JPH07508883A

JPH07508883A - ヌクレオチド配列集団の分類方法

Info

Publication number: JPH07508883A
Application number: JP6503130A
Authority: JP
Inventors: シブソン、デイビッド、ロス
Original assignee: メディカルリサーチカウンシル
Priority date: 1992-07-13
Filing date: 1993-07-13
Publication date: 1995-10-05
Anticipated expiration: 2017-01-28
Also published as: DE69315074D1; WO1994001582A1; ATE159986T1; AU4575893A; IL106316A0; EP0650528A1; DE69315074T2; GB9214873D0; AU686563B2; EP0650528B1; US5728524A; CA2139944A1; JP3251291B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヌクレオチド配列集団の分類方法本発明は、核酸配列の集団の個々のメンバーの研究、特にそのような集団の個々のメンバーが非常に多様な量で存在しつる場合の研究を容易にする技術に関する。この技術は、配列の索引付けを可能にする。複雑な核酸又はポリヌクレオチドの集団を研究することが必要であるという状況は益々増加している。例えば、もし生物例えばヒトのゲノムの全体配列が決定されその情報が入手可能なら、非常に高価な資源が創造されつるということが現在広く認識されている。しかしながら、そのような作業の程度は、過小評価されるべきではない。例えば、ヒトゲノムはほぼ１００．０００の遺伝子（これらのまさに実質的な部分はヒトの脳で発現されうる：Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、第１１巻、第１５７〜１５８頁、１９８８年）を含みうる。ヒト遺伝子のストックの非常に少ないパーセテージのみが現在のところ調べられており、そしてこれは、断片化されかつ、特別の目的に向けた様式で通常行われている。ヒトゲノム配列決定のアプローチの最良の手段に関して、多くの公開された討論がある。Ｂｒｅｎｎｅｒは、ゲノムＤＮＡよりも逆転写されたｍＲＮＡから製造されるｃＤＮＡに研究を集中すべきであると主張している（ＣＴＢＡ　ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＳｙｍｐｏｓｉｕｍ、第１４９巻、第６頁、１９９０年）。殆どの有用なゲノム情報は、ｍＲＮＡに対応するゲノムの部分に存在し、この部分は全体のほんの一部（５％以下）であることが、主たる理由である。更に、ｃＤＮＡを製造する技術もまた公知である。一方、全ての発現されたｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡをほぼ完全に回収すると仮定してさえも、遺伝子の制御及び調節を負う配列を含んでいるいくつかの潜在的に有用な情報がｃＤＮＡアプローチにより失われるであろう。それにも拘わらず、ｃＤＮＡアプローチは、ゲノムＤＮＡ配列決定に依存したアプローチにおける繰り返し配列及び／又は非コーディング配列の分析から生じる固有の非能率な点を少なくともかなり減少できる。最近、新しいｃＤＮＡを同定し、特徴付けするための迅速な方法の結果が報告された（　Ａｄａｍｓ、　Ｍ、　Ｄ、　ら、５ｃｉｅｎｃｅ　。第２５２巻、１９９１年、第１６５１〜１６５６頁）。本質的に、半自動化配列リーダーを用いて、ランダムにつりあげられた多数のｃＤＮＡのそれぞれの一末端より配列の一回読みとり（Ｓｉｎｇｌｅ　ｒｅａｄ）を行う。ｃＤＮＡの核酸配列（又はｃＤＮＡの核酸配列を翻訳することにより製造されるタンパク質配列）を互いに及び公開されたデータベースの公知の配列と比較することにより、ランダムにつったｃＤＮＡのそれぞれが明白に分類されうろことが示された。ｃＤＮＡは、全く新しいか又は既に公知の配列に多かれ少なかれ一致するとして分類されうる。この方法で同定されたｃＤＮＡは、更に特徴づけられ、物理的マツピングを含む多（の標準的な利用において有用であると判った。不運にも、このような方法は、不十分である。任意に与えられたｃＤＮＡの集団のために行われたプロセスが長ければ長いほど、能率は低下し、そして新しいクローンの同定速度は遅（なる。本質的に、既につりあげられたｃＤＮＡの数が増加すればするほど、特定のｃＤＮＡを１回より多くつりあげる確率は増加する。なぜなら、種々のｃＤＮＡが見つかるところの存在量は非常に広範囲であり、かつ該存在量は数オーダーの程度で変化しうるからである。従って、いくつかの配列は非常に希である一方、単一のｃＤＮＡのタイプが特定の組織から製造されたｃＤＮＡの集団の１０％程度を含みうる（Ｌｅｖｉｎ、　Ｂ、　、Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　、第２巻：真核生物の染色体、第２版、第７０８−７１９頁、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ；　Ｔｉ１ｅｙｓ　１９８０年）。任意に与えられた集団中のより稀な種を失うことを避ける必要性は、かなりの問題を与える。混合されたヌクレオチド集団、例えばヒトゲノム配列決定で検定されるべき集団の検定効率を上げるという問題の解決に向けて、多くのアプローチが試みられてきた。従って、もしそれらのｃＤＮＡの配列についての情報があれば、極端に低いレベルで存在するｃＤＮＡを選択的に増幅するために標準ＰＣＲ法が用いられつる。もしそうでなければ、所望のｃ　ＤＮＡに特異的なプライマーを構築することはできず、そして所望のｃＤＮＡを選択的に増幅することはできない。それ故、もし未知の多数の遺伝子を特徴付けすることを望むのなら、標準ＰＣＲ法は不十分である。　他のアプローチとして、ｃＤＮＡの集団のメンバーをより一定の豊富さで製造することが試みられている（いわゆる、標準化法）。第一のアプローチは、ゲノムＤＮＡへのｃＤＮＡのハイブリダイゼーションを含む。飽和の時点では、ゲノム／　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａハイブリッドから回収したｃＤＮＡは、それらをエンコードする遺伝子と同じ存在量で存在している。これは、元のｃＤＮＡライブラリーよりはるかに同質の集団を提供するが、問題を完全には解決していない。非常に稀な配列について飽和を達成するためには、かなりの期間に亘って多量のゲノムＤＮＡにアニーリングされることが要求される大量のｃＤＮＡを用いることが必要である。更に、多重コピーで存在するゲノムＤＮＡの所々の部分と相同性を有するｃＤＮＡが、過度に示されるであろう。第二のアプローチは、それ自身にアニーリングするｃＤＮＡの二次再会合速度論を利用する。長期間のアニーリングの後、−重鎖のままのｃＤＮＡは、はとんど同じ存在量であり、そして標準ＰＣＲによって回収されうる（　Ｐａｔａｎｊａｌｉ、Ｓ、Ｒ，ら、ＰＮＡＳ　ｔｌｓＡ、第８８巻、１９９１年、第１！１４３〜１９４Ｔ頁；　］Ｃｏ、Ｍ、Ｓ、Ｂ９、ＮＡＲ１９、第１８巻、１９９１年、第５７０５〜５７１１頁参照）。しかしながら、これら２つの文献に開示された方法は著しい欠点をもつ。それらは、−重鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡの厳格な物理的分離に完全に依存しており、各反応において多くのマニュアル操作を要求し、そしてハイブリダイゼーション時間を延長することを要求する（Ｐａｔａｎｊｉａｌ　ｉらの方法では、２８８時間にまで及ぶ）。ヌクレオチド集団の“標準化”における更なるアプローチは、係属中の英国特許出願第９１１５４０７．０号（ＭＲＣにより、１９９１年７月１７日に出願された）中に記載されており、そしてそれはＰＣＲプロセスを含み、該ＰＣＲプロセスにおいては、不均−ＤＮＡ集団及び適当なオリゴヌクレオチドプライマーを含む混合物をまず形成し、そしてＤＮＡを変性させるが、慣用のＰＣＲ実験計画を行う前に、その条件を、より普通のＤＮＡ種の変性された鎖は互いにリアニールすることができるが、一方プライマーのＤＮＡ鎖へのアニーリングは起こらないように変えた。この方法により、その後に、より稀な種が、より普通な種に優先して増幅されうる。このＰＣＲ樟準化法は、一般に以下の工程を含む＝（ａ）ＤＮＡが変性されるところのＰＣＲプロセスにおいて用いるのに適した不均−ＤＮＡ集団及びオリゴヌクレオチドプライマーを含む混合物を調製する、（ｂ）条件を、より普通のＤＮＡ種の変性された鎖はリアニールすることができるが、一方プライマーのＤＮＡ鎖へのアニーリングは起こらないように変える、（ｃ）更に混合物の条件を、プライマーがより稀なりＮＡ種を含むリアニールされずに残っている一本鎖ＤＮＡにアニールするように変える、そして（ｄ）工程（ｃ）で製造された混合物中で拡張合成を行う。有利には、方法は上記４つの工程の（り返し利用よりなる。条件は反応混合物の温度の変化によって変えられうると理解される。しかしながら、相補的ＤＮＡ鎖どうしのハイブリダイゼーシヨンに影響するいずれの条件も、要求された結果を達成するように変えられつる。任意の与えられたＤＮＡ種のリアニーリング効率は生成物の濃度及び時間に依存するので、配列が多量になればなるほど与えられた期間中にリアニーリングする程度は大きくなる。いったんＤＮＡ種がある境界濃度に達すると、ブライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）工程前に著しい量が二本鎖の形にアニーリングするので、もはや指数関数的には増幅されない。従って、個々のＤＮＡ種がその境界濃度までその方法により増幅されると、その種の増幅速度は減少し始める。それ故、結局、全てのＤＮＡ種が同じ濃度で存在する。リア二−リング工程の長さは、どの（らい多くのＤＮＡが境界濃度で存在するかを決定する。それ故、リア二−リング工程の期間は、それぞれのＤＮＡ集団に対して経験的に決定されるのが好ましい。ＰＣＲ標準化方法においては、一般に、ＤＮＡプライマーは全ＤＮＡ集団のある試料を選択的にプライム（ｐｒｉｍｅ）するように適合されつる。集団のある試料のみをプライムするプライマーを用いて、その試料のみが増幅されかつ標準化される。これにより、製造されたＤＮＡの全量は減少され、このことはくり返し回数を少なく保つことができるということを意味する。このことは、該方法を複雑なりＮＡ集団例えばｃＤＮＡ集団に適用できるということを保証する。更に、第一のプライマー及び第二のプライマーを用いることができ、該第−のプライマーは全ｃＤＮＡ集団のある試料を選択的にプライムするように適合されており、該第二のプライマーは一般のプライマーである。有利には、一般のプライマーはオリゴｄＴである（オリゴｄＴプライマーはｃ　ＤＮＡの末端においてポリへの尾にアニーリングするので、それぞれのプライムされたｃＤＮＡはその後そっくりそのまま複製される）。本発明は、今、おそらく種々の存在量の核酸配列の混合された又は不均一の集団の個々のメンバーを研究しそして同定、例えば複雑な生物例えばヒトの与えられた原料組織からのｃＤＮＡの殆どを能率的に同定できる新しい方法を提供する。本発明の方法は、特に、集団中のより稀な配列の分類（及び調査）を容易にするのに適合する。更に、核酸配列例えば上記したｃＤＮＡは該方法において製造され、ある意味においては、該方法は、広範囲の他の適用への新しい、便利なそして強力なアプローチのためにそれらを有用にする。従って、本発明は、特徴付けがされていない核酸を配列特異的なサブセットに選別することにより該核酸を分類する方法に関し、該方法は、以下の（ａ）〜（ｃ）を含む；（ａ）場合により、最初に、該特徴付けされていない核酸を試薬、好ましくはエンドヌクレアーゼの作用下に付し、ここで該試薬は該核酸を切断し、より小さい大きさの切断生成物を製造する、（ｂ）特徴付けされていない核酸又は場合によっては（ａ）からの切断生成物のいずかを、アダプター分子の集団と反応させてアダプター化された（すなわち、アダプターがついた）生成物を製造し、ここで該アダプター分子のそれぞれは核酸配列末端認識手段を有し、かつアダプター分子の該集団は、核酸配列の所定のサブセットに連結できる配列末端認識手段を有する一連のこのような分子を包含する、そして（ｃ）選ばれた核酸配列末端認識手段をもつアダプターを含む（ｂ）から得られたアダプター化された生成物のみを選択及び分離する。