JPWO2013018882A1 - Ｋｉｆ５ｂ遺伝子とｒｅｔ遺伝子との融合遺伝子、並びに該融合遺伝子を標的としたがん治療の有効性を判定する方法 - Google Patents

Ｋｉｆ５ｂ遺伝子とｒｅｔ遺伝子との融合遺伝子、並びに該融合遺伝子を標的としたがん治療の有効性を判定する方法 Download PDF

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Abstract

がんにおいて、薬剤による治療の有効性を予測する指標となりうる遺伝子を同定し、当該遺伝子を標的として薬剤による治療の有効性を予測する新規な方法を提供することを目的とし、肺腺がんの全トランスクリプトームシークエンシングを行った。その結果、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子とのインフレーム融合転写産物を同定した。また、このＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ遺伝子融合は、日本人肺腺がんの６／３１９（２％）、アメリカ人肺腺がんの１／８０（１％）に検出された。そして、この７例はいずれもＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＡＬＫがん遺伝子といった公知の活性化変異を示さなかったことから、当該遺伝子融合は、がん化における責任変異（ドライバー変異）であることが判明した。当該遺伝子融合は、ＲＥＴチロシンキナーゼタンパク質の恒常的な活性化をもたらすものと考えられることから、当該遺伝子融合が検出される患者に対しては、ＲＥＴチロシンキナーゼに対する阻害剤による治療が有効であることを見出した。

Description

本発明は、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子に関する。また、この融合遺伝子を標的としたＲＥＴタンパク質チロシンキナーゼに対する阻害剤によるがん治療の有効性を判定する方法に関する。さらに、本発明は、この有効性の判定を利用したがんの治療方法に関する。また、本発明は、これらの方法に用いるための分子にも関する。
がんは日本における死因の第一位を占める疾病であり、その治療法の改善が求められている。特に肺がんは、日本のみならず世界においてもがん死の筆頭要因であり、年間１００万人以上の死をもたらす。肺がんは大きく小細胞肺がんと非小細胞肺がんとに分けられ、さらに非小細胞肺がんは、肺腺がん（ｌｕｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＬＡＤＣ）、肺扁平上皮がん、大細胞がんの３種類に分けられる。そして、これらのうち、肺腺がんは非小細胞肺がんの約５０％を占め、その頻度は上昇している（非特許文献１）。
肺腺がんに関しては、かなりの部分が、がん遺伝子の活性化によって発生することが明らかになっている。そして、がん遺伝子の活性化においては、ＥＧＦＲ遺伝子（１０〜４０％）やＫＲＡＳ遺伝子（１０〜２０％）の体細胞変異、ＡＬＫ遺伝子とＥＭＬ４（ｅｃｈｉｎｏｄｅｒｍ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｋｅ ４）遺伝子との融合やＡＬＫ遺伝子とＫＩＦ５Ｂ遺伝子との融合等（５％）が相互排他的に生じていることも明らかとなっている（非特許文献２〜６）。
肺腺がんを含めヒトのがんにおいて、発生に関与する変異遺伝子（変異タンパク質）や融合遺伝子（融合タンパク質）などのがん遺伝子を同定することは、これら遺伝子を標的とした新規ながん治療方法やがん検査方法の開発に大きく寄与するため、強く望まれている。
特に、進行した肺がんにおいては、薬剤による治療が主体となるが、個々の症例で薬剤に対する反応性が大きく異なるため、どのような薬剤が治療効果を有するかを予測する手段が求められている。そのため、前述の通り、変異遺伝子や融合遺伝子といった、その予測の指標となり得る分子の同定が進められており、例えば、ＥＧＦＲやＡＬＫタンパク質を標的としたチロシンキナーゼ阻害剤はＥＧＦＲ変異やＡＬＫ融合を持つ肺腺がんの治療に特に有効であることが明らかになっている。さらに、肺がんの４〜５％に存在するＡＬＫチロシンキナーゼ遺伝子の融合を検出する手法がＡＬＫタンパク質のチロシンキナーゼに対する阻害剤適応例の選出法として開発され、臨床試験が進行している。
しかしながら、肺がんを含めたがんにおける融合遺伝子等の解明はいまだ十分とはいえず、薬剤による治療の有効性を予測する指標となりうる変異遺伝子や融合遺伝子の同定が望まれているのが現状である。
Ｈｅｒｂｓｔ，Ｒ．Ｓ．ら、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００８年、３５９巻、１３６７〜１３８０ページ Ｐａｅｚ，Ｊ．Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００４年、３０４巻、１４９７〜１５００ページ Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｋ．ら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２００９年、１５巻、３１４３〜３１４９ページ Ｓｏｄａ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２００７年、４４８巻、５６１〜５６６ページ Ｊａｎｋｕ，Ｆ．ら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ、２０１０年、７巻、４０１〜４１４ページ Ｌｏｖｌｙ，Ｃ．Ｍ．ら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ、２０１１年、８巻、６８〜７０ページ
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、肺がん等において薬剤による治療の有効性を予測する指標となりうる遺伝子を同定することにある。また、当該遺伝子を標的として薬剤による治療の有効性を予測する新規な方法を提供することにある。さらに、本発明は、当該遺伝子を標的とした薬剤による治療の有効性の予測に基づいて、肺がん等を治療する方法を提供することを目的とする。さらなる本発明の目的は、これら方法において当該遺伝子の検出に用いられる分子を提供することにある。
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、３０例の肺腺がんの全トランスクリプトームシークエンシングにより、キネシンファミリーメンバー５Ｂ（ＫＩＦ５Ｂ）遺伝子とＲＥＴ受容体型チロシンキナーゼがん遺伝子（ＲＥＴ遺伝子）とのインフレーム（Ｉｎ−ｆｌａｍｅ）融合転写産物を同定した。この融合遺伝子は第１０染色体ｐ１１、ｑ１１領域間の逆位によって生じるものであった。このＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ遺伝子融合は、日本人肺腺がんの６／３１９（２％）に検出されたが、当該遺伝子融合が検出された６例はいずれもＥＧＦＲ変異、ＫＲＡＳ変異、ＡＬＫ融合といった公知のがん遺伝子活性化変異を示さなかった。さらに、この融合転写産物はアメリカ人由来の肺腺がんにおいても存在していた（１／８０（１％））。これら事実から、当該遺伝子融合は、広い人種において、がん化における責任変異（ドライバー変異）であることが明らかになった。
この遺伝子融合は、ＲＥＴチロシンキナーゼの恒常的な活性化をもたらすものと考えられ、このような活性化が生じている患者においては、ＲＥＴチロシンキナーゼに対する阻害剤が治療において有効性を示すものと考えられる。このため、本発明者らは、肺がん等において、当該遺伝子融合を標的として薬剤による治療の有効性を予測することが可能であり、さらに、この予測において薬剤による治療が有効であると判定された患者に当該薬剤を投与すれば、効率的に治療を行うことが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
従って、本発明は、ＫＩＦ５ＢとＲＥＴとの融合ポリペプチド、このポリペプチドの存在を指標としたＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を判定する方法、この有効性の判定を利用したがんの治療方法、並びに、これらの方法に用いるための分子に関し、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
（１） ＫＩＦ５Ｂタンパク質のＮ末端部分と、ＲＥＴタンパク質のＣ末端部分とが融合しているポリペプチド。
（２） （１）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（３） ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を判定する方法であって、患者から単離した試料における（２）に記載のポリヌクレオチドの存在または非存在を検出する工程を含み、前記ポリヌクレオチドの存在が検出されれば、前記患者における前記ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定される方法。
（４） （３）に記載の方法によりＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を判定するための薬剤であって、少なくとも１５塩基の鎖長を有する下記（ａ）〜（ｃ）に記載のいずれかであるポリヌクレオチド、または、下記（ｄ）に記載の抗体を含む薬剤
（ａ）ＫＩＦ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及びＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも一つのプローブであるポリヌクレオチド
（ｂ）ＫＩＦ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド
（ｃ）ＫＩＦ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点を挟み込むように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド
（ｄ）ＫＩＦ５Ｂタンパク質とＲＥＴタンパク質とが融合しているポリペプチドに結合する抗体。
（５） がんを治療する方法であって、（３）に記載の方法によりＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定された患者に、前記ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を投与する工程を含む方法。
（６） ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を有効成分とするがんの治療剤であって、（３）に記載の方法によりＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定された患者に投与される治療剤。
本発明によれば、がんに対する治療の有効性を予測すること、特にＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を予測することが可能となる。これにより、薬剤を投与することが有効ではないと考えられるがん患者への薬剤の投与を回避することができるため、効率的ながん治療を実現することが可能となる。
