CN103764676A - Kif5b基因和ret基因的融合基因、以及以该融合基因为目标的判断癌症治疗有效性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于,提供一种在癌症中鉴定能够成为预测药剂的治疗有效性的指标的基因、以该基因为目标预测药剂的治疗有效性的新型的方法,并进行了肺腺癌的全转录组测序。其结果,鉴定了KIF5B基因和RET基因的框内融合转录产物。另外,该KIF5B-RET基因融合在日本人肺腺癌的6/319(2%)、美国人肺腺癌的1/80(1%)中被检测出。而且发现,该7例均不显示EGFR、KRAS、ALK癌基因这样的公知的活化突变,因此,判明该基因融合为癌化中的责任突变(驱动突变)。该基因融合被认为是导致RET酪氨酸激酶蛋白的稳定活化的因素,因此,对于检测出该基因融合的患者,以RET酪氨酸激酶抑制剂进行的治疗是有效的。
Description
技术领域
本发明涉及KIF5B基因和RET基因的融合基因。还涉及一种以该融合基因为目标的判断利用RET蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗癌症的有效性的方法。而且,本发明涉及一种利用有该有效性的判断的癌症的治疗方法。另外,本发明还涉及用于这些方法的分子。
背景技术
癌症为日本占死因第一位的疾病,一直谋求其治疗方法的改善。特别是肺癌,不仅在日本,在世界上也是癌症死亡的首要因素,一年间引起100万人以上的死亡。肺癌大致分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌,而且,非小细胞肺癌分为肺腺癌(lung adenocarcinoma,LADC)、肺鳞状上皮癌、大细胞癌3种。而且,其中肺腺癌占非小细胞肺癌的约50%,其频率正在上升(非专利文献1)。
关于肺腺癌,已知相当一部分是因癌基因活化而产生的。而且也得知,在癌基因的活化中,EGFR基因(10~40%)或KRAS基因(10~20%)的体细胞突变、ALK基因和EML4(echinodermmicrotubule-associated protein-like4)基因的融合、或ALK基因和KIF5B基因的融合等(5%)相互排斥地产生(非专利文献2~6)。
在包含肺腺癌的人癌症中,鉴定参与产生癌症的突变基因(突变蛋白质)或融合基因(融合蛋白质)等癌基因大大有助于以这些基因为目标的新型癌症治疗方法或癌症检查方法的开发,因此强烈期望。
特别是在晚期肺癌中,利用药剂的治疗成为主体,但每个病例对药剂的反应性大大不同,所以,正在谋求预测哪种药剂具有治疗效果的方法。因此,如上述那样一直在进行突变基因或融合基因这样的能够成为其预测指标的分子的鉴定,例如已知以EGFR或ALK蛋白为目标的酪氨酸激酶抑制剂对具有EGFR突变或ALK融合的肺腺癌的治疗特别有效。而且,存在于4~5%的肺癌中的ALK酪氨酸激酶基因的融合的检测方法作为ALK蛋白质的酪氨酸激酶抑制剂的适应例的选出方法被开发,并进行了临床试验。
但是,包含肺癌在内的癌症中的融合基因等的阐明还不充分,目前的现状为,期望对能够成为预测利用药剂的治疗有效性的指标的突变基因或融合基因进行鉴定。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Herbst,R.S.等、The New England journal of medicine、2008年、359卷、1367~1380页
非专利文献2:Paez,J.G.等、Science、2004年、304卷、1497~1500页
非专利文献3:Takeuchi,K.等、Clin Cancer Res、2009年、15卷、3143~3149页
非专利文献4:Soda,M.等、Nature、2007年、448卷、561~566页
非专利文献5:Janku,F.等、Nat Rev Clin Oncol、2010年、7卷、401~414页
非专利文献6:Lovly,C.M.等、Nat Rev Clin Oncol、2011年、8卷、68~70页
发明内容
发明要解决的课题
本发明就是鉴于上述现有技术具有的课题而完成的发明,其目的在于,鉴定在肺癌等中能够成为预测利用药剂的治疗有效性的指标的基因。还提供一种以该基因为目标预测利用药剂的治疗有效性的新型的方法。本发明的目的还在于提供一种基于以该基因为目标的利用药剂的治疗有效性的预测而治疗肺癌等的方法。而且,本发明的目的在于提供一种在这些方法中用于该基因的检测的分子。
用于解决课题的方法
本发明的发明人等为了达到上述目的而进行了反复深入的研究,结果发现,通过30例肺腺癌的全转录组测序,鉴定了驱动蛋白家族成员5B(KIF5B)基因和RET受体型酪氨酸激酶癌基因(RET基因)的框内(In-flame)融合转录产物。该融合基因是由第10染色体p11、q11区域间的倒位而产生的。该KIF5B-RET基因融合在日本人肺腺癌的6/319(2%)中被检测出,但检测出该基因融合的6例均不显示EGFR突变、KRAS突变、ALK融合这样的公知的癌基因活化突变。而且,该融合转录产物在来自美国人的肺腺癌中也存在(1/80(1%))。由这些事实得知,该基因融合在广泛的人种中为癌化中的责任突变(驱动突变)。
该基因融合认为是导致RET酪氨酸激酶的稳定活化的因素,产生这种活化的患者认为是RET酪氨酸激酶抑制剂在治疗中显示有效性的。因此,本发明的发明人等发现,可以在肺癌等中以该基因融合为目标预测利用药剂的治疗有效性,而且,如果对在该预测中被判断为利用药剂的治疗有效的患者投与该药剂,则可以有效地进行治疗,从而完成了本发明。
因此,本发明涉及一种KIF5B和RET的融合多肽、以该多肽的存在为指标的判断利用RET酪氨酸激酶抑制剂治疗癌症的有效性的方法、利用有该有效性判断的癌症的治疗方法、以及用于这些方法的分子,更详细而言,提供以下的发明。
(1)一种多肽,其为KIF5B蛋白的N末端部分与RET蛋白的C末端部分融合而成的多肽。
(2)一种多核苷酸,其编码(1)所述的多肽。
(3)一种判断利用RET酪氨酸激酶抑制剂治疗癌症的有效性的方法,其包括检测从患者分离的试样中的(2)所述的多核苷酸存在或不存在的工序,如果检测出上述多核苷酸存在,则判断为上述患者利用上述RET酪氨酸激酶抑制剂治疗癌症的有效性高。
(4)一种药剂,用于通过(3)所述的方法判断利用RET酪氨酸激酶抑制剂治疗癌症的有效性,其含有具有至少15个碱基的链长的下述(a)~(c)所记载的任一种多核苷酸、或下述(d)所记载的抗体,
(a)作为选自与编码KIF5B蛋白的多核苷酸杂交的探针和与编码RET蛋白的多核苷酸杂交的探针中的至少一种探针的多核苷酸,
(b)作为与编码KIF5B蛋白的多核苷酸和编码RET蛋白的多核苷酸的融合点杂交的探针的多核苷酸,
(c)作为以插入编码KIF5B蛋白的多核苷酸与编码RET蛋白的多核苷酸的融合点的方式设计的一对引物的多核苷酸,
(d)与KIF5B蛋白和RET蛋白融合而成的多肽结合的抗体。
(5)一种癌症的治疗方法,其包括将上述RET酪氨酸激酶抑制剂对通过(3)所述的方法判断为利用RET酪氨酸激酶抑制剂治疗癌症的有效性高的患者进行给药的工序。
(6)一种以RET酪氨酸激酶抑制剂作为有效成分的癌症治疗剂,其是对通过(3)所述的方法判断为利用RET酪氨酸激酶抑制剂治疗癌症的有效性高的患者进行给药的治疗剂。
发明的效果
根据本发明,可以预测对癌症治疗的有效性,特别是预测利用RET酪氨酸激酶抑制剂治疗癌症的有效性。由此,可以避免对认为投药无效的癌症患者投与药剂,因此可以实现有效的癌症治疗。
附图说明
[图1]是表示野生型KIF5B和RET蛋白的结构(图1上部的“KIF5B”和“RET”)、在肺腺癌患者中鉴定的4个KIF5B-RET融合突变体(图1下部的“1~4”)及各自的突变体中的切断点(图1上部的“KIF5B”和“RET”所添加的线(1、2、3、4、1-3))的概略图。需要说明的是,图1中,“TM”表示跨膜结构域。
