JPWO2012014795A1

JPWO2012014795A1 - 新規ｒｅｔ融合体の検出法

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Publication number: JPWO2012014795A1
Application number: JP2012526465A
Authority: JP
Inventors: 信昭新堂; 西村　耕一; 耕一西村; 佐野　頼方; 頼方佐野; 真浅海; 文山中; 崇史二見; 竜也川瀬
Original assignee: Astellas Pharma Inc
Current assignee: Astellas Pharma Inc
Priority date: 2010-07-26
Filing date: 2011-07-22
Publication date: 2013-09-12
Also published as: US20130137111A1; WO2012014795A1; EP2599878A1; EP2599878A4

Abstract

【課題】癌の新たな原因遺伝子であるポリヌクレオチドを解明し、これにより、当該ポリヌクレオチド又はそれがコードするポリペプチドの検出方法、及びそのためのキット及びプライマーセットを提供することを課題とする。【解決手段】癌患者の一部に存在している、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子の一部とＲＥＴ遺伝子の一部との融合遺伝子が癌の原因遺伝子であることを見出し、当該遺伝子であるポリヌクレオチド及びそれがコードするポリペプチドの検出方法を構築した。前記検出方法では、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子の一部とＲＥＴ遺伝子の一部との融合遺伝子、あるいは、それがコードする融合タンパク質を検出する。前記プライマーセット又は検出用キットは、ＫＩＦ５Ｂをコードする部分から設計されるセンスプライマーと、ＲＥＴをコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーとを含む。【選択図】なし

Description

本発明は、ＲＥＴキナーゼ領域を含む新規の融合遺伝子又は該融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の検出方法に関する。

レアレンジドデュアリングトランスフォーメーション（ｒｅａｒｒａｎｇｅｄｄｕｒｉｎｇｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＲＥＴ）遺伝子は染色体１０番長腕のセントロメア付近に存在し、２１個のエキソンからなる。コードする蛋白質は容体型チロシンキナーゼであり、中央部に細胞膜貫通領域を有し、そのカルボキシル末端側にチロシンキナーゼ領域、アミノ末端側に細胞外領域を有する。カルボキシル末端のスプライシングの違いにより１０７２アミノ酸（ＲＥＴ９）、１１０６アミノ酸（ＲＥＴ４３）、１１１４アミノ酸（ＲＥＴ５１）の３種類の蛋白質が存在することが知られている（非特許文献１）。ＲＥＴはリガンド／ＧＦＲ複合体を介して二量体を形成することで自己のチロシンをリン酸化し活性化する（非特許文献１）。

甲状腺乳頭癌において、ＲＥＴ遺伝子が染色体内逆位もしくは染色体間転座により他の遺伝子（Ｈ４、ＥＬＥ１など）と融合し、癌化能を持った融合型チロシンキナーゼＲＥＴ／ＰＴＣが発現していることが報告されている（非特許文献２）。これらの融合はＲＥＴのチロシンキナーゼ領域のアミノ末端側で生じており、ＲＥＴは細胞外領域及び細胞膜貫通領域を失い、融合パートナーとの融合蛋白質を形成している。融合パートナー分子の多くは複合体形成ドメインを有していることから、融合体自身も複合体を形成していると考えられており、この複合体形成がＲＥＴのチロシンキナーゼ活性の恒常的な自己リン酸化を引き起こし、細胞内シグナルが異常に活性化され癌化及び細胞増殖を惹き起こしていると考えられている（非特許文献２）。実際に、ＲＥＴ／ＰＴＣ融合遺伝子をマウス正常細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入すると癌細胞様に形質転換すること、さらにはＲＥＴキナーゼ抑制化合物がＲＥＴ／ＰＴＣ融合遺伝子を発現した甲状腺癌細胞株の細胞増殖を抑制できることから、ＲＥＴ／ＰＴＣ融合体が甲状腺癌の治療標的分子となる可能性が示唆されている（非特許文献３−５）。これまでに１０種類以上のＲＥＴ／ＰＴＣ融合遺伝子が甲状腺癌において存在する事が報告されているが、肺癌でＲＥＴ融合遺伝子が存在しているとの報告は無い。

キネシンファミリープロテイン５Ｂ（Ｋｉｎｅｓｉｎｆａｍｉｌｙｐｒｏｔｅｉｎ５Ｂ；ＫＩＦ５Ｂ）遺伝子は染色体１０番短腕に存在し２６個のエキソンからなる。ＫＩＦ５Ｂは、細胞内の微小管輸送に関わるモーター蛋白質複合体の構成分子の一つであり、微小管に沿って移動する特性を有し細胞内物質輸送に関与していることが知られている（非特許文献６）。

