ES2601460T3

ES2601460T3 - Materiales y métodos para el diagnóstico del cáncer de vejiga y el control de la recurrencia del mismo

Info

Publication number: ES2601460T3
Application number: ES12806869.9T
Authority: ES
Inventors: Nick GIAFIS; Irina Sokolova; Minghao SONG; Frank POLICHT; Svetlana SITAILO
Original assignee: Abbott Molecular Inc
Current assignee: Abbott Molecular Inc
Priority date: 2011-12-30
Filing date: 2012-12-20
Publication date: 2017-02-15
Anticipated expiration: 2032-12-20
Also published as: US20130171637A1; EP2798079B1; WO2013101611A1; JP2015503347A; EP2798079A1; JP6284487B2; US9290814B2

Abstract

Un método de diagnóstico del cáncer de vejiga en un paciente, cuyo método comprende poner en contacto una muestra de células uroteliales obtenida del paciente con un conjunto de sondas marcadas de forma detectable que consiste en una sonda específica del locus de c-myc, que hibrida con Q24 en el cromosoma humano 8, una sonda específica del locus de AURKA, que hibrida con q 13 en el cromosoma humano 20, una sonda centromérica para el cromosoma humano 7, y una sonda centromérica para el cromosoma humano 17 en condiciones de hibridación, y determinar la presencia de anomalías cromosómicas, en donde la presencia de anomalías cromosómicas de c-myc, AURKA, el cromosoma 7, y el cromosoma 17 indica que el paciente tiene cáncer de vejiga, después de lo cual se diagnostica cáncer de vejiga en el paciente.

Description

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DESCRIPCION

Materiales y metodos para el diagnostico del cancer de vejiga y el control de la recurrencia del mismo

La presente descripcion se refiere al diagnostico del cancer de vejiga y al control de la recurrencia del mismo, a la determinacion de anomalfas cromosomicas, y a la hibridacion in situ, asf como a un conjunto de sondas y a un kit util para el diagnostico del cancer de vejiga.

Antecedentes

El cancer de vejiga a menudo se desarrolla en personas de cincuenta anos o mas. Los hombres desarrollan cancer de vejiga a una tasa de 2 a 3 veces mayor que las mujeres. Asimismo, los fumadores tienen aproximadamente cuatro veces mas probabilidades de desarrollar cancer de vejiga que los no fumadores.

El cancer de vejiga se clasifica groseramente en dos tipos, es decir, el cancer superficial de vejiga y el cancer de vejiga infiltrante. El cancer de vejiga superficial se caracteriza por tumores papilares superficiales que sobresalen hacia fuera de la superficie interna de la vejiga y por una malignidad relativamente baja. El cancer de vejiga superficial se puede tratar por via endoscopica, aunque es recurrente en las vejigas de la mitad de los pacientes o mas. Por el contrario, el cancer de vejiga infiltrante se caracteriza por una infiltracion profunda, tal como la pared de la vejiga, y la metastasis a otras partes del organismo. El cancer de vejiga infiltrante puede ser tratado por medio de extirpacion de la vejiga, quimioterapia y radioterapia.

El signo mas comun de cancer de vejiga es la hematuria indolora; sin embargo, los smtomas pueden ser similares a los de la cistitis, por ejemplo, aumento de la frecuencia urinaria, dolor durante la miccion, o sensacion de vaciado incompleto de la vejiga. El diagnostico de cancer de vejiga se lleva a cabo por analisis de orina (diagnostico citologico), imagenes de rayos x, o endoscopia.

Debido a la falta de marcadores tumorales espedficos y altamente sensibles para el diagnostico precoz, tal como el analisis de orina o de sangre, el cancer de vejiga se detecta a menudo despues de que el cancer haya progresado. En consecuencia, se desea una aplicacion practica de un metodo de deteccion simple con el uso de marcadores tumorales espedficos y altamente sensibles para el cancer urotelial, y particularmente para el cancer de vejiga.

Se ha propuesto una variedad de marcadores y metodos para el diagnostico del cancer de vejiga. Los ejemplos incluyen la deteccion de cambios en los niveles de expresion de genes, tales como nucleofosmina/B23 (Publicacion de Patente JP (kokai) Num. 2004-337120 (A)), HURP (Publicacion de Patente JP (kokai) Num. 2004-248508 (A)), Y CYP4B1 o CYP4B2 (Publicacion de Patente Jp (kokai) Num. 2002-238599 (A)), la deteccion de cambios en el nivel de una protema dada en la orina (Publicaciones de Patente JP (kokai) Num. 2004-61288 (A) y H7-309895 (1995)(A)), y la deteccion de cambios en el nivel de Fas soluble en sangre u orina (Publicacion de Patente JP (kokai) Num. 2000-131321 (A); y Patente de los Estados Unidos Num. 7.759.077). Mas recientemente, se ha propuesto la deteccion de un aumento en el nivel de protema CXCL1 (vease la Patente de los Estados Unidos Num. 7.910.316), la deteccion de un aumento en el nivel de protema 184P1E2 (veanse las Patentes de los Estados Unidos Num. 7.879.570 y 7.135.549), la deteccion de la presencia de antfgeno carcinoembrionario (CEA; vease la Patente de los Estados Unidos Num. 7.862.997), la deteccion de un aumento en el nivel de protema 58P1D12 (vease la Patente de los Estados Unidos Num. 7.842.458), la deteccion de la presencia de survivina (veanse las Patentes de los Estados Unidos Num. 7.794.926 y 7.776.518), la deteccion de un aumento en el nivel de 213P1F11 (vease la Patente de los Estados Unidos Num. 7.563.444), el analisis de la actividad de a-metilacil-CoA racemasa (veanse las Patentes de los Estados Unidos Num. 7.374.902 y 7.374.897), la deteccion de un aumento en el nivel de 36P6D5 (vease la Patente de los Estados Unidos Num. 7.223.542), la ausencia de metiltioadenosina fosforilasa (MTAP; vease la Patente de los Estados Unidos Num. 7.192.711), la deteccion de un aumento en el nivel de SIX1 (Patente de los Estados Unidos Num. 7.153.700), la deteccion de un aumento en el nivel de la nucleofosmina/B23 (vease la Patente de los Estados Unidos Num. 7.011.950), la deteccion de aumentos en los niveles de sindecan-1 e inhibidor del activador del factor de crecimiento de hepatocitos de tipo 2 (vease la Patente de los Estados Unidos Num. 6.998.232), la deteccion de un aumento de antfgeno de celulas madre de la prostata (vease la Patente de los Estados Unidos Num. 6.960.443), la deteccion de la presencia de BLCA-6 (vease la Patente de los Estados Unidos Num. 6.951.926), la deteccion de la presencia de auto-anticuerpos anti-Csk (vease la Patente de los Estados Unidos Num. 6.759.204), la deteccion de un cambio en el numero de cromosomas 1, 7, 8, 9, 10, 11, Y y/o X (vease la Patente de los Estados Unidos Num. 6.573.042), la deteccion del nivel de neurotrofina-3, factor de crecimiento nervioso, factor neurotrofico derivado de la lmea de celulas de la glfa, y/o la triptasa en la orina (vease la Patente de los Estados Unidos Num. 6.008.003), y la deteccion y cuantificacion de la expresion de ANXA10, C14orf78, CTSE, CRH, IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1R14D, SLC1A6, TERT, ASAM y MCM10 (vease la publicacion de la solicitud de la Patente Europea. Num. EP 2138848). Se ha propuesto que la deteccion de celulas aneusomicas utilizando un conjunto de sondas compuesta por sondas centromericas de los cromosomas 3, 7 y 17 y la sonda espedfica del locus 9p21 es util para el seguimiento de la recurrencia y la necesidad de continuar el tratamiento (vease la Patente de los Estados Unidos Num. 7.232.655), Song et al., Cancer Genetics and Citogenetics, 198, vol.

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2, pags. 114-150, 2010, describen un metodo FISH utilizando sondas para CEP3, CEP7, CEP17 y 9p21 para el diagnostico del cancer de vejiga.

La presente descripcion tiene por objeto proporcionar un conjunto de marcadores, as^ como los metodos de utilizacion y un kit, para la deteccion de cancer de vejiga, en particular en pacientes que tienen smtomas de cancer de vejiga o que tienen cancer de vejiga recurrente, y el control de la recurrencia de cancer de vejiga. Este y otros objetos y ventajas, asf como caractensticas de la invencion, resultaran evidentes a partir de la descripcion detallada proporcionada en la presente memoria.

Compendio

Se proporciona un metodo de diagnostico del cancer de vejiga en un paciente. El metodo comprende poner en contacto una muestra de celulas uroteliales obtenidas del paciente con un conjunto de sondas marcadas de forma detectable en condiciones de hibridacion. El conjunto de sondas marcadas de forma detectable comprende una sonda espedfica del locus de c-myc, una sonda espedfica del locus de AURKA, una sonda centromerica para el cromosoma 7, y una sonda centromerica para el cromosoma 17. El metodo tambien comprende la determinacion de la presencia de anomalfas cromosomicas. La presencia de anomalfas cromosomicas que implican al menos dos de las sondas marcadas de forma detectable indica que el paciente tiene cancer de vejiga.