上記の方法において、アダプター分子は、好ましくは、公知のヌクレオチド組成の一本鎖末端が存在するところのオリゴヌクレオチド（上記方法でいうところの “核酸配列末端認識手段”）を含み、該一本鎖末端はそれぞれ所定の核酸末端配列又は末端ヌクレオチドに相補性を示し、それらと連結されつる。もちろん、アダプター分子の他の形も意図されうる。例えば、好ましくは共有結合的な手段によって、任意の特定のヌクレオチド又は核酸塩基に対して特定の反応を起こしうるアダプターが選ばれうる。従って、望まれるのなら、ある核酸中における稀な塩基例えば５−ヒドロキシメチルシトシン又はチオヌクレオチドの存在を利用できる。本発明の方法の工程（ｂ）から得られるアダプターと核酸の間の連結の性質は、本発明の成功と無関係である。但し、このような連結は、工程（Ｃ）を行なえるように十分に強く、そして更に、連結は核酸配列末端又は末端ヌクレオチドの公知の種類のみに対して公知の意味において特異的でなければならない。本発明の方法は、二本鎖又は−重鎖核酸物質に適用でき、本発明の方法で処理されうる開始の“特徴付けされていない”物質の性質についてはその他の特別な限定はない。好ましくは、本発明の方法の工程（ｂ）は、特徴付けされていない核酸配列又は（ａ）からの切断生成物の両末端が公知の方法でアダプターに結合されつるような、アダプター分子の集団を用いて行われる。本発明のアダプター分子の少なくともいくつかは、固相上にアダプター化された生成物を固定化することにより本発明の工程（ｃ）において物理的分離を可能にするように構築されうる。別の方法として、ＰＣＲプライマーとハイブリダイゼーシタンできる公知の配列を（それらの配列末端認識手段に加えて）含むアダプター分子が用いられつる。このような実施態様においては、アダプター化された生成物の混合物に対してのＰＣＲ技術の適用は、前もって選択された配列を用いて、１以上の前もって決定された配列のサブセットが選択されることを効果的に可能にする。本発明の方法における開始核酸物質が、既に、別々の核酸配列の集団の形でありうると理解される。或いは、たいへん長い連続分子例えば完全な染色体でさえ用いられることができ、そして選別及び分類するための配列の集団を製造するために、本発明の方法の任意的な切断工程、工程（ａ）が行わられうる。もし、任意的な工程（ａ）が行われ、そして切断のために用いられた試薬がエンドヌクレアーゼであれば、これは、基質である特徴付けされていない核酸に依存して、二本鎖物質に対して特異的な酵素でありうるか又は−重鎖生成物上の認識された配列において切断する能力を有する酵素でありうる。一本鎖ＤＮＡを認識し、かつまた二本鎖配列を切断したとき切断された配列オーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を残しく後記を参照）、該オーバーハングは少なくとも部分的に退化されているところの、適した制限エンドヌクレアーゼの具体例は、ＢｓｔＮＩＳＤｄｅＩ、ＨｇａＩＳＨｉｎｆＩ及びＭ　ｎ　ｌ　Ｉを含む。従って、例えば、Ｈｇａ　Ｉは、切断部位から５つの塩基で始まる５塩基オ一バー／％ングを残し、Ｍｎ１Ｉは７塩基を切りとるが、１塩基オーバー／１ングしか残さない。−重鎖切断は、また、本来は一本鎖ＤＮＡを切断できない酵素のために、酵素のための認識部位の配列を含んでいるオリゴヌクレオチドを一本鎖にアニーリングして、両鏡を切断するために酵素にとって十分な長さ及び性質を有する部分的二本鎖を提供することにより達成されることができる。本発明のパイオニア的な方法の能力の一つの観点は、まず第一に、核酸配列を分類及び選別する能率的な技術の適用において試験されるべき物質のおおいな普遍性である。確かに、行われる任意の選別／選択方法の段階の数に応じて（そして、以下の記述は、それによって選択の追加的及び更なる程度が達成されうるところの種々の方法への案内を与える）、アダプター分子を意図し、その際、特異性が、特徴付けされていない核酸配列末端（例えば最後のヌクレオチドに特異的な）への連結のために利用できる１のヌクレオチド塩基によってのみ決定されることは完全に本発明好ましい実施態様の範囲内である。後述するように、種々の段階において選別／選択することによって、高い程度まで選別／選択できるということは、本発明の他の大きな利点である。このような段階の数と選別／選択の程度との間には指数関数的な関係がある。本発明の一つの好ましい観点は、特徴付けされていない核酸を分類する方法であり、該方法は以下の（ａ）〜（ｃ）を含む；（ａ）該特徴付けされていない核酸を試薬、好ましくは離れた位置の切断及び認識部位を有するエンドヌクレアーゼの作用下に付し、ここで該試薬は該核酸を切断して、二本鎖切断生成物を製造し、その個々の鎖は切断された末端においてオーバーラツプして、公知の程度まで延びている一本鎖を与える、（ｂ）　（ａ）からの切断生成物をアダプター分子と連結して、アダプター化された切断生成物を製造し、ここで、該アダプター分子のそれぞれは切断生成物末端認識配列を有し、そしてこのようにして用いるアダプター分子は、切断製造された延びている一本鎖の配列の所定のサブセットに相補的な認識配列を有する一連のアダプター分子を包含する、そして、（ｃ）公知の認識配列のアダプターを有する（ｂ）から得られたそのようなアダプター化された切断生成物のみを選択及び分離する。上記の好ましい本発明の方法は、選択及び選別という一般的な利点とは別に、それは゛マーカー”を（特定のアダプターの形で、後述を参照）任意の配列において前もって決定された部位に位置させることができるので、更に、配列を索引付けする方法であるという非常に重要な利点を提供する。更に、初めて、配列サブセットが製造されることができ、該サブセットにおいては、個々の配列“末端” について少し判るばかりでなく配列の方向性も確定される。一般に、本発明においては、工程（ｂ）において同時にアダプターの集団を用いるのが便利である。もちろん、状況に応じ或いは何らかの理由でそれが好ましければ、全ての可能性のある配列タイプを“アダプター化する”ために要求される全ての可能性のあるアダプター分子のサブセットを用いて、別途の反応を行いうる。本発明においては、“特徴付けされていない核酸”とは、単に、任意の核酸、又は部分的に或いは完全に未知の配列である核酸配列の集団を意味することを意図する。上記のように、特徴付けされていない核酸が二本鎖であるか又は−重鎖のいずれでかあるかということは、本発明の普遍性にとって重要ではない。しかしながら、以下の記述においては、工程（ａ）に従って核酸フラグメントを製造するためにエンドヌクレアーゼとしてＦｏｋｌを用いる本発明の好ましい実施態様のカテゴリーを記述する。もし、このような酵素或いは同様の酵素を用いることが望ましく、かつ分類することが望まれている特徴付けされていない核酸が一本鎖配列物質からなるのなら、このような−重鎖物質は、まず、本技術分野の公知の方法により二本鎖配列に転化されることができる（例えば、Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、　、第７４巻、１９７７年、第５４６３〜５４７６頁、Ｚｏｌｌｅｒ、　Ｍ、　Ｊ、　とＳｍ１ｔｈ、　Ｍ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、第１００巻、１９８３年、第４６８〜５００頁、Ｇｕｂｌｅｒ、　Ｕ、とＨｏｆｆ１ａｎ、　Ｂ、　Ｊ、、Ｇｅｎｅｓ第２５巻、１９８３年、第２６３〜２６９頁を参照）。工程（ａ）から得られる切断生成物の末端における鎖オーバーラツプの程度は、好ましい実施態様においては、もし二本鎖物質で行うならば、たった一つの塩基程度と少なくても良いが、２〜１０塩基が好ましく、４〜６塩基が更に好ましい。（ａ）からの切断生成物の可能な限り多くが（少なくとも５０％、及び理想的には９５％以上）それぞれ末端オーバーラッピングをこのように有しているのが好ましく、そして、従って、好ましいタイプのアダプターによって“アダプター化される”ことができる。工程（８）において用いられるつる好ましい試薬はエンドヌクレアーゼであり、好ましくは、その切断部位が二本鎖基買の２本の鎖に亘って非対称的に配置されており、かつその特異性が切断部位に隣接する塩基の性質によっては影響されないところのクラス■制限エンドヌクレアーゼである。本発明の好ましいオリゴヌクレオチドアダプター分子を用いた場合は、配列特異的な切断のいずれの手段も好ましく用いられうるけれども、最も好ましくは、切断部位は、種々の切断生成物の末端上のフラグメント末端における配列によっては完全には決定されない。配列特異的な化学的切断が報告されている（Ｃｈｕ、Ｂ、Ｃ、Ｆ、とＯｒｇｅｌ、　Ｌ、　Ｅ、、Ｐｒｏｃ。Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　、第９６３〜９６７頁、１９８５年）が、好ましい試薬は、上記したように、タイプ■制限エンドヌクレアーゼのサブセットである。このサブセットは、多重認識配列をもつ酵素、中断されたパリンドロームを認識する酵素及び非パリンドローム配列を認識する酵素を含む。合わせて広範囲の特異性をカバーするこれらのタイプのタイプ■制限エンドヌクレアーゼは、容易に入手でき、そしてそれらの反応において非常に特異的であり効率的である（総論：Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｒ，Ｊ、、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５０、第１８巻、１９９０年、第２３３１〜２３６５頁）。要求されるタイプの酵素のいくつかを、以下の表１に列記する。表　１それらの認識配列の外側で切断する酵素の切断部位を括弧中に示す。例えば、ＧＧＴＣＴＣ（１１５）は、５’　、、、ＧＧＴＣＴＣＮマ　、　、３ｔでの切断を示す。いくつかの酵素によって製造された切断は、プラントであり、一方、他の酵素は、−重鎖延びを有する末端を製造する。好ましい酵素は、後者のカテゴリーのものである。なぜなら、これらは、プラント末端化された末端から一重鎖延びを製造する必要なしに、サブセットに分類するために塩基特異的な連結を用いることを可能とするからである。先に示したように、本発明での使用において好ましいエンドヌクレアーゼはＦｏｋｌである。本発明の方法の重要な特徴は、アダプター分子の使用である。好ましいアダプター分子は一般に、アダプターがそれと反応するよう設計されているところの延びた切断由来配列を反映しているか又はそれに相補的である“オーバーハンギングフラグメント認識配列を有する。また好ましくは、このようなアダプターは５° 　ヒドロキシル基を末端に有するべきである。５゛　リン酸塩基を避けることは、アダプターを巻き込む不適当な連結の危険を除去する。或いは、アダプター化されるべきフラグメントは、それらの５′リン酸塩基が除去されるべきであり、そして互いに連結する能力のあるアダプターは本技術分野の公知の方法により分離されつるように選択されるべきである。アダプター分子は、アダプター配列に付着したときに、特異的配列の選択及び分離（本発明の方法の工程（Ｃ））を可能とする部分をまた含んでいても良い。例えば、アダプターはビオチンを有することができ、それによって、所望のアダプター化された分子を選択及び分離することにおいて、ビオチン／アビジン反応を利用することを可能にする。更に、アダプターは好ましくは、特異的にアダプター化された分子を、コア配列に相補的なプライマーを用いて公知の技術（例えばＰＣＲ）によって増幅できるように、公知の及び選択された配列を含む。本発明のアダプターは、好ましくは切断生成物の末端に結合されうる短い二本鎖オリゴヌクレオチドである。それらは、それらの配列が前もって決定されることができかつ高濃度で容易に製造されうろことができるように、化学的に合成される。