[图2]是表示肺腺癌患者(病例:BR0020)中的KIF5B-RET融合转录产物的概略图。需要说明的是,图2的上部表示双末端读段分析的结果,下部表示接合区读段(junction read)分析的结果。另外,各核酸(A、T、G、C)用各自图中所示的对应的颜色进行识别。
[图3]是表示利用RT-PCR检测各肺腺癌患者中的KIF5B-RET融合(图3的上部)、RET激酶结构域(外显子12-13,图3的中部)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH,内部标准,图3的下部)的结果的电泳照片。需要说明的是,图3中,“T”表示各肺腺癌患者的肺腺癌组织的结果,“N”表示各肺腺癌患者的非癌肺组织的结果(在图5中也同样)。另外,BR0019为KIF5B-RET融合阴性肺腺癌的病例,BR0020、BR1001、BR1002、BR0030、BR1003和BR1004为KIF5B-RET融合阳性肺腺癌的病例(在图5中也同样)。而且,“NTC”表示没有模板DNA的阴性对照的结果。
[图4]是表示利用桑格测序分析KIF5B-RET融合转录产物的cDNA的结果的电泳图。需要说明的是,将使用KIF5B-RET-F1引物和KIF5B-RET-R1引物进行扩增得到的RT-PCR产物使用KIF5B-RET-F1(BR0020、BR1001、BR1002和BR0030)引物以及KIF5B-F-orf2438(BR1003和BR1004)引物直接测序。
[图5]是表示利用基因组PCR检测各肺腺癌患者中的KIF5B-RET融合的结果的电泳照片。图5中,照片的下方表示含有KIF5B基因和RET基因的融合点(切断点结合部)的DNA片段的扩增所的引物的位置。另外,“int”表示内含子,“ex”表示外显子。而且,用星号表示BR0030和BR1004的非癌肺组织中所看到的非特异条带。
[图6]是表示利用桑格测序分析了含有KIF5B基因和RET基因的融合点的基因组片段的结果的电泳图。需要说明的是,PCR产物利用直接测序进行分析,在各自的样品的扩增及测序中使用下述引物。BR0020:KIF5B-int15-F1/KIF5B-RET-R1和RET-int11-R0.5、BR1001:KIF5B-int15-F1/KIF5B-RET-R1和RET-int11-R1、BR1002:KIF5B-int15-F2/RET-int11-R3和KIF5B-int15-F3.5、BR0030:KIF5B-ex16-F1/KIF5B-RET-R1和KIF5B-ex16-F1、BR1003:KIF5B-ex23-F1/KIF5B-RET-R1和KIF5B-ex23-F1,另外,融合点中的重复核苷酸用BR1002和BR0030所附的方框表示,KIF5B基因和RET基因的融合点中的插入(insertion)核苷酸用BR1001和BR1003所附的方框表示。
[图7]是表示利用桑格测序分析含有KIF5B-RET融合点的基因组片段的结果(特别是含有RET外显子7-RET内含子7的349bp的基因组片段插入于切断点结合部)的电泳图。需要说明的是,将使用KIF5B-ex24-F1引物和RET-int7-R1引物扩增得到的PCR产物使用RET-int7-R2引物直接测序。
[图8]是表示研究了KIF5B基因和RET基因融合的6个病例中的2个病例(BR0020和BR1001)中10号染色体的基因组拷贝数的结果的概略图。需要说明的是,拷贝数利用CNAG程序分析进行推定(在图9中也同样)。另外,图中,参考基因组上的KIF5B基因和RET基因的位置及方向利用箭头表示(在图9中也同样)。
[图9]是表示研究KIF5B基因和RET基因融合的6个病例中的2个病例(BR0012和BR0005)中10号染色体的基因组拷贝数的结果的概略图。
[图10]是表示参与KIF5B-RET融合的推定染色体重构(突变体1)的概略图。
[图11]是表示利用使用荧光标记的DNA探针而施行的原位杂交检测出的BR0020病例中产生KIF5B-RET融合的染色体倒位的显微镜照片(观察倍数:400倍)。在该病例中,检测出在比RET基因的激酶结构域的编码区域更靠5’侧的上游区域杂交的探针(5’RET,图中红色的荧光点)、和在RET基因的激酶结构域的编码区域及比该编码区域更靠3’侧的下游区域杂交的探针(3’RET,图中绿色的荧光点)的信号的分离(split,用图中箭头指示的地方)。另外,在图11的下部表示各探针组基因组上杂交的位置。
[图12]是表示进行了苏木精-伊红染色的KIF5B-RET融合阳性肺腺癌(BR1004)中的代表的组织结构的显微镜照片(观察倍数:50倍)。需要说明的是,在该肺腺癌细胞中,看到克拉拉(Clara)细胞或II型肺上皮细胞分化。另外,这些肿瘤细胞沿肥厚的肺胞壁伸长至肿瘤边缘部(左侧的载玻片)。而且,在其中央部也看到乳头状的增殖(右侧的载玻片)。
[图13]是表示对甲状腺转录因子-1(TTF-1)进行了免疫染色的KIF5B-RET融合阳性肺腺癌(BR1004)中的代表性组织结构的显微镜照片(观察倍数:50倍)。需要说明的是,在该肺腺癌细胞中,观察到TTF-1在核中弥漫性很强的表达。
[图14]是表示利用U133APlus2.0微阵列分析评价了肺腺癌(ADC)及非癌肺组织(N)中的RET表达水平的结果的标绘图。需要说明的是,RET的表达水平使用211421s at探针(ret proto-oncogene(multipleendocrine neoplasia and medullary thyroid carcinoma1,Hirschsprungdisease))进行评价。另外,图14中,“+”表示KIF5B-RET融合阳性肺腺癌的评价结果,“-”表示KIF5B-RET融合阴性肺腺癌的评价结果。而且,图14中的P值是利用U检验评价表达水平之差而得到的值。
[图15]是表示KIF5B-RET融合阳性肺腺癌肿瘤样品(BR1004)中的RET蛋白的免疫组织学染色结果的显微镜照片(观察倍数:50倍)。需要说明的是,在该肺腺癌肿瘤样品中,看到RET蛋白在腺癌细胞的细胞质中以颗粒状表达。
[图16]是表示研究没有看到RET融合、但RET基因的表达水平高的2个病例中10号染色体的基因组拷贝数的结果的概略图。需要说明的是,拷贝数利用CNAG程序分析进行推定。另外,图中,KIF5B基因及RET基因的位置及方向利用箭头表示。
[图17]是表示沿RET子转录产物(NM_020975.4)显示来自肺腺癌及非癌肺组织的序列读段分布的结果的图。需要说明的是,来自KIF5B-RET融合阳性样品BR0020的序列读段大致位于融合点的下游。另一方面,在没有确认融合、但看到RET基因表达的6个样品(图17中,利用星号标记的样品)中,序列读段遍及RET转录产物整体分布,另外,没有检测出突变。需要说明的是,图17中,“RET表达”表示利用寡聚核苷酸微阵列评价的RET表达水平。
[图18]是表示在来自USA群体的肺腺癌病例中,利用RT-PCR检测KIF5B-RET融合转录产物(突变体1,图18的上部)及GAPDH(内部标准,图18的下部)的结果的电泳照片。需要说明的是,图18中,“T”表示上述群体的肺腺癌组织的结果,“N”表示上述群体的非癌肺组织的结果。“USA1580”表示来自USA群体的肺腺癌病例。
[图19]是表示利用桑格测序分析了来自USA群体的肺腺癌病例中的KIF5B-RET融合转录产物(突变体1)的cDNA的结果的电泳图。
具体实施方式
<KIF5B-RET融合多肽及编码该多肽的多核苷酸>
如后述的实施例中所示,KIF5B蛋白和RET蛋白的融合例最初在肺腺癌中得知。因此,本发明提供一种KIF5B蛋白的N末端部分和RET蛋白的C末端部分融合的多肽(以下也称为“KIF5B-RET融合多肽”)。本发明还提供一种编码该多肽的多核苷酸(以下也称为“KIF5B-RET融合多核苷酸”)。