Tambien se proporciona un metodo para el control de la recurrencia del cancer de vejiga en un paciente. El metodo comprende poner en contacto una muestra de celulas uroteliales obtenidas del paciente con un conjunto de sondas marcadas de forma detectable en condiciones de hibridacion. El conjunto de sondas marcadas de forma detectable comprende una sonda espedfica del locus de c-myc, una sonda espedfica del locus de AURKA, una sonda centromerica para el cromosoma 7, y una sonda centromerica para el cromosoma 17. El metodo tambien comprende la determinacion de la presencia de anomalfas cromosomicas. La presencia de anomalfas cromosomicas que implican al menos dos de las sondas marcadas de forma detectable indica que el cancer de vejiga se ha repetido en el paciente.

Tambien se proporciona un conjunto de sondas. El conjunto de sondas comprende una sonda espedfica del locus de c-myc, una sonda espedfica del locus de AURKA, una sonda centromerica para el cromosoma 7, y una sonda centromerica para el cromosoma 17.

Tambien se proporciona un kit. El kit comprende un conjunto de sondas que permite el diagnostico del cancer de vejiga, o un control de la recurrencia del mismo, en un paciente y las instrucciones para el diagnostico del cancer de vejiga, o el control de la recurrencia del mismo, en un paciente. El conjunto de sondas comprende una sonda espedfica del locus de c-myc, una sonda espedfica del locus de AURKA, una sonda centromerica para el cromosoma 7, y una sonda centromerica para el cromosoma 17. Las instrucciones comprenden la determinacion en una muestra de celulas uroteliales obtenidas del paciente de la presencia de anomalfas cromosomicas. La presencia de anomalfas cromosomicas que implican al menos dos de las sondas indica que el paciente tiene cancer de vejiga.

Descripcion detallada

La presente descripcion proporciona un conjunto de marcadores, asf como los metodos para su utilizacion y un kit, para la deteccion del cancer de vejiga, en particular en pacientes que tienen smtomas de cancer de vejiga o que tienen cancer de vejiga recurrente, y para el control de la recurrencia del cancer de vejiga . El metodo permite la deteccion del cancer de vejiga en sus etapas mas tempranas.

Los siguientes terminos son relevantes para la presente descripcion:

"Aproximadamente" se refiere a una variacion de aproximadamente +/- 10% del valor declarado. Se debe entender que tal variacion se incluye siempre en cualquier valor dado proporcionado en la presente memoria, se haga referencia espedfica a la misma o no.

"Cancer de vejiga" es un cancer que se forma en los tejidos de la vejiga. Cancer de vejiga se utiliza en la presente memoria para incluir el carcinoma de celulas transicionales (TCC), que tambien se conoce como carcinoma de celulas uroteliales, carcinoma de celulas escamosas y adenocarcinoma.

"Biomarcador", tal como se define por los Institutos Nacionales de Salud, es "una caractenstica que se mide y se evalua objetivamente como un indicador de procesos normales biologicos, procesos patogenicos, o respuestas farmacologicas a una intervencion terapeutica".

"Sonda de enumeracion de cromosomas (CEP)" o "sonda centromerica" es cualquier sonda que permita enumerar el numero de cromosomas espedficos en una celula. Una sonda de enumeracion de cromosomas tfpicamente reconoce y se une a una region cerca de o en el centromero (en adelante, "peri-centromericas") de un cromosoma espedfico, tfpicamente una secuencia de ADN repetitiva (por ejemplo, ADN satelite alfa). Por lo general se considera que el centromero de un cromosoma representa ese cromosoma, ya que se requiere el centromero para la segregacion fiel durante la division celular. La delecion o amplificacion de una region cromosomica particular, puede diferenciarse de la perdida o ganancia de todo el cromosoma

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(aneusoirna), en la que normalmente se encuentra, mediante la comparacion del numero de senales que corresponde al locus concreto (numero de copias) con respecto al numero de senales correspondientes al centromere. Un metodo para realizar esta comparacion consiste en dividir el numero de senales que representan el lugar geometrico por el numero de senales que representan el centromere. Las razones de menos de uno indican la perdida relativa o la delecion del locus, y las razones mayores que uno indican una ganancia relativa o una amplificacion del locus. Del mismo modo, la comparacion se puede hacer entre dos loci diferentes en el mismo cromosoma, por ejemplo en dos brazos diferentes del cromosoma, para indicar las ganancias o perdidas desequilibradas dentro del cromosoma. En lugar de una sonda centromerica para un cromosoma, un experto en la tecnica reconocera que se puede utilizar alternativamente una sonda de brazo cromosomico para aproximarse a una perdida o ganancia cromosomica total. Sin embargo, tales sondas no son tan precisas al enumerar los cromosomas, ya que la perdida de las senales de estas sondas no siempre puede indicar una perdida de todo el cromosoma. Los ejemplos de las sondas de enumeracion de cromosomas incluyen sondas CEP® disponibles comercialmente de Abbott Molecular, Inc., Des Plaines, IL (anteriormente Vysis, Inc., Downers Grove, IL).

"Numero de copias" es una medida de ADN, ya sea de un solo locus, de uno o mas loci, o de un genoma completo. Un "numero de copias" de dos es "de tipo salvaje" en un ser humano (a causa de diploidia, a excepcion de los cromosomas sexuales). Un "numero de copias" distinto de dos en un ser humano (a excepcion de los cromosomas sexuales) se desvfa del tipo salvaje. Estas desviaciones incluyen amplificaciones, es decir, aumento en el numero de copias, y supresiones, es decir, disminucion en el numero de copias e incluso ausencia de numero de copias.

"Marcado", "marcado con un marcador detectable," y "marcado de manera detectable" se utilizan indistintamente en la presente memoria para indicar que una entidad (p. ej., una sonda) puede ser detectada. "Marca" y "marca detectable" significan un radical unido a una entidad para hacer que la entidad detectable, tal como un radical unido a una sonda para hacer detectable la sonda tras la union a una secuencia diana. El radical, en sf mismo, puede no ser detectable pero puede llegar a ser detectable tras la reaccion con otro radical. Se pretende que el uso del termino "marcado de manera detectable" abarque semejante marcaje. La marca detectable se puede seleccionar de tal manera que la marca genere una senal, que puede ser medida y cuya intensidad es proporcional a la cantidad de entidad unida. Se conoce una amplia variedad de sistemas de marcaje y/o deteccion de moleculas, tales como acidos nucleicos, p. ej., sondas. Se pueden preparar acidos nucleicos marcados mediante la incorporacion o la conjugacion de una marca que es directamente o indirectamente detectable por medios espectroscopicos, fotoqmmicos, bioqmmicos, inmunoqmmicos, electricos, opticos, qmmicos u otros medios. Los marcadores detectables adecuados incluyen radioisotopos, fluoroforos, cromoforos, agentes quimioluminiscentes, enzimas, micropartreulas, partfculas magneticas, partreulas densas de electrones, marcadores de masa, marcadores de espm, haptenos, y similares. En la presente memoria se prefieren los fluoroforos y los agentes quimioluminiscentes.

"Sonda espedfica del locus" se refiere a una sonda que se une selectivamente a un locus espedfico en una region de un cromosoma, p. ej., un locus que se ha determinado que experimenta ganancia/perdida en la metastasis. Una sonda puede dirigirse a regiones codificantes o no codificantes, o ambas, incluyendo los exones, intrones, y/o secuencias reguladoras, tales como secuencias promotoras y similares.

"Muestra de acido nucleico" se refiere a una muestra que comprende acido nucleico en una forma adecuada para la hibridacion con una sonda, tal como una muestra que comprende nucleos o acidos nucleicos aislados o purificados a partir de dichos nucleos. La muestra de acido nucleico puede comprender ADN genomico total o parcial (p. ej., uno o varios cromosomas en particular), ARNm total o parcial (p. ej., uno o varios cromosomas o uno o varios genes en particular), o una o varias secuencias seleccionadas. Los cromosomas condensados (tales como los que estan presentes en la interfase o metafase) son adecuados para su uso como dianas en la hibridacion in situ, tal como FISH.

"Corte predeterminado" y "nivel predeterminado" se refieren en general a un valor de corte que se utiliza para evaluar los resultados de diagnostico/pronostico/eficacia terapeutica mediante la comparacion de los resultados del analisis frente al corte/nivel predeterminados, el corte/nivel predeterminados, donde el corte/nivel predeterminados ya se han relacionado o asociado con varios parametros clrnicos (p. ej., gravedad de la enfermedad, progresion/no progresion/mejora, etc.).