これまでにＫＩＦ５Ｂと容体型チロシンキナーゼＰＤＧＦＲαとの融合蛋白質が過好酸球増加症患者において発現しているとの報告がなされている（非特許文献７）。また、非小細胞肺癌において、ＫＩＦ５Ｂと容体型チロシンキナーゼであるアナプラスチックリンフォーマキナーゼ（ＡｎａｐｌａｓｔｉｃＬｙｍｐｈｏｍａＫｉｎａｓｅ）との融合蛋白質が存在すると報告されている（非特許文献８）が、ＫＩＦ５ＢとＲＥＴが融合しているとの報告はなされていない。

トレンド・イン・ジェネティクス（TRENDS in Genetics），（英国），２００６年，２２巻，ｐ．６２７−６３６ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・エンドクリノロジー（European journal of endoclinology），（英国），２００６年，１５５巻，ｐ．６４５−６５３キャンサー・リサーチ（CANCER RESEARCH），（米国），２００２年，６２巻，ｐ．７２８４−７２９０ジャーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド・メタボリズム（The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism），（米国），２００６年，９１巻，ｐ．４０７０−４０７６ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY），（米国），２００７年，２８２巻，ｐ．２９２３０−２９３４０ネイチャー・レビューズ・モレキュラー・セル・バイオロジー（NATURE REVIEWS Molecular cell Biology），（英国），２００９年，１０巻，ｐ．８７７−８８４リューケミア（Leukemia），（英国），２００６年，２０巻，ｐ．８２７−８３２クリニカル・キャンサー・リサーチ（CLINICAL CANCER RESEARCH），（米国），２００９年，１５巻，ｐ．３１４３−３１４９

癌の新たな原因遺伝子であるポリヌクレオチドを解明し、これにより、当該ポリヌクレオチド又はそれがコードするポリペプチドの検出方法、及びそのためのキット及びプライマーセットを提供することを課題とする。

本発明者は、肺癌患者から得た検体から、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子の一部と、キナーゼであるＲＥＴ遺伝子の一部とが融合した新規の融合遺伝子を単離同定し（実施例１）、これらの融合遺伝子が肺癌患者検体に存在すること（実施例２）、また、これらの融合遺伝子が腫瘍形成能を有し、癌の原因遺伝子であることを見出した（実施例３、４及び６）。本発明者は、これらの知見から、これらの融合遺伝子およびそれにコードされる融合タンパク質の検出方法を構築し（実施例２及び実施例５）、そのためのキット及びプライマーセットを提供し、これらの融合遺伝子又はそれにコードされる融合タンパク質を検出することにより、ＲＥＴ阻害薬物治療の対象となる癌患者を選別することを可能とした。

すなわち、本発明は、以下の［１］〜［９］に関する。
［１］被験者から得た試料中の、下記に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とする、キネシンファミリープロテイン５Ｂ（Ｋｉｎｅｓｉｎｆａｍｉｌｙｐｒｏｔｅｉｎ５Ｂ；ＫＩＦ５Ｂ）遺伝子とリアレンジドデュアリングトランスフォーメーション（ｒｅａｒｒａｎｇｅｄｄｕｒｉｎｇｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＲＥＴ）遺伝子との融合遺伝子又は該融合遺伝子によってコードされる融合蛋白質の検出方法：
配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
［２］前記ポリペプチドが、配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、［１］の方法。
［３］前記ポリペプチドが、配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［１］又は［２］の方法。
［４］下記に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子の検出用キット：
配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
［５］前記ポリペプチドが、配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、［４］に記載のキット。
［６］前記ポリペプチドが、配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［４］又は［５］に記載のキット。
［７］ＫＩＦ５Ｂ遺伝子をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＲＥＴ遺伝子をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、前記［１］〜［３］のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含む、プライマーセット。
［８］配列番号１の塩基番号１から１７２５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号１７２６から２８０８間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセットであって、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される増幅産物の大きさが１ｋｂ以下である前記プライマーセット又はその相補鎖からなるプライマーセット。
［９］配列番号３の塩基番号１から１７２５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号１７２６から２９３４間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセットであって、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される増幅産物の大きさが１ｋｂ以下である前記プライマーセット又はその相補鎖からなるプライマーセット。

また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とするＲＥＴキナーゼ領域を含む融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌）の存在の検出方法；
被験者から得た試料中の、下記（１）乃至（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程、
（１）配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。

