JP4649608B2 - 膀胱癌患者の予後検出方法 - Google Patents
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細胞内の中心体やAurora A等のタンパクの発現は、間接的免疫蛍光法を用いて確認することができる。例えば、観察対象の組織切片を液体窒素で冷却したイソペンタンなどに浸して凍結させる。次に、凍結組織をクリオスタットのチャンバーに移し、温度が平衡に達するまで静置させる。包埋剤を用いて組織ブロックをスタブにマウントした後、ブロックの表面を対象の組織に適した温度でトリミングを行い、切片の検体を作製する。作製した検体は、清浄なスライドグラス上に置き、室温で乾燥させる。
Aurora Aタンパクの過剰発現は100個以上の細胞を観察し、20個以上の細胞胞体が染色されていた場合と定義する(参照文献:Sen S,Zhou H,Zhang RD,et al.Amplification/overexpression of a mitotic kinase gene in human bladder cancer.J Natl Cancer Inst.2002;94:1320‐9.)。
染色体不安定性の測定は、20番染色体長腕13領域(20q13)増幅の有無と、染色体不安定性の指標となるばらつきの割合を検討するため、20q13(Vysis社)および7,9,17番染色体コピー数を二色または多色FISH法(fluorescence in situ hybridization法)を用いて検討する。スペクトラムオレンジで標識された20q13プローベを、蛍光標識された20番染色体特異的セントロメアプローベ(D20Z1)とともに検体にハイブリダイズさせ、スポット数をカウントする。7,9,17番染色体については、コピー数の異常は、それぞれCEP7,CEP9,CEP17(いずれもVysis社)プローベを検体にハイブリダイズさせてスポット数をカウントすることにより確認する。実験手技の詳細はプローベ販売業者の推薦する方法に従う。染色体不安定性の測定は、100個以上の細胞について、3蛍光波長帯(DAPI/スペクトラム緑/スペクトラム赤)通過フィルターおよび1蛍光波長帯(スペクトラムアクア)通過フィルターを装着した蛍光顕微鏡下で観察して行なう。
7番、9番および17番染色体のコピー数を計測し、そのコピー数がモード(正常細胞では2)以外の染色体コピー数を有する細胞の割合が25%を超える症例を染色体不安定性ありと判定する(参照文献:Lengauer C,Kinzler KW,Vogelstein B.Genetic instability in colorectal cancers.Nature 1997;386:623‐7.)。
ゲノムDNAを膀胱癌継代培養細胞株および健常人ボランテイア末梢血からDNA抽出キット(SepaGene,三光純薬、東京)を用いてそれぞれ抽出する。これらのDNAを用いてHarada等の方法(Harada T,Okita K,Shiraishi K,Kusano N,Kondoh S,Sasaki K.Cancer Res.2002;62:835−39.)に従い、CGH法(comparative genomic hybridization法)とデジタル画像解析をおこなう。腫瘍および正常DNAはニックトランスレーション法にてそれぞれスペクトラム緑、スペクトラム赤(Vysis社、Downers Grove)で標識される。デジタル画像解析システムはQUIPS XL(Vysis社)を使用する。
統計解析はJMP4.0ソフトウェアー(SAS社、Cary)をもちいて行い、グループ毎の再発、腫瘍進展までの期間はKaplan‐Meier法を用いて計算され、統計学的有意差の検定はlog‐rank testを用いる。カテゴリー変数の単変量解析にはカイ二乗検定またはFisher直接確率統計法をもちいて有意差検定をおこない、多変量解析にはCox比例ハザードモデルをもちいて全ての因子が有意となるまで有意でない因子を順次外していくステップダウン法をおこなう。全ての検定においてp値が0.05未満の場合を有意とする。
8種類のヒト膀胱癌継代培養細胞株(KK47,RT‐4,T24,EJ‐1,5637,J82,TCC‐SUP,SCaBER)を基礎実験に用いた。3×105個の細胞を75cm2細胞培養用フラスコ(Coning社、New York)に播種後10%ウシ胎児血清添加RPMI1640培養液(Sigma社、セントルイス)で培養(37℃、5%二酸化炭素、95%空気下)、対数増殖期(播種後4‐5日目)に細胞を回収し、DNAを抽出後CGH法の検体に供した。また、分割チャンバーを有するスライドグラス(4.0cm2,Nunc社、Naperville)を用いて、同一細胞数となるように調節された癌細胞を細胞株毎にチャンバー内に播種し、Aurora Aタンパク発現および中心体数計測のための免疫蛍光実験と、20q13の増幅、および7,9,17番染色体コピー数異常の検討のためのFISH法の実験に用いた。
中心体とAurora Aタンパクの発現を免疫蛍光法で検討するため、検体は10%ホルマリン/メタノール液で固定(25℃、20分間)後、PBSで洗浄、PBS溶解0.5%Triton X液にて透徹(25℃、5分間)させた後ブロッキング溶液(PBS溶解10%ヤギ血清)に1時間接触させ実験に用いた。中心体免疫蛍光染色にはマウスモノクローナル抗γチュブリン抗体(Sigma社)を一次抗体として使用した。Alexa488または568を蛍光色素とするヤギ抗マウスIgG抗体(Molecular Probe社、Eugene)を二次抗体として37℃1時間接触させることにより、上記の抗原‐抗体複合物に特異的に結合させた。結合体は、倍率1000倍視野の蛍光顕微鏡(オリンパス社、東京)により検出した。