"Sonda", en el contexto de la presente descripcion, es un oligonucleotido o polinucleotido que se puede hibridar selectivamente con al menos una porcion de una secuencia diana en condiciones que permiten o promueven la hibridacion selectiva. En general, una sonda puede ser complementaria a la hebra de ADN codificante o efectora (+) de ADN o complementaria a la hebra de ADN no codificante o anti-sentido (-) (a veces referida como "complementaria inversa"). Las sondas pueden variar significativamente de longitud. En algunas aplicaciones se puede preferir una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nucleotidos, tal como aproximadamente 15 a aproximadamente 75 nucleotidos, p. ej., de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 nucleotidos, mientras que se puede preferir una longitud de aproximadamente 50- 1x105 nucleotidos para sondas cromosomicas y se puede preferir una longitud de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 800.000 nucleotidos para las sondas espedficas de locus.

"Hibridar de manera selectiva con" (asf como "hibridacion selectiva", "hibridar espedficamente con", e "hibridacion espedfica"), en el contexto de la presente descripcion, se refiere a la union, formacion de duplex o hibridacion de una molecula de acido nucleico preferentemente con una secuencia de nucleotidos particular

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en condiciones rigurosas. El termino "condiciones rigurosas" se refiere a condiciones bajo las cuales una sonda hibridara preferentemente con su secuencia diana, y en menor medida, o en absoluto, con otras secuencias no diana. Una "hibridacion rigurosa" y unas "condiciones de lavado de hibridacion rigurosas" en el contexto de la hibridacion de acidos nucleicos (p. ej., en forma de matriz, hibridacion de Southern, hibridacion Northern, o FISH) son dependientes de la secuencia, y se diferencian en diferentes condiciones. Una extensa grna para la hibridacion de acidos nucleicos se encuentra, por ejemplo, en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hibridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Cap. 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," Elsevier, NY (1993) ("Tijssen"). En general, la hibridacion y las condiciones de lavado altamente rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5°C mas baja que el punto de fusion termico (Tm) para la secuencia espedfica a una fuerza ionica y un pH definidos. La Tm es la temperatura (a una fuerza ionica y pH definidos) a la que 50% de la secuencia diana hibrida con una sonda perfectamente coincidente. Las condiciones muy rigurosas se seleccionan para que sean iguales a la Tm para una sonda concreta. Un ejemplo de condiciones de hibridacion rigurosas para la hibridacion de acidos nucleicos complementarios, que tienen mas de 100 residuos complementarios, en una matriz o en un filtro en una transferencia Southern o Northern es de 42°C utilizando soluciones de hibridacion convencionales (vease, p. ej., Sambrook y Russell, Molecular Cloning:. A Laboratory Manual, 3a edicion, Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, Nueva York (2001)).

"Secuencia diana", "region diana" y "diana de acido nucleico" se refieren a una secuencia de nucleotidos que se encuentra en una localizacion cromosomica espedfica cuya perdida y/o ganancia, por ejemplo, se esta determinando.

La terminologfa utilizada en la presente memoria tiene el proposito de describir solamente realizaciones particulares y no se pretende de otro modo que sean limitantes.

Metodo de diagnostico de cancer de vejiga

Se proporciona un metodo de diagnostico de cancer de vejiga en un paciente, tal como un paciente con hematuria y/u otros signos y/o smtomas de cancer de vejiga. El metodo comprende poner en contacto una muestra de celulas uroteliales obtenidas del paciente con un conjunto de sondas marcadas de forma detectable que comprenden o que consisten en, una sonda espedfica del locus de c-myc (8q24), una sonda espedfica del locus de Aurora quinasa (AURKA; 20q13, espedficamente20q13.2), una sonda centromerica para el cromosoma 7, y una sonda centromerica para el cromosoma 17 en condiciones de hibridacion, y la determinacion de la presencia de anomalfas cromosomicas. La presencia de anomalfas cromosomicas que implican al menos dos de las sondas marcadas de forma detectable indica que el paciente tiene cancer de vejiga. Por lo tanto, en vista de lo anterior, la deteccion de anomalfas cromosomicas que implican a c-myc (8q24) y Aurora quinasa (AURKA; 20q13); c-myc (8q24) y el cromosoma 7; c-myc (8q24) y el cromosoma 17; AURKA (20q13) y el cromosoma 7; AURKA (20q13) y el cromosoma 17; el cromosoma 7 y el cromosoma 17; c-myc (8q24), AURKA (20q13), y el cromosoma 7; c-myc (8q24), AURKA (20q13), y el cromosoma 17; AURKA (20q13), el cromosoma 7, y el cromosoma 17; el cromosoma 7, el cromosoma 17, y c-myc (8q24); o c-myc (8q24), AURKA (20q13), el cromosoma 7, y el cromosoma 17 indica que el paciente tiene cancer de vejiga.

El metodo puede ser utilizado para detectar o controlar el cancer de vejiga recurrente. Por lo tanto, tambien se proporciona un metodo de control de la recurrencia de cancer de vejiga en un paciente. El metodo comprende poner en contacto una muestra de celulas uroteliales obtenidas del paciente con un conjunto de sondas marcadas de forma detectable en condiciones de hibridacion. El conjunto de sondas marcadas de forma detectable comprende, o consiste en, una sonda espedfica del locus de c-myc, una sonda espedfica del locus de AURKA, una sonda centromerica para el cromosoma 7, y una sonda centromerica para el cromosoma 17. El metodo tambien comprende la determinacion de la presencia de anomalfas cromosomicas. La presencia de anomalfas cromosomicas que implican al menos dos de las sondas marcadas de forma detectable indica que el cancer de vejiga se ha repetido en el paciente. Por lo tanto, en vista de lo anterior, la deteccion de anomalfas cromosomicas que implican a c-myc (8q24) y Aurora quinasa (AURKA; 20q13); c-myc (8q24) y el cromosoma 7; c-myc (8q24) y el cromosoma 17; AURKA (20q13) y el cromosoma 7; AURKA (20q13) y el cromosoma 17; el cromosoma 7 y el cromosoma 17; c-myc (8q24), AURKA (20q13), y el cromosoma 7; c-myc (8q24), AURKA (20q13), y el cromosoma 17; AURKA (20q13), el cromosoma 7, y el cromosoma 17; el cromosoma 7, el cromosoma 17, y c-myc (8q24); o c-myc (8q24), AURKA (20q13), el cromosoma 7, y el cromosoma 17 indica que el cancer de vejiga se ha repetido en el paciente. En general, para los analisis en los que se puede realizar una repeticion del ensayo (p. ej., el control de la recurrencia de la enfermedad), se obtiene una segunda muestra de ensayo o una muestra de ensayo posterior en un penodo de tiempo despues de haber obtenido la primera muestra de ensayo del sujeto. Espedficamente, se puede obtener una segunda muestra de ensayo del sujeto semanas o anos despues de haber obtenido la primera muestra de ensayo del sujeto. Por ejemplo, la segunda muestra de ensayo se puede obtener del sujeto en un periodo de tiempo de aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 13 semanas, aproximadamente 14 semanas, aproximadamente 15 semanas, aproximadamente 16 semanas, aproximadamente 17 semanas, aproximadamente 18 semanas, aproximadamente 19 semanas, aproximadamente 20 semanas, aproximadamente 21 semanas, aproximadamente

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22 semanas, aproximadamente 23 semanas, aproximadamente 24 semanas, aproximadamente 25 semanas, aproximadamente 26 semanas, aproximadamente 27 semanas, aproximadamente 28 semanas, aproximadamente 29 semanas, aproximadamente 30 semanas, aproximadamente 31 semanas, aproximadamente 32 semanas, aproximadamente 33 semanas 34 semanas, aproximadamente 35 semanas 36 semanas aproximadamente, aproximadamente 37 semanas, aproximadamente 38 semanas, aproximadamente 39 semanas, aproximadamente 40 semanas, aproximadamente 41 semanas, aproximadamente 42 semanas, aproximadamente 43 semanas, aproximadamente 44 semanas, aproximadamente 45 semanas, aproximadamente 46 semanas, aproximadamente 47 semanas, aproximadamente 48 semanas, aproximadamente 49 semanas, aproximadamente 50 semanas, aproximadamente 51 semanas, aproximadamente 52 semanas, aproximadamente 1,5 anos, aproximadamente 2 anos, aproximadamente 2,5 anos, aproximadamente 3,0 anos, aproximadamente 3,5 anos, aproximadamente 4,0

anos, aproximadamente 4,5 anos, aproximadamente 5,0 anos, aproximadamente 5,5 anos, aproximadamente 6,0

anos, aproximadamente 6,5 anos, aproximadamente 7,0 anos, aproximadamente 7,5 anos, aproximadamente 8,0

anos, aproximadamente 8,5 anos, aproximadamente 9,0 anos, aproximadamente 9,5 anos o aproximadamente 10,0

anos despues de haber obtenido la primera muestra de ensayo del sujeto.