本発明の検出方法は、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子と、ＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌）を検出する方法として利用できる。また、本発明の検出方法は、染色体の再構成を検出する方法として利用できる。また、本発明の検出方法によれば、ＲＥＴ阻害剤の適用対象者であるか否かを鑑別することができ、これにより、ＲＥＴ阻害薬による治療の有効性が期待されるテーラーメード医療が実践できる。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、本発明の検出方法に用いることができる。

《本発明の検出方法》
本発明の検出方法には、（１）融合遺伝子の検出方法と、（２）前記融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の検出方法とが含まれる。

（１）融合遺伝子の検出方法
本発明における融合遺伝子の検出方法は、被験者から得た試料中の、本明細書のポリヌクレオチドの存在を検出する工程を含む。

被験者から得た試料としては、被験者からの採取物（生体から分離した試料）、具体的には、任意の採取された体液（好ましくは血液）、肺胞・気管支洗浄液、生検された試料、喀痰試料を用いるが、好適には、被験者の肺患部の生検試料又は喀痰試料を用いる。試料からゲノムＤＮＡを抽出して用いることができ、またその転写産物（ゲノムが転写及び翻訳される結果生じる産物；例えばｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、蛋白質）を用いることができる。特にはｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを調製して用いることが好ましい。

融合遺伝子の検出方法における「本明細書のポリヌクレオチドの存在を検出する工程」において、その検出対象となる本明細書のポリヌクレオチド（以下、検出対象ポリヌクレオチドと称する）は、ＫＩＦ５Ｂの一部とＲＥＴキナーゼ領域を含むＲＥＴの一部との融合タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのことをいう。検出対象ポリヌクレオチドとしては、下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが特に好ましい。
（ｉ）配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）、
（ｉｉ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）、並びに、
（ｉｉｉ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。

配列番号２で表されるアミノ酸配列は、配列番号１で表される塩基配列によりコードされる配列である。配列番号４で表されるアミノ酸配列は、配列番号３で表される塩基配列によりコードされる配列である。配列番号２で表されるアミノ酸からなるポリペプチドである蛋白質を「ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ１Ｓ」と称し、配列番号４で表されるアミノ酸からなるポリペプチドである蛋白質を「ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ１Ｌ」と称する。「ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ１Ｓ」及び「ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ１Ｌ」を総称して「ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ１」と称する。ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ１Ｓをコードする遺伝子を「ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドｖ１Ｓ」と称し、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ１Ｌをコードする遺伝子を「ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドｖ１Ｌ」と称する。ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ１をコードする遺伝子を「ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドｖ１」と称する。

「機能的等価改変体」としては、「配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個、好ましくは１〜数個、更に好ましくは１〜７個、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド」が好ましく、「配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド」が特に好ましい。

「相同ポリペプチド」は、「配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド」であるが、該同一性が、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチドが好ましい。

なお、本明細書における前記「同一性」とは、ＮＥＥＤＬＥｐｒｏｇｒａｍ（J Mol Biol 1970; 48: 443-453）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Ｉｄｅｎｔｉｔｙを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｇａｐｐｅｎａｌｔｙ＝１０
Ｅｘｔｅｎｄｐｅｎａｌｔｙ＝０．５
Ｍａｔｒｉｘ＝ＥＢＬＯＳＵＭ６２

あるポリペプチドが「腫瘍形成能を有する」ことは、実施例４の方法で確認する。具体的には、当該ポリペプチドを発現するプラスミドを導入した宿主（３Ｔ３繊維芽細胞）をヌードマウスの皮下に接種し、腫瘍形成の有無で判断する方法で確認する。

本発明の検出方法における検出対象ポリヌクレオチドとしては、「配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、腫瘍形成能を有するポリペプチド」をコードするポリヌクレオチドが好ましく、「配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードするポリヌクレオチドが最も好ましい。

本発明のポリヌクレオチドの検出方法における「ポリヌクレオチドの存在を検出する工程」は、被験者から得た試料のゲノム中の検出対象ポリヌクレオチド（融合点を含むゲノム配列）の存在を検出すること、あるいは、被験者から得た試料から抽出したゲノムＤＮＡの転写産物（例えばｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ）を調製し、検出対象ポリヌクレオチドに対応するｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの存在を検出することにより実施する。

ゲノムＤＮＡの抽出は公知の方法で行うことができ、市販のＤＮＡ抽出キットを用いて簡便に行うことができる。

検出工程は公知の遺伝子解析法（例えば遺伝子検出法として常用されるＰＣＲ，ＬＣＲ（Ligase chain reaction）、ＳＤＡ（Strand displacement amplification）、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-based amplification）、ＩＣＡＮ（Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids）、ＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification）法、ＴＭＡ法（Gen-Probe’s TMA system）、インサイチュハイブリダイゼーション法、更にマイクロアレイなど周知の方法）に従って実施することができる。例えば、検出対象ポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸をプローブとしたハイブリダイゼーション技術、又は、検出対象ポリヌクレオチドにハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとした遺伝子増幅技術等を利用する。

