JP5780527B2 - 単分子dnaから形成される環状dnaの作成方法 - Google Patents
単分子dnaから形成される環状dnaの作成方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5780527B2 JP5780527B2 JP2012531803A JP2012531803A JP5780527B2 JP 5780527 B2 JP5780527 B2 JP 5780527B2 JP 2012531803 A JP2012531803 A JP 2012531803A JP 2012531803 A JP2012531803 A JP 2012531803A JP 5780527 B2 JP5780527 B2 JP 5780527B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- adapter
- dna
- restriction enzyme
- dna molecule
- site
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title claims description 232
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 title claims description 78
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 173
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 168
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 143
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 93
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 93
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 91
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 57
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 51
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 51
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 22
- 108091081548 Palindromic sequence Proteins 0.000 claims description 21
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 16
- NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxycytosine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 0.000 claims description 6
- LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 0.000 claims description 6
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 claims description 6
- KHWCHTKSEGGWEX-UHFFFAOYSA-N deoxyadenylic acid Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(O)=O)O1 KHWCHTKSEGGWEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- LTFMZDNNPPEQNG-UHFFFAOYSA-N deoxyguanylic acid Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1CC(O)C(COP(O)(O)=O)O1 LTFMZDNNPPEQNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 37
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 27
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 5
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 5
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 3
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical group [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000025053 regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
- C12Q2521/30—Phosphoric diester hydrolysing, i.e. nuclease
- C12Q2521/301—Endonuclease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
- C12Q2525/30—Oligonucleotides characterised by their secondary structure
- C12Q2525/307—Circular oligonucleotides
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
1)各目的DNA分子の一方の末端に第一段階環状化用アダプター(A)を結合させ、他方の末端に、アダプター(b)と前記アダプター(A)を含む第二段階環状化用アダプター(B)を結合させる工程;ここで、アダプター(B)は、DNA分子にアダプター(b)側を介して結合して、アダプター(B)中のアダプター(A)は、DNA分子とアダプター(b)との結合の外側に位置する、
ここで、
アダプター(A)は、いずれのアダプター(A)の切断末端とも非特異的に結合する切断末端を生じさせる切断部位を含む:
アダプター(b)は、同一のアダプター(b)由来の切断末端にのみ特異的に結合する切断末端を生じさせる切断部位を含む;
2)アダプター(A)の切断部位において、工程1)で得られたDNA分子を切断する第一切断工程、
3)工程2)で得られたDNA分子の両末端を結合させて環状化させる第一段階環状化工程;
4)工程3)において、環状化せず直線状となった単分子および複数分子が結合したDNAを除去する工程;