El metodo anterior se puede llevar a cabo usando cualquier metodo de deteccion adecuado conocido en la tecnica. Preferiblemente, el metodo anterior se lleva a cabo utilizando la hibridacion in situ, tal como la hibridacion fluorescente in situ (FISH). Preferiblemente, cada sonda se marca de manera detectable con una marca distinta, tal como un fluoroforo diferente.

Cuando los metodos anteriores se llevan a cabo por medio de hibridacion in situ, en la que cada sonda esta marcada de forma detectable (y, cuando se utilizan dos o mas sondas simultaneamente o secuencialmente con la misma muestra, marcadas de manera distinta), tal como mediante FISH, en la que cada sonda esta marcada con un fluoroforo, los metodos se llevan a cabo tfpicamente en una muestra de celulas uroteliales, que se obtienen a partir de una muestra de orina de miccion o, alternativamente, un lavado de la vejiga (p. ej., con agua o solucion salina). Si se obtienen las celulas de una muestra de orina, preferiblemente la muestra de orina se obtiene de la primera orina de la manana del paciente. Las celulas contenidas en la orina o el lavado de vejiga se pueden cosechar en cualquier manera adecuada conocida en la tecnica. Preferiblemente, las celulas se recogieron por centrifugacion y resuspension de las celulas sedimentadas. Tfpicamente, las celulas se resuspendieron en solucion salina tamponada con fosfato (PBS). Una vez recogidas las celulas, se pueden preparar para la hibridacion in situ de acuerdo con metodos bien conocidos en la tecnica. Las celulas pueden ser analizados en un corto penodo de tiempo despues de la cosecha. Alternativamente, las celulas se pueden fijar (p. ej., en solucion de acido y alcohol, tal como metanol:acido acetico glacial (3:1), solucion de acido y acetona, aldehfdos, tales como formaldetndo, paraformaldetndo, y glutaraldetndo, o una solucion de formalina tamponada neutra (formaldetndo en una solucion acuosa de fosfato de sodio)) y analizar en un momento posterior. Si se desea, se pueden tratar (p. ej., con ARNasa y pepsina) celulas frescas (las celulas frescas se pueden cultivar durante 1-3 dfas y se puede anadir un bloqueador, como Colcemid, al cultivo para bloquear las celulas en metafase, durante la cual los cromosomas estan muy condensados y pueden ser visualizados), congeladas, o fijadas (p. ej., fijadas en etanol o formalina e incluidas en parafina) para aumentar la accesibilidad del acido nucleico diana (p. ej., ADN) y reducir la union no espedfica, y despues someterlas a hibridacion con una o mas sondas, lavando para eliminar cualquier sonda sin unir, y a deteccion de las sondas hibridadas. Por ejemplo, se puede aplicar una suspension de celulas en forma de una unica capa sobre un soporte solido adecuado para el examen por microscopfa, tal como un portaobjetos o un cubreobjetos, y se puede medir la densidad celular mediante un microscopio de contraste de la luz o de fase. Se puede depositar una muestra de orina de miccion que se recoge y se fija en una solucion tal como PreservCyt en un portaobjetos (UroCyte, disponible de Hologic, Marlborough, MA) utilizando un sistema de deposito de celulas tal como ThinPrep 2000. Los portaobjetos se pueden preparar y empapar en deshidratante al 95% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Despues, los portaobjetos se pueden secar en una posicion vertical sobre una mesa de laboratorio durante aproximadamente 30 minutos a una hora antes de la hibridacion. A continuacion el portaobjetos se trata previamente en 2X citrato de sodio salino (SSC) a 72°C durante aproximadamente 2 minutos y se digiere con proteasa (0,1 a 0,5 mg/ml en HCl 10 mM) a 37°C durante aproximadamente 10 minutos. Despues de la digestion con la proteasa, el portaobjetos se puede enjuagar en 1X solucion salina tamponada con fosfato (PBS) durante aproximadamente cinco minutos a temperatura ambiente, fijar en solucion de formalina tamponada neutra al 1% durante aproximadamente cinco minutos a temperatura ambiente, aclarar de nuevo en 1X PBS durante aproximadamente cinco minutos a temperatura ambiente, pasar a traves de etanol graduado, y secar. Preferiblemente, el portaobjetos se pone en contacto con una o mas sondas desnaturalizadas simultaneamente a 73°C durante aproximadamente dos minutos en un ThermoBrite Denaturation/Hybridization (Abbott Molecular, Inc., Des Plaines, IL) y se hibrida a 37°C durante la noche (aproximadamente 16-24 horas). Despues de la hibridacion, los cubreobjetos se retiran de los portaobjetos y los portaobjetos se sumergen a continuacion en un tampon de lavado principal durante aproximadamente cinco minutos a 73°C y luego un tampon de lavado secundario durante aproximadamente un minuto a temperatura ambiente. Los portaobjetos se secan y se montan con una solucion I "anti-desvanecimiento" de hidrato de dihidrocloruro de 4'6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI) II (Abbott Molecular, Inc.). Preferiblemente, el portaobjetos se analiza con un microscopio de epifluorescencia equipado con filtros de paso de banda individuales (Abbott Molecular, Inc.).

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Alternativamente, una seccion (aproximadamente 5 pm de espesor) de una muestra (FFPE) fijada con formalina, incluida en parafina de las celulas uroteliales (p. ej., de un tumor sospechoso) se puede montar en un portaobjetos, tal como un portaobjetos cargado positivamente SuperFrost Plus (disponible de ThermoShandon, Pittsburgh, PA), cocer a 56-60°C durante la noche, des-parafinar utilizando Hemo-de, CtriSolv, o xileno durante cinco minutos, sumergir en 1 x solucion salina de citrato de sodio, pH 6,3, a 80°C durante 35 minutos, y lavar en agua durante tres minutos. Despues de la digestion con proteasa (1-4 mg de pepsina/mL, tal como 1,5 mg de pepsina/mL, y disuelto en 0,1-0,2 N de HCl) a 37°C durante 15 minutos, la seccion se puede enjuagar en agua durante tres minutos, pasar a traves de etanol graduado, y secar. Preferiblemente, la hibridacion con una o mas sondas como las decritas anteriormente se realiza a 37°C durante 16-24 horas en un horno automatico de co-desnaturalizacion (HYBrite o ThermoBrite/Hybridization System, Abbott Molecular, Inc., Des Plaines, IL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (tales metodos rtpicamente implican la desnaturalizacion de las sondas y los acidos nucleicos diana). Despues de la hibridacion, la seccion se coloca preferiblemente en tampon de lavado (2 x solucion salina de citrato de sodio/NP40 al 0,3%; disponible de Abbott Molecular, Inc.) a temperatura ambiente durante 2-10 minutos para eliminar el cubreobjetos y despues se sumerge en tampon de lavado de 73°C durante dos minutos, se seca, y se monta con solucion I "anti-desvanecimiento" de hidrato de dihidrocloruro de 4',6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Abbott Molecular, Inc.). Preferiblemente, el portaobjetos se analiza con un microscopio de epifluorescencia equipado con filtros de paso de banda individuales (Abbott Molecular, Inc.).

Antes de la deteccion, las celulas de una muestra pueden ser opcionalmente pre-seleccionados basandose en anomalfas citologicas evidentes. La pre-seleccion identifica las celulas sospechosas, lo que permite que el escrutinio se centre en esas celulas. La pre-seleccion permite el escrutinio rapido y aumenta la probabilidad de que un resultado positivo no se pierda. Durante la pre-seleccion, las celulas de una muestra biologica se pueden colocar en un portaobjetos de microscopio y escanear visualmente para detectar las anomalfas citologicas comunmente asociadas con celulas displasicas y neoplasicas. Tales anomalfas incluyen anomalfas en el tamano nuclear, la forma nuclear, y la tincion nuclear, segun la evaluacion de la contratincion nucleos con colorantes o tintes de acido nucleico, tales como yoduro de propidio o dicloruro de 4,6-diamino-2-fenilindol (DAPI), por lo general despues de la hibridacion de las sondas a sus ADN diana. Tfpicamente, las celulas neoplasicas albergan los nucleos que se agrandan, de forma irregular, y/o muestran un patron de tincion nuclear moteado. El yoduro de propidio, que se utiliza rtpicamente a una concentracion de aproximadamente 0,4 pg/ml a aproximadamente 5 pg/ml, es un colorante espedfico de ADN rojo fluorescente que se puede observar en un pico de longitud de onda de emision de 614 nm. DAPI, que se utiliza rtpicamente a una concentracion de aproximadamente 125 ng/ml a aproximadamente 1.000 ng/ml, es tinte espedfico de ADN azul fluorescente que puede ser observado en un pico de longitud de onda de emision de 452 nm con un filtro DAPI a bajo aumento. En este caso, solo aquellas celulas pre-seleccionadas para la deteccion se someten a recuento de perdidas y/o ganancias cromosomicas. Preferiblemente, las celulas pre- seleccionadas en el orden de al menos 20, y mas preferiblemente al menos 30-40, en numero son elegidas para la evaluacion de las perdidas y/o ganancias cromosomicas.