具体的には、被験者から得た試料由来の核酸、例えばｍＲＮＡ等を用いて測定する。ｍＲＮＡ量の測定は、検出対象ポリヌクレオチド配列を特異的に増幅できるように設計したプライマーを用いて遺伝子増幅反応方法にて測定する。本発明の検出方法に用いられるプライマー、又は、検出用キットに含まれるプライマーは、検出対象ポリヌクレオチド配列を特異的に増幅できるものであれば、特には限定されず、検出対象ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計する。ＰＣＲ増幅モニター法におけるプライマー設計は、プライマー設計ソフトウェア（例えば、Primer Express; PE Biosystems）などを利用してできる。また、ＰＣＲ産物のサイズが大きくなると増幅効率が悪くなるため、センスプライマーとアンチセンスプライマーは、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを対象に増幅したときの増幅産物の大きさが１ｋｂ以下になるように設定するのが適切である。

より具体的には、センスプライマー（５’−プライマー）をＫＩＦ５Ｂをコードする部分から、アンチセンスプライマー（３’−プライマー）をＲＥＴをコードする部分から設計する。好ましくは、本発明の検出用キットに含まれるプライマーを用い、更に好ましくは、検出用キットに最も好適に含まれるプライマーを用いる。ＰＣＲ増幅モニター法では、各遺伝子に対応した上記センスプライマーを混ぜることにより、１反応液により全ての融合ポリヌクレオチドを検出するマルチプレックスＰＣＲ（Multiplex PCR）を設計することもできる。各増幅技術に適した方法によって目的とした遺伝子（全体又はその特異的部分）が増幅されたか否かを確認することができる。例えば、ＰＣＲ法では、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイド染色等によって目的とするサイズの増幅断片が得られたか否かを確認できる。目的とするサイズの増幅断片が得られた場合は、被験者から得た試料において、検出対象ポリヌクレオチドが存在していたことになる。このように、検出対象ポリヌクレオチドの存在を検出することができる。

本発明の融合遺伝子の検出方法としては、被験者から得た試料中の、特定のポリヌクレオチドの存在を遺伝子増幅反応により検出する工程に加え、さらに目的とするサイズの増幅断片が得られたか否かを検出する工程を含むことが好ましい。

ハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＲＮＡプロテクション法などを使用して行う。ハイブリダイゼーションに用いるプローブとしては、検出対象ポリヌクレオチド又はそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下で（好ましくはよりストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズする連続した少なくとも３２塩基の核酸分子であって、融合点を中心にその上流及び下流のそれぞれ１６塩基からなる配列又はそれらの相補鎖を含むプローブを用いることができる。

インサイチュハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、公知のFISH法（fusion assay）に従って実施することができる。または、クロモジェニックインサイチュハイブリダイゼーション（CISH）法とシルバーインサイチュハイブリダイゼーション（SISH）法を組み合わせたヒュージョンアッセイで実施することができる。

なお、本明細書における融合点とは、ＫＩＦ５Ｂの各遺伝子由来の部分とＲＥＴ遺伝子由来の部分とが融合した点を意味する。

また、本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」の条件である。「よりストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」の条件である。

さらには、ＲＴ−ＰＣＲ等の遺伝子増幅技術を利用することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター（リアルタイムＰＣＲ）法（Genome Res., 6(10), 986, 1996）を用いることにより、検出対象ポリヌクレオチドの存在について、より定量的な解析を行うことが可能である。ＰＣＲ増幅モニター法としては、例えば、ＡＢＩＰＲＩＳＭ７９００（ＰＥバイオシステムズ社）を用いることが出来る。リアルタイムＰＣＲは公知の方法であり、そのための装置およびキットは市販されており、これらを利用して簡便に行える。

（２）前記融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の検出方法
本発明における融合タンパク質の検出方法は、被験者から得た試料における、特定のポリペプチド、すなわち、検出対象ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド（以下、検出対象ポリペプチドと称する）の存在を検出する工程を含む。

このような検出する工程は、被験者から得た試料（例えば、被験者から得た癌組織や細胞）由来の可溶化液を調製し、その中に含まれる検出対象ポリペプチドを、ＫＩＦ５Ｂに対する抗体と、抗ＲＥＴ抗体とを組み合わせることによる免疫学的測定法又は酵素活性測定法等により実施できる。好適には、検出対象ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いた、酵素免疫測定法、２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、ウェスタンブロッティング法等の手法を用いることができる。