本发明中上述的“KIF5B(驱动蛋白家族成员5B,KINESINFAMILY MEMBER5B)蛋白”也称为KNS1(驱动蛋白1,KINESIN1)蛋白、UKHC(驱动蛋白,重链,普遍存在的、KINESINHEAVY CHAIN,UBIQUITOUS)蛋白或KINH蛋白,是在人体中以定位于10p11.2的基因所编码的蛋白质。在本发明中,“KIF5B蛋白”只要是来自人的蛋白质即可,典型而言,是由序列号2所记载的氨基酸序列构成的蛋白质。而且,在本发明中,“KIF5B蛋白的N末端部分”典型而言为包含位于上述KIF5B蛋白的N末端侧的马达区和卷曲螺旋结构域的一部分或全部的部分(参照图1)。
本发明中上述的“RET(转染重排,REARRANGED DURINGTRANSFECTION)蛋白”也称为RET酪氨酸激酶蛋白或RET受体型酪氨酸激酶蛋白,是在人体中以定位于10q11.2的基因所编码的蛋白质。在本发明中,“RET蛋白”只要是来自人的蛋白质即可,典型而言,是由序列号为4记载的氨基酸序列构成的蛋白质。而且,在本发明中,“RET蛋白的C末端部分”典型而言包含位于上述RET蛋白的C末端侧的激酶结构域(参照图1)。
另外,作为本发明的“KIF5B蛋白的N末端部分和RET蛋白的C末端部分融合而成的多肽”,如后述的实施例中所示,是由10p11.2和10q11.2的区域间的倒位产生的融合基因所编码的多肽即可,典型而言,是包含位于上述KIF5B蛋白的N末端侧的马达区和卷曲螺旋结构域的一部分或全部的多肽以及包含位于上述RET蛋白的C末端侧的激酶结构域的多肽融合而成的多肽,例如是由序列号6、8、10或12中记载的氨基酸序列构成的多肽。
本发明中上述的“KIF5B蛋白”、“RET蛋白”及“KIF5B-RET融合多肽”的氨基酸序列可以在自然界中(即非人工性地)发生突变。另外,也可以人为地向氨基酸导入突变。因此,这种突变体也包含在本发明中。
作为KIF5B-RET融合多肽的突变体,可列举由序列号6、8、10或12中记载的氨基酸序列中将1个或多个氨基酸进行了取代、缺失、添加和/或插入后的氨基酸序列构成的蛋白质。在此,“多个”通常为50个氨基酸以内,优选30个氨基酸以内,更优选10个氨基酸以内,特别优选数个的氨基酸以内(例如5个氨基酸以内、3个氨基酸以内、2个氨基酸以内、1个氨基酸)。
另外,作为KIF5B-RET融合多肽的突变体,可列举与由序列号5、7、9或11中记载的碱基序列构成的DNA在严格条件下杂交的DNA所编码的多肽。作为高严格度的杂交条件,可列举例如0.2×SSC、65℃的条件,作为低严格度的杂交条件,可列举例如2.0×SSC、50℃的条件。
而且,作为KIF5B-RET融合多肽的突变体,可列举与由序列号6、8、10或12中记载的氨基酸序列具有80%以上(例如85%、90%、95%、97%、99%以上)的相同性的氨基酸序列构成的多肽。序列的相同性可以利用BLASTX或BLASTP(氨基酸水平)的程序(Altschul et al.J.Mol.Biol.,215:403-410,1990)而确定。该程序以利用Karlin及Altschul的算法BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:2264-2268,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873-5877,1993)为基础。在利用BLASTX等分析氨基酸序列的情况下,参数设定为例如score=50、wordlength=3。另外,使用Gapped BLAST程序分析氨基酸序列的情况下,可以以Altschul等(Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997)中记载的方式进行。在使用BLAST和Gapped BLAST程序的情况下,使用各程序的默认参数。这些分析方法的具体方法为公知的。
在本发明的“编码KIF5B-RET融合多肽的多核苷酸”中,包括编码该多肽的mRNA、编码该多肽的cDNA、编码该多肽的基因组DNA等。本发明的编码KIF5B-RET多肽的cDNA的典型例为由序列号5、7、9或11中记载的DNA序列构成的多核苷酸。
需要说明的是,就本发明的多核苷酸而言,只要是本领域技术人员,就可以从由保持KIF5B基因和RET基因的融合基因的肺腺癌等制备的cDNA文库或基因组DNA文库中利用公知的杂交技术而提取。另外,也可以通过以上述由肺腺癌等制备的mRNA、cDNA或基因组DNA为模板利用公知的基因扩增技术(PCR)来扩增、制备。而且,也可以以天然型KIF5B基因和天然型RET基因的cDNA为材料,利用PCR、限制性内切酶处理、定位诱变(site-directed mutagenesis)法(Kramer,W.&Fritz,HJ.,Methods Enzymol,1987,154,350.)等公知的基因扩增技术或重组技术而制备。
进而,通过将这样制备的多核苷酸插入适当的表达载体中并将该载体导入无细胞蛋白质合成体系(例如网织红细胞提取液、小麦胚芽提取液)而进行培育,另外通过将该载体导入适当的细胞(例如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞)中,将得到的转化体进行培养,由此可以制备本发明的多肽。
<判断利用RET酪氨酸激酶抑制剂治疗癌症的有效性的方法>
如后述的实施例中所示,得知:KIF5B基因和RET基因的融合为癌症中的责任突变,通过该融合而产生RET酪氨酸激酶蛋白的表达亢进,进而产生RET酪氨酸激酶蛋白的稳定活化,有助于癌的恶性化等。因此,在检测出这种融合的癌症患者中,利用RET酪氨酸激酶抑制剂治疗有效的可能性高。
因此,本发明提供一种判断利用RET酪氨酸激酶抑制剂治疗癌症的有效性的方法,该方法包括检测从患者分离的试样中的KIF5B-RET融合多核苷酸存在或不存在的工序,如果检测出上述多核苷酸存在,则判断为上述患者的上述利用上述RET酪氨酸激酶抑制剂治疗癌症的有效性高。
本发明中,“患者”不仅是患有癌症的人,也可以为怀疑是患有癌症的人。作为成为适用本发明的方法的对象的“癌”,只要是看到KIF5B基因和RET基因的融合基因的表达的癌,就没有特别限制。优选为肺癌,进一步优选为非小细胞肺癌,特别优选为肺腺癌。
本发明中,“试样”不仅包含生物体试样(例如细胞、组织、脏器、体液(血液、淋巴液等)、消化液、痰、肺胞-支气管清洗液、尿、便),也包含由这些生物体试样得到的核酸提取物(基因组DNA提取物、mRNA提取物、由mRNA提取物制备的cDNA制备物或cRNA制备物等)和蛋白质提取物。另外,对上述试样可以实施福尔马林固定处理、醇固定处理、冷冻处理或石蜡包埋处理。
而且,就基因组DNA、mRNA、cDNA或蛋白质而言,只要是本领域技术人员,就可以考虑上述试样的种类及状态等而选择适合的公知方法来制备。
在本发明中,作为成为评价癌症治疗的有效性的对象的“RET酪氨酸激酶抑制剂”,只要是可以直接或间接性地抑制RET酪氨酸激酶的功能的物质,就没有特别限制。只要可以抑制RET酪氨酸激酶,则也可以为抑制其它酪氨酸激酶的物质。作为可以适用于本发明的公知的RET酪氨酸激酶抑制剂,可列举例如:4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(通用名:凡德他尼(Vandetanib);以VEGFR、EGFR及RET为目标的化合物)、4-[4-[3-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]酰脲]苯氧基]-N-甲基吡啶-2-羧酰胺(通用名:索拉非尼(Sorafenib);以BRAF及RET等为目标的化合物)、N-[2-(二乙基氨基)乙基]-5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1,2-二氢-3H-吲哚-3-茚)甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酰胺单[(2S)-2-羟基琥珀酸酯](通用名:舒尼替尼(Sunitinib);以PDGFR、VEGFR、RET等为目标的化合物)、N-(3,3-二甲基吲哚啉-6-基)-2-(吡啶-4-基甲基氨基)烟酰胺(通用名:莫特塞尼(Motesanib);以PDGFR、VEGFR、RET等为目标的化合物)、XL184/卡博替尼胶囊(XL184/Cabozantinib;以VEGFR、MET、RET等为目标的化合物)。
