JP4833252B2 - ３６ｐ６ｄ５：分泌腫瘍抗原 - Google Patents

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Description

本出願は、１９９９年１０月２８日に出願された、米国特許仮出願番号第６０／１６２，４１７号（その全体の内容が本明細書中で参考として援用される）の特典を主張する。
（発明の分野）
本明細書中に記載される発明は、３６Ｐ６Ｄ５と呼ばれる遺伝子およびそのコードされる腫瘍抗原、ならびに診断および治療方法、ならびに３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物を発現する種々の癌の管理において有用である組成物に関する。
（発明の背景）
癌は、冠状動脈の疾患に次ぐ、ヒトの第２の死亡原因である。世界中で、数百万のヒトが、毎年癌で死亡している。米国のみで、癌は、毎年５０万をゆうに越えるヒトの死亡原因であり、１４０万人が毎年新たに診断されている。心臓疾患による死亡は有意に減少しているが、一般的には癌による死亡は増大している。２１世紀の始めには、癌は第１の死亡原因になると予想される。
世界中で、いくつかの癌は、主だった死亡原因として突出している。特に、肺、前立腺、乳房、結腸、膵臓、および卵巣の癌腫は、癌による死亡の主な原因を示す。これらおよび実質的に全ての他の癌腫は、共通する致死的な特徴を共有する。ごくわずかな例外をともなうが、癌腫による転移性の疾患は致命的である。さらに、当初は生存している初期の癌腫を有するこのような癌の患者についてもなお、共通する実験は、彼らの生存性が劇的に変更されることを示した。多くの癌患者は、再発の可能性または処置の失敗の自覚による強烈な不安を経験する。多くの癌患者は、処置後の身体の衰弱を経験する。多くの癌患者は、再発を経験する。
一般的に言って、最も致命的な癌の管理における基本的な問題は、有効かつ非毒性の全身治療の欠如である。分子的医薬（その初期において、なおも非常に多い）は、これらの癌が管理される様式を、再定義することを約束する。疑いなく、癌診断および処置に対する新規な分子論的アプローチの発展を目標とする集中的な世界中での努力が存在する。例えば、真に腫瘍特異的な遺伝子およびタンパク質を同定することに大きな興味があり、これらの遺伝子およびタンパク質は、診断マーカーおよび予後マーカーならびに／または治療標的または薬剤として使用され得る。これらの領域における研究努力が推奨され、そして有用な分子的技術の利用可能性の増加が、癌に関する重要な知識の獲得を加速している。それにも関わらず、進行は、遅く、そして一般的に一様ではない。
以下に記載されるように、前立腺癌の管理は、分子生物学が臨床における真の進行に翻訳する制限された程度の良好な例として機能する。制限された例外とももに、この状況は、上記の他の主要な癌と多少は同じである。
世界中で、前立腺癌は、男性における４番目の最も一般的な癌である。北アメリカおよび北ヨーロッパでは、これは、最も一般的な男性の癌であり、そして男性の癌による死亡の第２の原因である。米国のみで、４０，０００人をゆうに超える男性が、唯一肺癌に次いで、毎年この疾患によって死亡する。これらの数の程度にもかかわらず、転移性の前立腺癌についての有効な処置はなお存在していない。外科手術による前立腺切除、放射線治療、ホルモン切除治療、および化学療法が、主な処置の形態でありつづけている。残念なことに、これらの処置は多くについては不十分であり、そしてしばしば、所望されない結果を付随する。
診断の最前線においては、初期段階の局在化した腫瘍を正確に検出し得る前立腺の腫瘍マーカーが存在していないことが、この疾患の管理における有意な限界を残している。血清のＰＳＡアッセイが非常に有用なツールであるが、その特異性および一般的な有用性は、以下にさらに議論されるように、いくつかの重要な局面を欠いていると広範に認識されている。ほとんどの前立腺癌は、最初に、尿道から離れた、前立腺の末梢領域に発生する。この領域内の腫瘍は、いずれの症状も起こさず、その結果、ほとんどの男性が、有意な進行が起こるまで、疾患の臨床的症状を提示しない。前立腺の転移領域への腫瘍の進行は、尿道の閉塞に導き得、従って、症状の最初の症状が生じる。しかし、これらの臨床的症状は、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）の一般的な非悪性状態と区別することができない。前立腺癌の早期の検出および診断は、現在のところ、指での直腸試験（ＤＲＥ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）測定、直腸横断（ｔｒａｎｓｒｅｃｔａｌ）超音波検査（ＴＲＵＳ）、および直腸横断針生検（ＴＲＮＢ）に依存する。現在、ＤＲＥと組合せた血清ＰＳＡ測定が、前立腺癌を検出および診断するために使用される主要なツールを提供する。両方は、勢力的な研究を、この疾患のより良好な診断マーカーの発見に注ぐ、この両方は、主要な制限を有する。
同様に、前立腺癌の代表的な致命的な転移段階の出現を予測し得る利用可能なマーカーは存在しない。転移段階の診断は、現在、切開手術または腹腔鏡下骨盤リンパ節切除、全身放射性核種スキャン、骨格Ｘ線撮影、および／または骨損傷生検分析によって達成される。明らかに、より良好な画像化および他のあまり侵襲的ではない診断方法が、患者に行われる困難なこれらの手順を容易にする可能性、ならびに改善された診断の正確さおよび切開治療の選択枝を提供する。同様な問題は、どの癌が無痛性であるか、およびどの癌が攻撃的であるかを決定するための有効な予後マーカーの欠如である。例えば、ＰＳＡは、無痛性癌と攻撃的癌との間を正確には区別できない。信頼がおけるように初期段階の疾患を同定し得、転移に対する感受性を予測し得、そして腫瘍を正確に画像化し得る前立腺腫瘍マーカーが存在するまで、前立腺癌の管理は、極端に困難であり続ける。
ＰＳＡは、現在、前立腺癌を、スクリーニングし、診断し、そしてモニターするために最も広範に使用される腫瘍マーカーである。特に、血清ＰＳＡの検出のためのいくつかの免疫アッセイが、広範に臨床に使用される。近年、血清中のＰＳＡ ｍＲＮＡについての逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイが、開発された。しかし、ＰＳＡは、疾患特異的マーカーではない。なぜなら、ＰＳＡのレベルの増加は、ＢＰＨおよび前立腺炎を有する患者の大きな割合（２５〜８６％）で（Ｇａｏら、１９９７、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３１：２６４−２８１）、そして他の非悪性障害において、そしていくらかの正常な男性において検出可能であり、このマーカーの診断特異性を有意に制限する因子であるからである。例えば、４〜１０ｎｇ／ｍｌの血清ＰＳＡの上昇が、ＢＰＨにおいて観測され、そしてさらにより高い値が前立腺（特に、急性前立腺炎）において観測される。ＢＰＨは、男性において、非常に一般的な状態である。さらに、この状況を混乱させるのは、血清ＰＳＡの上昇が、ＤＲＥからの疾患の任意の指標がなくとも観測され得ること、またはその逆という事実である。さらに、現在、ＰＳＡが、前立腺特異的ではないことが認識されている（Ｇａｏら、前出、総説について）。
ＰＳＡベースの検出の特異性を改善するように設計された種々の方法が記載され、この方法は、例えば、ＰＳＡ密度および遊離ＰＳＡ対複合体化ＰＳＡの比を測定することである。しかし、これらの方法論のいずれも、悪性前立腺疾患をから良性のものを再現可能なように区別することはできない。さらに、ＰＳＡ診断剤は、５７〜７９％の感度を有し（Ｃｕｐｐ ＆ Ｏｓｔｅｒｌｉｎｇ，１９９３，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ Ｐｒｏｃ ６８：２９７−３０６）、従って、疾患を有する男性の有意な集団において前立腺癌を同定することを失敗する。
前立腺において優位に発現されるいくつかの公知のマーカーが存在し、これは、例えば、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭ）であり、これはラットニューロペプチドと８５％同一であるヒドロラーゼである（Ｃａｒｔｅｒら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７４９；Ｂｚｄｅｇａら、１９９７、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：２２７０）。しかし、小腸および脳におけるＰＳＭの発現（Ｉｓｒａｅｌｉら、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：１８０７）、ならびに脳におけるニューロペプチド異化作用における潜在的な役割は、抗ＰＳＭ治療での潜在的な神経毒性の関与を生じる。再発性の前立腺癌を画像化するための、インジウム−１１１で標識された抗ＰＳＭモノクローナル抗体は、いくつかの可能性を示す（Ｓｏｄｅｅら、１９９６、Ｃｌｉｎ Ｎｕｃ Ｍｅｄ ２１：７５９−７６６）。より最近同定された前立腺癌のマーカーとしては、ＰＣＴＡ−１（Ｓｕら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７２５２）、および前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）（Ｒｅｉｔｅｒら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１７３５）が挙げられる。新規なガレクチン（ｇａｌｅｃｔｉｎ）であるＰＣＴＡ−１は、発現細胞の培地に大量に分泌され、そして前立腺癌についての診断血清マーカーとしての可能性を保持し得る（Ｓｕら、１９９６）。ＧＰＩ連結細胞表面分子であるＰＳＣＡが、ＬＡＰＣ−４ ｃＤＮＡからクローニングされ、そして正常な前立腺細胞の基底細胞において、および癌上皮おいて主に発現されるという点で独特である（Ｒｅｉｔｅｒら、１９９８）。前立腺癌のためのワクチンが、種々の抗原（ＰＳＭおよびＰＳＡを含む）を用いて活発に探索されている。
ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＣＴＡ、およびＰＳＣＡのような以前に同定されたマーカーが前立腺癌の診断および処置についての努力を促進したが、診断および治療をさらに改善するための、前立腺癌および関連する癌についてのさらなるマーカーおよび治療標的の同定が必要とされている。
（発明の要旨）
本発明は、３６Ｐ６Ｄ５と呼ばれる、遺伝子およびタンパク質に関する。正常な個体において、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質は、膵臓において主に発現され、前立腺および小腸において、より低いレベルの発現が検出される。３６Ｐ６Ｄ５はまた、いくつかのヒト癌異種移植片および前立腺癌、乳癌、卵巣癌および結腸癌由来の細胞系列において、いくつかの場合、高レベルで発現される。正常な発現と比較して、３６Ｐ６Ｄ５の過剰発現は、前立腺癌リンパ節転移由来の前立腺癌異種移植片において最初に観測され、そしてＳＣＩＤマウスにおいて、脛骨内的にそして皮下的に継代される。３６Ｐ６Ｄ５の極端に高いレベルの発現が、乳癌細胞系列ＤＵ４４７５（乳腺癌から最初に誘導された細胞系列）において検出された（Ｌａｎｇｌｏｉｓら、１９７９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３９：２６０４）。この３６Ｐ６Ｄ５遺伝子はまた、膀胱癌、腎臓癌、結腸癌および肺癌由来の腫瘍患者サンプルにおいて、いくつかの場合高レベルで発現される。
本明細書中に提供される９３１ｂｐの全長３６Ｐ６Ｄ５ ｃＤＮＡ（配列番号１）は、２〜１９のタンパク質前駆体（Ｇｅｎｂａｎｋ）およびヒト骨芽細胞（Ｑ９２５２０）と有意に相同な２３５アミノ酸のオープンリーディングフレーム（配列番号２）をコードする。推定２３５アミノ酸の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質はまた、Ｎ末端シグナル配列を含み、このことは、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質が分泌されることを示す。この３６Ｐ６Ｄ５遺伝子は、従って、分泌された腫瘍抗原をコードし、この抗原は、３６Ｄ６Ｐ５を発現する前立腺癌、乳癌、結腸癌、膵臓癌、および卵巣癌の処置に対する種々のアプローチのための診断マーカー、病期分類マーカーおよび／または予後マーカーとして有用であり得、そして／またはこの種々のアプローチのための標的として機能し得る。３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の推定分子量は、約２６ｋＤであり、そしてそのｐＩは、８．９７である。
発現分析は、いくつかの前立腺および他の癌細胞系列、ならびに前立腺癌の患者のサンプルおよび腫瘍異種移植片における、高レベルの３６Ｐ６Ｄ５発現を立証する。膀胱癌細胞系列、結腸癌細胞系列、腎臓癌細胞系列、乳癌細胞癌系列、肺癌細胞癌系列、卵巣癌細胞系列および前立腺癌細胞系列のような癌細胞において観察される過剰発現と合わせて、正常な成人組織における３６Ｐ６Ｄ５の発現プロフィールは、３６Ｐ６Ｄ５が、少なくともいくつかの癌において異常に発現され、そしてこのような癌に対する有用な診断標的および／または治療標的として機能し得ることの証拠を提供する。
本発明は、好ましくは単離された形態の、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子の全てまたは一部に対応するか、またはそれらに相補的なポリヌクレオチド、ｍＲＮＡ、および／またはコード配列を提供し、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびそのフラグメント、ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、および３６Ｐ６Ｄ５遺伝子またはｍＲＮＡ配列またはその部分に相補的な、関連する分子、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、ならびに３６Ｐ６Ｄ５遺伝子、、ｍＲＮＡ、または３６Ｐ６Ｄ５をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む。
また、ｃＤＮＡおよび３６Ｐ６Ｄ５をコードする遺伝子を単離するための手段が提供される。３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子、このような分子で形質転換または形質導入された細胞、および３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物の発現のための宿主−ベクター系がまた、提供される。本発明は、さらに、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質およびそのポリペプチドフラグメントを提供する。本発明は、さらに、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質およびそのポリペプチドフラグメントに結合する抗体を提供し、この抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、マウスおよび他の哺乳動物抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およ完全なヒト抗体、ならびに検出可能なマーカーで標識された抗体を含む。
本発明はさらに、種々の生物学的サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドおよびタンパク質の存在および状態を検出するための方法、ならびに３６Ｐ６Ｄ５を発現する細胞を同定する方法を提供する。本発明の代表的な実施形態は、癌のような増殖調節不全のいくつかの形態を有するか、または有する疑いのある組織サンプルにおいて３６Ｐ６Ｄ５をモニターするための方法を提供する。
本発明はさらに、前立腺癌のような、３６Ｐ６Ｄ５を発現する癌を処置するための、種々の治療組成物およびストラテジーを提供し、これには、３６Ｐ６Ｄ５の転写、翻訳、プロセシングまたは機能を阻害することを目的とした治療ならびに癌ワクチンが含まれる。
本発明はさらに、以下の項目を提供する；
（項目１）３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を発現する癌の存在を検出する方法であって、個体由来の試験組織サンプル中の細胞により発現される３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のレベルを決定する工程、およびこのように決定されたレベルを、対応する正常サンプル中の発現される３６Ｐ６Ｄ５のレベルと比較する工程を包含し、正常サンプルに対して増加した試験サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の存在が、個体におけるこのような癌の存在を示す、方法。
（項目２）上記細胞により発現される３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のレベルを決定する工程が、細胞を、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質に特異的に結合する抗体と接触させることを包含する、項目１に記載の方法。
（項目３）上記抗体が、ポリクローナル抗体を含む、項目２に記載の方法。
（項目４）上記抗体が、モノクローナル抗体を含む、項目２に記載の方法。
（項目５）３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物をモニタリングする方法であって、個体由来の試験組織サンプル中の細胞により発現される３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物の状態を決定する工程、およびこのように決定された状態を、対応する正常サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物の状態と比較する工程を包含し、正常サンプルに対して試験サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物の変更された状態の存在が、個体内の細胞成長の調節不全を示す、方法。
（項目６）細胞成長の調節不全の証拠について生物学的サンプルを試験する方法であって、生物学的サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５の状態を、対応する正常サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５の状態と比較する工程を包含し、ここで生物学的サンプルにおける３６Ｐ６Ｄ５の状態の変更が、細胞成長の調節不全と関連する、方法。
（項目７）上記生物学的サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５の状態が、３６Ｐ６Ｄ５ｍＲＮＡ発現のレベルまたは３６Ｐ６Ｄ５タンパク質発現のレベルを試験することにより評価される、項目６に記載の方法。
（項目８）上記３６Ｐ６Ｄ５の状態における変更が、３６Ｐ６Ｄ５発現細胞が通常存在しない組織由来の生物学的サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５発現細胞の存在により同定される、項目６に記載の方法。
（項目９）個体における癌の存在を診断する方法であって：
（ａ）個体から得られた試験サンプル中で発現された３６Ｐ６Ｄ５ｍＲＮＡのレベルを決定する工程；および
（ｂ）このように決定されたレベルを、比較可能な既知の正常組織サンプル中で発現された３６Ｐ６Ｄ５ｍＲＮＡのレベルと比較する工程、
を包含し、正常組織サンプルと比較して、試験サンプル中の増加した３６Ｐ６Ｄ５ｍＲＮＡ発現の存在が、癌の存在を示す、方法。
（項目１０）個体における癌の存在を診断する方法であって：
（ａ）個体から得られた試験サンプル中で発現された３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のレベルを決定する工程；および
（ｂ）このように決定されたレベルを、比較可能な既知の正常組織サンプル中で発現された３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のレベルと比較する工程、
を包含し、正常組織サンプルと比較して、試験サンプル中の増加した３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の存在が、癌の存在を示す、方法。
（項目１１）上記癌が、前立腺癌または結腸癌であり、そして上記試験組織サンプルおよび上記正常組織サンプルが、前立腺組織、結腸組織、リンパ組織、血清、血液または精液からなる群から選択される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）上記試験サンプル中で発現された３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のレベルを決定する工程が、サンプルを、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質に特異的に結合する抗体と接触させることを包含する、項目１０に記載の方法。
（項目１３）上記抗体が、ポリクローナル抗体を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）上記抗体が、モノクローナル抗体を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１５）３６Ｐ６Ｄ５を発現する癌を有する患者を処置する方法における使用のためのベクターであって、方法は、ベクターを患者に投与する工程を包含し、ここでベクターは、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む単鎖モノクローナル抗体をコードし、その結果、ベクターが、単鎖モノクローナル抗体コード配列を癌細胞に送達し、そしてコードされる単鎖抗体が、癌細胞内で発現される、ベクター。
（項目１６）３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む薬学的組成物であって、ここでポリヌクレオチドは、以下：
（ａ）配列番号１に示される配列を有するポリヌクレオチド（Ｔはまた、Ｕであり得る）；
（ｂ）配列番号１に示される配列のおおよそヌクレオチド残基番号５９からおおよそヌクレオチド残基番号７６３を有するポリヌクレオチド（Ｔはまた、Ｕであり得る）；
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する３６Ｐ６Ｄ５タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）少なくとも２０ヌクレオチド塩基長である、（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）のポリヌクレオチドのフラグメントであるポリヌクレオチド；
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリヌクレオチドに完全に相補的であるポリヌクレオチド；または
（ｆ）ストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド、
からなる群から選択される、薬学的組成物。
（項目１７）長さ全体にわたって配列番号２に示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、薬学的組成物。
（項目１８）３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む薬学的組成物であって、ここでポリペプチドが、配列番号２の残基１２０〜１２３のＮＶＴＡ、配列番号２の残基２０８〜２１１のＮＨＳＤ、配列番号２の残基４３〜４５のＳＩＲ、配列番号２の残基１６０〜１６２のＳＴＲ、配列番号２の残基４６〜４９のＳＩＧＥ、配列番号２の残基１５５〜１５８のＴＹＤＤ、配列番号２の残基８１〜８６のＧＧＧＲＳＫ、配列番号２の残基１０８〜１１３のＧＩＮＩＡＩ、配列番号２の残基１１９〜１２４のＧＮＶＴＡＴ、配列番号２の残基５〜３６のＡＧＧＬＬＫＶＶＦＶＶＦＡＳＬＣＡＷＹＳＧＹＬＬＡＥＬＩＰＤＡＰ、ＧＬＬＫＶＶＦＶＶ（配列番号１９）、ＬＭＧＥＱＬＧＮＶ（配列番号２０）、ＬＬＡＥＬＩＰＤＡ（配列番号２１）、ＷＶＦＩＡＡＫＧＬ（配列番号２２）、ＶＶＦＶＶＦＡＳＬ（配列番号２３）、ＧＧＬＬＫＶＶＦＶ（配列番号２４）、ＦＩＡＡＫＧＬＥＬ（配列番号２５）、ＫＩＣＦＥＤＮＬＬ（配列番号２６）、ＩＮＩＡＩＶＮＹＶ（配列番号２７）およびＮＭＫＦＲＳＳＷＶ（配列番号２８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、薬学的組成物。
（項目１９）上記ポリヌクレオチドが、検出可能なマーカーで標識される、項目１６に記載の薬学的組成物。
（項目２０）項目１６に記載のポリヌクレオチドによりコードされる３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチドを含む、薬学的組成物。
（項目２１）項目２０に記載のポリペプチドの少なくとも１５個連続したアミノ酸を有するポリペプチドを含む、薬学的組成物。
（項目２２）項目２０に記載の３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを含む、薬学的組成物。
（項目２３）上記抗体またはそのフラグメントがモノクローナルである、項目２２に記載の薬学的組成物。
（項目２４）項目２３に記載のモノクローナル抗体の抗原結合領域を有する組換えタンパク質を含む、薬学的組成物。
（項目２５）上記抗体またはそのフラグメントが検出可能なマーカーで標識される、項目２２に記載の薬学的組成物。
（項目２６）上記検出可能なマーカーが、放射性同位体、蛍光性化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素からなる群から選択される、項目２５に記載の薬学的組成物。
（項目２７）上記抗体フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、またはｓＦｖフラグメントを含む、項目２２に記載の薬学的組成物。
（項目２８）上記抗体またはそのフラグメントが、ヒト抗体を含む、項目２２に記載の薬学的組成物。
（項目２９）上記抗体またはそのフラグメントが、毒素または治療因子に結合体化される、項目２２に記載の薬学的組成物。
（項目３０）上記抗体が、マウス抗原結合領域の残基およびヒト抗体の残基を含む、項目２３に記載の薬学的組成物。
（項目３１）項目２３に記載のモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインを有する単鎖モノクローナル抗体を含む、薬学的組成物。
（項目３２）３６Ｐ６Ｄ５を発現する癌の処置のためのワクチン組成物であって、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の免疫原性部分および生理学的に受容可能なキャリアを含む、ワクチン組成物。
（項目３３）項目３２に記載のワクチン組成物であって、ここで３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の上記免疫原性部分が、ＧＬＬＫＶＶＦＶＶ（配列番号１９）、ＬＭＧＥＱＬＧＮＶ（配列番号２０）、ＬＬＡＥＬＩＰＤＡ（配列番号２１）、ＷＶＦＩＡＡＫＧＬ（配列番号２２）、ＶＶＦＶＶＦＡＳＬ（配列番号２３）、ＧＧＬＬＫＶＶＦＶ（配列番号２４）、ＦＩＡＡＫＧＬＥＬ（配列番号２５）、ＫＩＣＦＥＤＮＬＬ（配列番号２６）、ＩＮＩＡＩＶＮＹＶ（配列番号２７）およびＮＭＫＦＲＳＳＷＶ（配列番号２８）からなる群から選択される、ワクチン組成物。
（項目３４）３６Ｐ６Ｄ５を発現する癌の処置のためのワクチン組成物であって、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の免疫原性部分をコードするポリヌクレオチドおよび生理学的受容可能なキャリアを含む、ワクチン組成物。
（項目３５）項目３４に記載のワクチン組成物であって、ここで３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の上記免疫原性部分は、ＧＬＬＫＶＶＦＶＶ（配列番号１９）、ＬＭＧＥＱＬＧＮＶ（配列番号２０）、ＬＬＡＥＬＩＰＤＡ（配列番号２１）、ＷＶＦＩＡＡＫＧＬ（配列番号２２）、ＶＶＦＶＶＦＡＳＬ（配列番号２３）、ＧＧＬＬＫＶＶＦＶ（配列番号２４）、ＦＩＡＡＫＧＬＥＬ（配列番号２５）、ＫＩＣＦＥＤＮＬＬ（配列番号２６）、ＩＮＩＡＩＶＮＹＶ（配列番号２７）およびＮＭＫＦＲＳＳＷＶ（配列番号２８）からなる群から選択される、ワクチン組成物。
（項目３６）３６Ｐ６Ｄ５を発現する癌を処置するためのワクチン組成物であって、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む単鎖モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、ワクチン組成物。
（項目３７）患者において３６Ｐ６Ｄ５を発現する癌の発生を阻害するための医薬の製造における、項目３４に記載のワクチン組成物の使用。
（項目３８）患者において３６Ｐ６Ｄ５を発現する癌の発生を阻害するための医薬の製造における、項目３６に記載のワクチン組成物の使用。
（発明の詳細な説明）
他に特に定義されていない限りは、本明細書中で使用される当該分野の全ての用語、記号、および他の科学的な専門用語は、本発明が関係している当業者によって一般的に理解されている意味を有するように意図される。いくつかの場合においては、一般的に理解されている意味を有する用語は、明確さおよび／または容易な参照のために本明細書中で定義され、そして本明細書中でのこのような定義の包含は、当該分野で一般的に理解されている意味を超える実質的な差異を示すようには決して解釈されないはずである。本明細書中に記載されるかまたは参照される技術および手順（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｎｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、（１９８９）編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈｅｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．に記載されている、広範囲に利用されている分子クローニング方法論）は、一般的に十分に理解されており、そして当業者によって従来の方法論を使用して一般的に使用される。適切である場合には、商業的に入手可能なキットおよび試薬の使用を含む手順が、一般的には、製造業者によって定義されるプロトコールおよび／またはそうでなければ他に記載されているパラメーターに従って行われる。
本明細書中で使用される場合は、用語「進行した前立腺癌」、「局所的に進行した前立腺癌」、「進行した疾患」、および「局所的に進行した疾患」は、前立腺の莢膜を通じて拡大した前立腺癌を意味し、そしてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＵＡ）システムのもとでのステージＣの疾患、Ｗｈｉｔｍｏｒｅ−ＪｅｗｅｔｔシステムのもとでのステージＣ１Ｃ２の疾患、およびＴＮＭ（腫瘍、節、転移（ｔｕｍｏｒ、ｎｏｄｅ、ｎｅｔａｓｔａｓｉｓ））システムのもとでのステージＴ３〜Ｔ４およびＮ＋の疾患を含むように意味される。一般的には、外科手術は、局所的に進行した疾患を有する患者については推奨されず、そしてこれらの患者は、臨床的に局在化した（器官に限定された）前立腺癌を有している患者と比較して、実質的にあまり好ましくない結果を有する。局所的に進行した疾患は、前立腺の側縁を超えるしこり、あるいは前立腺の基部の上部の非対称性またはしこりの明白な証拠によって、臨床的に同定され得る。局所的に進行した前立腺癌は、現在は、腫瘍が前立腺の莢膜に侵入または浸潤するか、外科的な縁に伸びるか、あるいは精子の小包に侵入する場合には、根治的な前立腺切除後に病理学的に診断される。
本明細書中で使用される場合は、用語「転移性の前立腺癌」および「転移性の疾患」は、局所的なリンパ節または離れた部位に拡大した前立腺癌を意味し、そしてＡＵＡシステムのもとでのステージＤの疾患、およびＴＮＭシステムのもとでのステージＴ×Ｎ×Ｍ＋を含むように意味される。局所的に進行した前立腺癌の症例における場合には、外科手術は、一般的には、転移性の疾患を有している患者については意図されず、そしてホルモン（アンドロゲンの切除）治療が、好ましい処置態様である。転移性の前立腺癌を有している患者は、最終的には、処置の開始の１２〜１８ヶ月以内のアンドロゲン治療不応性状態を発症し、そしてこれらの患者のほぼ半分がその後６ヶ月以内に死亡する。前立腺癌の転移の最も一般的な部位は骨である。前立腺癌の骨転移は、どちらかといえば、骨溶解よりもむしろ骨芽細胞について特徴的である（すなわち、正味の骨の形成を生じる）。骨転移は、脊椎においてもっとも頻繁に見出され、大腿骨、骨盤、肋骨郭、頭蓋骨、および上腕骨が続く。他の一般的な転移の部位として、リンパ節、肺、肝臓、および脳が挙げられる。転移性の前立腺癌は、代表的には、開放性のまたは腹腔鏡による骨盤のリンパ腺切除、全身の放射性核種スキャン、骨格のレントゲン撮影、および／あるいは骨の病変の生検によって、診断される。
本明細書中で使用される場合は、用語「ポリヌクレオチド」は、少なくとも１０個の塩基または塩基対の長さのヌクレオチドの多形性の形態（リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれか、あるいはいずれかのヌクレオチドの型の改変された形態）を意味し、そしてＤＮＡの一本鎖および二本鎖の形態を含むように意味される。
本明細書中で使用される場合は、用語「ポリペプチド」は、少なくとも約６個のアミノ酸のポリマーを意味する。明細書を通じて、アミノ酸についての標準的な３文字または１文字の表記が、使用される。
本明細書中で使用される場合は、ポリヌクレオチドの状況で使用される「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）」、「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）」、「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ）」などは、従来のハイブリダイゼーション条件（好ましくは、例えば、５０％のホルムアミド／６×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ／１００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡ中でのハイブリダイゼーション）をいうように意味される。ここでは、ハイブリダイゼーションの温度は３７℃を超え、そして０．１×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ中での洗浄のための温度は５５℃以上であり、そしてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が最も好ましい。
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定可能であり、そして一般的には、プローブの長さ、洗浄温度、および塩濃度に依存する経験的な計算である。一般的には、より長いプローブは、適切なアニーリングのためにより高い温度を必要とし、一方、より短いプローブは、より低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般的には、それらの融解温度以下の環境下に相補鎖が存在する場合に、変性させられたＤＮＡが再度アニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間での所望される相同性の程度が高ければ高いほど、使用され得る相対的な温度は高くなる。結果として、より高い相対的な温度が、反応条件をよりストリンジェントにし、一方、より低い温度はあまりそうではないという結果になる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９５）を参照のこと。
「ストリンジェントな条件」、または「高ストリンジェントな条件」は、本明細書中で定義される場合は、以下によって同定され得る：（１）洗浄のために低いイオン強度および高温（例えば、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム、５０℃）を使用する；（２）変性剤（例えば、ホルムアミド）をハイブリダイゼーションの間に使用する（例えば、０．１％のウシの血清アルブミンを有する５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド／０．１％のＦｉｃｏｌｌ／０．１％のポリビニルピロリドン／７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを有するｐＨ６．５の５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、４２℃）；または（３）５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケの精子のＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％のデキストラン硫酸を４２℃で使用し、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中で４２℃で、そして５０％のホルムアミド中で５５℃で洗浄し、続いて５５℃でＥＤＴＡを含有している０．１×ＳＳＣから構成される高ストリンジェンシーの洗浄が続く。
「中程度にストリンジェントな条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９によって記載されたように同定され得、そして洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、およびＳＤＳ）の使用を含む。これは、上記に記載されたものよりもよりストリンジェントではない。中程度にストリンジェントな条件の例は、以下を含む溶液中での３７℃、一晩のインキュベーションである：２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、１０％ 硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡ、続いて約３７℃〜５０℃で１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する。当業者は、温度、イオン強度などを、因子（例えば、プローブ長など）を適応させるのに必要なように調整する方法を認識する。