野生型ＫＩＦ５Ｂ及びＲＥＴタンパク質の構造（図１上部の「ＫＩＦ５Ｂ」及び「ＲＥＴ」）、肺腺がん患者において同定した４つのＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合バリアント（図１下部の「１〜４」）、及び各々のバリアントにおける切断点（図１上部の「ＫＩＦ５Ｂ」及び「ＲＥＴ」に付されている線（１、２、３、４、１−３）を示す概略図である。なお、図１中「ＴＭ」は膜貫通ドメインを示す。 肺腺がん患者（症例：ＢＲ００２０）におけるＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合転写産物を示す概略図である。なお、図２の上部はペアエンドリード解析の結果を示し、下部はジャンクションリード解析の結果を示す。また、各核酸（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）は各々図中に示した対応する色にて識別されている。 各肺腺がん患者におけるＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合（図３の上部）、ＲＥＴキナーゼドメイン（エクソン１２−１３、図３の中部）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ、内部標準、図３の下部）をＲＴ−ＰＣＲにより検出した結果を示す電気泳動の写真である。なお図３中、「Ｔ」は各肺腺がん患者の肺腺がん組織の結果を示し、「Ｎ」は各肺腺がん患者の非がん肺組織の結果を示す（図５においても同様）。また、ＢＲ００１９はＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陰性肺腺がんの症例であり、ＢＲ００２０、ＢＲ１００１、ＢＲ１００２、ＢＲ００３０、ＢＲ１００３及びＢＲ１００４はＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性肺腺がんの症例である（図５においても同様）。さらに「ＮＴＣ」は鋳型ＤＮＡなしの陰性対照の結果を示す。 ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合転写産物のｃＤＮＡをサンガーシークエンシングにより分析した結果を示す電気泳動図である。なお、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ−Ｆ１プライマー及びＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ−Ｒ１プライマーを用いて増幅したＲＴ−ＰＣＲ産物を、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ−Ｆ１（ＢＲ００２０、ＢＲ１００１、ＢＲ１００２及びＢＲ００３０）プライマー並びにＫＩＦ５Ｂ−Ｆ−ｏｒｆ２４３８（ＢＲ１００３及びＢＲ１００４）プライマーを用いて、ダイレクトシークエンシングした。 各肺腺がん患者におけるＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合をゲノムＰＣＲにより検出した結果を示す電気泳動の写真である。図５中、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合点（切断点結合部）を含むＤＮＡ断片の増幅に用いたプライマーの位置を写真の下に示す。また「ｉｎｔ」はイントロンを示し、「ｅｘ」はエクソンを示す。さらに、ＢＲ００３０及びＢＲ１００４の非がん肺組織に見られた非特異バンドをアステリスクで示す。 ＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合点を含むゲノム断片をサンガーシークエンシングにより分析した結果を示す電気泳動図である。なお、ＰＣＲ産物はダイレクトシークエンシングにより分析し、各々のサンプルの増幅及びシークエンシングには、下記プライマーを用いた。ＢＲ００２０：ＫＩＦ５Ｂ−ｉｎｔ１５−Ｆ１／ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ−Ｒ１及びＲＥＴ−ｉｎｔ１１−Ｒ０．５、ＢＲ１００１：ＫＩＦ５Ｂ−ｉｎｔ１５−Ｆ１／ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ−Ｒ１及びＲＥＴ−ｉｎｔ１１−Ｒ１、ＢＲ１００２：ＫＩＦ５Ｂ−ｉｎｔ１５−Ｆ２／ＲＥＴ−ｉｎｔ１１−Ｒ３及びＫＩＦ５Ｂ−ｉｎｔ１５−Ｆ３．５、ＢＲ００３０：ＫＩＦ５Ｂ−ｅｘ１６−Ｆ１／ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ−Ｒ１及びＫＩＦ５Ｂ−ｅｘ１６−Ｆ１、ＢＲ１００３：ＫＩＦ５Ｂ−ｅｘ２３−Ｆ１／ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ−Ｒ１及びＫＩＦ５Ｂ−ｅｘ２３−Ｆ１ また、融合点における重複ヌクレオチドはＢＲ１００２及びＢＲ００３０に付した囲みで示し、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合点における挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）ヌクレオチドはＢＲ１００１及びＢＲ１００３に付した囲みで示す。 ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合点を含むゲノム断片をサンガーシークエンシングにより分析した結果（特にＲＥＴエクソン７−ＲＥＴイントロン７を含む３４９ｂｐのゲノム断片が切断点結合部に挿入されていること）を示す電気泳動図である。なお、ＫＩＦ５Ｂ−ｅｘ２４−Ｆ１プライマー及びＲＥＴ−ｉｎｔ７−Ｒ１プライマーを用いて増幅したＰＣＲ産物を、ＲＥＴ−ｉｎｔ７−Ｒ２プライマーを用いてダイレクトシークエンシングした。 ＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子とが融合している６症例のうちの２症例（ＢＲ００２０及びＢＲ１００１）における、染色体１０番のゲノムコピー数を調べた結果を示す概略図である。なお、コピー数はＣＮＡＧプログラム分析により推定した（図９においても同じ）。また図中、リファレンスゲノム上のＫＩＦ５Ｂ遺伝子及びＲＥＴ遺伝子の位置及び方向は矢印によって示す（図９においても同じ）。 ＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子とが融合している６症例のうちの２症例（ＢＲ００１２及びＢＲ０００５）における、染色体１０番のゲノムコピー数を調べた結果を示す概略図である。 ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合に関与する推定染色体再構成（バリアント１）を示す概略図である。 蛍光標識したＤＮＡプローブを用いて施行したｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションにより検出されたＢＲ００２０症例でのＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合を生じる染色体逆位を示す顕微鏡写真（観察倍率：４００倍）である。当該症例においては、ＲＥＴ遺伝子のキナーゼドメインのコード領域よりも５’側の上流領域にハイブリダイズするプローブ（５’ＲＥＴ、図中赤色の蛍光スポット）と、ＲＥＴ遺伝子のキナーゼドメインのコード領域および該コード領域よりも３’側の下流領域にハイブリダイズするプローブ（３’ＲＥＴ、図中緑色の蛍光スポット）とのシグナルの分離（ｓｐｌｉｔ、図中矢印にて指し示されている箇所）が検出された。また、図１１の下部に各プローブ群がハイブリダイズするゲノム上の位置を示す。 へマトキシリン−エオジン染色したＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性肺腺がん（ＢＲ１００４）における代表的な組織構造を示す顕微鏡写真（観察倍率：５０倍）である。なお、この肺腺がん細胞において、クララ（Ｃｌａｒａ）細胞又はII型肺上皮細胞分化が認められた。また、これらの腫瘍細胞は肥厚した肺胞隔壁に沿って、腫瘍辺縁部に伸長していた（左側のスライド）。さらに、その中央部において乳頭状の増殖も認められた（右側のスライド）。 甲状腺転写因子−１（ＴＴＦ−１）に対する免疫染色を行ったＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性肺腺がん（ＢＲ１００４）における代表的な組織構造を示す顕微鏡写真（観察倍率：５０倍）である。なお、この肺腺がん細胞において、ＴＴＦ−１の核におけるびまん性の強い発現が観察された。 Ｕ１３３Ａプラス２．０マイクアレイ分析によって、肺腺がん（ＡＤＣ）及び非がん肺組織（Ｎ）におけるＲＥＴの発現レベルを評価した結果を示すプロット図である。なお、ＲＥＴの発現レベルは、２１１４２１＿ｓ＿ａｔプローブ（ｒｅｔ ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｎｅｏｐｌａｓｉａ ａｎｄ ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ １，Ｈｉｒｓｃｈｓｐｒｕｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ））を用いて評価した。また図１４中、「＋」はＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性肺腺がんを評価した結果を示し、「−」はＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陰性肺腺がんを評価した結果を示す。さらに、図１４中のＰ値は、発現レベルの差をＵ検定によって評価して得られた値である。 ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性の肺腺がん腫瘍サンプル（ＢＲ１００４）におけるＲＥＴタンパク質の免疫組織学的染色の結果を示す顕微鏡写真（観察倍率：５０倍）である。なお、この肺腺がん腫瘍サンプルにおいて、ＲＥＴ蛋白質は腺がん細胞の細胞質に顆粒状に発現していることが認められた。 ＲＥＴ融合は認められないが、ＲＥＴ遺伝子の発現レベルが高い２症例における、染色体１０番のゲノムコピー数を調べた結果を示す概略図である。なお、コピー数はＣＮＡＧプログラム分析により推定した。また図中、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子及びＲＥＴ遺伝子の位置及び方向は矢印によって示す。 肺腺がん及び非がん肺組織由来のシークエンスリードの分布をＲＥＴ子転写産物（ＮＭ＿０２０９７５．４）に沿って示した結果を示す図である。なお、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性サンプル ＢＲ００２０由来のシークエンスリードは融合点の下流に殆ど位置していた。一方、融合は確認されていないが、ＲＥＴ遺伝子の発現が認められる６サンプル（図１７中、アスタリスクによってマークしたサンプル）においては、ＲＥＴ転写産物全体にわたってシークエンスリードは分布しており、また変異は検出されなかった。なお図１７中「ＲＥＴ発現」には、オリゴヌクレオチドマイクロアレイによって評価したＲＥＴの発現レベルを示す。 ＵＳＡコホート由来の肺腺がん症例において、ＲＴ−ＰＣＲにより、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合転写産物（バリアント１、図１８の上部）及びＧＡＰＤＨ（内部標準、図１８の下部）を検出した結果を示す電気泳動の写真である。なお図１８中、「Ｔ」は前記コホートの肺腺がん組織の結果を示し、「Ｎ」は前記コホートの非がん肺組織の結果を示す。「ＵＳＡ１５８０」はＵＳＡコホ―ト由来の肺腺がん症例を示す。 ＵＳＡコホ―ト由来の肺腺がん症例におけるＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合転写産物（バリアント１）のｃＤＮＡをサンガーシークエンシングにより分析した結果を示す電気泳動図である。
＜ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチド及び該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド＞
後述の実施例において示す通り、ＫＩＦ５Ｂタンパク質とＲＥＴタンパク質との融合例が肺腺がんにおいて初めて明らかになった。したがって、本発明は、ＫＩＦ５Ｂタンパク質のＮ末端部分と、ＲＥＴタンパク質のＣ末端部分とが融合しているポリペプチド（以下、「ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチド」とも称する）を提供する。また、本発明は、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、「ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド」とも称する）を提供する。
本発明にかかる「ＫＩＦ５Ｂ（キネシンファミリーメンバー５Ｂ、ＫＩＮＥＳＩＮ ＦＡＭＩＬＹ ＭＥＭＢＥＲ ５Ｂ）タンパク質」は、ＫＮＳ１（キネシン１，ＫＩＮＥＳＩＮ１）タンパク質、ＵＫＨＣ（キネシン，重鎖，ユビキタス、ＫＩＮＥＳＩＮ，ＨＥＡＶＹ ＣＨＡＩＮ，ＵＢＩＱＵＩＴＯＵＳ）タンパク質又はＫＩＮＨタンパク質とも称されるタンパク質であり、ヒトにおいては１０ｐ１１．２に座乗している遺伝子にコードされているタンパク質である。本発明において、「ＫＩＦ５Ｂタンパク質」は、ヒト由来のものであれば、典型的には配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である。さらに、本発明において、「ＫＩＦ５Ｂタンパク質のＮ末端部分」とは、典型的には、前記ＫＩＦ５Ｂタンパク質のＮ末端側にあるモーター領域とコイルドコイルドメインの一部又は全部とを含むものである（図１ 参照）。