本发明中,“KIF5B-RET融合多核苷酸存在或不存在的检测”可以以编码上述融合多肽的基因组DNA或来自上述基因组DNA的转录产物为对象直接性地进行,也可以以来自上述转录产物的翻译产物(上述融合多肽)为对象间接性地进行。
另外,上述编码融合多肽的基因组DNA是由10p11.2和10q11.2的区域间的倒位形成的,因此,在“KIF5B-RET融合多核苷酸存在或不存在的检测”中,也可以检测该倒位的现象。在该倒位的检测中,可以检测例如比RET基因的激酶结构域的编码区域更靠5’侧的上游区域和RET基因的激酶结构域的编码区域及比该编码区域更靠3’侧的下游区域的分离,另外,还可以检测RET基因的钙粘素重复子的编码区域及比该区域更靠5’侧的上游区域和RET基因的跨膜结构域的编码区域及比该编码区域更靠3’侧的下游区域的分离,而且,还可以检测KIF5B基因的卷曲螺旋结构域的一部分或全部的编码区域及比该编码区域更靠5’侧的上游区域和比KIF5B基因的卷曲螺旋结构域的编码区域更靠3’侧的下游区域的分离。
在本发明中的“KIF5B-RET融合多核苷酸存在或不存在的检测”中可以使用公知方法。在以“编码上述编码融合多肽的基因组DNA”为对象的情况下,可以采用例如使用荧光等的原位杂交(ISH)、基因组PCR法、直接测序、Southern印迹法、基因组微阵列分析。另外,在以“来自上述基因组DNA的转录产物”为对象的情况下,可以采用例如RT-PCR法、直接测序、Northern印迹法、斑点杂交法、cDNA微阵列分析。
治疗或诊断的过程中得到的生物体试样(活检样品等)大多进行福尔马林固定,在该情况下,从作为检测对象的基因组DNA在福尔马林固定下也稳定、检测灵敏度高的观点出发,优选使用原位杂交。
在原位杂交中,通过使具有至少15个碱基的链长的下述(a)或(b)中记载的多核苷酸与上述生物体试样杂交,可以检测编码KIF5B-RET融合多肽的基因组DNA。
(a)作为选自与编码KIF5B蛋白的多核苷酸杂交的探针和与编码RET蛋白的多核苷酸杂交的探针中的至少一种探针的多核苷酸,
(b)作为与编码KIF5B蛋白的多核苷酸和编码RET蛋白的多核苷酸的融合点杂交的探针的多核苷酸。
本发明中的上述编码KIF5B蛋白的多核苷酸只要是来自人的多核苷酸即可,典型而言,为由Genbank登录号NT_008705.16确定的基因组序列中的第32237938~32285371的DNA序列构成的基因。
另外,本发明中的上述编码RET蛋白的多核苷酸只要是来自人的多核苷酸即可,典型而言,为由Genbank登录号NT_033985.7确定的基因组序列中的第1217582~1270862的DNA序列构成的基因。
但是,基因的DNA序列通过其突变等可以在自然界中(即非人工性地)发生突变。因此,这种天然的突变体也能够成为本发明的对象(以下同样)。
本发明的(a)中记载的多核苷酸只要是通过与作为该多核苷酸的目标碱基序列的编码KIF5B蛋白的多核苷酸或编码RET蛋白的多核苷酸杂交而可以检测出上述生物体试样中的编码KIF5B-RET融合多肽的基因组DNA的存在的多核苷酸即可,优选为下述(a1)~(a4)中记载的多核苷酸。
(a1)与KIF5B基因的卷曲螺旋结构域的一部分或全部的编码区域及比该编码区域更靠5’侧的上游区域杂交的多核苷酸(以下也称为“5’KIF5B探针1”)和与RET基因的激酶结构域的编码区域及比该编码区域更靠3’侧的下游区域杂交的多核苷酸(以下也称为“3’RET探针1”)的组合,
(a2)与比RET基因的激酶结构域的编码区域更靠5’侧的上游区域杂交的多核苷酸(以下也称为“5’RET探针1”)和RET基因的激酶结构域的编码区域及比该编码区域更靠3’侧的下游区域杂交的多核苷酸(3’RET探针1)的组合,
(a3)与RET基因的钙粘素重复子的编码区域及比该区域更靠5’侧的上游区域杂交的多核苷酸(以下也称为“5’RET探针2”)和与RET基因的跨膜结构域的编码区域及比该编码区域更靠3’侧的下游区域杂交的多核苷酸(以下也称为“3’RET探针2”)的组合,
(a4)与KIF5B基因的卷曲螺旋结构域的一部分或全部的编码区域及比该编码区域更靠5’侧的上游区域杂交的多核苷酸(5’KIF5B探针1)和比KIF5B基因的卷曲螺旋结构域的编码区域更靠3’侧的下游区域杂交的多核苷酸(以下也称为“3’KIF5B探针1”)的组合。
在本发明中,作为用于原位杂交的上述(a1)中记载的多核苷酸所杂交的区域(目标碱基序列),从对于目标碱基序列的特异性及检测灵敏度的观点出发,优选为从KIF5B基因和RET基因的融合点1000000个碱基以内的区域,另外,作为用于原位杂交的上述(a2)~(a4)中记载的多核苷酸杂交的区域,从相同的观点出发,优选为从KIF5B基因或RET基因中的切断点1000000个碱基以内的区域。
另外,在本发明中,用于原位杂交的上述(b)中记载的多核苷酸只要是通过与作为该多核苷酸的目标碱基序列的编码KIF5B蛋白的多核苷酸和编码RET蛋白的多核苷酸的融合点杂交而可以检测出上述生物体试样中的编码KIF5B-RET融合多肽的基因组DNA的存在的多核苷酸即可,作为典型例,为与编码由序列号5、7、9或11中记载的碱基序列构成的多核苷酸的基因组DNA杂交的多核苷酸,例如与图6及7中记载的KIF5B基因和RET基因的融合点杂交的多核苷酸。
另外,在本发明中,从对于目标碱基序列的特异性及检测的灵敏度的观点出发,用于原位杂交的上述(a)或(b)中记载的多核苷酸优选为可以覆盖上述目标碱基序列整体的、由多种多核苷酸构成的集团。在上述的情况下,构成该集团的多核苷酸的长度至少为15个碱基,优选为100~1000个碱基。
为了检测,用于原位杂交的上述(a)或(b)中记载的多核苷酸优选利用荧光色素等进行标记。作为上述的荧光色素,可列举例如DEAC、FITC、R6G、TexRed、Cy5,但并不限于这些物质。另外,除荧光色素之外,还可以利用DAB等色素(chromogen:色原)或基于酶的金属沉淀而通过银等标记上述多核苷酸。
在原位杂交中,在使用5’KIF1B探针1和3’RET探针1的情况下、使用5’RET探针1和3’RET探针1的情况下、使用5’RET探针2和3’RET探针2的情况下、使用5’KIF1B探针1和3’KIF1B探针1的情况下,这些探针优选用互不相同的色素进行标记。而且,在使用这样用不同的色素标记的探针的组合进行原位杂交的情况下,在观察到5’KIF1B探针1的标记发出的信号(例如荧光)和3’RET探针1的标记发出的信号的重叠时,可以判断为能够检测出编码KIF5B-RET融合多肽的基因组DNA。另一方面,在观察到5’RET探针1的标记发出的信号和3’RET探针1的标记发出的信号的分离、5’RET探针2的标记发出的信号和3’RET探针2的标记发出的信号的分离或5’KIF1B探针1的标记发出的信号和3’KIF1B探针1的标记发出的信号的分离时,可以判断为能够检测出编码KIF5B-RET融合多肽的基因组DNA。
需要说明的是,多核苷酸的标记可以利用公知方法进行。例如,可以利用切口平移法或随机引物法,将利用荧光色素等标记的底物碱基引入多核苷酸中,标记该多核苷酸。
在原位杂交中,使上述(a)或(b)中记载的多核苷酸与上述生物体试样杂交时的条件可以因该多核苷酸的长度等各种因素而变动,作为高严格度的杂交的条件,可列举例如0.2×SSC、65℃的条件,作为低严格度的杂交的条件,可列举例如2.0×SSC、50℃的条件。需要说明的是,只要是本领域技术人员,除盐浓度(SSC的稀释率等)和温度之外,可以通过适当选择例如表面活性剂(NP-40等)的浓度、甲酰胺的浓度、pH等各种条件来实现与上述条件同样的严格度的杂交的条件。