Alternativamente, una zona que evidencia un cierto nivel de displasia o una lesion sospechosa puede ser localizada utilizando el filtro DAPI a bajo aumento e inspeccionado cuidadosamente para determinar la presencia de nucleos que albergan un numero de copias anormales de cualquier sonda. En una celula normal, se detectaran dos copias de una sonda dada. En una celula anormal, se detectaran mas o menos copias de una sonda dada. Las zonas con los cambios mas significativos en el numero de copias se seleccionan preferiblemente para la enumeracion. Siempre que sea posible, se seleccionan tres zonas anormales y, dentro de cada zona anormal, se analizan 10 nucleos aleatorios a alta potencia (60 x 100 x objetivo). Preferiblemente, los nucleos no son solapantes y albergan senales suficientemente brillantes.

Alternativamente, las celulas de deteccion se pueden elegir independientemente de las caractensticas citologicas o histologicas. Por ejemplo, todas las celulas que no se solapan en una zona o zonas determinadas en un portaobjetos de microscopio se pueden evaluar para determinar las perdidas y/o ganancias cromosomicas. Como un ejemplo adicional, se pueden elegir las celulas en el portaobjetos, p. ej., las celulas que muestran una morfologfa alterada, del orden de al menos aproximadamente 50, y mas preferiblemente al menos aproximadamente 100, en numero que aparecen en orden consecutivo en un portaobjetos del microscopio para la evaluacion de las perdidas y/o ganancias cromosomicas.

Las copias de c-myc (8q24), AURKA (20q13), el cromosoma 7, y el cromosoma 17 se cuentan y se registran. La presencia de anomalfas cromosomicas que implican al menos dos de c-myc, AURKA, el cromosoma 7, y el cromosoma 17 indica que el paciente tiene cancer de vejiga.

Por lo tanto, estos metodos comprenden poner en contacto una muestra de celulas uroteliales obtenidas de un paciente, p. ej., una muestra de acido nucleico, con un conjunto de sondas marcadas de forma detectable que comprende una sonda espedfica para el locus de c-myc (8q24), una sonda espedfica para el locus de AURKA (20q13), una sonda centromerica para el cromosoma 7, y una sonda centromerica para el cromosoma 17 en condiciones que permiten (o promueven) que la sonda se una selectivamente con su secuencia de acido nucleico diana y forme un complejo de hibridacion estable. Tales metodos comprenden ademas la deteccion de la formacion

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del complejo de hibridacion y el recuento del numero de complejos de hibridacion. En vista del numero de complejos de hibridacion que comprenden c-myc (8q24), AURKA (20q13), el cromosoma 7, y el cromosoma 17, el metodo comprende adicionalmente la determinacion del numero de copias de c-myc (8q24), AURKA (20q13), el cromosoma 7, y el cromosoma 17. Si se desea, se puede comparar el numero de copias con un corte pre-determinado, en donde un numero de copias mayor que el corte pre-determinado (es decir, una ganancia) y un numero de copias menor que el corte predeterminado (es decir, una perdida), segun sea el caso, indica que el paciente tiene cancer de vejiga.

Mientras que la desparafinacion, el tratamiento previo, la tincion, y el lavado de diapositivas rutinario tambien se pueden llevar a cabo de acuerdo con los metodos conocidos en la tecnica, el uso de un sistema automatizado, sin embargo, tal como VP 2000 Processor (Abbott Molecular, Inc., Des Plaines, IL) , disminuye la cantidad de tiempo necesaria para preparar los portaobjetos para su evaluacion. Los portaobjetos se pueden preparar en grandes lotes (p. ej., 50 portaobjetos), en oposicion a lotes pequenos (p. ej., 4 portaobjetos) cuando se utilizan jarras de Coplin convencionales para el lavado post-hibridacion. Ademas, la puntuacion de los portaobjetos se puede automatizar completamente utilizando la formacion de imagenes automatizada, reduciendo asf la cantidad de tiempo invertida para el analisis de la muestra. La automatizacion completa tambien permite el uso de un algoritmo de formacion de imagenes que captura mas celulas anormales con mas frecuencia y de forma constante. Tambien, mientras se puede utilizar que cualquier metodo adecuado de preparacion de los portaobjetos conocido en la tecnica, los portaobjetos se preparan preferiblemente usando ThinPrep 2000 (Hologic, Inc., Bedford, MA), que genera monocapas de celulas mas uniformes y consistentes.

Otros metodos ya conocidos en la tecnica o actualmente en desarrollo pueden requerir el uso de una muestra de celulas uroteliales que son distintas de las celulas fijadas en formalina e incluidas en parafina, p. ej., celulas frescas o congeladas, celulas homogeneizadas, celulas lisadas, o acidos nucleicos aislados o purificados (p. ej., una "muestra de acido nucleico", tal como ADN) de las celulas uroteliales (se pretende que "muestra de celulas uroteliales" segun se utiliza en la presente memora abarque todas las formas de una muestra de celulas uroteliales que permiten la determinacion del numero de copias y la ganancia/perdida). Los nucleos tambien pueden ser extrafdos de secciones gruesas de los espedmenes incluidos en parafina para reducir los artefactos del truncamiento y eliminar el material extrano incluido. Tfpicamente, las muestras biologicas, una vez obtenidas, se cosechan y se procesan antes de la hibridacion utilizando metodos convencionales conocidos en la tecnica. Tal procesamiento incluye tfpicamente el tratamiento con proteasa y una fijacion adicional en una solucion de aldehudo, tal como formaldetudo.

Los ejemplos de los metodos que pueden ser utilizados en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa (Q-PCR), Q-PCR en tiempo real (Applied Biosystems, Foster City, CA), barrido densitometrico de productos de PCR, PCR digital, opcionalmente con pre-amplificacion del gen o de los genesy/o de la region o las regiones cromosomica para los cuales se debe determinar el numero de copias (veanse, p. ej., Vogelstein et al., PNAS USA 96: 9236-9.241 (1999); Publicacion de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Num. 2005/0252773; y Publicacion de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Num. 2009/0069194), La hibridacion genomica comparativa (CGH; vease, p. ej., Kallioniemi et al., Science 258: 818-821 (1992); y Publicacion de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Num. WO 93/18186), analisis de microsatelites o alelotipos Southern, matrices, micromatrices (Carter, Nature Genetics Suplement 39: S16-S21 (Julio de 2007)), hibridacion de sondas amplificables multiplex (MAPH), amplificacion de sondas dependientes de la ligacion multiplex (MLPA; vease, p. ej., Schouten et al., Nucleic Acids Res. 30: e 57 (2002)), cromatograffa lfquida de alta resolucion desnaturalizante (dHPLC; Kumar et al.., J. Biochem. Biophys. Methods 64 (3): 226-234 (2005)), hibridacion dinamica espedfica de alelos (DASH), medicion de longitudes de sondas fluorescentes en ADN genomico peinado (Herrick et al., PNAS 97 (1): 222-227 (2000)), pirosecuenciacion de secuencias desconocidas de referencia (RQPS; Liu et al., Cold Spring Harb. Protoc. doi: 10.1101/pdb.prot5491 (2010)), mapeo de extremos de fosmidos en una secuencia de referencia (basado en tecnologfa capilar), secuenciacion microelectroforetica y de nanoporos (vease, p. ej., Service, Science 311: 1544-1546 (2006); y Shendure et al., Nat. Rev. Genet. 5:335-344 (2004)), y similares.

La desnaturalizacion de dianas de acido nucleico para el analisis mediante hibridacion in situ y metodos similares normalmente se realiza de tal manera que se conserve la morfologfa celular. Por ejemplo, el ADN cromosomico puede ser desnaturalizado mediante pH elevado, calor (p. ej. temperaturas de aproximadamente 70-95°C), disolventes organicos (p. ej., formamida), y combinaciones de los mismos. Las sondas, por otra parte, se pueden desnaturalizar por calor en cuestion de minutos.