本発明にかかる「ＲＥＴ（トランスフェクション中の再構成、ＲＥＡＲＲＡＮＧＥＤ ＤＵＲＩＮＧ ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＯＮ）タンパク質」は、ＲＥＴチロシンキナーゼタンパク質又はＲＥＴ受容体型チロシンキナーゼタンパク質とも称され、ヒトにおいて１０ｑ１１．２に座乗している遺伝子にコードされているタンパク質である。本発明において、「ＲＥＴタンパク質」は、ヒト由来のものであれば、典型的には配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である。さらに、本発明において、「ＲＥＴタンパク質のＣ末端部分」とは、典型的には、前記ＲＥＴタンパク質のＣ末端側にあるキナーゼドメインを含むものである（図１ 参照）。
また、本発明の「ＫＩＦ５Ｂタンパク質のＮ末端部分と、ＲＥＴタンパク質のＣ末端部分とが融合しているポリペプチド」としては、後述の実施例において示す通り、１０ｐ１１．２と１０ｑ１１．２との領域間の逆位により生じた融合遺伝子がコードするポリペプチドであればよいが、典型的には、前記ＫＩＦ５Ｂタンパク質のＮ末端側にあるモーター領域とコイルドコイルドメインの一部又は全部とを含むポリペプチドと前記ＲＥＴタンパク質のＣ末端側にあるキナーゼドメインを含むポリペプチドとが融合しているポリペプチドであり、例えば、配列番号：６、８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
本発明にかかる「ＫＩＦ５Ｂタンパク質」、「ＲＥＴタンパク質」、および「ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチド」のアミノ酸配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異しうる。また、人為的にアミノ酸に変異を導入することもできる。従って、このような変異体も本発明に含まれる。
ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドの変異体としては、配列番号：６、８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。ここで「複数」とは、通常、５０アミノ酸以内、好ましくは３０アミノ酸以内、より好ましくは１０アミノ酸以内、特に好ましくは数個のアミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。
また、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドの変異体としては、配列番号：５、７、９又は１１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするポリペプチドが挙げられる。高ストリンジェンシーなハイブリダイズの条件として、例えば、０．２ｘＳＳＣ、６５℃という条件が挙げられ、低ストリンジェンシーなハイブリダイズの条件として、例えば、２．０ｘＳＳＣ、５０℃という条件が挙げられる。
さらに、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドの変異体としては、配列番号：６、８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列と８０％以上（例えば、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＸ又はＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸レベル）のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０，１９９０）を利用して決定することができる。該プログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４−２２６８，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７，１９９３）に基づいている。ＢＬＡＳＴＸ等によってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
本発明の「ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」には、当該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、当該ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、当該ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ等が含まれる。本発明のＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴポリペプチドをコードするｃＤＮＡの典型例は、配列番号：５、７、９又は１１に記載のＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチドである。
なお、本発明のポリヌクレオチドは、当業者であれば、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子を保持する肺腺がん等から調製したｃＤＮＡのライブラリーライブラリーまたはゲノムＤＮＡのライブラリーから公知のハイブリダイゼーション技術を利用して抽出することができる。また、前記肺腺がん等から調製したｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを鋳型として公知の遺伝子増幅技術（ＰＣＲ) を利用することにより増幅し、調製することもできる。さらに、天然型ＫＩＦ５Ｂ遺伝子と天然型ＲＥＴ遺伝子とのｃＤＮＡを材料とし、ＰＣＲ、制限酵素処理、部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．＆Ｆｒｉｔｚ，ＨＪ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９８７，１５４，３５０．）等の公知の遺伝子増幅技術や組換え技術を利用して調製することもできる。
さらに、このようにして調製したポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを無細胞タンパク質合成系（例えば、網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液）に導入してインキュベーションすることにより、また該ベクターを適当な細胞（例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞）に導入し、得られた形質転換体を培養することにより、本発明のポリペプチドを調製することができる。
＜ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を判定する方法＞
後述の実施例において示す通り、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合はがんにおける責任変異であり、該融合によってＲＥＴチロシンキナーゼタンパク質の発現の亢進、ひいてはＲＥＴチロシンキナーゼタンパク質の恒常活性化が生じ、がんの悪性化等に寄与していることが明らかになった。そのため、このような融合が検出されるがん患者においては、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤による治療が有効である蓋然性が高い。
従って、本発明は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を判定する方法であって、患者から単離した試料におけるＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの存在または非存在を検出する工程を含み、前記ポリヌクレオチドの存在が検出されれば、前記患者における前記ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定される方法を提供する。
本発明において「患者」とは、がんに罹患しているヒトのみならず、がんに罹患していると疑いのあるヒトであってもよい。本発明の方法を適用する対象となる「がん」としては、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子の発現が認められるがんであれば特に制限はない。好ましくは肺がんであり、さらに好ましくは非小細胞肺がんであり、特に好ましくは肺腺がんである。
本発明において「試料」とは、生体試料（例えば、細胞、組織、臓器、体液（血液、リンパ液等）、消化液、喀痰、肺胞・気管支洗浄液、尿、便）のみならず、これらの生体試料から得られる核酸抽出物（ゲノムＤＮＡ抽出物、ｍＲＮＡ抽出物、ｍＲＮＡ抽出物から調製されたｃＤＮＡ調製物やｃＲＮＡ調製物等）やタンパク質抽出物も含む。また、前記試料は、ホルマリン固定処理、アルコール固定処理、凍結処理又はパラフィン包埋処理が施してあるものでもよい。
さらに、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はタンパク質は、当業者であれば、前記試料の種類及び状態等を考慮し、それに適した公知の手法を選択して調製することが可能である。
本発明においてがん治療の有効性を評価する対象となる「ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤」としては、ＲＥＴチロシンキナーゼの機能を直接的に又は間接的に抑制できる物質であれば特に制限はない。ＲＥＴチロシンキナーゼを阻害しうる限り、他のチロシンキナーゼを阻害する物質であってもよい。本発明に適用し得る公知のＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤としては、例えば、４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトキシ）キナゾリン（一般名：バンデタニブ（Ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ）；ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ及びＲＥＴを標的とする化合物）、４−［４−［３−［４−クロロ‐３−（トリフルオロメチル）フェニル］ウレイド］フェノキシ］−Ｎ−メチルピリジン−２−カルボアミド（一般名：ソラフェニブ（Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）；ＢＲＡＦ及びＲＥＴ等を標的とする化合物）、Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−５−［（Ｚ）−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキシアミド モノ［（２Ｓ）−２−ヒドロキシサクシネート］（一般名：スニチニブ（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）；ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＲＥＴ等を標的とする化合物）、Ｎ−（３，３−ジメチルインドリン−６−イル）−２−（ピリジン−４−イルメチルアミノ）ニコチンアミド（一般名：モテサニブ（Ｍｏｔｅｓａｎｉｂ）；ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＲＥＴ等を標的とする化合物）、ＸＬ１８４／カボザンチニブ（ＸＬ１８４／Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ；ＶＥＧＦＲ、ＭＥＴ、ＲＥＴ等を標的とする化合物）が挙げられる。
本発明において「ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの存在または非存在の検出」は、前記融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡや前記ゲノムＤＮＡからの転写産物を対象として直接的に行うことができるが、前記転写産物からの翻訳産物（前記融合ポリペプチド）を対象として間接的に行うこともできる。
