Después es generada la proteína 36P6D5 recombinante por infección de células de insecto HighFive (InVitrogen) con el baculovirus purificado. La proteína 36P6D5 recombinante puede ser detectada usando un anticuerpo específico de 36P6D5. La proteína 36P6D5 puede ser purificada y usada en varios ensayos a base de células o como inmunógeno para generar anticuerpos policlonales y monoclonales específicos para 36P6D5.
EJEMPLO 6: GENERACIÓN DE ANTICUERPOS POLICLONALES PARA 36P6D5
Para generar sueros policlonales para 36P6D5 se sintetizó un péptido que correspondía a los aminoácidos 163-177 (MVTYDDGSTRLNNDA) (SEQ ID NO: 12) de la secuencia de la proteína SGP-28/CRISP-3) y fue copulado a hemocianina de lapa “Keyhole” (KLH) usándole para inmunizar un conejo del modo que sigue. El conejo fue inmunizado inicialmente con 200 ug de péptido-KLH mezclado en adyuvante de Freund completo. El conejo fue inyectado después cada dos semanas con 200 ug de péptido-KLH en adyuvante de Freund incompleto. Se tomaron muestras de sangre aproximadamente 7-10 después de cada inmunización. Se usaron análisis por el ensayo ELISA y transferencia Western para determinar la especificidad y el título del suero de conejo para el péptido de inmunización y la proteína 36P6D5, respectivamente. Se prepararon anticuerpos policlonales para 36P6D5, purificados por afinidad, por paso del suero crudo procedente del conejo inmunizado sobre una matriz de afinidad que comprendía el péptido de 36P6D5 (MVTYDDGSTRLNNDA) (aminoácidos 163-177 de SEQ ID NO: 2) enlazado covalentemente con Affigel 15 (BioRad). Después de lavar extensamente la matriz con PBS, los anticuerpos específicos para el péptido de 36P6D5 fueron eluídos con tampón de glicocola de pH bajo (pH 2,5, 0,1 M), neutralizados inmediatamente y dializados extensamente frente a PBS.
Para ensayar el anticuerpo policlonal de conejo para determinar su reactividad con la proteína 36P6D5, se llevó a cabo un análisis de transferencia Western frente a un medio acondicionado de células 293T transfectadas con los vectores de expresión pAPTag5-36P6D5 ó PTag5-36P6D5. El pAb de conejo anti-36P6D5 purificado por afinidad (1 µg/ml) reconoce ambas formas de proteína 36P6D5 recombinante secretada desde células 293T (FIG. 5).
EJEMPLO 7 GENERACIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES PARA 36P6D5
Con objeto de generar anticuerpos monoclonales para 36P6D5, se usó proteína 36P6D5 marcada con HIS, expresada en 293T, purificada, para inmunizar ratones Balb/c. Los ratones Balb/C fueron inmunizados inicialmente por vía intraperitoneal con 50 µg de proteína 36P6D5 mezclada con adyuvante de Freund completo. Seguidamente los ratones fueron inmunizados cada 2 semanas con 50 µg de proteína 36P6D5 mezclada con adyuvante de Freund incompleto durante un total de 3 inmunizaciones. La reactividad del suero procedente de los ratones inmunizados para la proteína 36P6D5 completa fue monitorizada mediante el ensayo ELISA usando el inmunógeno y mediante transferencia Western usando medios acondicionados procedentes de células que expresan la proteína 36P6D5. Los ratones que mostraban la reactividad más fuerte fueron ensayados durante 3 semanas y administrados con una inyección final de proteína de fusión en PBS, y fueron sacrificados 4 días más tarde. Los bazos de los ratones sacrificados fueron cosechados luego y fusionados con células de mieloma SPO/2 u otro acompañante de fusión, de mieloma, adecuado, usando procedimientos operatorios estándar (Harlow y Lane, 1988). Los sobrenadantes de pocillos de cultivo que seguían a la selección de HAT, fueron examinados mediante el ensayo Elisa y transferencia Western para identificar clones productores de anticuerpo específico para 36P6D5.