作为使用上述(a)或(b)中记载的多核苷酸检测编码KIF5B-RET融合多肽的基因组DNA的方法,除上述原位杂交之外,可列举:Southern印迹法、Northern印迹法及斑点杂交法。在这些方法中,通过使上述(a)或(b)中记载的多核苷酸与转印有由上述生物体试样得到的核酸提取物的膜杂交而检测上述融合基因。在使用上述(a)的多核苷酸的情况下,与编码KIF5B蛋白的多核苷酸杂交的多核苷酸和与编码RET蛋白的多核苷酸杂交的多核苷酸识别为在膜中被展开的相同条带时,可以判断为能够检测出编码KIF5B-RET融合多肽的基因组DNA。
作为使用上述(b)的多核苷酸检测编码KIF5B-RET融合多肽的基因组DNA的方法,还可列举基因组微阵列分析或DNA微阵列分析。在这些方法中,制作在基板上固定有上述(b)的多核苷酸的阵列,使上述生物体试样与该阵列上的多核苷酸接触,由此检测该基因组DNA。
在PCR或测序中,为了以由上述生物体试样制备的DNA(基因组DNA、cDNA)或RNA为模板特异性地扩增KIF5B-RET融合多核苷酸的一部分或全部,可以使用下述(c)的多核苷酸。
(c)作为以插入编码KIF5B蛋白的多核苷酸和编码RET蛋白的多核苷酸的融合点的方式设计的一对引物的多核苷酸
“作为一对引物的多核苷酸”为在作为目标的上述融合多核苷酸等碱基序列中,一个引物与编码KIF5B蛋白的多核苷酸杂交,另一引物与编码RET蛋白的多核苷酸杂交的引物组。这些多核苷酸的长度通常为15~100个碱基,优选为17~30个碱基。
另外,从利用PCR法进行检测的精度或灵敏度的观点出发,本发明的(c)中记载的多核苷酸优选为与编码KIF5B蛋白的多核苷酸和编码RET蛋白的多核苷酸的融合点至5000个碱基内的上述融合多核苷酸的碱基序列互补的序列。
“作为一对引物的多核苷酸”可以基于作为目标的KIF5B-RET融合多核苷酸等碱基序列,利用公知方法而适当设计。作为公知方法,可列举例如利用Primer Express软件(注册商标,ABI公司制)的方法。
作为“作为一对引物的多核苷酸”的优选的例子,可列举包含选自KIF5B-RET-F1、KIF5B-int15-F1、KIF5B-int15-F2、KIF5B-ex16-F1、KIF5B-ex23-F1、KIF5B-ex24-F1、KIF5B-F-orf2438及KIF5B-int15-F3.5中的1个引物和选自KIF5B-RET-R1、RET-int11-R3、RET-int7-R1、RET-int11-R0.5、RET-int11-R1、RET-int7-R2及RET-R-orf2364中的1个引物的引物组,更优选列举KIF5B-RET-F1和KIF5B-RET-R1、KIF5B-int15-F1和KIF5B-RET-R1、KIF5B-int15-F2和RET-int11-R3、KIF5B-ex16-F1和KIF5B-RET-R1、KIF5B-ex23-F1和KIF5B-RET-R1、KIF5B-ex24-F1引物和RET-int7-R1引物。需要说明的是,关于这些引物的序列以及杂交的基因的位置,参照后述的表1及序列表。
在本发明中,作为检测KIF5B-RET融合多核苷酸的翻译产物的方法,可列举例如:免疫染色法、Western印迹法、ELISA法、流式细胞法、免疫沉降法、抗体阵列分析。在这些方法中,可使用与KIF5B-RET融合多肽结合的抗体。作为上述抗体,可列举例如:对含有KIF5B蛋白和RET蛋白的融合点的多肽特异性的抗体(以下也称为“融合点特异性抗体”)、与RET蛋白的比上述融合点靠近C末端侧的区域构成的多肽结合的抗体(以下也称为“RET-C末抗体”)、与KIF5B蛋白的比上述融合点靠近N末端侧的区域构成的多肽结合的抗体(以下也称为“KIF5B-N末抗体”)。在此,“融合点特异性抗体”是指:与含有上述融合点的多肽特异性地结合,但不与野生型(正常型)KIF5B蛋白及野生型(正常型)RET蛋白的任一种结合的抗体。
KIF5B-RET融合多肽可以利用上述融合点特异性抗体、另外可以利用上述RET-C末抗体和上述KIF5B-N末抗体的组合来检测。但是,例如在正常肺细胞中,几乎检测不到RET蛋白的表达,因此,在免疫染色法中,即使在单独使用RET-C末抗体的情况下,也可以检测出肺腺癌组织中的KIF5B-RET融合多肽的存在。
只要是本领域技术人员,就可以选择适当的公知方法制备“与KIF5B-RET融合多肽结合的抗体”。作为上述的公知方法,可列举:将由上述RET蛋白的C末端部分构成的多肽、KIF5B-RET融合多肽、由上述KIF5B蛋白的N末端部分构成的多肽等接种于免疫动物,使该动物的免疫系统活化,然后回收该动物的血清(多克隆抗体)的方法;杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体展示法等单克隆抗体的制作方法。只要采用结合了标记物质的抗体,就可以通过检测该标记而直接检测目标蛋白质。作为标记物质,只要是可以与抗体结合且能够检测的物质,就没有特别限制,可列举例如:过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、微过氧化物酶、辣根过氧化物酶(HRP)、异硫氰酸荧光素(FITC)、异硫氰酸罗丹明(RITC)、碱性磷酸酶、生物素及放射性物质等。而且,除采用结合了标记物质的抗体直接检测目标蛋白质的方法之外,也可以利用采用结合了标记物质的二次抗体、蛋白G或蛋白A等间接性地检测目标蛋白质的方法。
利用上述方法,在从患者中分离的试样中检测出KIF5B-RET融合多核苷酸的存在的情况下,该患者被判断为利用RET酪氨酸激酶抑制剂治疗癌症的有效性高,另一方面,在没有检测出KIF5B-RET融合多核苷酸的存在的情况下,该患者被判断为利用RET酪氨酸激酶抑制剂治疗癌症的有效性低。
<用于判断利用RET酪氨酸激酶抑制剂治疗癌症的有效性的药剂>
如上所述,作为具有至少15个碱基的链长的下述(a)~(c)中记载的任一种多核苷酸可以适用于检测KIF5B-RET融合多核苷酸的存在或不存在。
(a)作为选自与编码KIF5B蛋白的多核苷酸杂交的探针和与编码RET蛋白的多核苷酸杂交的探针中的至少一种探针的多核苷酸,
(b)作为与编码KIF5B蛋白的多核苷酸和编码RET蛋白的多核苷酸的融合点杂交的探针的多核苷酸,
(c)作为以插入编码KIF5B蛋白的多核苷酸与编码RET蛋白的多核苷酸的融合点的方式设计的一对引物的多核苷酸。
因此,本发明还提供一种含有这些多核苷酸的、用于判断利用RET酪氨酸激酶抑制剂治疗癌症的有效性的药剂。
这些多核苷酸具有与目标基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。在此,就“互补的”而言,只要可以进行杂交,则也可以不是完全互补的。这些多核苷酸相对于该特定的碱基序列通常具有80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、特别优选100%的相同性。
需要说明的是,(a)~(c)的多核苷酸可以为DNA,也可以为RNA,另外,可以为在其一部分或全部被PNA(polyamide nucleicacid,肽核酸)、LNA(注册商标,locked nucleic acid、Bridged NucleicAcid,交联核酸)、ENA(注册商标,2’-O,4’-C-Ethylene-bridged nucleicacids)、GNA(Glycerol nucleic acid,甘油核酸)、TNA(Threosenucleic acid,苏糖核酸)等人工核酸取代了核苷酸的多核苷酸。
另外,如上所述,与KIF5B-RET融合多肽结合的抗体可以适用于KIF5B-RET融合多核苷酸的翻译产物的检测。因此,本发明还提供一种含有该抗体的、用于判断利用RET酪氨酸激酶抑制剂治疗癌症的有效性的药剂。
在本发明的药剂中,除作为有效成分的上述物质(多核苷酸、抗体)之外,可以含有药理学上可接受的其它成分。作为这种其它成分,可列举例如:缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、生理食盐等。作为缓冲剂,可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐等。作为乳化剂,可以使用阿拉伯胶、藻酸钠、黄蓍胶等。作为悬浮剂,可以使用单硬脂酸甘油、单硬脂酸铝、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、十二烷基硫酸钠等。作为稳定剂,可以使用丙二醇、二乙氨基亚硫酸盐、抗坏血酸等。作为防腐剂,可以使用叠氮钠、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。