また、前記融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡは、１０ｐ１１．２と１０ｑ１１．２との領域間の逆位によって形成されるものであるから、「ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの存在または非存在の検出」においては、この逆位という現象を検出してもよい。かかる逆位の検出においては、例えば、ＲＥＴ遺伝子のキナーゼドメインのコード領域よりも５’側の上流領域と、ＲＥＴ遺伝子のキナーゼドメインのコード領域および該コード領域よりも３’側の下流領域との分離を検出してもよく、また、ＲＥＴ遺伝子のカドヘリンリピートのコード領域および該領域よりも５’側の上流領域と、ＲＥＴ遺伝子の膜貫通ドメインのコード領域および該コード領域よりも３’側の下流領域との分離を検出してもよく、さらに、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子のコイルドコイルドメインの一部または全部のコード領域および該コード領域よりも５’側の上流領域と、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子のコイルドコイルドメインのコード領域よりも３’側の下流領域との分離を検出してもよい。
本発明における「ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの存在または非存在の検出」には、公知の手法を用いることができる。「前記融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ」を対象とする場合においては、例えば、蛍光等を用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、ゲノムＰＣＲ法、ダイレクトシークエンシング、サザンブロッティング、ゲノムマイクロアレイ解析を用いることができる。また、「前記ゲノムＤＮＡからの転写産物」を対象とする場合においては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、ダイレクトシークエンシング、ノーザンブロッティング、ドットブロット法、ｃＤＮＡマイクロアレイ解析を用いることができる。
治療又は診断の過程で得られる生体試料（生検サンプル等）は、ホルマリン固定されていることが多いが、この場合は、検出対象であるゲノムＤＮＡがホルマリン固定下においても安定しており、検出感度が高いという観点から、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いることが好適である。
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいては、前記生体試料に、少なくとも１５塩基の鎖長を有する下記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出することができる。
（ａ）ＫＩＦ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及びＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも一つのプローブであるポリヌクレオチド
（ｂ）ＫＩＦ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド。
本発明にかかるＫＩＦ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ヒト由来のものであれば、典型的にはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号 ＮＴ＿００８７０５．１６で特定されるゲノムの配列のうち３２２３７９３８〜３２２８５３７１番目のＤＮＡ配列からなる遺伝子である。
また、本発明にかかるＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ヒト由来のものであれば、典型的にはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号 ＮＴ＿０３３９８５．７で特定されるゲノムの配列のうち１２１７５８２〜１２７０８６２番目のＤＮＡ配列からなる遺伝子である。
しかしながら、遺伝子のＤＮＡ配列は、その変異等により、自然界において（すなわち、非人工的に）変異しうる。従って、このような天然の変異体も本発明の対象になりうる（以下、同様）。
本発明の（ａ）に記載のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの標的塩基配列である、ＫＩＦ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズすることにより、前記生体試料におけるＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの存在を検出できるものであればよいが、好ましくは、下記（ａ１）〜（ａ４）に記載のポリヌクレオチドである。
（ａ１） ＫＩＦ５Ｂ遺伝子のコイルドコイルドメインの一部または全部のコード領域および該コード領域よりも５’側の上流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「５’ＫＩＦ５Ｂプローブ１」とも称する）と、ＲＥＴ遺伝子のキナーゼドメインのコード領域および該コード領域よりも３’側の下流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「３’ＲＥＴプローブ１」とも称する）との組み合わせ
（ａ２） ＲＥＴ遺伝子のキナーゼドメインのコード領域よりも５’側の上流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「５’ＲＥＴプローブ１」とも称する）と、ＲＥＴ遺伝子のキナーゼドメインのコード領域および該コード領域よりも３’側の下流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（３’ＲＥＴプローブ１）との組み合わせ
（ａ３） ＲＥＴ遺伝子のカドヘリンリピートのコード領域および該領域よりも５’側の上流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「５’ＲＥＴプローブ２」とも称する）と、ＲＥＴ遺伝子の膜貫通ドメインのコード領域および該コード領域よりも３’側の下流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「３’ＲＥＴプローブ２」とも称する）との組み合わせ
（ａ４） ＫＩＦ５Ｂ遺伝子のコイルドコイルドメインの一部または全部のコード領域および該コード領域よりも５’側の上流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（５’ＫＩＦ５Ｂプローブ１）と、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子のコイルドコイルドメインのコード領域よりも３’側の下流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「３’ＫＩＦ５Ｂプローブ１」とも称する）との組み合わせ。
本発明において、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いられる前記（ａ１）に記載のポリヌクレオチドがハイブリダイズする領域（標的塩基配列）としては、標的塩基配列に対する特異性及び検出の感度の観点から、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合点から１００００００塩基以内の領域であることが好ましく、また、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いられる前記（ａ２）〜（ａ４）に記載のポリヌクレオチドがハイブリダイズする領域としては、同観点から、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子またはＲＥＴ遺伝子における切断点から１００００００塩基以内の領域であることが好ましい。
また、本発明において、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いられる前記（ｂ）に記載のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの標的塩基配列である、ＫＩＦ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズすることにより、前記生体試料におけるＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの存在を検出できるものであればよいが、典型例としては、配列番号：５、７、９又は１１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドをコードするゲノムＤＮＡにハイブリダイズするポリヌクレオチド、例えば、図６および７に記載のＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合点にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
また、本発明において、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いられる前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドは、標的塩基配列に対する特異性及び検出の感度の観点から、前記標的塩基配列全体をカバーすることのできる、複数種のポリヌクレオチドからなる集団であることが好ましい。かかる場合、該集団を構成するポリヌクレオチドの長さは少なくとも１５塩基であるが、１００〜１０００塩基であることが好ましい。
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いられる前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドは、検出のため、蛍光色素等によって標識されていることが好ましい。かかる蛍光色素としては、例えば、ＤＥＡＣ、ＦＩＴＣ、Ｒ６Ｇ、ＴｅｘＲｅｄ、Ｃｙ５が挙げられるが、これらに制限されない。また、蛍光色素以外にＤＡＢ等の色素（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）や酵素的金属沈着に基づく銀等によって、前記ポリヌクレオチドを標識してもよい。
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、５’ＫＩＦ１Ｂプローブ１と３’ＲＥＴプローブ１とを用いる場合、５’ＲＥＴプローブ１と３’ＲＥＴプローブ１とを用いる場合、５’ＲＥＴプローブ２と３’ＲＥＴプローブ２とを用いる場合、５’ＫＩＦ１Ｂプローブ１と３’ＫＩＦ１Ｂプローブ１とを用いる場合、これらプローブは互いに異なる色素にて標識されていることが好ましい。そして、このように異なる色素にて標識したプローブの組み合わせを用いてｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った場合、５’ＫＩＦ１Ｂプローブ１の標識が発するシグナル（例えば、蛍光）と３’ＲＥＴプローブ１の標識が発するシグナルとの重なりが観察された際にＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出できたと判定することができる。一方、５’ＲＥＴプローブ１の標識が発するシグナルと３’ＲＥＴプローブ１の標識が発するシグナルとの分離、５’ＲＥＴプローブ２の標識が発するシグナルと３’ＲＥＴプローブ２の標識が発するシグナルとの分離または５’ＫＩＦ１Ｂプローブ１の標識が発するシグナルと３’ＫＩＦ１Ｂプローブ１の標識が発するシグナルとの分離が観察された際にＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出できたと判定することができる。
なお、ポリヌクレオチドの標識は、公知の手法により行うことができる。例えば、ニックトランスレーション法やランダムプライム法により、蛍光色素等によって標識された基質塩基をポリヌクレオチドに取り込ませ、該ポリヌクレオチドを標識することができる。