La afinidad de unión de un anticuerpo monoclonal para 36P6D5 puede determinarse usando tecnología estándar. Medidas de afinidad cuantifican la potencia de un anticuerpo para la unión con epítopos, y pueden usarse para ayudar a definir que anticuerpos monoclonales para 36P6D5 son preferidos para uso diagnóstico o terapéutico. El sistema BIAcore (Uppsala, Suecia) es un método preferido para determinar la afinidad de unión. El sistema BIAcore utiliza la resonancia de los plasmones superficiales (SPR, Welford K. Opt. Quant. Elect. 23:1, 1991; Morton y Myszka, Methods in Enzymology, 295:268, 1998) para monitorizar interacciones biomoleculares en tiempo real. El análisis por el sistema BIAcore genera convenientemente constantes de la velocidad de asociación, constantes de la velocidad de disociación, constantes de disociación de equilibrio, y constantes de afinidad.
En una ilustración específica de un método típico para generar anticuerpos monoclonales de 36P6D5, se usó proteína 36P6D5 marcada con HIS, expresada en 293T, purificada, para inmunizar 3 ratones hembra Balb C. Los ratones Balb C fueron inmunizados inicialmente por vía intraperitoneal (IP) con 50 µg de proteína 36P6D5 mezclada con adyuvante de Ribi y recibieron refuerzos IP 2 veces más con intervalos de semanas , con 25 µg de proteína 36P6D5 en adyuvante de Ribi. Después de la tercera administración de refuerzo los ratones fueron inmunizados subsiguientemente con 25 µg de proteína por vía IP, en el seno de PBS. Análisis por el ensayo Elisa de muestras de sangre para ensayo después de la cuarta inmunización, indicaron un título de al menos 2 x 106 para cada uno de los ratones inmunizados hacia el inmunógeno. El suero procedente de los ratones inmunizados reconoce específicamente la proteína 36P6D5 endógena en lisados celulares y medios acondicionados procedentes de una variedad de líneas celulares cancerosas incluyendo líneas celulares que derivan de cánceres de próstata (xenotrasplante LAPC4), colon (Colo 205, CaCo-2), mama (DU4475) y pancreáticos (Capan-1) (Fig. 9) Además, anticuerpos policlonales purificados procedentes de los sueros, fueron usados para desarrollar un ensayo Elisa de captura que detecta específicamente la proteína 36P6D5 en los sobrenadantes de las líneas celulares PC-3-36P6D5 y DU4475 y en muestras clínicas de suero (Tabla 2). Para generar hibridomas anti-36P6D5, se administró a los ratones un refuerzo final de 25 µg de 36P6D5 por vía IP, se les sacrificó 3 días después y se recolectaron células esplénicas que fueron fusionadas con acompañantes de mieloma usando procedimientos operatorios estándar (Harlow y Lane, 1988). Los sobrenadantes de pocillos de cultivo con los hibridomas fusionados fueron examinados mediante el ensayo ELISA y transferencia Western para identificar clones productores de anticuerpos específico de 36P6D5.
Usando estos anticuerpos ase detecto la proteína 36P6D5 en varias líneas celulares de cánceres con inclusión las derivadas de cáncer de colon, páncreas y mama, y en xenotrasplantes de cáncer de próstata. (Figura 9) Además, se detectó la proteína 36P6D5 en medio acondicionado de células que expresan la proteína endógenamente, lo que demuestra que es una proteína secretada y que puede servir como marcador sérico de diagnóstico.
Sin duda, usando un ensayo ELISA de captura, sensible, (Figura 10), se detectó la proteína 36P6D5 en 7/10 muestras de cáncer de colon y en 6/10 muestras de cáncer pancreático, pero solamente en 1/6 muestras de machos normales (Tabla 2). Estos resultados proporcionan evidencia de que la proteína 36P6D5 puede servir como medio de diagnóstico y, posiblemente, como una diana terapéutica para el cáncer de colon y pancreático, así como para otros cánceres que incluyen los derivados de tejidos de próstata y de mama.
EJEMPLO 8: IDENTIFICACIÓN DE CAMINOS POTENCIALES DE TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES
Para determinar si la proteína 36P6D5 activa directa o indirectamente caminos conocidos de transducción de señales en células, se llevaron a cabo ensayos con informadores de la transcripción basados en luciferasa (luc), en células que expresan 36P6D5. Estos informadores de la transcripción contienen sitios de unión de consenso para factores de la transcripción conocidos situados aguas debajo de caminos de la transducción de señales bien caracterizados. Los informadores y ejemplos de estos factores de la transcripción asociados, caminos de transducción de las señales y estímulos de activación, están indicados a continuación.
1.
NFkB-luc, NFkB/Rel; Ik-quinasa/SAPK; crecimiento/ apoptosis/estrés
2.
SER-luc, SRF/TCF/ELKI; MAPK/SAPK, crecimiento/diferenciación
3.
AP-1-luc, FOS/JUN; MAPK/SAPK/PKC; crecimiento/apoptosis/estrés
4.
ARE-luc, receptor androgénico; esteroides/MAPK; crecimiento/diferenciación/apoptosis
5.
p53-luc, p53; SAPK; crecimiento/diferenciación/apoptosis
6.
CRE-luc, CREB/ATF2; PKA/p38; crecimiento/apoptosis/estrés.
Los efectos mediados por 36P6D5 pueden ser ensayados en células que muestran expresión de mRNA, tales como las líneas celulares de cánceres que expresan 36P6D5 indicadas en la FIG. 4. Plásmidos informadores de luciferasa pueden ser introducidos mediante transfección mediada por lípidos (TFX-50, Promega). La actividad de luciferasa, un indicador de la actividad relativa de la transcripción, se mide por incubación de extractos de células con substrato de luciferina y la luminiscencia de la reacción se determina en un luminómetro.
EJEMPLO 9: ENSAYOS IN VITRO DE FUNCIÓN DE 36P6D5
El perfil de la expresión de 36P6D5 en el cáncer sugiere un papel funcional en la iniciación, la progresión y/o el mantenimiento tumoral. La proteína 36P6D5 puede funcionar como un factor secretado que estimula la proliferación de células del cáncer de próstata en el hueso. La función de 36P6D5 puede verificarse en células de mamífero usando enfoques in vitro. Para la expresión en mamíferos, la proteína 36P6D5 puede ser clonada en diversos vectores apropiados, que incluyen el pcDNA 3.1 myc-His-tag y el vector retroviral pSR�tkneo (Muller et al., MCB 11:1785, 1991). Usando tales vectores de expresión, la proteína 36P6D5 puede ser expresada en diversas líneas celulares de cánceres que incluyen, por ejemplo, PC-3, NIH 3T3, LNCaP y 293T. La expresión de 36P6D5 puede ser monitorizada usando anticuerpos anti-36P6D5.
Las líneas de células de mamífero que expresan 36P6D5 pueden ser ensayadas en varios ensayos in vitro e in vivo, que incluyen proliferación celular en cultivo de tejidos, activación de señales apoptóticas, formación de tumores primaria y metastásica en ratones SCID, e invasión in vitro usando un sistema de cultivo de invasión de membrana (MICS) (Welch et al., Int. J. Cancer 43: 449-457). El fenotipo de células con 36P6D5 es comparado con el fenotipo de células que carecen de expresión de 36P6D5.
Las líneas celulares que expresan 36P6D5 pueden ser ensayadas también para determinar la alteración de propiedades invasivas y migratorias midiendo el paso de células a través de una cámara con una membrana porosa revestida con matrigel (Becton Dickinson). El paso de células a través de la membrana hacia el lado opuesto es monitorizado usando un ensayo fluorescente (Becton Dickinson Technical Bulletin, nº 428) usando células indicadoras cargadas con calceína-Am (Molecular Probes). Las líneas celulares analizadas incluyen células parentales y PC3, 3T3 y LNCaP que sobreexpresan 36P6D5. Para ensayar si la proteína 36P6D5 posee propiedades quimioatrayentes, células indicadoras parentales son examinadas por paso a través de la membrana porosa hacia un gradiente de un medio acondicionado con 36P6D5 en comparación con medios testigo. Este ensayo puede ser usado también para calificar y cuantificar la neutralización específica del efecto inducido por 36P6D5, por composiciones terapéuticas candidatos para el cáncer. Las células pueden ser monitorizadas también para determinar cambios en el crecimiento, adhesividad y capacidad invasiva en presencia y ausencia de proteína 36P6D5 purificada, añadida exógenamente.
En otro ensayo funcional, pueden ser analizadas células que expresan de modo estable 36P6D5 para determinar su capacidad de formar colonias en agar blando. En estos experimentos, las células utilizadas en tales procedimientos (por ejemplo, células NIH-3T3) pueden ser transfectadas para que expresen de modo estable 36P6D5 o neo o activada por Ras (como el gen de ensayo, y los testigos negativo y positivo, respectivamente) con objeto de verificar la capacidad de transformación de 36P6D5. Los experimentos se llevan a cabo, típicamente, por duplicado y los ensayos de evalúan aproximadamente 4 semanas después de sembrar las células en las placas. Cuando las observaciones experimentales demuestran que la proteína 36P6D5 induce aumento en la formación de colonias con respeto a un testigo negativo (por ejemplo, neo) tales resultados indican que la proteína 36P6D5 posee capacidades de transformación importantes.