それらはまた、その工程の間に容易に精製されつるような様式で化学的に修飾されつる。上記したように、理想的には、いったんフラグメントに結合するとそのフラグメントのアダプター化された末端がもはや更なる連結反応に参加できないように、アダプターの５′末端は非ホスホリル化される。［好ましくは、本発明で用いられる全ての連結反応は、ＤＮＡリガーゼにより触媒される。なぜならこの酵素は、容易に人手できかつ使用が簡単である。］アダプターの切断生成物末端認識配列は、好ましいアダプター分子を構成する最も長いオリゴヌクレオチド鎖の５゛末端上にあり、長さが少なくとも３ヌクレオチドであり、そして５°末端から２ヌクレオチドの一本鎖化された位置において全くランダムな塩基を有するのが好ましい。すると、このことは連結反応の間及びそれに続くプライミング反応の間に選択を行うことを可能にする。その後、選択の最終の程度は、これら２つの段階において達成された選択の程度の生成物の結果であるので、最大の選択は、利用できるアダプター／プライマーによって達成されうる（更なる説明のためには後述を参照）。最も長いオリゴヌクレオチドの５′末端上のアダプター鎖の延びはまた、分離目的のために修飾されたオリゴヌクレオチドの使用を容易にする。好ましくは、短いオリゴヌクレオチドは、その５°末端において修飾される。このことは、用いられるすべての可能性のある一本鎖の延びに対してたった一つの修飾されたオリゴヌクレオチドを要求すること及び連結又はそれに続くブライミング反応を妨げないところの位置で修飾できるという２つの利点を有する。たった一つのタイプのアダプターが連結反応ごとに要求されるが、選ばれた配列のサブセット中のすべての可能性のある反応をカバーするアダプターが存在するのが好ましい。なぜなら、すると、選ばれたサブセット中のフラグメントが互いに連結する機会が最少にされるからである。前もって決定された認識配列を有する選ばれた特異的アダプターは、その−重鎖の延びにおいて他のアダプターと異なるばかりではなく、その配列の残りの部分においても他と異なることがまた好ましい。なぜなら、このことにより、それに続く工程において有用である方向性を導入することが可能であるからである。それ故、このアダプターは、それが結合する切断生成物との分離を容易にするために、修飾されたオリゴヌクレオチドを有するのが好ましい。本発明の方法は、ある方法でアダプターのいくつかを特異的にしそして工程（ｃ）における如く選択及び分離を行うことにより、配列のカテゴリー又はサブセットを製造するために用いられうる。この方法においては、配列のサブセットは選ばれた特異的なアダプターに依存して、例えばそれに続くヌクレオチド配列決定における使用のために供給されうる。このことは、例えば、配列の大きな集団の同定を、このような集団をサブセット（該サブセットのそれぞれは次に試験されつる）に分けるための合理的なアプローチを可能にすることにより容易にする。もちろん、本発明の方法において製造されるサブセットは、元の特徴付けされていない核酸中のすべての配列の公知のフラクション又は特定の部分とみなされうる。任意の特定のサブセットの大きさ及び性質を決定するに際し多（の配慮がなされつる。例えば、サブセットはあまりにも小さすぎるべきではない。何故なら、もし元の核酸がかなり多数の異なった配列を提供すると、サブセットの数の増加はまた、必要なアダプター及びプライマーの数及び核酸を分類するために必要とされる実験の数を増加させるからである。一方、本技術分野の当業者は、サブセットの大きさを、意図された用途において要求される解決の程度を与えるように合わせることが必要である。このことは、一般的なガイダンスというよりはむしろ本技術分野の当業者の選択事項である。好ましくは、サブセットのメンバーは、本発明の方法の後の利用例えば配列決定による同定のためのランダムピッキングにおいて同定を便利にする程度の数のみが平均的に存在する。この文脈においては、一つのサブセット中に１０００メンバー以下が好ましく、より好ましくは５００メンバー以下である。サブセットの大きさに関する更なるポイントは、プローブとして使用するためにサブセットを同時に標識することが要求されうるということである。好ましくは、このような場合、全サブセットの大きさは５００キロベースを超えるべきではない。これは、多くの様式、例えば５００の異なった１キロベースの大きさの配列又は例えば１０００の異なった５００ベースの大きさの配列により提供されうる。やはり、この事項も当業者の選択の一つである。また、アダプターが、本発明の方法において、フラグメントを連結するために設計されそして要求されるということが思い出されるべきである。いくつかの環境においては、このことは例えばアダプターが大きな濃度で存在することにより速度論的に進められつる。このような場合は、サブセットは、フラグメントの濃度又は多様性が、利用可能なフラグメント末端の範囲が所望のアダプター濃度を達成できるようなものであるように選ばれる。本発明は、本明細書中に記載した新しいアダプター分子、及び核酸配列の前もって決定されたグループをアダプター化するために設計されたこのようなアダプターのグループを含む本発明の方法を行うためのキットを含む。いくつかの実施態様においては、本発明のキットは、異なったアダプターの複数のグループを含む。本発明のキットはまた、なかんずく、核酸切断試薬例えばＦｏｋｌ又は上記した他のエンドヌクレアーゼ、及び／又はＰＣＲプライマーを含みつる。本発明の新しい分類方法を、以下に示す図との関係で更に記載する。特定の実施例を含む以下の記述中において理解されるように、多くの個々の特徴が言及され、それらは単にいずれかの特に記載した例を行うよりも本発明の実施例を行うにおいて広範囲で適用可能である。図面の説明図１は、特定のフラグメントを選択するための本発明の方法の背景にある基本的な手順の概要を示したものである。簡潔化のために、実際に用いられうる全てのアダプターは１の切断様式を示す。図３ａは、本発明の方法に従った特異的なアダプターの使用を説明している。　図３ｂは、エンドヌクレアーゼ消化後の特異的にアダプター化された配列の選択を説明している。図４は、本発明で用いられうる一連のアダプター及びプライマーを列記している。そして、図５ａ及び５ｂは、特異的なアダプター化された分子の（増幅目的のための）特異的な前もって決定されたブライミングを示す。図６は、後述する実施例２に記載のように本発明の方法によって分類された試料のアガロースゲル電気泳動により得られたゲルを示す。本発明の方法の概要を図１に示す。核酸又は核酸の集団は、公知の特異性及び切断特性をもつ選択された制限エンドヌクレアーゼによって切断される。好ましい具体例はＬされる一本鎖のオーバーハング又は延びは、２５６の可能性のある４つの塩基配列のいずれか一つであり得るということが判る。しかしながら与えられた切断部位においては、その配列はいつも同じである。図２に示すようにＦｏｋｌはオーバーバングを製造し、そしてまたその切断及び認識本発明の方法の次の段階は、エンドヌクレアーゼの作用の結果得られた核酸配列フラグメントの集団の、アダプターの集団との反応である。簡潔化のために、図１には２つの特異的なアダプターの使用のみを示すが、混合された集団中の配列を分類する、又はこのような配列集団を標準化する目的のために、配列の所定のサブセットに特異的な全ての可能性のあるアダプターが用いられると理解される。この点については、以下において再び言及する。図１に、塩基特異的なアダプターの一つを、固相に結合できるとして示す。この結合は、問題の特異的なアダプターによってアダプター化されているフラグメントの捕獲を可能とする。その後、増幅技術例えばＰＣＲが、塩基特異的なブライミング及びこのようにして単離されたフラグメントの増幅のために用いられうる。アダプター化が行われる場合は、アダプターのオーバーハングの全ての並べかえが存在する、又は元の核酸或いは核酸集団を表わさないハイブリッド分子を生じる可能性があるということが重要である。このようなハイブリッド分子は、特異的にアダプター化されていないフラグメントが、互いに又は特異的な様式でアダプター化されているフラグメントの遊離末端に連結する場合に生じうる。図３ａ及び３ｂにおいて最も明確に示されることができるように、本発明の方法が、エンドヌクレアーゼの作用から得られたフラグメントの選別又は分類を導くのはアダプター化の段階である。明らかに、任意の与えられたアダプターは切断された配列とのみ反応し、そこではオーバーハングはアダプターの認識配列に相補的である。従って、選択の程度は、この点で、アダプターの切断生成物末端認識配列の１以上の塩基を前もって選ぶことにより導かれつる。明らかに、このような特異的なアダプターのみが、オーバーハング又は延びた配列が適当な位置において相補的な塩基を有するところの切断生成物又はフラグメントと連結できる。このことは、特異的アダプターによってアダプター化されうる、エンドヌクレアーゼ活性から得られるフラグメントの割合を限定する。本発明の方法における好結果のアダプター化段階は、切断生成物末端に塩基の任意の組み合わせを製造できる制限エンドヌクレアーゼの使用に依存する。明らかに、もしオーバーハンギング塩基が、切断より得られる全ての生成物又はフラグメントにおいて同じなら、選択は不可能である。図３ｂから最も明確に判ることができるように、もし、非特異的なアダプター及び特異的なアダプターの混合物が用いられ、そして特異的なアダプターが標識されるか又はさもなければ得られた混合物から何らかの方法で分離されることが可能にされるならば、それによって、それぞれの切断部位のオーバーハング又は− 重鎖延び中に１以上の前もって決定された塩基を有するフラグメントの副集団は自動的に選択され、該塩基はアダプターの認識配列中の相補的塩基を選択することにより前もって決定される。図３ｂから判ることができるように、もし特異的なアダプターがビオチニル化されていれば、ビオチン残基を有するアダプター化された分子はストレプトアビジンをコートした磁気ビーズに結合され、洗浄されそして分離されることができる。もちろん、本技術分野において公知の他の分離系及び標識系を用いることもでき、そしてこのことは本明細書を読んだ当業者の選択事項である（　Ｕｈｌｅｎ、　Ｍ、、Ｎａｔｕｒｅ、第３４０巻、１９８９年、第７３３〜７４４頁）。図３ｂに示された技術は特異的なアダプターのたった一つのカテゴリーのみを示しており、該特異的なアダプターは、アダプターが結合するフラグメントのみを単離するための本技術分野で理解された方法においてビオチン／ストレプトアビジンを用いているけれども、多くの特異的なアダプターを同時に用いることができ、但しこのような特異的アダプター（及びアダプター化が行われた場合にそれらに結合する分子）をお互いから分離することができること、と理解される。本発明の好ましい方法の次の段階においては、所望により、特異的にアダプター化されたフラグメントを分離した後に、更なる程度の選択が、特異的にアダプター化された核酸フラグメントのサブセットの中の選ばれたサブセットのみをコピーし又は増幅することにより達成されうる。もちろん、もし選択されたプライマーのみを使用するＰＣＲタイプの方法を用いれば、最初の物理的分離は必ずしも必要でない。とにかく、この更なる選択は、特異的なアダプターのコア部分の前もって決定された配列に依存している。従って、特異的なアダプター化された分子の特定のセットが、例えばビオチン／ストレプトアビジン系を用いて固相に結合されることによりいったん単離されれば、このようにして固定化された核酸フラグメントは、固定化の部位から遠く離れたアダプターの末端にある固定化された核酸フラグメントに結合されているアダプターのコア配列に相補的でかつ特異的なプライマーを用いてコピー／増幅されうる。このようなプライマーは好ましくは、１以上の特定の過剰の（エキストラの）塩基により、アダプター化されたフラグメント中へ延びている。更なる選択におけるこの技術の成果として、その非結合末端に適当なアダプターを有するアダプター化されたフラグメントのみ、好ましくはプライマー上の選ばれた過剰の塩基に相補的な配列を有するフラグメントのみがコピーされつる。