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドと前記生体試料とをハイブリダイズさせる際の条件は、当該ポリヌクレオチドの長さ等の諸要因により変動し得るが、高ストリンジェンシーなハイブリダイズの条件として、例えば、０．２ｘＳＳＣ、６５℃という条件が挙げられ、低ストリンジェンシーなハイブリダイズの条件として、例えば、２．０ｘＳＳＣ、５０℃という条件が挙げられる。なお、当業者であれば、塩濃度（ＳＳＣの希釈率等）と温度の他、例えば、界面活性剤（ＮＰ−４０等）の濃度、ホルムアミドの濃度、ｐＨ等の諸条件を適宜選択することで、前記条件と同様のストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件を実現することができる。
前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドを用いて、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出する方法としては、前記ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション以外に、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング及びドットブロッティングが挙げられる。これら方法においては、前記生体試料から得られる核酸抽出物を転写したメンブレンに、前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより、前記融合遺伝子を検出する。前記（ａ）のポリヌクレオチドを用いた場合、ＫＩＦ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドとが、メンブレンにおいて展開された同一のバンドを認識した場合に、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出することができたと判定することができる。
前記（ｂ）のポリヌクレオチドを用いてＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出する方法としては、さらに、ゲノムマイクロアレイ解析やＤＮＡマイクロアレイ解析が挙げられる。これら方法においては、前記（ｂ）のポリヌクレオチドを基板に固定したアレイを作製し、当該アレイ上のポリヌクレオチドに前記生体試料を接触させることにより、当該ゲノムＤＮＡを検出する。
ＰＣＲやシークエンシングにおいては、前記生体試料から調製したＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ）やＲＮＡを鋳型としてＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの一部又は全部を特異的に増幅するために、下記（ｃ）のポリヌクレオチドを用いることができる。
（ｃ）ＫＩＦ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点を挟み込むように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド
「一対のプライマーであるポリヌクレオチド」は、標的となる前記融合ポリヌクレオチド等の塩基配列において、片方のプライマーがＫＩＦ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズし、他方のプライマーがＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプライマーセットである。これらポリヌクレオチドの長さは、通常１５〜１００塩基であり、好ましくは１７〜３０塩基である。
また、本発明の（ｃ）に記載のポリヌクレオチドは、ＰＣＲ法による検出の精度や感度の観点から、ＫＩＦ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点から５０００塩基内の前記融合ポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な配列であることが好ましい。
「一対のプライマーであるポリヌクレオチド」は、標的となるＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド等の塩基配列に基づき、公知の手法により適宜設計することができる。公知の手法としては、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ソフトウェア（登録商標、ＡＢＩ社製）を利用する方法が挙げられる。
「一対のプライマーであるポリヌクレオチド」の好適な例としては、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ−Ｆ１、ＫＩＦ５Ｂ−ｉｎｔ１５−Ｆ１、ＫＩＦ５Ｂ−ｉｎｔ１５−Ｆ２、ＫＩＦ５Ｂ−ｅｘ１６−Ｆ１、ＫＩＦ５Ｂ−ｅｘ２３−Ｆ１、ＫＩＦ５Ｂ−ｅｘ２４−Ｆ１、ＫＩＦ５Ｂ−Ｆ−ｏｒｆ２４３８及びＫＩＦ５Ｂ−ｉｎｔ１５−Ｆ３．５からなる群から選択される１のプライマーと、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ−Ｒ１、ＲＥＴ−ｉｎｔ１１−Ｒ３、ＲＥＴ−ｉｎｔ７−Ｒ１、ＲＥＴ−ｉｎｔ１１−Ｒ０．５、ＲＥＴ−ｉｎｔ１１−Ｒ１、ＲＥＴ−ｉｎｔ７−Ｒ２及びＲＥＴ−Ｒ−ｏｒｆ２３６４からなる群から選択される１のプライマーとからなるプライマーセットが挙げられ、より好ましくは、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ−Ｆ１及びＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ−Ｒ１、ＫＩＦ５Ｂ−ｉｎｔ１５−Ｆ１及びＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ−Ｒ１、ＫＩＦ５Ｂ−ｉｎｔ１５−Ｆ２及びＲＥＴ−ｉｎｔ１１−Ｒ３、ＫＩＦ５Ｂ−ｅｘ１６−Ｆ１及びＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ−Ｒ１、ＫＩＦ５Ｂ−ｅｘ２３−Ｆ１及びＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ−Ｒ１、ＫＩＦ５Ｂ−ｅｘ２４−Ｆ１プライマー及びＲＥＴ−ｉｎｔ７−Ｒ１プライマーが挙げられる。なお、これらのプライマーの配列並びにハイブリダイズする遺伝子の位置については、後述の表１及び配列表を参照のこと。
本発明において、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの翻訳産物を検出する方法としては、例えば、免疫染色法、ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー法、免疫沈降法、抗体アレイ解析が挙げられる。これら方法においては、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドに結合する抗体が用いられる。かかる抗体としては、例えば、ＫＩＦ５Ｂタンパク質とＲＥＴタンパク質との融合点を含むポリペプチドに特異的な抗体（以下、「融合点特異的抗体」とも称する）、ＲＥＴタンパク質の前記融合点よりＣ末端側の領域からなるポリペプチドに結合する抗体（以下、「ＲＥＴ−Ｃ末抗体」とも称する）、ＫＩＦ５Ｂタンパク質の前記融合点よりＮ末端側の領域からなるポリペプチドに結合する抗体（以下、「ＫＩＦ５Ｂ−Ｎ末抗体」とも称する）が挙げられる。ここで、「融合点特異的抗体」とは、前記融合点を含むポリペプチドに特異的に結合するが、野生型（正常型）ＫＩＦ５Ｂタンパク質及び野生型（正常型）ＲＥＴタンパク質のいずれにも結合しない抗体を意味する。
ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドは、前記融合点特異的抗体により、また、前記ＲＥＴ−Ｃ末抗体と前記ＫＩＦ５Ｂ−Ｎ末抗体との組み合わせにより検出することができる。ただし、例えば、正常肺細胞ではＲＥＴタンパク質の発現は殆ど検出されないため、免疫染色法において、ＲＥＴ−Ｃ末抗体を単独で用いた場合でも、肺腺がん組織におけるＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドの存在を検出することができる。
「ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドに結合する抗体」は、当業者であれば適宜公知の手法を選択して調製することができる。かかる公知の手法としては、前記ＲＥＴタンパク質のＣ末端部分からなるポリペプチド、ＫＩＦ５Ｂ-ＲＥＴ融合ポリペプチド、前記ＫＩＦ５Ｂタンパク質のＮ末端部分からなるポリペプチド等を免疫動物に接種し、該動物の免疫系を活性化させた後、該動物の血清（ポリクローナル抗体）を回収する方法や、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法等のモノクローナル抗体の作製方法が挙げられる。標識物質を結合させた抗体を用いれば、当該標識を検出することにより、標的蛋白質を直接検出することが可能である。標識物質としては、抗体に結合することができ、検出可能なものであれば特に制限されることはなく、例えば、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、アルカリホスファターゼ、ビオチン、及び放射性物質などが挙げられる。さらに、標識物質を結合させた抗体を用いて標的蛋白質を直接検出する方法以外に、標識物質を結合させた二次抗体、プロテインＧまたはプロテインＡ等を用いて標的蛋白質を間接的に検出する方法を利用することもできる。
上記の方法により、患者から単離した試料において、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの存在が検出された場合、当該患者は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定され、一方、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの存在が検出されなかった場合は、当該患者は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が低いと判定される。
＜ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を判定するための薬剤＞
上記の通り、少なくとも１５塩基の鎖長を有する、下記（ａ）〜（ｃ）に記載のいずれかであるポリヌクレオチドは、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの存在または非存在の検出に好適に用いることができる。
（ａ）ＫＩＦ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及びＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも一つのプローブであるポリヌクレオチド
（ｂ）ＫＩＦ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド
（ｃ）ＫＩＦ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点を挟み込むように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド。
従って、本発明は、これらポリヌクレオチドを含む、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を判定するための薬剤をも提供するものである。
これらポリヌクレオチドは、標的遺伝子の特定の塩基配列に相補的な塩基配列を有する。ここで「相補的」とは、ハイブリダイズする限り、完全に相補的でなくともよい。これらポリヌクレオチドは、該特定の塩基配列に対して、通常、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは１００％の相同性を有する。
なお、（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、またその一部又は全部において、ＰＮＡ（ｐｏｌｙａｍｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ペプチド核酸）、ＬＮＡ（登録商標、ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、架橋化核酸）、ＥＮＡ（登録商標、２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）、ＧＮＡ（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、グリセロール核酸）、ＴＮＡ（Ｔｈｒｅｏｓｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、トレオ―ス核酸）等の人工核酸によって、ヌクレオチドが置換されているものであってもよい。