5)アダプター(b)の切断部位において、工程3)および工程4)で得られた環状DNA分子を切断する第二切断工程、および、
6)工程5)で得られたDNA分子の両末端を結合させて環状化させる第二段階環状化工程。
第二段階環状化工程においては、アダプター(b)が同一のアダプター(b)由来の切断末端にのみ特異的に結合することから、複数のDNA分子の環状化による直線状化は実質的に生じなく環状化されるDNAは単分子DNAとなる。この時、環状化されない直線状のDNA分子は、上記同様に除去する必要がある。
工程6)において環状化されない直線状のDNAは、極めて微量の工程5)において切断された(b)部分の再結合がなされなかった単分子DNAと大半の工程3)で複数DNA分子が環状化し、工程5)において、各アダプター(b)の切断後、再結合できなかった、単分子または複数分子のDNAである。
1)各目的DNA分子の一方の末端に第一段階環状化用アダプター(A)を結合させ、他方の末端に、アダプター(b)と前記アダプター(A)を含む第二段階環状化用アダプター(B)を結合させる工程;ここで、アダプター(B)は、DNA分子にアダプター(b)側を介して結合して、アダプター(B)中のアダプター(A)は、DNA分子とアダプター(b)との結合の外側に位置する、
ここで、
アダプター(A)は、パリンドローム配列を認識する制限酵素サイトを含む二本鎖DNAであり、
アダプター(B)は、アダプター(b)と前記アダプター(A)を含み、アダプター(b)は、互いに逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトを含み、その逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトの間に、個々のアダプター(b)に固有の配列を有する二本鎖DNA配列を含む二本鎖DNAであり、該逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトによりアダプター(b)が開裂した場合、該開裂部位は、同一のアダプター(b)由来の開裂部位とのみ再結合するものである;
2)アダプター(A)に含まれる制限酵素サイトを認識する制限酵素により、工程1)で得られたDNA分子を切断する第一切断工程、
3)工程2)で得られたDNA分子の両末端をライゲーションさせて環状化させる第一段階環状化工程;
4)工程3)において、環状化せず直線状となった単分子および複数分子が結合したDNAを除去する工程;
5)アダプター(b)におけるニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトを認識するニック作成酵素または制限酵素により、工程3)および工程4)で得られた環状DNA分子を切断する第二切断工程、および、
6)工程5)で得られたDNA分子の両末端をライゲーションさせて環状化させる第二段階環状化工程。
アダプター(B)は下記構造y1−Y−y2−Xを有する互いに相補的な二本鎖DNAからなる二本鎖DNAである:
Xは、パリンドローム配列を認識する制限酵素サイトである二本鎖DNAであり;
y1およびy2は、互いに逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトを含む二本鎖DNAであり;
Yは、環状化させる個々のDNA分子に固有の配列を有する二本鎖DNA配列であって、nは1以上40以下の整数であり、N1〜Nnは、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、dAMP、dCMP、dGMPおよびdTMPからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオチドであり、N’1〜N’nは、前記N1〜Nnに対してそれぞれ下記:
上記構造において、nは1〜40であり、好ましくは、nは4〜15、さらに好ましくはnは5〜10である。ただし、nが40を超えても本発明の方法を実施することができる。
Xは、パリンドローム配列を認識する制限酵素サイトである二本鎖DNAであり;
y1およびy2は、互いに逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトを含む二本鎖DNAであり;
Yは、環状化させる個々のDNA分子に固有の配列を有する二本鎖DNA配列であって、nは1以上40以下の整数であり、N1〜Nnは、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、dAMP、dCMP、dGMPおよびdTMPからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオチドであり、N’1〜N’nは、前記N1〜Nnに対してそれぞれ下記:
上記構造において、nは1〜40であり、好ましくは、nは4〜15、さらに好ましくはnは5〜10である。ただし、nが40を超えても本発明の方法を実施することができる。
1)上記第一または第二の態様の方法を用いて得られた環状DNA分子における、アダプター(B)の両側に隣接するそれぞれ15塩基以上600塩基以下の塩基配列を解読する工程;および、
2)解読した塩基配列を既知の遺伝子の両末端の配列と比較することにより、環状DNA分子に含まれる遺伝子を同定する工程。
好ましくは、解読する塩基配列は、15〜100塩基、さらに好ましくは25〜35塩基である。ただし、600塩基以上を解読しても本発明の方法を実施することができる。
1)上記第一または第二の態様の方法を用いて得られた環状DNA分子における、アダプター(B)の両側に隣接するそれぞれ15塩基以上600塩基以下の塩基配列を解読する工程;および、
2)解読した塩基配列を既知の遺伝子の両末端の配列と比較する工程、ここで、両末端の遺伝子が既知の相異なる遺伝子に対応する場合、環状DNA分子に含まれる遺伝子は融合遺伝子であると同定される。
好ましくは、解読する塩基配列は、15〜100塩基、さらに好ましくは25〜35塩基である。ただし、600塩基以上を解読しても本発明の方法を実施することができる。
本発明は、第一の態様において、以下の工程を含む、単分子DNAから形成される環状DNAからなり、複数分子DNAから形成される環状DNAを含まない、環状DNAの作成方法を提供する:
1)各目的DNA分子の一方の末端に第一段階環状化用アダプター(A)を結合させ、他方の末端に、アダプター(b)と前記アダプター(A)を含む第二段階環状化用アダプター(B)を結合させる工程;ここで、アダプター(B)は、DNA分子にアダプター(b)側を介して結合して、アダプター(B)中のアダプター(A)は、DNA分子とアダプター(b)との結合の外側に位置する、
ここで、
アダプター(A)は、いずれのアダプター(A)の切断末端とも非特異的に結合する切断末端を生じさせる切断部位を含む:
アダプター(b)は、同一のアダプター(b)由来の切断末端にのみ特異的に結合する切断末端を生じさせる切断部位を含む;
2)アダプター(A)の切断部位において、工程1)で得られたDNA分子を切断する第一切断工程、
3)工程2)で得られたDNA分子の両末端を結合させて環状化させる第一段階環状化工程;
4)工程3)において、環状化せず直線状となった単分子および複数分子が結合したDNAを除去する工程;