本発明の検出方法における検出対象ポリヌクレオチド又は検出対象ポリペプチドが、被験者から得た試料から検出された場合は、当該被験者は、当該ポリヌクレオチド陽性の癌を有する対象（患者）であり、ＲＥＴ阻害剤による治療の適用対象となる。

《本発明の検出用キット、本発明のプライマーセット》
本発明の検出用キットには、少なくとも、本発明の検出方法における検出対象ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンス及びアンチセンスプライマーが含まれる。センス及びアンチセンスプライマーセットは、検出対象ポリヌクレオチド増幅用のプライマーとして機能するポリヌクレオチドのセットである。

「ＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子」とは、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子の一部とＲＥＴ遺伝子の一部とが融合した遺伝子のことをいう。

本発明のプライマーセットには、
（１）ＫＩＦ５Ｂをコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＲＥＴをコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは「検出対象ポリヌクレオチド」にストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなり、センスプライマーは「検出対象ポリヌクレオチド」の相補鎖にストリンジェントな条件（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなるプライマーセット
が含まれる。

また、前記プライマーセット（１）のより具体的な態様として、本発明のプライマーセットには、以下の（２）及び（３）のプライマーセットが含まれる。
（２）配列番号１の塩基番号１から１７２５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号１７２６から２８０８間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
（３）配列番号３の塩基番号１から１７２５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号１７２６から２９３４間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。

これらのプライマーセット（１）〜（３）においては、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーの選択位置の間隔が１ｋｂ以下であるか、あるいは、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される増幅産物の大きさが１ｋｂ以下であることが好ましい。

また、本発明のプライマーは、通常、１５〜４０塩基、好ましくは１６〜２４塩基、更に好ましくは１８〜２４塩基、特に好ましくは２０〜２４塩基の鎖長を有する。

本発明のプライマーセットは、本発明の検出方法において、検出対象ポリヌクレオチドを増幅及び検出するために用いることができる。また、本発明のプライマーセットに含まれる各プライマーは、特に限定されるものではないが、例えば、化学合成法によって製造することができる。

以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法に従って実施可能である。また、市販の試薬やキット等を用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。

［実施例１］ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドｖ１の単離
非小細胞肺癌患者肺癌組織由来ＲＮＡ（米国アステランド社）Ｌｇ１６５検体ＲＮＡに対して、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ、ライフテクノロジーズ社）およびオリゴ（ｄＴ）プライマー（オリゴ（ｄＴ）２０プライマー、ライフテクノロジーズ社）を用いて、キットのプロトコールにしたがって逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。

次に、制限酵素ＮｏｔＩ認識配列を含んだ配列番号５および配列番号６のプライマーを用いて、上記で得たｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＨＳＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ；タカラバイオ株式会社）を行いてＰＣＲ（９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃３．５分を３５サイクル）を行い、電気泳動したところ、約３ｋｂのＰＣＲ産物を得たことがわかった。本ＰＣＲ産物をＮｏｔＩ消化し、発現ベクター（ｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ−ｂｓｄ；ライフテクノロジーズ社）のマルチクローニングサイトに存在するＮｏｔＩサイトにクローニングし発現プラスミドを構築した。インサートはダイデオキシシーケンス法により配列を決定した（ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ；ライフテクノロジーズ社）。この結果、ＮＣＢＩに登録されているＫＩＦ５Ｂ（ＮＭ＿００４５２１）のコーディングシーケンス（以下ＣＤＳ）のＮ末端からエキソン１５までが、ＲＥＴのショートフォーム（ＮＭ＿０２０６３０）のＣＤＳのエキソン１２からＣＤＳのＣ末端までと融合している転写産物（ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ）（配列番号１）が存在していることが明らかになった。配列番号１によりコードされるポリペプチドを配列番号２に示す。

また、同様にＮｏｔＩ配列を含んだ配列番号５および配列番号７のプライマーを用いてＰＣＲを行い、クローニングした結果、ＮＣＢＩに登録されているＫＩＦ５ＢのＣＤＳのＮ末端からエキソン１５までが、ＲＥＴのロングフォーム（ＮＭ＿０２０９７５）のＣＤＳのエキソン１２からＣＤＳのＣ末端までと融合している転写産物（ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｌ）（配列番号３）が存在していることを見出した。配列番号３によりコードされるポリペプチドを配列番号４に示す。