En otro ensayo funcional, pueden compararse células parentales y células que expresan 36P6D5 para determinar su aptitud para inducir acumulación citoplásmica de cAMP. En una realización típica, células tales como un xenotrasplante LAPC (o cualquiera de una diversidad de otras células tales como células 293T) pueden ser expuestas a 36P6D5 y/o transfectadas con el vector pcDNA4 HIS MAX vacío o con pcDNA4 HIS MAX 36P6D5. Típicamente, las células son privadas de alimento en suero fetal bovino (FBS) al 1% durante la noche e incubadas con medio solo o en presencia de una molécula secretora o de FBS al 18%. Las células son lisadas luego y analizadas para determinar el contenido de cAMP mediante inmunoensayo con enzimas ligadas (EIA) según las recomendaciones del fabricante (Linco Research, St. Charles, MI).
Muchos genes identificados como que desempeñan un papel en la oncogénesis actúan activando el camino de señalización de cAMP. Típicamente, en ausencia de ligando, las moléculas de señalización están, normalmente, en estado inactivo. Por unión a ligandos o sobreexpresión, tales moléculas adquieren una conformación activa y forman complejos con proteínas G. Esta interacción de por resultado la disociación de subunidades de proteína G y la activación de adenilato-ciclasa, dando por resultado la acumulación de cAMP (Birnbaumer L., Cell, 71:1069, 1992). La producción intensificada de cAMP da como resultado la activación de varios caminos de señalización aguas abajo que median el efecto de tales moléculas. Una demostración de que células puestas en contacto o transfectadas con 36P6D5 conducen a la acumulación de cAMP en respuesta a FBS, indicaría que la proteína 36P6D5 actúa como una molécula de señalización en estas condiciones.
EJEMPLO 10: ENSAYO IN VIVO DE PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO TUMORAL DE 36P6D5
El efecto de la proteína 36P6D5 sobre el crecimiento de células tumorales puede ser evaluado, in vivo, mediante sobreexpresión génica en ratones portadores de tumores. Por ejemplo, ratones SCID pueden ser inyectados por vía SQ en cada flanco con 1 x 106 de varias líneas de células de próstata, mama, colon, pancreáticas y ováricas que contienen el vector vacío tkNeo o 36P6D5. Al menos dos estrategias pueden ser usadas: (1) Expresión de 36P6D5 constitutiva bajo la regulación de un promotor LTR, y (2) Expresión regulada bajo el control de un sistema vector inducible, tal como ecdysone, tet, etc. El volumen tumoral es verificado luego a la aparición de tumores palpables y seguido a lo largo del tiempo para determinar si células que expresan 36P6D5 crecen a mayor velocidad. Adicionalmente, puede implantarse ortotópicamente a los ratones 1 x 105 de las mismas células para determinar si la proteína 36P6D5 tiene efecto sobre el crecimiento local en el tejido diana (es decir, la próstata) o sobre la aptitud de las células para experimentar metástasis, específicamente en los pulmones, los ganglios linfáticos, el hígado, la médula ósea, etc. En relación con el cáncer de próstata, el efecto de 36P6D5 sobre la formación y crecimiento de tumores óseos puede ser determinado inyectando intratibialmente células de tumores de próstata, según se ha descrito en el Ejemplo 1.
Estos ensayos son útiles también para determinar el efecto inhibidor de 36P6D5 de composiciones terapéuticas candidato, tales como, por ejemplo, anticuerpos de 36P6D5, moléculas antisentido de 36P6D5 y ribozimas.
EJEMPLO 11 ENSAYO IN VITRO DE INTERACCIÓN DE LA PROTEÍNA 36P6D5
También pueden usarse líneas celulares que expresan 36P6D5 para identificar interacciones de proteína-proteína mediadas por 36P6D5. La observación de que 36P6D5 es una molécula secretada que se une a células (véase, por ejemplo, la Figura 8) proporciona evidencia de que esta molécula interacciona con otras proteínas sobre la superficie celular. Esta interacción puede ser examinada usando técnicas de inmunoprecipitación como ha sido puesto de manifiesto por otros autores (Hamilton Bj, et al., Biochem. Biophys Res. Commun. 261:646-51, 1999). La proteína 36P6D5 puede ser inmunoprecipitada desde líneas de células de cáncer de próstata que expresan 36P6D5 y examinada para determinar la asociación de proteínas por transferencia Western. La interacción de proteínas puede ser estudiada también mediante un sistema híbrido de dos levaduras, según ha sido descrito por Shnyreva M et al., (Shnyreva M. et al., J. Biol. Chem. 19:275; 15498-503, 2000). Estos ensayos pueden ser utilizados también para analizar el efecto de tratamientos terapéuticos potenciales del cáncer sobre la función de 36P6D5.