5)アダプター(b)の切断部位において、工程3)および工程4)で得られた環状DNA分子を切断する第二切断工程、および、
6)工程5)で得られたDNA分子の両末端を結合させて環状化させる第二段階環状化工程。
具体的には、本発明の第一の態様の方法は、2段階の環状化によることを特徴とする。
以下、第一の態様の方法を工程の順に説明する。
工程1)で得られたDNA分子はその両端にアダプター(A)が結合しているため、この第一切断工程により、各DNA分子の両端にアダプター(A)由来の切断末端が生じる。
本発明の第二の態様は、以下の工程を含む、単分子DNAから形成される環状DNAからなり、複数分子DNAから形成される環状DNAを含まない、環状DNAの作成方法を提供する:
1)各目的DNA分子の一方の末端に第一段階環状化用アダプター(A)を結合させ、他方の末端に、アダプター(b)と前記アダプター(A)を含む第二段階環状化用アダプター(B)を結合させる工程;ここで、アダプター(B)は、DNA分子にアダプター(b)側を介して結合して、アダプター(B)中のアダプター(A)は、DNA分子とアダプター(b)との結合の外側に位置する、
ここで、
アダプター(A)は、パリンドローム配列を認識する制限酵素サイトを含む二本鎖DNAであり、
アダプター(B)は、アダプター(b)と前記アダプター(A)を含み、アダプター(b)は、互いに逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトを含み、その逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトの間に、個々のアダプター(b)に固有の配列を有する二本鎖DNA配列を含む二本鎖DNAであり、該逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトによりアダプター(b)が開裂した場合、該開裂部位は、同一のアダプター(b)由来の開裂部位とのみ再結合するものである;
2)アダプター(A)に含まれる制限酵素サイトを認識する制限酵素により、工程1)で得られたDNA分子を切断する第一切断工程、
3)工程2)で得られたDNA分子の両末端をライゲーションさせて環状化させる第一段階環状化工程;
4)工程3)において、環状化せず直線状となった単分子および複数分子が結合したDNAを除去する工程;
5)アダプター(b)におけるニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトを認識するニック作成酵素または制限酵素により、工程3)および工程4)で得られた環状DNA分子を切断する第二切断工程、および、
6)工程5)で得られたDNA分子の両末端をライゲーションさせて環状化させる第二段階環状化工程。
工程1)は、図5に模式的に示すように、各目的DNA分子の一方の末端に第一段階環状化用アダプター(A)を結合させ、他方の末端に、アダプター(b)と前記アダプター(A)を含む第二段階環状化用アダプター(B)を結合させる工程である。ここで、アダプター(B)は、DNA分子にアダプター(b)側を介して結合して、アダプター(B)中のアダプター(A)は、DNA分子とアダプター(b)との結合の外側に位置する。
アダプター(A):このアダプターは、第一段階目に制限酵素で切断し、その後に環状DNAを期待して遺伝子結合(ligation)を行うための配列である。従って、パリンドローム配列を認識する制限酵素サイトであれば如何なる制限酵素サイトを含むものでもよい。好ましくは、目的DNAをなるべく切断しないような稀な遺伝子配列を認識する制限酵素のサイトを含むものである。アダプター(A)に含まれる制限酵素サイトとしては、例えば、NotIやEcoRIが挙げられる。
ニック作成酵素認識サイトの場合
開裂部位は、各分子特異的な遺伝子切断断端(overhang)に相当する部分である。上記のように制限酵素で作成する場合は塩基数に制限があるが、ニック作成酵素では自由に長さを設定することができる。特異性を高くするためには開裂部位の塩基数は長い程よいが、長すぎる時にはミスマッチで遺伝子結合する可能性が高くなる。ゲノムなど複雑性が増す場合には開裂部位の塩基数をより長く設定し、同時にミスマッチ結合(ミス・アニーリング)の可能性に対してエンドヌクレアーゼによる分解過程を追加することが望ましい。なお、開裂部位の配列はランダムな組合せとし、DNA分子1つ1つについて異なるものとなるよう設計する。
Xは、パリンドローム配列を認識する制限酵素サイトである二本鎖DNAであり;
y1およびy2は、互いに逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトを含む二本鎖DNAであり;
Yは、環状化させる個々のDNA分子に固有の配列を有する二本鎖DNA配列であって、nは1以上40以下の整数であり、N1〜Nnは、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、dAMP、dCMP、dGMPおよびdTMPからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオチドであり、N’1〜N’nは、前記N1〜Nnに対してそれぞれ下記:
上記構造において、nは1〜40であり、好ましくは、nは4〜15、さらに好ましくはnは5〜10である。ただし、nが40を超えても本発明の方法を実施することができる。
本発明の第三の態様は、上記本発明の第二の態様の方法において用いられる好適なアダプター(B)、即ち、下記構造y1−Y−y2−Xを有する互いに相補的な二本鎖DNAからなる環状DNA作成用アダプターを提供する:
Xは、パリンドローム配列を認識する制限酵素サイトである二本鎖DNAであり;
y1およびy2は、互いに逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトを含む二本鎖DNAであり;
Yは、環状化させる個々のDNA分子に固有の配列を有する二本鎖DNA配列であって、nは1以上40以下の整数であり、N1〜Nnは、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、dAMP、dCMP、dGMPおよびdTMPからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオチドであり、N’1〜N’nは、前記N1〜Nnに対してそれぞれ下記:
上記構造において、nは1〜40であり、好ましくは、nは4〜15、さらに好ましくはnは5〜10である。ただし、nが40を超えても本発明を実施することができる。
本発明の第四の態様は、上記本発明の第二の態様の方法において用いられる好適なアダプター(A)およびアダプター(B)とを含む環状DNA作成用キット提供する。即ち、上記第三の態様に記載のXにおける制限酵素サイトと同一の制限酵素サイトを含む二本鎖DNAからなるアダプター(A)と、上記第三の態様に記載のアダプター(B)とを含む、環状DNA作成用キットを提供する。
本発明の第五の態様は、本発明の第一または第二の態様による二段階環状化方法を用いる、cDNAライブラリーの作成方法を提供する。本発明の第一または第二の態様による方法を直鎖状cDNAからなるライブラリーに適用することにより、単分子DNAのみからなる環状化DNAを含むcDNAライブラリーを作成することができる。