另外,除含有多核苷酸和抗体的标准品之外,也可以将检测多核苷酸或抗体所附加的标记所需要的底物、阳性对照(例如KIF5B-RET融合多核苷酸、KIF5B-RET融合多肽、或保持它们的细胞等)或阴性对照、在原位杂交等中使用的对比染色用试剂(DAPI等)、抗体的检测中需要的分子(例如二次抗体、蛋白G、蛋白A)、用于试样的稀释或清洗的缓冲液等标准品组合,做成用于使用本发明的方法的试剂盒。在该试剂盒中可以包含该试剂盒的使用说明书。本发明还提供一种用于使用上述本发明的方法的试剂盒。
<治疗癌症的方法、癌症治疗剂>
如上所述,利用本发明的方法检测出KIF5B-RET融合多核苷酸的存在的患者认为利用RET酪氨酸激酶抑制剂治疗癌症的有效性高。因此,通过对癌症患者中的保持KIF5B基因和RET基因的融合基因的患者选择性地投与RET酪氨酸激酶抑制剂,可以有效地进行癌症的治疗。因此,本发明提供一种治疗癌症的方法,其包括将上述RET酪氨酸激酶抑制剂对通过本发明的方法判断为利用RET酪氨酸激酶抑制剂治疗癌症的有效性高的患者进行给药的工序。
另外,本发明提供一种癌症治疗剂,其以RET酪氨酸激酶抑制剂作为有效成分,其是对通过上述本发明的方法判断为利用RET酪氨酸激酶抑制剂治疗癌症的有效性高的患者进行给药的治疗剂。
作为“RET酪氨酸激酶抑制剂”,如上所述,只要是可以直接或间接性地抑制RET酪氨酸激酶的功能的物质,就没有特别限制。只要可以抑制RET酪氨酸激酶,则也可以为抑制其它酪氨酸激酶的物质。作为可以适用于本发明的公知的RET酪氨酸激酶抑制剂,可列举例如:4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(通用名:凡德他尼(Vandetanib);以VEGFR、EGFR及RET为目标的化合物)、4-[4-[3-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]酰脲]苯氧基]-N-甲基吡啶-2-羧酰胺(通用名:索拉非尼(Sorafenib);以BRAF及RET等为目标的化合物)、N-[2-(二乙基氨基)乙基]-5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1,2-二氢-3H-吲哚-3-茚)甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酰胺单[(2S)-2-羟基琥珀酸酯](通用名:舒尼替尼(Sunitinib);以PDGFR、VEGFR、RET等为目标的化合物)、N-(3,3-二甲基吲哚啉-6-基)-2-(吡啶-4-基甲基氨基)烟酰胺(通用名:莫特塞尼(Motesanib);以PDGFR、VEGFR、RET等为目标的化合物)、XL184/卡博替尼胶囊(XL184/Cabozantinib;以VEGFR、MET、RET等为目标的化合物)。
对患者投与RET酪氨酸激酶抑制剂的方法根据该抑制剂的种类或癌症的种类等而适当选择,可以采用例如口服、静脉内、腹腔内、经皮、肌肉内、气管内(气雾剂)、直肠内、阴道内等给药方式。
实施例
以下,基于实施例更具体地说明本发明,但本发明并不限定于以下的实施例。
<样品>
日本人群体包含在1997年至2008年在国立癌研究中心中央医院接受了外科的切除的319例的肺腺癌患者。USA(UMD)群体在1987年至2009年在巴尔的摩大都市圈(Metropolitan Baltimore)地区的医院被招募。另外,全部的肿瘤按照恶性肿瘤的TNM分类进行了病理诊断。
总RNA从粗略切分并冻结的组织样品中按照制造者的指导使用三唑试剂提取,使用型号2100生物分析仪(model2100bioanalyzer,安捷伦科技社制)进行品质检定。结果,显示全部的样品超过6的RIN(RNA integrity number)值。另外,使用QIAamp DNA小量提取试剂盒(注册商标,Qiagen公司制)从组织样品中也提取了基因组DNA。需要说明的是,该研究是得到本研究相关组织的伦理审查员会的承认而进行的。
<RNA测序>
用于RNA测序的cDNA文库按照制造者的标准操作方法使用mRNA-Seq样品制备试剂盒(Illumina公司制)而制备。简洁地进行说明的话,从2μg的总RNA精制poly-A(+)RNA,用片段化缓冲液在94℃下加热5分钟而进行片段化之后,用于双链cDNA合成。将得到的双链cDNA与PE接头DNA连接之后,将250~300bp(插入DNA大小:150~200bp)的部分进行凝胶精制,用15个循环的PCR进行扩增。接着,将这样形成的文库提供给使用基因组分析仪IIx测序仪(GAIIx,Illumina公司制)的50-bp双末端测序。
<融合转录产物的检测>
融合转录产物的检测是改变Totoki Y等、Nat Genet.、2011年5月、43卷、5号、464~469页中记载的方法而进行的。简洁地进行说明的话,首先,将相同碱基序列的双末端读序(paired-end read)认为是在PCR扩增过程中生成的而将它们除去。接着,使用BOWTIE程序(版本0.12.5),相对于RefSeq数据库(File:human.rna.fna fromftp://ftp.ncbi.nih.gov/refseq,Date:Sep20,2010)中注册的人RNA序列以允许2个碱基以下的错配的条件下绘制双末端读段(paired-end read)。而且,除去以适当的间隔和方向而绘制的同一RNA序列的“适当的”读段对(read pair)。接着,除去符合多个基因组座位的读段之后,构建读段的“簇(cluster)”。
接着,利用以下的分析条件选出暗示融合转录产物的“对簇”。
(I)由正向、反向分别的比对构建由在相当于最大的插入序列长的距离内排列的读段构成的“簇”(两个读段只要其终点不超出相当于最大插入序列长的距离,则使其位于相同的簇)。
(II)位于最左或最右的读段间的距离如果大于插入序列长,则舍去。
(III)如果一个序列位于“正向簇”,另一个序列位于“反向簇”,则选出其双末端读段(将该“正向簇”和“反向簇”合称为“对簇”)。
(IV)选出至少一个双末端读段与基准人RNA序列完全一致的对簇。
(V)除去因碱基的多样性而误选的基因对。出于该目的,使用BLASTN程序,将对簇中所含的双末端读段相对人基准RNA序列排列。接着,在一端的序列排列为对簇、另一端以适当的距离和方向排列为相同的RNA序列的情况下,将该基因对排除在外。作为截止值,使用预测值1000。
而且,在一个肺腺癌样品中可得到超过20的双末端读段,获得在3例非癌肺组织的任一个中均不表现的基因对。在一个基因区域内或邻接的基因区域中绘制的对簇,它们具有在RefSeq数据库中未注册的选择性剪接、通读转录产物的可能性,因此,进一步从分析中除去。使用MapSplice(文本1.14.1)软件探索跨越融合边界点的接合区读段(junction read)。此时,相互接合两个由与相对于每个基因的读段簇区域与邻接的300bp的区域构成的基因组DNA序列而制作一个DNA序列,对该DNA使用MapSplice软件探索接合区读段。
<RT-PCR、基因组PCR、桑格测序>
将总RNA(500ng)使用superscriptIII逆转录酶(注册商标,Invitrogen公司制)进行逆转录。而且,将得到的cDNA(相当于10ng的总RNA)或10ng的基因组DNA供于使用了KAPA Taq DNA聚合酶(KAPA生物系统公司制)的PCR扩增。在以下条件下的热循环器内进行反应:于95℃30秒、60℃30秒、72℃2分钟进行40个循环,其后,于72℃进行最终延长反应10分钟。另外,为了评价cDNA合成效率而扩增了编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的基因。而且,PCR产物使用BigDye终止子试剂盒和ABI3130xl DNA测序仪(应用生物系统公司制)在双向直接确定碱基序列。需要说明的是,表1表示本研究中使用的引物。