また、上記の通り、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドに結合する抗体は、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの翻訳産物の検出に好適に用いることができる。従って、本発明は、当該抗体を含む、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を判定するための薬剤をも提供するものである。
本発明の薬剤においては、有効成分としての前記物質（ポリヌクレオチド、抗体）に加え、薬理学上許容される他の成分を含むことができる。このような他の成分としては、例えば、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、防腐剤、生理食塩などが挙げられる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。防腐剤としてはアジ化ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。
また、ポリヌクレオチドや抗体を含む標品に加えて、ポリヌクレオチドや抗体に付加した標識の検出に必要な基質、陽性対照（例えば、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチド、またはこれらを保持する細胞等）や陰性対照、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等において用いられる対比染色用試薬（ＤＡＰＩ等）、抗体の検出に必要な分子（例えば、二次抗体、プロテインＧ、プロテインＡ）、試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液等の標品を組み合わせ、本発明の方法に用いるためのキットとすることもできる。当該キットには、当該キットの使用説明書を含めることができる。本発明は、上記本発明の方法に用いるためのキットをも提供するものである。
＜がんを治療する方法、がんの治療剤＞
上記の通り、本発明の方法によりＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの存在を検出された患者は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと考えられる。このため、がん患者のうち、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子を保持する患者に選択的に、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を投与することにより、効率的にがんの治療を行うことが可能である。従って、本発明は、がんを治療する方法であって、上記本発明の方法によりＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定された患者に、前記ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を投与する工程を含む方法を提供するものである。
また、本発明は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を有効成分とするがんの治療剤であって、上記本発明の方法によりＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定された患者に投与される治療剤を提供するものである。
「ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤」としては、上記の通り、ＲＥＴチロシンキナーゼの機能を直接的に又は間接的に抑制できる物質であれば特に制限はない。ＲＥＴチロシンキナーゼを阻害しうる限り、他のチロシンキナーゼを阻害する物質であってもよい。本発明に適用し得る公知のＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤としては、例えば、４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトキシ）キナゾリン（一般名：バンデタニブ（Ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ）；ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ及びＲＥＴを標的とする化合物）、４−［４−［３−［４−クロロ‐３−（トリフルオロメチル）フェニル］ウレイド］フェノキシ］−Ｎ−メチルピリジン−２−カルボアミド（一般名：ソラフェニブ（Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）；ＢＲＡＦ及びＲＥＴ等を標的とする化合物）、Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−５−［（Ｚ）−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキシアミド モノ［（２Ｓ）−２−ヒドロキシサクシネート］（一般名：スニチニブ（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）；ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＲＥＴ等を標的とする化合物）、Ｎ−（３，３−ジメチルインドリン−６−イル）−２−（ピリジン−４−イルメチルアミノ）ニコチンアミド（一般名：モテサニブ（Ｍｏｔｅｓａｎｉｂ）；ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＲＥＴ等を標的とする化合物）、ＸＬ１８４／カボザンチニブ（ＸＬ１８４／Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ；ＶＥＧＦＲ、ＭＥＴ、ＲＥＴ等を標的とする化合物）が挙げられる。
患者へのＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤の投与方法は、当該阻害剤の種類やがんの種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、経口、静脈内、腹腔内、経皮、筋肉内、気管内（エアゾール）、直腸内、膣内等の投与形態を採用することができる。
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜サンプル＞
日本人コホートは１９９７年から２００８年に国立がん研究センター中央病院で外科的切除を受けた３１９例の肺腺がん患者からなる。ＵＳＡ（ＵＭＤ）コホートは１９８７年から２００９年にボルチモア大都市圏（Ｍｅｔｒｏｐｏｌｉｔａｎ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）地区の病院でリクルートされた。また、全ての腫瘍は悪性腫瘍のＴＮＭ分類に従い病理学的に診断された。
トータルＲＮＡは、大まかに切り分けて凍結した組織サンプルから製造者のインストラクションに従いトリゾール試薬を用いて抽出し、モデル２１００ バイオアナライザー（ｍｏｄｅｌ ２１００ ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ、アジレント・テクノロジー社製）を用いて質の検定を行った。結果、全てのサンプルが６を超えるＲＩＮ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｎｕｍｂｅｒ）値を示した。また、組織サンプルからは、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡミニキット（登録商標、キアゲン社製）を用いてゲノムＤＮＡも抽出した。なお、この研究は、本研究に係る組織の倫理審査員会の承認を得て進められた。
＜ＲＮＡシークエンシング＞
ＲＮＡシークエンシングのためのｃＤＮＡライブラリーは製造者の標準プロトコールに従い、ｍＲＮＡ−Ｓｅｑサンプル調製キット（イルミナ社製）を用いて調製した。簡潔に説明すると、２μｇのトータルＲＮＡからｐｏｌｙ−Ａ（＋）ＲＮＡを精製し、フラグメンテーション緩衝液で９４℃、５分加熱することで断片化した後、２本鎖ｃＤＮＡ合成に用いた。得られた２本鎖ｃＤＮＡをＰＥアダプターＤＮＡにライゲ―ションした後、２５０〜３００ｂｐ（挿入ＤＮＡサイズ：１５０〜２００ｂｐ）のフラクションをゲル精製し、１５サイクルのＰＣＲで増幅した。そして、このように生成したライブラリーをゲノムアナライザーＩＩｘシークエンサー（ＧＡＩＩｘ、イルミナ社製）を用いた５０−ｂｐペアエンドシークエンスに供した。
＜融合転写産物の検出＞
融合転写産物の検出は、Ｔｏｔｏｋｉ Ｙら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．、２０１１年５月、４３巻、５号、４６４〜４６９ページに記載の方法を改変して行った。簡潔に説明すると、まず最初に、同じ塩基配列のペアエンドリードを、これらはＰＣＲ増幅過程で生成したものと考えられることから除去した。次いで、ＢＯＷＴＩＥプログラム（バージョン０．１２．５）を用いて、ペアエンドリードをＲｅｆＳｅｑデータベース（Ｆｉｌｅ：ｈｕｍａｎ．ｒｎａ．ｆｎａ ｆｒｏｍ ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｆｓｅｑ，Ｄａｔｅ：Ｓｅｐ２０，２０１０）に登録されているヒトＲＮＡ配列に対して２塩基以下のミスマッチを許す条件でマップした。そして、適正な間隔と向きで同一ＲＮＡ配列にマップされる“適正な”リードペアを除去した。次いで、複数のゲノム座位にヒットするリードを除去した後に、リードの“クラスター”を構築した。
次に、融合転写産物を示唆する“ペアクラスター”を以下の解析条件により選出した。
（Ｉ）最大の挿入配列長に該当する距離内に整列されるリードからなる“クラスター”を順方向、逆方向それぞれのアライメントから構築する（二つのリードはその終点が最大の挿入配列長に該当する距離より離れていなければ同一のクラスターに位置させる）。
（II）最も左又は右に位置するリード間の距離が挿入配列長よりも大きければ捨てる。
（III）片方の配列が“順方向クラスター”、もう片方の配列が“逆方向クラスター”に位置するならば、そのペアエンドリードを選出する（この“順方向クラスター”と“逆方向クラスター”とを合わせて“ペアクラスター”と呼ぶ）。
（IV） 少なくとも一方のペアエンドリードが基準ヒトＲＮＡ配列に完全一致するペアクラスターを選出する。
（Ｖ） 塩基の多様性によって誤って選ばれた遺伝子ペアを除去する。この目的のため、ＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて、ペアクラスターに含まれるペアエンドリードをヒト基準ＲＮＡ配列に対して整列した。次に、一方の端の配列がペアクラスターに整列され、もう片方が適正な距離と向きで同一のＲＮＡ配列に整列された場合、その遺伝子ペアを除外した。カットオフ値として、予測値１０００を用いた。
そして、一つの肺腺がんサンプルにおいて２０を超えるペアエンドリードが得られ、３例の非がん肺組織のいずれにも表れなかった遺伝子ペアをピックアップした。一つの遺伝子領域内、もしくは隣接した遺伝子領域にマップされたペアクラスターはそれらがＲｅｆＳｅｑデータベースに未登録の選択的スプライシング・リードスルー転写産物の可能性があるので、更なる解析から外した。融合境界点をまたぐジャンクションリードをＭａｐＳｐｌｉｃｅ（バージョン１．１４．１）ソフトウエアを用いて探索した。この際、それぞれの遺伝子に対するリードクラスター領域と隣接する３００ｂｐの領域からなるゲノムＤＮＡ配列二つをつなぎ合わせて一つのＤＮＡ配列を作り、このＤＮＡに対してＭａｐＳｐｌｉｃｅソフトウエアを用いてジャンクションリードを探索した。
＜ＲＴ−ＰＣＲ、ゲノムＰＣＲ、サンガーシークエンシング＞