ヒト膀胱癌継代細胞培養株8株の基礎検討結果を表1に示す。間接的免疫蛍光法により測定した結果、2つの細胞株(KK47,RT‐4)はCH(中心体複製異常)を有する細胞の割合が5%以下であり、他の6株(T24,EJ‐1,5637,J‐82,TCC‐sup,SCaBER)は5%以上であった。5%以上の6株ではCGH法にて20q(20番染色体長腕)コピー数増加、FISH法にて20q13コピー数増加、Aurora‐Aタンパク過剰発現を共通して認めたが5%以下の2株ではこれらの変異を認めなかった。図1AはKK47株細胞で2個の中心体数(正常)、7番および9番染色体コピー数2本でdisomy(正常コピー数)であることを示している。一方図1BはTCC‐sup株細胞で中心体複製異常と7番および9番染色体コピー数異常を示している。これらの基礎検討結果を基に中心体複製異常症例(以下CH+)の定義を、中心体複製異常を有する細胞の割合が5%以上の症例と定義した。
組織学的に移行上皮癌と診断され、本研究に対する文書による同意が得られた臨床検体50例を臨床検討に用いた(表2)。非浸潤性(pT1以下)は43例、浸潤癌(pT2以上)は7例であった。経尿道的腫瘍切除術による膀胱温存治療は46例、膀胱全摘術は4例に行われた。いずれの患者も過去に放射線治療や抗癌剤による化学療法の既往はなかった。腫瘍の分化度はWHO基準により、腫瘍の病期はTNM分類により分類された。膀胱温存治療をうけた患者は3ヶ月毎の膀胱鏡検査および尿細胞診検査、膀胱全摘術をうけた患者は6ヶ月毎の胸腹部のCTによる画像診断、1年に一度の骨シンチグラムにより経過観察された。
タッチ検体は10%ホルマリン/メタノール液で固定(25℃、20分間)後、PBSで洗浄、PBS溶解0.5% Triton X液にて透徹(25℃、5分間)させた後ブロッキング溶液(PBS溶解10%ヤギ血清)に1時間接触させ実験に用いた。中心体免疫蛍光染色にはウサギ抗ペリセントリンポリクローナル抗体(Covance社、Burkely)を一次抗体として使用した。Alexa594を蛍光色素とする抗ウサギIgG抗体(Molecular Probe社、Eugene)を二次抗体として37℃1時間接触させることにより、上記の抗原−抗体複合物に特異的に結合させた。結合体は、倍率1000倍視野の蛍光顕微鏡(オリンパス社、東京)により検出した。
患者臨床背景因子と臨床検討結果のまとめを表2に示す。合計50例(男性41、女性9、平均年齢66.9歳[33歳から88歳まで])について検討した。病理組織学的分化度はgrade 1:5,grade 2:31,grade 3:14例であり、病理組織学的病期(深達度)はpTa:9,pT1:34,pT2:7例である。
平均43.3ヶ月(範囲4−94ヶ月)の観察期間中に、非浸潤性膀胱癌患者(pTaまたはpT1)43例中23例(53.5%)に腫瘍再発をみとめた。CH‐症例はCH+症例に比べ有意に非再発期間の延長を認めた(図2A,P=0.0028,log‐rank test)。腫瘍分化度grade2と判定された非浸潤性膀胱癌患者においてもCH‐症例はCH+症例に比べ有意に非再発期間の延長を認めた(図2B,P=0.0129,l g‐rank test)。多変量解析においてCH+は非浸潤性膀胱癌の再発予測における最も強い予後予測因子であることが証明された(表4,ハザード比1.882,95%信頼限界1.161‐3.325,P=0.0094)。
CH+症例で染色体不安定性を有しない症例は30%であったが、染色体不安定性を有しCH+であった症例は95.5%であり、CH‐であった症例は4.5%であったことより、中心体過剰複製の発生は染色体不安定性に先行することが示唆される。これらの所見を総合すると中心体過剰複製は癌発生の初期段階より出現する変異であり、染色体不安定性を惹起する事により最終的に悪性度のより高い腫瘍を誘導するのではないかと推定される。
術後補助療法として、放射線併用抗癌剤化学療法をうけた患者のデータは中心体複製異常の確認が術後補助療法の治療方針決定に応用できることを示唆している。
Claims (3)
- 膀胱移行上皮癌に侵食された臓器組織切除手術後の患者の予後の検出において、患者の切除組織あるいは、尿中に存在する細胞について、その細胞の中心体を2段階抗原抗体反応により標識し、標識された中心体数の数値を蛍光顕微鏡下で測定し、3個以上の中心体が存在する中心体複製異常細胞が全細胞中に5%以上存在するか否かにより再発および進展の可能性の有無を検出することを特徴とする膀胱移行上皮癌患者の予後検出方法。
- 細胞の中心体に対し、マウスあるいはウサギに感作して得られた抗体を一次抗体として結合させ、さらに、一次抗体に特異的に結合するIgG蛍光抗体を二次抗体として結合させ、蛍光顕微鏡下で、中心体数の数値を測定し、全細胞中に存在する中心体複製異常の存在率を算出し、再発および進展の指標とする請求項1に記載の膀胱移行上皮癌患者の予後検出方法。
- 少なくとも観察対象の膀胱移行上皮癌患者の切除組織あるいは、尿中に存在する細胞の中心体に結合する一次抗体と、一次抗体に特異的に結合するIgG蛍光二次抗体とを含有し、再発および進展の可能性の有無を検出することを特徴とする膀胱移行上皮癌患者の予後検出用キット。
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