[表1]
<EGFR、KRAS、ALK突变的分析>
关于全部的肺腺癌组织的基因组DNA中的EGFR及KRAS基因的体细胞突变,使用“Takano,T.等、J Clin Oncol.、2005年、23卷、6829~6837页”中记载的高分辨率熔解(high-resolution melting,HRM)法进行分析。另外,关于来自相同的组织的总RNA,使用多重(multiplex)逆转录PCR法研究了ALK/EML4或ALK/KIF5B融合转录产物的表达。
<基因组拷贝数分析>
肺腺癌的基因组拷贝数如本发明的发明人等过去的报告(Iwakawa,R.等、“MYC Amplification as a Prognostic Marker of Early Stage LungAdenocarcinoma Identified by Whole Genome Copy Number Analysis”、Clin Cancer Res.、2010年12月10日在线)中记载的那样,使用基因芯片人图谱250-K SNP阵列(GeneChip Human Mapping250-K SNParrays,注册商标,Affymetrix公司制)和Affymetrix公司制基因芯片图谱阵列用拷贝数分析仪(CNAG)软件(参照Nannya,Y.等、CancerRes.、2005年、65卷、6071~6079页)而确定。
<微阵列分析和数据处理>
将全部228例供于表达谱分析。将总RNA(100ng)用5×MegaScriptT7试剂盒标记,用Affymetrix U133Plus2.0阵列进行分析。得到的数据用MAS5算法正规化,使54,4675探针的平均表达水平在每个样品中为1000。
<免疫组织化学分析>
将石蜡块以4μm的厚度进行薄切,分布于硅烷涂层载玻片上。接着,将薄切切片用二甲苯-醇系列进行脱石蜡、亲水化,将载玻片用3%过氧化氢水处理20分钟,由此封闭内源性过氧化物酶,接着,用去离子水清洗2~3分钟。抗原活化使用targeted retrieval溶液进行95度的温水浴40分钟。清洗载玻片之后,用5%正常动物血清反应10分钟,封闭非特异反应,使用作为一次抗体的RET(1︰250稀释,3454_1克隆)及TTF1(1︰100稀释,8G7G3/1克隆),在室温下孵育1小时。就检测而言,对于TTF1,使用Envision-Plus系统,对于RET,在EnVision-FLEX处理后追加LINKER试剂,各自检测。清洗后,显色使用3,3’-二氨基联苯胺溶液反应5分钟,流水清洗后通过苏木精的计数器染色进行可视化。需要说明的是,对于TTF1,将超过肿瘤细胞中的10%的核染色判断为阳性,对于RET,将细胞质染色判断为阳性。
<荧光原位杂交(FISH)>
首先,在第一天,与免疫染色同样,将薄切切片进行脱石蜡、亲水化后风干。风干后,在常温的0.2N盐酸中静置20分钟,再在常温的精制水中静置3分钟,其后,在常温的清洗缓冲液(2×SSC WashBuffer)中静置3分钟。接着,在85℃的预处理液(PretreatmentSolution)中静置30分钟,其后,用清洗缓冲液(2×SSC Wash Buffer)进行2次清洗。接着,在37℃的蛋白酶溶液中静置60分钟,进行酶处理,用2×SSC Wash Buffer进行2次清洗。
接着,在常温的10%中性缓冲福尔马林中静置10分钟并进行再固定,用常温的清洗缓冲液(2×SSC Wash Buffer)进行2次清洗。而且,用醇系列脱水后使其风干。
在KIF5B基因和RET基因的融合基因的检测中,使用以可以检测由KIF5B基因和RET基因的融合基因的形成而产生的、比RET基因的激酶结构域的编码区域更靠5’侧的上游区域和RET基因的激酶结构域的编码区域及比该编码区域更靠3’侧的下游区域的分离(split)的方式设计的下述探针组合。
5’RET探针1:具有覆盖BAC克隆DNA(GSP1506F09)的100~1000个碱基的链的、用TexRed标记的探针组(株式会社GSP研究所制)
3’RET探针1:具有覆盖用FITC标记的BAC克隆DNA(GSP1877H08、GSP1018G02、GSP1070C12、GSP0369G08或GSP0075D03)的100~1000个碱基的链的、用TexRed标记的探针组(株式会社GSP研究所制)。
需要说明的是,这些探针的标记是用切口平移法进行的。另外,这些探针组杂交的基因组上的位置示于图11的下部。
而且,在进行了上述福尔马林固定的薄切切片上添加上述DNA探针混合液10μl,载置盖玻片,用纸带密封。接着,使用杂交仪(制品名:Thermo Brite(注册商标),雅培日本公司制),在75℃下孵育5分钟后,再在37℃下孵育72小时~96小时,由此进行杂交。
在孵育后去掉纸带,在常温的杂交后清洗缓冲液(2×SSC/0.3%NP-40pH7~7.5)中放入载置有盖玻片的标本,放置5分钟之后,剥下盖玻片。接着,加热至72±1℃,然后,在杂交后清洗缓冲液(2×SSC/0.3%NP-40pH7~7.5)中放入标本,静置30秒~1分钟。
接着,将标本移至放入有用铝箔遮光的2×SSC Wash Buffer的常温的科普林缸中。而且,通过将DAPI10μl添加于载玻片而进行对比染色,载置盖玻片,用镊子将盖玻片固定化。
在荧光显微镜下进行判断,分别计数在50个肿瘤细胞中来自红色的RET的信号及来自绿色的着丝粒10的信号中的融合、分离及单独信号。
(实施例1)
首先,为了鉴定能够成为治疗目标的新型嵌合体融合转录产物,进行了30例肺腺癌和3例附随非癌肺组织的全转录组测序(RNA测序,Meyerson,M.等、Nat Rev Genet、2010年、11卷、685~696页)。需要说明的是,上述30例肺腺癌中,具有EML4-ALK融合的2例,具有EGFR突变的2例,具有KRAS突变的2例,不具有EGFR/KRAS/ALK突变的24例(参照表2)。
[表2]
而且,将由上述RNA测序得到的2×107以上的双末端读序进行分析,进行逆转录(RT)-PCR产物的桑格测序。将得到的结果示于表2、图1及图2。
由表2所示的结果得知:对包含EML4-ALK的2例的7个融合转录产物进行鉴定,其中,存在于染色体10p11.2的KIF5B基因和存在于染色体10q11.2的RET基因的融合在病例BR0020中被检测出(参照图1的KIF5B-RET突变体1、图2)。
需要说明的是,关于RET基因,与KIF5B以外的其它基因的融合显示为甲状腺乳头癌中的驱动突变(责任突变)(参照Mani,R.S.等、Nat Rev Genet、2010年、11卷、819~829页及Wells,S.A.,Jr.等、ClinCancer Res、2009年、15卷、7119~7123页)。但是,包含肺腺癌的癌症与KIF5B-RET融合转录产物的关系尚未得知,因此,着眼于该融合基因进一步进行分析。
(实施例2)
接着,以包含进行了全转录组测序的30例的319例的日本肺腺癌为对象进行了RT-PCR筛选和PCR产物的桑格测序。将得到的结果示于表3、图3及图4。
[表3]
如表3、图3及图4所示,得知:在2.0%(6/319)的病例中表达了KIF5B-RET融合转录产物。另外也得知:对4个突变体(variant)进行鉴定,其全部为框内(in-frame)。而且也得知:这些融合转录产物所编码的蛋白质具有KIF5B的卷曲螺旋结构域和RET的激酶结构域(参照图1)。需要说明的是,已知该KIF5B的卷曲螺旋结构域在KIF5B的同源二聚体的形成中发挥作用(Hirokawa,N.、Nat Rev Mol Cell Biol、2009年、10卷、682~696页),因此,可以设想,与PTC-RET或KIF5B-ALK融合同样,KIF5B-RET蛋白通过KIF5B的卷曲螺旋结构域而形成同源二聚体,导致RET的激酶功能的稳定活化。