アミノ酸比較の状況において、用語「同一性」は、同一である同じ相対的位置のアミノ酸残基のパーセンテージを表現するために使用される。この状況においてはまた、用語「相同性」は、ＢＬＡＳＴ分析の保存性アミノ酸の判断基準を使用して、当該分野において一般的に理解されるように、同一であるかまたは類似であるかのいずれかである、同じ相対位置でのアミノ酸残基のパーセンテージを表現するために使用される。例えば、同一性％の値は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０−４８０（１９９６）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ）によって生成され得る。アミノ酸置換（これは、このような判断基準の下では保存性であると見なされる）に関するさらなる詳細は以下に提供される。さらなる定義が、引き続くサブセクションを通して提供される。
（３６Ｐ６Ｄ５の分子生物学および３６Ｐ６Ｄ５に関する使用）
以下の実施例にさらに記載されるように、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子および３６Ｐ６Ｄ５タンパク質は、多数の分析的な手段を用いて特徴付けられる。例えば、コードするヌクレオチドおよびアミノ酸配列の分析は、潜在的に関連する分子、ならびに認識可能な構造ドメイン、位相特性、および３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡおよびタンパク質の構造内の他のエレメントを同定するために実行された。３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析は、３６Ｐ６Ｄ５メッセージを発現する正常組織および癌性組織の範囲を確立するために実施された。
３６Ｐ６Ｄ５タンパク質は、最初にシグナル配列を含む２３５アミノ酸前駆体に翻訳されることが予想され、これは、翻訳後プロセシングの間に切断されて、２１１または２１２アミノ酸の成熟な分泌タンパク質を生じる（図１）。３６Ｐ６Ｄ５タンパク質は、推定分子量＝２５．９およびｐＩ＝８．９７を有する。３６Ｐ６Ｄ５は、細胞内である最初の２８アミノ酸を有する膜関連タンパク質であることが推定される。シグナルペプチドアルゴリズムに基づいて、このタンパク質の細胞内部分は、２９と３０との間で切断されて、残りの分子を可溶性タンパク質として放出するようである。この３６Ｐ６Ｄ５遺伝子は、通常、膵臓に主に発現されるが（図３）、いくつかのヒト癌（前立腺癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌、肺癌、膀胱癌、腎臓癌および卵巣癌を含む）にも発現または過剰発現される（図４、６および７）。３６Ｐ６Ｄ５タンパク質構造は、２つの以前に記載されたタンパク質配列（２−１９タンパク質前駆体（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｐ９８１７３）（配列番号１５）およびＧＳ３７８６と指定される骨芽細胞タンパク質（Ｑ９２５２０）（配列番号１６）に対して有意な相同性を示す（図２）。３６Ｐ６Ｄ５は、推定骨芽細胞タンパク質（ＮＰ−０５５７０３．１）に、その全体の配列にわたって３６％同一性で類似性を有し、ａａ７４とａａ２３５との間に最大の５４％相同性が生じる。これはまた、タンパク質ＧＳ３７８６と弱く類似である。３６Ｐ６Ｄ５が骨由来タンパク質に類似性を有するという事実は、ＬＡＰＣ４ＡＤ（ＩＴ）およびＬＡＰＣ４ＡＤ（ＳＱ）ＲＮＡを比較するＳＳＨを用いて発見されたように、驚くべきことではない。骨芽細胞タンパク質に対するその相同性を考慮すると、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質が、骨の癌細胞（例えば、図４、６および７に示される３６Ｐ５Ｄ６癌細胞）の増殖を刺激する分泌因子として機能し得る可能性はある。
本明細書中に開示されるように、３６Ｐ６Ｄ５は、そのポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗ポリペプチド抗体が、癌（特に、前立腺癌）のような細胞成長の調節不全と関連する状態を調べることにむく周知の診断アッセイに使用される遺伝子ファミリーに見出される特徴に類似した、特異的な特徴を示す（例えば、実施例３に記載されるように、組織発現のその非常に特異的なパターンおよび前立腺癌におけるその過剰発現の両方などを参照のこと）。このクラスの最も公知のメンバーは、ＰＳＡであり、これは、前立腺癌の存在を同定およびモニターするために長年い医療従事者によって使用されている典型的なマーカーである（例えば、Ｍｅｒｒｉｌｌら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１６３（２）：５０３−５１２０（２０００）；Ｐｏｌａｓｃｉｋら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．Ａｕｇ；１６２（２）：２９３−３０６（１９９９）、およびＦｏｒｔｉｅｒら、Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９１（１９）：１６３５−１６４０（１９９９）を参照のこと）。ｐ５３およびＫ−ｒａｓを含む種々の他の診断マーカーがまた、この状況において使用される（例えば、Ｔｕｌｃｈｉｎｓｋｙら、Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ １９９９ Ｊｕｌ；４（１）９９−１０２およびＭｉｎｉｍｏｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔ Ｐｒｅｖ ２０００；２４（１）：１−１２を参照のこと）。結果として、３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドおよびポリペプチド（ならびにこれらの分子の存在を同定するために使用される、３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドプローブおよび抗３６Ｐ６Ｄ５抗体）ならびにこれらの特性に関するこの開示は、当業者が、これらの分子を、例えば、癌と関連する状態を調べることにむく種々の診断アッセイにおいて使用される方法に類似した方法に使用することを可能にする。
本明細書中に記載される３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体を使用する診断方法の代表的な実施形態は、ＰＳＡポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体を使用する十分に確立された診断アッセイからの方法に類似した方法である。例えば、まさにＰＳＡポリヌクレオチドがプローブとして（例えば、ノーザン分析（例えば、Ｓｈａｒｉｅｆら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．３３（３）５６７−７４（１９９４）を参照のこと））およびプライマーとして（例えば、ＰＣＲ分析（例えば、Ｏｋｅｇａｗａら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１６３（４）：１１８９−１１９０（２０００）を参照のこと））、ＰＳＡの過剰発現または前立腺癌の転移をモニタリングする方法にＰＳＡ ｍＲＮＡの存在および／またはレベルを観察するために使用されるように、本明細書中に記載される３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドは、同じ方法で、３６Ｐ６Ｄ５過剰発現または前立腺癌およびこの遺伝子を発現する他の癌の転移を検出するために使用され得る。あるいは、まさにＰＳＡポリペプチドがＰＳＡに特異的な抗体（これは次いで、ＰＳＡタンパク質過剰発現（例えば、Ｓｔｅｐｈａｎら、Ｕｒｏｌｏｇｙ ５５（４）：５６０−３（２０００）を参照のこと）または前立腺細胞の転移（例えば、Ａｌａｎｅｎら、Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９２（３）：２３３−７（１９９６）を参照のこと）をモニタリングする方法においてＰＳＡタンパク質の存在および／またはＰＳＡタンパク質のレベルを観察するために使用され得る）を作製するために使用されるように、本明細書中に記載される３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチドは、前立腺細胞およびこの遺伝子を発現する他の癌細胞の３６Ｐ６Ｄ５過剰発現または転移を検出する際に使用するための抗体を作製するために使用され得る。詳細には、転移は、起源の器官（例えば、膀胱、腎臓、または前立腺など）から体の異なる領域（例えば、リンパ節）への癌細胞の移動を含むので、３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドおよび／または３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチドを発現する細胞の存在に関して生物学的サンプルを調べるアッセイは、転移の証拠を提供するために使用され得、例えば、通常３６Ｐ６Ｄ５を発現する細胞を含まない組織（リンパ節）由来の生物学的サンプルが３６Ｐ６Ｄ５を発現する細胞を含むことが見出された場合である。あるいは、３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、癌の証拠を提供するために使用され得、例えば、通常３６Ｐ６Ｄ５を発現しないかまたは異なるレベルで発現する生物学的サンプル中の細胞（例えば、腎臓細胞、膀胱細胞、肺細胞および前立腺細胞など）が３６Ｐ６Ｄ５を発現することかまたは増加した３６Ｐ６Ｄ５の発現を有することが見出された場合である。このようなアッセイにおいて、当業者は、第２の組織制限マーカー（３６Ｐ６Ｄ５に加えて）（例えば、ＰＳＡ、ＰＣＳＡなど）（例えば、Ａｌａｎｅｎら、Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９２（３）：２３３−２３７（１９９６）を参照のこと）の存在に関して生物学的サンプルを試験することによって転移の補充の証拠を作製することをさらに望み得る。
まさにＰＳＡポリヌクレオチドフラグメントおよびポリヌクレオチド改変体が、この分子をモニタリングする方法における使用のために当業者によって使用されるように、３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドフラグメントおよびポリヌクレオチド改変体はまた、類似の様式で使用され得る。詳細には、この分子のモニタリング方法に使用される代表的なＰＳＡポリヌクレオチドは、ＰＳＡ ｃＤＮＡ配列のフラグメントからなるプローブまたはプライマーである。これを説明すると、ＰＳＡポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するために使用されるプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応中で機能するために全ＰＳＡ配列未満を含まなくてはならない。このようなＰＣＲ反応の状況において、当業者は、概して、目的のポリヌクレオチドの異なる部分を増幅するためまたは増幅反応を最適化するためにプライマーとして使用され得る種々の異なるポリヌクレオチドフラグメントを作製する（例えば、Ｃａｅｔａｎｏ−Ａｎｏｌｌｅｓ，Ｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２５（３）：４７２−４７６，４７８−４８０（１９９８）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：１２１−１５４（１９９８）を参照のこと）。このようなフラグメントの有用性のさらなる例示は、実施例３に提供され、ここで、３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドフラグメントは、プローブとして使用されて、癌細胞中の３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡの過剰発現を示す。さらに、医療従業者によるその使用を容易にするために、改変体ポリヌクレオチド配列が、代表的に、ＰＣＲおよびノーザンブロット分析において対応するｍＲＮＡに対するプライマーおよびプローブとして使用される（例えば、Ｓａｗａｉら、Ｆｅｔａｌ Ｄｉａｇｎ．Ｔｈｅｒ．１９９６ Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；１１（６）：４０７−１３およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｕｎｉｔ２、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編、１９９５を参照のこと）。ポリヌクレオチドフラグメントおよび改変体は、代表的に、これらが共通の属性または比較的高いストリンジェンシーの条件下で標的ポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号１に示される３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチド）に結合し得る特徴を有する限り、この状況において有用である。
まさに、ＰＳＡポリペプチドフラグメントおよびポリペプチド改変体がこの分子をモニタリングする方法に使用するために当業者によって使用されるように、３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチドフラグメントおよびポリペプチド改変体はまた、類似の様式で使用され得る。詳細には、この分子のモニタリング方法に使用される代表的なＰＳＡポリペプチドは、ＰＳＡタンパク質に特異的に結合する抗体によって認識され得るエピトープを含むＰＳＡタンパク質のフラグメントである。抗体（例えば、抗ＰＳＡ抗体）を作製するために使用されるポリペプチドフラグメントまたはポリペプチド改変体を使用するこの実施は、代表的に、広範な種々の系（例えば、従業者によって使用される融合タンパク質）を用いて当該分野内である（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｕｎｉｔ１６、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｕｌら、編、１９９５を参照のこと）。この状況において、目的タンパク質中の種々のエピトープの各々は、抗体が作製される構造を提供するために機能する。代表的に、当業者は、一般的に、目的のポリペプチドの異なる部分に特異的な抗体を作製するために使用され得る種々の異なるポリペプチドフラグメントを作製する（例えば、米国特許第５，８４０，５０１号および米国特許第５，９３９，５３３号を参照のこと）。例えば、下記に議論する３６Ｐ６Ｄ５の生物学的モチーフのうちの１つを含むポリペプチドを使用することが好ましくあり得る。ポリペプチドフラグメントおよび改変体は、代表的に、これらが、共通の属性または標的ポリペプチド配列に特異的な抗体を作製し得るエピトープを有する特徴（例えば、配列番号２に示される３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチド）を有する限り、本状況において有用である。
本明細書中に示されるように、３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドおよび３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチド（ならびに、これらの分子の存在を同定するために使用される３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドプローブおよび抗３６Ｐ６Ｄ５抗体）は、これらを前立腺癌診断の際に有用にする特異的な特性を示す。本明細書中に記載される特定の疾患状態（例えば、前立腺癌）の存在または発症を評価するために３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物の存在を測定する記載される診断アッセイは、ＰＳＡを用いて好首尾になされたように、予防的な測定のための潜在的な候補物を同定する際またはさらなるモニタリングの際に特に有用である。さらに、これらの物質は、例えば、前立腺起源の転移の明確な診断がＰＳＡ単独に関する試験に基づいてなされ得ない状況（例えば、Ａｌａｎｅｎら、Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９２（３）：２３３−２３７（１９９６）を参照のこと）においてＰＳＡに対して類似した特徴を有する分子に関する当該分野の要求を満たし、結果として、３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドおよび３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチド（ならびにこれらの分子の存在を同定するために使用される３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドプローブおよび抗３６Ｐ６Ｄ５抗体を含む）のような物質は、前立腺起源の転移を確認するために使用されなければならない。
最後に、診断アッセイにおけるこれらの使用に加えて、本明細書中に開示される３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドは、多数の他の特定の有用性、例えば、２１ｑ２２．２−２２．３中の染色体の異常と関連する発癌の表示におけるこれらの使用を有する。さらに、診断アッセイにおけるこれらの使用に加えて、本明細書中に開示される３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチドおよび３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドは、他の有用性、例えば、未知の起源の組織に関する法医学的分析におけるこれらの使用を有する（例えば、Ｔａｋａｈａｍａ Ｋ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉ Ｉｎｔ １９９６ Ｊｕｎ ２８；８０（１−２）：６３−９を参照のこと）。
以下に詳細に議論されるように、３６Ｐ６Ｄ機能は、当該分野で周知である種々の技術を用いて哺乳動物細胞中で評価され得る。哺乳動物発現に関して、３６Ｐ６Ｄは、以下を含むいくつかのベクターにクローン化され得る：ｐｃＤＮＡ ３．１ ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ｔａｇ（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）およびレトロウイルスベクターｐＳＲαｔｋｎｅｏ（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９１、ＭＣＢ １１：１７８５）。これらの発現ベクターを使用して、３６Ｐ６Ｄ５は、ＰＣ−３、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＬＮＣａＰ、および２９３Ｔを含むいくつかの細胞株中で発現され得る。３６Ｐ６Ｄ５の発現は、ノーザンブロット分析を用いてモニターされ得る。３６Ｐ６Ｄ５を発現する哺乳動物細胞株は、組織培養物中の細胞増殖、アポトーシスシグナルの活性化、ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍形成、および膜浸潤培養系（ＭＩＣＳ）（Ｗｅｌｃｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４３：４４９−４５７）を用いるインビボ浸潤を含むいくつかのインビトロアッセイおよびインビボアッセイにおいて試験され得る。３６Ｐ６Ｄ５細胞表現型は、３６Ｐ６Ｄ５発現を欠く細胞の表現型と比較され得る。
（３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチド）
本発明の一つの局面は、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子、ｍＲＮＡおよび／またはコード配列（好ましくは、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質およびそのフラグメント、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドならびに関連分子をコードするポリヌクレオチド、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子もしくはｍＲＮＡ配列またはその一部分に相補的な、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、ならびに３６Ｐ６Ｄ５遺伝子、ｍＲＮＡもしくは３６Ｐ６Ｄ５をコードするポリヌクレオチド（集合的に、「３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチド」）にハイブリダイズする、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む単離形態における）のすべてもしくは一部分に対応するか、またはそのすべてもしくは一部分に相補的なポリヌクレオチドを提供する。本明細書中で使用される場合、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子およびタンパク質は、本明細書中で具体的に記載される３６Ｐ６Ｄ５遺伝子およびタンパク質、ならびに他の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質および前述の構造的に類似の改変体に対応する、遺伝子およびタンパク質を含むことが意味される。このような他の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質および改変体は、一般的に、３６Ｐ６Ｄ５コード配列に高度に相同なコード配列を有し、そして好ましくは、少なくとも約５０％のアミノ酸同一性、そして少なくとも約６０％のアミノ酸相同性を共有し（ＢＬＡＳＴ標準を使用して）、より好ましくは、７０％以上の相同性を共有する（ＢＬＡＳＴ標準を使用して）。
３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドは、図１（配列番号１）（ここで、Ｔは、Ｕでもあり得る）に示されるようなヒト３６Ｐ６Ｄ５のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド；３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の全体もしくは一部をコードするポリヌクレオチド；上記のものに対して相補的である配列；または上記のいずれかのポリヌクレオチドフラグメントを含み得る。別の実施形態は、図１（配列番号１）のヌクレオチド残基数５９〜ヌクレオチド残基数７６３もしくは７６６（ここで、Ｔは、Ｕでもあり得る）に示されるような配列を有するポリヌクレオチドを含む。別の実施形態は、図１（配列番号１）のヌクレオチド残基数１３１〜ヌクレオチド残基数７６３もしくは７６６（ここで、Ｔは、Ｕでもあり得る）に示されるような配列を有するポリヌクレオチドを含む。別の実施形態は、配列が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９，ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に登録番号２０７１９７として１９９９年４月９日に寄託された、プラスミドに含まれるｃＤＮＡによってコードされる、３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、図１（配列番号１）に示されるヒト３６Ｐ６Ｄ５ ｃＤＮＡにハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを含む。
本明細書中で開示される本発明の代表的な実施形態は、３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡ配列の特定の部分を含む３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチド（およびこのような配列に相補的であるもの）（例えば、このタンパク質およびそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド）を含む。例えば、本明細書中で開示される本発明の代表的な実施形態は、以下を含む：配列番号２に示される３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のおよそアミノ酸〜およそアミノ酸１０をコードするポリヌクレオチド、配列番号２に示される３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のおよそアミノ酸２０〜およそアミノ酸３０をコードするポリヌクレオチド、配列番号２に示される３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のおよそアミノ酸３０〜およそアミノ酸４０をコードするポリヌクレオチド、配列番号２に示される３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のおよそアミノ酸４０〜およそアミノ酸５０をコードするポリヌクレオチド、配列番号２に示される３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のおよそアミノ酸５０〜およそアミノ酸６０をコードするポリヌクレオチド、配列番号２に示される３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のおよそアミノ酸６０〜およそアミノ酸７０をコードするポリヌクレオチド、配列番号２に示される３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のおよそアミノ酸７０〜およそアミノ酸８０をコードするポリヌクレオチド、配列番号２に示される３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のおよそアミノ酸８０〜およそアミノ酸９０をコードするポリヌクレオチド、および配列番号２に示される３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のおよそアミノ酸９０〜およそアミノ酸１００をコードするポリヌクレオチドなど。このスキームの後、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のアミノ酸１００〜２３５のアミノ酸配列の一部分をコードするポリヌクレオチドは、本発明の代表的な実施形態である。３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のより大きな部分をコードするポリヌクレオチドがまた意図される。例えば、配列番号２に示される３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のおよそアミノ酸１（または２０、または３０、または４０など）〜およそアミノ酸２０（または３０、または４０、または５０など）をコードするポリヌクレオチドは、当該分野で周知の種々の技術によって生成され得る。
３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドのさならる例示的な実施形態は、図１（配列番号１）に示される配列の、およそヌクレオチド残基数１からおよそヌクレオチド残基数２５０、およそヌクレオチド残基数２５０からおよそヌクレオチド残基数５００、およびおよそヌクレオチド残基数５００からおよそヌクレオチド残基数７５０、およびおよそヌクレオチド残基数７５０からおよそヌクレオチド残基数９１３を有するポリヌクレオチドからなる実施形態を含む。これらのポリヌクレオチドフラグメントは、図１（配列番号１）に示されるように３６Ｐ６Ｄ５配列の任意の部分、例えば、図１（配列番号１）に示されるポリヌクレオチド配列内の２３５アミノ酸ＯＲＦを有するポリヌクレオチド（例えば、およそヌクレオチド残基数５９からおよそヌクレオチド残基数７６３）を含み得る。
本明細書中で開示される本発明のさらなる例示的な実施形態は、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質配列内に含まれる、１つ以上の生物学的モチーフをコードする３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドフラグメントを含む。本発明の代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、以下の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質および３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチドを議論する文書においてより詳細に開示されるように、１つ以上の３６Ｐ６Ｄ５ Ｎ−グリコシル化部位、カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位、タンパク質キナーゼｃリン酸化部位、アミノ酸透過酵素サインまたはｎ−ミリストイル化部位をコードするものが挙げられる。
前の段落のポリヌクレオチドは、多数の異なる特異的な用途を有する。例えば、ヒト３６Ｐ６Ｄ５遺伝子が染色体２１ｑ２２．２−２２．３にマップするので、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の異なる領域をコードするポリヌクレオチドを使用して、種々の癌に関連しているとして同定されている染色体２１（バンドｑ２２．２−２２．３）の細胞遺伝学異常を特徴付けし得る。詳細には、２１ｑ２２．２−２２．３中の種々の染色体の異常が、多数の異なる癌においてしばしば細胞遺伝学の異常として同定されている（例えば、Ｂａｂｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．１９８９ Ｍａｒ；３８（１）１２７−９およびＨｏら、Ｂｌｏｏｄ．１９９６年６月１５日；８７（１２）５２１８−２４を参照のこと）。結果として、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の特異的な領域をコードするポリヌクレオチドは、悪性腫瘍の表現型に寄与し得る染色体２１のこの領域における細胞遺伝学異常の以前の可能性のある特異的な性質よりも、より正確に描写するために使用され得る新規のツールを提供する。この状況においては、これらのポリヌクレオチドは、より微妙でありあまり一般的ではない染色体異常を同定するために染色体のスクリーニングの感受性を拡大することへの当業者の要求を満たす（例えば、Ｅｖａｎｓら、１９９４、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１７１（４）：１０５５−１０５７を参照のこと）。
あるいは、３６Ｐ６Ｄ５は、前立腺癌に高度に発現されることが示されるように（例えば、図４を参照のこと）、これらのポリヌクレオチドは、正常組織 対
癌性組織において、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物の状態を評価する方法に使用され得る。代表的には、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の特定の領域をコードするポリヌクレオチドが使用されて、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物の特定の領域（ＲＮＡ結合配列を含むような領域）において、混乱状態（例えば、欠失、挿入、点変異など）の存在を評価し得る。例示的なアッセイは、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ、ならびに一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析（例えば、Ｍａｒｒｏｇｉら、Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．２６（８）：３６９−３７８（１９９９）を参照のこと）の両方を含み、これらの両方は、タンパク質の特定の領域をコードするポリヌクレオチドを利用して、タンパク質内のこれらの領域を試験する。
本明細書中で開示される本発明の他の具体的に意図された実施形態は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、リボザイムおよびアンチセンス分子、ならびに天然の供給源または合成由来にせよ、代替の骨格に基づくか、または代替の塩基を含む核酸分子である。例えば、アンチセンス分子は、ＲＮＡ、あるいは他の分子（ペプチド核酸（ＰＮＡ）または塩基対依存様式でＤＮＡもしくはＲＮＡに特異的に結合する非核酸分子（例えば、ホスホロチオエート誘導体）を含む）であり得る。当業者は、３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドおよび本明細書中で開示されるポリヌクレオチド配列を使用して、核酸分子のこれらのクラスを容易に獲得し得る。
アンチセンス技術は、細胞内部に位置する標的ポリヌクレオチドに結合する外因性オリゴヌクレオチドの投与を含む。用語「アンチセンス」は、このようなオリゴヌクレオチドが、その細胞内標的（例えば、３６Ｐ６Ｄ５）に相補的であるという事実をいう。例えば、Ｊａｃｋ Ｃｏｈｅｎ，ＯＬＩＧＯＤＥＯＸＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９８８；およびＳｙｎｔｈｅｓｉｓ １：１−５（１９８８）を参照のこと。
本発明の３６Ｐ６Ｄ５アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｓオリゴヌクレオチド（ホスホロチオエート誘導体またはＳ−オリゴ、Ｊａｃｋ Ｃｏｈｅｎ、前出を参照のこと）のような誘導体を含み、この誘導体は、癌細胞増殖阻害作用の増大を示す。Ｓ−オリゴ（ヌクレオシドホスホロチオエート）は、オリゴヌクレオチド（Ｏ−オリゴ）の等電子アナログであり、リン酸基の非架橋酸素原子は、硫酸原子に置換される。本発明のＳ−オリゴは、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（これは、イオウ転移試薬である）での対応するＯ−オリゴの処理によって調製され得る。Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：４６９３−４６９８（１９９０）；およびＩｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：１２５３−１２５４（１９９０）（これらの開示は、本明細書中で参考として完全に援用される）を参照のこと。本発明のさらなる３６Ｐ６Ｄ５アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当該分野で公知のモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む（例えば、Ｐａｒｔｒｉｇｅら、１９９６，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＆Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ６：１６９−１７５を参照のこと）。
本発明の３６Ｐ６Ｄ５アンチセンスオリゴヌクレオチドは、代表的に、３６Ｐ６Ｄ５ゲノム配列もしくは対応するｍＲＮＡの、最初の１００個のＮ末端コドンまたは最後の１００個のＣ末端コドンに相補的であり、そしてこれらのコドンと安定にハイブリダイズする、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。完全な相補性は必要ではないが、高い程度の相補性が好ましい。この領域に相補的なオリゴヌクレオチドの使用は、３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡへの選択的ハイブリダイゼーションを可能にし、そしてタンパク質キナーゼの他の調節サブユニットを特定するｍＲＮＡへの選択的ハイブリダイゼーションを可能にしない。好ましくは、本発明の３６Ｐ６Ｄ５アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡにハイブリダイズする配列を有するアンチセンスＤＮＡ分子の１５〜３０ｍｅｒフラグメントである。必要に応じて、３６Ｐ６Ｄ５アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３６Ｐ６Ｄ５の最初の１０個のＮ末端コドンおよび最後の１０個のＣ末端コドンにおける領域に相補的な３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドである。あるいは、アンチセンス分子は、３６Ｐ６Ｄ５発現の阻害において、リボザイムを利用するように改変される。Ｌ．Ａ．ＣｏｕｔｕｒｅおよびＤ．Ｔ．Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：５１０−５１５（１９９６）。
本発明のこの局面のさらなる特定の実施形態は、プライマーおよびプライマーペアを含み、これは、本発明のポリヌクレオチドまたはその任意の特定の部分の特異的増幅、および本発明の核酸分子またはその任意の部分に選択的もしくは特異的にハイブリダイズするプローブの特異的増幅を可能にする。プローブは、検出可能なマーカー（例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生体発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素のような）で標識され得る。このようなプローブおよびプライマーが、サンプルにおける３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドの存在を検出するために使用され得、そして３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を発現する細胞を検出するための手段として使用され得る。