この更なる選択技術においては、間違ってアニールされたプライマーからは新しい鎖を殆ど合成しないばかりか間違ってアニールされた塩基を除きもしないポリメラーゼを用いることが特に好ましい。適した酵素は、ＡＭＶリバーストランスクリブターゼ（にａｃｉａｎ、Ｄ、Ｌ、　、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＩＪｒｏｌ、、第６巻、１９７７年、第１４３頁）、Ｍ−ＭＬｖリバーストランスクリプターゼ（Ｒｏｔｈ、　Ｍ、　Ｊ、ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、、第２５０巻、１９８５年、第９３２６〜９３３５頁）　、ＤＮＡポリメラーゼ１クレノウ（エキソヌクレアーゼを含まず）　（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ、Ｖ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、第７４巻、１９８８年、第５４６３〜５４６７頁）、遺伝子的に設計されたＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（５ｅｑｕｅｎａｓｅ　（商標）　、Ｔａｂｏｒ、Ｓ、とＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｃ，Ｃ，、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、第２６４巻、１９８９年、第６４４７〜６４５８頁、米国特許第４７９５６９９号明細書）及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｌａｗｙｅｒ、　Ｆ、ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、第２６４巻、１９８９年、第６４２７〜６４３７頁）を含む。好ましくは、更なる選択は、得られた新しく合成された分子のサブセットを選択することによって達成されつる。これを行うために、上記の如く塩基特異的なプライミングが行なわれうる。但し、問題となるプライマーのためのテンプレートはフラグメントの固定化部から遠（離れたところのアダプターではなく、むしろ固体支持体に最初に結合されたアダプターのコア部分の配列である。本発明の基本方法の工程（ｃ）に続く選択の最初の段階においてコピーにより得られる分子は一本鎖であると理解される。選択の更なる段階は、選択されたフラグメントを二本鎖に変え、そしてこのようなフラグメントは、標準的な技術（例えば、“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ″、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ、、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ。Ｅ、　Ｆ、及びＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、　、Ｃ３ｌＩ　Ｐｒｅｓｓｓ　１９８９年）によりクローン化されつる。従って、本発明の方法は　分子を分類するためばかりでなく、一連の段階において選択する（それ故、任意の特定のフラグメントの利用可能な量を°濃厚化する ”）ために用いられうる。濃厚化の最終の程度は、アダプター化段僧及びプライミング段階における、詳細に前もって決定された塩基の数に依存する。例として、もしプライミングを２回繰り返し、そしてもし一つの塩基に特異的な特異的アダプターを用い、かつ第一のプライマーが一つの塩基に特異的であり、第二のプライマーが２つの塩基に特異的である場合は、選択から得られる濃厚化のレベルは、１２８倍である。このことは、ただ一点のみでの選択を与える前もって決定された又は前もって選ばれた塩基のそれぞれは４っの可能性のうちの一つである（並びかえの全数は２５６となる）が、各７ラグメントがアダプター化されることができる末端を２つ有すると、濃厚化の程度は半分になるという事実で説明される。種々の組み合わせを用いて同程度の濃厚化が達成されつるということが当業者によって理解される。例えば、プライミングを２回繰り返すと再び仮定すると、２つの塩基に特異的であるアダプターは、１２８倍の濃厚化を達成するためにはただ一つの塩基に対してそれぞれ特異的なプライマーを要求するのみである。濃厚化の特定の程度を決定する又は計画する場合は、前もって決定された塩基は異なるべきであるということが重要であるばかりでなく、選択のために用いられる塩基の並びかえは、可能な限りの多くの様式で分布される、つまり“拡げられる”ことが有利である。何故なら、このことは要求されるプライマー及びアダプターの数を最少化するからである。例えば、所望の配列のそれぞれを１２８倍濃厚化する２５６の配列サブセットのパネルは、全部で２５６の塩基特異的なアダプターを用いることができ、アダプターそれぞれは、その“オーバーハング１中の可能性のある４つの塩基の一つに特異的である。しかしながら、例えば、２つの塩基のそれぞれに特異的である１６のアダプターを、アダプターの一つの３゛末端においてたった一つの塩基に特異的な４つのプライマー及び他のアダプターの３゛末端においてたった一つの塩基に特異的な更に４つのプライマーとともに用いるのが好ましい。この場合は、全部でたった２４のアダプター及びプライマーしか要求せず、要求されるこれらの試薬の量で見ると１／１０未満となる。目的の核酸配列の任意の集団の個々のメンバーが短ければ短いほど、任意に選択されたエンドヌクレアーゼの作用により一回のみ切断される核酸のパーセンテージは大きくなると理解される。もしある集団中の個々の核酸配列の殆どが２回（或いはそれ以上）切断されないならば、上記した考えに従って、それらは完全な範囲の選択／濃厚化を受けることはない。（１回の切断のみの結果として）両末端で自分自身をアダプター化しないフラグメントの、切断集団中での存在を、本発明を図式的に図３ｂに示す。この問題は、所望により、２以上の異なった制限エンドヌクレアーゼを、別々に又は−緒に用いることにより検討されうる。更に、本発明の方法は、（もし判れば）認識部位及び切断部位の間の間隔が、選ばれた集団中の核酸配列の大きさと関係する都合の良い距離である場合に、酵素の選択により°調節できる２ものである。核酸配列のサブセットが本発明の方法を用いていったん製造されれば、それらは種々の方法に用いられうる。標識された配列サブセットはプローブとして用いられることができ、そしてサブセットのライブラリーはクローニング技術によって製造されつる。更に、配列のサブセットは、標準法（例えば、”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”　、Ｍａｎｉａｔｉｓら、前掲、を参照）を用いて固定化した後に精査されうる。本発明の方法は、制限フラグメントのサブセットを製造するために、適した原料物質に適用されることができ、そして、配列決定のためにクローンがサブセットからランダムにつり上げられ、順次サブセットを試験する。いずれかの特定のサブセットが、新しいクローンの見掛は上の原料として“使い尽くされた状態”になると（又は、更に正確には、新しい配列の回収速度が落ちると）、新鮮なサブセットが試験されうる。ポアソン分布が、メンバーが同じ割合で存在するところのサブセットからクローンがランダムにつり上げられる頻度を表すのに用いられつる。もちろん、このような分布は、メンバーが等量で存在しない場合には歪み、該歪みは、量の実際の相違に依存する。観察された分布は、サブセットの新しいメンバーをランダムにつり上げる確率を算出するために用いられることができ、そしてこの情報は、新しいメンバーをつり上げる目的においであるセットを存続させるか否かの決定に用いられ得る。もし、その意図が、与えられたサブセットの更に多（のメンバーの同定であるならば、このことは、まだつり上げられておらずかつ新しい配列を含んでいるクローンを同定するために、既につり上げられたクローンのプールを用いて調製されたプローブを用いてもっと効率よく達成されつる。この方法により精査されるべきサブセットライブラリーの大きさが小さいので、この技術は、元の開始の核酸を先金に表すライブラリーを精査することに比べ特に便利である。上記したＰＣＲ標準化技術は、開始の核酸集団又はライブラリーによりは、本発明の方法により製造されたサブセットに適用することができ、従って、個々のサブセット中の核酸配列の均衡をより稀な配列にとって好ましくシフトさせる。組織原料からのｃＤＮＡの探査においては、それらの末端でない点からこのようなｃ　ＤＮＡを配列決定できることが有効である。この方法では、偏りが、潜在的により興味のあるコーディング領域にとって好ましく導入されつる。本発明の方法は、このような偏りを導入するのに有利である。　゛しかしながら、基本的には、本発明の利点は、配列の索引付け、そしてその結果としての新しい配列の構造の理解及びマツピングのための大きな利点、及び全組織或いは全生体からさえから調製されたｍＲＮＡからｃＤＮＡを系統的につり上げられることができ、その際、得られうる種々の配列の“収率”は増加することを含む。この後者の点は、本発明を以下の実施例により更に記述及び説明する。実施例１この実施例で用いた全てのオリゴヌクレオチドは、トリチル基を付け、ＡＢＩ社製の３８０Ｂ　Ｄ　Ｎ　Ａ　シンセサイザーを用いて、製品指示書に従って合成した。精製は、逆相ＨＰＬＣにより行った（例えば、Ｂｅａｋｅｒ、　Ｃ，Ｒ，ら、Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、第３２６巻、第２９３〜２９９頁、１９８５年参照）。ヒト脳及び副腎組織は、１２〜１５週月経齢の胎児の混合物より得、次いで液体窒素中で素早く凍結し、ビジヨー（ｂｉｊｏｕ　）ボトル中で一８０℃のフリーザー中にて保存した。２つのタイプの組織を、別々に、フリーザーから直接用いてｃＤＮＡを調製し、サブセットへの選別のためそれから制限フラグメントを製造した。別々の組織のそれぞれ１ｇを、Ｌｌｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ　Ｔ２５　Ｄｉｓｐｅｒｓｅｒ　Ｊａｎｋｅ　ａｎｄ　ｌ：ｕｎｋｅｌ、　Ｉｌ：Ａ−Ｌａｂｏｒｔａｃｈｎｉｋ社製を用いて、氷上にて、４Ｍのグアニジニウムイソチオシアネートの存在下で、ホモジナイズし、マクロ分子を可溶化した。それぞれのホモジネートから、ＲＮＡを、遠心により単離し、それをセシウムトリフロロ酢酸を通して沈降させた。これは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｗｉｔを用いて、製品指示書に従って行った。但し、遠心は３６時間行い、そして、得られたＲＮＡは、最終的には、２回のエタノール沈殿（それぞれの沈殿後に７０％エタノール洗浄を続けて行った）を行うことにより脱塩及び濃縮された。それぞれの場合において、ポリＡ　（ｍＲＮＡ）を、オリゴｄＴをコートした磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ　）にそれ結合させることにより、２００〜４００μｇの全ＲＮＡより単離した。結合していない物質を含む溶液をビーズより除き、そしてビーズを洗浄し、次いですぐに使用のためにｍＲＮＡを溶出した。ｍＲＮＡの単離は、製品指示書に従って行った。ビーズからのＲＮＡの収率は、全ＲＮＡの１〜３％であった。溶出したＲＮＡの２〜４μｇをｃＤＮＡの合成のために用いた。ｃ　ＤＮＡ合或は、Ｇｕｂｌｅｒ、　［１とＩｉｏｆｆｍａｎ、Ｂ、Ｊ、　、Ｇｅｎｅ１第２５巻、第２６３頁、１９８３年の方法に従い、ＰｈａｒｍａｃｉａＫｉｔ用いて製品指示書に従い行った。オリゴｄＴを鎖ＣＤＮＡの初めの合成反応をプライムするために用いた。ＣＤＮＡを、フェノール／クロロホルムで２回抽出することにより精製し、次いで、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　３４００５ｐｕｎカラムを用い、製品指示書に従ってそれにｃＤＮＡ反応混合物を通すことにより約３００塩基未満の核酸を含む低分子量溶質を除いた。