本発明の第六の態様は、以下の工程を含む、本発明の第一または第二の態様による方法を用いて得られた環状DNA分子をメイトペア法に供することにより遺伝子を同定する方法を提供する:
1)本発明の第一または第二の態様による方法を用いて得られた環状DNA分子における、アダプター(B)の両側に隣接するそれぞれ15塩基以上600塩基以下の塩基配列を解読する工程;および、
2)解読した塩基配列を既知の遺伝子の両末端の配列と比較することにより、環状DNA分子に含まれる遺伝子を同定する工程。
本発明の第七の態様は、以下の工程を含む、本発明の第一または第二の態様による方法を用いて得られた環状DNA分子をメイトペア法に供することにより融合遺伝子を検出する方法を提供する:
1)本発明の第一または第二の態様による方法を用いて得られた環状DNA分子における、アダプター(B)の両側に隣接するそれぞれ15塩基以上600塩基以下の塩基配列を解読する工程;および、
2)解読した塩基配列を既知の遺伝子の両末端の配列と比較する工程、ここで、両末端の遺伝子が既知の相異なる遺伝子に対応する場合、環状DNA分子に含まれる遺伝子は融合遺伝子であると同定される。
mRNAからcDNAライブラリーを合成する場合、現在使用されている最も一般的な方法(Clontech SMART cDNA method) では、図7のようにmRNAの3’末端のpolyAサイトに相補的なpolyT配列を有するオリゴヌクレオチド (1)を用いて、まず相補鎖DNAを逆転写酵素で合成する。合成終了時にmRNAの5’末端において図7のように特定オリゴヌクレオチド配列 (2)が取り込まれる。次にこの特定配列へ相補的なオリゴヌクレオチドからDNA合成を行う、あるいはPCRでcDNAライブラリーが作成される。
この場合、mRNAの3’末端のpolyAサイトに相補的なpolyT配列を有するオリゴヌクレオチド(1)配列にアダプター(B)を導入しておき、オリゴヌクレオチド(2)配列にアダプター(A)を付加しておくことでcDNAライブラリーが合成されたときには、自動的に本発明の基本形の構造になっており、右端左端に新たな配列を結合させる必要もなく、そのまま次のステップへ進むことができる。この方法で、さらにcDNAライブラリーをPCR増幅する際に、そのまま増幅したのではある特定のN塩基配列が増幅されてしまう。そのためN塩基の多様性を維持するため、例えば、上流primerとして5’リン酸基付加primerを使用し、下流primerにはN塩基を含むprimer を用いて増幅し、PCR後にリン酸基primerを取り込んだ側のストランドをλexonucleaseで分解し、再度上流primerからprimer-extensionを行い、N塩基による多様性を維持したcDNAライブラリーを完成させる、等の手続きを行う。但し、アダプター結合法であればこの過程は必要なく、ライブラリーの断片化などの修飾を行った上で本発明のアダプターを導入するためには、次のアダプター結合法を行う。
cDNAライブラリーを作成した場合、図7の(3)のように3’末端、5’末端にそれぞれ制限酵素配列を導入しておくことができる。この場合の制限酵素としては通常のパリンドローム配列を使用することも、末端を区別するためにノン・パリンドローム配列を使用することも可能であり、またアダプター結合を確実にするため平滑末端からA突出塩基の形状へアダプターを結合することも可能である。ライブラリーの修飾を行った上に本発明のアダプターを導入するためにはこちらの方法が望ましい。
ゲノムを対象とする場合はcDNAライブラリーとは状況が異なる。ゲノム断片にはcDNAと異なりDNA断片の左右を区別することができない。従って図8のように左端のアダプター、右端のアダプターを双方結合させて、双方のアダプターが適切に結合したもの、即ち図8の( a ) のみをPCR法やビオチン法、あるいは両端のX制限酵素配列としてノン・パリンドローム配列を挿入することや、N領域を含む制限酵素(BstXI等)により同一部位に制限酵素サイトを複数設置する方法等、で選択してゆくことができる。
基本的に、以下のような手法をとることによりアダプター(A)と(B)をDNA分子の両末端にそれぞれ付加する。第一に、目的DNA分子数に応じて、ある程度の濃度を決定した複数のDNA群に、先ず、アダプター(A)を結合させる。この場合、アダプター(A)の添加量は存在する対象DNA分子量よりも少なめとする。ただし、量論的には、対象DNA分子数と同数であっても、あるいは、DNA断片に一塩基突出を酵素的に作成し、相補的なアダプターを結合させてもよく、この場合は特にアダプターの濃度は過剰であっても構わない。これにより、アダプター(A)をDNA分子の末端に結合させる。次いで、アダプター(B)を結合させる。
図8の(a)タイプの分子の場合、第1環状化、ニックによる切断、第2環状化が問題なく行われ、問題なく目的の環状化DNAが作成される。
一方、図8の(b)タイプの分子の場合、第1環状化は、単分子としては不可であるため除去される。しかし複数DNAとの環状化は形成しうる(例えば、(b)タイプの分子と(c)タイプの分子による2分子結合)。この複数DNA分子は必ず結合先として(a)または(c)タイプの分子と結合することになる。従って、両側は必ずN配列のある特異配列との結合となる。このため、ニック切断後の第2環状化は形成不可となり排除される。
また、図8の(C)タイプの分子の場合、第1環状化は単分子としては不可で除去される。しかし複数DNAとの環状化は形成しうる(例えば、(b)タイプの分子と(c)タイプの分子による2分子結合)。このDNA断片はもともと両端に異なるN配列があるため、ニック切断後の第2環状化は不可であり排除される。
図8の(a) タイプの分子の場合、第1環状化、ニックによる切断、第2環状化が問題なく行われ、問題なく目的の環状化DNAが作成される。
一方、図8の(b)タイプの分子の場合、第1環状化は可能であるが、ニック配列を有さないためニック切断が行われずに環状化DNAのまま残ってしまい排除できない。これを防ぐ方法例として、下記ののBstXI法がある。
また図8の(c)タイプの分子の場合、第1環状化およびニックによる切断は可能であるが、もともと両端に異なるN配列があるため、ニック切断後の第2環状化は不可であり排除される。
両端にアダプター(A)が付加された場合、第一段階でライゲーションされるが、第二段階の開裂が起きないため、このままでは環状のままとどまるという問題を解決する方法として、アダプター(A)の制限酵素サイトを含む外側に例えばBstXIを仕込むことが挙げられる。つまり、下記制限酵素サイトBstXI部位において、CCANNNNNNTGGを、例えば、 CCAGAATTCTGGとなるようにEcoRIサイトを組み込む。
こうるすことにより、もしアダプター(A)同士が両端につき、それ同士が会合した場合、BstXIで切断することで、環状化を開き、排除することができる。もちろんアダプター(A)および(B)とが結合した場合にはアダプター(B)にはBstXIの認識配列がないため、BstXIでは開裂されない。
かかる可能性は確率論的に十分無視できるが、その根拠を以下に説明する。