このようなプローブの例としては、配列番号１に示されるヒト３６Ｐ６Ｄ５ ｃＤＮＡ配列の、すべてまたは一部分を含むポリペプチドが挙げられる。３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡを特異的に増幅し得るプライマーペアの例はまた、続く実施例において記載される。当業者に理解されるように、非常に多くの異なるプライマーおよびプローブが、本明細書中に提供される配列に基づいて調製され得、そして３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡを有効に増幅および／または検出するために使用され得る。
本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドは、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子ではない遺伝子に、対応するかまたは相補的である混入ポリヌクレオチド、または３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物もしくはそのフラグメントではないポリペプチドをコードする混入ポリヌクレオチドから実質的に分離されている場合、「単離された」と言われる。当業者は、容易に核酸単離手順を利用して、単離された３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドを獲得し得る。
本発明の３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドは、種々の目的に有用である。この目的としては、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子、ｍＲＮＡまたはそのフラグメントの、増幅および／または検出のための、プローブおよびプライマーとしての使用；前立腺癌および他の癌の、診断および／または予後のための試薬としての使用；３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチドの発現を指向し得るコード配列としての使用；３６Ｐ６Ｄ５遺伝子の発現および／または３６Ｐ６Ｄ５転写物の翻訳を、調節または阻害するための手段としての使用；ならびに治療薬としての使用が挙げられるが、これらに限定されない。
（３６Ｐ６Ｄ５をコードする核酸分子の単離）
本明細書中に記載される３６Ｐ６Ｄ５ ｃＤＮＡ配列は、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物をコードする他のポリヌクレオチドの単離、ならびに３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物ホモログ、代わりにスプライシングされたアイソフォーム、対立遺伝子改変体、および３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物の変異体形態をコードするポリヌクレオチドの単離を可能にする。３６Ｐ６Ｄ５遺伝子をコードする全長ｃＤＮＡを単離するために利用され得る種々の分子クローニング方法は、周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓを参照のこと）。例えば、λファージクローニング方法論が、市販のクローニング系を使用して慣用的に利用され得る（例えば、Ｌａｍｂｄａ ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。３６Ｐ６Ｄ５遺伝子ｃＤＮＡを含むファージクローンは、標識された３６Ｐ６Ｄ５ ｃＤＮＡまたはそのフラグメントを用いて調べることにより同定され得る。例えば、一つの実施形態において、３６Ｐ６Ｄ５ ｃＤＮＡ（図１Ａ〜１Ｄ；配列番号１）またはその一部分が、合成され、そしてプローブとして使用されて、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子に対応する重複するｃＤＮＡおよび３６Ｐ６Ｄ５遺伝子に対応する全長ｃＤＮＡを回収し得る。３６Ｐ６Ｄ５遺伝子自体は、３６Ｐ６Ｄ５ ＤＮＡプローブまたはプライマーを使用して、ゲノムＤＮＡライブラリー、細菌人工染色体ライブラリー（ＢＡＣ）、酵母人工染色体ライブラリー（ＹＡＣ）などをスクリーニングすることによって単離され得る。
（組換えＤＮＡ分子および宿主−ベクター系）
本発明はまた、３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡまたはＲＮＡ分子（これには、当該分野において周知のファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ならびに種々のウイルス性および非ウイルス性ベクターが含まれるが、これらに限定されない）、およびこのような組換えＤＮＡまたはＲＮＡ分子で形質転換またはトランスフェクトされた細胞を提供する。本明細書中で使用される場合、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、インビトロでの分子操作に供されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。このような分子を生成するための方法は周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９（前出）を参照のこと）。
本発明はさらに、適切な原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞において３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子を含む、宿主−ベクター系を提供する。適切な真核生物宿主細胞の例としては、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス感染可能細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）またはＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞））が挙げられる。適切な哺乳動物細胞の例としては、種々の前立腺癌細胞株（例えば、ＰｒＥＣ、ＬｎＣａＰおよびＴｓｕＰｒ１）、他のトランスフェクト可能であるかまたは形質導入可能な前立腺細胞株、ならびに組換えタンパク質の発現のために慣用的に使用される多くの哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞）が挙げられる。より詳細には、３６Ｐ６Ｄ５のコード配列を含むポリヌクレオチドを使用し、当該分野で慣用的に使用され、そして広く知られたかなり多数の宿主−ベクター系のいずれかを用いて、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質またはそれらのフラグメントを生成し得る。
３６Ｐ６Ｄ５タンパク質またはそれらのフラグメントの発現に適切な広範な種々の宿主−ベクター系が利用可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９（前出）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５（前出）を参照のこと）。哺乳動物での発現に好ましいベクターとしては、ｐｃＤＮＡ ３．１ ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ｔａｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびレトロウイルスベクターｐＳＲαｔｋｎｅｏ（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９１、ＭＣＢ １１：１７８５）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの発現ベクターを使用して、３６Ｐ６Ｄ５は、好ましくは、いくつかの前立腺癌細胞株および非前立腺癌細胞株（例えば、２９３、２９３Ｔ、ｒａｔ−１、ＮＩＨ３Ｔ３およびＴｓｕＰｒ１を含む）において発現させ得る。本発明の宿主−ベクター系は、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質またはそれらのフラグメントの産生のために有用である。このような宿主−ベクター系は、３６Ｐ６Ｄ５および３６Ｐ６Ｄ５変異の機能的特性を研究するために使用され得る。
組換えヒト３６Ｐ６Ｄ５タンパク質は、３６Ｐ６Ｄ５をコードする構築物でトランスフェトされた哺乳動物細胞によって産生され得る。実施例に記載される例示的な実施形態において、２９３Ｔ細胞は、３６Ｐ６Ｄ５をコードする発現プラスミドでトランスフエェクトされ得、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質は、２９３Ｔ細胞に発現され、そして組換え３６Ｐ６Ｄ５タンパク質は、標準的な精製方法（例えば、抗３６Ｐ６Ｄ５抗体を用いるアフィニティ精製）を用いて単離され得る。本明細書中で実施例にも記載される別の実施形態において、３６Ｐ６Ｄ５コード配列は、レトロウイルスベクターｐＳＲαＭＳＶｔｋｎｅｏへとサグクローニングされ、そして３６Ｐ６Ｄ５発現細胞株を確立するために、種々の哺乳動物細胞株（例えば、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、ＴｓｕＰｒ１細胞、２９３細胞およびｒａｔ−１細胞）を感染させるために使用される。当該分野において周知の種々の他の発現系がまた利用され得る。３６Ｐ６Ｄ５コード配列にインフレームで結合したリーダーペプチドをコードする発現構築物は、分泌形態の組換え３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の生成のために利用され得る。
３６Ｐ６Ｄ５遺伝子またはそれらのフラグメントによってコードされるタンパク質は、種々の用途を有する。これには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体の産生、および３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物に結合する、リガンドおよび他の因子および細胞構成要素を同定するための方法において。３６Ｐ６Ｄ５タンパク質（例えば、３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチド）またはそれらのフラグメントに対して惹起された抗体は、診断および予後アッセイ、ならびに３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の発現によって特徴付けられるヒト癌（腎臓肺癌、結腸癌、前立腺癌、脳腫瘍、膀胱癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌および乳癌を含むが、これに限定されない）の管理における画像化方法において有用であり得る（例えば、図４、６および７を参照）。このような抗体は、細胞内に発現され得、そしてこのような癌を有する患者の処置方法において使用され得る。３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の検出のために有用な種々の免疫学的アッセイが意図され、これには、ＦＡＣＳ分析、種々の型のラジオイムノアッセイ、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光アッセイ（ＥＬＩＦＡ）、免疫細胞学的方法などが挙げられるが、これらに限定されない。
このような抗体は、標識され得、そして３６Ｐ６Ｄ５発現細胞を検出し得る免疫学的画像化試薬として使用され得る（例えば、ラジオシンチグラフィ（ｒａｄｉｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｉｃ）画像化方法において）。３６Ｐ６Ｄ５タンパク質はまた、以下にさらに記載されるように、癌ワクチンを生成するにおいて特に有用であり得る。
（３６Ｐ６Ｄ５タンパク質）
本発明の別の局面は、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質およびそのポリペプチドフラグメントを提供する。本発明の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質としては、本明細書中で特に同定されたタンパク質、ならびに対立遺伝子改変体、保存的置換改変体およびホモログ（これらは、以下に概説される方法に従って過度な実験を伴わずに単離／生成および特徴付けされ得る）が挙げられる。異なる３６Ｐ６Ｄ５タンパク質またはそのフラグメントの部分を組合せる融合タンパク質、ならびに３６Ｐ６Ｄ５タンパク質および異種ポリペプチドの融合タンパク質もまた含まれる。このような３６Ｐ６Ｄ５タンパク質は、集合的に、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質、本発明のタンパク質、または３６Ｐ６Ｄ５という。本明細書中で使用される場合、用語「３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチド」は、少なくとも６個のアミノ酸（好ましくは、少なくとも１５個のアミノ酸）のポリペプチドフラグメントまたは３６Ｐ６Ｄ５タンパク質をいう。
３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の特定の実施形態は、配列番号２に示されるようなヒト３６Ｐ６Ｄ５のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。あるいは、３６Ｐ６Ｄ５のタンパク質の実施形態は、配列番号２に示されるようなヒト３６Ｐ６Ｄ５のアミノ酸配列における変更を有する改変ポリペプチドを含む。
一般的に、ヒト３６Ｐ６Ｄ５の天然に存在する対立遺伝子改変体は、高い程度の構造的同一性および相同性（例えば、９０％以上の同一性）を共有する。代表的に、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の対立遺伝子改変体は、本明細書中に記載される３６Ｐ６Ｄ５配列内に保存的アミノ酸置換を含むか、または３６Ｐ６Ｄ５ホモログにおいて対応する位置に由来するアミノ酸の置換を含む。３６Ｐ６Ｄ５対立遺伝子改変体の１つのクラスは、特定の３６Ｐ６Ｄ５アミノ酸配列の少なくとも小さな領域と高い程度の相同性を共有するが、この配列とは根本的な逸脱（例えば、非保存的置換、短縮化（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、挿入、またはフレームシフト）をさらに含むタンパク質である。
保存的アミノ酸置換はしばしば、タンパク質のコンフォメーションも機能も変更することなく、タンパク質中で作製され得る。このような変化としては、以下が挙げられる：任意のイソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、およびロイシン（Ｌ）の、任意の他のこれらの疎水性アミノ酸に対する置換；グルタミン酸（Ｅ）に対するアスパラギン酸（Ｄ）、およびその逆の置換；アスパラギン（Ｎ）に対するグルタミン（Ｑ）、およびその逆の置換；ならびに、スレオニン（Ｔ）に対するセリン（Ｓ）、およびその逆の置換。他の置換はまた、タンパク質の三次元構造における特定のアミノ酸の環境およびその役割に依存して、保存的とみなされ得る。例えば、グリシン（Ｇ）およびアラニン（Ａ）は、しばしば交換可能であり得、アラニン（Ａ）およびバリン（Ｖ）も同様であり得る。比較的疎水性であるメチオニン（Ｍ）はしばしば、ロイシンおよびイソロイシンと交換可能であり得、そして時としてバリンと交換可能であり得る。リシン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）はしばしば、そのアミノ酸残基の重要な特徴がその電荷であり、そしてこれら２つのアミノ酸残基の異なるｐＫが重要でない位置において、交換可能である。さらに他の変化が、特定の状況において、「保存的」とみなされ得る。
本明細書中に開示される本発明の実施形態は、広範な種々の当該分野で認められた３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の改変体（例えば、アミノ酸の挿入、欠失および置換を有するポリペプチド）を含む。３６Ｐ６Ｄ５改変体は、当該分野において公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発、アラニンスキャニング（ａｌａｎｉｎｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ）、およびＰＣＲ変異誘発）を使用して作製され得る。部位特異的変異誘発（Ｃａｒｔｅｒら、１９８６、Ｎｕｄ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４３３１；Ｚｏｌｌｅｒら、１９８７、Ｎｕｄ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７）、カセット式変異誘発（Ｗｅｌｌら、１９８５、Ｇｅｎｅ ３４：３１５）、制限選択的変異誘発（Ｗｅｌｌｓら、１９８６、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ Ｓｅｒ．Ａ、３１７：４１５）または他の公知技術を、クローン化されたＤＮＡにおいて実施し、３６Ｐ６Ｄ５改変体ＤＮＡを産生し得る。走査型アミノ酸分析もまた、連続配列に沿って１以上のアミノ酸を同定するために使用され得る。とりわけ好ましい走査アミノ酸は、比較的小さい中性アミノ酸である。このようなアミノ酸としては、アラニン、グリシン、セリン、およびシステインが挙げられる。アラニンが、代表的に、この群の中で好ましい走査アミノ酸である。なぜなら、アラニンは、β炭素を越えて側鎖を排除し、そして改変体の主鎖コンフォメーションを変更する可能性が低いからである。アラニンもまた、代表的に好ましい。なぜなら、アラニンは、最も一般的なアミノ酸であるからである。さらに、埋没位置および露出位置の両方において、頻繁に見出される（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．、ＮＹ）；Ｃｈｏｔｈｉａ、１９７６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５０：１）。アラニン置換が適切な量の改変体を生じない場合には、同配体アミノ酸が使用され得る。
本明細書中で規定される場合、３６Ｐ６Ｄ５改変体は、配列番号２のアミノ酸配列を有する３６Ｐ６Ｄ５タンパク質と共通した少なくとも１つのエピトープを有するという顕著な特性を有し、その結果、３６Ｐ６Ｄ５改変体に特異的に結合する抗体はまた、配列番号２のアミノ酸配列を有する３６Ｐ６Ｄ５タンパク質に特異的に結合する。ポリペプチドは、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質に特異的に結合する抗体によって認識され得るエピトープをもはや含まない場合、配列番号２に示されるタンパク質の改変体でなくなる。当業者は、タンパク質を認識する抗体が、種々のサイズを有するエピトープに結合し、そして約６個のアミノ酸（連続または不連続）の順序の分類は、最小のエピトープにおけるアミノ酸の代表的な数としてみなされることを理解する。例えば、Ｈｅｂｂｅｓら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）２６（９）：８６５−７３；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８５）１３５（４）：２５９８−６０８を参照のこと。最小６個のアミノ酸エピトープ内の所定の位置に含まれ得る約２０個のアミノ酸があるので、偶然に起こるこのようなエピトープのおおよその確率は、少なくとも２０6、すなわち６４００万分の１である。３６Ｐ６Ｄ５タンパク質改変体の別の特定のクラスは、配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を共有する。３６Ｐ６Ｄ５タンパク質改変体の別の特定のクラスは、以下に記載される１以上の３６Ｐ６Ｄ５生物学的モチーフを含む。
上記で考察したように、特許請求された本発明の実施形態は、配列番号２に示される３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の２３５未満のアミノ酸配列を含むポリペプチド（およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を含む。例えば、本明細書中に開示される本発明の代表的な実施形態は、以下が挙げられる：配列番号２に示される３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のおおよそアミノ酸１〜おおよそアミノ酸１０からなるポリペプチド、配列番号２に示される３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のおおよそアミノ酸２０〜おおよそアミノ酸３０からなるポリペプチド、配列番号２に示される３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のおおよそアミノ酸３０〜おおよそアミノ酸４０からなるポリペプチド、配列番号２に示される３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のおおよそアミノ酸４０〜おおよそアミノ酸５０からなるポリペプチド、配列番号２に示される３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のおおよそアミノ酸５０〜おおよそアミノ酸６０からなるポリペプチド、配列番号２に示される３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のおおよそアミノ酸６０〜おおよそアミノ酸７０からなるポリペプチド、配列番号２に示される３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のおおよそアミノ酸７０〜おおよそアミノ酸８０からなるポリペプチド、配列番号２に示される３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のおおよそアミノ酸８０〜おおよそアミノ酸９０からなるポリペプチド、および配列番号２に示される３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のおおよそアミノ酸９０〜おおよそアミノ酸１００からなるポリペプチドなど。このスキームに従って、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のアミノ酸１００〜２７３のアミノ酸配列の部分からなるポリペプチドが、本発明の代表的な実施形態である。３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のより大きな部分からなるポリペプチドもまた意図される。例えば、配列番号２に示される３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のおおよそアミノ酸１（または、２０もしくは３０もしくは４０など）〜おおよそアミノ酸２０（または、３０もしくは４０もしくは５０など）からなるポリペプチドが、当該分野において周知の種々の技術によって生成され得る。
本明細書中に開示される本発明のさらなる例示的な実施形態は、配列番号２に示されるような３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチド配列内に含まれる１以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含む３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチドを含む。１つの実施形態では、本発明の代表的ポリペプチドは、残基１２０〜１２３におけるＮＶＴＡ、および／または残基２０８〜２１１におけるＮＨＳＤのような１以上の３６Ｐ６Ｄ５ Ｎ−グリコシル化部位を含み得る（配列番号２）。別の実施形態では、本発明の代表的ポリペプチドは、残基４３〜４５におけるＳＩＲおよび／または残基１６０〜１６２におけるＳＴＲのような１以上の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質キナーゼＣリン酸化部位を含み得る（配列番号２）。別の実施形態では、本発明の代表的ポリペプチドは、残基４６〜４９でＳＩＧＥおよび／または残基１５５〜１５８におけるＴＹＤＤのような１以上の３６Ｐ６Ｄ５カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位を含み得る（配列番号２）。別の実施形態では、本発明の代表的ポリペプチドは、残基８１〜８６におけるＧＧＧＲＳＫ、残基１０８〜１１３におけるＧＩＮＩＡＩおよび／または残基１１９〜１２４におけるＧＮＶＴＡＴのような１以上のＮ−ミリストイル化部位を含み得る（配列番号２）。別の実施形態において、本発明の代表的ポリペプチドは、残基５〜３６におけるアミノ酸パーミアーゼサインＡＧＧＬＬＫＶＶＦＶＶＦＡＳＬＣＡＷＹＳＧＹＬＬＡＥＬＩＰＤＡＰを含み得る（配列番号２）。別の実施形態において、本発明の代表的なポリペプチドは、図１に示されるシグナル配列を含み得る。なお別の実施形態において、本発明の代表的なポリペプチドは、本明細書中に記載されるプロセスによって同定される１以上の免疫原性エピトープ（例えば、図１に示されるエピトープ）を含み得る。これらの発明の関連する実施形態は、上記の異なるモチーフの組合せを含むポリペプチドを含み、好ましい実施形態は、これらのポリペプチドのモチーフまたは介在性配列のいずれかの内に、挿入、欠失または置換は含まないものである。さらに、多くのＮ末端および／またはＣ末端のいずれかのアミノ酸残基をこれらのモチーフのいずれかの側に含む実施形態が望ましくあり得る（例えば、モチーフが配置されるポリペプチド構造のより多くの部分を含むために）。代表的には、モチーフのいずれかの側のＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸残基の数は、約５〜約５０個の間のアミノ酸残基であり得る。
このような実施形態の例示的な例としては、ＳＩＲおよび／またはＳＩＧＥおよび／またはＮＨＳＤ（配列番号２）からなる群から選択される１以上のモチーフを有するポリペプチドが挙げられる。あるいは、本明細書中に開示される生物学的モチーフの他の組合せを有するポリペプチドがまた、意図される（例えば、ＳＩＲおよび他の生物学的モチーフの任意の１つ（例えば、ＳＩＧＥ）を有するポリペプチドまたはＴＹＤＤおよび他の生物学的モチーフの任意の１つ（例えば、ＧＧＧＲＳＫ）を有するポリペプチドなど）（配列番号２）。
上記の１以上の３６Ｐ６Ｄ５モチーフからなるポリペプチドは、上記の３６Ｐ６Ｄ５モチーフが増殖調節不全に関係するという観察において、そして３６Ｐ６Ｄ５が癌において過剰発現されるので、悪性の表現型の特定の特性を明らかにする際に有用である（図４、６および７）。例としてのカゼインキナーゼＩＩおよびタンパク質キナーゼＣは、悪性の表現型の発生に関係すると知られている酵素である（例えば、Ｃｈｅｎら、１９９８、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．、７８（２）：１６５−１７４；Ｇａｉｄｄｏｎら、１９９５、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６（１０）：４３３１−４３３８；Ｈａｌｌら、１９９６、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４（６）：１１１９−１１２６；Ｐｅｔｅｒｚｉｅｌら、１９９９、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８（４６）：６３２２−６３２９；およびＯ’Ｂｒａｉｎ、１９９８、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．５（２）：３０５−３０９を参照のこと）。さらに、グリコシル化とミリストイル化の両方はまた、癌および癌の進行に関連するタンパク質修飾である（例えば、Ｄｅｎｎｉｓら、１９９９、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４７３（１）：２１−３４；Ｒａｊｕら、１９９７、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２３５（１）：１４５−１５４を参照のこと）。
以前の段落のポリペプチドは、多くの異なる特定の用途を有する。３６Ｐ６Ｄ５は、種々の癌（腎臓癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌および肺癌を含む）の細胞株および／または患者のサンプルにおいて発現することが示されるので（例えば、図４、６および７を参照）、これらのポリペプチドは、正常組織 対 癌性組織における３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物の状態を評価し、そして悪性の表現型を明らかにする方法において使用され得る。代表的には、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の特定の領域をコードするポリペプチドは、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物の特定の領域（例えば、ＲＮＡ結合モチーフを含む領域）において、摂動（例えば、欠失、挿入、点変異など）の存在を評価するために使用され得る。例示的なアッセイは、正常組織 対 癌性組織におけるこの領域の特性を評価するために、３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチド配列内に含まれる１以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含む３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチドを標的化する抗体を使用し得る。あるいは、３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチド配列内に含まれる１以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含む３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチドは、３６Ｐ６Ｄ５のこの領域と相互作用する因子についてスクリーニングするために使用され得る。
上で論じられるように、遺伝子暗号における重複性は、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子配列におけるバリエーションを可能とする。具体的には、当業者は、特定の宿主種による特定のコドンの優先度を認識し、そして所望の宿主に対して好ましいとして、開示された配列を適用し得る。例えば、好ましいコドン配列は、典型的に、より高頻度のコドンで置換される珍しいコドン（すなわち、所望の宿主の公知の配列において、約２０％未満の使用頻度を有するコドン）を有する。特定の生物に対するコドン優先度は、例えば、以下のアドレスでインターネット上で利用可能なコドン使用頻度表を利用することによって計算され得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／〜ｎａｋａｍｕｒａ／ｃｏｄｏｎ．ｈｔｍｌ．。約２０％未満の使用頻度を有する任意のコドンを置換することによって特定の宿主種に対して最適化されたヌクレオチド配列は、本明細書中で「コドン最適化配列」という。
細胞宿主においてタンパク質発現を増強するためのさらなる配列修飾は、公知である。
これらは、偽のポリアデニル化シグナル、エキソン／イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様反復をコードする配列および／または遺伝子発現に対して有害であり得るような他の十分に特徴付けられた配列の排除を含む。この配列のＧＣ含量は、宿主細胞において発現される公知の遺伝子に対する参照によって計算される場合、所定の細胞宿主に対して平均のレベルに調整され得る。可能な場合、この配列はまた、予測されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を避けるために修飾され得る。他の有用な改変は、Ｋｏｚａｋ、１９８９、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、９：５０７３−５０８０に記載されるように、オープンリーディングフレームの開始での翻訳開始コンセンサス配列の付加を含む。偽のポリアデニル化配列の排除、エキソン／イントロンスプライシングシグナルの排除、トランスポゾン様反復の排除および／またはコドン最適化に加えてのＧＣ含量の最適化によって所定の宿主種において発現に対して最適化されたヌクレオチド配列は、本明細書中で「発現増強配列」という。
３６Ｐ６Ｄ５タンパク質は、多くの形態で、好ましくは、単離された液体で、具体化され得る。本明細書中で使用される場合、タンパク質は、物理的、機械的または化学的方法が利用され、通常３６Ｐ６Ｄ５タンパク質と結合する細胞成分から３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を除去する場合、「単離」されるといわれる。当業者は、標準的な精製方法を容易に用いて、単離された３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を得ることができる。精製された３６Ｐ６Ｄ５タンパク質分子は、抗体または他のリガンドメインへの３６Ｐ６Ｄ５の結合を減少させるほかのタンパク質または分子が実質的にない。単離および精製の性質および程度は、意図される用途に依存する。３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の実施形態は、精製された３６Ｐ６Ｄ５タンパク質および機能的な可溶性タンパク質を含む。１つの形態において、このような機能的な可溶性３６Ｐ６Ｄ５タンパク質またはそれらのフラグメントは、抗体または他のリガンドメインに結合する能力を保持する。
本発明はまた、３６Ｐ６Ｄ５アミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメントを含む３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチド（例えば、配列番号２に示されるような３６Ｐ６Ｄ５に対するアミノ酸配列の部分に対応するポリペプチド）を提供する。本明細書中のこのようなポリペプチドは、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の性質（例えば、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質に結合するエピトープに特異的に結合する抗体の生成を誘発する能力）を示す。
３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチドは、本明細書中に開示されるヒト３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のアミノ酸配列に基づいて、当該分野において周知の、標準的なペプチド合成技術を使用して、または化学切断方法を使用して生成され得る。あるいは、組換え方法を使用して、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のポリペプチドフラグメントをコードする核酸分子を生成し得る、この点において、本明細書中に記載される３６Ｐ６Ｄ５コード核酸分子は、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の規定のフラグメントを生成するために手段を提供する。３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチドは、ドメイン特異的抗体（例えば、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の細胞外エピトープおよび細胞内エピトープを認識する抗体）の生成および特徴付け、３６Ｐ６Ｄ５またはその特定の構造ドメインに結合する薬剤または細胞因子の同定、および種々の治療状況（癌ワクチンを含むが、これらに限定されない）において、特に有用である。
特定の興味深い構造を含む３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチドは、例えば、以下：Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｋａｒｐｌｕｓ−ＳｃｈｕｌｔｚまたはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析の方法を含む、当該分野で周知の種々の分析技術を使用するか、または免疫原性に基づいて、予測および／または同定され得る。このような構造を含むフラグメントは、サブユニット特異的抗３６Ｐ６Ｄ５抗体の生成において、または３６Ｐ６Ｄ５に結合する細胞因子の同定において、特に有用である。
以下の実施例に記載される実施形態において、３６Ｐ６Ｄ５は、Ｃ末端６×ＨｉｓおよびＭＹＣタグ（ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨＩＳ、Ｉｍｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＴａｇ５（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ ＴＮ）を有する、３６Ｐ６Ｄ５をコードするＣＭＶ駆動発現ベクターのような市販の発現ベクターでトランスフェクトされた細胞（例えば、２９３Ｔ細胞）において、簡便に発現され得る。このＴａｇ５ベクターは、ＩｇＧＫ分泌シグナル（これは、トランスフェクトされた細胞において分泌３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の産生を容易にするために用いられ得る）を提供する。培養培地中の分泌されたＨＩＳタグ化ＰＳＣＡは、標準的な技術を使用して、ニッケルカラムを使用して精製され得る。