カラムのための操作緩衝液は、１ｈＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　、　１ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　５０ｍＭ　ＮａＣ１を含みｐＨ７，５であった。カラムの溶出液を１０ｏ＋Ｍ　Ｍｇ２＋に調節し、次いで精製されたｃＤＮＡに、１０μｇたり１単位のエンドヌクレアーゼＦｏｋｒを３７℃で１時間作用させて、特定部位を切断して、アダプターを受けることができるようにした。２回の連続したフェノール／クロロホルム抽出を行い、それに続き、上記のようにしてそれを３４００５ｐｕｎカラムに通すことによりｃ　ＤＮＡフラグメントを精製した。用いたアダプターは、オリゴヌクレオチド５’ＮＮＮＮＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＣＧＡＣＡＧＡＣＡとソノ相補鎖である５’　ＴＧＴＣＴＧＴＣＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＧＡ、及び５°ＡＡＮ４Ｎ４ＴＣＴＣＧＧＡＣＡＧＴＧＣＴＣＣＧＡＧＡＡＣ或いは５°ＴＴアダプターの混合物の２００ｐｍｏｌを、ＭｇＣｌ２を１０鳳蓋、ＡＴＰを１ｈＭ及びＴ４ＤＮＡリガーゼを０．０２５単位／μｇ加えられた溶出緩衝液中で一緒に装置することにより、溶出した物質の２５％に加えられた。オリゴヌクレオチド５゛ビオチニル化ＧＴＴＣＴＣＧＧＡＧＣＡＣＴＧＴＣＣＧＡＧＡ、及びそれと−緒に用いられたそれと相補性であるオリゴヌクレオチドのどちらか一方は、それぞれ、全アダプターのモル比率の１７３２を含んでいた。最終反応容量は９０μｌであり、それを６５℃で３分間加熱し、次いで、室温にまで冷却しりガーゼを添加した。連結は、１２℃で１６時間行った。２回の連続したフェノール／クロロホルム抽出を、リガーゼを除くために行った。最終の水性相を上記のようにして５４００５ｐｕｎカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）に通した、但し、カラムは１０ｍＭ　ＴｒｉｓＳｐＨ８，３／　５０ｍＭ　ＮａＣ１で用いた。カラム溶出液を、２００μの最終容量にて、２５ｍ１ｌ　Ｍｇ２”、０゜５ｍＭ　ｄＮＴＰｓに調節した。混合液を、サーモサイクラ−（Ｔｅｃｈｎｅ　ＭＷ２）中に置き、７８℃で５分間加熱した。この時点で、１０単位のクローン化されたＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ、　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｋｍｅｒ）を添加した。引き続き、アダプターの連結されていない鎖に充填するために、７２℃で１０分間温装した。２回目の装置の後、製品指示書に従って調製した２００μｍのストレプトアビジンをコートした磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ　）を加えて、５°ＧＴＴＣＴＣＧＧＡＧＣＡＣＴＧＴＣＣＧＡＧＡビオチニル化アダプターに相補性であるオリゴヌクレオチドのそれに連結されたｃＤＮＡを結合した。ビーズの結合は、１０分ごとに混合しながら２８℃で３０分間処理することにより行われた。ビオチニル化されていないｃＤＮＡは、４００μｌの、２ＭＮａＣ＋にて２回、新鮮０．１５ｍＭ　Ｎａ０Ｂにて４回、それぞれ２８℃で５分間にて、水で２回、そして最後に２０ｍ１ｌ　Ｔｒｉｓ　ｐＢ　８゜３．５０ｍＭ　ＮａＣ１及び２５μｌＭＭｇ２＋を含む緩衝液で、ビーズから洗浄された。次いで、ビーズを、更に０．５ｍＭ　ｄＮＴＰｓを含む最終緩衝液の２４０μに懸濁して、６０μ ｌの４つに分割した。６０μｌの分割物の４つ（それぞれの組織から２つ）を、固定化されたアダプター化フラグメントのサブセットをプライムしかつコピーするために更に特異的に処理した。プライマー５°ＣＴＧＴＣＴＧＴＣＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＧＡＡの２１）＋１０１を２つの分割物（それぞれの組織から一つ）のそれぞれに加えた。プライマー５’　ＣＴＧＴＣＴＧＴＣＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧの２　ｐ＋Ｉｏｌを他の２つの分割物のそれぞれに加えた。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの２゜５単位を各反応に加え、そして、９５℃で３０秒間の変性、６３℃で２分間のアニーリング及び７２℃で３分間の重合を交互に１６サイクル行い、溶液中に選択された一本鎖を蓄積させた。ＤＮＡ合成反応を完成したときに、更に３０μｌの再懸濁されたビーズをそれぞれの反応に加えて、ビオチニル化フラグメントを除去した。反応を、１０分ごとに混合しながら、２８℃で３０分間温装して、ビオチニル化した鎖が確実にビーズに結合されるようにした。次いで、新たに合成された鎖を含む各水性相を取り出し、酵素を除くためにフェノール／クロロホルムで２回抽出し、その後、上記のようにして、１０１Ｍ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，３／　５０μｌＭ　ＮａＣｌで平衡化された３４００５ｐｕｎカラムを過て更に精製した。選択されたフラグメントのサブセットのＰＣＲ増幅の繰り返しは、それぞれの場合において、プライマー５°ＧＴＴＣＴＣＧＧＡＧＣＡＣＴＧＴＣＣＧＡＧＡＧ又は５’　ＧＴＴＣＴＣＧＧＡＧＣＡＣＴＧＴＣＣＧＡＧＡＣの−っと共に元のプライマーを用いて行った。これは同時にフラグメントを二本鎖化し、利用できる物質の量を増加した。各プライマーペアは異なって挙動すると予想されるので、何回の増幅サイクルがこの段階で要求されるかは不明であった。それ故、標準アガロースゲル電気泳動を用いて所与のサイクル回数後に反応生成物を試験することにより、経験的に適した数を直接に決定することが必要であった。いくつかの場合においては、非特異的な生成物の蓄積を避けるために、両プライマーがそれぞれ２　ｐｍｏｌで存在する状態で増幅の最初の５サイクルを行うことが必要であった。全ての反応は、上記のカラム溶出液の８μｌ又は１２．５％を用いて行ったが、そのどちらかはより大きいが１２μｌは超えない。反応条件を、４０μｌの最終容量にて、２０＠Ｍ　Ｔｒｉｓ２＋ｐＨ８，３，５０ｍＭ　ＮａＣｌ　、　２５ａＭ　Ｍｇ　、　０．５ｍＭ　ｄＮＴＰｓ及び２．５単位のＴ　ａ　ｑ　ＤＮＡポリメラーゼに調節した。各プライマーの２ｐＩＩｏｌで最初の増幅を行ったときとは別に、各プライマーの２０ｐｍｏｌを用いた。増幅のサイクルは、９５℃で３０秒間、６５℃で１分間及び７２℃で３分間にて行った。クローニングの目的のため、選択されたｃＤＮＡを、反応をモニターしなかったことを除いては直前に記したようにして増幅した。そのかわり、全ての観察できる生成物を生じさせるために前もって示されたサイクルの数に加えて他の４サイクルを行った。更に、余分の７２℃で１０分間の装置を、最後のサイクルの後に行った。次いで、反応生成物を方向性クローニングのために調製した。水を加えて、最終反応容量を６０μｌに調節した。酵素を、２回の連続したフェノール／クロロホルム抽出により除いた。最終水性混合物を、上記のようにして８４００カラムに通した、但し、カラムは１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ　ｐＨ７，５，５０ｍＭ　ＮａＣ１で平衡化されていた。方向性クローニングのためには、選択されたｃＤＮＡ各末端に、Ａｓ１ａｎｄｉｓ、　Ｃ，とｄｅ　Ｊｏｎｇ、Ｐ、Ｊ、（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、第１８巻、第６１５６頁、１９９０年）の方法の改良にてアダプターにより導入された種々の公知の配列が用いられた。種々の付着末端は、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性を用いて各末端上で製造されて、それぞれの場合において３′末端から最初のＴまでが切除された。カラム溶出液の７５μｍ又は７５％（最小の方）に、９．５μｍの１００ｍＭ　ＴｒｉｓＢＣＩ　ｐＨ７，４，１００ｉＭ　ＭｇＣｌ２及び９．５μｌの０．５　ｍＭ　ｄＴＴＰを加えた。１６単位の７４ＤＮＡポリメラーゼを加えて、反応を水浴中にて３７℃で３０分間温装した。酵素を、２回連続的にフェノール／クロロホルム抽出するこ、とにより除いた。最終水性相の塩を、上記のようにして、１０　ｍＭ　ＴｒｉｓＢＣｌ　ｐＨ７，４，１ｎＭ　ＥＤＴＡで平衡化された８３００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）に通すことにより調節した。Ｅ、ｃｏｌｉプラスミドクローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｉｓ＋　（Ａｌｔｉｎｇ−１１ｅｅｓｅ、　１１．Ａ、と５ｈｏｒｔ　Ｊ、Ｍ、、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、第１７巻、第９４９４頁）を、削除されたｃＤＮＡを受け取るために、ＢａｍＨＩ及びＨ４ｎｄＩ［部位において制限切断することにより調製し、次いで、オリゴヌクレオチド５°ＡＧＣＴＣＧＧＣＴＣＧＡＧＴＣＴＧとその部分的に相補的なオリゴヌクレオチド５’　ＧＣＧＡＣＡＧＡＣＡＧＣＡＧＡＣＴＣＧＡＧＣＣＧ、及びオリゴヌクレオチド５’　ＧＡＴＣＣＧＧＣＴＣＧＡＧＴとその部分的に相補的なオリゴヌクレオチド５°ＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＴＣＧＡＧＣＣＧによって製造された特異的アダプターを用いて、得られた付着末端をアダプター化した。ベクターの調製及びアダプター化は、標準法に従って行った。ｃＤＮＡの挿入は、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄｍ制限部位の間に行った。組み換えベクターを、宿主ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ　（Ｂｕｌ　１ｏｃｋ、　Ｉｌ、　０．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　、第５巻、第３７６〜３７８頁、１９８７年）中に、Ｂａｎｎａｈａｎ、Ｄ、Ｊ、（ＭｏＬ、　Ｂｉｏｌ、　、第１６６巻、第５７７〜５８０頁、１９８３年）　の方法により形質転換した。連結及び転換の適当な標準対照もまた含む。形質転換後の手順は、”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ″１第２版（Ｓｉａｂｒｏｏｋ　Ｊ、、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、、とＭａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、　Ｃ３ＨＰｒｅｓｓ、　１９８９年）に記載されている。５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１０μｇ／Ｉｌｌのテトラサイクリンを含むＸ　−ｇａｌ／　ＩＰＴＧＬ−アガープレート上に塗布することによりコロニーを製造した。きれいなコロニーをつり上げ、それぞれを１００μｍのし一栄養培地及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むマクロタイタープレートの別々のウェル中に入れた。３７℃で１６時間生育させた。１００μ】の５０％又は３０％グリセロールをプレートに加えて、ブ、レートをそれぞれ−２０又は−８０℃に保管した。保管されたそれらに対応するバクテリアをジデオキシ法による配列決定（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、　Ｍｉｌｋｌｅｎ、　Ｓ、とＣｏｕｌｓｏｎ、＾、Ｒ９、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、第７４巻、第５４６３〜５４６７頁、１９７７年）のためのテンプレートの調製のために用いた。