また、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ及びＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１ＬのＯＲＦ全長をＮ末端にＦＬＡＧタグが付加されたタンパク質として発現するため、ＮｏｔＩサイトおよびＦＬＡＧ配列を導入した配列番号８および配列番号６のプライマー及び配列番号８および配列番号７のプライマーにて、上記ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ及びＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１ＬのＯＲＦ全長を含むＰＣＲ産物をそれぞれ鋳型として、同条件によるＰＣＲを行い、発現ベクター（ｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ−ｂｓｄ；ライフテクノロジーズ社）のマルチクローニングサイトに存在するＮｏｔＩサイトにクローニングし発現プラスミドを構築した（ＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ／ｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ−ｂｓｄ、ＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｌ／ｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ−ｂｓｄ）。

［実施例２］ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドｖ１の検出
非小細胞肺癌臨床検体由来ｃＤＮＡ（米国アステランド社）１８１サンプルを基質とし、配列番号９及び配列番号１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして、定量的ＰＣＲキット（ＰｏｗｅｒＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ；ライフテクノロジーズ社）を用い、アプライドバイオシステムズ７９００ＨＴシステムにて、定量ＰＣＲ（９５℃１０分の後、９５℃１５秒、５９℃６０秒を４５サイクル）を行い遺伝子発現量を測定した。その結果、上述のサンプルＬｇ１６５のみで増幅が確認された。以上から、上記方法により、非小細胞肺癌臨床検体由来の試料中のＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴポリヌクレオチドｖ１の存在を検出することができ、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴポリヌクレオチドｖ１陽性患者を選択できることが示された。

［実施例３］ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドｖ１による増殖因子非依存性増殖亢進作用の検討
上記ＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ／ｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ−ｂｓｄ、又はＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｌ／ｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ−ｂｓｄを２μｇ、トランスフェクション試薬（ＣｅｌｌＬｉｎｅＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＫｉｔＶ；Ｌｏｎｚａ社）を用いて、エレクトロポレーション法（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ；Ｌｏｎｚａ社）にて、それぞれＢＡ／Ｆ３細胞に導入し、ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社）に１０％牛血清（インビトロジェン社）、１ｎｇ／ｍＬのマウスリコンビナントＩＬ−３（Ｒ＆Ｄ社）加えた培地で培養した。導入２日後に上記培地にＢｌａｓｔｃｉｄｉｎ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）１０μｇ／ｍＬを添加したものに交換し、さらに２週間培養を続け、Ｎ末端にＦＬＡＧタグが付加されたＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓを安定発現するＢＡ／Ｆ３細胞および、Ｎ末端にＦＬＡＧタグが付加されたＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｌを安定発現するＢＡ／Ｆ３細胞を取得した（それぞれＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ発現／ＢＡ／Ｆ３細胞、ＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｌ発現／ＢＡ／Ｆ３細胞と命名した）。

ＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ発現／ＢＡ／Ｆ３細胞及びＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｌ発現／ＢＡ／Ｆ３細胞の増殖能を検討した。
ＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ発現／ＢＡ／Ｆ３細胞、ＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｌ発現ＢＡ／Ｆ３細胞、及び親株であるＢＡ／Ｆ３細胞を、増殖因子ＩＬ−３の非存在下で、１ウェル当り２×１０³個ずつ９６ウェルプレートに撒き８日間培養し、細胞数測定試薬（ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−Ｇｌｏ^TM ＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＡｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ社）を添加し２０分撹拌した後、発光測定装置（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ；パーキンエルマー社）を用いて細胞数を測定した。その結果、ＢＡ／Ｆ３細胞は死滅したが、ＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ発現／ＢＡ／Ｆ３細胞およびＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｌ発現／ＢＡ／Ｆ３細胞は播種日に比べてそれぞれ２７倍、２６倍の細胞数の増加が観察された。以上により、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドｖ１Ｓ及びＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドｖ１Ｌは、増殖因子非依存性増殖亢進作用を有することがわかった。

［実施例４］ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドｖ１の足場非依存的増殖亢進作用及び腫瘍形成能の検討
ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１ＳＯＲＦ全長をレンチウイルス発現ベクターにサブクローニングするため、ＳｐｅＩサイトを導入した配列番号１１および、ＳａｌＩサイトを導入した配列番号１２のプライマーを設計した。

上記ＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ／ｐＴａｒｃｅｒ−ＣＭＶ−ｂｓｄを鋳型として、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＨＳＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社）を行いてＰＣＲ（９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃３．５分を３５サイクル）を行ったところ、約３ｋｂのＰＣＲ産物が得られた。本ＰＣＲ産物を精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ；キアゲン社）、本ＰＣＲ産物をＳｐｅＩ、ＳａｌＩ消化した産物をレンチウイルス発現ベクター（ｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５−ＴＯＰＯ；ライフテクノロジーズ社）のマルチクローニングサイトに存在するＳｐｅＩ−ＸｈｏＩサイトにクローニングした（ＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ／ｐＬｅｎｔｉ６．３と命名した）。