確立論的に分離した遺伝子同士が再び会合する可能性を推定するため、(1)DNA分子の体積と反応溶液量(体積)で推定する場合、(2)反応溶液中の分子数から推定する場合(これらの時、Y部分のN塩基数が十分に長く特異性が高いと仮定しておく)、さらに(3)N塩基数が十分に長くはなく決まっている場合、の3つに分けて可能性を概算する。
まずDNA1分子を球状として体積を推定し、反応系で一度分離された分子同士が互いに球体として溶液中で会合する可能性を概算する。
一塩基の長さ:0.34 nm (0.34 x 10e-9 m = 3.4 x 10e-8 mm)
3kbp (3000 bp) のプラスミドの長さ:1 x 10e-4 mm
球体として占めると推定した体積は:4/3 x 3.14 x (1 x 10e-4) x (1 x 10e-4) x (1 x 10e-4) mm3 = 4 x 10e-12 mm3
一分子の体積を4 x 10e-12 mm3と仮定すると100 ul中には球体として:100 mm3 / 4 x 10e-12 mm3 = 2.5 x 10e13となる。
従って、均一であるとすると、ある球体に相補的とされる同等な球体が会合する可能性は、(1 / (2.5 x 10e13)) = 4 x 10e-14と極めて小さい。
一方、分子数を計算すると、
3kbpのプラスミドの分子量は:625 x 3000 = 1.8 x 10e6
1モルのプラスミド質量は:1 mol/L = 1.8 x 10e6 g / 1L = 1.8 x 10e12 ug / 1L
3 ugのプラスミドのモル数は:1 (mol/L) x 3 ug / (1.8 x 10e12) ug = 3 /1.8 x 10e-12 mol/L = 1.6 x 10e-12 mol/L = 1.6 x 10e-9 mol/ml
アボガドロ数を 6 x 10e23 とすると、3ugプラスミドを1ml中に溶かした時の分子数は:1.6 x 10e-9 mol/ml x 6 x 10e23 = 1.6 x 6 x 10e14 = 1 x 10e15 個
従って、100 ul の反応系に 3ugのプラスミドが存在すると:100 ul = 10 e-1 mm3であるので、1 x 10e14 分子数あることになる。
この分子数の溶液中である分子が、その分子に相補的とされる同等な分子に会合する可能性は、1 / 1 x 10e14と極めて小さい。
N塩基数が「5」である場合、同じ遺伝子断端同士を有して2つの同遺伝子が再結合する可能性は:((1/4) x (1/4) x (1/4) x (1/4) x (1/4)) x ((1/4) x (1/4) x (1/4) x (1/4) x (1/4)) = 1 x 10e-6
従ってこれらの概算から、複数のDNAが環状形成した後に分離した場合に、その際と同じDNA同士で再結合する可能性は極めて低く、十分に無視できると結論できる。
2段階DNA結合(ligation)法により単分子DNAによる環状化の効率を上げ、複数DNA分子による環状化のノイズを減少させることを検証するため以下のような実験を行った。
Claims (17)
- 以下の工程を含む、単分子DNAから形成される環状DNAからなり、複数分子DNAから形成される環状DNAを含まない、環状DNAの作成方法:
1)各目的DNA分子の一方の末端に第一段階環状化用アダプター(A)を結合させ、他方の末端に、アダプター(b)と前記アダプター(A)を含む第二段階環状化用アダプター(B)を結合させる工程;ここで、アダプター(B)は、DNA分子にアダプター(b)側を介して結合して、アダプター(B)中のアダプター(A)は、DNA分子とアダプター(b)との結合の外側に位置する、
ここで、
アダプター(A)は、いずれのアダプター(A)の切断末端とも非特異的に結合する切断末端を生じさせる切断部位を含む:
アダプター(b)は、同一のアダプター(b)由来の切断末端にのみ特異的に結合する切断末端を生じさせる切断部位を含む;
2)アダプター(A)の切断部位において、工程1)で得られたDNA分子を切断する第一切断工程、
3)工程2)で得られたDNA分子の両末端を結合させて環状化させる第一段階環状化工程;
4)工程3)において、環状化せず直線状となった単分子および複数分子が結合したDNAを除去する工程;
5)アダプター(b)の切断部位において、工程3)および工程4)で得られた環状DNA分子を切断する第二切断工程、および、
6)工程5)で得られたDNA分子の両末端を結合させて環状化させる第二段階環状化工程。 - 以下の工程を含む、単分子DNAから形成される環状DNAからなり、複数分子DNAから形成される環状DNAを含まない、環状DNAの作成方法:
1)各目的DNA分子の一方の末端に第一段階環状化用アダプター(A)を結合させ、他方の末端に、アダプター(b)と前記アダプター(A)を含む第二段階環状化用アダプター(B)を結合させる工程;ここで、アダプター(B)は、DNA分子にアダプター(b)側を介して結合して、アダプター(B)中のアダプター(A)は、DNA分子とアダプター(b)との結合の外側に位置する、
ここで、
アダプター(A)は、パリンドローム配列を認識する制限酵素サイトを含む二本鎖DNAであり、
アダプター(B)は、アダプター(b)と前記アダプター(A)を含み、アダプター(b)は、互いに逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトを含み、その逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトの間に、個々のアダプター(b)に固有の配列を有する二本鎖DNA配列を含む二本鎖DNAであり、該逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトによりアダプター(b)が開裂した場合、該開裂部位は、同一のアダプター(b)由来の開裂部位とのみ再結合するものである;
2)アダプター(A)に含まれる制限酵素サイトを認識する制限酵素により、工程1)で得られたDNA分子を切断する第一切断工程、
3)工程2)で得られたDNA分子の両末端をライゲーションさせて環状化させる第一段階環状化工程;
4)工程3)において、環状化せず直線状となった単分子および複数分子が結合したDNAを除去する工程;
5)アダプター(b)におけるニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトを認識するニック作成酵素または制限酵素により、工程3)および工程4)で得られた環状DNA分子を切断する第二切断工程、および、
6)工程5)で得られたDNA分子の両末端をライゲーションさせて環状化させる第二段階環状化工程。 - 請求項2に記載の工程6)において、アダプター(b)が部分的に異なる切断配列部位を介して結合して環状化することにより形成される環状化DNAを、エンドヌクレアーゼを用いて分解する工程をさらに含む請求項2に記載の方法。
- アダプター(A)がパリンドローム配列を認識する制限酵素サイトXを含む二本鎖DNAであり、
アダプター(B)が下記構造y1−Y−y2−Xを有する互いに相補的な二本鎖DNAからなる二本鎖DNAである請求項2記載の方法:
Xは、パリンドローム配列を認識する制限酵素サイトである二本鎖DNAであり;