３６Ｐ６Ｄ５の改変（例えば、共有結合性改変）は、本発明の範囲内に含まれる。１つの型の共有結合性改変としては、３６Ｐ６Ｄ５の選択された側鎖あるいはＮ末端残基またはＣ末端残基と反応し得る有機誘導体化薬剤での、３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチドの標的化されたアミノ酸残基の反応が挙げられる。本発明の範囲内の３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチドの別の型の共有結合性改変としては、このポリペプチドのネイティブなグリコシル化パターンの変更が挙げられる。「ネイティブなグリコシル化パターンの変更」は、本明細書中の目的のために、ネイティブ配列３６Ｐ６Ｄ５に見い出される１以上の糖質部分の欠失（基礎となるグリコシル化部位の除去、または化学的手段および／または酵素的手段によるグリコシル化の欠失のいずれかによって）、および／またはネイティブ配列３６Ｐ６Ｄ５に存在しない、１以上のグリコシル化部位の付加を意味することが意図される。さらに、この句は、存在する種々の糖質部分の性質および割合の変更を含む、ネイティブタンパク質のグリコシル化の質的変化を含む。３６Ｐ６Ｄ５の別の型の共有結合性改変としては、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号に示されるような様式の、種々の非タンパク質様ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン）のうちの１つへの、３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチドの連結が挙げられる。
本発明の３６Ｐ６Ｄ５はまた、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合された３６Ｐ６Ｄ５を含むキメラ分子を形成する様式で、改変され得る。１つの実施形態において、このようなキメラ分子としては、ポリヒスチジンエピトープタグを有する３６Ｐ６Ｄ５の融合体が挙げられ、このタグは、固定されたニッケルが選択的に結合し得るエピトープを提供する。このエピトープタグは、一般に、３６Ｐ６Ｄ５のアミノ末端またはカルボキシル末端に配置される。代替的実施形態において、このキメラ分子は、３６Ｐ６Ｄ５の免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域との融合体を含み得る。キメラ分子の二価形態（「免疫付着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）」とも呼ばれる）について、このような融合体は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対するものであり得る。このＩｇ融合体は、好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域の代わりに、３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチドの可溶性（膜貫通ドメインを欠失または不活性化した）形態での置換を含む。特に好ましい実施形態において、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧＩ分子のヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域、またはヒンジ領域、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の産生については、米国特許第５，４２８，１３０号（１９９５年６月２７日公布）もまた参照のこと。
（３６Ｐ６Ｄ５抗体）
用語「抗体」は、最も広範な意味で用いられ、そして具体的には、単一の抗３６Ｐ６Ｄ５モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニストおよび中和抗体を含む）およびポリエピトープ性（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ）特異性を有する抗３６Ｐ６Ｄ５抗体組成物を網羅する。本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体をいう。すなわち、この抗体を含有する個々の集団は、少量で存在し得る、可能な天然に存在する変異体を除いて同一である。
本発明の別の局面は、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質およびポリペプチドに結合する抗体を提供する。最も好ましい抗体は、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質に対して特異的に結合し、そして非３６Ｐ６Ｄ５タンパク質およびポリペプチドに対しては結合しない（または弱く結合する）。特に意図される抗３６Ｐ６Ｄ５抗体として、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、ならびにこれらの抗体の抗原結合ドメインおよび／または１つ以上の相補性決定領域を含有しているフラグメントが挙げられる。本明細書中で使用される場合は、抗体フラグメントは、その標的（すなわち、抗原結合領域）に対して結合する免疫グロブリン分子の可変領域の少なくとも一部として定義される。
本発明の３６Ｐ６Ｄ５抗体は、前立腺癌診断アッセイおよび前立腺癌予後アッセイ、ならびに画像化法において特に有用であり得る。細胞内発現された抗体（例えば、単鎖抗体）は、３６Ｐ６Ｄ５の発現が関与する癌（例えば、進行性前立腺癌および転移性前立腺癌）を処置する際に、治療的に有用であり得る。このような抗体は、３６Ｐ６Ｄ５がまた、他の型の癌（例えば、前立腺癌、肝臓癌、腎臓癌、膀胱癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌および肺癌）において発現または過剰発現される限り、これらの他の癌の処置、診断および／または予後において有用であり得る。
３６Ｐ６Ｄ５抗体はまた、例えば、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の生物学的活性を調節するかもしくは阻害することによるか、または３６Ｐ６Ｄ５タンパク質もしくは３６Ｐ６Ｄ５結合パートナーを発現する癌細胞を標的化するかもしくは破壊することにより、治療的に使用され得る。３６Ｐ６Ｄ５は、分泌タンパク質であるので、抗体は、そのレセプターに結合する３６Ｐ６Ｄ５の能力、またはそれを介してその生物学的活性を示す他のタンパク質と相互作用する３６Ｐ６Ｄ５の能力をブロックするために治療的に有用であり得る。
本発明はまた、３６Ｐ６Ｄ５および変異体３６Ｐ６Ｄ５のタンパク質およびポリペプチドの、検出および定量に有用な種々の免疫学的アッセイを提供する。このような方法およびアッセイは、一般に、適切には、３６Ｐ６Ｄ５または変異体３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を認識および結合し得る、１以上の３６Ｐ６Ｄ５抗体を含み、そして、以下を含むが、これらに限定されない当該分野で周知の種々の免疫学的アッセイ形式で行われ得る：種々の型のラジオイムノアッセイ、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素連結免疫蛍光アッセイ（ＥＬＩＦＡ）など。さらに、３６Ｐ６Ｄ５を発現する前立腺癌および他の癌を検出し得る、免疫学的画像化方法もまた、本発明によって提供され、これらには、標識した３６Ｐ６Ｄ５抗体を使用するラジオシンチグラフィー画像化方法が挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは、３６Ｐ６Ｄ５を発現する癌（例えば、前立腺癌細胞株、乳癌、膵臓癌細胞株、結腸癌細胞株および卵巣癌細胞株）の検出、モニタリングおよび予後において、臨床的に有用であり得る。
３６Ｐ６Ｄ５抗体はまた、３６Ｐ６Ｄ５および変異体３６Ｐ６Ｄ５のタンパク質およびポリペプチドの精製、ならびに３６Ｐ６Ｄ５ホモログおよび関連分子の単離のための方法において使用され得る。例えば、１つの実施形態において、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を精製する方法は、３６Ｐ６Ｄ５抗体（これは、固体マトリックスに結合されている）を、３６Ｐ６Ｄ５を含有する溶解産物または他の溶液と共に、この３６Ｐ６Ｄ５抗体が３６Ｐ６Ｄ５に結合するのを可能にする条件下でインキュベートする工程；固体マトリックスを洗浄して不純物を除去する工程；および３６Ｐ６Ｄ５をその結合された抗体から溶出する工程を包含する。本発明の３６Ｐ６Ｄ５抗体の他の用途としては、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を模倣する抗イディオタイプ抗体の生成が挙げられる。
抗体の調製のための種々の方法が、当該分野で周知である。例えば、抗体は、単離または免疫結合体化された形態の、３６Ｐ６Ｄ５のタンパク質、ペプチドまたはフラグメントを使用して、適切な哺乳動物宿主を免疫することによって調製され得る（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ；Ｈａｒｌｏｗ，１９８９，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８９））。さらに、３６Ｐ６Ｄ５の融合タンパク質（例えば、３６Ｐ６Ｄ５ ＧＳＴ融合タンパク質）もまた使用され得る。特定の実施形態において、配列番号２のオープンリーディングフレームアミノ酸配列の全てまたはほとんどを含むＧＳＴ融合タンパク質が生成され得、そして適切な抗体を生成するための免疫原として使用され得る。別の実施形態では、３６Ｐ６Ｄ５ペプチドは、合成され得、そして免疫原として使用され得る。
さらに、当該分野で公知の裸のＤＮＡ免疫化技術を（精製３６Ｐ６Ｄ５タンパク質または３６Ｐ６Ｄ５発現細胞を用いてかまたは用いずに）使用して、コードされる免疫原に対する免疫応答を生じさせ得る（概説については、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，１９９７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７〜６４８を参照のこと）。
配列番号２に示されるような３６Ｐ６Ｄ５のアミノ酸配列を使用して、抗体を生成するために３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の特定の領域を選択し得る。例えば、３６Ｐ６Ｄ５アミノ酸配列の疎水性および親水性分析を使用して、３６Ｐ６Ｄ５構造の疎水性領域を同定し得る。免疫原性構造を示す３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の領域、ならびに他の領域およびドメインは、以下のような当該分野で公知の種々の他の方法を使用して容易に同定され得る：Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｋａｒｐｌｕｓ−ＳｃｈｕｌｔｚまたはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析。
このことを例示して、ヒトＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ２へ３６Ｐ６Ｄ５タンパク質由来のペプチドの結合を推定し、そして以下の表１に示す。具体的には、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の完全アミノ酸配列を、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ（ＢＩＭＡＳ）ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に見出されるＨＬＡ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｏｔｉｆ Ｓｅａｒｃｈアルゴリズムに入力した。このＨＬＡ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｏｔｉｆ Ｓｅａｒｃｈアルゴリズムは、Ｋｅｎ Ｐａｒｋｅｒ博士により開発され、ＨＬＡクラスＩ分子の溝、および特に、ＨＬＡ−Ａ２中の特異的なペプチド配列の結合に基づく（例えば、Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０−６（１９９１）；Ｈｕｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１２６１−３（１９９２）；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−７（１９９２）；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３−７５（１９９４）を参照のこと）。このアルゴリズムは、ＨＬＡ−Ａ２ならびに他のＨＬＡクラスＩ分子に対する推定される結合のための完全なタンパク質配列に由来する、８マー、９マー、および１０マーのペプチドの位置決定およびランキングを可能にする。ほとんどのＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドが９マーであり、好ましくは、２位にロイシン（Ｌ）、そして９位にバリン（Ｖ）またはロイシン（Ｌ）を含有する（Ｐａｒｋｅｒら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−７）。３６Ｐ６Ｄ５推定結合ペプチドの結果を、以下の表１に示す。表１では、各ファミリーのメンバーについて上位１０の順位の候補物が、その位置、各特定のペプチドのアミノ酸配列、および推定結合スコアと共に示される。結合スコアは、３７℃（ｐＨ６．５）でのペプチド含有複合体の解離の推定半減期に対応する。最も高い結合スコアを有するペプチドは、細胞表面上のＨＬＡクラスＩへ最も密に結合しそれによりＴ細胞認識について最も良好な免疫原性標的を提示すると推定される。ＨＬＡ−Ａ２へのペプチドの実際の結合は、抗原プロセシング欠損細胞株Ｔ２上でのＨＬＡ−Ａ２の発現の安定化によって評価され得る（例えば、Ｘｕｅら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３０：７３−８（１９９７）およびＰｅｓｈｗａら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３６：１２９−３８（１９９８）を参照のこと）。特異的なペプチドの免疫原性は、樹状細胞の存在下でのＣＤ８＋脂肪障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の刺激によってインビトロで評価され得る。
免疫原としての使用のためのタンパク質またはポリペプチドを調製するための方法、およびキャリア（例えば、ＢＳＡ、ＫＬＨまたは他のキャリアタンパク質）とのタンパク質の免疫結合体を調製するための方法は、当該分野で周知である。いくつかの状況下で、例えば、カルボジイミド試薬を使用する直接的な結合体が使用され得；他の例において、連結試薬（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬによって供給される連結試薬）が、効果的であり得る。３６Ｐ６Ｄ５免疫原の投与は一般に、当該分野で一般に理解されるように、適切な期間にわたって、適切なアジュバントの使用を伴う注射によって行われ得る。免疫スケジュールの間、抗体の力価は、抗体形成の能力（ａｄｅｑｕａｃｙ）を決定することによって理解され得る。
３６Ｐ６Ｄ５モノクローナル抗体が好ましく、そして当該分野で周知の種々の手段によって産生され得る。例えば、所望のモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞株が、一般に公知のように、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの標準的なハイブリドーマ技術、または産生性（ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）Ｂ細胞を不死化する改変を使用して調製され得る。
所望の抗体を分泌する不死化細胞株は、抗原が３６Ｐ６Ｄ５タンパク質または３６Ｐ６Ｄ５フラグメントである免疫アッセイによってスクリーニングされる。所望の抗体を分泌する適切な不死化細胞培養物が同定される場合、これらの細胞を展開し、そしてインビトロ培養物または腹水のいずれかから抗体が産生され得る。
抗体またはフラグメントはまた、現在の技術を使用して、組換え手順によって産生され得る。３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の所望の領域に特異的に結合する領域はまた、複数の種起源のキメラ抗体またはＣＤＲグラフト化抗体の状況下で産生され得る。ヒト化３６Ｐ６Ｄ５抗体またはヒト３６Ｐ６Ｄ５抗体もまた産生され得、そして治療的状況下での使用のために好ましい。１以上の非ヒト抗体ＣＤＲを対応するヒト抗体配列と置換することによる、マウス抗体および他の非ヒト抗体をヒト化するための方法は、周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６を参照のこと）。Ｃａｒｔｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５、およびＳｉｍｓら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６もまた参照のこと。完全なヒトモノクローナル抗体を産生するための方法としては、ファージディスプレイ法およびトランスジェニック動物法が挙げられる（概要について、Ｖａｕｇｈａｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：５３５−５３９を参照のこと）。
完全なヒト３６Ｐ６Ｄ５モノクローナル抗体は、大きいヒトＩｇ遺伝子コンビナトリアルライブラリー（すなわち、ファージディスプレイ）を使用するクローニング技術を使用して生成され得る（Ｃｌａｒｋ，Ｍ．編，１９９３，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍａｎ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ Ａｃａｄｅｍｉｃ、４５−６４頁のＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ：ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ；ＢｕｒｔｏｎおよびＢａｒｂａｓ、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（同書）６５−８２頁）。完全なヒト３６Ｐ６Ｄ５モノクローナル抗体はまた、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／２４８９３（ＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９７年１２月３日公開）に記載されるように、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作されたトランスジェニックマウスを使用して産生され得る（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ、１９９８、Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ ７（４）：６０７−６１４もまた参照のこと）。この方法は、ファージディスプレイ技術に必要とされるインビトロ操作を回避し、そして高親和性の真正ヒト抗体を効率的に産生する。
３６Ｐ６Ｄ５抗体の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質との反応性は、適切には、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質、３６Ｐ６Ｄ５ペプチド、３６Ｐ６Ｄ５発現細胞またはその抽出物を使用する、多くの周知の手段（ウエスタンブロット、免疫沈降、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析を含む）によって確証され得る。
本発明の３６Ｐ６Ｄ５抗体またはそのフラグメントは、選択マーカーで標識化されるか、または第２の分子に結合体化され得る。適切な検出マーカーとしては、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素が挙げられるがこれらに限定されない。３６Ｐ６Ｄ５抗体に結合体化するために第２の分子は、意図された使用に従って選択され得る。例えば、治療用途については、第２分子は、毒物または治療剤であり得る。さらに、２以上の３６Ｐ６Ｄ５エピトープに特異的な二特異的抗体が、当該分野で一般に公知の方法を使用して生成され得る。ホモ二量体抗体もまた、当該分野で公知の架橋技術によって生成され得る（例えば、Ｗｏｌｆｆら、１９９３，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２５６０−２５６５）。
（３６Ｐ６Ｄ５トランスジェニック動物）
３６Ｐ６Ｄ５またはその改変形態をコードする核酸はまた、トランスジェニック動物または「ノックアウト」動物のいずれかを生成するために使用され得、これらの動物は、次いで、治療的に有用な試薬の開発およびスクリーニングにおいて有用である。トランスジェニック動物（例えば、マウスまたはラット）は、導入遺伝子を含む細胞を有する動物であり、その導入遺伝子は、その動物に、または出生前（例えば、胚段階）でその動物の祖先に導入される。導入遺伝子は、細胞のゲノム内に組み込まれるＤＮＡであり、トランスジェニック動物は、その細胞から発生する。１つの実施形態において、３６Ｐ６Ｄ５をコードするｃＤＮＡが、確立された技術に従って、３６Ｐ６Ｄ５コードするゲノムＤＮＡをクローニングするために使用され得、そしてそのゲノム配列は、３６Ｐ６Ｄ５をコードするＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を生成するために使用され得る。
トランスジェニック動物（特に、マウスまたはラットのような動物）を生成するための方法は、当該分野で慣用的となり、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号および４，８７０，００９号に記載される。代表的に、特定の細胞が、組織特異的エンハンサーと共に３６Ｐ６Ｄ５導入遺伝子の組み込みのために標的化される。胚段階の動物の生殖系列に導入された、３６Ｐ６Ｄ５をコードする１コピーの導入遺伝子を含むトランスジェニック動物を使用して、３６Ｐ６Ｄ５をコードするＤＮＡの発現の増大の効果を試験し得る。このような動物は、例えば、その過剰発現と関連する病理学的状態からの防御を付与すると考えられる試薬についての、試験動物として使用され得る。本発明のこの局面に従って、動物をその試薬で処置し、そしてこの導入遺伝子を保有する処置していない動物と比較した、その病理学的状態の発生率の減少は、その病理学的状態についての潜在的な治療的介入を示す。
あるいは、３６Ｐ６Ｄ５の非ヒトホモログを使用して、３６Ｐ６Ｄ５「ノックアウト」動物を構築し得、この動物は、３６Ｐ６Ｄ５をコードする内因性遺伝子とその動物の胚細胞に導入された３６Ｐ６Ｄ５をコードする改変ゲノムＤＮＡと間の相同組換えの結果として、３６Ｐ６Ｄ５をコードする欠損性または改変型遺伝子を有する。例えば、３６Ｐ６Ｄ５をコードするｃＤＮＡを使用して、確立された技術に従って、３６Ｐ６Ｄ５をコードするゲノムＤＮＡをクローニングし得る。３６Ｐ６Ｄ５をコードするゲノムＤＮＡの一部は、欠失され得るか、または別の遺伝子（例えば、組み込みをモニターするために使用され得る、選択マーカーをコードする遺伝子）で置換され得る。代表的に、数キロベースの変更されていない隣接ＤＮＡ（５’末端および３’末端の両方）が、そのベクターに含まれる（相同組換えベクターの記載については、例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、１９８７、Ｃｅｌｌ、５１：５０３を参照のこと）。このベクターは、胚性幹細胞株に（例えば、エレクトロポレーションによって）注入され、そして導入されたＤＮＡが内因性のＤＮＡと相同組換えした細胞が、選択される（例えば、Ｌｉら、Ｃｅｌｌ、１９９２、６９：９１５を参照のこと）。次いで、この選択された細胞を、動物（例えば、マウスまたはラット）の胚盤胞に導入し、凝集キメラを形成させる（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編，１９８７（Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ）、１１３−１５２頁を参照のこと）。次いで、キメラ性の胚を、適切な偽妊娠雌性養母動物に移植し、そしてその胚は、満期まで育成させて、「ノックアウト」動物を作製し得る。生殖細胞中に相同組換えされたＤＮＡを有する子孫は、標準的な技術によって同定され得、そしてその子孫を用いて、全ての細胞が相同組換えＤＮＡを含む動物を育種し得る。ノックアウト動物は、例えば、３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチドの非存在に起因する、特定の病理学的状態に対して防御する能力および病理学的状態の発生について、特徴付けられ得る。
（３６Ｐ６Ｄ５の検出のための方法）
本発明の別の局面は、３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドおよび３６Ｐ６Ｄ５タンパク質ならびにそれらの改変体を検出するための方法、ならびに３６Ｐ６Ｄ５を発現する細胞を同定するための方法に関する。３６Ｐ６Ｄ５の発現プロフィールは、それを遺伝子座および／または転移された疾患についての潜在的な診断マーカーにする。この状況において、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物の状態は、進行した状態の疾患に対する感受性、進行速度および／または腫瘍の凝集性を含む、種々の因子を予測するために有用な情報を提供し得る。以下で詳細に議論されるように、患者サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物の状態は、以下を含む当該分野で周知の種々のプロトコルによって分析され得る：免疫組織化学分析、インサイチュハイブリダイゼーションを含む種々のノーザンブロット技術、ＲＴ−ＰＣＲ分析（例えば、レーザー捕捉微小分析サンプルに対して）、ウエスタンブロット分析および組織アレイ分析。
より詳細には、本発明は、生物学的サンプル（例えば、血清、骨、前立腺および他の組織、尿、精液、細胞調製物など）中の３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドの検出のためのアッセイを提供する。検出可能な３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドとしては、例えば、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子またはそのフラグメント、３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡ、選択的スプライシング改変体３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡ、および３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡもしくはＲＮＡ分子が挙げられる。３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドを増幅し、そして／または３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドの存在を検出するための多くの方法は、当該分野において周知であり、そして本発明のこの局面の実施に用いられ得る。
１つの実施形態において、生物学的サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡを検出するための方法は、少なくとも１つのプライマーを使用して、逆転写によってサンプルからｃＤＮＡを産生する工程；その中の３６Ｐ６Ｄ５ ｃＤＮＡを増幅するために、センスおよびアンチセンスのプライマーとして３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドを使用して、そのように産生されたｃＤＮＡを増幅する工程；および増幅された３６Ｐ６Ｄ５ ｃＤＮＡの存在を検出する工程、を包含する。必要に応じて、増幅された３６Ｐ６Ｄ５ ｃＤＮＡの配列が、決定され得る。別の実施形態において、生物学的サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５遺伝子を検出する方法は、サンプルからゲノムＤＮＡを最初に単離する工程；その中の３６Ｐ６Ｄ５遺伝子を増幅するために、センスおよびアンチセンスのプライマーとして３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドを使用して単離されたゲノムＤＮＡを増幅する工程；および増幅された３６Ｐ６Ｄ５遺伝子の存在を検出する工程、を包含する。任意の多くの適切なセンスプローブおよびアンチセンスプローブの組合せが、３６Ｐ６Ｄ５について提供されるヌクレオチド配列（配列番号１）から設計され、そしてこの目的のために使用され得る。
本発明はまた、他の生物学的サンプルの組織（例えば、血清、骨、前立腺、および他の組織、尿、細胞調製物など）中の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の存在を検出するためのアッセイを提供する。３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を検出するための方法もまた、周知であり、そして例えば、免疫沈降、免疫組織化学分析、ウエスタンブロット分析、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡなどが挙げられる。例えば、１つの実施形態において、生物学的サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の存在を検出する方法は、３６Ｐ６Ｄ５抗体、その３６Ｐ６Ｄ５反応性フラグメント、または３６Ｐ６Ｄ５抗体の抗原結合領域を含む組換えタンパク質と、サンプルとを最初に接触させる工程；次いで、それに対するサンプル中の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の結合を検出する工程、を包含する。
３６Ｐ６Ｄ５を発現する細胞を同定するための方法もまた、提供される。１つの実施形態において、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子を発現する細胞を同定するためのアッセイは、細胞中の３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡの存在を検出するための工程を包含する。細胞中の特定のｍＲＮＡを検出するための方法は、周知であり、そして例えば、相補ＤＮＡプローブを使用するハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、標識された３６Ｐ６Ｄ５リボプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロットおよび関連技術）ならびに種々の核酸増幅アッセイ（例えば、３６Ｐ６Ｄ５に特異的な相補プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ、および例えば、分岐ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなどの他の増幅型検出方法）が挙げられる。あるいは、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子を発現する細胞を同定するためのアッセイは、細胞中の３６Ｐ６Ｄ５Ｓタンパク質または細胞によって分泌された３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の存在を検出する工程を包含する。タンパク質を検出するための種々の方法が、当該分野において周知であり、そして３６Ｐ６Ｄ５タンパク質および３６Ｐ６Ｄ５発現細胞の検出のために用いられ得る。
３６Ｐ６Ｄ５発現分析はまた、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子発現を調節する因子を同定かつ評価するためにツールとして有用であり得る。例えば、３６Ｐ６Ｄ５発現は、前立腺癌において有意にアップレギュレートされ、そして３６Ｐ６Ｄ５はまた、他の癌において発現され得る。癌細胞での３６Ｐ６Ｄ５発現または過剰発現を阻害し得る分子または生物学的因子の同定は、治療上の価値があり得る。このような因子は、ＲＴ−ＰＣＲ、核酸ハイブリダイゼーションまたは抗体結合によって３６Ｐ６Ｄ５発現を定量するスクリーニングを使用することにより、同定され得る。
（循環性３６Ｐ６Ｄ５および排出された３６Ｐ６Ｄ５についてのアッセイ）
成熟３６Ｐ６Ｄ５タンパク質は、ＯＲＦをコードするｃＤＮＡ中のＮ末端シグナル配列を含有する。３６Ｐ６Ｄ５は、膵臓癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、卵巣癌、膵臓癌およびおそらく他の癌において発現される分泌タンパク質であるので、３６Ｐ６Ｄ５を発現する腫瘍は、血管へ３６Ｐ６Ｄ５を分泌すること、そして／または尿もしくは血清へ排出されることが予想され、ここでは、このタンパク質は、分子診断分野において周知のアッセイおよび技術を使用して、検出および定量され得る。循環性３６Ｐ６Ｄ５または排出された３６Ｐ６Ｄ５のレベルを検出および定量することは、３６Ｐ６Ｄ５を発現する癌（これらとしては、前立腺癌、肝臓癌、膀胱願、乳癌、結腸癌、卵巣癌および膵臓癌が挙げられるが、これらに限定されない）の診断、病期分類および予後における多くの用途を有することが予想される。血清、尿、精液中のタンパク質の検出および定量のための、異なる多くの技術的なアプローチが、当該分野で周知である。
３６Ｐ６Ｄ５は、前立腺癌、肝臓癌、膀胱願、乳癌、結腸癌、卵巣癌、膵臓癌およびおそらく他の癌において発現される分泌タンパク質であるので、血液または血清中の３６Ｐ６Ｄ５を検出および定量するためのアッセイは、個体における３６Ｐ６Ｄ５を発現する癌の検出、診断、予後および／または病期分類のために有用であることが予想される。例えば、正常な組織における３６Ｐ６Ｄ５発現は、膵臓において主に見出され（図３）、これは、前立腺および小腸において検出されるよりも低いレベルの３６Ｐ６Ｄ５発現を有する。しかし、高レベルの発現は、前立腺癌由来の移植片、ならびに乳癌、結腸癌、膵臓癌および卵巣癌由来の細胞株において検出される（図４）。従って、血清３６Ｐ６Ｄ５の検出は、前立腺癌、乳癌、結腸癌、卵巣癌または膵臓癌の存在の指標を提供し得る。癌の診断は、この情報および／または他の情報に基づいて為され得る。例えば、前立腺癌に関して、このような他の情報としては、血清ＰＳＡ測定、ＤＲＥおよび／または超音波検査が挙げられ得る。さらに、血清において検出される３６Ｐ６Ｄ５のレベルは、病期分類または予後において有能な情報を提供し得る。例えば、図９および１０において提示されるデータにより支持されるように、細胞集団が、支質および微小血管を介して展開および増殖する場合、より高いレベルの３６Ｐ６Ｄ５が、血清において観察されると予想される。これに関連して、血清中の非常に高いレベルの３６Ｐ６Ｄ５タンパク質が、より大きなおよび／またはより進行性の腫瘍を示唆し得る。
さらに、末梢血および骨髄は、３６Ｐ６Ｄ５発現を検出するためにＲＴ−ＰＣＲを使用して、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質および／または３６Ｐ６Ｄ５発現癌細胞（前立腺癌、膀胱癌、結腸癌、膵臓癌、肝臓癌および卵巣癌が挙げられるが、これらに限定されない）の存在について都合良くアッセイされ得る。ＲＴ−ＰＣＲ増幅可能な３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡの存在は、癌の存在の指標を提供する。末梢血中の腫瘍細胞についてのＲＴ−ＰＣＲ検出アッセイは、多くのヒト固体腫瘍の診断および管理における用途について現在評価されている。前立腺癌の分野では、これらとしては、ＰＳＡおよびＰＳＭを発現する細胞の検出についてのＲＴ−ＰＣＲアッセイが挙げられる（Ｖｅｒｋａｉｋら，１９９７，Ｕｒｏｌ．Ｒｅｓ．２５：３７３〜３８４；Ｇｈｏｓｓｅｉｎら，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１３：１１９５〜２０００；Ｈｅｓｔｏｎら，１９９５，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１：１６８７〜１６８８）。ＲＴ−ＰＣＲアッセイは、当該分野で周知である。
１つの実施形態では、捕獲ＥＬＩＳＡは、血清、尿または精液中の３６Ｐ６Ｄ５を検出しそして定量するために使用される。３６Ｐ６Ｄ５についての捕獲ＥＬＩＳＡは、該して、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の異なるエピトープを認識する少なくとも２種類の異なる型のモノクローナル抗体、または１種類の抗３６Ｐ６Ｄ５モノクローナル抗体および異なる種（例えば、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ハムスターなど）由来の特異的なポリクローナル血清を含む。このアッセイでは、１種類の試薬が、捕獲（またはコーティング）抗体として作用し、そして他方が検出抗体として作用する。表２に示すように、膵臓由来の臨床的血清サンプルおよび膵臓、ならびに正常な雄のドナーを、上記および図１０に記載するように捕獲ＥＬＩＳＡを使用して、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質についてスクローニングした。ＰＣ−３−３６Ｐ６Ｄ５およびＤｕ４４７５細胞からの上性ならびにＰＣ−３−ｎｅｏ細胞からの上清は、各々、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質検出についてポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして作用した。ＮＤ：検出されないか、または検出感度以下。
３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を、７／１０の結腸癌および６／１０の膵臓癌患者において検出した。これらのうちの１つは、比較的高レベル（２９．７０ｎｇ／ｍｌ）を有したが、これは、１／６の正常な雄のドナーにおいてであった。関連した実施形態では、ＦＡＣＳ分析は、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を発現する細胞（例えば、疾患の局所部位を捕獲した細胞）および他の部位（例えば、リンパ系）へ移動した細胞の検出のために使用される。