この目的のための、バクテリアを、これらが液体培養で生育されのと同時に調製された５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むし一アガープレート上で生育させるか、又は塗布後に保管から出した。或いは、保存物より新鮮な液体培養物に接種した。全ての場合において、ｃＤＮＡ挿入物は、ＰＣＨにより配列決定のため増幅された（　５ａｉｋｉ、　Ｒ，Ｉｌｌ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　。第２３９巻、第４８７〜４９１　頁、１９８８年）。ＰＣＲは、楊枝により反応物に直接加えられたバクテリアを用いて行うか、又は液体培養物中のバクテリアから或いはプレートから調整法（Ｈｏｌｍｅｓ、　Ｄ、　Ｓ、とＱｕｉｇｌｅｙ、　Ｍ、、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、第１１４巻、第１９３頁、１９８１年）によって単離されたプラスミドの１１５０を用いて行った。ＰＣＲプライマーである５°ビオチニル化Ｇ丁ＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ及び５’　ＣＧＡＧＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＴＣＧのそれぞれの２０ｐｍｏｌを、２．５２＋ｍＭ　Ｍｇ　、　５０　ｍＭ　ＫＣｌ、　Ｔｒｉｓ−ＢＣＩ　ｐＨ８，３及び０．２５単位のＡｍｐｌｉｔａｑ　（Ｃｅｔｕｓ　）を含む４（ｌｕｌの反応物中で用いた。反応は、９５℃で１分間行い、引き続き９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間及び７２℃で４０秒間にて３５サイクル行った。そのサイクルの後、最終の温室を７２℃で５分間行った。ＰＣＨの後、標準アガロースゲル電気泳動を用いて、どの反応が成功したかを決定した。次いで、−重鎖配列決定のために、成功した反応のビオチニル化鎖をストレプトアビジンをコートしたビーズ（Ｄｙｎａｌ　）に結合することにより、それらを回収し、次いで洗浄をした。全ての操作は製品指示書に従った。但し、洗浄工程は、マニュアルで行うか又は側腕ローダ−（Ｂｅｃｋｍａｎ）に接続されたバイオメック（Ｂｉｏｍｅｋ）ロボットワークスティジョンを用いて９６ウエルマイクロタイタープレート中で自動的に行った。ジデオキシ鎖停止配列決定反応を、テンプレートとして固定化された、ビオチニル化鎖、及びプライマーとして２ｐｔｉｏ　１のオリゴヌクレオチド５’　ＣＧＡＧＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＴＣＧを用いて行った。反応は、蛍光標識されたターミネータ−（ＤｕＰｏｎｔ）又はフルオレセイン標識されたプライマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、製品指示書に従っ行った。反応物を、自動化ＤＮＡシークエンサーを用いて分析した。”Ｄｕ　Ｐｏｎｔ″反応のためにＧｅｎｅｓｉｓ２０００を用い、”Ｐｈａｒｍａｃｉａ　”反応のためにＡ、Ｌ、Ｆを用いた。ＧｅｎｅｓｉＳ２０００の読みとりについて、製品Ｂａ５ｅ　Ｃａ１ｌｅｒソフトウエアを用いて塩基が割り当てられた。次いで、呼び出された塩基のファイルを、塩基の呼び出しのために用いたアップル　マツキントラシュ　コンピューターからサン　ネットワークに移した。Ａ、Ｌ、Ｆ、の読みとりからの生データは、直接サンネットワークに移され、そこでは、塩基は公知の“トレース　エディター　ソフトウェア″　（ＴＥＤ　）を用いて呼び出された。両方の場合において、呼び出された塩基のファイルを５ｙｂａｓｅ　（商標）データベースに入れた。データ入力は、自動的にベクター及びアダプター或いはリンカ−配列の除去を伴うが、曖昧な塩基は編集されない。指名していない塩基を除いた後、ファイルは自動的にｃＤＮＡデータベース及び公開されている入手可能のデータベース、ＧＥＮＢＡＮＫ及び５ＴＩＳＳＰＲＯＴの最新版の他の配列と比較された。検索は、“基本部分整列検索ツール（ｂａｓｉｃ　１ｏｃａｌ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　５ｅａｒｃｈ　ｔｏｏｌ　）　（ＢＬＡＳＴ　）（ｌ［ａｒｌｉｎ、Ｓ、と＾Ｉｔｓｃｈｕｌ、Ｓ、Ｆ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、第８７巻、第２２６４〜２２６８頁、１９９０年）を用いて行った。種々のｃＤＮＡフラグメントがそれぞれの中に存在するので、種々のサブセットの増幅生成物は量的に異なって出現すると予想された。このことは、アガロースゲル電気泳動により確認された。更に、増幅生成物は用いられたｃＤＮＡに依存した。増幅生成物の平均の大きさは増幅で減少したので、増幅生成物は人工物ではなさそうである。用いた５ｐｕｎカラムは、３００塩基対未満の物質に対して選択した。それ故、この物質は少量で存在していると予想され、そしてそれ故、平均の大きさの減少を説明する増幅と共に出現する最後のものであると予期された。最も通常の増幅の人工物は、その平均的な大きさが増幅で増加するマルチマーであり、これは観察されなかった。ランダムにつり上げた３５の配列は、選択された塩基からの正確な距離におけるＦｏｋ１部位の存在について得点をつけられた。１０　（２８，５％）は、曖昧な塩基なのでデータを与えられない。１５（残りのうちの６０％）はこのような部位を有さず、一方、１０（残りのうちの４０％）は予想されたＦｏｋＩ部位を有していた。これは全く予想される通りである。なぜなら、Ｆｏｋｌは、切断に対して内部的である（この場合はそれは選択されたフラグメント中に現れる）ことができるか、または外部的である（この場合はそれは選択されたフラグメントから除かれる）こともできるからである。完全にランダムな核酸配列分布を想定すると、すべての可能性の等しい蓋然性がある。異るクローン中の同じフラグメントの異る単離物が観察された場合に、これらは、用いたアダプター及びベクターとの関係で同じ意味を有するということが常に見い出された。このことは、ランダムな分類によっては殆どあり得ないであろうし、本発明の方法の結果としてありうるのみであろう。観察された配列が、既に公知の配列に対応すると判った場合は、選択されたＦｏｋＩフラグメントは、選択のために用いた塩基に考慮して予想されたもの、例えば、ヒトアミロイドＡ４ｍＲＮＡのｍ　ＲＮ　Ａに対応するＤＮＡの塩基の２６４２と３０３９の間のＦｏｋ　Ｉフラグメントであることが見いだされた。実施例２核酸のサブセットは実施例１と同様にしてｃＤＮＡから調製した。ｃＤＮＡは、既に実施例１に記載した胎児副腎及び胎児脳のｃＤＮＡに加え、実施例１の記載と同様にして胎児肝臓から調製した。肝臓のサブセットのための制限消化、アダプター化及びブライミングは、実施例１の記載と同様にして行った。特に、フラグメントの特定のサブセットへの連結のために用いたアダプターは、５’　ＴＴＮＮＴＣＴＣＧＧＡＣＡＧＴＧＣＴＣＣＧＡＧＡＡＣテあり、そして特異的にアダプター化されたサブセットのＰＣＲの間に特定のサブセットのブライミングのために用いたプライマーは、５°ＣＴＧＴＣＴＧＴＣＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＧＡＣ（要求されたサブセットに対して特異的に連結しないアダプターのため）と５゜ＧＴＴＣＴＣＧＧＡＧＣＡＣＴＧＴＣＣＧＡＧＡＣ（フラグメントのサブセットを特異的に選択するために用いられたアダプターのため）であった。対照として、サブセットをｃＤＮＡを追加しないで同じようにして調製した。２０μｍの試料を、サブセットを製造する最終ＰＣＲ反応の後に取り出して、アガロースゲル電気泳動による分析に付し、そして核酸は臭化エチジウムにより検出した。結果を、表６に示す。図６中、レーンの意味は以下の通りである：レーン１：マーカーレーン２：６と同様、但しｃＤＮＡの、添加なしレーン３ニアと同様、但しｃＤＮＡの添加なしレーン４：８と同様、但しｃＤＮＡの添加なしレーン５：大きさのマーカー：最も上から最も下までの、見えるバンドはそれぞれ、２１７６、１？６６、１２３０．１０３３．６５３．５１７゜４５３、３９４．２９８．２３４塩基対であるレーン６：胎児脳のｃＤＮＡサブセット、１１に特異的なアダプター、ｇに特異的な特異的アダプターブライマー、Ｃに特異的な非特異的アダプターブライマーレーン７：胎児副腎のｃＤＮＡサブセット、ａａに特異的なアダプター、ｇに特異的な特異的アダプターブライマー、ｇに特異的な非特異的アダプタープライマーレーン８：胎児肝臓のｃＤＮＡサブセット、１１に特異的なアダプター、ｇに特異的な特異的アダプターブライマー、ｇに対する非特異的アダプタープライマー図６のレーン２〜４及び６〜８より、もしｃＤＮＡが加えられなければ増幅が観察されないことがわかり、このことは、例えばプライマーの二量体化によるデノボ増幅は問題でないことを示している。更に、他の生成物に加えて、強い特定のバンドが胎児肝臓試料で観察され、そして異なった強い特定のバンドが胎児副腎試料で観察された。いくつかのより弱いバンドが胎児脳試料で観察された。このことは、選別方法の特異性を検定する機会を提供する。用いられていない物質を、実施例１と同様にしてクローン化し、次いで、個々のクローンを実施例１と同様にして配列した。サブセットのそれぞれからの配列ファイルを、データベースから別々にコピーした。次いで、所与のサブセットからの配列を、１ｃａａｓｓ　［ソフトウェア１ｃａｔｏｏｌｓ　（Ｐａｒｓｏｎｓ、　Ｊ、ら、ＣＡＢＩＯ３，第４巻、第３６７〜２７１１９８８年）からの包括的類似性比較アルゴリズム（ｇｌｏｂａｌ　５１ｍ１ｌａｒｉｔｙ　ｃ。１ｐａｒｉｓｏｎ　ａｌｉｇｏｒｉｔｂ＋＋＋　）　］を用いて、互に比較した。このことは、どのくらいの頻度で、分類したｃ　ＤＮＡから同じ制限フラグメントが観察されるかを決定する。ＢＬＡＳＴサーチと比較することにより、著しいクローニングの偏りはないと仮定して、肝臓サブセットの２１．４％が、血清アルブミンのカルボキシ末端に対応する末端においてＦｏｋＩ制限フラグメント（Ｇｅｎｂａｎｋ　アクセス番号ＬＯＯ１３２において、塩基が２０８０未満）であること、及びこれがアガロースゲルで観察された主要なバンドであるということが推定されつる。バンドの大きさはこの推定と一致する。血清アルブミン（これは、豊富な転写物である）からは６の可能なＦＯｋＩ制限フラグメントがあるので、分類方法による本質的な選択が生じた。同様に、副腎サブセット中の豊富な制限フラグメント（６，４％）が、ＮＡＤＨ−ユービキノンオキシドレダクターゼの鎖４　（Ｇｅｎｂａｎｋ　アクセス番号ＪＯ１４１５において、塩基が１１７１１超）のための遺伝子の領域内でミドコントリから由来した。制限フラグメントは脳サブセットを支配しなかった。これらの結果もまた、アガロースゲル分析と一致し、選択が起こったことを再び示している。クローニングを、選択性及び非選択性のアダプターに関して方向性をもって行った。もし選択が起こらず、フラグメントが１回より多く観察された時は、その方向性はランダム（５０％がある方向に、そして５０％が反対方向）であると予想されるので、上記のクローニングは、分類方法の更なる検定を提供する。実際、以下の表２で示された結果は、１回より多くフラグメントが生じたときは（１ｃａａｓｓ比校により決定して）、４０の場合のすべてにおいてアンチセンスマツチが起きないことを示している。このことは、選択が、方向性クローニングの間に維持されている方向性を導入しないかぎり、非常に起こりそうにない。選択は、アダプターの連結及びブライミングを通して達成され、従ってこれらのそれぞれは選択の間、高い特異性の程度を有しなければならない。連結反応におけるオリゴヌクレオチドが、非特異的なアダプターの５°末端に最も近い４つの可能な塩基位置のそれぞれにおいて、全ての可能性のある組み合わせをカバーすると仮定して、連結の特異性は顕著である。