y1およびy2は、互いに逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトを含む二本鎖DNAであり;
Yは、環状化させる個々のDNA分子に固有の配列を有する二本鎖DNA配列であって、nは1以上40以下の整数であり、N1〜Nnは、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、dAMP、dCMP、dGMPおよびdTMPからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオチドであり、N’1〜N’nは、前記N1〜Nnに対してそれぞれ下記:
- y1およびy2がニック作成酵素認識サイトを含む請求項4記載の方法。
- ニック作成酵素がNb.BtsIまたはNt.BspQIである請求項5記載の方法。
- y1およびy2が制限酵素サイトを含む請求項4記載の方法。
- 下記構造y1−Y−y2−Xを有する互いに相補的な二本鎖DNAからなる環状DNA作成用アダプター:
Xは、パリンドローム配列を認識する制限酵素サイトである二本鎖DNAであり;
y1およびy2は、互いに逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトを含む二本鎖DNAであり;
Yは、環状化させる個々のDNA分子に固有の配列を有する二本鎖DNA配列であって、nは1以上40以下の整数であり、N1〜Nnは、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、dAMP、dCMP、dGMPおよびdTMPからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオチドであり、N’1〜N’nは、前記N1〜Nnに対してそれぞれ下記:
- y1およびy2がニック作成酵素認識サイトを含む請求項8記載のアダプター。
- ニック作成酵素がNb.BtsIまたはNt.BspQIである請求項9記載のアダプター。
- y1およびy2が制限酵素サイトを含む請求項8記載のアダプター。
- 請求項8に記載のXにおける制限酵素サイトと同一の制限酵素サイトを含む二本鎖DNAからなるアダプター(A)と、請求項8〜10のいずれかに記載のアダプター(B)とを含む、環状DNA作成用キット。
- 請求項1から7いずれか記載の方法を用いる、cDNAライブラリーの作成方法。
- 以下の工程を含む、請求項1から7いずれか記載の方法を用いて得られた環状DNA分子をメイトペア法に供することにより遺伝子を同定する方法:
1)請求項1から7いずれか記載の方法を用いて得られた環状DNA分子における、アダプター(B)の両側に隣接するそれぞれ15塩基以上600塩基以下の塩基配列を解読する工程;および、
2)解読した塩基配列を既知の遺伝子の両末端の配列と比較することにより、環状DNA分子に含まれる遺伝子を同定する工程。 - 以下の工程を含む、請求項1から7いずれか記載の方法を用いて得られた環状DNA分子をメイトペア法に供することにより融合遺伝子を検出する方法:
1)請求項1から7いずれか記載の方法を用いて得られた環状DNA分子における、アダプター(B)の両側に隣接するそれぞれ15塩基以上600塩基以下の塩基配列を解読する工程;および、
2)解読した塩基配列を既知の遺伝子の両末端の配列と比較する工程、ここで、両末端の遺伝子が既知の相異なる遺伝子に対応する場合、環状DNA分子に含まれる遺伝子は融合遺伝子であると同定される。 - アダプター(B)の両側に隣接する両側の配列が、既知融合遺伝子の両側の末端に対応する、請求項15に記載の融合遺伝子の検出方法。
- アダプター(B)の両側に隣接する配列が、相異なる遺伝子の末端配列に対応し、かつ既知融合遺伝子の両側の末端には対応しないことにより、環状DNA分子に含まれる遺伝子が新規融合遺伝子であると同定される請求項15に記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012531803A JP5780527B2 (ja) | 2010-09-02 | 2011-08-22 | 単分子dnaから形成される環状dnaの作成方法 |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010196719 | 2010-09-02 | ||
JP2010196719 | 2010-09-02 | ||
JP2012531803A JP5780527B2 (ja) | 2010-09-02 | 2011-08-22 | 単分子dnaから形成される環状dnaの作成方法 |
PCT/JP2011/068856 WO2012029577A1 (ja) | 2010-09-02 | 2011-08-22 | 単分子dnaから形成される環状dnaの作成方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2012029577A1 JPWO2012029577A1 (ja) | 2013-10-28 |
JP5780527B2 true JP5780527B2 (ja) | 2015-09-16 |
Family
ID=45772675
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012531803A Active JP5780527B2 (ja) | 2010-09-02 | 2011-08-22 | 単分子dnaから形成される環状dnaの作成方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US8962245B2 (ja) |
EP (1) | EP2620497B1 (ja) |
JP (1) | JP5780527B2 (ja) |
KR (1) | KR101583589B1 (ja) |
CN (1) | CN103119162B (ja) |
WO (1) | WO2012029577A1 (ja) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2620497B1 (en) * | 2010-09-02 | 2017-10-11 | Kurume University | Method for producing circular dna formed from single-molecule dna |
US9416358B2 (en) | 2011-08-31 | 2016-08-16 | Kurume University | Method for exclusive selection of circularized DNA from monomolecular DNA in circularizing DNA molecules |
EP2753715A4 (en) | 2011-09-09 | 2015-05-20 | Univ Leland Stanford Junior | METHODS FOR OBTAINING A SEQUENCE |