トータルＲＮＡ（５００ｎｇ）をスーパースクリプトIII逆転写酵素（登録商標、インビトロジェン社製）を用いて逆転写した。そして、得られたｃＤＮＡ（１０ｎｇのトータルＲＮＡに相当）もしくは１０ｎｇのゲノムＤＮＡをＫＡＰＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＡＰＡバイオシステムス社製）を用いたＰＣＲ増幅に供した。反応は次の条件のもとサーマルサイクラー内で行った：９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃２分を４０サイクル、その後７２℃１０分最終伸長反応。また、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）をコードする遺伝子をｃＤＮＡ合成の効率の評価のため増幅した。さらに、ＰＣＲ産物はＢｉｇＤｙｅターミネーターキットとＡＢＩ ３１３０ｘｌ ＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムス社製）とを用いて、両方向に塩基配列を直接決定した。なお、本研究で用いたプライマーを表１に示す。
＜ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＡＬＫ変異の解析＞
全ての肺腺がん組織のゲノムＤＮＡにおける、ＥＧＦＲ及びＫＲＡＳ遺伝子の体細胞変異については、「Ｔａｋａｎｏ，Ｔ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．、２００５年、２３巻、６８２９〜６８３７ページ」に記載の高解像度融解（ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｅｌｔｉｎｇ、ＨＲＭ）法を用いて解析した。また、同じ組織に由来するトータルＲＮＡについて、ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ逆転写ＰＣＲ法を用いてＡＬＫ／ＥＭＬ４又はＡＬＫ／ＫＩＦ５Ｂ融合転写産物の発現を調べた。
＜ゲノムコピー数解析＞
肺腺がんのゲノムコピー数は、本発明者による過去の報告（Ｉｗａｋａｗａ，Ｒ．ら、「ＭＹＣ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓ ａ Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｍａｒｋｅｒ ｏｆ Ｅａｒｌｙ Ｓｔａｇｅ Ｌｕｎｇ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２０１０年１２月１０日オンライン）に記載したように、ジーンチップ ヒトマッピング２５０−Ｋ ＳＮＰアレイ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｍａｐｐｉｎｇ ２５０−Ｋ ＳＮＰ ａｒｒａｙｓ、登録商標、アフィメトリクス社製）とアフィメトリクス社製ジーンチップマッピングアレイ用コピー数アナライザー（ＣＮＡＧ）ソフトウエア（Ｎａｎｎｙａ，Ｙ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.、２００５年、６５巻、６０７１〜６０７９ページ 参照）とを用いて決定した。
＜マイクロアレー解析とデータ処理＞
全部で、２２８例を発現プロファイル解析に供した。トータルＲＮＡ（１００ｎｇ）を５×メガスクリプトＴ７キットでラベルし、アフィメトリクス Ｕ１３３ プラス ２．０ アレイで解析した。得られたデータはＭＡＳ５アルゴリズムで正規化し、５４，４６７５プローブの平均発現レベルをそれぞれのサンプルで１０００になるようにした。
＜免疫組織化学解析＞
パラフィンブロックを４μｍ厚にて薄切し、シランコーティングスライドに発付した。次いで、薄切切片をキシレン・アルコール系列で脱パラフィン・親水化し、スライドを３％過酸化水素水で２０分処理することで内因性ペルオキシダーゼをブロックし、次に脱イオン水で２〜３分洗浄した。抗原賦活化はｔａｒｇｅｔｅｄ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ溶液を用いて９５度の温浴を４０分行った。スライドを洗浄後、５％正常動物血清で１０分反応させ、非特異反応をブロッキングし、一次抗体としてＲＥＴ（１：２５０希釈、３４５４＿１クローン）及びＴＴＦ１（１：１００希釈、８Ｇ７Ｇ３／１クローン）を用い、室温にて１時間インキュベーションした。検出はＴＴＦ１に対してはＥｎｖｉｓｉｏｎ−Ｐｌｕｓシステムを用いて、ＲＥＴに対してはＥｎＶｉｓｉｏｎ−ＦＬＥＸ処理後にＬＩＮＫＥＲ試薬を追加して、各々検出した。洗浄後、発色は３，３’−ジアミノベンジジン溶液を用いて５分間反応させ、流水洗浄後にヘマトキシリンによるカウンター染色で可視化した。なお、ＴＴＦ１に対しては腫瘍細胞における１０％を超える核染色、ＲＥＴに対しては細胞質染色を陽性と判断した。
＜蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）＞
まず１日目に、免疫染色同様、薄切切片を脱パラフィン・親水化後風乾を行った。風乾後、常温の０．２Ｎ塩酸に２０分間静置し、さらに常温の精製水に３分間静置し、その後、常温の洗浄緩衝液（２×ＳＳＣ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ）にて３分間静置した。次いで、８５℃の前処理液（Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に３０分間静置し、その後洗浄緩衝液（２×ＳＳＣ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ）にて２回洗浄を行った。次いで、３７℃のプロテアーゼ溶液に６０分間静置し、酵素処理を行い、２×ＳＳＣ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒにて２回洗浄行った。
次いで、常温の１０％中性緩衝ホルマリンに１０分間静置して再固定を行い、常温の洗浄緩衝液（２×ＳＳＣ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ）にて２回洗浄行った。そして、アルコール系列で脱水後風乾させた。
ＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子の検出には、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子の形成によって生じる、ＲＥＴ遺伝子のキナーゼドメインのコード領域よりも５’側の上流領域と、ＲＥＴ遺伝子のキナーゼドメインのコード領域および該コード領域よりも３’側の下流領域との分離（ｓｐｌｉｔ）を検出できるように設計された下記プローブのセットを用いた。
５’ＲＥＴプローブ１：ＢＡＣクローンＤＮＡ(ＧＳＰ１５０６Ｆ０９) をカバーする１００〜１０００塩基の鎖を有する、ＴｅｘＲｅｄで標識されたプローブ群（株式会社ＧＳＰ研究所製）
３’ＲＥＴプローブ１：ＦＩＴＣで標識されたＢＡＣクローンＤＮＡ（ＧＳＰ１８７７Ｈ０８、ＧＳＰ１０１８Ｇ０２、ＧＳＰ１０７０Ｃ１２、ＧＳＰ０３６９Ｇ０８又はＧＳＰ００７５Ｄ０３）をカバーする１００〜１０００塩基の鎖を有する、ＴｅｘＲｅｄで標識されたプローブ群（株式会社ＧＳＰ研究所製）。
なお、これらプローブの標識はニックトランスレーション法にて行った。また、これらプローブ群がハイブリダイズするゲノム上の位置を図１１の下部に示す。
そして、前記ホルマリン固定した薄切切片に前記ＤＮＡプローブ混合液を１０μｌ添加し、カバーガラスを乗せ、ペーパーボンドでシールした。次いで、ハイブリダイザー（製品名：Ｔｈｅｒｍｏ Ｂｒｉｔｅ（登録商標）、アボットジャパン社製）を用いて、７５℃にて５分間インキュベートした後、さらに３７℃にて７２時間〜９６時間インキュベートすることにより、ハイブリダイゼーションを行った。
インキュベート後に、ペーパーボンドを取り除き、常温のポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液（２ｘＳＳＣ／０．３％ＮＰ−４０ ｐＨ７〜７．５）にカバーガラスの乗った標本を入れ、５分放置した後、カバーガラスを剥がした。次いで、７２±１℃に加温したポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液（２ｘＳＳＣ／０．３％ＮＰ−４０ ｐＨ７〜７．５）に標本を入れ、３０秒〜１分静置した。
次いで、アルミ箔で遮光でした２×ＳＳＣ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒを入れた常温のコプリンジャーに標本を移した。そして、ＤＡＰＩ １０μｌをスライドガラスに添加することにより対比染色を行い、カバーガラスをのせ、マニキュアにてカバーガラスを固定化した。
判定は蛍光顕微鏡下で行い、腫瘍５０細胞にて、赤色のＲＥＴ由来のシグナル及び緑色のセントロメア１０由来のシグナルにおける融合、分離及び単独シグナルをそれぞれカウントした。
（実施例１）
先ず、治療標的となりうる新規キメラ融合転写産物を同定するため、３０例の肺腺がんと３例の付随非がん肺組織の全トランスクリプトームシークエンシング（ＲＮＡシークエンシング、Ｍｅｙｅｒｓｏｎ，Ｍ．ら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ、２０１０年、１１巻、６８５〜６９６ページ）を行った。なお、これら３０例の肺腺がんは、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合を有する２例、ＥＧＦＲ変異を有する２例、ＫＲＡＳ変異を有する２例、そして、ＥＧＦＲ／ＫＲＡＳ／ＡＬＫ変異を有しない２４例であった（表２ 参照）。
そして、前記ＲＮＡシークエンシングで得られた２×１０７以上のペアエンドリードを解析し、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ産物のサンガーシークエンシングを行った。得られた結果を表２、図１及び図２に示す。
表２に示した結果から明らかなように、ＥＭＬ４−ＡＬＫの２例を含む７つの融合転写産物が同定され、これらの中で、染色体１０ｐ１１．２に存在するＫＩＦ５Ｂ遺伝子と染色体１０ｑ１１．２に存在するＲＥＴ遺伝子の融合が症例ＢＲ００２０において検出された（図１のＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴバリアント１、図２ 参照）。
なお、ＲＥＴ遺伝子については、ＫＩＦ５Ｂ以外の他の遺伝子との融合が甲状腺乳頭癌におけるｄｒｉｖｅｒ変異（責任変異）であることが示されている（Ｍａｎｉ，Ｒ．Ｓ．ら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ、２０１０年、１１巻、８１９〜８２９ページ、及びＷｅｌｌｓ，Ｓ．Ａ．，Ｊｒ．ら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２００９年、１５巻、７１１９〜７１２３ページ 参照）。しかしながら、肺腺がんを含めたがんとＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合転写産物との関係は知られていなかったため、この融合遺伝子について着目して更なる解析を進めた。
（実施例２）
次に、全トランスクリプトームシークエンシングを行った３０例を含む３１９例の日本の肺腺がんを対象としたＲＴ−ＰＣＲスクリーニングとＰＣＲ産物のサンガーシークエンシングとを行った。得られた結果を表３、図３及び図４に示す。
表３、図３及び図４に示す通り、２．０％（６／３１９）の症例において、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合転写産物を発現していることが明らかになった。また、４つのｖａｒｉａｎｔが同定され、そのすべてがｉｎ−ｆｒａｍｅであることも明らかになった。さらに、これらの融合転写産物にコードされる蛋白質は、ＫＩＦ５ＢのコイルドコイルドメインとＲＥＴのキナーゼドメインを有していることも明らかになった（図１ 参照）。なお、このＫＩＦ５Ｂのコイルドコイルドメインは、ＫＩＦ５Ｂのホモダイマー形成において機能することが知られているため（Ｈｉｒｏｋａｗａ，Ｎ．、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、２００９年、１０巻、６８２〜６９６ページ）、ＰＴＣ−ＲＥＴやＫＩＦ５Ｂ−ＡＬＫ融合と同様に、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ蛋白質はＫＩＦ５Ｂのコイルドコイルドメインを介してホモダイマーを形成し、ＲＥＴのキナーゼ機能の恒常的な活性化をもたらすことが想定される。
また、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合は、他の主要なタイプの肺がん（０／２０５扁平上皮がん、０／２０小細胞がん）や４０例の肺腺がんを含む９０の肺がん細胞株では検出されなかった。なお、これらの肺がん細胞株については、Ｂｌａｎｃｏ，Ｒ．ら、Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ、２００９年、３０巻、１１９９〜１２０６ページを参照のこと。