一つの比較として、配列決定及び分析を実施例１と同様にして行った。但し、分類されていない或いは方向的にクローン化されていない慣用の、市販のｃＤＮＡライブラリーをｃＤＮＡクローンの原料として用い、そして適当な配列決定プライマーを用いた。この比較の結果を、表２に示す。アンチセンスマツチが、成人肝臓（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、カタログ番号＋１Ｌ１００１ｂ）及び成人脳皮質ライブラリー（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、カタログ番号ＢＬ１００３６）において、それぞれ１０．５％及び３６．３．％の頻度で共通して観察された。本発明の方法を用いて、元の核酸からの制限フラグメントがサブセットにひとたび分類されれば、それらは全ての分子遺伝子的又は分子生物学的技術により有利に操作されかつ分析されつる。それらはまた、それらの分類された特定の性質を利用する広範囲の適用のために有用である。元の集団の状態と比較して、分類によってフラグメントに与えられた性質の有用なタイプのいくつかは、それらの相対存在量が分類された集団中でより高いこと、分類された集団の全てのメンバーのすべての末端における配列が同じであり、そしてそれ故索引付けされること、分類された集団のメンバーは特有の及び分離しているセットを形成すること、一つのタイプの核酸から製造されたサブセットは関連する核酸から製造された同じサブセットと共通点があること、そしてサブセット中のフラグメントの２つの末端を別々に認識することによってそれらは判っている方向性を獲得することである。ヒトゲノム配列決定プロジェクトにおけるｃＤＮＡから製造された制限フラグメントを分類するための方法の適用は、意図されつる本発明の方法の適用を最も技術的に要求する具体例の一つである。−重鎖ＲＮＡは、まず二本鎖ＣＤＮＡに転化されなければならなかった。更に、ｃＤＮＡから製造されたフラグメントは、ｍＲＮＡ集団の元の組成を反映して種々の存在量で存在した。それにも拘わらず、分類は、成功裡に達成され、従って方法の強靭さを説明している。分類されたフラグメントの方向性が判っていると、原則的に、ＰＣＨによりブロービングするために直接フラグメントを用いることができる。このことは、個々のサブセットのために用いられたアダプターのコア配列が異なることを除いては、同じフラグメントが２つの同一のサブセットから単離されることを要求するであろう。次いで、あるセットからのフラグメントは、そのアダプター配列の一つの５゛末端において固定化され、その後、標的とアニールされる。標的とフラグメントの間でアニーリングは、アダプターに対応する配列においては起こらない。次いで、ＤＮＡポリメラーゼ（その唯一のヌクレアーゼ活性としての３”エンドヌクレアーゼ活性を有する）を用いて、アニール化されていない３′末端を、最初の相補的にアニールされた塩基が達成されるまで切除し、この時点において、固定化されていないアダプター配列の逆の相補部分が標的中にコピーされることとなる。次いで、切除後に、核酸を加熱変性させ、同時に酵素を失活させ、そして固定化されたフラグメントを取除いて、固定化されていないアダプター配列を取り込んでいる標的を残す。次いで、標的のコピーが、取り込まれたアダプターに対応するプライマーから作られる。次いで、標的が変性され、そして第二のサブセットからのフラグメントの相補性鎖にアニールされる。このフラグメントもまた、その５°末端において固定化される。切除は上記のようにして行われた。このとき、標的上のアダプター配列の逆の相補部分は、固定化されたフラグメント上に取り込まれるようになる。その後、標的に対して特異的にそれらの起源を負っているフラグメントが専ら、今固定化された５°末端に対応するプライマー及び前に固定化された５°末端に対応するプライマーを用いてＰＣＨにより増幅される。このアプローチにおいて１回で、１より多いタイプの７ラグメントを用いることも可能である。更に、プローブと標的の間に厳格な相補性は要求されず、従って、条里性が検出されうる。分類された集団のメンバーが特有の及び分離しているセットを形成するという事実は、目的のフラグメントの同定を更に便利に行うために用いられ得る。サブセットの任意のメンバーが、適したハイブリダイゼーションプローブを用いて検出されつるように、フラグメントがサブセット中に分類される。サブセットのブロービングは、いずれのサブセット中に目的のフラグメントが見いだされるかを同定する。次いで、そのサブセット中のフラグメントは、目的のものを見いだすためにプローブ化される。この２つの工程のアプローチは、全ての可能性のあるフラグメントを１回でブロービングするより容易である。分類された集団のメンバーが、特有のかつ分離しているセットを形成するという原理は、配列決定プロジェクトにおいて利用されうる。２以上の異なる制限エンドヌクレアーゼが、オーバーラッピングフラグメントがサブセットのセットの間で製造されるということを知って、サブセットの２以上の対応するセットを製造するために用いられ得る。次いで、それぞれのサブセットのメンバーが配列決定される。分類の程度は、メンバーのそれぞれを容易に同定することを可能にする、サブセット当たり多くのフラグメントを製造できるように予め決定される。これは、配列決定プロジェクトに対する他のアプローチにおいて通常起こるように同じ配列を繰り返し読む必要性を最小化する。更に、最終のオーバーラッピング配列中に予想されるギャップはより少ない。不明確さに対応する塩基を確認できるように、与えられた配列を数回読むことがしばしば望まれる。このことは、同じフラグメントの異なった単離物を読むことにより容易に達成される。挿入物が配列決定するにはあまりに長いか、又はフラグメントが成功裡に分類されるのには不適当な大きさであると、配列にギャップが生じる。異なった制限エンドヌクレアーゼによって製造されたフラグメントが、配列を延ばす目的のために、どのサブセット中に見いだされるかを予測するために、公知のフランキング配列を用いてこのようなギャップを簡単に埋めることが可能である。ベクターからのフラグメントもまた存在するが、それらがどのサブセット中に生じるかは予測できかつそれらはその大きさより同定されうるので、それらは容易に避けられつる。フラグメントが、元の集団中よりは、分類されたサブセット中でより高い相対存在量であるという事実は、核酸ハイブリダイゼーションプローブを用いる適用を利するようである。このような適用においては、感受性が“ノイズに対するシグナル”の比によって決定される。これは、プローブの全てが特定の標的に対して特異的である訳ではな（、そしてそれ故バックグランドに寄与できない（従って、感受性を減少する）ところの適用において重大となる。それ故、プローブとして同時に用いられることができる、核酸の大きさ又は異る核酸の数において限界が設定され、それは、従って、適用の可能な範囲を減少する。これらの限界は、プローブとして、最初の意図されたプローブの分類されたサブセットを別々に用いることにより解決されうる。この方法においては、さもなければ元の核酸の詳細なサブクローニング及び／又は特徴付けを要求するブロービングの適用を可能にする。この方法において、任意の可能な組み合わせにてプローブ又は標的として用いられ得る本技術分野の公知のタイプの核酸の具体例は、ｃＤＮＡのフラグメント、クローン又はライブラリー；ラムダゲノムクローン又はライブラリー：コスミドゲノムクローン又はライブラリー：Ｐ１ゲノムクローン又はライブラリー、ＹＡＣゲノムクローン又はライブラリー；分類された染色体又は分類された染色体の生成物；染色体特異的ライブラリー、顕微解剖された染色体からの物質の生成物又はライブラリー；併発（ｃｏ−ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ）クローニングの生成物又は併発クローンのライブラリー、ＩＲ８−ＰＣＲ生成物又はこれらの生成物のライブラリーを含む。一般に、目標は、可能な対組み合わせ間の共通の配列の検出である。それは、それらのシグナル強度における太きな相違の結果として通常不可能である配列の同時検定を可能にするので、プローブ及び／又は標的において、広く異なった存在量の配列があるときに特に役立つ。このような状態の古い具体例は、ｃＤＮＡライブラリーの差別スクリーニング（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）が行われる場合である。典型的には、２つの異なったｃ　ＤＮＡライブラリー中のクローンが、そのライブラリーの一つを作るために用いられたｃＤＮＡから調製されたプローブを用いて検出される。所与のクローンからのシグナルの強度は、プローブが対応するところのライブラリー中のその存在量を示す。多くのクローンが、検出されるにはあまりに低い存在量である。分類を通してのサブセット中のプローブの適した濃厚化は、全てのクローンが測定できるシグナルを製造することを可能にする。分類によってプローブからのフラグメントの濃厚化は、標的中の最も少ない存在量の配列でさえ検出され得るように設定されうろこと、分類された集団のメンバーが特有のかつ分離されたセットを形成すること、そして核酸配列のあるタイプから製造されたサブセットが関連する核酸から製造された同じサブセットと比較できることを条件として、クローンの同定又はマツピングの目的ために目的のライブラリーの個々のメンバーをフィンガープリントできる。これはまた、所与のフラグメントの両末端が独立に分類された結果として、サブセットが、離れて、部分的にオーバーラッピングしていることを要求する。プローブからのそれぞれのサブセットは、すると、目的の１以上のライブラリー中のクローンを検出するために用いられる。次いで、各クローンは、それを検出するサブセットによって決定されるサインを獲得する。解決は、どれだけ多くの特徴がサブセット中にあるか、どれだけ多くのサブセットが製造されるか、及びそれのためにサインが決定されたクローンの数に依存する。十分な数のサブセットが、各クローンがそれを通じて同定されつるところの特有のサインを与えられつるように、１以上の酵素からそれらを調製することにより製造されつる。同じサインをもつクローンは、同じ挿入物を有すると想定され、一方物理的マッピングの目的のためには、オーバーラツプするサインが、オーバーラツプする挿入物を意味する。遺伝子的マツピングプロジェクトにおける共通の要求は、例えば臨床上の遺伝学においては、個人間で多量である塩基をスクリーニングして、多型性が見いだされるところのゲノム領域の運命を、関連遺伝分析のために世代を通じてモニターできるようにすることである。制一部位多型性は、この点に関して有用である。塩基多型性は、それらが検出できる制限部位を有するか否かに関係して異る個体を結果しうる。分類された集団のメンバーが特有のかつ分離されているセットを形成すること及び核酸の一つのタイプから製造されたサブセットが関係ある核酸から製造された同じサブセットと同等であること、という双子の原理は、個体の間での制限部位における多型性を検出するためにそれら自身をプローブとして用いることができるところのクローンを検出する便利な手段を提供する。クローンは、一つの個体からのサブセット中のフラグメントから調製される。次いで、これらは、クローンを製造するために用いられたフラグメントを用いて精査され、そしてまた、それとは別に、異なった個体から調製された対応するサブセットからのフラグメントを用いて精査される。個体間の制限部位多型性を検出できるクローンは、それらが由来しないところの個体からのサブセットがプローブとして用いられた場合に、それらが由来するところの個体からのサブセットがプローブとして用いられる場合と対照的に、シグナルを生じることができなかったものとして同定される。多型性は、サブセットを調製するために元々用いられた酵素のための部位中に中にある。ゲノム又はｃＤＮＡのクローンは、その適用のために用いられ得る。ｃＤＮＡクローンの使用は、制限部位多型性が実際の遺伝子中に検出されるということが知られ、するとその運命は世代を通じて追跡されつるという利点を有する。