EP2861787B1 (en) * | 2012-06-18 | 2017-09-20 | Nugen Technologies, Inc. | Compositions and methods for negative selection of non-desired nucleic acid sequences |
EP3015554A1 (en) | 2014-10-31 | 2016-05-04 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Gene expression analysis |
CN107002292B (zh) * | 2014-11-26 | 2019-03-26 | 深圳华大智造科技有限公司 | 一种核酸的双接头单链环状文库的构建方法和试剂 |
EP3225721B1 (en) * | 2014-11-26 | 2019-07-24 | MGI Tech Co., Ltd. | Method and reagent for constructing nucleic acid double-linker single-strand cyclical library |
JP2018504899A (ja) * | 2014-12-24 | 2018-02-22 | キージーン・エン・フェー | 主鎖媒介性メイトペアシーケンシング |
CN106148323B (zh) * | 2015-04-22 | 2021-03-05 | 北京贝瑞和康生物技术有限公司 | 一种用于构建alk基因融合突变检测文库的方法和试剂盒 |
EP3382034A1 (en) * | 2017-03-31 | 2018-10-03 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Gene expression analysis by means of generating a circularized single stranded cdna library |
WO2021214258A1 (en) | 2020-04-22 | 2021-10-28 | Fabmid | Methods for circularizing linear double stranded nucleic acids |
WO2023072958A1 (en) | 2021-10-25 | 2023-05-04 | Fabmid | Methods for circularizing linear double stranded nucleic acids and the products thereof |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008295444A (ja) * | 2006-10-11 | 2008-12-11 | Astellas Pharma Inc | Eml4−alk融合遺伝子 |
JP2008545448A (ja) * | 2005-06-06 | 2008-12-18 | 454 ライフ サイエンシーズ コーポレイション | 両末端配列決定(pairedendsequencing) |
WO2009098037A1 (en) * | 2008-02-05 | 2009-08-13 | Roche Diagnostics Gmbh | Paired end sequencing |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH04303303A (ja) | 1991-03-29 | 1992-10-27 | Fuji Heavy Ind Ltd | 高層ビルのごみ容器輸送装置 |
US20080096255A1 (en) | 2004-07-02 | 2008-04-24 | Matthias Harbers | Method for Preparing Sequence Tags |
WO2007145612A1 (en) * | 2005-06-06 | 2007-12-21 | 454 Life Sciences Corporation | Paired end sequencing |
WO2009032167A1 (en) | 2007-08-29 | 2009-03-12 | Illumina Cambridge | Method for sequencing a polynucleotide template |
US7897344B2 (en) | 2007-11-06 | 2011-03-01 | Complete Genomics, Inc. | Methods and oligonucleotide designs for insertion of multiple adaptors into library constructs |
US8352194B1 (en) | 2008-06-17 | 2013-01-08 | University Of South Florida | Method to identify cancer fusion genes |
JPWO2011043220A1 (ja) | 2009-10-06 | 2013-03-04 | 富士レビオ株式会社 | 融合遺伝子の測定方法 |
EP2586862B9 (en) | 2010-06-22 | 2016-07-13 | LSI Medience Corporation | Detection method for novel ros1 fusion product |
EP2599878A4 (en) | 2010-07-26 | 2014-02-12 | Astellas Pharma Inc | NEW METHOD FOR DETECTING FUSED BODIES RET |
EP2620497B1 (en) * | 2010-09-02 | 2017-10-11 | Kurume University | Method for producing circular dna formed from single-molecule dna |
ES2578370T3 (es) | 2011-07-01 | 2016-07-26 | HTG Molecular Diagnostics, Inc | Métodos para detectar fusiones génicas |
US9216172B2 (en) | 2011-08-04 | 2015-12-22 | National Cancer Center | Method for determining effectiveness of cancer treatment by assessing the presence of a KIF5B-RET chimeric gene |
-
2011
- 2011-08-22 EP EP11821594.6A patent/EP2620497B1/en not_active Not-in-force
- 2011-08-22 WO PCT/JP2011/068856 patent/WO2012029577A1/ja active Application Filing