以下に詳細に議論されるように、３６Ｐ６Ｄ５血清レベルを含む３６Ｐ６Ｄ５のレベルは、３６Ｐ６Ｄ５発現腫瘍の存在、程度および積極性の指標を提供するために使用され得る。記載されるように、上記３６Ｐ６Ｄ５は、前立腺における、最も重要で、正確でそして臨床的に有用な生化学的マーカーであるＰＳＡと、多くの特徴を共有する。前立腺の正常なアーキテクチャを崩壊させる任意のプロセスは、支質および微小血管へのＰＳＡの拡散を可能にする。結果として、血清前立腺特異的抗原レベルの臨床学的に重要な増加が、前立腺癌で見られる。特に、より多くの悪性細胞および癌と関連する支質崩壊は、増加した血清前立腺特異的抗原レベルを説明する。これに関して、血清前立腺特異的抗原レベルは、臨床的段階、腫瘍容積、組織学的グレードならびに非膜穿孔および精液のベシクル浸潤と正相関する。例えば、Ｂｏｓｔｗｉｃｋ、Ｄ．Ｇ．Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１０２（４補完１）：Ｓ３１〜Ｓ３７（１９９４）を参照のこと。
３６Ｐ６Ｄ５はまた、組織発現（前立腺を含む）の制限されたパターンを示す分泌分子であるので、類似分子としてＰＳＡを使用して、悪性細胞の増加した負荷および癌において生じる支質崩壊は、血清３６Ｐ６Ｄ５抗原レベルを１以上の臨床的に関連したファクター（例えば、臨床段階、腫瘍容積、組織学的グレードならびに被膜穿孔および精液ベシクル浸潤）と正相関させる。経時的な血清３６Ｐ６Ｄ５測定は、さらなる情報を提供することが予想され、ここで３６Ｐ６Ｄ５の増加は、進行を反映することが予想され、そして増加の速度は、積極性と相関することが予想される。同様に、血清３６Ｐ６Ｄ５の減少は、より遅い増殖性腫瘍または消退型腫瘍を反映することが予想される。血清中の３６Ｐ６Ｄ５の同定は、腫瘍イニシエーションまたは初期病期疾患を検出するために有用であり得る。手術または治療を受けている患者においては、血清３６Ｐ６Ｄ５レベルは、処置応答および潜在的な再発をモニタリングするために有用である。
（３６Ｐ６Ｄ５およびその産物の状態のモニタリング）
個体中の３６Ｐ６Ｄ５遺伝子および３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物の状態を評価するアッセイは、この個体に由来する生物学的サンプルの増殖または腫瘍形成の可能性についての情報を提供し得る。例えば、３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡが、正常前立腺組織と比較した場合に前立腺癌において高度に発現されるので、生物学的サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡ転写物またはタンパク質の相対的なレベルを評価するアッセイが、３６Ｐ６Ｄ５の調節不全に関連する疾患（例えば、癌）を診断するために使用され得、そして適切な治療の選択を定義することにおいて有用な予後の情報を提供し得る。
３６Ｐ６Ｄ５は、例えば、種々の前立腺癌異種移植組織および癌細胞株、ならびに癌患者サンプルに発現されるので、３６Ｐ６Ｄ５の発現状態は、形成異常な（ｄｉｓｐｌａｓｉｃ）前癌性細胞および癌性細胞の存在、段階、および位置を含む情報を決定するために、疾患の種々の段階に対する罹病性を推定するため、ならびに／または腫瘍侵略性を測定するために有用である情報を提供し得る。さらに、発現プロフィールは、これを転移疾患に関する強力な画像化試薬にする。結果として、本発明の重要な局面は、生物学的サンプル（例えば、細胞成長の調節不全（例えば、癌）によって特徴付けられた病状を罹患するかまたは罹患している疑いのある個体由来のサンプル）における３６Ｐ６Ｄ５の状態を試験するための、種々の分子予後方法および分子診断方法に関する。
腫瘍形成は、細胞成長が漸進性に調節不全になり、そして細胞が正常な生理学的状態から前癌性状態、次いで癌性状態に進行する複数工程プロセスであることが知られている（例えば、Ａｌｅｒｓら、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．７７（５）：４３７−４３８（１９９７）およびＩｓａａｃｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖ．２３１９−３２（１９９５））。この状況において、細胞成長の調節不全の証拠に関して生物学的サンプルを試験すること（例えば、前立腺癌における異常な３６Ｐ６Ｄ５発現）は、癌のような病状が、治療選択がさらに限定される段階に進行する前に、このような異常な細胞生理機能の初期検出を可能にし得る。このような試験において、目的の生物学的サンプル（例えば、細胞成長の調節不全を有することが疑われるサンプル）における３６Ｐ６Ｄ５の状態は、例えば、対応する正常サンプル（例えば、病状がもたらされていない個体（例えば、細胞成長の調節不全を有する疑いが無い個体）（あるいは別の個体）由来のサンプル）の３６Ｐ６Ｄ５の状態と、目的の生物学的サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５の状態における変更に関して比較され得（正常なサンプルと比較される場合）、調節されていない細胞増殖の証拠を提供する。正常サンプルのように病状がもたらされていない生物学的サンプルを用いることに加えて、ｍＲＮＡ発現の所定の正常レベルのような所定の標準値がまた、使用されて（例えば、Ｇｒｅｖｅｒら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１９９６ Ｄｅｃ ９；３０６−１４および米国特許第５，８３７，５０１号を参照のこと）、３６Ｐ６Ｄ５を正常 対 疑わしいサンプルにおいて比較する。
用語「状態」は、この状況において、その当該分野で受け入れられた意味に従って使用され、そして遺伝子およびその産物の条件または状況をいう。本明細書中に詳細に記載されるように、３６Ｐ６Ｄ５の状態は、当該分野で公知の多数のパラメーターによって評価され得る。代表的に、３６Ｐ６Ｄ５の状態における変更は、３６Ｐ６Ｄ５発現細胞の位置の変化および／または３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡ発現および／もしくは３６Ｐ６Ｄ５タンパク質発現における増加を含む。
代表的に、当業者は、多数のパラメーターを用いて遺伝子およびその産物の条件または状況を評価する。これらとしては、発現された遺伝子産物の位置（３６Ｐ６Ｄ５発現細胞の位置を含む）ならびに発現された遺伝子産物（例えば、３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡ、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド）のレベルおよび生物学的活性が挙げれるが、これらに限定されない。３６Ｐ６Ｄ５の状態変更は、当該分野で周知の広範な種々の方法論によって評価され得、代表的には以下に議論されるものである。代表的に、３６Ｐ６Ｄ５の状態変更は、３６Ｐ６Ｄ５および／もしくは３６Ｐ６Ｄ５発現細胞の位置変化、ならびに／または３６Ｐ６Ｄ５
ｍＲＮＡ発現および／もしくは３６Ｐ６Ｄ５ タンパク質発現における増加を含む。
本明細書中に詳細に議論されるように、細胞成長の調節不全と関連する状況または現象を同定するために、生物学的サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５の状態は、当業者によって使用される多数の方法によって評価され得、これには、ゲノムサザン分析（例えば、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子中の摂動を試験するために）、３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡのノーザン分析および／またはＰＣＲ分析（例えば、３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡのポリヌクレオチド配列または発現レベルにおける変更を試験するため）、およびウエスタン分析および／または免疫組織化学分析（例えば、ポリペプチド配列中の変更、サンプル中のポリペプチド局在における変更、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の発現レベルの変更および／またはポリペプチド結合パートナーとの３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の結合を調べるため）が挙げられるが、これらに限定されない。検出可能な３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドとしては、例えば、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子またはそのフラグメント、３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡ、選択的スプライシング改変体３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡ、および３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子が挙げられる。
３６Ｐ６Ｄ５の発現プロフィールは、３６Ｐ６Ｄ５を局所的な疾患および／または転移疾患に関する潜在的な診断マーカーにする。詳細には、３６Ｐ６Ｄ５の状態は、特定の疾患の段階、進行、および／または腫瘍の積極性についての罹患性を推定するために有用な情報を提供し得る。本発明は、３６Ｐ６Ｄ５の発現の状態を決定するため、ならびに３６Ｐ６Ｄ５を発現する癌（例えば、前立腺癌、膀胱癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌、および肺癌のような癌）を診断するための、方法およびアッセイを提供する。患者のサンプル中の３６Ｐ６Ｄ５の発現の状態は、当該分野で周知の多数の手段（免疫組織化学的分析、インサイチュハイブリダイゼーション、レーザー捕捉微小解剖サンプルについてのＲＴ−ＰＣＲ分析、臨床的なサンプルおよび細胞株についてのウェスタンブロット分析、ならびに組織アレイ分析を含むが、これらに限定されない）によって分析され得る。３６Ｐ６Ｄ５遺伝子および遺伝子産物の状態を評価するための代表的なプロトコールは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｔｓ ２（ノーザンブロッティング）、４（サザンブロッティング）、１５（イムノブロッティング）、および１８（ＰＣＲ分析）に見出され得る。
上記のように、生物学的サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５の状態は、多数の当該分野で周知の手順によって試験され得る。例えば、体の特定の位置から採取された生物学的サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５の状態は、３６Ｐ６Ｄ５発現細胞（例えば、３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡまたは３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を発現する細胞）の存在または非存在に関してサンプルを評価することによって試験され得る。この試験は、例えば、３６Ｐ６Ｄ５発現細胞が、このような細胞を通常含まない生物学的サンプル（例えば、リンパ節）に見出された場合に、細胞成長の調節不全の証拠を提供し得る。生物学的サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５の状態におけるこのような変更は、しばしば、細胞成長の調節不全と関連する。詳細には、細胞成長の調節不全の１つの指標は、起源の器官（例えば、膀胱、腎臓または前立腺）から体の異なる領域（例えば、リンパ節）への癌細胞の転移である。対照的に、細胞成長の調節不全の証拠は、重要である。なぜなら、例えば、不顕性リンパ節転移は、前立腺癌を有する実質的な割合の患者において検出され得るからであり、そしてこのような転移は、疾患進行に関する公知の予言物（ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ）と関連する（例えば、Ｊ Ｕｒｏｌ １９９５ Ａｕｇ；１５４（２ Ｐｔ １）：４７４−８を参照のこと）。
１つの局面においては、本発明は、調節不全細胞の増殖に関連する疾患（例えば、過形成または癌）を有していると疑われる個体に由来する試験組織サンプル中の細胞によって発現される３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物の状態を決定すること、次いで、対応する正常なサンプル中の３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物の状態に対して、そのように決定された状態を比較することによる、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物をモニタリングするための方法を提供する。正常なサンプルと比較して試験サンプル中の異常な３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物の存在は、個体の細胞内での調節されていない細胞の増殖の存在に関する指標を提供する。
別の局面においては、本発明は、個体における癌の存在を決定することにおいて有用であるアッセイを提供する。これは、対応する正常な細胞または組織中での発現レベルと比較して、試験細胞または組織サンプル中での３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現における有意な増大を検出することを含む。３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡの存在は、例えば、前立腺組織、腎臓組織、膀胱組織、卵巣組織、胸部組織、膵臓組織、結腸組織および肺組織を含むがこれらに限定されない組織サンプル中で評価され得る（例えば、図４、６および７を参照のこと）。任意のこれらの組織における有意な３６Ｐ６Ｄ５の発現の存在は、これらの癌の出現、存在、および／または重篤度を示すために有用であり得る。なぜなら、対応する正常な組織は３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡを発現しないか、またはそれをより低いレベルで発現するからである。
関連する実施形態においては、３６Ｐ６Ｄ５の発現の状態は、核酸のレベルよりもむしろタンパク質のレベルで決定され得る。例えば、このような方法またはアッセイは、試験組織サンプル中の細胞によって発現される３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のレベルを決定すること、および対応する正常なサンプル中で発現される３６Ｐ６Ｄ５のレベルに対してこのように決定されたレベルを比較することを含む。１つの実施形態においては、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の存在は、例えば、免疫組織化学的方法を使用して評価される。３６Ｐ６Ｄ５抗体または３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の発現を検出し得る結合パートナーは、この目的のための当該分野で周知の種々のアッセイ形式において使用され得る。
他の関連する実施形態においては、当業者は、挿入、欠失、置換などのこれらの分子の構造における摂動を同定するために、生物学的サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性を評価し得る。このような実施形態は、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列における摂動が、増殖の調節不全の表現型に関連している多数のタンパク質において観察されるので、有用である（例えば、Ｍａｒｒｏｇｉら、Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．２６（８）：３６９−３７８（１９９９）を参照のこと）。この状況においては、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列における摂動を観察するための広範な種々のアッセイが、当該分野で周知である。例えば、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物の核酸またはアミノ酸配列の大きさおよび構造が、本明細書中で議論される、ノーザン、サザン、ウェスタン、ＰＣＲ、およびＤＮＡ配列決定プロトコールによって観察され得る。さらに、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列における摂動を観察するための他の方法（例えば、一本鎖の立体構造多形性分析）が、当該分野で周知である（例えば、米国特許第５，３８２，５１０号および同第５，９５２，１７０号を参照のこと）。
別の実施形態においては、当業者は、生物学的サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５遺伝子のメチル化の状態を試験し得る。遺伝子の５’調節領域中のＣｐＧアイランドの異常な脱メチル化および／過剰なメチル化は、しばしば、不死化された細胞および形質転換された細胞において生じ、そして種々の遺伝子の変更された発現を生じ得る。例えば、ｐｉ−クラスのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼのプロモーター過剰メチル化（正常な前立腺において発現されるが、９０％より多くの前立腺の癌腫においては発現されないタンパク質）は、この遺伝子の転写を永続的にサイレントにさせるようであり、そして最も頻繁には前立腺の癌腫におけるゲノムの変更が検出される（Ｄｅ Ｍａｒｚｏら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５（６）：１９８５−１９９２（１９９９））。さらに、この変更は、高いグレードの前立腺の表皮内新生物（ＰＩＮ）の少なくとも７０％の症例において存在する（Ｂｒｏｏｋｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ．、１９９８、７：５３１−５３６）。別の例においては、ＬＡＧＥ−Ｉ腫瘍特異的遺伝子（これは、正常な前立腺においては発現されないが、前立腺癌の２５〜５０％において発現される）の発現が、リンパ芽球細胞においてデオキシアザシチジンによって誘導され、このことは、腫瘍の発現が脱メチル化に起因することを示唆している（Ｌｅｔｈｅら、１９９８、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７６（６）：９０３−９０８）。この状況においては、遺伝子のメチル化の状態を試験するための種々のアッセイが、当該分野で周知である。例えば、当業者は、サザンハイブリダイゼーションアプローチにおいて、ＣｐＧアイランドの全体的なメチル化の状態を評価するために、メチル化されたＣｐＧ部位を含む配列を切断し得ないメチル化感受性制限酵素を利用し得る。さらに、ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）は、所定の遺伝子のＣｐＧアイランド中に存在するＣｐＧ部位の全てのメチル化の状態を迅速にプロフィール化し得る。この手順は、亜硫酸水素ナトリウム（これは、メチル化されていない全てのシトシンをウラシルに転換する）によるＤＮＡの最初の改変、続くメチル化されていないＤＮＡに対してメチル化されたＤＮＡについて特異的なプライマーを使用する増幅を含む。メチル化の干渉を含むプロトコールもまた、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｔｓ １２、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５に見出され得る。
遺伝子の増幅は、３６Ｐ６Ｄ５の状態、２１ｑ２２．２−２２．３にマップされる座、種々の癌において摂動されることが示される領域を評価するさらなる方法を提供する。遺伝子の増幅は、例えば、従来のサザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノーザンブロッティング（Ｔｈｏｍａｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：５２０１−５２０５（１９８０））、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、またはインサイチュハイブリダイゼーション（本明細書中に提供される配列に基づいて適切に標識されたプローブを使用する）によって直接、サンプル中で測定され得る。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖、またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む特定の二重鎖を認識し得る抗体が、使用され得る。抗体は、次いで、標識され得、そして二重鎖が表面に結合させられるアッセイが行われ得、その結果、表面上での二重鎖の形成に際して、この二重鎖に結合した抗体の存在が検出され得る。
上記に議論される組織に加えて、生検組織または末梢血または骨髄が、前立腺、腎臓、膀胱、卵巣、乳房、膵臓、結腸および肺ガンを含むがこれに限定されないガン細胞の存在について、３６Ｐ６Ｄ５の発現を検出するために、例えば、ノーザン、ドットブロットまたはＲＴ−ＰＣＲ分析を使用して簡便にアッセイされ得る（図４、６および７）。ＲＴ−ＰＣＴで増幅可能な３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡの存在は、ガンの存在の指標を提供する。末梢血中の腫瘍細胞についてのＲＴ−ＰＣＲ検出アッセイは、現在は、多数のヒト固形腫瘍の診断および管理における使用のために評価されている。前立腺ガンの分野においては、これらは、ＰＳＡおよびＰＳＭを発現する細胞の検出のためのＲＴ−ＰＣＲアッセイを含む（Ｖｅｒｋａｉｋら、１９９７、Ｕｒｏｌ．Ｒｅｓ．２５：３７３−３８４；Ｇｈｏｓｓｅｉｎら、１９９５、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１３：１１９５−２０００；Ｈｅｓｔｏｎら、１９９５、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１：１６８７−１６８８）。ＲＴ−ＰＣＴアッセイが、当該分野で周知である。
本発明の関連する局面は、個体におけるガン発症に対する罹患性を推定することに関する。１つの実施形態においてはガンに対する罹患性を推定するための方法は、組織サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡまたは３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を検出することを含み、その存在はガンに対する罹患性を示す。ここでは、３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡの発現の存在の程度は、罹患性の程度に比例する。特定の実施形態においては、前立腺組織中での３６Ｐ６Ｄ５の存在が試験され、サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５の存在は、前立腺ガンの罹患性（または前立腺腫瘍の発生または存在）の指標を提供する。別の特定の実施形態においては、組織中の３６Ｐ６Ｄ５の存在が調査され、サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５の存在が、ガンの罹患性（または腫瘍の発生または存在）の指標を提供する。密接に関連する実施形態においては、当業者は、挿入、欠失、置換などのこれらの分子の構造における摂動（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）を同定するために、生物学的サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性を評価し得、サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物中の１つ以上の摂動の存在は、ガンの罹患性の指標（または腫瘍の発生もしくは存在）を提供する。
本発明のなお別の関連する局面は、腫瘍の積極性を測定するための方法に関する。１つの実施形態においては、腫瘍の積極性を測定するための方法は、腫瘍のサンプル中の細胞によって発現される３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡまたは３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のレベルを決定すること、同じ個体から採取された対応する正常な組織または正常な組織の参照サンプル中で発現された３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡまたは３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のレベルに対して、そのように決定されたレベルを比較することを含む。ここでは、正常なサンプルに対して比較した、腫瘍サンプル中での３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡまたは３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の発現の程度は、積極性の程度を示す。特定の実施形態においては、前立腺腫瘍の積極性は、３６Ｐ６Ｄ５が腫瘍細胞中で発現される程度を決定することによって評価される。
より高い発現レベルは、より積極性のある腫瘍であることを示す。密接に関連する実施形態においては、当業者は、挿入、欠失、置換などのこれらの分子の構造における摂動を同定するために、生物学的サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性を評価し得、１つ以上の摂動の存在は、より積極性の高い腫瘍を示す。
本発明はさらに、調節不全の細胞増殖の証拠のために生物学的サンプルを検査する方法を提供する。１つの実施形態において、本発明は、生物学的サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５の状態を、対応する正常なサンプル中の３６Ｐ６Ｄ５の状態と比較する工程を包含し、ここで、生物学的サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５の状態の変化は、調節不全の細胞増殖と関連する。生物学的サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５の状態は、例えば、３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡ発現のレベルまたは３６Ｐ６Ｄ５タンパク質発現のレベルを調べることによって、評価され得る。１つの実施形態において、３６Ｐ６Ｄ５の状態における変更は、３６Ｐ６Ｄ５発現細胞が通常不在である組織由来の生物学的サンプル中で、３６Ｐ６Ｄ５発現細胞の存在によって、３６Ｐ６Ｄ５の状態の変更が同定される。
別の局面において、本発明は、個体における癌の存在を決定する際に有用なアッセイを提供し、対応する正常な細胞または組織における発現レベルと比較した試験細胞または組織サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡまたはタンパク質発現における有意な増加を検出する工程を包含する。３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡの存在は、例えば、結腸、肺、前立腺、脾臓、膀胱、乳房、卵巣、子宮頚部、精巣、頭および首、脳、胃、骨などを含むがこれらに限定されない組織サンプル中で評価され得る。これらの組織のいずれかにおける有意な３６Ｐ６Ｄ５発現の存在は、対応する正常組織が３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡを発現しないかまたはより低いレベルで発現するので、別の組織に由来するこれらの癌または癌の転移の発生、存在および／または重篤度を示すために有用であり得る。
本発明のなお別の関連する局面は、経時的に個体中の悪性腫瘍の進行を観察するための方法に関する。１つの実施形態においては、経時的に個体中の悪性腫瘍の進行を観察するための方法は、腫瘍のサンプル中の細胞によって発現される３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡまたは３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のレベルを決定すること、同じ個体から種々の時点で採取された等価な組織サンプル中で発現される３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡまたは３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のレベルに対して、そのように決定されたレベルを比較する工程を含む。ここでは、経時的な腫瘍サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡまたは３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の発現の程度は、ガンの進行についての情報を提供する。特定の実施形態においては、ガンの進行は、腫瘍細胞中の３６Ｐ６Ｄ５の発現が経時的に変化する程度を決定することによって評価され、より高い発現レベルは、ガンの進行を示す。密接に関連する実施形態においては、当業者は、挿入、欠失、置換などのこれらの分子の構造における摂動を同定するために、生物学的サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性を評価し得、１つ以上の摂動の存在は、ガンの進行を示す。
上記の診断アプローチは、当該分野で公知の広範な種々の予後および診断プロトコールの任意の１つと組合せられ得る。例えば、本明細書中に開示される本発明の別の実施形態は、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子および３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物の発現（または３６Ｐ６Ｄ５遺伝子および３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物の摂動）と、組織サンプルの状態を診断および予後する手段としての悪性腫瘍に関連する因子との間の一致を観察するための方法に関する。この状況においては、悪性腫瘍に関連する広範な種々の因子（例えば、悪性腫瘍に関連する別の遺伝子の発現（ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、およびＰＳＭの発現を含む））、ならびに全体的な細胞学的観察（例えば、Ｂｏｃｋｉｎｇら、１９８４、Ａｎａｌ．Ｑｕａｎｔ．Ｃｙｔｏｌ．６（２）：７４−８８；Ｅｐｔｓｅｉｎ，１９９５、Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９５、Ｆｅｂ；２６（２）：２２３−９；Ｔｈｏｒｓｏｎら、１９９８、Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．１１（６）：５４３−５１；Ｂａｉｓｄｅｎら、１９９９、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．２３（８）：９１８−２４を参照のこと）が利用され得る。３６Ｐ６Ｄ５遺伝子および３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物の発現（または３６Ｐ６Ｄ５遺伝子および３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物中の摂動）と、悪性腫瘍に関連するさらなる因子との間の一致を観察するための方法は、例えば、一致する特定の因子のセットまたは集まりの存在が、組織サンプルの状態を診断および予後するための基準の情報を提供するので、有用である。
代表的な実施形態においては、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子および３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物の発現（または３６Ｐ６Ｄ５遺伝子および３６Ｐ６Ｄ５遺伝子産物の摂動）と、悪性腫瘍に関連する因子との間での一致を観察するための方法は、組織サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡまたはタンパク質の過剰発現を検出すること、組織サンプル中のＰＳＡ ｍＲＮＡまたはタンパク質の過剰発現を検出すること、ならびに３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡまたはタンパク質と、ＰＳＡ ｍＲＮＡまたはタンパク質の過剰発現との間での一致を観察することを伴う。特定の実施形態においては、前立腺組織中での３６Ｐ６Ｄ５およびＰＳＡのｍＲＮＡの発現が試験される。好ましい実施形態においては、サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５とＰＳＡのｍＲＮＡの過剰発現の一致は、前立腺ガンの指標、前立腺ガンの罹患性、または前立腺腫瘍の発生もしくは存在を提供する。
３６Ｐ６Ｄ５のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を検出および定量するための方法が本明細書中に記載され、そして当該分野で周知の標準的な核酸およびタンパク質の検出および定量技術を使用する。３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡの検出および定量のための標準的な方法として、標識された３６Ｐ６Ｄ５リボプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、および３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチドプローブを使用する関連技術、３６Ｐ６Ｄ５について特異的なプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ分析、および他の増幅型の検出方法（例えば、分枝ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど）が挙げられる。
特定の実施形態においては、以下の実施例に記載されるように、半定量的ＲＴ−ＰＣＲが、３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡの発現を検出しそして定量するために使用され得る。３６Ｐ６Ｄ５を増幅し得るかなり多数のプライマーが、この目的のために試用され得、これには、本明細書中で詳細に記載される種々のプライマーのセットが挙げられるがこれらに限定されない。タンパク質の検出および定量のための標準的な方法が、この目的のために使用され得る。特定の実施形態においては、野生型の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質と特異的に反応するポリクローナルまたはモノクローナル抗体が、生検組織の免疫組織化学的アッセイにおいて使用され得る。
（３６Ｐ６Ｄ５と相互作用する分子の同定）
本明細書中に開示される３６Ｐ６Ｄ５タンパク質配列は、当業者が、３６Ｐ６Ｄ５と相互作用するタンパク質、低分子、および他の試薬、ならびに種々の当該分野で受容されているプロトコールの任意の１つを通じて３６Ｐ６Ｄ５によって活性化される経路を同定することを可能にする。例えば、当業者は、種々のいわゆる相互作用捕捉システム（「ツーハイブリッドアッセイ」とも呼ばれる）の１つを利用し得る。このようなシステムにおいては、相互作用する分子が、転写因子を再構成し、レポーター遺伝子の発現を指向し、次いでその発現がアッセイされる。代表的なシステムは、真核生物の転写活性化因子の再構成を通じてインビボでのタンパク質−タンパク質の相互作用を同定し、そしてこれは、例えば、米国特許第５，９５５，２８０号、同第５，９２５，５２３号、同第５，８４６，７２２号、および同第６，００４，７４６号に開示されている。
あるいは、当業者は、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質配列と相互作用する分子を、ペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって同定し得る。このような方法においては、３６Ｐ６Ｄ５のような選択されたレセプター分子に結合するペプチドが、アミノ酸のランダムなまたは制御されたコレクションをコードするライブラリーをスクリーニングすることによって同定される。ライブラリーによってコードされるペプチドは、バクテリオファージコートタンパク質の融合タンパク質として発現され、次いで、バクテリオファージ粒子が、目的のレセプターに対してスクリーニングされる。
広範な種々の用途を有しているペプチド（例えば、治療薬または診断薬）が、期待されるリガンドまたはレセプター分子の構造についてのいかなる以前の情報をも用いることなく、同定され得る。３６Ｐ６Ｄ５タンパク質配列と相互作用する分子を同定するために使用され得る代表的なペプチドライブラリおよびスクリーニング方法が、例えば、米国特許第５，７２３，２８６号および同第５，７３３，７３１号に開示されている。
あるいは、３６Ｐ６Ｄ５を発現する細胞株が、３６Ｐ６Ｄ５によって媒介されるタンパク質−タンパク質相互作用を同定するために使用され得る。この可能性は、他の研究者によって示されているように、免疫沈降技術を使用して試験され得る（Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＢＪら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９９、２６１：６４６−５１）。代表的には、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質は、抗３６Ｐ６Ｄ５抗体を使用して、３６Ｐ６Ｄ５を発現する前立腺ガン細胞株から免疫沈降させられ得る。あるいは、Ｈｉｓ−タグに対する抗体が、３６Ｐ６Ｄ５を発現するように操作された細胞株中で使用され得る（上記のベクター）。免疫沈降させられた複合体は、ウェスタンブロッティング、タンパク質の35Ｓ−メチオニン標識、タンパク質の微小配列決定、銀染色、および二次元ゲル電気泳動のような手順によってタンパク質の会合について試験され得る。