Despues de la desnaturalizacion, se lleva a cabo la hibridacion. Las condiciones para hibridar espedficamente las sondas a sus dianas de acido nucleico generalmente incluyen combinaciones de condiciones que se pueden emplear en un procedimiento de hibridacion dado para producir tubridos espedficos, cuyas condiciones pueden ser facilmente determinadas por un experto normal en la tecnica. Tales condiciones suelen incluir temperatura controlada, fase lfquida, y contacto entre una sonda y una diana. Las condiciones de hibridacion vanan dependiendo de muchos factores, incluyendo la concentracion de sonda, la longitud de la diana, el contenido de G-C de la diana y la sonda, la composicion del disolvente, la temperatura y la duracion de la incubacion. Al menos una etapa de desnaturalizacion puede preceder al contacto de las sondas con las dianas. Alternativamente, la sonda y la diana se

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pueden someter a condiciones de desnaturalizacion mientras estan en contacto entre sf, o con el contacto posterior de la sonda con la muestra biologica. La hibridacion se puede lograr con la posterior incubacion de la sonda/muestra, por ejemplo, en una fase lfquida de una mezcla con una relacion en volumen de aproximadamente 50:50 de 2 a 4 x SSC y formamida, a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 25 a aproximadamente 55°C durante un tiempo que se encuentra ilustrativamente en el intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 96 horas, o mas preferiblemente a una temperatura de aproximadamente 32 a aproximadamente 42°C durante un tiempo en el intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 24 horas. Con el fin de aumentar la especificidad, se puede utilizar un agente de bloqueo, tal como un acido nucleico de bloqueo sin marcar, como se describe en la Patente de los Estados Unidos Num. 5.756.696 (cuyo contenido se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad, y en concreto para la descripcion de la utilizacion del acido nucleico de bloqueo). Se pueden emplear facilmente otras condiciones para la hibridacion espedfica de las sondas a sus dianas de acido nucleico presentes en la muestra, como sera evidente para un experto en la tecnica. Los protocolos de hibridacion se describen, por ejemplo, en Pinket et al., PNAS USA 85: 9l38- 9142 (1988); In situ Hybridization Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 33, Choo, ed., Humana Press, Totowa, NJ (1994); y Kallioniemi et al., PNAS USA 89: 5321-5325 (1992).

Al termino de un penodo de incubacion adecuado, se puede eliminar la union no espedfica de las sondas cromosomicas con una muestra de ADN por medio de una serie de lavados. La temperatura y las concentraciones de sal se eligen convenientemente para una rigurosidad deseada. El nivel de rigurosidad requerido depende de la complejidad de una secuencia de sonda espedfica en relacion con la secuencia genomica, y se puede determinar mediante la hibridacion de sondas sistematicamente a muestras de composicion genetica conocida. En general, los lavados de alta rigurosidad se pueden llevar a cabo a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 65 a aproximadamente 80°C con aproximadamente 0,2 x a aproximadamente 2 x SSC y de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1% de un detergente no ionico, tal como Nonidet P-40 (NP40). Si se requieren lavados de rigurosidad mas baja, los lavados se pueden llevar a cabo a una temperatura inferior con un aumento de la concentracion de sal.

Cuando se utilizan sondas o composiciones de la sonda marcadas con fluoroforo, el metodo de deteccion puede implicar microscopfa de fluorescencia, citometna de flujo, u otros medios para determinar la hibridacion de la sonda. Se puede utilizar cualquier metodo de formacion de imagenes microscopicas adecuado junto con los metodos descritos en la presente memoria para observar multiples fluoroforos. En el caso en el que se emplea la microscopfa de fluorescencia, las muestras hibridadas se pueden visualizar bajo luz adecuada para la excitacion de cada fluoroforo y con el uso de un filtro o varios filtros apropiados. Alternativamente se pueden utilizar sistemas de formacion de imagenes digitales automatizados, tales como los sistemas MetaSystems, BioView, Leica, Ikonisys, o Applied Imaging.

Dependiendo del metodo empleado, se puede utilizar un sistema de analisis de imagenes digital para facilitar la visualizacion de los resultados y para mejorar la sensibilidad de deteccion de pequenas diferencias en la intensidad de fluorescencia. Un sistema ilustrativo es QUIPS (un acronimo de sistema de procesamiento de imagenes cuantitativo), que es un sistema de analisis de imagenes automatizado basado en un microscopio de fluorescencia convencional equipado con una fase automatizada, control de foco y rueda de filtros (Ludl Electronic Products, Ltd., Hawthorne, NY). La rueda de filtros esta montada en la trayectoria de excitacion de fluorescencia del microscopio para la seleccion de la longitud de onda de excitacion. Los filtros especiales (Chroma Technology, Brattleboro, VT) en el bloque dicroico permiten la excitacion de los multiples colorantes sin cambio de registro de las imagenes. El microscopio tiene dos puertos para camara, uno de los cuales tiene una camara CCD intensificada (Quantex Corp., Sunnyvale, Calif.) para la visualizacion de imagenes de video sensible a alta velocidad, que se utiliza para encontrar zonas interesantes sobre un portaobjetos, asf como para el enfoque. El otro puerto de camara tiene una camara CCD refrigerada (modelo 200 de Photometrics Ltd., Tucson, AZ), que se utiliza para la adquisicion de imagenes reales a alta resolucion y sensibilidad. La camara CCD refrigerada esta interconectada a una estacion de trabajo SUN 4/330 (SUN Microsystems, Inc., Mountain View, CA) a traves de un bus VME. Toda la adquisicion de imagenes multicolores se controla mediante un paquete de soporte logico de procesamiento de imagenes SCIL-Image (Delft Centre for Image Processing, Delft, Pafses Bajos).

En la matriz CGH (aCGH) las sondas se inmovilizan en lugares distintos sobre un sustrato y no estan marcadas (vease, p. ej., Publicacion de la Solicitud de Patente Internacional Num. WO 96/17958). En lugar de ello, los acidos nucleicos de la muestra, que comprenden uno o varios acidos nucleicos diana, se marcan. Cualquiera de los acidos nucleicos de la muestra se marca antes de la hibridacion o se marcan de manera detectable los complejos de hibridacion. En aCGH de color doble o multiple, la matriz de sondas se hibrida simultaneamente o secuencialmente a dos o mas colecciones de acidos nucleicos diana marcados de forma diferente.

En vista de lo anterior, un procedimiento manual puede implicar la recogida de celulas de la orina y la fijacion de las mismas en el reactivo de Carnoy. Se pueden preparar portaobjetos de doce pocillos que contienen gotas de 3 jL, 10 |jL y 30 jL gotas de una muestra de suspension celular. Los portaobjetos se pueden tratar previamente de forma manual (opcionalmente, pre-tratados utilizando VP2000 (Abbott Molecular, Inc., Des Plaines, IL)), hibridar de forma

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manual (opcionalmente, hibridar usando Thermobrite Denaturation/Hybridization System (Abbott Molecular, Inc.)), y lavar manualmente. Utilizando la microscop^a, se pueden seleccionar celulas anormales, y se pueden enumerar las sondas. Preferiblemente, se utiliza un procedimiento automatizado. Un procedimiento automatizado puede incluir la recogida de celulas de la orina y la fijacion de las mismas en PreservCyt (Hologic, Inc., Bedford, MA). Se pueden preparar portaobjetos ThinPrep (Hologic, Inc.), pre-tratados utilizando VP2000 (Abbott Molecular, Inc.), e hibridar empleando Thermobrite Denaturation/Hybridization System (Abbott Molecular, Inc.). Los portaobjetos se pueden lavar y, mediante microscopfa, se pueden identificar las celulas anormales, y se pueden enumerar las sondas. Se pueden escanear previamente las celulas, clasificarlas y obtener imagenes, lo que permite la enumeracion automatica de la sonda y el examen a distancia. El uso de ThinPrep da como resultado un fondo mas limpio, la reduccion de la perdida de celulas, una morfologfa de celulas mas grandes y mas planas, y una mejor calidad de la senal.

Sondas

Tambien se proporciona un conjunto de sondas. El conjunto de sondas comprende, o consiste en, una sonda espedfica del locus de c-myc, una sonda espedfica del locus de AURKA, una sonda centromerica para el cromosoma 7, y una sonda centromerica para el cromosoma 17.

Las sondas adecuadas para su utilizacion como sondas espedficas del locus se hibridan a una region espedfica en un cromosoma que contiene un gen. La sonda espedfica del locus del gen c-myc (8q24) puede hibridar con la totalidad o una porcion del gen c-myc en Q24 en el cromosoma 8 (es decir, 8q24). La sonda espedfica del locus del gen AURKA (20q13) puede hibridar con la totalidad o una porcion del gen AURKA en q13 en el cromosoma 20 (es decir, 20q13, espedficamente 20q13.2). Se encuentra disponible un clon de AURKA en M.D. Anderson Cancer Center de la Universidad de Texas. Alternativamente, se puede utilizar una sonda que hibrida con la totalidad o parte de 20q13 y una region adyacente en uno o ambos lados de 20q13. Dicha sonda, por ejemplo, puede hibridar con la totalidad o una porcion del gen ZNF217 de 17,5 kb y/o la totalidad o una parte del locus D20S108, que esta situado en 20q12.

Las sondas adecuadas para su uso como sondas cromosomicas se hibridan con ADN repetitivo asociado con el centromero de un cromosoma. Los centromeres de cromosomas de primates contienen una familia compleja de largas repeticiones en tandem de ADN, que se componen de una longitud del monomero de repeticion de aproximadamente 171 pares de bases (pb), que se conoce como ADN satelite a. Las sondas cromosomicas tienen tfpicamente aproximadamente 50-1x105 nucleotidos de longitud. Las sondas mas largas tfpicamente comprenden fragmentos mas pequenos de aproximadamente 100 a 500 nucleotidos de longitud. La sonda para el cromosoma 7 puede hibridar con el ADN satelite alfa situado en el centromero del cromosoma 7, mientras que la sonda para el cromosoma 17 puede hibridar con el ADN satelite alfa situado en el centromero del cromosoma 17. Los ejemplos de tales sondas incluyen CEP7 y CEP17.

Las sondas de enumeracion del cromosoma (CEP) y las sondas espedficas del locus que se dirigen a una region o subregion cromosomica pueden ser obtenidas comercialmente o pueden ser facilmente preparadas facilmente por los expertos en la tecnica. Tales sondas se pueden obtener comercialmente de Abbott Molecular, Inc. (Des Plaines, IL), Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR), o Cytocell (Oxfordshire, Reino Unido). Las sondas cromosomicas se pueden preparar, por ejemplo, a partir de acidos nucleicos de proternas (PNA), ADN humanos clonados tales como plasmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC), y cromosomas artificiales de Pl (PAC) que contienen insertos de secuencias de ADN humano. Se puede obtener una region de interes a traves de la amplificacion por PCR o la clonacion. En otra realizacion, las sondas cromosomicas pueden ser sondas oligo. Alternativamente, las sondas cromosomicas se pueden preparar sinteticamente de acuerdo con metodos conocidos en la tecnica.

Cuando se desea el redireccionamiento de un locus de un gen particular, se pueden preferir las sondas que hibridan a lo largo de toda la longitud del gen diana, aunque no es necesario. Se puede disenar una sonda espedfica del locus para hibridar con un oncogen o un gen supresor de tumor, cuya aberracion genetica se correlaciona con la metastasis, p. ej., c-myc.

Las sondas se pueden preparar por cualquier metodo conocido en la tecnica. Las sondas se pueden sintetizar o producir de forma recombinante.

Preferiblemente, las sondas se marcan de forma detectable, y, cuando se utilizan dos o mas sondas simultaneamente o secuencialmente en la misma muestra, preferiblemente cada sonda esta marcada de forma distinta. Preferiblemente, las sondas se marcan de forma detectable con fluoroforos, y, cuando se utilizan dos o mas sondas de forma simultanea o secuencial en la muestra, preferiblemente cada sonda esta marcada de manera distinta con un fluoroforo. Los ejemplos de los fluoroforos preferidos incluyen, pero no se limitan a, acido 7-amino-4- metil-cumarin-3-acetico (AMCA), 5-carboxi-X-rodamina, 6-carboxi-X-rodamina, lisamina-rodamina B, 5- carboxifluorescema, 6-carboxifluorescema, fluorescema-5-isotiocianato (FITC), acido 7-dietilaminocumarin-3- carboxflico, tetrametilrodamina-5-isotiocianato, tetrametilrodamina-6-isotiocianato, 5-carboxiltetrametil-rodamina, 6-

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carboxitetrametil-rodamina, acido 7-hidroxicumarin-3-carbox^lico, acido N-4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza- 3-indacenopropionico, eosina-5-isotiocianato, eritrosina-5-isotiocianato, SpectrumRed (Abbott Molecular, Inc.), SpectrumGold (Abbott Molecular, Inc.), SpectrumGreen (Abbott Molecular, Inc.), SpectrumAqua (Abbott Molecular, Inc.), ROJO TEXAS (Molecular Probes, Inc.), Lucifer amarillo, y acetilacida azul CASCADES (Molecular Probes, Inc.). La marca concreta utilizada no es cntica; deseablemente, sin embargo, la marca concreta no interfiere en la hibridacion in situ de la sonda y la deteccion de la marca en cualquier otra sonda. Deseablemente la marca es detectable a un numero de copias tan bajo como sea posible para maximizar la sensibilidad del analisis y para ser detectable por encima de cualquier senal de fondo. Tambien deseablemente, la marca proporciona una senal muy localizada, proporcionando asf un alto grado de resolucion espacial.

La union de fluoroforos a sondas de acidos nucleicos es bien conocida en la tecnica y se puede lograr por cualquier medio disponible. Los fluoroforos se pueden unir covalentemente a un nucleotido en particular, por ejemplo, y el nucleotido marcado se puede incorporar a la sonda utilizando tecnicas convencionales tales como la traslacion de muescas, el cebado aleatorio (Rigby et al., J. Mol. Biol. 113:237 (1997)), el marcaje por PCR, el marcaje de los extremos, el marcaje directo mediante modificacion qmmica de determinados residuos, tales como los residuos de citosina (Patente de los Estados Unidos Num. 5.491.224), y similares. Alternativamente, el fluoroforo se puede unir covalentemente a los nucleotidos con brazos conectores activados, que han sido incorporados a la sonda, por ejemplo, a traves de un conector a los nucleotidos de desoxicitidina de la sonda que se han sometido a transaminacion. Los metodos para marcar sondas se describen en la Patente de los Estados Unidos Num. 5.491.224 y como describen Morrison et al., en Molecular Cytogenetcis: Protocols and Applications, Capftulo 2, "Labeling Fluorescence In Situ Hybridization Probes for Genomic Targets", pags. 21-40, Fan, Ed., Humana Press (2002), incorporados ambos a la presente memoria como referencia por sus descripciones de sondas de marcaje.

Un experto en la tecnica reconocera que se pueden utilizar otros agentes o colorantes en lugar de fluoroforos como radicales que contienen marcas. Los agentes luminiscentes incluyen, por ejemplo, radicales que contienen marcas radioluminiscentes, quimioluminiscentes, bioluminiscentes y fosforescentes. Los agentes que son detectables con luz visible incluyen colorantes de cianina. Alternativamente, se pueden utilizar radicales de deteccion que se visualizan por medios indirectos. Por ejemplo, las sondas se pueden marcar con biotina o digoxigenina utilizando metodos de rutina conocidos en la tecnica, y luego se pueden procesar adicionalmente para la deteccion. La visualizacion de una sonda que contiene biotina se puede lograr a traves de la posterior union de avidina conjugada con un marcador detectable. El marcador detectable puede ser un fluoroforo, en cuyo caso la visualizacion caso y la discriminacion de las sondas se pueden lograr como se describe a continuacion.

Las sondas cromosomicas hibridadas a regiones diana se pueden visualizar alternativamente por medio de reacciones enzimaticas de radicales marcados con sustratos adecuados para la produccion de productos coloreados insolubles. Cada sonda se puede discriminar de otras sondas del conjunto por la eleccion de un radical de marcaje distinto. Una sonda que contiene biotina dentro de un conjunto se puede detectar a traves de la posterior incubacion con avidina conjugada con fosfatasa alcalina (AP) o peroxidasa de rabano picante (HRP) y un sustrato adecuado. El 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato y el nitroazul de tetrazolio (NBT) sirven como sustratos para la fosfatasa alcalina, mientras que el diaminobenzoato sirve como sustrato para la HRP.

Kit

Tambien se proporciona un kit. El kit comprende, o consiste en, (a) un conjunto de sondas que permite el diagnostico del cancer de vejiga, o el control de la recurrencia del mismo, en un paciente y (b) instrucciones para el diagnostico del cancer de vejiga, o el control de la recurrencia del mismo, en un paciente. El conjunto de sondas comprende, o consiste en, una sonda espedfica del locus de c-myc, una sonda espedfica del locus de AURKA, una sonda centromerica para el cromosoma 7, y una sonda centromerica para el cromosoma 17. Las instrucciones comprenden la determinacion en una muestra de celulas uroteliales obtenidas del paciente de la presencia de anomalfas cromosomicas, en donde la presencia de anomalfas cromosomicas que implican al menos dos de las sondas indica que el paciente tiene cancer de vejiga. Tales kits pueden comprender adicionalmente, o consistir en, agentes de bloqueo u otras sondas, diversas marcas o agentes de marcaje para facilitar la deteccion de las sondas, reactivos para la hibridacion (p. ej., tampones), una expansion de la metafase, y similares.

Ejemplo

El siguiente ejemplo sirve para ilustrar la presente invencion. No se pretende que el ejemplo limite el alcance de la invencion reivindicada de ninguna manera.

Ejemplo 1

Este ejemplo describe el analisis de portaobjetos con espedmenes utilizando el conjunto de sondas que comprende una sonda espedfica del locus de c-myc (8q24), una sonda espedfica del locus de AURKA (20q13, espedficamente 20q13.2), una sonda centromerica para el cromosoma 7, y una sonda centromerica para el cromosoma 17.

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Cada muestra de celulas uroteliales se coloco en un vial ThinPrep (Hologic, Inc.), y se anadio PreservCyt (Hologic, Inc., Bedford, MA) al vial para asegurar un volumen de 20 mL. Se utilizo un procesador ThinPrep T-2000 (Hologic, Inc.) para la preparacion de la muestra. Los portaobjetos se prepararon y se empaparon en deshidratante al 95% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Despues, los portaobjetos se secaron en una posicion vertical sobre una mesa de laboratorio durante aproximadamente 30 minutos a una hora antes de la hibridacion. Los portaobjetos fueron evaluados bajo microscopio optico para determinar la celularidad y la morfologfa nuclear.

La sonda espedfica del locus de c-myc (8q24) se marco con Red, mientras que la sonda espedfica del locus de AURKA (20q13) se marco con Gold, la sonda centromerica para el cromosoma 7 se marco con Green, y la sonda centromerica para el cromosoma 17 se marco con Aqua.

Se utilizo el siguiente protocolo para la hibridacion fluorescente in situ (FISH). Los portaobjetos se colocaron en 2 x SSC a 72°C durante 2 minutos, 0,1 a 0,5 mg/ml de pepsina (en HCl 10 mM) a 37°C durante 10 minutos, 1 x PBS (solucion salina tamponada con fosfato) a temperatura ambiente durante 5 minutos, NBF al 1% a temperatura ambiente durante 5 minutos, 1 x PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos, etanol del 70% a temperatura ambiente durante 1 minuto, etanol del 85% a temperatura ambiente durante 1 minuto, y etanol del 100% a temperatura ambiente durante 1 minuto, y despues se seco al aire. Despues de ser secado al aire, cada portaobjetos se puso en contacto con 5 pL de mezcla de sonda y se cubrio con un cubreobjetos de 18 x 18 mm. Los portaobjetos se co-desnaturalizaron a 73°C durante dos minutos en un ThermoBrite Denaturation/Hybridization System (Abbott Molecular, Inc., Des Plaines, IL) y se hibridaron a 37°C durante la noche (16-24 horas). Despues de la hibridacion, los portaobjetos se lavaron con 0,4 x SSC con NP40 al 0,3% durante dos minutos a 73°C y 2 x SSC con NP40 al 0,1% durante un minuto a temperatura ambiente. A continuacion, se anadio DAPI II a los portaobjetos, y los portaobjetos se cubrieron con cubreobjetos de 24 x 30 mm. Se revisaron los portaobjetos mediante microscopfa de fluorescencia con filtros Red, Gold, Green, Aqua y DAPI.

Los portaobjetos se escanearon utilizando un sistema de escaneo automatico Ikonisys (Ikonisys, Inc., New Haven, CT). Los datos se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1

Diagnostico: Diagnostico Rechazado por Panel de Sondas Diagnostico confirmado por Panel de Sondas

Alto Grado (Histologfa-biopsia)1: 2 18

Bajo Grado (Histologfa-biopsia)1: 3 24

Bajo/Alto Grado (Histologfa-biopsia): 0 1

NPUBPM (Histologfa-biopsia)2: 0 4

Negativo (Histologfa-biopsia): 10 15

Negativo (citologia): 3 38

Positivo (citologia): 0 16

Total: 18 116

1Clasificacion de la Organizacion Mundial de la Salud (OMS) 2004 2Neoplasia papilar urotelial de bajo potencial maligno

La sensibilidad del panel de sondas fue de 76,2% (48/63) (intervalo de confianza de 95%) incluyendo NPUBPM como cancer, y 76,3% excluyendo NPUBPM como cancer. La especificidad del panel de sondas fue de 86,8% (46/53) (intervalo de confianza de 95%).

Cincuenta y dos de los 58 espedmenes confirmados por biopsia, que consisrtan en 21 de alto grado, 28 de bajo grado, dos no determinados, y siete NPUBPM, tambien fueron sometidos a ensayo utilizando el panel de sondas. El diagnostico fue confirmado para 47/52 muestras y rechazado para 5/52 espedmenes.

La invencion descrita de manera ilustrativa en la presente memoria se puede poner en practica adecuadamente en ausencia de cualquier elemento o limitacion, que no se describa espedficamente en la presente memoria. Asf, por ejemplo, cada caso de la presente memoria de cualquiera de los terminos "que comprende", "que consiste

esencialmente en" y "que consiste en" puede sustituirse por cualquiera de los otros dos terminos. Del mismo modo, las formas singulares "un", "uno" y "una" y "el" y "la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. As^ por ejemplo, las referencias a "el metodo" incluyen uno o mas metodos y/o etapas del tipo, que se describen en la presente memoria y/o que seran evidentes para los expertos en la tecnica tras la lectura 5 de la descripcion.

Los terminos y expresiones que se han empleado, se utilizan como terminos de descripcion y no de limitacion. En este sentido, cuando ciertos terminos se definen en "Definiciones" y se definen, se describen, o se comentan de otro modo en otra parte de la "Descripcion detallada", todas estas definiciones, descripciones y comentarios estan 10 destinados a ser atribuidos a tales terminos. Tampoco hay ninguna intencion en el uso de tales terminos y expresiones de excluir ningun equivalente de las caractensticas mostradas y descritas o de las porciones de las mismas. Ademas, si bien se utilizan subtftulos, p. ej., "Definiciones", en la "Descripcion detallada", tal uso es unicamente para facilitar la referencia y no se pretende limitar ninguna descripcion realizada en una seccion solamente a esa seccion; mas bien, se pretende que cualquier descripcion realizada bajo un subtftulo constituya una 15 descripcion en todos y cada uno de los otros subtftulos.

Claims

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10

15

20

25

30

35

REIVINDICACIONES

1. Un metodo de diagnostico del cancer de vejiga en un paciente, cuyo metodo comprende poner en contacto una muestra de celulas uroteliales obtenida del paciente con un conjunto de sondas marcadas de forma detectable que consiste en una sonda espedfica del locus de c-myc, que hibrida con Q24 en el cromosoma humano 8, una sonda espedfica del locus de AURKA, que hibrida con q 13 en el cromosoma humano 20, una sonda centromerica para el cromosoma humano 7, y una sonda centromerica para el cromosoma humano 17 en condiciones de hibridacion, y determinar la presencia de anomalfas cromosomicas, en donde la presencia de anomalfas cromosomicas de c-myc, AURKA, el cromosoma 7, y el cromosoma 17 indica que el paciente tiene cancer de vejiga, despues de lo cual se diagnostica cancer de vejiga en el paciente.
2. El metodo de la reivindicacion 1, en donde el paciente tiene hematuria.
3. El metodo de la reivindicacion 1, en donde el paciente ha sido diagnosticado previamente de cancer de vejiga.
4. Un procedimiento de control de la recurrencia del cancer de vejiga en un paciente, cuyo metodo comprende poner en contacto una muestra de celulas uroteliales obtenida del paciente con un conjunto de sondas marcadas de forma detectable que consiste en una sonda espedfica del locus de c-myc, que hibrida con Q24 en el cromosoma humano 8, una sonda espedfica del locus de AURKA, que hibrida con q13 en el cromosoma humano 20, una sonda centromerica para el cromosoma humano 7, y una sonda centromerica para el cromosoma humano 17 en condiciones de hibridacion, y determinar la presencia de anomalfas cromosomicas, en donde la presencia de anomalfas cromosomicas de c-myc, AURKA, el cromosoma 7, y el cromosoma 17 indica que el cancer de vejiga se ha repetido en el paciente, despues de lo cual se controla la recurrencia de cancer de vejiga en el paciente.
5. Un conjunto de sondas marcadas de forma detectable que consiste en una sonda espedfica del locus de c-myc, que hibrida con Q24 en el cromosoma humano 8, una sonda espedfica del locus de AURKA, que hibrida con q13 en el cromosoma humano 20, una sonda centromerica para el cromosoma humano 7, y una sonda centromerica para el cromosoma humano 17.
6. Un kit que comprende (a) un conjunto de sondas marcadas de forma detectable que permite el diagnostico del cancer de vejiga, o el control de la recurrencia del mismo, en un paciente, en donde el conjunto de sondas consiste en una sonda espedfica del locus de c-myc, que hibrida con Q24 en el cromosoma humano 8, una sonda espedfica del locus de AURKA, que hibrida con q13 en el cromosoma humano 20, una sonda centromerica para el cromosoma humano 7, y una sonda centromerica para el cromosoma humano 17 y (b) instrucciones para el diagnostico del cancer de vejiga, o el control de la recurrencia del mismo, en un paciente, en donde las instrucciones comprenden la determinacion en una muestra de celulas uroteliales obtenidas del paciente de la presencia de anomalfas cromosomicas, en donde la presencia de anomalfas cromosomicas de c-myc, AURKA, cromosoma 7, y el cromosoma 17 indica que la paciente tiene cancer de vejiga.