Para determinar la contribución de los diversos dominios contenidos dentro del ORF de 36P6D5 a la función de 36P6D5, pueden generarse mutantes de 36P6D5 que carecen de uno o más dominios. Las líneas celulares que expresan la proteína 36P6D5 mutante, pueden ser evaluadas para determinar la alteración de la proliferación, invasión, migración, activación de la transcripción e interacción de proteína-proteína.
EJEMPLO 12 LOCALIZACIÓN CROMOSÓMICA DE 36P6D5
La localización cromosómica de 36P6D5 se determinó usando el panel híbrido de radiación de GeneBridge4 (Walter et al., Nat. Genetics 7:22, 1994) (Research Genetics, Huntsville Al). Se usaron los cebadores de PCR que siguen para localizar 36P6D5: 36P6D5.7 ATACCCAAAGAACGAAGCTGACAC (SEQ ID NO: 17) 36P6D5.8 TACTCATCAAATATGGGCTGTTGG (SEQ ID NO: 18)
El vector de mapeo resultante para los 93 DNAs del panel híbrido de radiación fue: 000101110110100100100110110011111111010111111110111110100000010 111011001110001101110001001011
Este es el programa de mapeo que puede encontrarse en la dirección de internet http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bi/contig/rhmapper.pl maps 36P6D5 para el cromosoma 21q22.2-22.3.
EJEMPLO 13 DETECCIÓN DE LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS 36P6D5 EN CÁNCERES HUMANOS
Como muestra la Figura 9, un subconjunto de células cancerosas expresan y secretan la proteína 36P6D5. Medios acondicionados y/o lisados de células procedentes de una diversidad de líneas de células cancerosas que representan cánceres derivados de tejido prostático (xenotrasplante LAPC4), de colon (Colo 205, Ca Co-1), de mama (Du4475) y pancreático (Capan-1), así como también células de cáncer de próstata PC3 producidas para sobreexpresar la proteína 36P6D5, fueron sometidos a análisis Western usando un pAb murino anti-36P6D5. Brevemente, células (α 25 ug de proteína total) y medios acondicionados (25 ul de medios filtrados 0,22 uM, puros) fueron solubilizados en tampón de muestra de SDS-PAGE, separados sobre un gel de SDS-PAGE al 10-20% y transferidos a nitrocelulosa. Las transferencias fueron bloqueadas en solución salina tamponada con Tris (TBS) + leche desnatada al 3% y sondadas luego con una dilución 1:1.000 (en TBS + Tween-20 al 0,15% + leche al 1%) de suero derivado de ratones inmunizados con proteína 36P6D5 purificada. Las transferencias fueron lavadas luego e incubadas con una dilución 1.4.000 de anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado a HRP. Después de lavar fueron desarrolladas bandas inmunorreactivas anti-36P6D5 y visualizadas mediante quimiluminiscencia intensificada y exposición a película auto-radiográfica. Las bandas inmunorreactivas anti-36P6D5 específicas que representan la proteína 36P6D5 endógena están indicadas con flechas y se encuentran, aproximadamente, entre 35 y 40 kD. El peso molecular de 36P6D5 calculado a partir de la secuencia de aminoácidos es 26 kD lo que sugiere que la proteína 36P6D5 endógena ha sido modificada después de la traducción, posiblemente por glicosilación. Estos resultados demuestran que la proteína 36P6D5 puede ser útil como diana de diagnóstico y terapéutica de cánceres de próstata, colon, mama, pancreático y, potencialmente, de otros cánceres humanos.
Como muestra la Figura 10, un ensayo ELISA de captura, sensible y específico, detecta la proteína 36P6D5 en sobrenadantes de líneas celulares de cánceres humanos. Un ensayo Elisa de captura fue desarrollado usando un pAb murino anti-36P6D5, purificado de proteína G, como Ab de captura y una forma biotinilada del mismo pAb como Ab de detección. Brevemente, 1 µg de pAb murino anti-36P6D5, purificado, se usó para revestir pocillos de una placa ELISA. Después de bloquear con PBS que contenía leche al 3% se añadió a los pocillos 50 µl de medios acondicionados procedentes o bien de células PC3-neo, PC3-36P6D5 ó DU4475, o cantidades diversas de proteína Tag536P6D5 purificada, fijadas en medios de cultivo de tejidos, y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Los pocillos fueron lavados 4X con PBS+ Tween-20 (PBS-T) al 0,05% y 1X con PBS. Los pocillos fueron incubados luego durante 1 hora con 3 µg/ml de pAb anti-36P6D5 biotinilado en PBS-T + leche al 1% (TBS-TM, 50 µl/pocillo) y lavados como antes. Los pocillos fueron incubados después con 50 µl de una dilución 1:8.000 de complejo de avidina-HRP (Neutralite ϕ, Southern Biotechnology, Inc) en TBS-TM durante 1 hora. Después de lavar, los pocillos fueron desarrollados luego por adición de 200 µl de sustrato TMB. La reacción se detuvo por adición de 50 µl de H2SO4 1M y se determinaron las densidades ópticas de los pocillos en 450 nm. Se muestra la curva patrón generada usando la proteína Tag5-36P6D5 y la detección y cuantificación específicas de 36P6D5 presente en sobrenadantes derivados de células PC-3 que sobreexpresan 36P6D5 y proteína 36P6D5 endógena secretada por células de cáncer de mama Du4475.
La Figura 11 muestra también la expresión de 36P6D5 en cánceres humanos. Como indica la Figura 11, en un método típico para detectar la expresión de 36P6D5 en cánceres humanos, lisados de células procedentes de tejidos de cánceres de colon, mama y riñón (Ca), así como sus tejidos adyacentes normales igualados (N) fueron sometidos a análisis Western usando un anticuerpo monoclonal de ratón anti-36P6D5. Brevemente, fueron solubilizados tejidos (α 25 µg de proteína total) en solución tampón de muestra de SDS-PAGE y separados sobre un gel de SDS-PAGE a 10-20% y transferidos a nitrocelulosa. Las transferencias fueron bloqueadas en solución salina tamponada con Tris (TBS) + leche desnatada al 3%, y sondados con 2 µg/ml (en TBS + Tween 20 al 0,15% + leche al 1%) de anticuerpo anti-36P6D5
purificado. Las transferencias fueron lavadas luego en incubadas con una dilución 1:4.000 de anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con HRP. Después de lavar, fueron desarrolladas bandas inmunorreactivas anti36P6D5 y visualizadas por quimiluminiscencia intensificada y exposición a 5 película auto-radiográfica. Las bandas inmunorreactivas anti-36P6D5 específicas representan una forma monomérica de la proteína 36P6D5, comprendida, aproximadamente, entre 35 y 40 kD, y formas multiméricas de la proteína, comprendidas, aproximadamente, en 90 y 120 kD. Estos resultados demuestran que la proteína 36P6D5 puede ser útil como diana de diagnóstico y
10 terapéutica de cánceres de colon, mama, riñón y, potencialmente, otros cánceres humanos..
La presente invención no está limitada en su alcance por las realizaciones aquí descritas, que están destinadas como ilustraciones sencillas 15 de aspectos individuales de la invención, y cualesquiera que sean funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. Diversas modificaciones de los modelos y métodos de la invención, además de los descritos en esta memoria, serán evidentes para los expertos en la técnica desde la descripción y enseñanzas anteriores, y de modo semejante están
20 destinadas a situarse dentro del alcance de la invención. Tales modificaciones u otras realizaciones pueden ser puestas en práctica sin apartarse del verdadero alcance y espíritu de la invención
25
30
35
TABLAS
TABLA 1: Unión predicha de péptidos procedentes de proteínas 36P6D5 a la molécula HLA-A2 de MHC de clase 1.
Orden
Posición inicial Listado de restos de subsecuencias Puntuación (Estimada del tiempo medio de separación)
1
7 GLLKVVFVV (SEQ ID NO:19) 1407,5
2
97 LMGEQLGNV (SEQ ID NO:20) 104,7
3
27 LLAELIPDA (SEQ ID NO:21) 79,6
4
188 WVFIAAKGL (SEQ ID NO:22) 31,8
5
11 VVFVVFASL (SEQ ID NO:23) 22,3
6
6
GGLLKVVFV (SEQ ID NO:24) 21.2
7
190 FIAAKGLEL (SEQ ID NO:25) 13,5
8
89 KICFEDNLL (SEQ ID NO:26) 10,3
9
109 INIAIVNYV (SEQ ID NO:27) 9,8
10
181 NMKFRSSWV (SEQ ID NO:28) 9,7
Tabla 2: 36P6D5 es detectada en muestras de sueros obtenidos de pacientes 10 cancerosos.
imagen1
Muestras clínicas de sueros procedentes de pacientes con cáncer pancreático y donantes normales (masculinos), fueron clasificadas por la proteína 36P6D5 usando un ensayo ELISA de captura según se describe en la Figura 10. Sobrenadantes procedentes de células PC-3-36P6D5 y Du4475. y
5 procedentes de células PC-3-neo, sirvieron de testigos positivos y negativos, respectivamente, para detectar la proteína 36P6D5. ND: no detectado o por debajo de la sensibilidad de detección. Se detectó la proteína 36P6D5 en 7/10 pacientes de cáncer de colon y 6/10 pacientes de cáncer pancreático, uno de los cuales tenía niveles relativamente altos (29,70 ng/ml), pero solamente
10 en 1/6 de los donantes normales (masculinos).
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> UroGenesys, Inc.
<120> 36P6D5: ANTÍGENO TUMORAL SECRETADO
<130> 129.22WOU1
<150> 60/162,417
<151> 28-10-1999
<160> 28
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
<210> 1
<211> 913
<212> DNA
<213> Sintético
<400> 1
imagen1
<210> 2
<211> 235
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 2
imagen1
imagen1
<210> 3 <211> 14 <212> DNA <213> Sintético
<400> 3 ttttgatcaa gctt
14
<210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Sintético
<400> 4 ctaatacgac tcactatagg gctcgagcgg ccgcccgggc ag
42
<210> 5 <211> 12 <212> DNA <213> Sintético
<400> 5 ggcccgtcct ag
12
<210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Sintético
<400> 6 gtaatacgac tcactatagg gcagcgtggt cgcggccgag
40
<210> 7 <211> 10 <212> DNA <213> Sintético
<400> 7 cggctcctag
10
<210> 8
<211> 22 <212> DNA <213> Sintético
<400> 8 ctaatacgac tcactatagg gc
22
<210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Sintético
<400> 9 tcgagcggcc gcccgggcag ga
22
<210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Sintético
<400> 10 agcgtggtcg cggccgagga
20
<210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Sythetic
<400> 11 atatcgccgc gctcgtcgtc gacaa
25
<210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Sintético
<400> 12 agccacacgc agctcattgt agaagg
26
<210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Sintético
<400> 13 gcattcttgg catcgttatt cag
23
<210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Sintético
<400> 14 taactgggaa tgtgacagca acac
24
<210> 15
<211> 181
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 15
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<210> 16
<211> 174
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 16 <210> 20
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<210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Sintético
<400> 17 atacccaaag aacgaagctg acac
24
<210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Sintético
<400> 18 tactcatcaa atatgggctg ttgg
24
<210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Sintético
<400> 19
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<212> PRT
<213> Sintético
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<212> PRT
<213> Sintético
<400> 28
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Claims (20)

  1. REIVINDICACIONES
    1.-Un método para detectar la presencia de cáncer de próstata en un individuo, cuyo método comprende determinar el nivel de expresión de la proteína de SEQ ID NO: 2 en una muestra biológica de ensayo procedente de un individuo y comparar el nivel así determinado con el nivel de dicha expresión que es evidenciada en la correspondiente muestra normal, en el que la expresión elevada de dicha proteína evidenciada en la muestra de ensayo con relación a la muestra normal, es una indicación de la presencia de dicho cáncer en el individuo.
  2. 2.-Un método de examen de una muestra biológica para evidenciar un crecimiento celular desordenado, que comprende comparar el nivel de expresión de la proteína de SEQ ID NO:2 de la muestra biológica con el nivel de dicha expresión evidenciado en la correspondiente muestra normal, en el que una elevación del nivel de expresión de dicha proteína evidenciado en la muestra biológica comparado con la muestra normal, es una indicación de que la muestra manifiesta un crecimiento celular desordenado y está condicionado por células que manifiestan un crecimiento celular desordenado.