３６Ｐ６Ｄ５と相互作用する低分子は、このようなスクリーニングアッセイの関連する実施形態を通じて同定され得る。例えば、リン酸化および脱リン酸化、二次メッセンジャーのシグナル伝達、および腫瘍形成を媒介する３６Ｐ６Ｄ５の能力を妨害する分子を含む、タンパク質の機能を妨害する低分子が同定され得る。代表的な方法は、例えば、米国特許第５，９２８，８６８号に議論されており、そして少なくとも１つのリガンドが低分子であるハイブリッドリガンドを形成するための方法を含む。例示的な実施形態においては、次いで、ハイブリッドのリガンドが、第１および第２の発現ベクターを含む細胞中に順に導入される。それぞれの発現ベクターは、転写モジュールのコード配列に連結された標的のタンパク質をコードする、ハイブリッドタンパク質を発現するためのＤＮＡを含む。
細胞はさらに、レポーター遺伝子を含む。その発現は、互いに第１および第２のハイブリッドタンパク質の近位に条件付けられる。発現は、ハイブリッドのリガンドが両方のハイブリッドタンパク質上の標的部位に結合する場合にのみ、生じる事象である。レポーター遺伝子を発現するこれらの細胞が選択され、そして未知の低分子または未知のハイブリッドタンパク質が同定される。
本発明の代表的な実施形態は、図１（配列番号２）に示される３６Ｐ６Ｄ５アミノ酸配列と相互作用する分子をスクリーニングする方法から構成される。この方法は、分子の集団を３６Ｐ６Ｄ５アミノ酸配列と接触させる工程、相互作用を容易にする条件下で分子の集団が３６Ｐ６Ｄ５アミノ酸配列と相互作用することを可能にする工程、３６Ｐ６Ｄ５アミノ酸配列と相互作用した分子の存在を決定する工程、次いで３６Ｐ６Ｄ５アミノ酸配列とは相互作用していない分子を、３６Ｐ６Ｄ５のアミノ酸配列と相互作用した分子から分離する工程を包含する。特定の実施形態においては、この方法はさらに、３６Ｐ６Ｄ５のアミノ酸配列と相互作用する分子を精製する工程を包含する。好ましい実施形態においては、３６Ｐ６Ｄ５アミノ酸配列は、ペプチドのライブラリーと接触させられる。
（細胞性微小環境を調節するための３６Ｐ６Ｄ５の使用）
種々の分泌されたタンパク質が、前立腺癌において記載されている（その多数が、腫瘍形成および進行のプロセスに関与していることが示されている）（Ｉｎｏｕｅ Ｋ．Ｃｌｉ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０００；６：２１０４−１９、Ｄｏｗ ＪＫ，ｄｅＶｅｅ Ｗｈｉｔｅ ＲＷ．Ｕｒｏｌｏｇｙ．２０００；５５：８００−６）。腫瘍進行のプロセスにおいて、癌細胞は、それらが局所的な前立腺癌の微小環境および骨微小環境の両方において増殖可能な分子を分泌および発現する。前立腺癌の独特の特徴は、腫瘍の進行のプロセスにおいて、癌細胞は骨に対して転移性となることであり、最近の研究は、骨への転移する偏好が、骨微小環境において、それらが増殖するのを可能にする分子を分泌および発現する前立腺癌の能力に基づいていることを示唆する（Ｋｏｅｎｅｍａｎ ＫＳ，Ｙｅｕｎｇ Ｆ，Ｃｈｕｎｇ ＬＷ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ １９９９：３９：２４６）。この内容において、本明細書中で示されるデータ（例えば、図８および９を参照のこと）は、（１）骨に対する前立腺細胞の標的化する際、（２）骨微小環境における前立腺細胞の増殖を可能とする際、（３）前立腺癌腫瘍細胞または骨髄細胞の造骨細胞への分化を誘導する際または（４）前立腺癌細胞と骨間質との相互作用をサポートすることによって、癌細胞の増殖についての好ましい環境を創出し得る。結果として、この分子は、培地を調製するおよび／または前立腺癌細胞が転移し得る微小環境を模倣するための方法において使用され得る。
３６Ｐ６Ｄ５が前立腺および骨微小環境に通常位置する細胞と相互作用する可能性を試験するために、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を組換えタンパク質（ｐＴａｇ５ ３６Ｐ６Ｄ５）として発現された。精製された組換え３６Ｐ６Ｄ５を次いで、種々の関連細胞タイプ（前立腺上皮細胞、前立腺腫瘍細胞株、前立腺粘膜細胞、骨肉腫および骨粘膜細胞を含む）とインキュベートした。３６Ｐ６Ｄ５のインタクトな細胞への結合は、ＦＡＣＳ分析および熱量測定アッセイによって、検出される。我々の研究は、組換え３６Ｐ６Ｄ５ ＡＰ−融合タンパク質は、ＬＡＰＣ４およびＬＡＰＣ９異種移植片に由来する前立腺癌の存在下でインキュベートされる場合、それは、ＬＡＰＣ９およびＬＡＰＣ４異種移植片細胞に結合する。３６Ｐ６Ｄ５の細胞表面への結合は、ＡＰ基質におけるＡＰにおける熱量測定の変化を使用して検出した（図８）。対照的に、適切なコントロールとともにインキュベートされる場合、色の変換は全く観察されなかった。３６Ｐ６Ｄ５に結合および反応し得る細胞集団を同定する際に、この分析は、価値のあるものである。さらに、標的細胞集団の同定およびが、３６Ｐ６Ｄ５レセプターを単離および同定する方法を提供し得る。この情報は、種々の治療学的適用および低分子設計において使用され得る。
本明細書中に示されたデータ（例えば、図８を参照のこと）を用いて、転移性細胞の微小環境と同様に癌細胞が生じる局所前立腺の微小環境を再現することによる、癌細胞表現型を調節しそして異なる段階の転移を分析する方法を使用して、それによって、新規の治療用の組成物および方法ならびに診断用の組成物および方法を当業者が評価し得る癌モデルを生成し得る。例示的方法は、３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチドが細胞に結合するようにこのペプチドをこの細胞に暴露することによりこの細胞の微小環境を調節することからなり、これによって、細胞の微小環境を調節する。この状況に関連する方法は、３６Ｐ６Ｄ５ポリペプチド（例えば、抗３６Ｐ６Ｄ５抗体）と相互作用してこのペプチドの細胞への結合を阻害するかまたは容易にする分子に細胞を暴露することによりこの細胞の微小環境を調節することからなり、これによって、この細胞の微小環境を調節する。特定の微小環境の生成または調節についてのこのような方法は、癌細胞（前立腺癌細胞を含む）が細胞微小環境に存在する因子に依存して差示的に調節されるという観察に基づいて種々の多様な微小環境を生成するための当該分野における必要性を満足する（例えば、Ｌｅｖｅｓｑｕｅら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３９（５）：２３７５−２３８１（１９９８）を参照のこと）。したがって、この微小環境において細胞により分泌されかつ細胞に結合する分子として３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を同定することは、癌の進行を生じる事象をより正確に再現および調節する状況で３６Ｐ６Ｄを含有および／または操作するために、当業者がこの情報を使用することを可能にする。
多くの実験を、前立腺癌細胞の増殖に対して３６Ｐ６Ｄ５がどのように寄与し得るかを調査するために設計し得る。第一の典型的なセットの実験において、前立腺癌上皮細胞を、組換え３６Ｐ６Ｄ５の存在下または非存在下でインキュベートし、そして十分に証明された熱量測定アッセイを使用して増殖について評価する。平行して、３６Ｐ６Ｄ５を安定に発現するように操作したＰＣ３細胞を、細胞増殖能について評価する。第二の典型的なセットの実験において、タグ化前立腺癌細胞（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するように操作したＰＣ３細胞）を、骨間質細胞の存在下で増殖する。これらの細胞を、組換え３６Ｐ６Ｄ５の存在下または非存在下でインキュベートし、そして、ＧＦＰの増加を測定することによって細胞増殖について評価する。
本明細書中に提供される開示を使用して、骨転移における３６Ｐ６Ｄ５の役割を試験し得る。３６Ｐ６Ｄ５が骨形成性になるように前立腺細胞を誘導するか否かを決定するために、前立腺初代細胞ならびに細胞株を、組換え精製３６Ｐ６Ｄ５の存在下または非存在下で増殖し得る。次いで、細胞を、骨成熟の初期マーカーおよび後期マーカー（オステオネクチン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼおよびオステオカルシンを含む）の発現について試験し得る。骨のような伝統的な保護的微小環境での前立腺細胞増殖を支援する増殖因子の発現を３６Ｐ６Ｄ５が誘導するか否かもまた、決定し得る。ＰＣＲ技術およびＥＬＩＳＡ技術を使用して、組換え精製３６Ｐ６Ｄ５の存在下または非存在下での細胞増殖におけるＦＧＦ、ＨＧＦ、およびＩＧＦの発現および分泌を調査し得る。同様の実験を、骨髄細胞を使用して実施して、３６Ｐ６Ｄ５が軟骨細胞前駆体の成熟骨細胞への分化を誘導するか否かを決定し得る。これらの実験は、骨における前立腺癌増殖に有利な環境の作製の支持、および治療介入についての標的の同定における、３６Ｐ６Ｄ５の役割を例証する際に貴重であり得る。
本明細書中に提供される開示を使用して、細胞−細胞相互作用における３６Ｐ６Ｄ５の役割を試験し得る。間質細胞または骨細胞との前立腺細胞相互作用を増強することによる前立腺細胞の骨への漸増において、３６Ｐ６Ｄ５が役割を担うことが可能である。ＧＦＰ発現前立腺癌細胞を、組換え３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の存在下または非存在下で増殖し得る。ＧＦＰ細胞を、種々の時間にわたって、コントロールまたは３６Ｐ６Ｄ５処理した間質細胞および骨細胞とともにインキュベートし得る。非接着性細胞は除去され得、そして間質細胞および骨細胞との接着を、培養物中のＧＦＰの量を測定することによって評価し得る。このデータは、癌細胞が生じそして癌細胞による転移部位のコロニー形成として増殖する局所前立腺の微小環境を調節する因子のインヒビターを考察する際に不可欠である。
（治療方法および組成物）
前立腺の癌（および恐らく他の癌）において高度に発現される遺伝子としての３６Ｐ６Ｄ５の同定は、このような癌の処置のための多数の治療アプローチへの道を開く。上記に議論されているように、３６Ｐ６Ｄ５が癌細胞から分泌され、そしてこの様式で増殖シグナルを調節することは、可能である。転写因子としてのその潜在的な役割および前立腺癌におけるその高度な発現は、３６Ｐ６Ｄ５を低分子媒介治療のための潜在的な標的にする。
従って、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の活性を阻害することを目的とする治療アプローチが、前立腺癌および３６Ｐ６Ｄ５を発現する他の癌を罹患している患者について有用であると予想される。３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の活性を阻害することを目的とするこれらの治療アプローチは、一般的に２つのクラスに分けられる。１つのクラスは、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質とその結合パートナーまたは他のタンパク質との結合または会合を阻害するための種々の方法を含む。別のクラスは、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子の転写または３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡの翻訳を阻害するための種々の方法を含む。
（抗体に基づく治療の細胞表面の標的としての３６Ｐ６Ｄ５）
３６Ｐ６Ｄ５構造的特徴は、この分子が抗体に基づく治療ストラテジーについての魅力的な標的であることを示す。細胞外分子と細胞内分子との両方を標的化するための、多数の代表的な抗体ストラテジーが当該分野において公知である（例えば、相補体およびＡＤＣＣにより媒介される殺傷、ならびに以下に記載するイントラボディーの使用を参照のこと）。３６Ｐ６Ｄ５が種々の系列の癌細胞上で発現され、そして対応する正常な細胞上では発現されないので、３６Ｐ６Ｄ５免疫反応性組成物の全身的な投与は、標的ではない器官および組織への免疫治療分子の結合によって引き起こされる毒性、非特異性、および／または非標的効果を伴わずに、良好な感受性を示すことが予想される。３６Ｐ６Ｄ５のドメインと特異的に反応する抗体は、毒素もしくは治療薬との結合体として、または細胞の増殖もしくは機能を阻害し得る裸の抗体としてのいずれかで、３６Ｐ６Ｄ５を発現する癌を全身的に処置するために有用であり得る。
３６Ｐ６Ｄ５抗体は、この抗体が３６Ｐ６Ｄ５に結合し、そして結合パートナーとの相互作用のような機能を調節または摂動し、続いて細胞および腫瘍の増殖の阻害および／または破壊を媒介し、そして／または細胞もしくは腫瘍の増殖を阻害するように、患者中に導入され得る。このような抗体が治療効果を発揮する機構は、補体によって媒介される細胞の溶解、抗体依存性の細胞性の細胞傷害性、３６Ｐ６Ｄ５の生理学的機能を調節すること、リガンド結合またはシグナル伝達経路を阻害すること、腫瘍細胞の分化を調節すること、腫瘍の血管形成因子のプロフィールを変更すること、ならびに／またはアポトーシスを誘導することによることを含み得る。３６Ｐ６Ｄ５抗体は、毒性の試薬または治療薬に結合体化され得、そして３６Ｐ６Ｄ５を保有している腫瘍細胞に対して直接毒性の試薬または治療薬を送達するために使用され得る。毒性の試薬の例として、カリヒマイシン（ｃａｌｃｈｅｍｉｃｉｎ）、マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）、放射性同位元素（例えば、131Ｉ、イットリウム、およびビスマス）が挙げられるが、これらに限定されない。
抗３６Ｐ６Ｄ５抗体を使用する癌の免疫治療は、以下を含むがこれらに限定されない他の型の癌の処置において良好に使用されている種々のアプローチから生成される教示に従い得る：結腸癌（Ａｒｌｅｎら、１９９８、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：１３３−１３８）、多発性骨髄腫（Ｏｚａｋｉら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ ９０：３１７９−３１８６；Ｔｓｕｎｅｎａｒｉら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ ９０：２４３７−２４４４）、胃癌（Ｋａｓｐｒｚｙｋら、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：２７７１−２７７６）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｅｍｐｈａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：９３−１０１）、白血病（Ｚｈｏｎｇら、１９９６、Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．２０：５８１−５８９）、結腸直腸癌（Ｍｏｕｎら、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：６１６０−６１６６）；Ｖｅｌｄｅｒｓら、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：４３９８−４４０３）、および乳癌（Ｓｈｅｐａｒｄら、１９９１、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１１７−１２７）。いくつかの治療アプローチは、毒素に対する裸の抗体の結合体化（例えば、抗ＣＤ２０抗体に対する131Ｉの結合体化（例えば、ＲｉｔｕｘａｎTM、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．）を含むが、一方、他のアプローチは、抗体および他の治療薬の同時の投与（例えば、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎTM（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）とパクリタキセル（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．））を含む。前立腺癌の処置については、例えば、３６Ｐ６Ｄ５抗体は、照射、化学療法、またはホルモンの除去と組合せて、投与され得る。
３６Ｐ６Ｄ５抗体治療は、全てのステージの癌について有用であり得るが、抗体治療は、進行したかまたは転移性の癌において特に適切であり得る。本発明の抗体治療を用いる処置は、以前に１回以上の化学療法を受けた患者について示され得、一方、本発明の抗体治療と化学療法または照射のレジメンとの組合せが、化学療法による処置を受けていない患者について好ましくあり得る。さらに、抗体治療は、付随する化学療法の減少した投与量の使用を可能にし得、特に、化学療法薬の毒性に寛容ではない患者について、非常に良好である。
いくつかの癌患者については、好ましくは、腫瘍組織の免疫組織化学的な評価、定量的な３６Ｐ６Ｄ５の画像化、または３６Ｐ６Ｄ５の発現の存在および程度を確実に示し得る他の技術を使用して、３６Ｐ６Ｄ５の発現の存在およびその発現のレベルを評価することが所望され得る。腫瘍の生検または外科的な標本の免疫組織化学的な分析が、この目的のために好ましくあり得る。腫瘍組織の免疫組織化学的分析のための方法は、当該分野で周知である。
前立腺および他の癌を処置することにおいて有用である抗３６Ｐ６Ｄ５モノクローナル抗体として、腫瘍に対する強力な免疫応答を開始し得るもの、および細胞傷害性を指向し得るものが挙げられる。これに関して、抗−３６Ｐ６Ｄ５モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、補体によって媒介される細胞の細胞傷害性または抗体依存性の細胞の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の機能（これらの両方ともが、エフェクター細胞のＦｃレセプター部位または補体タンパク質との相互作用のために、イムノグロブリン分子のインタクトなＦｃ部分を必要とする）のいずれかによって、腫瘍細胞の溶解を誘発し得る。さらに、腫瘍の増殖に対して直接的な生物学的効果を発揮する抗３６Ｐ６Ｄ５ ｍＡｂが、本発明の実施において有用である。このような直接的な細胞傷害性のｍＡｂが作用し得る可能性のある機構として、細胞の増殖の阻害、細胞の分化の調節、腫瘍の血管形成因子のプロフィールの調節、およびアポトーシスの誘導が挙げられる。特定の抗−３６Ｐ６Ｄ５ ｍＡｂが抗腫瘍効果を発揮する機構は、ＡＤＣＣ、ＡＤＭＭＣ、補体によって媒介される細胞の溶解などを決定するように設計されたかなり多数のインビトロでのアッセイを使用して、当該分野で一般的に公知であるように評価され得る。
マウスもしくは他の非ヒトモノクローナル抗体、またはヒト／マウスのキメラｍＡｂの使用は、いくつかの患者において、中程度〜強力な免疫応答を誘導し得る。いくつかの例においては、これは、循環からの抗体のクリアランスおよび減少した効率を生じる。最も重篤な例においては、このような免疫応答は、腎不全を生じ得る可能性のある免疫複合体の多量の形成を導き得る。従って、本発明の治療方法の実施において使用される好ましいモノクローナル抗体は、完全なヒトまたはヒト化されたもののいずれかであり、そして高い親和性で標的の３６Ｐ６Ｄ５抗原に対して特異的に結合するが、患者において低い抗原性を示すかまたは抗原性を示さないものである。
本発明の治療方法は、単一の抗３６Ｐ６Ｄ５ ｍＡｂの、ならびに種々のｍＡｂの組合せまたは混合物の投与を意図する。このようなｍＡｂの混合物は、それらが種々のエピトープを標的化し、種々のエフェクター機構を利用するか、または免疫エフェクター機能に依存するｍＡｂと細胞傷害性のｍＡｂとを直接結合するｍＡｂを含む限りにおいて、特定の利点を有し得る。組合せ中のこのようなｍＡｂは、相乗的治療効果を示し得る。さらに、抗３６Ｐ６Ｄ５ ｍＡｂの投与は、以下を含むがこれらに限定されない他の治療薬と組合せられ得る：種々の化学療法剤、アンドロゲンブロッカー、および免疫調節因子（例えば、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ）。抗３６Ｐ６Ｄ５ ｍＡｂは、それらの「裸の」形態または結合体化していない形態で投与され得るか、あるいはそれらに対して結合体化した治療薬を有し得る。
抗３６Ｐ６Ｄ５抗体処方物は、腫瘍部位へ抗体を送達し得る任意の経路を通じて投与され得る。可能性のある有効な投与経路として、静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内などが挙げられるが、これらに限定されない。処置は一般的には、静脈内注射（ＩＶ）（代表的には、約０．１から約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量）のような受容可能な投与経路を通じる、抗３６Ｐ６Ｄ５抗体調製物の繰り返しの投与を含む。１週間あたりで１０〜５００ｍｇの範囲のｍＡｂの用量が、有効であり得、そして十分に寛容化され得る。
転移性の乳癌の処置におけるＨｅｒｃｅｐｔｉｎ ｍＡｂでの臨床試験に基づいて、約４ｍｇ／ｋｇ患者体重のＩＶの最初の負荷用量、続く約２ｍｇ／ｋｇＩＶの抗３６Ｐ６Ｄ５ ｍＡｂ調製物の毎週の用量が、受容可能な用量レジメンを示し得る。好ましくは、最初の負荷用量は、９０分以上の注入として投与される。期間維持用量は、最初の用量が十分に寛容化される場合は、３０分以上の注入として投与され得る。しかし、当業者によって理解されるように、種々の因子が、特定の症例における理想的な投与レジメンに影響を与える。このような因子として、例えば、使用されるＡｂまたはｍＡｂの結合親和性および半減期、患者における３６Ｐ６Ｄ５の発現の程度、循環している破棄された（ｓｈｅｄ）３６Ｐ６Ｄ５抗原の程度、所望される定常状態の抗体濃度レベル、処置の頻度、ならびに本発明の処置方法と組合せて使用される化学療法剤の影響が挙げられ得る。
必要に応じて、患者は、最も有効な投与レジメンおよび関連する因子の決定を補助するために、血清中の循環している破棄された３６Ｐ６Ｄ５抗原のレベルについて評価されるべきである。このような評価はまた、治療を通じて目的のものをモニタリングするために使用され得、そして他のパラメーター（例えば、前立腺癌治療における血清ＰＳＡレベル）を評価することと組合せて治療的成功を計測するために有用であり得る。
（３６Ｐ６Ｄ５タンパク質機能の阻害）
本発明は、３６Ｐ６Ｄ５のその結合パートナーもしくはリガンドに対する結合または他のタンパク質との会合を阻害する種々の方法および組成物、ならびに３６Ｐ６Ｄ５機能を阻害するための方法を含む。
（細胞内抗体を用いる３６Ｐ６Ｄ５の阻害）
１つのアプローチにおいて、３６Ｐ６Ｄ５に特異的に結合する単鎖抗体をコードする組換えベクターが、遺伝子導入技術を通じて３６Ｐ６Ｄ５を発現する細胞中に導入され得る。ここでは、コードされる単鎖の抗３６Ｐ６Ｄ５抗体は、細胞内で発現され、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質に結合し、そしてそれによってその機能を阻害する。このような細胞内単鎖抗体を操作するための方法は、周知である。このような細胞内抗体はまた、「イントラボディー（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）」としても公知であり、細胞内の特定の部分に対して特異的に標的化され得、それによって処置の阻害活性が集められる場所にわたって制御を提供する。この技術は、当該分野で良好に適用されている（概要については、ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎおよびＭａｒａｓｃｏ、１９９５、ＴＩＢＴＥＣＨ、第１３巻）。イントラボディーは、他の豊富な細胞表面レセプターの発現を実質的に排除することが示されている。例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：３１３７−３１４１；Ｂｅｅｒｌｉら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９：２３９３１−２３９３６；Ｄｅｓｈａｎｅら、１９９４、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：３３２−３３７を参照のこと。
単鎖抗体は、可撓性のリンカーポリペプチドによって連結された重鎖および軽鎖の可変ドメインを含み、そして単一のポリペプチドとして発現される。必要に応じて、単鎖抗体が、軽鎖の定常領域に対して連結された単鎖の可変領域フラグメントとして発現され得る。周知の細胞内輸送シグナルが、所望される細胞内部分に対して発現されたイントラボディーを正確に標的化するために、このような単鎖抗体をコードする組換えのポリヌクレオチドベクター中に操作され得る。例えば、小胞体（ＥＲ）に対して標的化されたイントラボディーは、リーダーペプチドを、そして必要に応じて、ＫＤＥＬアミノ酸モチーフのようなＣ末端のＥＲ保持シグナルを取り込むように操作され得る。核内で活性を発揮するように意図されたイントラボディーは、核局在化シグナルを含むように操作され得る。脂質部分は、血漿膜の細胞質ゾル側にイントラボディーを鎖でつなぐように、イントラボディーに対して連結され得る。イントラボディーはまた、細胞質ゾル中で機能を発揮するように標的化され得る。例えば、細胞質ゾルのイントラボディーは、細胞質ゾル中の因子を隔離するために使用され得、それによってそれらを、それらの天然の細胞性の目的地に対して輸送されることから妨げる。
１つの実施形態においては、イントラボディーは、核において３６Ｐ６Ｄ５を捕獲し、これによって核におけるその活性を防止するために使用され得る。核標的化シグナルは、所望の標的化を達成するために、このような３６Ｐ６Ｄ５イントラボディーに操作され得る。このような３６Ｐ６Ｄ５イントラボディーは、特定の３６Ｐ６Ｄ５ドメインに特異的に結合するよう設計され得る。別の実施形態において、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質に特異的に結合する細胞質ゾルイントラボディーが、３６Ｐ６Ｄ５が核への接近を得ることを防止するために使用され得、これによって３６Ｐ６Ｄ５がいかなる生物学的活性を核において及ぼすことをも防止し得る（例えば、３６Ｐ６Ｄ５が他の因子と転写複合体を形成することを防止し得る）。
このような特定の腫瘍細胞についてこのようなイントラボディーの発現を特異的に指向するために、イントラボディーの転写が、適切な腫瘍特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーの調節制御下に配置され得る。前立腺について特異的なイントラボディーの発現を標的化するために、例えば、ＰＳＡプロモーターおよび／またはプロモーター／エンハンサーが利用され得る（例えば、米国特許第５，９１９，６５２号を参照のこと）。
（組換えタンパク質での３６Ｐ６Ｄ５の阻害）
別のアプローチにおいては、３６Ｐ６Ｄ５に結合し得、それによって３６Ｐ６Ｄ５がその結合パートナー（単数または複数）に対して会合／結合すること、または他のタンパク質（単数または複数）と会合することを妨げ得る、組換え分子が、３６Ｐ６Ｄ５機能を阻害するために使用される。このような組換え分子は、例えば、３６Ｐ６Ｄ５特異的抗体分子の反応性の部分（単数または複数）を含み得る。特定の実施形態においては、３６Ｐ６Ｄ５結合パートナーの３６Ｐ６Ｄ５結合ドメインが、ヒトのＩｇＧ（例えば、ヒトのＩｇＧ１）のＦｃ部分に対して連結された２つの３６Ｐ６Ｄ５リガンド結合ドメインを含有している二量体の融合タンパク質中に操作され得る。このようなＩｇＧ部分は、例えば、ＣH２およびＣH３ドメイン、ならびにヒンジ領域を含み得るが、ＣH１ドメインは含まない。このような二量体の融合タンパク質は、可溶性の形態で、３６Ｐ６Ｄ５の発現に関連している癌（前立腺、膀胱、卵巣、乳房、膵臓、結腸、および肺の癌を含むがこれらに限定されない）を罹患している患者に対して投与され得る。ここでは、二量体の融合タンパク質は３６Ｐ６Ｄ５に特異的に結合し、それによって結合パートナーとの３６Ｐ６Ｄ５の相互作用をブロックする。このような二量体の融合タンパク質はさらに、公知の抗体連結技術を使用して多量体のタンパク質へと結合させられ得る。
（３６Ｐ６Ｄ５の転写または翻訳の阻害）
別のクラスの治療アプローチにおいては、本発明は、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子の転写を阻害するための種々の方法および組成物を提供する。同様に、本発明はまた、タンパク質への３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡの翻訳を阻害するための方法および組成物を提供する。
１つのアプローチにおいては、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子の転写を阻害する方法は、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子を３６Ｐ６Ｄ５アンチセンスポリヌクレオチドと接触させることを含む。別のアプローチにおいては、３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡの翻訳を阻害する方法は、アンチセンスポリヌクレオチドと３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡを接触させることを含む。別のアプローチにおいては、３６Ｐ６Ｄ５特異的リボザイムが、３６Ｐ６Ｄ５メッセージを切断するために使用され得、それによって翻訳が阻害される。このようなアンチセンスおよびリボザイムに基づく方法はまた、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子の調節領域（例えば、３６Ｐ６Ｄ５の開始部位、プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメント）に対して指向され得る。同様に、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子の転写因子を阻害し得るタンパク質が、３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡの転写を阻害するために使用され得る。上記の方法において有用である種々のポリヌクレオチドおよび組成物が、上記に記載されている。別のアプローチにおいては、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子の翻訳を、モルホリノアンチセンス技術を使用して阻害し得る。転写および翻訳を阻害するためのアンチセンスおよびリボザイム分子の使用は当該分野で周知である。
３６Ｐ６Ｄ５転写活性を妨害することを通じて３６Ｐ６Ｄ５の転写を阻害する他の因子もまた、３６Ｐ６Ｄ５を発現する癌の処置のために有用であり得る。同様に、３６Ｐ６Ｄ５のプロセシングを妨害し得る因子が、３６Ｐ６Ｄ５を発現する癌の処置に有用であり得る。このような因子を利用する癌の処置方法もまた、本発明の範囲内である。
（治療ストラテジーについての一般的な考察）
遺伝子導入および遺伝子治療技術が、３６Ｐ６Ｄ５を合成する腫瘍細胞に対して治療用のポリヌクレオチド分子（すなわち、アンチセンス、リボザイム、イントラボディーをコードするポリヌクレオチド、および他の３６Ｐ６Ｄ５阻害分子）を送達するために使用され得る。多数の遺伝子治療アプローチが当該分野で公知である。３６Ｐ６Ｄ５アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、３６Ｐ６Ｄ５の転写を妨害し得る因子などをコードする組換えベクターが、このような遺伝子治療アプローチを使用して腫瘍細胞を標的化するために送達され得る。
上記の治療アプローチは、広範な種々の化学療法または放射線治療レジメの任意の１つと組合せられ得る。これらの治療アプローチもまた、化学療法の減少した投与量および／またはより少ない頻度の投与の使用を、特に、化学療法剤の毒性を十分に寛容化しない患者において可能にし得る。
特定の組成物（例えば、アンチセンス、リボザイム、イントラボディー）の抗腫瘍活性、またはこのような組成物の組合せが、種々のインビトロおよびインビボでのアッセイ系を使用して評価され得る。治療能力を評価するためのインビトロでのアッセイとして、細胞増殖アッセイ、軟質寒天アッセイ、および腫瘍促進活性を示す他のアッセイ、治療組成物が結合パートナーに対する３６Ｐ６Ｄ５の結合を阻害する程度を決定し得る結合アッセイなどが挙げられる。
インビボでは、３６Ｐ６Ｄ５治療組成物の効果は、適切な動物モデルにおいて評価され得る。例えば、異種の前立腺癌のモデル（ここでは、ヒトの前立腺癌の移植片または継代された異種移植片組織が、免疫和解された動物（例えば、ヌードマウスまたはＳＣＩＤマウス）中に導入される）が、前立腺癌に対する関係において適切であり、そして記載されている（Ｋｌｅｉｎら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：４０２−４０８）。例えば、１９９８年４月２３日に公開された、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９８／１６６２８号、Ｓａｗｙｅｒｓらは、初代の腫瘍の発達、微小な転移、および後期の疾患の特徴である骨芽細胞の転移の形成を要約し得るヒトの前立腺癌の種々の異種移植片モデルを記載している。効率は、腫瘍形成、腫瘍の退行、または転移などの阻害を測定するアッセイを使用して推定され得る。以下の実施例をもまた参照のこと。
アポトーシスの促進を定量するインビボアッセイもまた、可能性のある治療組成物を評価することにおいて有用であり得る。１つの実施形態においては、治療組成物で処置された生存しているマウスに由来する異種移植片が、アポトーシス性の病巣の存在について試験され、そして処置されていないコントロールの異種移植片を保有しているマウスに対して比較され得る。アポトーシス性の病巣が処置されたマウスの腫瘍中で見出される程度は、組成物の治療効率の指標を提供する。
上記の方法の実施において使用される治療用組成物は、所望される送達方法のための適切なキャリアを含有している薬学的組成物中に処方され得る。適切なキャリアとして、治療組成物とともに混合された場合に、治療組成物の抗腫瘍機能を保持し、そして患者の免疫系と反応しない任意の材料が挙げられる。例として、滅菌のリン酸緩衝化生理食塩水、静菌水などのような、任意の多数の標準的な薬学的キャリアなどが挙げられるがこれらに限定されない（一般的には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第１６版、Ａ．Ｏｓａｌ．編、１９８０を参照のこと）。
治療用処方物は可溶化され得、そして、腫瘍部位に治療用組成物を送達し得る任意の経路を通じて投与され得る。可能性のある有効な投与経路として、静脈内、非経口、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内、器官内、正常位などが挙げられるが、これらに限定されない。
静脈内注射のための好ましい処方物は、保存された静菌水、滅菌の保存されていない水、および／または０．９％の注射のための滅菌の塩化ナトリウム（ＵＳＰ）を含有しているポリビニルクロライドもしくはポリエチレンバッグ中に稀釈された溶液中の治療用組成物を含む。治療用タンパク質調製物は、凍結乾燥され得、そして滅菌の散剤として、好ましくは、減圧下で保存され、次いで、注射の前に、例えば、ベンジルアルコール保存料を含有している静菌水中でまたは滅菌水中で再構成され得る。
以下の方法を使用する癌の処置のための投与量および投与プロトコールは、方法および標的の癌によって変化し、そして、当該分野で示されている多数の他の因子に一般に依存する。
（癌ワクチン）
上記のように、３６Ｐ６Ｄ５の発現プロフィールは、これが進行および転移した前立腺癌において高度に発現されることを示す。この発現パターンは、癌−精巣（ＣＴ）抗原またはＭＡＧＥを暗示し、これらは、黒色腫および他の癌にてアップレギュレートされる、精巣特異的遺伝子である（Ｖａｎ ｄｅｎ ＥｙｎｄｅおよびＢｏｏｎ、Ｉｎｔ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｒｅｓ．２７：８１〜８６、１９９７）。癌におけるその組織特異的発現および高レベル発現に起因して、ＭＡＧＥは、癌ワクチンについての標的として現在調査されている（Ｄｕｒｒａｎｔ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ ８：７２７〜７３３、１９９７；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ７２：９７２〜９７６、１９９７）。
本発明はさらに、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質またはそのフラグメントを含む癌ワクチン、およびＤＮＡベースのワクチンを提供する。３６Ｐ６Ｄ５の発現を考慮すると、癌ワクチンは、非標的組織に対して非特異的効果を生成することなく、３６Ｐ６Ｄ５を発現している癌の特異的な予防および／または処置に効果的であることが予期される。抗癌療法での使用について、液性免疫および細胞媒介性免疫を生成するワクチンにおける腫瘍抗原の使用は、当該分野で周知であり、そしてヒトＰＳＭＡおよびげっ歯類ＰＡＰ免疫原を使用して、前立腺癌に使用されている（Ｈｏｄｇｅら、１９９５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６３：２３１〜２３７；Ｆｏｎｇら、１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３１１３〜３１１７）。このような方法は、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質もしくはそのフラグメント、または３６Ｐ６Ｄ５をコードする核酸分子、および３６Ｐ６Ｄ５免疫原を発現し、かつ適切に提示し得る組換えベクターを用いることによって容易に実施され得る。代表的な技術の例示的な例としては、免疫応答（例えば、体液応答）を哺乳動物において生じさせる方法が挙げられ、この方法は、この哺乳動物の免疫系を、免疫反応性エピトープ（例えば、配列番号２に示す３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のエピトープ）に曝露する工程を包含し、その結果、この哺乳動物は、免疫応答を生じ、この応答は、そのエピトープが発生したことに特異的である（例えば、このエピトープを特異的に認識する抗体）。