- 2011-08-22 CN CN201180042478.5A patent/CN103119162B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2011-08-22 KR KR1020137006174A patent/KR101583589B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2011-08-22 JP JP2012531803A patent/JP5780527B2/ja active Active
- 2011-08-22 US US13/819,396 patent/US8962245B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2015
- 2015-01-12 US US14/594,458 patent/US9434941B2/en active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008545448A (ja) * | 2005-06-06 | 2008-12-18 | 454 ライフ サイエンシーズ コーポレイション | 両末端配列決定(pairedendsequencing) |
JP2008295444A (ja) * | 2006-10-11 | 2008-12-11 | Astellas Pharma Inc | Eml4−alk融合遺伝子 |
WO2009098037A1 (en) * | 2008-02-05 | 2009-08-13 | Roche Diagnostics Gmbh | Paired end sequencing |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
JPN6011060061; RUAN Y ., et al.: 'Multiplex parallel pair-end-ditag sequencing approaches in system biology' Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med vol.2, no.2, 201004, p.224-234 * |
JPN6014049777; Nature (2007) vol.448, no.7153, p.561-566 * |
JPN6014049781; PLoS Comput. Biol. (2008) vol.4, issue 4, e1000051 * |
JPN6014049784; Genome Res. (2009) vol.19, no.4, p.521-532 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2620497A1 (en) | 2013-07-31 |
US20150197745A1 (en) | 2015-07-16 |
KR101583589B1 (ko) | 2016-01-08 |
JPWO2012029577A1 (ja) | 2013-10-28 |
CN103119162A (zh) | 2013-05-22 |
EP2620497A4 (en) | 2014-02-19 |
US20130164757A1 (en) | 2013-06-27 |
KR20130101508A (ko) | 2013-09-13 |
CN103119162B (zh) | 2016-09-07 |
WO2012029577A1 (ja) | 2012-03-08 |
US9434941B2 (en) | 2016-09-06 |
EP2620497B1 (en) | 2017-10-11 |
US8962245B2 (en) | 2015-02-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5780527B2 (ja) | 単分子dnaから形成される環状dnaの作成方法 | |
JP7459010B2 (ja) | Tm増強ブロッキングオリゴヌクレオチド、ならびに標的濃縮の改善およびオフターゲット選択の低減のためのベイト | |
AU2018212756B2 (en) | Construction of next generation sequencing (NGS) libraries using competitive strand displacement | |
CN108431233B (zh) | Dna文库的高效率构建 | |
JP7008407B2 (ja) | ヌクレアーゼ、リガーゼ、ポリメラーゼ、及び配列決定反応の組み合わせを用いた、核酸配列、発現、コピー、またはdnaのメチル化変化の識別及び計数方法 | |
CA3006792A1 (en) | Improved adapters, methods, and compositions for duplex sequencing | |
US20180223350A1 (en) | Duplex adapters and duplex sequencing | |
US20230017673A1 (en) | Methods and Reagents for Molecular Barcoding | |
JP2023513606A (ja) | 核酸を評価するための方法および材料 | |
JP2023540782A (ja) | 遺伝子ライブラリーの高効率構築および遺伝子解析のためのアダプターおよび方法 | |
JP6066209B2 (ja) | Dna分子の環状化において単分子による環状化dnaのみを選別する方法 | |
WO2024119461A1 (en) | Compositions and methods for detecting target cleavage sites of crispr/cas nucleases and dna translocation | |
US20210147926A1 (en) | Construction of next generation sequencing (ngs) libraries using competitive strand displacement |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130725 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20140120 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20141125 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150109 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150623 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150707 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5780527 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |