JP6066209B2 - Dna分子の環状化において単分子による環状化dnaのみを選別する方法 - Google Patents
Dna分子の環状化において単分子による環状化dnaのみを選別する方法 Download PDFInfo
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Description
本明細書中、「単分子環状DNA」とは、単一のDNA分子により形成される環状DNAをいい、「複数分子環状DNA」とは、複数のDNA分子により形成される環状DNAをいう。
1)各目的DNA分子の一方の末端に第一段階環状化用アダプター(A)を結合させ、他方の末端に、アダプター(b)と前記アダプター(A)を含む第二段階環状化用アダプター(B)を結合させる工程;ここで、アダプター(B)は、DNA分子にアダプター(b)側を介して結合して、アダプター(B)中のアダプター(A)は、DNA分子とアダプター(b)との結合の外側に位置する、
ここで、
アダプター(A)は、いずれのアダプター(A)の切断末端とも非特異的に結合する切断末端を生じさせる切断部位を含む;
アダプター(b)は、該アダプター(b)ごとに異なる固有配列を2つ含み、該2つの固有配列は同一方向または逆方向に配向した同一の配列であり; かつ、
アダプター(b)は、該2つの固有配列の間に、いずれのアダプター(b)の切断末端とも非特異的に結合する切断末端を生じさせる切断部位を含み、該切断部位は、アダプター(A)の切断部位を切断する際には切断されることがなく、かつ、アダプター(A)の切断末端とは結合しない切断末端を生じさせるものである;
2)アダプター(A)の切断部位において、工程1)で得られたDNA分子を切断する第一切断工程;
3)工程2)で得られたDNA分子の両末端を結合させて環状化させる第一段階環状化工程;
4)工程3)において環状化せず直線状となったDNA分子を除去する工程;
5)アダプター(b)の切断部位において、工程3)および工程4)で得られた環状DNA分子を切断する第二切断工程; および、
6)工程5)で得られたDNA分子の両末端を結合させて環状化させる第二段階環状化工程、
ここで、工程6)で得られる環状DNA分子は、アダプター(b)部分の配列を配列決定することにより、アダプター(b)部分に含まれる2つの固有配列が同一であれば、複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAであり、該2つの固有配列が異なっていれば、複数分子環状DNAであるかまたは複数分子環状DNAに由来する単分子環状DNAであると判定されるものである。
1)本発明の第一の態様の方法によって環状DNA分子を作成する工程;および
2)該作成された環状DNA分子についてアダプター(b)部分の配列を配列決定し、複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別する工程、ここで、アダプター(b)部分に含まれる2つの固有配列が同一であれば、当該環状DNA分子は複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAであり、該2つの固有配列が異なっていれば、当該環状DNA分子は複数分子環状DNAであるかまたは複数分子環状DNAに由来する単分子環状DNAである。
1)各目的DNA分子の一方の末端に第一段階環状化用アダプター(A)を結合させ、他方の末端に、アダプター(b)と前記アダプター(A)を含む第二段階環状化用アダプター(B)を結合させる工程;ここで、アダプター(B)は、DNA分子にアダプター(b)側を介して結合して、アダプター(B)中のアダプター(A)は、DNA分子とアダプター(b)との結合の外側に位置する、
ここで、
アダプター(A)は、いずれのアダプター(A)の切断末端とも非特異的に結合する切断末端を生じさせる切断部位を含む;
アダプター(b)は、該アダプター(b)ごとに異なる固有配列を2つ含み、該2つの固有配列は同一方向または逆方向に配向した同一の配列であり; かつ、
アダプター(b)は、該2つの固有配列の間に、いずれのアダプター(b)の切断末端とも非特異的に結合する切断末端を生じさせる切断部位を含み、該切断部位は、アダプター(A)の切断部位を切断する際には切断されることがなく、かつ、アダプター(A)の切断末端とは結合しない切断末端を生じさせるものである;
2)アダプター(A)の切断部位において、工程1)で得られたDNA分子を切断する第一切断工程;
3)工程2)で得られたDNA分子の両末端を結合させて環状化させる第一段階環状化工程;
4)工程3)において環状化せず直線状となったDNA分子を除去する工程;
5)アダプター(b)の切断部位において、工程3)および工程4)で得られた環状DNA分子を切断する第二切断工程;
6)工程5)で得られたDNA分子の両末端を結合させて環状化させる第二段階環状化工程;および、
7)工程6)で得られた環状DNA分子が有するアダプター(b)部分の配列を配列決定し、複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別する工程、ここで、アダプター(b)部分に含まれる2つの固有配列が同一であれば、当該環状DNA分子は複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAであり、該2つの固有配列が異なっていれば、当該環状DNA分子は複数分子環状DNAであるかまたは複数分子環状DNAに由来する単分子環状DNAである。
好ましくは、アダプター(B)は、下記構造Z1−Y−Z2−AまたはZ1−Y−Z’2−Aを有する互いに相補的な二本鎖DNAである:
[構造中、
Aは、パリンドローム型制限酵素サイトXを含む二本鎖DNAであって、アダプター(A)に相当し;
Z1−Y−Z2は、本発明の第一から第三までの態様におけるアダプター(b)に相当し;
Yは、パリンドローム型制限酵素サイトy1およびy2を含む二本鎖DNAであり;
y1およびy2は同一であり、Xとは異なる配列を有し、かつ、Xの切断により生じる切断末端と相補的でない切断末端を生じさせるものであり;
Z1およびZ2は、アダプターごとに異なる固有配列C1およびC2を含む二本鎖DNA配列であり、ここで、C1とC2は、互いに逆方向に配向した同一の配列であり;
nは1以上40以下の整数であり;
N1〜Nnは、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、dAMP、dCMP、dGMPおよびdTMPからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオチドであり;
N’1〜N’nは、前記N1〜Nnに対してそれぞれ下記:
または
[構造中、
Z1−Y−Z’2は、本発明の第一から第三までの態様におけるアダプター(b)に相当し;
Z1およびZ’2は、アダプターごとに異なる固有配列C1およびC’2を含む二本鎖DNA配列であり、ここで、C1とC’2は、同一方向に配向した同一の配列であり;
A、X、Y、y1、y2、n、N1〜Nn、N’1〜N’n、およびkの定義は、上記の構造Z1−Y−Z2−Aにおけるものと同一である]。
上記Z1−Y−Z2−AおよびZ1−Y−Z’2−Aいずれの構造においても、nは1〜40であり、好ましくは、nは4〜15であり、さらに好ましくは、nは5〜10である。ただし、nが40を超えても本発明の方法を実施することができる。
[構造中、
Aは、パリンドローム型制限酵素サイトXを含む二本鎖DNAであり;
Yは、パリンドローム型制限酵素サイトy1およびy2を含む二本鎖DNAであり;
y1およびy2は同一であり、Xとは異なる配列を有し、かつ、Xの切断により生じる切断末端と相補的でない切断末端を生じさせるものであり;
Z1およびZ2は、アダプターごとに異なる固有配列C1およびC2を含む二本鎖DNA配列であり、ここで、C1とC2は、互いに逆向きに配向した同一の配列であり;
nは1以上40以下の整数であり;
N1〜Nnは、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、dAMP、dCMP、dGMPおよびdTMPからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオチドであり;
N’1〜N’nは、前記N1〜Nnに対してそれぞれ下記:
または
[構造中、
Z1およびZ’2は、アダプターごとに異なる固有配列C1およびC’2を含む二本鎖DNA配列であり、ここで、C1とC’2は、同一方向に配向した同一の配列であり;
A、X、Y、y1、y2、n、N1〜Nn、N’1〜N’n、およびkの定義は、上記の構造Z1−Y−Z2−Aにおけるものと同一である]。
上記Z1−Y−Z2−AおよびZ1−Y−Z’2−Aいずれの構造においても、nは1〜40であり、好ましくは、nは4〜15であり、さらに好ましくは、nは5〜10である。ただし、nが40を超えても本発明の方法を実施することができる。
1)本発明の第一の態様の方法によって作成された環状DNA分子の集団、本発明の第二の態様の方法によって作成された複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAまたは本発明の第三の態様の方法によって選別された複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAにおける、アダプター(B)の両側に隣接するそれぞれ15塩基以上600塩基以下の塩基配列を解読する工程、ここで、本発明の第一の態様の方法によって作成された環状DNA分子の集団を用いる場合には、当該工程の前に、当該工程と同時に、または当該工程の後に、アダプター(b)部分の配列を配列決定することにより複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別する工程をさらに含む;および、
2)工程1)で解読した塩基配列を既知の遺伝子の両末端の配列と比較することにより、該複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAに含まれる遺伝子を同定する工程。
好ましくは、解読する塩基配列は、15〜100塩基、さらに好ましくは25〜35塩基である。ただし、600塩基以上を解読しても本発明の方法を実施することができる。
1)本発明の第一の態様の方法によって作成された環状DNA分子の集団、本発明の第二の態様の方法によって作成された複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAまたは本発明の第三の態様の方法によって選別された複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAにおける、アダプター(B)の両側に隣接するそれぞれ15塩基以上600塩基以下の塩基配列を解読する工程、ここで、本発明の第一の態様の方法によって作成された環状DNA分子の集団を用いる場合には、当該工程の前に、当該工程と同時に、または当該工程の後に、アダプター(b)部分の配列を配列決定することにより複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別する工程をさらに含む;および、
2)工程1)で解読した塩基配列を既知の遺伝子の両末端の配列と比較する工程、ここで、両末端の遺伝子が既知の相異なる遺伝子に対応する場合、該複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAに含まれる遺伝子は融合遺伝子であると同定される。
好ましくは、解読する塩基配列は、15〜100塩基、さらに好ましくは25〜35塩基である。ただし、600塩基以上を解読しても本発明の方法を実施することができる。
本発明は、第一の態様として、以下の工程を含む、環状DNA分子の集団の作成方法であって、該方法により作成された環状DNA分子の集団から複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別することを可能にする方法を提供する:
1)各目的DNA分子の一方の末端に第一段階環状化用アダプター(A)を結合させ、他方の末端に、アダプター(b)と前記アダプター(A)を含む第二段階環状化用アダプター(B)を結合させる工程;ここで、アダプター(B)は、DNA分子にアダプター(b)側を介して結合して、アダプター(B)中のアダプター(A)は、DNA分子とアダプター(b)との結合の外側に位置する、
ここで、
アダプター(A)は、いずれのアダプター(A)の切断末端とも非特異的に結合する切断末端を生じさせる切断部位を含む;
アダプター(b)は、該アダプター(b)ごとに異なる固有配列を2つ含み、該2つの固有配列は同一方向または逆方向に配向した同一の配列であり; かつ、
アダプター(b)は、該2つの固有配列の間に、いずれのアダプター(b)の切断末端とも非特異的に結合する切断末端を生じさせる切断部位を含み、該切断部位は、アダプター(A)の切断部位を切断する際には切断されることがなく、かつ、アダプター(A)の切断末端とは結合しない切断末端を生じさせるものである;
2)アダプター(A)の切断部位において、工程1)で得られたDNA分子を切断する第一切断工程;
3)工程2)で得られたDNA分子の両末端を結合させて環状化させる第一段階環状化工程;
4)工程3)において環状化せず直線状となったDNA分子を除去する工程;
5)アダプター(b)の切断部位において、工程3)および工程4)で得られた環状DNA分子を切断する第二切断工程; および、
6)工程5)で得られたDNA分子の両末端を結合させて環状化させる第二段階環状化工程、
ここで、工程6)で得られる環状DNA分子は、アダプター(b)部分の配列を配列決定することにより、アダプター(b)部分に含まれる2つの固有配列が同一であれば、複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAであり、該2つの固有配列が異なっていれば、複数分子環状DNAであるかまたは複数分子環状DNAに由来する単分子環状DNAであると判定されるものである。
工程1)は、各目的DNA分子の一方の末端に第一段階環状化用アダプター(A)を結合させ、他方の末端に、アダプター(b)と前記アダプター(A)を含む第二段階環状化用アダプター(B)を結合させる工程である。ここで、アダプター(B)は、DNA分子にアダプター(b)側を介して結合させることにより、アダプター(B)中のアダプター(A)は、DNA分子とアダプター(b)との結合の外側に位置する。即ち、各目的DNA分子の一端には、アダプター(A)を、他端にはアダプター(B)を結合させ、アダプター(B)中のアダプター(A)をアダプター(b)よりも末端側に位置させることにより、アダプター(A)を各目的DNA分子の両末端に位置させる。
(1)「複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNA」(例えば図6のA4)、ここで、該単分子環状DNAは、第一段階環状化工程において形成された単分子環状DNA(例えば図6のA2)が第二切断工程によって切断されて生じる単分子DNA(例えば図6のA3)が自己環状化することにより形成されるものである;
(2)「複数分子環状DNAに由来する単分子環状DNA」(例えば図6のB4-1)、ここで、該単分子環状DNAは、第一段階環状化工程において形成された複数分子環状DNA(例えば図6のB2)が第二切断工程によって切断されて生じる単分子DNA(例えば図6のB3)が自己環状化することにより形成されるものである;
(3)「複数分子環状DNA-1」(例えば図6のB4-2)、ここで、該DNA-1は、第一段階環状化工程において形成された複数分子環状DNA(例えば図6のB2)が第二切断工程によって切断されて生じる単分子DNA(例えば図6のB3)同士が複数結合して環状化することにより形成されるものである;
(4)「複数分子環状DNA-2」(例えば図6のB4-3)、ここで、該DNA-2は、第一段階環状化工程において形成された単分子環状DNA(例えば図6のA2)が第二切断工程によって切断されて生じる単分子DNA (例えば図6のA3)と、第一段階環状化工程において形成された複数分子環状DNA(例えば図6のB2)が第二切断工程によって切断されて生じる単分子DNA(例えば図6のB3)とが結合して環状化することにより形成されるものである; および
(5)「複数分子環状DNA-3」(例えば図6のB4-4)、ここで、該DNA-3は、第一段階環状化工程において形成された単分子環状DNA(例えば図6のA2)が第二切断工程によって切断されて生じる単分子DNA(例えば図6のA3)同士が複数結合して環状化することにより形成されるものである。
ここで、例えばNNNNNを上流および下流で
と設定する。
本発明は、第二の態様として、以下の工程を含む、複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAの作成方法を提供する:
1)本発明の第一の態様の方法によって環状DNA分子を作成する工程;および
2)該作成された環状DNA分子についてアダプター(b)部分の配列を配列決定し、複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別する工程、ここで、アダプター(b)部分に含まれる2つの固有配列が同一であれば、当該環状DNA分子は複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAであり、該2つの固有配列が異なっていれば、当該環状DNA分子は複数分子環状DNAであるかまたは複数分子環状DNAに由来する単分子環状DNAである。
本発明は、第三の態様として、以下の工程を含む、環状DNA分子の作成において複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別する方法を提供する:
1)各目的DNA分子の一方の末端に第一段階環状化用アダプター(A)を結合させ、他方の末端に、アダプター(b)と前記アダプター(A)を含む第二段階環状化用アダプター(B)を結合させる工程;ここで、アダプター(B)は、DNA分子にアダプター(b)側を介して結合して、アダプター(B)中のアダプター(A)は、DNA分子とアダプター(b)との結合の外側に位置する、
ここで、
アダプター(A)は、いずれのアダプター(A)の切断末端とも非特異的に結合する切断末端を生じさせる切断部位を含む;
アダプター(b)は、該アダプター(b)ごとに異なる固有配列を2つ含み、該2つの固有配列は同一方向または逆方向に配向した同一の配列であり; かつ、
アダプター(b)は、該2つの固有配列の間に、いずれのアダプター(b)の切断末端とも非特異的に結合する切断末端を生じさせる切断部位を含み、該切断部位は、アダプター(A)の切断部位を切断する際には切断されることがなく、かつ、アダプター(A)の切断末端とは結合しない切断末端を生じさせるものである;
2)アダプター(A)の切断部位において、工程1)で得られたDNA分子を切断する第一切断工程;
3)工程2)で得られたDNA分子の両末端を結合させて環状化させる第一段階環状化工程;
4)工程3)において環状化せず直線状となったDNA分子を除去する工程;
5)アダプター(b)の切断部位において、工程3)および工程4)で得られた環状DNA分子を切断する第二切断工程;
6)工程5)で得られたDNA分子の両末端を結合させて環状化させる第二段階環状化工程;および、
7)工程6)で得られた環状DNA分子が有するアダプター(b)部分の配列を配列決定し、複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別する工程、ここで、アダプター(b)部分に含まれる2つの固有配列が同一であれば、当該環状DNA分子は複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAであり、該2つの固有配列が異なっていれば、当該環状DNA分子は複数分子環状DNAであるかまたは複数分子環状DNAに由来する単分子環状DNAである。
好ましくは、アダプター(B)は、下記構造Z1−Y−Z2−AまたはZ1−Y−Z’2−Aを有する互いに相補的な二本鎖DNAである:
[構造中、
Aは、パリンドローム型制限酵素サイトXを含む二本鎖DNAであって、アダプター(A)に相当し;
Z1−Y−Z2は、本発明の第一から第三までの態様におけるアダプター(b)に相当し;
Yは、パリンドローム型制限酵素サイトy1およびy2を含む二本鎖DNAであり;
y1およびy2は同一であり、Xとは異なる配列を有し、かつ、Xの切断により生じる切断末端と相補的でない切断末端を生じさせるものであり;
Z1およびZ2は、アダプターごとに異なる固有配列C1およびC2を含む二本鎖DNA配列であり、ここで、C1とC2は、互いに逆方向に配向した同一の配列であり;
nは1以上40以下の整数であり;
N1〜Nnは、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、dAMP、dCMP、dGMPおよびdTMPからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオチドであり;
N’1〜N’nは、前記N1〜Nnに対してそれぞれ下記:
または
[構造中、
Z1−Y−Z’2は、本発明の第一から第三までの態様におけるアダプター(b)に相当し;
Z1およびZ’2は、アダプターごとに異なる固有配列C1およびC’2を含む二本鎖DNA配列であり、ここで、C1とC’2は、同一方向に配向した同一の配列であり;
A、X、Y、y1、y2、n、N1〜Nn、N’1〜N’n、およびkの定義は、上記の構造Z1−Y−Z2−Aにおけるものと同一である]。
アダプター(b)における固有配列の長さ(上記構造Z1−Y−Z2−AまたはZ1−Y−Z’2−Aを有するアダプターにおいては、構造中の「n」)は、特に限定されないが、好ましくは1〜40塩基、より好ましくは4〜15塩基、さらに好ましくは5〜10塩基である。塩基数が多いほど固有配列の種類が増え、第一段階環状化工程において同じアダプター(b)部分を有する(即ち、同じ固有配列を有する)異なるDNA分子同士が結合して複数分子環状DNAを形成する確率は低下する。
本発明は、第四の態様として、上記本発明の第一から第三までの態様の方法において用いられる好適なアダプター(B)、即ち、下記構造Z1−Y−Z2−AまたはZ1−Y−Z’2−Aを有する互いに相補的な二本鎖DNAからなる環状DNA作成用アダプターであって、該アダプターを用いて作成された環状DNA分子の集団から複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別することを可能にするためのアダプターを提供する:
[構造中、
Aは、パリンドローム型制限酵素サイトXを含む二本鎖DNAであり;
Yは、パリンドローム型制限酵素サイトy1およびy2を含む二本鎖DNAであり;
y1およびy2は同一であり、Xとは異なる配列を有し、かつ、Xの切断により生じる切断末端と相補的でない切断末端を生じさせるものであり;
Z1およびZ2は、アダプターごとに異なる固有配列C1およびC2を含む二本鎖DNA配列であり、ここで、C1とC2は、互いに逆向きに配向した同一の配列であり;
nは1以上40以下の整数であり;
N1〜Nnは、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、dAMP、dCMP、dGMPおよびdTMPからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオチドであり;
N’1〜N’nは、前記N1〜Nnに対してそれぞれ下記:
または
[構造中、
Z1およびZ’2は、アダプターごとに異なる固有配列C1およびC’2を含む二本鎖DNA配列であり、ここで、C1とC’2は、同一方向に配向した同一の配列であり;
A、X、Y、y1、y2、n、N1〜Nn、N’1〜N’n、およびkの定義は、上記の構造Z1−Y−Z2−Aにおけるものと同一である]。
上記第四の態様のアダプターにおける構造Z1−Y−Z2またはZ1−Y−Z’2に代表され、上記本発明の第一から第三までの態様において好適に使用される、同一の固有配列を2つ有するアダプター(b)は、例えば、ヘアピン構造を有する核酸を用い、ポリメラーゼ伸長、ニック作成、ポリメラーゼ伸長という3段階の反応を行うことにより作成することができる(図8)。しかし、作成方法はこれに限定されず、例えば配列合成等によって所望のアダプター(b)を作成することも可能である。
本発明は、第五の態様として、上記本発明の第一から第三までの態様の方法において用いられる好適なアダプター(A)およびアダプター(B)を含む環状DNA作成用キットであって、該キットを用いて作成された環状DNA分子の集団から複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別することを可能にするキットを提供する。即ち、上記第四の態様に記載の制限酵素サイトXと同一の制限酵素サイトを含む二本鎖DNAからなるアダプター(A)と、上記第四の態様に記載のアダプター(B)とを含む、環状DNA作成用キットを提供する。
本発明の第六の態様は、本発明の第一から第三までのいずれかの態様の二段階環状化方法を用いる、cDNAライブラリーの作成方法である。
本発明の第一の態様による方法を直鎖状cDNAからなるライブラリーに適用することにより、ライブラリーのメンバーについてアダプター(b)部分の配列を配列決定することによって複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAであるメンバーのみを選別することが可能なcDNAライブラリーを作成することができる。従って、例えばかかるcDNAライブラリーを用いて遺伝子解析を行う場合、該ライブラリーについて網羅的に配列解読を行った後、複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのデータのみを解析対象として選別することができる。
本発明の第七の態様は、以下の工程を含む、環状DNA分子をメイトペア法に供することにより遺伝子を同定する方法である:
1)本発明の第一の態様の方法によって作成された環状DNA分子の集団、本発明の第二の態様の方法によって作成された複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAまたは本発明の第三の態様の方法によって選別された複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAにおける、アダプター(B)の両側に隣接するそれぞれ15塩基以上600塩基以下の塩基配列を解読する工程、ここで、本発明の第一の態様の方法によって作成された環状DNA分子の集団を用いる場合には、当該工程の前に、当該工程と同時に、または当該工程の後に、アダプター(b)部分の配列を配列決定することにより複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別する工程をさらに含む;および、
2)工程1)で解読した塩基配列を既知の遺伝子の両末端の配列と比較することにより、該複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAに含まれる遺伝子を同定する工程。
あるいは、同じサンプルを、アダプター(B)の外側の配列解読用およびアダプター(b)部分の配列解読用として複数に分け、これらを同時にシークエンシング反応に供試してそれぞれ配列データを取得する場合も挙げられる。
いずれにおいても、アダプター(b)部分における2つの固有配列が同一であるサンプル(即ち、複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNA)のデータのみを解析対象として選別することができる。
本発明の第八の態様は、以下の工程を含む、環状DNA分子をメイトペア法に供することにより融合遺伝子を検出する方法である:
1)本発明の第一の態様の方法によって作成された環状DNA分子の集団、本発明の第二の態様の方法によって作成された複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAまたは本発明の第三の態様の方法によって選別された複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAにおける、アダプター(B)の両側に隣接するそれぞれ15塩基以上600塩基以下の塩基配列を解読する工程、ここで、本発明の第一の態様の方法によって作成された環状DNA分子の集団を用いる場合には、当該工程の前に、当該工程と同時に、または当該工程の後に、アダプター(b)部分の配列を配列決定することにより複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別する工程をさらに含む;および、
2)工程1)で解読した塩基配列を既知の遺伝子の両末端の配列と比較する工程、ここで、両末端の遺伝子が既知の相異なる遺伝子に対応する場合、該複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAに含まれる遺伝子は融合遺伝子であると同定される。
当該工程1)において、「当該工程と同時に」アダプター(b)部分の配列を配列決定する場合については、上記第七の態様と同様である。
mRNAからcDNAライブラリーを合成する場合、現在使用されている最も一般的な方法(Clontech SMART cDNA method) では、図9のようにmRNAの3’末端のpolyAサイトに相補的なpolyT配列を有するオリゴヌクレオチド (1)を用いて、まず相補鎖DNAを逆転写酵素で合成する。合成終了時にmRNAの5’末端において図9のように特定オリゴヌクレオチド配列 (2)が取り込まれる。次にこの特定配列へ相補的なオリゴヌクレオチドからDNA合成を行うこと、あるいはPCRにより、cDNAライブラリーが作成される。
この場合、mRNAの3’末端のpolyAサイトに相補的なpolyT配列を有するオリゴヌクレオチド(1)配列にアダプター(B)を導入しておき、オリゴヌクレオチド(2)配列にアダプター(A)を付加しておく。これにより、cDNAライブラリーが合成されたときには、自動的に本発明の基本形の構造になっており、右端左端に新たな配列を結合させる必要もなく、そのまま次のステップへ進むことができる(図9)。この方法で、さらにcDNAライブラリーをPCR増幅する際に、そのまま増幅したのではある特定の固有配列が増幅されてしまう。そこで、固有配列の多様性を維持するため、例えば、上流プライマーとして5’リン酸基付加プライマーを使用し、下流プライマーには固有配列を含むプライマーを用いて増幅し、PCR後にリン酸基プライマーを取り込んだ側のストランドをλエキソヌクレアーゼで分解し、再度上流プライマーからプライマー伸長を行い、固有配列による多様性を維持したcDNAライブラリーを完成させる、等の手続きを行う。但し、アダプター結合法であればこの過程は必要なく、ライブラリーの断片化などの修飾を行った上で本発明のアダプターを導入するためには、次のアダプター結合法を行う。
cDNAライブラリーを作成した場合、図9の(3)のように3’末端、5’末端にそれぞれ制限酵素サイトを導入しておくことができる。この場合の制限酵素サイトとしては通常のパリンドローム型制限酵素サイトを使用することも、末端を区別するためにノン・パリンドローム型制限酵素サイトを使用することも可能である。また、アダプター結合を確実にするため、平滑末端ではなくA突出塩基を有する末端へアダプターを結合することも可能である。ライブラリーの修飾を行った上に本発明のアダプターを導入するためにはこちらの方法が望ましい。
ゲノムを対象とする場合はcDNAライブラリーとは状況が異なる。ゲノム断片は、cDNAと異なりDNA断片の左右を区別することができない。従って図10のように左端のアダプター、右端のアダプターを双方結合させて、双方のアダプターが適切に結合したもの、即ち図10の( a ) のみを、PCR法や修飾リンカーを用いる方法、あるいは両端の制限酵素サイトXとしてノン・パリンドローム配列を用いることや、N領域を含む制限酵素(BstXI等)を用いて同一部位に制限酵素サイトを複数設置する方法等によって選択してゆくことができる。