例えば、ウイルス遺伝子送達システムは、３６Ｐ６Ｄ５をコードする核酸分子を送達するために使用され得る。本発明のこの局面の実施において使用され得る種々のウイルス遺伝子送達システムとして、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ワクシニア、鶏痘、カナリアポックス、アデノウイルス、インフルエンザ、ポリオウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、およびシンドビスウイルス（Ｒｅｓｔｉｆｏ、１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６５８−６６３）。非ウイルス送達システムもまた、抗腫瘍応答を誘導するために患者に（例えば、筋肉内で）導入される３６Ｐ６Ｄ５タンパク質またはそのフラグメントをコードする裸のＮＤＡを使用することによって使用され得る。１つの実施形態においては、全長のヒトの３６Ｐ６Ｄ５ ｃＤＮＡが使用され得る。別の実施形態においては、特異的細胞毒性のＴリンパ球（ＣＴＬ）エピトープをコードする３６Ｐ６Ｄ５核酸分子が使用され得る、ＣＴＬエピトープは、特定されたＨＬＡ対立遺伝子に最適に結合し得る３６Ｐ６Ｄ５タンパク質中のペプチドを同定するための、特異的なアルゴリズム（例えば、Ｅｐｉｍｅｒ、Ｂｒｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を使用して決定され得る。
種々のエキソビボのストラテジーもまた、使用され得る。１つのアプローチは、患者の免疫システムに対して３６Ｐ６Ｄ５抗原を提示するための樹状細胞の使用を含む。樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ、Ｂ７同時刺激因子、ならびにＩＬ−１２を発現し、そして従って、高度に特殊化された抗原提示細胞である。前立腺ガンにおいては、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のペプチドでパルスされた自己由来の樹状細胞が、前立腺ガンの患者の免疫システムを刺激するためのＰｈａｓｅ Ｉの臨床試験において使用される（Ｔｊｏａら、１９９６、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２８：６５−６９；Ｍｕｒｐｈｙら、１９９６、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２９：３７１−３８０）。樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子の状況においてＴ細胞に対して３６Ｐ６Ｄ５ペプチドを提示するために使用され得る。１つの実施形態においては、自己由来の樹状細胞が、ＭＨＣ分子に結合し得る３６Ｐ６Ｄ５ペプチドでパルスされる。別の実施形態においては、樹状細胞が、完全な３６Ｐ６Ｄ５タンパク質でパルスされる。なお別の実施形態は、以下のような当該分野で公知の種々の実行ベクターを使用して樹状細胞中の３６Ｐ６Ｄ５遺伝子の過剰発現を操作することを含む：アデノウイルス（Ａｒｔｈｕｒら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：１７−２５）、レトロウイルス（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３７６３−３７７０）、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＤＮＡトランスフェクション（Ｒｉｂａｓら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：２８６５−２８６９）、および腫瘍に由来するＲＮＡトランスフェクション（Ａｓｈｌｅｙら、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１７７−１１８２）。３６Ｐ６Ｄ５を発現する細胞もまた、ＧＭ−ＣＳＦのような免疫調節因子を発現するように操作され得、そして免疫化試薬として使用され得る。
抗イディオタイプ抗３６Ｐ６Ｄ５抗体もまた、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を発現する細胞に対して免疫応答を誘導するためのワクチンつとして、抗ガン治療において使用され得る。詳細には、抗イディオタイプ抗体の生成は当該分野で周知であり、そして３６Ｐ６Ｄ５タンパク質上のエピトープを模倣する抗イディオタイプ抗３６Ｐ６Ｄ５抗体を作成するように容易に適合させられ得る（例えば、Ｗａｇｎｅｒら、１９９７、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １６：３３−４０；Ｆｏｏｎら、１９９５、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９６：３３４−３４２；Ｈｅｒｌｙｎら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ４３：６５−７６を参照のこと）。このような抗イディオタイプ抗体は、ガンのワクチンストラテジーにおいて使用され得る。
遺伝子による免疫化方法が、３６Ｐ６Ｄ５を発現するガン細胞に対して指向された予防的または治療的な体液性および細胞性の免疫応答を作成するために使用され得る。３６Ｐ６Ｄ５タンパク質／免疫原をコードするＤＮＡ、および適切な調節配列を含有している構築物が、個体の筋肉または皮膚中に直接注射され得る。その結果、筋肉または皮膚の細胞は、構築物を取りこみ、そしてコードされる３６Ｐ６Ｄ５タンパク質／免疫原を発現する。３６Ｐ６Ｄ５タンパク質免疫原の発現は、骨癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、および卵巣癌対する予防的または治療的な体液性および細胞性の免疫の作成を生じる。当該分野で公知の種々の予防的および治療的な遺伝子による免疫化技術が、使用され得る（概説については、インターネットアドレスｗｗｗ．ｇｅｎｗｅｂ．ｃｏｍで公開されている情報および参考文献を参照のこと）。
（診断組成物およびキット）
上記に記載されているかまたは示唆されている診断用および治療用の適用における使用については、キットがまた本発明によって提供される。このようなキットは、閉じられた制限の中に、１つ以上の容器手段（例えば、バイアル、チューブなど）を受容させられる仕切られたキャリア手段を含み得る。それぞれの容器手段は、この方法において使用される別々のエレメントの１つを含有している。例えば、１つの容器手段は、検出可能な標識であるかまたは検出可能に標識され得るプローブを含み得る。このようなプローブは、それぞれ３６Ｐ６Ｄ５タンパク質または３６Ｐ６Ｄ５遺伝子またはメッセージについて特異的な抗体またはポリヌクレオチドであり得る。キットが標的の核酸を検出するために核酸のハイブリダイゼーションを利用する場合には、キットはまた、標的の核酸配列の増幅のためのヌクレオチド（単数または複数）を含有している容器、および／あるいはレポーター手段（例えば、レポーター分子（例えば、酵素標識、蛍光標識、または放射性同位元素標識）に対して結合させられたビオチン結合タンパク質（例えば、アビジンまたはストレプトアビジン））を含有している容器を有し得る。
本発明のキットは、代表的には、上記に記載されている容器、および商業的にそして使用者の視点から所望される材料（緩衝液、稀釈液、フィルター、針、シリンジ、および使用のための説明書を有するパッケージ挿入物を含む）を含有している１つ以上の他の容器を含む。組成物が特異的な治療または非治療的な適用のために使用されることを示す標識は、容器上に存在し得、そしてまた、上記に記載されているようなインビボまたはインビトロでのいずれかの使用のための指針を示し得る。
従って、本発明はまた、３６Ｐ６Ｄ５関連分子を含有する診断組成物を提供する。このような分子は、本明細書中で記載される様々な３６Ｐ６Ｄ５ポリヌクレオチド、プライマー、プローブ、タンパク質、フラグメント、抗体を含む。診断組成物に含まれる分子は、必要に応じて、検出可能なマーカーで標識され得る。３６Ｐ６Ｄ５診断組成物は、適切な緩衝液、希釈剤および必要に応じて他の成分をさらに含み得る。
（実施例）
本発明の種々の局面がさらに記載され、そして以下のいくつかの実施例の方法によって説明される。これらの全てが、本発明の範囲を制限するようには意図されない。
（実施例１：３６Ｐ６Ｄ５遺伝子のｃＤＮＡフラグメントのＳＳＨによって生成された単離物）
（材料および方法）
（ＬＡＣＰ異種移植片：）
ＬＡＣＰ異種移植片を、Ｄｒ．Ｃｈａｒｌｅｓ Ｓａｗｙｅｒｓ（ＵＣＬＡ）から入手し、そして記載されているように作成した（Ｋｌｅｉｎら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：４０２−４０８）。アンドロゲン依存性のＬＡＣＰ−４異種移植片（ＬＡＰＣ−４ ＡＤ）を、雄性のＳＣＩＤマウスにおいて皮下増殖させ、そしてレシピエントの雄性においてかなりの量の小さい組織として継代した。ＬＡＰＣ−４ ＡＤ異種移植片を、脛骨内で増殖した。皮下で増殖したＬＡＰＣ−４ ＡＤ異種移植片腫瘍組織を、１〜２ｍｍ3の切片に切断し、同時にこの組織を１×Ｉｓｃｏｖｅｓ培地に入れ、切断組織を、次いで、１．３Ｋｒｐｍで４分間遠心分離し、上清を１０ｍｌの氷冷した１×Ｉｓｃｏｖｅｓ培地に再懸濁し、そして１．３Ｋｒｐｍで４分間遠心分離した。次いで、ペレットを、１％プロナーゼＥと共に１×Ｉｓｃｏｖｅｓに再懸濁し、そして穏やかに撹拌しながら、室温で２０分間インキュベートし、続いて２〜４分間氷上でインキュベートした。濾液を１．３Ｋｒｍｐで４分間遠心分離し、このプロナーゼを、１０ｍｌのＩｓｃｏｖｅｓに再懸濁して再度遠心分離することによって吸引したペレットから除去した。次いで、細胞の凝集物を、ＰｒＥＧＭ培地に入れ、そして一晩増殖した。次いで、この細胞を収集し、濾過し、２×ＲＰＭＩで洗浄し、そして計数した。約５０，０００個の細胞を等容量の氷冷Ｍａｔｒｉｇｅｌと氷上で混合し、そして２７ゲージ針でＳＣＩＤマウスの近位脛骨幹端に外科的に注射した。１０〜１２週間後、骨髄中で増殖しているＬＡＰＣ−４腫瘍を回収した。
（細胞株：）
ヒトの細胞株（例えば、ＨｅＬａ）を、ＡＴＣＣから入手し、そして５％のウシの胎児の血清を有しているＤＭＥＭ中で維持した。
（ＲＮＡの単離：）
腫瘍組織および細胞株を、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）中で、１０ｍｌ／ｇ組織または１０ｍｌ／１０8個の細胞を使用して、全ＲＮＡを単離するためにホモジナイズした。ポリＡ ＲＮＡを、ＱｕｉａｇｅｎのＯｌｉｇｏｔｅｘ ｍＲＮＡ Ｍｉｎｉ ａｎｄ Ｍｉｄｉキットを使用して全ＲＮＡから精製した。全ｍＲＮＡを、分光光度分析（Ｏ．Ｄ．２６０／２８０ｎｍ）によって定量し、そしてゲル電気泳動によって分析した。
（オリゴヌクレオチド：）
以下のＨＰＬＣ精製したオリゴヌクレオチドを使用した。
ＤＰＮＣＤＮ（ｃＤＮＡ合成プライマー）
Figure 0004833252
 （抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション：）
抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）を、前立腺癌において差次的に発現され得る遺伝子に対応するｃＤＮＡを同定するために使用した。このＳＳＨ反応は、２つの異なる環境（すなわち、皮下（「ＬＡＰＣ−４ ＡＤ
ＳＱ」）および脛骨内（「ＬＡＰＣ−４ ＡＤ ＩＴ」）の増殖環境）において増殖するＬＡＰＣ−４ ＡＤ異種移植片由来のｃＤＮＡを使用した。ここで、このＬＡＰＣ−４ ＡＤ ＩＴ異種移植片は、「テスター」ｃＤＮＡの供給源として使用され、一方、ＬＡＰＣ−４ ＡＤ ＳＱ異種移植片は、「ドライバー」ｃＤＮＡの供給源として使用された。
テスターｃＤＮＡおよびドライバーｃＤＮＡに対応している二本鎖のｃＤＮＡを、上記に記載するように、異種移植片組織から単離した２μｇのポリ（Ａ）+ＲＮＡから、ＣＬＯＮＴＥＣＨのＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ ｃＤＮＡ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔおよび１ｎｇのオリゴヌクレオチドＤＰＮＣＤＮをプライマーとして使用して、合成した。第１鎖および第２鎖の合成を、キットの使用者のマニュアルプロトコール（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｎｏ．ＰＴ１１１７−１、Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．Ｋ１８０４−１）に記載されているように行った。得られたｃＤＮＡを、ＤｐｎＩＩで３時間、３７℃で消化した。消化したｃＤＮＡを、フェノール／クロロホルム（１：１）で抽出し、そしてエタノール沈殿させた。
ドライバーｃＤＮＡを、ヒトの細胞株ＨｅＬａ、２９３、Ａ４３１、Ｃｏｌｏ２０５、およびマウスの肝臓に由来するＤｐｎ ＩＩ消化したｃＤＮＡを合わせることによって生成した。テスターｃＤＮＡを、関連の異種移植片供給源（上記を参照のこと）由来の１μｌのＤｐｎ ＩＩで消化したｃＤＮＡ（４００ｎｇ）を、５μｌの水中に稀釈することによって生成した。次いで、稀釈したｃＤＮＡ（２μｌ、１６０ｎｇ）を、２μｌのアダプター１およびアダプター２（１０μＭ）に対して、別々の連結反応において、１０μｌの全容量中で１６℃で一晩、４００ｕのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を使用して連結させた。連結を、１μｌの０．２ＭのＥＤＴＡおよび７２℃で５分間の加熱を用いて停止させた。
最初のハイブリダイゼーションを、１．５μｌ（６００ｎｇ）のドライバーｃＤＮＡを、１．５μｇ（２０ｎｇ）のアダプター１およびアダプター２を連結させたテスターｃＤＮＡを含有している２つのそれぞれのチューブに添加することによって行った。４μｌの最終容量中で、サンプルにミネラルオイルを重層し、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈサーマルサイクラー中で９８℃で１．５分間変性させ、次いで６８℃で８時間ハイブリダイズさせた。次いで、２つのハイブリダイゼーションを、さらなる１μｌの新しい変性ドライバーｃＤＮＡとともに混合し、そして６８℃で一晩ハイブリダイズさせた。次いで、第２回目のハイブリダイゼーションを、２０ｍＭの２００μｌのＨｅｐｅｓ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ中に稀釈し、７０℃で７分間加熱し、そして−２０℃で保存した。
（ＳＳＨによって生成した遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅、クローニング、および配列決定）
ＳＳＨ反応によって得られた遺伝子フラグメントを増幅するために、２回のＰＣＲ増幅を行った。最初のＰＣＲ反応においては、１μｌの稀釈した最終のハイブリダイゼーション混合物を、２５μｌの最終容量中の１μｌのＰＣＲプライマー１（１０μＭ）、０．５μｌのｄＮＴＰ混合物（１０μＭ）、２．５μｌの１０×反応緩衝液（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、および０．５μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ ｃＤＮＡポリメラーゼＭｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）に対して、添加した。ＰＣＲ１を、以下の条件を使用して行った：７５℃で５分間、９４℃で２５秒間、次いで２７サイクルの、９４℃で１０秒間、６６℃で３０秒間、７２℃で１．５分間。５個の別々の最初のＰＣＲ反応を、それぞれの実験について行った。生成物をプールし、そして水で１：１０に稀釈した。第２回目のＰＣＲ反応については、プールしそして稀釈した最初のＰＣＲ反応物を、プライマーＮＰ１およびＮＰ２（１０μＭ）をＰＣＲプライマー１の代わりに使用したことをのぞいて、ＰＣＲ１について使用したものと同じ反応混合物に対して添加した。ＰＣＲ２を、１０〜１２サイクルの、９４℃で１０秒、６８℃で３０秒、７２℃で１．５分を使用して行った。ＰＣＲ産物を、２％のアガロースゲル電気始動を使用して分析した。
ＰＣＲ産物を、Ｔ／Ａベクタークローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｐＣＲ２．１中に挿入した。形質転換したＥ．ｃｏｌｉを、青色／白色選択およびアンピシリン選択に供した。白色のコロニーを採取し、そして９６ウェルプレート中に並べ、そして液体培養物中で一晩増殖させた。挿入物を同定するために、ＰＣＲ増幅を、１ｍｌの細菌培養物について、ＰＣＲ１の条件、ならびにプライマーとしてＮＰ１およびＮＰ２を使用して行った。ＰＣＲ産物を、２％のアガロースゲル電気始動を使用して分析した。
細菌クローンを、９６ウェル形式で２０％のグリセロール中に保存した。プラスミドＤＮＡを調製し、配列決定し、そしてＧｅｎＢａｎｋ、ｄＢｅｓｔ、およびＮＣＩ−ＣＧＡＰデータベースの核酸相同性検索に供した。
（ＲＴ−ＰＣＲ発現分析：）
第１鎖のｃＤＮＡを、１μｇのｍＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）１２〜１８プライミングを用いて、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍを使用して作製した。製造業者のプロトコールを使用し得、そしてこのプロトコールは、逆転写酵素を用いた４２℃で５０分間のインキュベーション、続く２０分間の３７℃でのＲＮａｓｅ Ｈ処理を含んだ。反応の完了後、容量を、較正の前に水を用いて２００μｌに増大させた。１６個の異なる正常なヒトの組織に由来する第１鎖のｃＤＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手した。
複数の組織に由来する第１鎖のｃＤＮＡの較正を、β−アクチンを増幅するためのプライマー５’ａｔａｔｃｇｃｃｇｃｇｃｔｃｇｔｃｇｔｃｇａｃａａ３’（配列番号１１）および５’ａｇｃｃａｃａｃｇｃａｇｃｔｃａｔｔｇｔａｇａａｇｇ３’（配列番号１２）を使用することによって、行った。第１鎖のｃＤＮＡ（５μｌ）を、０．４μＭのプライマー、０．２μＭの各ｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ８．３）、および１×Ｋｌｅｎｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含有している全容量５０μｌ中で増幅させた。５μｌのＰＣＲ反応物を、１８、２０、および２２サイクルで取り出し、そしてアガロースゲル電気泳動に使用した。ＰＣＲを、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈサーマルサイクラーを使用して、以下の条件下で行った：最初の変性は、９４℃で１５秒間、続いて、１８、２０、および２２サイクルの、９４℃で１５秒、６５℃で２分、７２℃で５秒。７２℃での最後の伸張を、２分間行った。アガロースゲル電気泳動後、複数の組織からの２８３ｂｐのβ−アクチンバンドのバンド強度を、目視検査によって比較した。
第１鎖のｃＤＮＡについての稀釈係数を、２２回のＰＣＲサイクルの後の全ての組織中で等量のβ−アクチンのバンド強度を生じるように計算した。３回の較正が、２２回のＰＣＲサイクルの後に全ての組織中で等しいバンド強度を達成するために必要であった。
３６Ｐ６Ｄ５遺伝子の発現レベルを決定するために、５μｌの較正した第１鎖のｃＤＮＡを、以下のプライマーの対を使用する２５、３０、および３５サイクルの増幅を使用するＰＣＲによって分析した：
Figure 0004833252
 半定量的な発現分析を、明るいバンド強度を生じるサイクル数でのＰＣＲ産物を比較することによって達成した。
（結果）
材料および方法（上記）に記載するＳＳＨ実験は、多数の候補遺伝子フラグメントクローン（ＳＳＨクローン）の単離を導いた。全ての候補のクローンを配列決定し、そして、対応する遺伝子の正体についての情報を提供するため、および異なる発現について特定の遺伝子を分析するための指針を補助するために、主要な一般的な遺伝子およびＥＳＴデータベース中の全ての配列に対する相同性分析に供した。一般的には、任意の検索されるデータベース中のいずれの公知の配列遺伝子フラグメントに対しても相同性を有さず、従って、新規の遺伝子を提示すると考えられる遺伝子フラグメント、ならびに以前に配列決定された発現される配列タグ（ＥＳＴ）に対して相同性を示す遺伝子フラグメントを、ＲＴ−ＰＣＲおよび／またはノーザン分析による異なる発現の分析に供した。
約４２７ｂｐを含有しているＳＳＨクローンの１つは、いずれの公知の遺伝子に対して相同性を示さず、そして３６Ｐ６Ｄ５と命名された。ＲＴ−ＰＣＲの最初の発現分析は、他のサンプルと比較して、ＬＡＰＣ−４ ＡＤ（ＩＴ）および正常な前立腺において最高の発現を示した。従って、このクローンは、以下の図２に示す３６Ｐ６Ｄ５をコードする全長のｃＤＮＡフラグメントを示す。
（実施例２）
（３６Ｐ６Ｄ５遺伝子をコードする全長ｃＤＮＡの単離）
４２３ｂｐの単離した３６Ｐ６Ｄ５遺伝子フラグメントを、ヒト前立腺ｃＤＮＡライブラリにおける３６Ｐ６Ｄ５の全長ｃＤＮＡを同定するためのプローブとして使用した。これにより、９３１ｂｐのｃＤＮＡ、３６Ｐ６Ｄ５−ＧＴＣ４（これは、２つの以前に報告された配列、２〜１９タンパク質前駆体（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｐ９８１７３）およびＧＳ３７８６（Ｑ９２５２０）と称されるヒト骨芽細胞に対して有意な相同性を有する２３５アミノ酸ＯＲＦをコードする）を単離した。
クローン３６Ｐ６Ｄ５−ＧＴＣ４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を図１に示す。コードされたアミノ酸配列は、Ｎ末端シグナル配列を示し、これにより分泌されるタンパク質が（ＰＳＯＲＴプログラムを使用して）予測される。２〜１９タンパク質前駆体および骨芽細胞タンパク質ＧＳ３７８６との３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のアミノ酸配列アライアメントを図２に示す。
（実施例３）
（３６Ｐ６Ｄ５遺伝子発現のノーザンブロッド分析）
正常ヒト組織中での３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡの発現を、最初に、全部で１６個の異なる正常ヒト組織を含有している、２つの複数の組織ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のノーザンブロッティングによって、プローブとして標識した３６Ｐ６Ｄ５ ｃＤＮＡを使用して、分析した。ＲＮＡサンプルを、β−アクチンプローブを用いて定量的に較正した。この分析の結果を図３に示し、そしてこの結果は、試験した１６この組織内で、３６Ｐ６Ｄ５遺伝子は膵臓において優勢に発現され、前立腺および小腸において非常に低いレベルで発現されることが検出されたことを示す。
さらに、ヒト眼組織および細胞株における３６Ｐ６Ｄ５発現を分析するために、ＬＡＰＣ−４ヒト前立腺癌異種移植片由来のＲＮＡおよび非前立腺癌細胞株のパネル由来のＲＮＡを、３６Ｐ６Ｄ５ ｃＤＮＡをプローブとして使用するノーザンブロットによって分析した。全てのＲＮＡサンプルを、エチジウムブロマイド染色、続く標識したβ−アクチンプローブを用いる分析によって定量的に較正した。この分析の結果を図４に示し、正常な前立腺と比較して全ての場合において、高レベルで皮下および脛骨内で増殖するＬＡＰＣ−４前立腺癌異種移植片における３６Ｐ６Ｄ５発現を示す。さらに、有意な発現は、いくつかの非前立腺癌細胞株（膵臓癌細胞（Ｃａｐａｎ−１）、結腸癌細胞（ＣａＣｏ−２、Ｃｏｌｏ−２０５）、乳癌細胞（ＣＡＭＡ−１，ＤＵ４４７５）、および卵巣癌細胞（ＳＷ６２６、ＣＡＯＶ−３、ＯＶ１０６３）を含む）において検出され、いくつかの場合において高レベルで検出された。特に、最高レベルの発現は、乳癌細胞株ＤＵ４４７５において検出された。
（実施例４）
（組換え３６Ｐ６Ｄ５の産生および精製）
３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の細胞成分局在化の分析のような多数の状況において使用するための組換え３６Ｐ６Ｄ５を提示するために、部分または全長ｃＤＮＡを、カルボキシル末端において６Ｈｉｓタグを提供する発現ベクターのような様々な発現ベクター（例えば、ｐＣＤＮＡ ３．１ ｍｙｃ−ｈｉｓ、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）のうちの任意の１つにクローン化し得る。
典型的な実施形態において、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の高レベルな発現を駆動するために、３６Ｐ６Ｄ５ ｃＤＮＡコードアミノ酸３０〜２３５（マイナスＮ末端シグナル配列）を、提供されたアルカリホスファターゼ（ＡＰ）ｃＤＮＡ配列と共に、およびこれに融合することなく、ｐＡＰＴａｇ５哺乳動物分泌ベクター（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ）にクローン化した。このベクターは、精製および検出のためのＣ末端６×ＨｉｓおよびＭＹＣタグ、ならびに分泌を駆動するＮ末端Ｉｇリーダー配列を提供する。ｐＡＰＴａｇ５−３６Ｐ６Ｄ５またはｐＴａｇ５−３６Ｐ６Ｄ５（ＡＰに融合しない）のいずれかを安定に発現する２９３Ｔ細胞は、これらの細胞株由来の条件付き培地の抗Ｈｉｓウエスタンブロットによって可視化されるように、精製のための組換えタンパク質の供給源として働く（図５）。条件付き培地中に存在するＨＩＳタグ化３６Ｐ６Ｄ５タンパク質は、以下の方法を使用して精製される。条件付き培地を５〜１０倍に濃縮し、そして同時に、１０ｋｄ ＭＷカットオフ膜を用いて、アミコン（ａｍｉｃｏｎ）限外濾過装置を使用して、緩衝液を、５００ｍＭ ＮａＣｌおよび２０ｍＭ イミダゾールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）（緩衝液Ａ）に交換した。この調製物は、０．１〜０．５ｍｌのニッケル金属親和性樹脂（Ｎｉ−ＮＴＡ、Ｑｉａｇｅｎ）に結合したバッチであり、緩衝液Ａで広範に洗浄される。
次いで、ＨＩＳタグ化ＳＧＰ−２８／ＣＲＩＳＰ−３タンパク質を、３００ｍＭ ＮａＣｌを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ ６．３）中の０〜４００ｍＭの勾配のイミダゾールで溶出し、次いで、ＰＢＳで広範に透析した。精製したタンパク質は、次いで、増殖アッセイのため、リガンド結合研究のため、または抗体試薬を精製するための免疫原として使用し得る。
典型的な構築物のさらなる実施形態は以下に提供される。
（ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ構築物）
哺乳動物細胞中で３６Ｐ６Ｄ５を発現させるために、７０５ｂｐ（２３５アミノ酸）の３６Ｐ６Ｄ５ ＯＲＦを、ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ Ａ（Ｉｎｖｉｒｔｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローン化した。タンパク質の発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターから駆動される。組換えタンパク質は、Ｃ末端に融合されたｍｙｃおよび６個のヒスチジンを有する。ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクターはまた、エピソームの複製のためのＳＶ４０起点およびラージＴ抗原を発現する細胞株中での単純なベクターレスキューとともに、ｍＲＮＡの安定性を増強するために、ウシの成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列を含む。
ネオマイシン耐性遺伝子は、タンパク質およびアンピシリン耐性遺伝子を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてＣｏｌＥ１起点は、Ｅ．ｃｏｌｉ中でのプラスミドの選択および維持を可能にする。
（ｐＡＰｔａｇ）
シグナル配列（アミノ酸３０〜２３５）を有さない３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を、ｐＡＰｔａｇ−５（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐ．Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ）にクローン化した。この構築物は、ＩｇＧＫシグナル配列をＮ末端に融合しつつ、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のＣ末端でアルカリホスファターゼ融合を生成する。得られる組換え３６Ｐ６Ｄ５タンパク質は、トランスフェクトされた哺乳動物細胞の培地に分泌するために最適化され、そして３６Ｐ６Ｄ５タンパク質と相互作用するリガンドまたはレセプターのようなタンパク質を同定するために使用され得る。タンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターから駆動され、そして組換えタンパク質はまた、アルカリホスファターゼのＣ末端に融合したｍｙｃおよび６個のヒスチジンを含み得る。Ｚｅｏｓｉｎ耐性遺伝子によって、このタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択が可能となり、そしてアンピシリン耐性遺伝子によって、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミドの選択が可能となる。
（ｐｔａｇ５）
シグナル配列（アミノ酸３０〜２３５）を有さない３６Ｐ６Ｄ５タンパク質をまた、ｐＴａｇ−５にクローン化した。このベクターは、ｐＡＰＴａｇに類似しているが、アルカリホスファターゼ融合を有さない。
（ｐＳＲａ構築物）
構成的に３６Ｐ６Ｄ５を発現する哺乳動物細胞株を作製するために、７０５ｂｐ（２３５アミノ酸）のＯＲＦをｐＳＲα構築物中にクローン化した。両栄養性およびエコトロピックなレトロウイルスを、ｐＳＲα構築物の２９３Ｔ−１０Ａ１パッケージング株中へのトランスフェクション、またはｐＳＲαとヘルパープラスミド（j−）の２９３細胞中への同時トランスフェクションによって、それぞれ作製する。レトロウイルスを、種々の哺乳動物細胞株を感染させるために使用し得、それによってクローン化した遺伝子である３６Ｐ６Ｄ５の宿主細胞株中への組込みを生じる。タンパク質の発現は、長末端反復（ＬＴＲ）から駆動される。ネオマイシン耐性遺伝子は、タンパク質およびアンピシリン耐性遺伝子を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてＣｏｌＥ１起点は、Ｅ．ｃｏｌｉ中でのプラスミドの選択および維持を可能にする。抗ＦＬＡＧ抗体を使用する検出を可能にするためにＣ末端にＦＬＡＧタグを融合させたさらなるｐＳＲα構築物を作製した。ＦＬＡＧヌクレオチド配列をＯＲＦの３’末端のクローニングプライマーに付加した。
さらなるｐＳＲａ構築物は、全長の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のＮ末端およびＣ末端の両方のＧＦＰおよびｍｙｃ／６Ｈｉｓ融合タンパク質を産生するために作製され得る。
（実施例５）
（バキュロウイルス系での組換え３６Ｐ６Ｄ５の産生）
バキュロウイルス発現系で組換え３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を作製するために、３６Ｐ６Ｄ５ ｃＤＮＡを、バキュロウイルス転移ベクターｐＢｌｕｅＢａｃ ４．５ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化する。このベクターは、Ｎ末端にＨｉｓタグを提供する。詳細には、ｐＢｌｕｅＢａｃ−３６Ｐ６Ｄ５を、組換えバキュロウイルスを作製するために、ＳＦ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）昆虫細胞中に、ヘルパープラスミドｐＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに同時トランスフェクトする（詳細については、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの説明マニュアルを参照のこと）。次いで、バキュロウイルスを、細胞上清から回収し、そしてプラークアッセイによって精製する。
次いで、組換え３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を、精製したバキュロウイルスでのＨｉｇｈＦｉｖｅ昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の感染によって作製する。組換え３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を、抗３６Ｐ６Ｄ５特異的抗体を使用して検出し得る。３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を精製し得、そして種々の細胞に基づくアッセイにおいて、または３６Ｐ６Ｄ５について特異的なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製するための免疫原として使用し得る。
（実施例６）
（３６Ｐ６Ｄ５ポリクローナル抗体の生成）
３６Ｐ６Ｄ５に対するポリクローナル血清を作製するために、ＳＧＰ−２８／ＣＲＩＳＰ−３タンパク質配列のアミノ酸１６３〜１７７（ＭＶＴＹＤＤＧＳＴＲＬＮＮＤＡ）（配列番号１２）に対応するペプチドを合成し、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合し、そして以下のようにウサギを免疫するために使用した。このウサギを、最初に、完全フロイントアジュバント中で混合した２００μｇのペプチド−ＫＬＨを用いて免疫した。次いで、このウサギに、不完全フロイントアジュバント中の２００μｇのペプチド−ＫＬＨを２週間ごとに注射した。各免疫の約７〜１０日後に、採血を行った。ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット分析を使用して、それぞれ、免疫ペプチドおよび３６Ｐ６Ｄ５タンパク質に対するウサギ血清の特異性および力価を決定した。Ａｆｆｉｇｅｌ１５（ＢｉｏＲａｄ）に対して共有結合させた３６Ｐ６Ｄ５ペプチド（ＭＶＴＹＤＤＧＳＴＲＬＮＮＤＡ）（配列番号２のアミノ酸１６３〜１７７）から構成したアフィニティーマトリクスに、免疫したウサギ由来の粗血清を通過させることによって、アフィニティー精製した３６Ｐ６Ｄ５ポリクローナル抗体を調製した。このマトリクスをＰＢＳで大規模に洗浄した後、３６Ｐ６Ｄ５ペプチドに対して特異的な抗体を、低いｐＨのグリシン緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ ２．５）で溶出し、直ちに中和し、そして大規模にＰＢＳに対して透析した。
このウサギポリクローナル抗体を３６Ｐ６Ｄ５タンパク質との反応性について試験するために、ｐＡＰＴａｇ５−３６Ｐ６Ｄ５発現ベクターまたはＰＴａｇ５−３６Ｐ６Ｄ５発現ベクターでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の馴化培地に対してウエスタンブロット分析を行った。アフィニティー精製したウサギ抗３６Ｐ６Ｄ５ ｐＡｂ（１μｇ／ｍｌ）は、２９３Ｔ細胞から分泌される両方の形態の組換え３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を認識する（図５）。
（実施例７）
（３６Ｐ６Ｄ５モノクローナル抗体の生成）
３６Ｐ６Ｄ５モノクローナル抗体を生成するために、精製した２９３Ｔ発現ＨＩＳタグ化３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を使用して、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを免疫する。Ｂａｌｂ Ｃマウスに、完全フロイントアジュバント中で混合した３６Ｐ６Ｄ５タンパク質５０μｇを最初に腹腔内に免疫する。続いて、マウスを、不完全フロイントアジュバント中で混合した３６Ｐ６Ｄ５タンパク質５０μｇで、２週間毎に、合計３回免疫する。免疫したマウス由来の血清の、全長３６Ｐ６Ｄ５タンパク質に対する反応性を、免疫原を使用するＥＬＩＳＡによって、および３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を発現する細胞由来の馴化培地を使用するウエスタンブロットによってモニタリングする。最大の反応性を示すマウスを３週間休ませ、そして最後に、ＰＢＳ中の融合タンパク質を注射し、次いで、４日後に屠殺する。次いで、この屠殺したマウスの脾臓を収集し、標準的な手順（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９９８）を使用して、ＳＰＯ／２骨髄腫細胞または他の適切な骨髄腫融合パートナーに融合する。ＨＡＴ選択の後の増殖ウェル由来の上清を、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットによってスクリーニングして、３６Ｐ６Ｄ５特異的抗体産生クローンを同定する。
３６Ｐ６Ｄ５モノクローナル抗体の結合親和性は、標準的な技術を使用して決定し得る。親和性の測定値は、エピトープ結合に対する抗体の強度を数量化し、そしてどの３６Ｐ６Ｄ５モノクローナル抗体が診断的用途または治療的用途のために好ましいかを定義するのを助けるために使用し得る。ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）は、結合親和性を決定するための好ましい方法である。ＢＩＡｃｏｒｅシステムは、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ、Ｗｅｌｆｏｒｄ Ｋ．１９９１，Ｏｐｔ．Ｑｕａｎｔ．Ｅｌｅｃｔ．２３：１；ＭｏｒｔｏｎおよびＭｙｓｚｋａ，１９９８，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２９５：２６８）を使用して、リアルタイムで生体分子の相互作用をモニタリングする。ＢＩＡｃｏｒｅ分析は、都合良く、会合速度定数、解離速度定数、平衡解離定数、および親和性定数を導く。