另外,KIF5B-RET融合在包含其它主要类型的肺癌(0/205鳞状上皮癌、0/20小细胞癌)和40例肺腺癌的90个肺癌细胞株中被检测出。需要说明的是,关于这些肺癌细胞株,参照Blanco,R.等、Hum Mutat、2009年、30卷、1199~1206页。
(实施例3)
接着,进行6例RET融合阳性例的基因组PCR分析。将得到的结果示于图5~10。
如图5~7所示,得知:人染色体10p11.2的KIF5B内含子15、16、24和染色体10q11.2的RET内含子7、11以体细胞水平进行融合。
另外,由上述结果也得知:进一步如图8及9所示,在两座位上没有产生基因组拷贝数的变化,因此显示:在图10所示的第10染色体的着丝粒区域内,在长臂和短臂之间产生了染色体倒位。
另外,RET融合阳性例的基因组中的切断点周围的DNA序列没有显示显著的相同性。而且得知:在病例BR0020中,切断点在没有核苷酸的重叠或插入下结合,与此相对,在其它病例中,产生了插入(BR1001及BR1003)或重叠(BR1002及BR0030)(参照图6)。另外,在病例BR1004中,看到伴有349bp的DNA片段插入的结合(参照图7)。
因此,上述结果与人癌中所发现的其它许多染色体转座例(参照Mani,R.S.等、Nat Rev Genet、2010年、11卷、819~829页)一致,因此暗示:KIF5B-RET融合是由经由非相同末端结合的错误的DNA双链切断的修复而形成的。
(实施例4)
接着,进行RET融合阳性例(BR0020)的荧光原位杂交分析。将得到的结果示于图11。由图11所示的结果得知:使用与比RET基因的激酶结构域的编码区域更靠5’侧的上游区域杂交的探针(5’RET探针1)、和与RET基因的激酶结构域的编码区域及比该编码区域更靠3’侧的下游区域杂交的探针(3’RET探针1)的情况下,检测出探针信号的分离(split)。
(实施例5)
接着,研究了具有KIF5B-RET融合的全部6例肺腺癌中有无其它公知的突变(EGFR、KRAS及ALK突变,参照非专利文献1、5及7)。将得到的结果示于表4。另外,对具有KIF5B-RET融合的全部6例肺腺癌的病理学所见也进行了观察。将得到的结果示于图11及12。需要说明的是,表4及5中记载的“ADC”表示为“腺癌”。
[表4]
由表4所示的结果得知:上述全部6例均为EGFR、KRAS、ALK突变阴性,即triple negative病例,RET融合与其它癌基因变化存在相互排斥的关系。需要说明的是,在全部病例中,作为肺腺癌的标记物的甲状腺转录因子-1(TTF1)为阳性。
因此,由该结果暗示:KIF5B-RET融合为责任突变,成为triplenegative肺腺癌的5.5%(6/109)的原因。
另外,如图12及图13所示,得知:KIF5B-RET融合阳性肿瘤显示乳头状或肺胞上皮取代性的增殖形态,显示高、中程度的分化度。
(实施例6)
接着,研究了KIF5B-RET融合阳性肺腺癌中的RET的表达水平。将得到的结果示于图3、图14、图15及表4。
如图3及图14所示,与融合阴性肺腺癌或非癌肺组织相比,KIF5B-RET融合阳性肺腺癌显示高的RET表达水平(参照图3)。另外,根据包含6例融合阳性例的228例的基因表达数据也确认RET表达水平的该倾向(参照图14)。
进一步由图15所示的结果得知:在使用了针对RET蛋白的C末端区域的抗体的免疫组织化学分析中,在检索到的融合阳性例的肿瘤细胞的细胞质内看到RET阳性的染色像(参照图15及表4)。另一方面,在非癌肺细胞或几个融合阴性例的肿瘤细胞中,没有看到这样的染色像。
需要说明的是,在一部分没有KIF5B-RET融合的肺腺癌(22%,48/222)中,也看到与非癌肺组织相比高水平的RET基因的表达。关于6例这样的病例(参照表5),通过RNA测序进行分析,但没有发现RET基因对KIF5B以外的基因的融合或RET基因的体细胞突变、RET座位的拷贝数增加(参照图16及17)。
[表5]
(实施例7)
肺腺癌中的癌基因突变的分布显示因民族而不同。在亚洲人中,与非亚洲人相比,EGFR突变的频率高(50%vs10%),KRAS突变具有相反的倾向(10%vs30%)。另一方面,已知ALK融合为同等(5%)(参照非专利文献6及Shigematsu,H.等、J Natl Cancer Inst、2005年、97卷、339~346页)。因此,为了了解非亚洲人中的KIF5B-RET融合的分布,研究了来自USA群体的腺癌病例(参照表3)中的KIF5B-RET融合的频率。将得到的结果示于图18及19。
由图18及19所示的结果得知:突变体1转录产物在USA病例中1/80(1.3%)被检测出,其1例为白种人。得知:该病例与上述的日本人病例同样,为EGFR、KRAS、ALK突变为阴性,即三阴性(triplenegative)病例,上述3突变与KIF5B-RET融合存在相互排斥的关系。
因此得知:亚洲人、非亚洲人均在肺腺癌的1~3%中产生KIF5B-RET融合。需要说明的是,具有1例RET融合的非亚洲人病例为吸烟者,但6例日本人融合阳性病例为非吸烟者,KIF5B-RET融合阳性病例中的吸烟带来的影响不清楚。
产业上的可利用性
如以上说明的那样,根据本发明,可以预测利用RET酪氨酸激酶抑制剂治疗癌症的有效性。
对RET受体型酪氨酸激酶具有抑制效果的抑制剂已经导入癌症医疗中。FDA批准抑制剂、例如凡德他尼或索拉非尼显示对于非小细胞肺癌具有抗癌症活性。如上所述,KIF5B基因和RET基因的框内融合在多个病例中产生。而且,KIF5B基因和RET基因的融合从EGFR/KRAS/ALK突变型肿瘤中背离。因此,KIF5B-RET融合能够成为现有的酪氨酸激酶抑制剂的目标。另外,KIF5B-RET融合并不限于包含日本人的亚洲人,在欧美人中也可看到。因此,本发明的方法在广泛的人种中,在提高癌症治疗的效率方面是非常有用的。
序列表自由文本
序列号1
<223>KIF5B cDNA
序列号3
<223>RET cDNA
序列号5
<223>KIF5B-RET融合突变体1
序列号7
<223>KIF5B-RET融合突变体2
序列号9
<223>KIF5B-RET融合突变体3
序列号11
<223>KIF5B-RET融合突变体4
序列号13~28
<223>人工合成引物的序列
Claims (6)
1.一种多肽,其特征在于:
其为KIF5B蛋白的N末端部分与RET蛋白的C末端部分融合而成的多肽。
2.一种多核苷酸,其特征在于:
其编码权利要求1所述的多肽。
3.一种判断利用RET酪氨酸激酶抑制剂治疗癌症的有效性的方法,其特征在于:
包括检测从患者分离的试样中的权利要求2所述的多核苷酸存在或不存在的工序,如果检测出所述多核苷酸存在,则判断为所述患者利用所述RET酪氨酸激酶抑制剂治疗癌症的有效性高。
4.一种药剂,用于通过权利要求3所述的方法判断利用RET酪氨酸激酶抑制剂治疗癌症的有效性,所述药剂的特征在于:
含有具有至少15个碱基的链长的下述(a)~(c)所记载的任一种多核苷酸、或下述(d)所记载的抗体,
(a)作为选自与编码KIF5B蛋白的多核苷酸杂交的探针和与编码RET蛋白的多核苷酸杂交的探针中的至少一种探针的多核苷酸,
(b)作为与编码KIF5B蛋白的多核苷酸和编码RET蛋白的多核苷酸的融合点杂交的探针的多核苷酸,
(c)作为以插入编码KIF5B蛋白的多核苷酸与编码RET蛋白的多核苷酸的融合点的方式设计的一对引物的多核苷酸,
(d)与KIF5B蛋白和RET蛋白融合而成的多肽结合的抗体。
5.一种癌症的治疗方法,其特征在于:
包括将所述RET酪氨酸激酶抑制剂对通过权利要求3所述的方法判断为利用RET酪氨酸激酶抑制剂治疗癌症的有效性高的患者进行给药的工序。
6.一种以RET酪氨酸激酶抑制剂作为有效成分的癌症治疗剂,其特征在于:
其是对通过权利要求3所述的方法判断为利用RET酪氨酸激酶抑制剂治疗癌症的有效性高的患者进行给药的治疗剂。
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