（実施例３）
次に、６例のＲＥＴ融合陽性例のゲノムＰＣＲ解析を行った。得られた結果を図５〜１０に示す。
図５〜７に示す通り、ヒト染色体１０ｐ１１．２のＫＩＦ５Ｂイントロン１５，１６，２４と染色体１０ｑ１１．２のＲＥＴイントロン７，１１とが体細胞レベルにて融合していることが明らかになった。
また、これらの結果から、さらに図８及び９に示す通り、両座位でゲノムコピー数の変化が生じていないことから、図１０に示すような第１０染色体のセントロメア領域で長腕と短腕の間で染色体逆位が生じたことを示していることも明らかになった。
また、ＲＥＴ融合陽性例のゲノムにおける切断点周辺のＤＮＡ配列は、有意な相同性を示していなかった。さらに、症例ＢＲ００２０では、切断点はヌクレオチドの重なりや挿入なしに結合しているのに対し、他の症例においては、挿入（ＢＲ１００１及びＢＲ１００３）や重なり（ＢＲ１００２及びＢＲ００３０）が生じていることが明らかになった（図６ 参照）。また、症例ＢＲ１００４では、３４９ｂｐのＤＮＡ断片の挿入を伴う結合が見出された（図７ 参照）。
従って、これらの結果はヒトがんで見出されている他の多くの染色体転座例（Ｍａｎｉ，Ｒ．Ｓ．ら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ、２０１０年、１１巻、８１９〜８２９ページ 参照）と合致しているため、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合は、非相同末端結合を介した誤ったＤＮＡ２本鎖切断の修復により形成されたことを示唆している。
（実施例４）
次に、ＲＥＴ融合陽性例（ＢＲ００２０）の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション解析を行った。得られた結果を図１１に示す。図１１に示した結果から明らかなように、ＲＥＴ遺伝子のキナーゼドメインのコード領域よりも５’側の上流領域にハイブリダイズするプローブ（５’ＲＥＴプローブ１）と、ＲＥＴ遺伝子のキナーゼドメインのコード領域および該コード領域よりも３’側の下流領域にハイブリダイズするプローブ（３’ＲＥＴプローブ１）を用いた場合、プローブシグナルの分離（ｓｐｌｉｔ）が検出された。
（実施例５）
次に、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合を持つ全６例の肺腺がんにおける他の公知の変異（ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ及びＡＬＫ変異、非特許文献１、５及び７ 参照）の有無を調べた。得られた結果を表４に示す。また、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合を持つ全６例の肺腺がんの病理学的所見についても観察した。得られた結果を図１１及び１２に示す。なお、表４および５に記載の「ＡＤＣ」は「腺がん」であることを示す。
表４に示した結果から明らかなように、前記全６例のいずれも、ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＡＬＫ変異が陰性、つまりｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ症例であり、ＲＥＴ融合と他のがん遺伝子変化とは相互排他的な関係にあった。なお、全ての症例において、肺腺がんのマーカーである甲状腺転写因子−１（ＴＴＦ１）は陽性であった。
従って、この結果から、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合が責任変異であり、ｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ肺腺がんの５．５％（６／１０９）の原因となることが示唆された。
また、図１２及び図１３に示す通り、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性腫瘍は乳頭状あるいは肺胞上皮置換性の増殖形態を示し、高・中程度の分化度を示していることが明らかになった。
（実施例６）
次に、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性肺腺がんにおけるＲＥＴの発現レベルを調べた。得られた結果を図３、図１４、図１５及び表４に示す。
図３及び図１４に示す通り、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性肺腺がんは融合陰性肺腺がんや非がん肺組織よりも高いＲＥＴ発現レベルを示した（図３ 参照）。また、６例の融合陽性例を含めた２２８例の遺伝子発現データによっても、ＲＥＴ発現レベルのその傾向は確かめられた（図１４ 参照）。
さらに図１５に示した結果から明らかなように、ＲＥＴ蛋白質のＣ末端領域に対する抗体を用いた免疫組織化学解析では、検索した融合陽性例の腫瘍細胞の細胞質内にＲＥＴ陽性の染色像が見られた（図１５及び表４ 参照）。一方、非がん肺細胞やいくつかの融合陰性例の腫瘍細胞では、そのような染色像は見られなかった。
なお、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合のない肺腺がんの一部（２２％，４８／２２２）においても、非がん肺組織よりも高いレベルのＲＥＴ遺伝子の発現がみられた。６例のそのような症例（表５ 参照）については、ＲＮＡシークエンシングにて解析したが、ＫＩＦ５Ｂ以外の遺伝子へのＲＥＴ遺伝子の融合やＲＥＴ遺伝子の体細胞変異、ＲＥＴ座位のコピー数増加は見出されなかった（図１６及び１７ 参照）。
（実施例７）
肺腺がんにおけるがん遺伝子変異の分布は民族によって異なることが示されている。アジア人では非アジア人よりもＥＧＦＲ変異の頻度が高く（５０％ ｖｓ １０％）、ＫＲＡＳ変異では逆の傾向にある（１０％ ｖｓ ３０％）。その一方、ＡＬＫ融合においては同等であること（５％）が知られている（非特許文献６、及びＳｈｉｇｅｍａｔｓｕ，Ｈ．ら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ、２００５年、９７巻、３３９〜３４６ページ 参照）。そこで、非アジア人におけるＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合の分布を知るため、ＵＳＡコホート由来の腺がん症例（表３ 参照）におけるＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合の頻度を調べた。得られた結果を図１８及び１９に示す。
図１８及び１９に示した結果から明らかなように、バリアント１転写産物はＵＳＡ症例において１／８０（１．３％）検出され、その１例はコケージャンであった。この症例は、前記の日本人症例と同様ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＡＬＫ変異が陰性、つまりトリプルネガティブ（ｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ）症例であり、前記３変異とＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合とは相互排他的な関係にあることが明らかになった。
従って、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合はアジア人、非アジア人共に肺腺がんの１〜３％に生じていることが明らかになった。なお、１例のＲＥＴ融合をもつ非アジア人症例は喫煙者であるが、６例の日本人融合陽性症例は非喫煙者であり、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合陽性症例における喫煙による影響は不明である。
以上説明したように、本発明によれば、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を予測することが可能となる。
ＲＥＴ受容体型チロシンキナーゼに対する阻害効果を持つ阻害剤は既にがん医療に導入されている。ＦＤＡ承認阻害剤、例えばバンデタニブやソラフェニブは非小細胞肺がんに対して抗がん活性を有することが示されている。上記の通り、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子とのインフレーム融合が複数例で生じている。さらにＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合は、ＥＧＦＲ／ＫＲＡＳ／ＡＬＫ変異型腫瘍から乖離している。従って、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合は、既存のチロシンキナーゼ阻害剤の標的となりうる。また、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合は日本人を含むアジア人に限らず、欧米人においても認められる。従って、本発明の方法は、幅広い人種において、がん治療の効率を高める上で、極めて有用である。
配列番号１
＜２２３＞ ＫＩＦ５Ｂ ｃＤＮＡ
配列番号３
＜２２３＞ ＲＥＴ ｃＤＮＡ
配列番号５
＜２２３＞ ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合バリアント１
配列番号７
＜２２３＞ ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合バリアント２
配列番号９
＜２２３＞ ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合バリアント３
配列番号１１
＜２２３＞ ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合バリアント４
配列番号１３〜２８
＜２２３＞ 人工的に合成されたプライマーの配列

Claims (6)

  1. ＫＩＦ５Ｂタンパク質のＮ末端部分と、ＲＥＴタンパク質のＣ末端部分とが融合しているポリペプチド。
  2. 請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  3. ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を判定する方法であって、患者から単離した試料における請求項２に記載のポリヌクレオチドの存在または非存在を検出する工程を含み、前記ポリヌクレオチドの存在が検出されれば、前記患者における前記ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定される方法。
  4. 請求項３に記載の方法によりＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を判定するための薬剤であって、少なくとも１５塩基の鎖長を有する下記（ａ）〜（ｃ）に記載のいずれかであるポリヌクレオチド、または、下記（ｄ）に記載の抗体を含む薬剤
    （ａ）ＫＩＦ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及びＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも一つのプローブであるポリヌクレオチド
    （ｂ）ＫＩＦ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド
    （ｃ）ＫＩＦ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点を挟み込むように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド
    （ｄ）ＫＩＦ５Ｂタンパク質とＲＥＴタンパク質とが融合しているポリペプチドに結合する抗体。
  5. がんを治療する方法であって、請求項３に記載の方法によりＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定された患者に、前記ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を投与する工程を含む方法。
  6. ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を有効成分とするがんの治療剤であって、請求項３に記載の方法によりＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定された患者に投与される治療剤。
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