基本的に、以下のような手法をとることによりアダプター(A)と(B)をDNA分子の両末端にそれぞれ付加する。第一に、目的DNA分子数に応じて、ある程度の濃度を決定した複数のDNA群に、先ず、アダプター(A)を結合させる。この場合、アダプター(A)の添加量は存在する対象DNA分子量よりも少なめとする。ただし、量論的には、対象DNA分子数と同数であっても、あるいは、DNA断片に一塩基突出を酵素的に作成し、相補的なアダプターを結合させてもよく、この場合は特にアダプターの濃度は過剰であっても構わない。これにより、アダプター(A)をDNA分子の末端に結合させる。次いで、アダプター(B)を結合させる。
例えば、アダプター(A)として、切断末端W1を生じさせるアダプター"A1"を用い、アダプター(B)に含まれるアダプター(A)として、切断末端W2を生じさせるアダプター"A2"を用いる。ここで、切断末端W1とW2が相補的である一方、W1同士およびW2同士は相補的でない、即ち、アダプター"A1"と"A2"の間でのみライゲーションが可能なように配列を設計または選択する。
図10の(a) タイプの分子の場合、第一段階環状化、第二切断、第二段階環状化が問題なく行われ、問題なく目的の環状化DNAが作成される。一方、図10の(b)タイプの分子の場合、単独で第一段階環状化が可能であるが、アダプター(b)部分を有さないため、第二切断が行われずに環状DNAのまま残ってしまい、排除することができない。これを防ぐ方法例として、下記の「BstXI法」がある。
両端にアダプター(A)が付加された場合、第一段階でライゲーションされるが、第二段階の開裂が起きないため、このままでは環状のまま留まってしまう。この問題を解決する方法として、アダプター(A)の制限酵素サイトを含む外側に、例えば BstXI を仕込むことが挙げられる。つまり、下記制限酵素サイトBstXI部位において、CCANNNNNNTGGを、例えば、 CCAGGATCCTGG となるようにBamHIサイトを組み込む。
第二切断工程により分離したDNA分子同士が再び会合する可能性は確率論的に十分無視できるが、その根拠を以下に説明する。
第二切断工程により複数分子環状DNAが切断されて生じた一のDNA分子が、切断前に結合していた相手DNA分子と再び会合する可能性を確率論的に推定するため、(1)DNA分子の体積と反応溶液量(体積)で推定する場合と、(2)反応溶液中の分子数から推定する場合に分けて可能性を概算する。
まずDNA1分子を球状として体積を推定し、反応系で一度分離された分子同士が互いに球体として溶液中で会合する可能性を概算する。
一塩基の長さ:0.34 nm (0.34 x 10e-9 m = 3.4 x 10e-8 mm)
3kbp (3000 bp) のプラスミドの長さ:1 x 10e-4 mm
球体として占めると推定した体積は:4/3 x 3.14 x (1 x 10e-4) x (1 x 10e-4) x (1 x 10e-4) mm3 = 4 x 10e-12 mm3
一分子の体積を 4 x 10e-12 mm3と仮定すると 100 μL中には球体として:100 mm3 / 4 x 10e-12 mm3 = 2.5 x 10e13 個分の体積が存在することとなる。
従って、均一であるとすると、ある球体に相補的とされる同等な球体が会合する可能性は、(1 / (2.5 x 10e13)) = 4 x 10e-14と極めて小さい。
一方、分子数を計算すると、
3kbpのプラスミドの分子量は:625 x 3000 = 1.8 x 10e6
1モルのプラスミド質量は:1 mol = 1.8 x 10e6 g = 1.8 x 10e12 μg
3 μgのプラスミドのモル数は:3 μg / (1.8 x 10e12) μg = 3/1.8 x 10e-12 mol = 1.6 x 10e-12 mol
アボガドロ数を 6 x 10e23 とすると、3μgのプラスミドの分子数は、1.6 x 10e-12 x 6 x 10e23 = 1.6 x 6 x 10e11 = 1 x 10e12 個となる。
従って、例えば 100μLの反応系中に 3μgのプラスミドが存在する場合、第二切断工程において分離した一方の分子が、他方の(即ち、同一の固有配列を有する)分子と再度会合する可能性は、1 / ((1 x 10e12) -1) = 1 x 10e-12 と極めて低い。
Claims (18)
- 以下の工程を含む、環状DNA分子の集団の作成方法であって、該方法により作成された環状DNA分子の集団から複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別することを可能にする方法:
1)各目的DNA分子の一方の末端に第一段階環状化用アダプター(A)を結合させ、他方の末端に、アダプター(b)と前記アダプター(A)を含む第二段階環状化用アダプター(B)を結合させる工程;ここで、アダプター(B)は、DNA分子にアダプター(b)側を介して結合して、アダプター(B)中のアダプター(A)は、DNA分子とアダプター(b)との結合の外側に位置する、
ここで、
アダプター(A)は、いずれのアダプター(A)の切断末端とも非特異的に結合する切断末端を生じさせる切断部位を含む;
アダプター(b)は、該アダプター(b)ごとに異なる固有配列を2つ含み、該2つの固有配列は同一方向または逆方向に配向した同一の配列であり; かつ、
アダプター(b)は、該2つの固有配列の間に、いずれのアダプター(b)の切断末端とも非特異的に結合する切断末端を生じさせる切断部位を含み、該切断部位は、アダプター(A)の切断部位を切断する際には切断されることがなく、かつ、アダプター(A)の切断末端とは結合しない切断末端を生じさせるものである;
2)アダプター(A)の切断部位において、工程1)で得られたDNA分子を切断する第一切断工程;
3)工程2)で得られたDNA分子の両末端を結合させて環状化させる第一段階環状化工程;
4)工程3)において環状化せず直線状となったDNA分子を除去する工程;
5)アダプター(b)の切断部位において、工程3)および工程4)で得られた環状DNA分子を切断する第二切断工程; および、
6)工程5)で得られたDNA分子の両末端を結合させて環状化させる第二段階環状化工程、
ここで、工程6)で得られる環状DNA分子は、アダプター(b)部分の配列を配列決定することにより、アダプター(b)部分に含まれる2つの固有配列が同一であれば、複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAであり、該2つの固有配列が異なっていれば、複数分子環状DNAであるかまたは複数分子環状DNAに由来する単分子環状DNAであると判定されるものである。 - アダプター(b)が、2つの固有配列の間に、いずれのアダプター(b)の切断末端とも非特異的に結合する切断末端を生じる切断部位を2つ含むものである、請求項1記載の方法。
- アダプター(A)が、パリンドローム型制限酵素サイトXを含む互いに相補的な二本鎖DNAであり、
アダプター(B)が、下記構造Z1−Y−Z2−AまたはZ1−Y−Z’2−Aを有する互いに相補的な二本鎖DNAである、請求項1または2記載の方法:
[構造中、
Aは、パリンドローム型制限酵素サイトXを含む二本鎖DNAであって、アダプター(A)に相当し;
Z1−Y−Z2は、請求項1または2におけるアダプター(b)に相当し;
Yは、パリンドローム型制限酵素サイトy1およびy2を含む二本鎖DNAであり;
y1およびy2は同一であり、Xとは異なる配列を有し、かつ、Xの切断により生じる切断末端と相補的でない切断末端を生じさせるものであり;
Z1およびZ2は、アダプターごとに異なる固有配列C1およびC2を含む二本鎖DNA配列であり、ここで、C1とC2は、互いに逆方向に配向した同一の配列であり;
nは1以上40以下の整数であり;
N1〜Nnは、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、dAMP、dCMP、dGMPおよびdTMPからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオチドであり;
N’1〜N’nは、前記N1〜Nnに対してそれぞれ下記:
または
[構造中、
Z1−Y−Z’2は、請求項1または2におけるアダプター(b)に相当し;
Z1およびZ’2は、アダプターごとに異なる固有配列C1およびC’2を含む二本鎖DNA配列であり、ここで、C1とC’2は、同一方向に配向した同一の配列であり;
A、X、Y、y1、y2、n、N1〜Nn、N’1〜N’n、およびkの定義は、上記の構造Z1−Y−Z2−Aにおけるものと同一である]。 - 請求項1〜3いずれかに記載の方法によって作成された環状DNA分子の集団。
- 以下の工程を含む、複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAの作成方法:
1)請求項1〜3のいずれかに記載の方法によって環状DNA分子を作成する工程;および
2)該作成された環状DNA分子についてアダプター(b)部分の配列を配列決定し、複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別する工程、ここで、アダプター(b)部分に含まれる2つの固有配列が同一であれば、当該環状DNA分子は複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAであり、該2つの固有配列が異なっていれば、当該環状DNA分子は複数分子環状DNAであるかまたは複数分子環状DNAに由来する単分子環状DNAである。 - 請求項5記載の方法によって作成された、複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNA。
- 以下の工程を含む、環状DNA分子の作成において、複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別する方法:
1)各目的DNA分子の一方の末端に第一段階環状化用アダプター(A)を結合させ、他方の末端に、アダプター(b)と前記アダプター(A)を含む第二段階環状化用アダプター(B)を結合させる工程;ここで、アダプター(B)は、DNA分子にアダプター(b)側を介して結合して、アダプター(B)中のアダプター(A)は、DNA分子とアダプター(b)との結合の外側に位置する、
ここで、
アダプター(A)は、いずれのアダプター(A)の切断末端とも非特異的に結合する切断末端を生じさせる切断部位を含む;
アダプター(b)は、該アダプター(b)ごとに異なる固有配列を2つ含み、該2つの固有配列は同一方向または逆方向に配向した同一の配列であり; かつ、
アダプター(b)は、該2つの固有配列の間に、いずれのアダプター(b)の切断末端とも非特異的に結合する切断末端を生じさせる切断部位を含み、該切断部位は、アダプター(A)の切断部位を切断する際には切断されることがなく、かつ、アダプター(A)の切断末端とは結合しない切断末端を生じさせるものである;
2)アダプター(A)の切断部位において、工程1)で得られたDNA分子を切断する第一切断工程;
3)工程2)で得られたDNA分子の両末端を結合させて環状化させる第一段階環状化工程;
4)工程3)において環状化せず直線状となったDNA分子を除去する工程;
5)アダプター(b)の切断部位において、工程3)および工程4)で得られた環状DNA分子を切断する第二切断工程;
6)工程5)で得られたDNA分子の両末端を結合させて環状化させる第二段階環状化工程;および、
7)工程6)で得られた環状DNA分子が有するアダプター(b)部分の配列を配列決定し、複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別する工程、ここで、アダプター(b)部分に含まれる2つの固有配列が同一であれば、当該環状DNA分子は複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAであり、該2つの固有配列が異なっていれば、当該環状DNA分子は複数分子環状DNAであるかまたは複数分子環状DNAに由来する単分子環状DNAである。 - アダプター(b)が、2つの固有配列の間に、いずれのアダプター(b)の切断末端とも非特異的に結合する切断末端を生じる切断部位を2つ含むものである、請求項7記載の方法。
- アダプター(A)が、パリンドローム型制限酵素サイトXを含む互いに相補的な二本鎖DNAであり、
アダプター(B)が、下記構造Z1−Y−Z2−AまたはZ1−Y−Z’2−Aを有する互いに相補的な二本鎖DNAである、請求項7または8記載の方法:
[構造中、
Aは、パリンドローム型制限酵素サイトXを含む二本鎖DNAであって、アダプター(A)に相当し;
Z1−Y−Z2は、請求項7または8におけるアダプター(b)に相当し;
Yは、パリンドローム型制限酵素サイトy1およびy2を含む二本鎖DNAであり;
y1およびy2は同一であり、Xとは異なる配列を有し、かつ、Xの切断により生じる切断末端と相補的でない切断末端を生じさせるものであり;
Z1およびZ2は、アダプターごとに異なる固有配列C1およびC2を含む二本鎖DNA配列であり、ここで、C1とC2は、互いに逆方向に配向した同一の配列であり;
nは1以上40以下の整数であり;
N1〜Nnは、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、dAMP、dCMP、dGMPおよびdTMPからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオチドであり;
N’1〜N’nは、前記N1〜Nnに対してそれぞれ下記:
または
[構造中、
Z1−Y−Z’2は、請求項7または8におけるアダプター(b)に相当し;
Z1およびZ’2は、アダプターごとに異なる固有配列C1およびC’2を含む二本鎖DNA配列であり、ここで、C1とC’2は、同一方向に配向した同一の配列であり;
A、X、Y、y1、y2、n、N1〜Nn、N’1〜N’n、およびkの定義は、上記の構造Z1−Y−Z2−Aにおけるものと同一である]。 - 請求項7〜9いずれかに記載の方法により選別された、複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNA。
- 下記構造Z1−Y−Z2−AまたはZ1−Y−Z’2−Aを有する互いに相補的な二本鎖DNAからなる環状DNA作成用アダプターであって、該アダプターを用いて作成された環状DNA分子の集団から複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別することを可能にするための、アダプター:
[構造中、
Aは、パリンドローム型制限酵素サイトXを含む二本鎖DNAであり;
Yは、パリンドローム型制限酵素サイトy1およびy2を含む二本鎖DNAであり;
y1およびy2は同一であり、Xとは異なる配列を有し、かつ、Xの切断により生じる切断末端と相補的でない切断末端を生じさせるものであり;
Z1およびZ2は、アダプターごとに異なる固有配列C1およびC2を含む二本鎖DNA配列であり、ここで、C1とC2は、互いに逆向きに配向した同一の配列であり;
nは1以上40以下の整数であり;
N1〜Nnは、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、dAMP、dCMP、dGMPおよびdTMPからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオチドであり;
N’1〜N’nは、前記N1〜Nnに対してそれぞれ下記:
または
[構造中、
Z1およびZ’2は、アダプターごとに異なる固有配列C1およびC’2を含む二本鎖DNA配列であり、ここで、C1とC’2は、同一方向に配向した同一の配列であり;
A、X、Y、y1、y2、n、N1〜Nn、N’1〜N’n、およびkの定義は、上記の構造Z1−Y−Z2−Aにおけるものと同一である]。 - 請求項11に記載のアダプターと、請求項11に記載のアダプターに含まれる制限酵素サイトXと同一の制限酵素サイトを含む二本鎖DNAからなるアダプターとを含む環状DNA作成用キットであって、該キットを用いて作成された環状DNA分子の集団から複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別することを可能にする、キット。
- 請求項1〜3いずれかに記載の方法を用いるcDNAライブラリーの作成方法であって、該ライブラリーが、該ライブラリーから複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別することが可能なものである、方法。
- 請求項5記載の方法または請求項7〜9いずれかに記載の方法を用いる、複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみからなるcDNAライブラリーの作成方法。
- 以下の工程を含む、環状DNA分子をメイトペア法に供することにより遺伝子を同定する方法:
1)請求項1〜3いずれかに記載の方法によって作成された環状DNA分子の集団または請求項6もしくは10に記載の複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAにおける、アダプター(B)の両側に隣接するそれぞれ15塩基以上600塩基以下の塩基配列を解読する工程、ここで、請求項1〜3いずれかに記載の方法によって作成された環状DNA分子の集団を用いる場合には、当該工程の前に、当該工程と同時に、または当該工程の後に、アダプター(b)部分の配列を配列決定することにより複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別する工程をさらに含む;および、
2)工程1)で解読した塩基配列を既知の遺伝子の両末端の配列と比較することにより、該複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAに含まれる遺伝子を同定する工程。 - 以下の工程を含む、環状DNA分子をメイトペア法に供することにより融合遺伝子を検出する方法:
1)請求項1〜3いずれかに記載の方法によって作成された環状DNA分子の集団または請求項6もしくは10に記載の複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAにおける、アダプター(B)の両側に隣接するそれぞれ15塩基以上600塩基以下の塩基配列を解読する工程、ここで、請求項1〜3いずれかに記載の方法によって作成された環状DNA分子の集団を用いる場合には、当該工程の前に、当該工程と同時に、または当該工程の後に、アダプター(b)部分の配列を配列決定することにより複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAのみを選別する工程をさらに含む;および、
2)工程1)で解読した塩基配列を既知の遺伝子の両末端の配列と比較する工程、ここで、両末端の遺伝子が既知の相異なる遺伝子に対応する場合、該複数分子環状DNAに由来しない単分子環状DNAに含まれる遺伝子は融合遺伝子であると同定される。 - アダプター(B)の両側に隣接する両側の配列が、既知融合遺伝子の両側の末端に対応する、請求項16に記載の融合遺伝子の検出方法。
- アダプター(B)の両側に隣接する配列が、相異なる遺伝子の末端配列に対応し、かつ既知融合遺伝子の両側の末端には対応しないことにより、環状DNA分子に含まれる遺伝子が新規融合遺伝子であると同定される請求項16に記載の方法。
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