３６Ｐ６Ｄ５モノクローナル抗体を生成するための典型的な方法の特定の例示において、精製した２９３Ｔ発現ＨＩＳタグ化３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を使用して、３匹の雌性Ｂａｌｂ Ｃマウスを免疫した。最初に、Ｂａｌｂ Ｃマウスを、Ｒｉｂｉアジュバント中で混合した３６Ｐ６Ｄ５タンパク質５０μｇで腹腔内（ＩＰ）で免疫し、そしてさらに二回、２週間間隔で、Ｒｉｂｉアジュバント中の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質２５μｇを腹腔内でブーストした。三回目のブーストの後、続いて、マウスを、ＰＢＳ中のタンパク質２５μｇで、腹腔内に免疫した。４回目の免疫の後の試験採血のＥＬＩＳＡ分析は、この免疫原に対して免疫したマウスの各々について、少なくとも２×１０6の力価を示した。免疫されたマウス由来の血清は、前立腺癌（ＬＡＰＣ４異種移植片）、結腸癌（Ｃｏｌｏ ２０５、ＣａＣｏ−２）、乳癌（ＤＵ４４７５）、および膵臓癌（Ｃａｐａｎ−１）由来の細胞株を含む様々な癌細胞株由来の細胞溶解物および馴化培地中の内因性３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を特異的に認識する（図９）。さらに、この血清から精製したポリクローナル抗体を使用して、ＰＣ−３−３６Ｐ６Ｄ５細胞株およびＤＵ４４７５細胞株の上清、ならびに臨床学的血清サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を特異的に検出する捕捉ＥＬＩＳＡを開発した（表２）。抗３６Ｐ６Ｄ５ハイブリドーマの生成のために、マウスに、２５μｇの３６Ｐ６Ｄ５を腹腔内に最後にブーストし、３日後に屠殺し、そして脾臓細胞を収集し、そして標準的な手順を使用して骨髄腫パートナーに融合する（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８）。融合ハイブリドーマ増殖ウェル由来の上清を、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットによってスクリーニングして、３６Ｐ６Ｄ５特異的抗体産生クローンを同定する。
これらの抗体を使用して、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質は、結腸癌、膵臓癌、および乳癌由来の細胞株を含むいくつかの細胞株において、ならびに前立腺癌異種移植片において検出された（図９）。さらに、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質は、このタンパク質を内因的に発現する細胞の馴化培地において検出され、このことは、このタンパク質が分泌タンパク質であり、そして診断血清マーカーとして働き得ることを示す。実際に、高感度の捕捉ＥＬＩＳＡを使用して（図１０）、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質は、７／１０の結腸癌サンプル、および６／１０の膵臓癌サンプルにおいて検出されたが、正常な雄性サンプルにおいては１／６しか検出されなかった（表２）。これらの結果は、３６Ｐ６Ｄ５が、結腸癌および膵臓癌、ならびに前立腺癌および乳癌組織由来の癌を含む他の癌の診断標的、およびおそらく治療標的として働き得るという証拠を提供する。
（実施例８）
（可能性のあるシグナル伝達経路の同定）
３６Ｐ６Ｄ５が細胞中の公知のシグナル伝達経路を直接または間接的に活性化するかどうかを決定するために、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）に基づく転写レポーターアッセイを、３６Ｐ６Ｄ５を発現する細胞中で行う。これらの転写レポーターは、十分に特徴付けられたシグナル伝達経路の下流に存在する公知の転写因子についてのコンセンサスな結合部位を含む。レポーターおよびそれらの会合する転写因子の例、シグナル伝達経路、および活性化の刺激を以下に列挙する。
１．ＮＦｋＢ−ｌｕｃ、ＮＦｋＢ／Ｒｅｌ；Ｉｋ−キナーゼ／ＳＡＰＫ；増殖／アポトーシス／ストレス
２．ＳＲＥ−ｌｕｃ、ＳＲＦ／ＴＣＦ／ＥＬＫ１；ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ；増殖／分化
３．ＡＰ−１−ｌｕｃ、ＦＯＳ／ＪＵＮ；ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ／ＰＫＣ；増殖／アポトーシス／ストレス
４．ＡＲＥ−ｌｕｃ、アンドロゲンレセプター；ステロイド／ＭＡＰＫ；増殖／分化／アポトーシス
５．ｐ５３−ｌｕｃ、ｐ５３；ＳＡＰＫ；増殖／分化／アポトーシス
６．ＣＲＥ−ｌｕｃ、ＣＲＥＢ／ＡＴＦ２；ＰＫＡ／ｐ３８；増殖／アポトーシス／ストレス
３６Ｐ６Ｄ５によって媒介される効果を、ｍＲＮＡの発現を示す細胞（例えば、図４に示される３６Ｐ６５Ｄ発現細胞）中でアッセイし得る。ルシフェラーゼレポータープラスミドを、脂質によって媒介されるトランスフェクション（ＴＦＸ−５０、Ｐｒｏｍｅｇａ）によって導入し得る。ルシフェラーゼ活性（相対的な転写活性の指標）を、ルシフェリン基質との細胞の抽出物のインキュベーションによって測定し、そして反応物の発光を、ルミノメーターでモニターする。
（実施例９）
（３６Ｐ６５Ｄ機能のインビトロアッセイ）
癌における３６Ｐ６５Ｄの発現プロフィールは、この遺伝子が腫瘍開始、進行および／または維持における機能的役割を示唆する。３６Ｐ６５Ｄは、骨における前立腺癌細胞の増殖を刺激する分泌因子として機能し得る。増殖シグナルを活性化することに関与するレセプターとして機能する可能性がある。３６Ｐ６５Ｄ機能を、インビトロアプローチを用いて哺乳動物細胞中で評価し得る。哺乳動物発現について、３６Ｐ６５Ｄを、ｐｃＤＮＡ ３．１ ｍｙｃ−Ｈｉｓ−タグおよびレトロウイルスベクターｐＳＲαｔｋｎｅｏ（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９１、ＭＣＢ １１：１７８５）を含む多くの適切なベクター中にクローン化し得る。このような発現ベクターを用い、例えば、３６Ｐ６５Ｄを、ＰＣ−３、ＮＩＨ３Ｔ３、ＬＮＣａＰおよび２９３Ｔを含むいくつかの癌細胞株で発現し得る。３６Ｐ６５Ｄの発現を、抗−３６Ｐ６５Ｄ抗体を用いてモニターし得る。
３６Ｐ６５Ｄを発現する哺乳動物細胞株を、いくつかのインビトロアッセイおよびインビボアッセイで試験し得、このアッセイには、組織培養中の細胞増殖、アポトーシスシグナルの活性化、ＳＣＩＤマウスにおける一次および転移性の腫瘍形成、および膜侵襲培養系（ＭＩＣＳ）を用いるインビトロ侵襲（Ｗｅｌｃｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４３：４４９−４５７）が含まれる。３６Ｐ６５Ｄ細胞表現型を、３６Ｐ６５Ｄの発現を欠く細胞の表現型と比較する。
３６Ｐ６５Ｄを発現する細胞株はまた、マトリゲルでコートされた多孔性膜チャンバ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を通る細胞の通過を測定することにより、侵襲特性および遊走特性の変化についてアッセイされ得る。向かい合う側への膜を通る細胞の通過を、カルセイン−Ａｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を負荷したインジケーター（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）細胞を用いる蛍光アッセイ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃４２８）を用いてモニターする。分析される細胞株は、親および３６Ｐ６５Ｄを過剰発現する、ＰＣ３細胞、３Ｔ３細胞ならびにＬＮＣａＰ細胞を含む。３６Ｐ６５Ｄが化学誘引物質の性質を有するか否かをアッセイするために、親のインジケーター細胞を、コントロール培地と比較して３６Ｐ６５Ｄ馴化培地の勾配に向かっての多孔性膜を通る通過についてモニターする。このアッセイはまた、候補の癌治療組成物による３６Ｐ６５Ｄで誘導される効果の特異的中和を定性および定量するために用い得る。細胞をまた、外的に添加した精製３６Ｐ６５Ｄタンパク質の存在下および非存在下において、増殖の変化、接着性の変化、および侵襲性の変化についてモニタリングし得る。
別の機能的アッセイにおいて、３６Ｐ６５Ｄを安定に発現する細胞は、軟寒天においてコロニーを形成するそれらの能力について分析され得る。これらの実験において、３６Ｐ６５Ｄの形質転換能力を評価するために、このような手順に使用される細胞（例えば、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞）をトランスフェクトして、３６Ｐ６５Ｄまたはｎｅｏまたは活性化Ｒａｓ（それぞれ、試験遺伝子、陰性コントロールおよび陽性コントロールとして）を安定に発現させ得る。典型的に、実験は二連で行い、そしてアッセイは、細胞プレーティングの約４週間後に評価する。実験的な観察が、３６Ｐ６５Ｄは陰性コントロール（例えば、ｎｅｏ）と比較してコロニー形成の増加を誘導することを示す場合、このような結果は、３６Ｐ６５Ｄが有意な形質転換能力を有することを示す。
別の機能アッセイにおいて、親細胞および３６Ｐ６５Ｄを発現する細胞を、ｃＡＭＰの細胞質蓄積を誘導するそれらの能力について比較し得る。代表的な実施形態において、ＬＡＰＣ異種移植片（または、２９３Ｔ細胞のような任意の種々の細胞）のような細胞を、３６Ｐ５Ｄ５に曝露させ得、そして／または空のｐｃＤＮＡ４ ＨＩＳ ＭＡＸベクターまたはｐｃＤＮＡ４ ＨＩＳ ＭＡＸ ３６Ｐ５Ｄ５でトランスフェクトし得る。代表的には、細胞を、１％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中で一晩飢餓させ、そして培地のみ、あるいは分泌分子または１０％ＦＢＳの存在下でインキュベートする。次いで、細胞を溶解し、そして製造業者の推奨（Ｌｉｎｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ Ｃｈａｒｌｅｓ，ＭＩ）に従う、酵素連結イムノアッセイ（ＥＩＡ）によってｃＡＭＰ含量について分析する。
多くの遺伝子は、ｃＡＭＰシグナル伝達経路を活性化することによって腫瘍形成機能において役割を果たすものとして同定された。代表的に、リガンドの非存在下では、シグナル伝達分子は、通常、不活性状態にある。リガンドの結合または過剰発現に際して、このような分子は、活性形態を獲得し、そしてＧタンパク質と複合体化する。この相互作用は、Ｇタンパク質サブユニットの解離およびアデニル酸シクラーゼの活性化を生じ、これが、ｃＡＭＰ蓄積を生じる（Ｂｉｒｎｂａｕｍｅｒ Ｌ，Ｃｅｌｌ １９９２、７１：１０６９）。ｃＡＭＰの増強された産生は、いくつかの下流のシグナル伝達経路の活性化を生じ、これらの経路は、このような分子の効果を調節する。３６Ｐ６Ｄ５によって接触されたかまたは３６Ｐ６Ｄ５でトランスフェクトされた細胞が、ＦＢＳに応答してｃＡＭＰの蓄積を導くことの実証は、３６Ｐ６５Ｄが、これらの条件下でシグナル伝達分子として機能することを示す。
（実施例１０）
（３６Ｐ６Ｄ５腫瘍増殖促進についてのインビボアッセイ）
腫瘍細胞増殖に対する３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の効果を、腫瘍保有マウスにおける遺伝子過剰発現によって、インビボで評価し得る。例えば、ＳＣＩＤマウスに、ｔｋＮｅｏ空ベクターまたは３６Ｐ６５Ｄを含む１×１０6の多くの前立腺癌細胞株、乳癌細胞株、結腸細胞株、膵臓細胞株および卵巣細胞株を、各側腹部にＳＱ注射し得る。以下の少なくとも２つのストラテジーが使用され得る：（１）ＬＴＲプロモーターの調節下での構成的３６Ｐ６５Ｄ発現、および（２）誘導性ベクター系（例えば、エクジソン、ｔｅｔなど）の制御下での調節された発現。次いで、腫瘍容積を、触知可能な腫瘍の出現時に、そしてその後、経時的にモニターして、３６Ｐ６Ｄ５発現細胞が、より速い速度で増殖するか否かを決定する。さらに、マウスに、１×１０5の同じ細胞を同所移植し得、３６Ｐ６Ｄ５が、標的組織（例えば、前立腺）における局所増殖に対する効果、または特に肺、リンパ節、肝臓、骨髄などに転移するそれらの細胞の能力に対する効果を、有するか否かを決定する。前立腺癌と比べて、骨髄腫瘍の形成および増殖に対する３６Ｐ６Ｄ５の効果は、実施例１に記載のように、前立腺腫瘍細胞を脛骨内に注射することによって評価され得る。
このアッセイはまた、例えば、３６Ｐ６Ｄ５抗体、３６Ｐ６Ｄ５アンチセンス分子およびリボザイムのような候補治療組成物の、３６Ｐ６Ｄ５阻害効果を決定するために有用である。
（実施例１１）
（３６Ｐ６Ｄ５タンパク質相互作用のインビトロアッセイ）
３６Ｐ６Ｄ５を発現する細胞株をまた使用して、３６Ｐ６Ｄ５によって媒介されるタンパク質−タンパク質相互作用を同定し得る。３６Ｐ６Ｄ５が、細胞に結合する分泌分子であるという観察（図８を参照のこと）は、この分子が、細胞表面上で他のタンパク質と相互作用するという証拠を提供する。この相互作用は、他者によって示されるような免疫沈降技術（Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＢＪら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９９，２６１：６４６−５１）を使用して試験され得る。３６Ｐ６Ｄ５タンパク質は、３６Ｐ６Ｄ５発現前立腺癌細胞株から免疫沈降され得、そしてウエスタンブロッティングによってタンパク質会合について試験され得る。タンパク質相互作用はまた、Ｓｈｎｙｒｅｖａら（Ｓｈｎｙｒｅｖａ Ｍら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０００．１９；２７５；１５４９８−５０３）に記載されるような、酵母ツーハイブリッド系によって研究され得る。これらのアッセイはまた、３６Ｐ６Ｄ５機能に対する、潜在的な癌治療剤の効果を分析するために使用され得る。
３６Ｐ６Ｄ５機能に対する３６Ｐ６Ｄ５ ＯＲＦ内に含まれる種々のドメインの寄与を決定するために、３６Ｐ６Ｄ５変異体を、１以上のドメインを欠失することにより生成し得る。変異体３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を発現する細胞株を、増殖、浸潤、移動、転写活性化およびタンパク質−タンパク質相互作用における変化について評価し得る。
（実施例１２）
（３６Ｐ６Ｄ５の染色体局在）
３６Ｐ６Ｄ５の染色体局在を、ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ４放射線照射ハイブリッドパネル（Ｗａｌｔｅｒら、１９９４、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：２２）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ Ａ１）を使用して決定した。以下のＰＣＲプライマーを、３６Ｐ６Ｄ５を局在化するために使用した：
Figure 0004833252
 この９３個の放射線照射ハイブリッドパネルＤＮＡについての得られたマッピングベクターは以下であった：
Figure 0004833252
 インターネットアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃｏｎｔｉｇ／ｒｈｍａｐｐｅｒ．ｐｌに見い出され得るこのマッピングプログラムは、３６Ｐ６Ｄ５を、染色体２１ｐ２２．２〜２２．３にマッピングする。
（実施例１３）
（ヒト癌における３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の発現の検出）
図９に示されるように、癌細胞のサブセットは、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を発現しそして分泌する。以下由来の癌を提示する種々の癌細胞株（前立腺組織（ＬＡＰＣ４異種移植片）、結腸組織（Ｃｏｌｏ ２０５、ＣａＣｏ−１）、乳房組織（Ｄｕ４４７５）および膵臓組織（Ｃａｐａｎ−１））、ならびに３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を過剰発現するよう操作されたＰＣ３前立腺癌細胞からの、馴化培地および／または細胞溶解物を、抗３６Ｐ６Ｄ５マウスｐＡｂを使用するウエスタンブロット分析に供した。手短に言うと、細胞（約２５μｇの総タンパク質）および馴化培地（２５μｌのきれいな（ｎｅａｔ）、０．２２μＭ 濾過培地）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中に可溶化し、そして１０〜２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ニトロセルロースに転写した。ブロットを、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）＋３％ 脱脂乳中でブロックし、次いで、精製３６Ｐ６Ｄ５タンパク質で免疫した、１：１，０００希釈（ＴＢＳ＋０．１５％
Ｔｗｅｅｎ−２０＋１％ ミルク中）のマウス由来の血清でプローブした。次いで、ブロットを洗浄し、１：４，０００希釈の抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合体化二次抗体と共にインキュベートした。洗浄後、抗３６Ｐ６Ｄ５免疫反応性のバンドを発色させ、そして増強化学ルミネセンスによって可視化し、そしてオートラジオグラフィーフィルムに露光した。内因性３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を表す、特異的抗３６Ｐ６Ｄ５免疫反応性のバンドを、矢印で示し、これは、約３５ｋＤと４０ｋＤとの間に泳動される。アミノ酸配列から計算した３６Ｐ６Ｄ５の分子量は、２６ｋＤであり、これは、内因性３６Ｐ６Ｄ５タンパク質が、翻訳後修飾される（おそらく、グリコシル化によって）ことを示唆する。これらの結果は、３６Ｐ６Ｄ５が、前立腺、結腸、乳房、膵臓および潜在的に他のヒト癌についての、診断的および治療的標的として有用であり得ることを実証する。
図１０に示されるように、高感度かつ特異的な捕捉ＥＬＩＳＡは、ヒト癌細胞株の上清において３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を検出する。捕捉ＥＬＩＳＡを、捕捉Ａｂとして、プロテインＧで精製したマウス抗３６Ｐ６Ｄ５ ｐＡｂ、および検出Ａｂとして、同じｐＡｂのビオチン化形態を使用して発色させた。手短には、１μｇの精製マウス抗３６Ｐ６Ｄ５ ｐＡｂを使用して、ＥＬＩＳＡプレートのウェルをコートした。３％ ミルクを含有するＰＢＳでのブロッキング後、ＰＣ３−ｎｅｏ、ＰＣ３−３６Ｐ６Ｄ５またはＤＵ４４７５細胞のいずれかからの５０μｌの馴化培地、または組織培養培地中に添加した種々の量の精製Ｔａｇ５−３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を、ウェルに添加し、そして室温で２時間インキュベートした。ウェルを、ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）で４回洗浄し、そしてＰＢＳで１回洗浄した。次いで、ウェルを、ＰＢＳ−Ｔ＋１％
ミルク（ＴＢＳ−ＴＭ、５０μｌ／ウェル）中の３μｇ／ｍｌのビオチン化抗３６Ｐ６Ｄ５ ｐＡｂと共に１時間インキュベートし、そして上記のように洗浄した。次いで、ウェルを、ＴＢＳ−ＴＭ中の５０μｌの１：８，０００希釈のアビジン−ＨＲＰ複合体（ＮｅｕｔｒａｌｉｔｅTM、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）と共に、１時間インキュベートした。洗浄後、次いで、ウェルを、２００μｌのＴＭＢ基質の添加によって発色させた。この反応を、５０μｌの１Ｍ Ｈ2ＳＯ4の添加によって停止し、そしてウェルの吸光度を、４５０ｎＭで読み取った。Ｔａｇ５−３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を使用して作成した標準曲線、ならびに３６Ｐ６Ｄ５を過剰発現するＰＣ−３細胞由来の上清中に存在する３６Ｐ６Ｄ５およびＤｕ４４７５乳癌細胞によって分泌される内因性３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の特異的検出および定量を示す。
図１１はまた、ヒト癌における３６Ｐ６Ｄ５発現を示す。図１１（ヒト癌における３６Ｐ６Ｄ５の発現を検出するための代表的方法）に示されるように、結腸、乳房および腎臓の癌組織由来の細胞溶解物（Ｃａ）、ならびにそれらの正常な対応する隣接組織（Ｎ）を、抗３６Ｐ６Ｄ５マウスモノクローナル抗体を使用するウェスタン分析に供した。手短に言うと、細胞（約２５μｇの総タンパク質）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中に可溶化し、そして１０〜２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ニトロセルロースに転写した。ブロットを、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）＋３％ 脱脂乳中でブロックし、次いで、２μｇ／ｍｌ（ＴＢＳ＋０．１５％ Ｔｗｅｅｎ−２０＋１％ ミルク中）の、精製抗３６Ｐ６Ｄ５抗体でプローブした。次いで、ブロットを洗浄し、１：４，０００希釈の抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合体化二次抗体と共にインキュベートした。洗浄後、抗３６Ｐ６Ｄ５免疫反応性のバンドを発色させ、そして増強化学ルミネセンスによって可視化し、そしてオートラジオグラフィーフィルムに露光した。特異的な抗３６Ｐ６Ｄ５免疫反応性のバンドは、モノマー形態の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質（これは、約３５ｋＤと４０ｋＤとの間に泳動される）およびマルチマー形態の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質（これは、約９０ｋＤと１２０ｋＤとの間に泳動される）を表す。これらの結果は、３６Ｐ６Ｄ５が、結腸、乳房、腎臓および潜在的に他のヒト癌についての、診断的および治療的標的として有用であり得ることを実証する。
本出願を通じて、種々の刊行物が括弧内に参照されている。これらの刊行物の開示は、それらの全体が本明細書に参考として援用されている。
本発明は、本明細書に開示される実施形態により範囲を限定されるべきではない。これらの実施形態は、本発明の個々の局面の単なる例示として意図され、そして機能的に等価であるすべてのものが、本発明の範囲内にある。本明細書に記載のモデルおよび方法に加えて、本発明のモデルおよび方法に対する種々の改変が、上記の記述および教示から当業者に明らかとなり、そして本発明の範囲内にあることが同様に意図される。このような改変またはその他の実施の形態は、本発明の真の範囲および趣旨から逸脱することなく実施され得る。
（表）
（表１：ヒトＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ２への３６Ｐ６Ｄ５タンパク質由来のペプチドの予測される結合）
Figure 0004833252
 （表２：３６Ｐ６Ｄ５は癌患者由来の血清サンプルにおいて検出される）
Figure 0004833252
 膵臓癌患者および正常男性ドナー由来の臨床血清サンプルを、図１０に記載されるように、捕捉ＥＬＩＳＡを使用して３６Ｐ６Ｄ５タンパク質についてスクリーニングした。ＰＣ−３−３６Ｐ６Ｄ５およびＤｕ４４７５細胞、ならびにＰＣ−３−ｎｅｏ由来の上清は、それぞれ、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質検出についての、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして機能した。ＮＤ；非検出または検出感度未満。３６Ｐ６Ｄ５タンパク質は、１０人中７人の結腸癌患者および１０人中６人の膵臓癌患者（そのうちの１人は、比較的高いレベル（２９．７０ｎｇ／ｍｌ）を有した）において検出されたが、正常男性ドナーでは、６人中１人しか検出されなかった。
図１Ａ〜１Ｂは、３６Ｐ６Ｄ５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）および推定されるアミノ酸配列（配列番号２）である。開始メチオニンおよびコンセンサスＫｏｚａｋ配列が太字で示され、そして推定Ｎ末端シグナル配列に下線が引かれている。 図１Ａ〜１Ｂは、３６Ｐ６Ｄ５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）および推定されるアミノ酸配列（配列番号２）である。開始メチオニンおよびコンセンサスＫｏｚａｋ配列が太字で示され、そして推定Ｎ末端シグナル配列に下線が引かれている。 図２Ａ〜２Ｂは、２〜１９のタンパク質前駆体（２Ａ）（配列番号１５）およびＧＳ３７８６タンパク質（骨芽細胞タンパク質）（２Ｂ）（配列番号１６）を有する３６Ｐ６Ｄ５ ＯＲＦのアミノ酸整列である。配列％同一性が図に示される。 図３は、種々の正常な組織におけるヒト３６Ｐ６Ｄ５発現のノーザンブロット分析を示し、これは、膵臓における優位な発現および前立腺および小腸における低い程度の発現を示す。 図４Ａ〜４Ｂは、前立腺癌移植片および種々の他のヒト癌細胞系列のパネルにおけるヒト３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。 図５Ａ〜５Ｂは、トランスフェクトされた２６３Ｔ移細胞のからの３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の分泌および抗３６Ｐ６Ｄ５ポリクローナル抗体出の検出を示す。２３９Ｔ細胞は、一過的に、ｐＣＤＮＡ ３．１ ＭＹＣ／ＨＩＳ ３６Ｐ６Ｄ５、ｐＴａｇ５ ３６Ｐ６Ｄ５のいずれかで、一過的にトランスフェクトされ、ここで、３６Ｐ６Ｄ５の天然のシグナル配列が、免疫グロブリンシグナル配列またはｐＡＰＴａｇ５ ３６Ｐ６Ｄ５（これは、３６Ｐ６Ｄ５よおびアルカリホスファターゼからなる融合タンパク質をコードする）（また、Ｉｇシグナル配列を含む）で置換される。馴化培地または全細胞溶解物が、ウサギ抗Ｈｉｓ ｐＡｂ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，１：２，５００の希釈、左側のパネル）またはアフィニティ精製されたウサギ抗３６Ｐ６Ｄ５ ｐＡｂ（１ｕｇ／ｍｌ、右側のパネル）を用いるウエスタンブロッティングに供した。抗Ｈｉｓおよび抗３６Ｐ６Ｄ５ ｐＡｂの活性バンドが、抗ウサギＨＲＰ結合体化二次抗体を含むブロットのインキュベーション、続く増強された化学発光検出によって可視化された。 図６は、癌患者の腫瘍における３６Ｐ６Ｄ５の発現を示す。膀胱癌、腎臓癌、結腸癌、および肺癌の患者の腫瘍における３６Ｐ６Ｄ５ ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。 図７は、膀胱癌およびそれらの一致する正常な組織における３６Ｐ６Ｄ５発現を、ノーザンブロット分析によって試験したことを示す。この図について、１０μｇの総ＲＮＡを各サンプルに充填した。３６Ｐ６Ｄ５発現の過剰発現を、試験した４つ癌（レーン３、５、７および８）のうちの３つで検出した。正常な個体から単離された膀胱組織において、発現は見られなかった（レーン１）。 図８は、ＬＡＰＣ９ ＡＤへの３６Ｐ６Ｄ５の結合を示す。ＬＡＰＣ９ ＡＤの異種移植片細胞の単一細胞懸濁液を、６ウェルプレートに一晩接着させた。この細胞を、コントロールまたは３６Ｐ６Ｄ５−ＡＰの存在下でインキュベートした。アルカリホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）基質であるＢＭ ｐｕｒｐｌｅを検出のために使用した。 図９Ａ〜９Ｂは、ヒト癌細胞が、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を発現し、そして分泌することを示す。前立腺組織（ＬＡＰＣ４ 異種移植片）、結腸組織（Ｃｏｌｏ ２０５、ＣａＣｏ−１）、乳房組織（Ｄｕ４４７５）、および膵臓組織（Ｃａｐａｎ−１）由来の癌、ならびに３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を過剰発現するように操作されたＰＣ３前立腺癌細胞を代表する種々の癌細胞系列からの馴化培地および／細胞溶解物を、抗３６Ｐ６Ｄ５マウスｐＡｂを使用するウエスタン分析に供した。内因性３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を表す特異的抗３６Ｐ６Ｄ５免疫反応性バンドが、矢印で示され、そしてほぼ３５ｋＤと４０ｋＤの間に移動する。アミノ酸配列から計算された３６Ｐ６Ｄ５の分子量は、２６ｋＤであり、これは、内因性３６Ｐ６Ｄ５タンパク質が、おそらくグリコシル化によって翻訳後に改変されたことを示唆する。 図１０は、敏感で特異的な捕獲ＥＬＩＳＡが、ヒト癌細胞系列の上清において３６Ｐ６Ｄ５を検出することを示す。捕獲ＥＬＩＳＡは、プロテインＧ精製マウス抗３６Ｐ６Ｄ５ ｐＡｂを捕獲Ａｂとして、そしてビオチン化形態の同じｐＡｂを検出Ａｂとして使用して開発された。Ｔａｇ５−３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を使用して作製された標準曲線が示され、そしてＰＣ−３−Ｎｅｏトランスフェクトされた細胞（Ｏ．Ｄ．＝０．０２３、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質濃度（ｎｇ／ｍｌ）＝Ｎ．Ｄ．）、３６Ｐ６Ｄ５を過剰発現するＰＣ−３細胞（Ｏ．Ｄ．＝０．１８６、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質濃度（ｎｇ／ｍｌ）＝１．４８）、Ｄｕ４４７５乳癌細胞によって分泌された内因性３６Ｐ６Ｄ５タンパク質（Ｏ．Ｄ．＝０．０８５、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質濃度（ｎｇ／ｍｌ）＝０．５０）由来の上清荷存在する３６Ｐ６Ｄ５の特異的検出および定量が示される。 図１１Ａ〜１１Ｂは、ヒト癌における３６Ｐ６Ｄ５の検出を示す。結腸癌組織、乳癌組織および腎臓癌組織からの細胞溶解物（Ｃａ）、ならびにそれらの隣接する正常な組織からの細胞溶解物（Ｎ）を、抗３６Ｐ６Ｄ抗体を使用するウエスタンブロットに供した。特異的抗３６Ｐ６Ｄ５免疫反応性バンドは、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のモノマー形態（これは、ほぼ３５ｋＤと４０ｋＤとの間に移動する）、およびこのタンパク質のマルチマー形態を（これは、ほぼ９０ｋＤと１２０ｋＤとの間に移動する）を表す。

Claims (19)

  1. 配列番号２の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を発現する膵臓癌の存在を検出するための方法であって、
    個体由来の血清又は血液である試験生物サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のタンパク質発現レベルを、該試験生物サンプルまたはその一部を該タンパク質に特異的に結合する抗体と接触させることによって決定する工程、および
    このように決定されたタンパク質発現レベルを、対応する正常サンプル中の該タンパク質のタンパク質発現レベルと比較する工程
    を包含し、
    前記対応する正常サンプルに対して増加した前記試験生物サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の存在が、前記個体における膵臓癌の存在を示す、方法。
  2. 個体における膵臓癌の存在を検出するためのキットであって、
    前記個体由来の試験生物サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の発現レベルを決定するための手段を備え、該試験生物サンプルは、血清又は血液であり、
    前記３６Ｐ６Ｄ５タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、及び
    前記試験生物サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の発現レベルが、対応する正常サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の発現レベルと比較される、キット。
  3. ３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の発現レベルを決定するための前記手段は、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質に特異的に結合する抗体を含む、請求項２に記載のキット。
  4. 前記抗体は、ポリクローナル抗体を含む、請求項３に記載のキット。
  5. 前記抗体は、モノクローナル抗体を含む、請求項３に記載のキット。
  6. 個体における膵臓癌の存在を診断するためのキットであって、
    前記個体から得られた試験生物サンプル中で発現された３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の発現レベルを決定するための手段を備え、該試験生物サンプルは、血清又は血液であり、
    前記３６Ｐ６Ｄ５タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、
    及び
    前記試験生物サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の発現レベルが、対応する正常サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の発現レベルと比較される、キット。
  7. 前記試験生物サンプル中で発現された３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の発現レベルを決定するための前記手段は、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質に特異的に結合する抗体を含む、請求項６に記載のキット。
  8. 前記抗体は、ポリクローナル抗体を含む、請求項７に記載のキット。
  9. 前記抗体は、モノクローナル抗体を含む、請求項７に記載のキット。
  10. 配列番号２の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質を発現する膵臓癌の存在を検出するための方法であって、
    個体由来の試験血清サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質のタンパク質発現レベルを、該血清サンプルまたはその一部を該タンパク質に特異的に結合する抗体と接触させることによって決定する工程、および
    このように決定されたタンパク質発現レベルを、対応する正常血清サンプル中にて発現される３６Ｐ６Ｄ５のタンパク質発現レベルと比較する工程
    を包含し、
    前記対応する正常血清サンプルに対して増加した前記試験血清サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の存在が、前記個体における膵臓癌の存在を示す、方法。
  11. 個体における膵臓癌の存在を検出するためのキットであって、
    前記個体由来の試験血清サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の発現レベルを決定するための手段を備え、
    前記３６Ｐ６Ｄ５タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、及び
    該試験血清サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の発現レベルが、対応する正常血清サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の発現レベルと比較される、キット。
  12. ３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の発現レベルを決定するための前記手段は、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質に特異的に結合する抗体を含む、請求項１１に記載のキット。
  13. 前記抗体は、ポリクローナル抗体を含む、請求項１２に記載のキット。
  14. 前記抗体は、モノクローナル抗体を含む、請求項１２に記載のキット。
  15. 個体における膵臓の腫瘍形成に関連する細胞成長の調節不全をモニタリングするためのキットであって、
    前記個体由来の試験血清サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の発現レベルを決定するための手段を備え、
    前記３６Ｐ６Ｄ５タンパク質は、配列番号１に示される核酸配列によってコードされ、及び
    前記試験血清サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の発現レベルが、対応する正常血清サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の発現レベルと比較される、キット。
  16. 個体における膵臓癌の存在を診断するためのキットであって、
    前記個体から得られた試験血清サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の発現レベルを決定するための手段を備え、
    前記３６Ｐ６Ｄ５タンパク質は、配列番号２において示されるアミノ酸配列を含み、及び
    前記試験血清サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の発現レベルが、対応する正常血清サンプル中の３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の発現レベルと比較される、キット。
  17. 前記試験血清サンプル中で発現された３６Ｐ６Ｄ５タンパク質の発現レベルを決定するための前記手段は、３６Ｐ６Ｄ５タンパク質に特異的に結合する抗体を含む、請求項１６に記載のキット。
  18. 前記抗体は、ポリクローナル抗体を含む、請求項１７に記載のキット。
  19. 前記抗体は、モノクローナル抗体を含む、請求項１７に記載のキット。
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