上記ＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ／ｐＬｅｎｔｉ６．３を３μｇ、パッケージング用プラスミド９μｇ（ＶｉｒａＰｏｗｅｒ^TM ＰａｃｋａｇｉｎｇＭｉｘ；ライフテクノロジーズ社）と共に、トランスフェクション試薬（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ２０００；ライフテクノロジーズ社）を用いて、２９３ＦＴ細胞パッケージング細胞（ライフテクノロジーズ社）に導入した。導入３日後の培養上清を、レンチウイルスとして回収し、ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ；Ｓｉｇｍａ社）を６μｇ／ｍｌの濃度で添加した後、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞に添加した。２日後にＮＩＨ３Ｔ３細胞の培養上清をＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社）に１０％牛血清（インビトロジェン社）、Ｂｌａｓｔｃｉｄｉｎ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）５μｇ／ｍｌを添加したものに交換し、さらに２週間培養を続け、Ｎ末端にＦＬＡＧが付加されたＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓを安定発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ／ＮＩＨ３Ｔ３と命名）を取得した。

９６ウェルスフェロイドプレート（スミロンセルタイトスフェロイド９６Ｕ；住友ベークライト）に、ＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ／ＮＩＨ３Ｔ３細胞、及び親株であるＮＩＨ３Ｔ３を、それぞれ１ウェル当り３×１０³個となるように１０％牛胎児血清を含む培地で播種した。５％ＣＯ₂存在下、３７℃にて培養後、翌日（Ｄａｙ１）および６日後（Ｄａｙ６）の細胞数を細胞数測定試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ^TM ＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＡｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ社）をマニュアルの方法に従って測定した。検出には発光測定装置（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ；パーキンエルマー社）を用いた。ＮＩＨ３Ｔ３細胞はＤａｙ１からＤａｙ６までで細胞数のカウントは増加しなかったのに対して、ＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ／ＮＩＨ３Ｔ３細胞はＤａｙ１からＤａｙ６までで細胞数のカウントの増加が確認された。以上から、ＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ／ＮＩＨ３Ｔ３細胞は足場非依存的細胞増殖を示すことが明らかとなった。

次に、ｉｎｖｉｖｏにおける造腫瘍能を検討するため本細胞株をヌードマウスに移植し腫瘍形成能を検討した。ＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ／ＮＩＨ３Ｔ３細胞をヌードマウスの皮下に３ｘ１０⁶個ずつ接種し８日観察したところ腫瘍形成が確認された。以上から、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドｖ１Ｓは癌の原因遺伝子であることが示された。

［実施例５］ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ１Ｓの検出
細胞中のＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ１Ｓを検出する方法を以下の通り構築した。ＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ／ＮＩＨ３Ｔ３細胞を細胞溶解液（５０ｍＭＨｅｐｅｓｐＨ７．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、２．５ｍＭＥＧＴＡ、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ｃｏｍｐｌｅｔｅｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｃｏｃｋｔａｉｌ；Ｒｏｃｈｅ社））に溶解し超音波処理し、遠心後得られた上清蛋白質に対してプロテインＧビーズ（ＰｒｏｔｅｉｎＧＳｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦａｓｔＦｌｏｗ；ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社）及び抗ＲＥＴ抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ社）あるいはウサギＩｇＧ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ社）を添加し４℃にて一晩、免疫沈降を行った。遠心後に沈降物を細胞溶解液にて５回洗浄し、ＳＤＳ溶解液にて沈殿物を懸濁した。この上清に対して抗ＫＩＦ５Ｂ抗体（ＳＩＧＭＡ社）を用いてイムノブロッティングを行った。その結果、抗ＲＥＴ抗体を用いて行った免疫沈降産物では、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ１Ｓが検出されたが、ウサギＩｇＧを用いて行った免疫沈降産物では、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ１Ｓは検出されなかった。以上の結果から、抗ＲＥＴ抗体及び抗ＫＩＦ５Ｂ抗体を組み合わせて用いることで、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ１Ｓを発現している癌細胞や癌組織中のＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ１Ｓの存在を検出することが可能となり、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ１Ｓ陽性癌患者を判定することが可能であることが明らかとなった。

［実施例６］ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ１Ｓ発現３Ｔ３細胞に対するＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチド抑制剤の足場非依存的細胞増殖抑制作用
足場非依存的な細胞増殖の測定（コロニー法など）は、化合物の抗癌作用（薬理効果）を検討する系として知られている（臨床腫瘍学セカンドエディション、癌と化学療法社）。コロニー法に変わる細胞非接着性の増殖を測定する方法として、前述のようなスフェロイドプレートを用いる方法がある。