  3. 3.-El método según la reivindicación 2, en el que la elevación del nivel de expresión de dicha proteína es identificado mediante la presencia de dicha proteína en una muestra biológica de un condicionado por un tejido en el que dicha proteína está normalmente ausente.
  4. 4.-El método según la reivindicación 1, en el que las muestras de tejidos de ensayo y normal están seleccionadas entre el grupo que consiste en tejido prostático, suero, sangre o semen.
  5. 5.-El método según la reivindicación 1, en el que la determinación del nivel de proteína de SEQ ID NO:2 de la muestra de ensayo comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo que se une específicamente a dicha proteína.
  6. 6.-El método según la reivindicación 5, en el que el anticuerpo comprende un anticuerpo policlonal.
  7. 7.-El método según la reivindicación 5, en el que el anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal.
  8. 8.-El método según la reivindicación 2, en el que la determinación del nivel de proteína de SEQ ID NO:2 comprende poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo que se une específicamente a dicha proteína.
  9. 9.-El método según la reivindicación 8, en el que el anticuerpo comprende un anticuerpo policlonal.
  10. 10.-El método según la reivindicación 8, en el que el anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal.
  11. 11.-Un método para detectar la presencia de cáncer en un individuo, que comprende:
    (a)
    determinar el nivel de expresión de mRNA que codifica la proteína de SEQ ID NO:2 de una muestra de ensayo obtenida del individuo; y
    (b)
    comparar el nivel así determinado con el nivel de expresión de mRNA de la correspondiente muestra biológica normal, en el que la expresión elevada del mRNA evidenciada en la muestra de ensayo con relación a la muestra normal, es una indicación de la presencia de cáncer en el individuo.
  12. 12.-El método según la reivindicación 11, en el que las muestras de ensayo y normal están seleccionadas entre el grupo que consiste en tejido de vejiga, tejido de próstata, tejido de colon, tejido linfático, suero, sangre o semen.
  13. 13.-Un método de examen de una muestra biológica para poner de manifiesto un crecimiento celular desordenado, que comprende comparar el nivel de expresión del mRNA que codifica la proteína de SEQ ID NO:2 de la muestra biológica con el nivel de dicha expresión de la correspondiente muestra normal, en el que una elevación del nivel de expresión de dicho mRNA evidenciado en la muestra biológica en comparación con la muestra normal, es una indicación de que la muestra manifiesta un crecimiento celular desordenado o está condicionado por células que manifiestan crecimiento celular desordenado.
  14. 14.-El método según la reivindicación 13, en el que la elevación del nivel de expresión de dicha proteína, se identifica por la presencia de dicha proteína en una muestra biológica de un tejido, o está condicionada por un tejido en el que dicha proteína está normalmente ausente.
  15. 15.-. El método según la reivindicación 13, en el que las muestras de ensayo y normal están seleccionadas entre el grupo que consiste en tejido de vejiga, tejido de próstata, tejido de colon, tejido linfático, suero, sangre o semen.
  16. 16.-El método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en el que las muestras de ensayo y normal son tejido de vejiga o tejido de próstata.
  17. 17.-Una composición de vacuna para el tratamiento de un cáncer que expresa SEQ ID NO:2, que comprende una parte inmunógena de la proteína de SEQ ID NO:2 y un excipiente fisiológicamente aceptable.
  18. 18.-Una composición de vacuna para el tratamiento de un cáncer que expresa SEQ ID NO:2, que comprende un polinucleótido que codifica una parte inmunógena de una proteína de SEQ ID NO:2 y un excipiente fisiológicamente aceptable.
  19. 19.-La composición de vacuna según las reivindicaciones 17 ó 18, en el que la parte inmunógena de una proteína de SEQ ID NO:2 está seleccionada entre el grupo que consiste en GLLKWFW (SEQ ID NO:19), LMGEQLGNV (SEQ ID NO:20), LLAELIPDA (SEQ ID NO:21), WVFIAAKGL (SEQ ID NO: 22), WFWFASL (SEQ ID NO:23) , GGLLKWFV (SEQ ID NO:24), FIAAKGLEL (SEQ ID NO:25), KICFEDNLL (SEQ ID NO:26), INIAIVNYV (SEQ ID NO:27) y NMKFRSSWV (SEQ ID NO:28).
  20. 20.-Una composición de vacuna para el tratamiento de un cáncer que expresa SEQ ID NO:2, que comprende un polinucleótido que codifica un anticuerpo monoclonal de una sola cadena que comprende los dominios variables de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a una proteína de SEQ ID NO:2.
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