９６ウェルスフェロイドプレート（スミロンセルタイトスフェロイド９６Ｕ；住友ベークライト）に、ＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ／ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、１ウェル当り２×１０³個となるように１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で播種した。また、ポジティブコントロール用に培地のみ添加したウェルを調製した。５％ＣＯ₂存在下、３７℃にて一晩培養後、癌治療薬Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ、Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ、又はＶａｎｄｅｔａｎｉｂを最終濃度１．１μＭで添加した。ネガティブコントロールとして化合物の溶媒であるＤＭＳＯを化合物と同濃度（０．１％）になるように添加した。その後、５％ＣＯ₂存在下、３７℃で５日間培養し、細胞数測定試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ^TM ＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＡｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ社）を添加し２０分撹拌した後、発光測定装置（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ；パーキンエルマー社）を用いて測定した。ポジティブコントロール、ネガティブコントロールの値をそれぞれ１００％抑制値、０％抑制値として各化合物の増殖阻害％を算出した。その結果、Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ、Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ、Ｖａｎｄｅｔａｎｉｂの阻害％はそれぞれ７７％、９６％、８３％であった。

ＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ／ＮＩＨ３Ｔ３細胞内のＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴリン酸化に対する化合物の抑制効果を試験した。
ＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ／ＮＩＨ３Ｔ３細胞を２×１０⁵個播種した翌日、Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ、Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ、Ｖａｎｄｅｔａｎｉｂをそれぞれ１μＭの濃度で添加し４時間培養した。その後、細胞溶解液（５０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、５ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭＥＧＴＡ、１ｍＭＮａＶＯ₄、１ｍＭＤＴＴ、プロテアーゼ抑制剤カクテルｃｏｍｐｌｅｔｅ）にて細胞を溶解した。ＳＤＳ溶解液を加え、１０６２番目のチロシン残基がリン酸化されたＲＥＴを特異的に認識する抗リン酸化ＲＥＴ抗体（ＳＡＮＴＡ−ＣＲＵＺ）及び抗ＲＥＴ抗体（ＣＥＬＬＳＩＧＮＡＬＩＮＧＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）を用いたイムノブロッティングを行い、約１１０Ｄａのリン酸化ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ１Ｓのチロシンリン酸化量及び総蛋白質量の定量を画像解析システム（ＶｅｒｓａＤｏｃＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）により算出した。リン酸化量を総蛋白質量で割った値を算出し、化合物未添加（化合物の溶媒であるＤＭＳＯ添加）時を対照（抑制率０％）として各化合物１μＭ添加時のリン酸化抑制率を算出した結果、Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ、Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ、Ｖａｎｄｅｔａｎｉｂはそれぞれ５７％、９４％、７４％であった。この結果により、Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ、Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ及びＶａｎｄｅｔａｎｉｂがＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ１Ｓの阻害剤であることが分かった。

以上の結果は、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ１Ｓを発現する癌細胞や腫瘍の増殖をＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチド抑制剤が抑制できることを示している。

ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチド抑制剤による治療の有効性が期待される適用対象者を本発明の検出方法により識別することで、テーラーメード医療が実践できることが示された。

本発明の検出方法は、本明細書の融合遺伝子陽性の癌患者の判定に有用である。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、前記検出方法に用いることができる。

以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＳｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号５〜８、１１及び１２で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。

Claims

被験者から得た試料中の、下記に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とする、キネシンファミリープロテイン５Ｂ（Ｋｉｎｅｓｉｎｆａｍｉｌｙｐｒｏｔｅｉｎ５Ｂ；ＫＩＦ５Ｂ）遺伝子とリアレンジドデュアリングトランスフォーメーション（ｒｅａｒｒａｎｇｅｄｄｕｒｉｎｇｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＲＥＴ）遺伝子との融合遺伝子又は該融合遺伝子によってコードされる融合蛋白質の検出方法：
配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
前記ポリペプチドが、配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
前記ポリペプチドが、配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
下記に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子の検出用キット：
配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
前記ポリペプチドが、配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、請求項４に記載のキット。
前記ポリペプチドが、配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項４に記載のキット。
ＫＩＦ５Ｂ遺伝子をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＲＥＴ遺伝子をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。
配列番号１の塩基番号１から１７２５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号１７２６から２８０８間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセットであって、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される増幅産物の大きさが１ｋｂ以下である前記プライマーセット又はその相補鎖からなるプライマーセット。
配列番号３の塩基番号１から１７２５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号１７２６から２９３４間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセットであって、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される増幅産物の大きさが１ｋｂ以下である前記プライマーセット又はその相補鎖からなるプライマーセット。