もし、それらの間に上記の如く多型性が検出された個体が、戻し交配においてその祖父母に対応する個体であるならば特に有利である。次いで、戻し交配は元の祖父母のそれぞれに等しく行われたと仮定すると、Ｆ２世代の個体の５０％が、多型性を検出されると評点されつる。もしＦ２の個体のそれぞれからの核酸が別々に、分離及び増幅されれば、それはまた有用である。次いで、多型性が元の祖父母間で検出されているところのものに対応する、増幅されたＦ２サブセット中で多型性が評点され得る。このことは、通常の有限の戻し交配資源はこの目的のために永続性にされること、各試料からのシグナルが存在する又は存在しないという性質により、格子配列上にそれらをスポットした後に、同時に多くに試料を便利に精査することができること、そして、標的は（存在する場合）、それがより容易に検出されるようにサブセット中に濃厚化されること、という３つの利点を有する。このことは、植物又は動物の育種において特に価値がある。上記の観点においては、本発明は、本発明の方法、又は本発明の方法に従って選別或いは分類された配列の集団を用いることを含み、該使用は以下のいづれかの１以上を利用する：（ａ）分類された集団中での配列の相対的により高い存在量、（ｂ）アダプターの使用による分類された配列の“索引付け”（Ｃ）分類された集団のメンバーが特有のかつ分離されたセットを形成するという事実、（ｄ）ある核酸原物質から製造された所与のサブセットが関連する核酸からの対応する“アダプター化された”サブセットと同等である事実、（ｅ）アダプター化の結果としての、配列が知られた方向性を獲得する。前述の普遍性に対する偏見なく、本発明は、なかんずく、アダプター化されかつ分類された配列のＰＣＲプローブとしての使用；前もって選択された目的のフラグメント又は発明の方法の使用；核酸原物質を制限エンドヌクレアーゼの作用にさらすことにより製造された配列のセットを（例えば、配列決定目的のために）選別又は分類するための本発明の方法の使用；集団中の所与の配列の存在量を増加させ、それによりハイブリダイゼーションプローブによる探査を容易にするための本発明の方法の使用；配列の分類されたサブセットのハイブリダイゼーションプローブとしての使用；クローンの同定又はマツピングにおける本発明の方法の使用；及び、場合により問題の種の１より大きい世代を通じてモニターされた種の配列長型性の検査における本発明の使用を含む。上の記載はすべてを尽すものではなく、そしてこのパイオニア発明の適用を限定するものとして解釈されるものではないと理解される。他の観点において、本発明は、明らかに以下を含む＝（ａ）核酸試料を所定の核酸配列のサブセットに分類及び選別することにおいて、それぞれが核酸配列末端認識手段を有するところのアダプター分子の集団を用いる方法であって、該アダプター分子のそれぞれは一つの所定の塩基に特異的である核酸配列末端認識手段を存するところの方法。（ｂ）核酸分類工程において使用するための試薬を含み、がつ核酸配列末端認識手段として一本鎖末端延長を有する二本鎖オリゴヌクレオチドの形のアダプター分子の集団を含むキット。（ｃ）　（ｉ）アダプター分子の核酸配列末端認識手段が所定の塩基を認識し、かつ該塩基の存在が選択のための基礎を形成でき、及び／又は（ｉｉ）　（もしあるならば）プライマーがそれらの配列中に所定の塩基を含み、かつ該塩基の存在が選択のための基礎を形成できる、ところの上記キット。（ｄ）核酸分類方法において使用するためのアダプター分子の集団であって、該アダプター分子が所定の塩基を認識する核酸配列末端認識手段を含み、それによって、該所定の塩基の選ばれた一つが認識されているところのサブセットの選択に基づいて、該アダプター分子に連結された核酸配列の分類を可能にするところのアダプター分子の集団。（ｅ）核酸配列を分類するための方法であって、該配列は、所定のヌクレオチド塩基を含む配列に連結するための特異性をそれぞれが示すアダプター分子の集団に連結されており、かつ得られた連結された配列の分類が塩基のための選択に基づいているところの方法。図１図２ｎｎｎｎｃｃｔａｃｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎ　ｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎ１３盈拳ｎ−イ４ｅａ　４１Ｍ乙Ｊソ）ＪＡ’・　与えＳ茗ＴミＤルア１＆’ダ１６’ｌ　イｆ７色ｉｊノ゛？、−二Ｊ）’ｕｚ　ｋｌフｆｌ、’７ム°’Ｉｎｌ　Ｚ’ ：ＪＩＪ図３ａＩＪＦｆＬＬｎ＊＋：Ｊ７Ｚ　＊＝　ｔ＋ｌｔ１図３ｂ図４ｉｆＪ°ｌ工禾ｒ乙・用いた７γγクーオＬヤ・アラインーーリ４１亨１図５ａ図６国際調査報告ＰＣＴ／ＧＢ　９：１１０１４５２ −＋＋１−鴫−＾ｅｍ＋ｗ−舛・フロントページの続き（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＮＥ、ＳＮ。ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＢＹ。ＣＡ、ＣＨ，ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＫＺ、ＬＫ、ＬＵ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ、ＰＴ、ＲＯ，ＲＵ。ＳＤ、ＳＥ、ＳＫ、ＤＡ、ＵＳ、ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】

１．特徴付けされていない核酸を配列特異的なサブセットに選別することによって、該核酸を分類する方法であって、（ａ）場合により、最初に、該特徴付けされていない核酸を試薬、好ましくはエンドヌクレアーゼの作用下に付し、ここで該試薬は該核酸を切断して、より小さい大きさの切断生成物を製造する、（ｂ）特徴付けされていない核酸、又は場合により（ａ）からの切断生成物のいずれかを、アダプター分子の集団と反応させることによりアダプター化された生成物を製造し、ここで該アダプター分子のそれぞれは核酸配列末端認識手段を有し、かつアダプター分子の該集団は、核酸配列の所定のサブセットに結合しうる配列末端認識手段をもつ一連のこのような分子を包含する、そして（ｃ）選はれた核酸配列末端認識手段のアダプターを含む（ｂ）から得られたアダプター化された生成物のみを選択及び分離する、ことを含む方法。
２．アダプター分子が、核酸配列末端認識手段が公知のヌクレオチド組成の一本鎖末端を含むところのオリゴヌクレオチドを含む請求の範囲第１項記載の方法。
３．一本鎖末端が所定のヌクレオチドに相補性を示す請求の範囲第２項記載の方法。
４．アダプター分子の集団が、特徴付けされていない核酸又は切断生成物の両末端がそれらに連結されうるような個々の分子を含む請求の範囲第１項〜第３項のいずれか一つに記載の方法。
５．アダプター分子の少なくともいくつかが固相上に固定化されるように適合されている請求の範囲第１項〜第４項のいずれか一つに記載の方法。
６．アダプター化された生成物の選択が、一つの所定の塩基を有するアダプター分子を選択することに基づいている請求の範囲第１項〜第５項のいずれか一つに記載の方法。
７．任意的工程（ａ）が、二本鎖核酸に対して特異的であるか又は一本鎖核酸上の認識された配列において切断する能力を有するエンドヌクレアーゼを用いることによって達成される請求の範囲第１項〜第６項のいずれか一つに記載の方法。
８．エンドヌクレアーゼが、一本鎖の核酸を切断するもの、例えばＢｓｔＮＩ、ＤｄｅＩ、ＨｇａＩ、ＨｉｎｆＩ又はＭｎｌＩから選はれる、請求の範囲第７項記載の方法。
９．アダプター分子の少なくともいくつかがＰＣＲプライマーとのハイブリダイゼーシヨンを可能にする公知の配列を含んでいる請求の範囲第１項〜第８項のいずれか一つに記載の方法。
１０．アダプター化された生成物の選択が、プライマーが一つの所定の塩基を好ましくは３′末端に有するところの核酸合成のプライミングに付された生成物を選択することに基づいている請求の範囲第９項記載の方法。
１１．特徴付けされていない核酸を分類する方法であって、（ａ）該特徴付けされていない核酸を試薬、好ましくは離れた位置の切断及び認識部位を有するエンドヌクレアーゼの作用下に付し、ここで該試薬は該核酸を切断して、二本鎖切断生成物を製造し、該生成物の個々の鎖は切断された末端においてオーバーラップして、公知の程度まで延びている一本鎖を残す、（ｂ）（ａ）からの切断生成物をアダプター分子と連結して、アダプター化された切断生成物を製造し、ここで該アダプター分子のそれぞれは切断生成物末端認識配列を有し、そしてこのようにして用いられるアダプター分子は、切断製造された延びている一本鎖の配列の所定のサブセットに相補的な認識配列を有する一連のアダプター分子を包含し、そして、（ｃ）公知の認識配列のアダプターを有する（ｂ）から得られたアダプター化された切断生成物のみを選択及び分離する、ことを含む方法。
１２．工程（ｂ）において多くの別々の反応を行い、その個々の反応において、一連のアダプター分子のサブセットが連結される請求の範囲第１１項記載の方法。
１３．特徴付けされていない核酸が、最初に二本鎖核酸に転化される一本鎖核酸よりなる請求の範囲第１１項又は第１２項記載の方法。
１４．工程（ａ）で用いられるエンドヌクレアーゼが、その切断部位が二本鎖基質の２本の鎖に亘って非対称的に配置されており、かつその特異性が切断部位に隣接する塩基の性質によっては影響されないところのクラスＩＩ制限エンドヌクレアーゼから選ばれ、場合により該エンドヌクレアーゼがＦｏｋ１であるところの請求の範囲第１１項〜第１３項のいずれか一つに記載の方法。
１５．（ａ）からの切断生成物が、長さが１〜１０塩基、場合により４〜６塩基である延びた一本値を有するところの請求の範囲第１１項〜第１４項のいずれか一つに記載の方法。
１６．アダプター分子が、工程（ａ）から得られる切断生成物の延びた一本鎖に相補的である延びた一本鎖を含む切断生成物末端認識配列を有する請求の範囲第１１項〜第１５項のいずれか一つに記載の方法。
１７．アダプター分子の少なくともいくつかが、５′ヒドロキシル基をもつ切断生成物末端認識配列末端を有するところの請求の範囲第１６項に記載の方法。
１８．アダプター分子切断生成物末端認識配列が、長さが少なくとも３ヌクレオチドであり、かつ末端、場合により５′末端から２或いはそれ以上のヌクレオチドの位置に選択されていないランダムな塩基が存在するものである請求の範囲第１１項〜第１７項のいずれか一つに記載の方法。
１９．アダプター分子が、核酸配列がそのアダプターに付着された時に、分離を可能とする部分を含む請求の範囲第１１項〜第１８項のいずれか一つに記載の方法。
２０．分離を可能とする部分がビオチン残基を含む請求の範囲第１９項記載の方法。
２１．アダプター化された生成物の選択が、一つの所定の塩基を有するアダプター分子を選択することに基づいている請求の範囲第１０項〜第２０項のいずれか一つに記載の方法。
２２．アダプター分子が、そのような分子に連結された核酸配列が、コア配列に相補性を示すプライマーを用いることによって増幅されうるように、所定のコア配列を含む請求の範囲第１１項〜第２１項のいずれか一つに記載の方法。
２３．アダプター化された生成物の選択が、プライマーが好ましくは３′末端に、一つの所定の塩基を有するところの核酸合成のプライミングに付された生成物を選択することに基づいている請求の範囲第２２項記載の方法。
２４．（ｂ）で用いられるアダプター分子が、工程（ａ）の後に存在する切断生成物の選ばれたサブセットの全ての可能性のあるメンバーに対応する請求の範囲第１１項〜第２３項のいずれか一つに記載の方法。
２５．アダプター分子の少なくともいくつかが、存在する全ての他のアダプターの認識配列とは異なる所定の認識配列を有する請求の範囲第１１項〜第２４項のいずれか一つに記載の方法。
２６．核酸試料を所定の核酸配列のサブセットに分類及び選別することにおいて、アダプター分子のそれぞれが核酸配列末端認識手段を有するアダプター分子の集団を用いる方法であって、該アダプター分子のそれぞれが一つの所定の塩基に特異的である核酸配列末端認識手段を有する方法。
２７．アダプター分子が、末端に、核酸配列末端認識手段として働く一本鎖の延長部分を有する二本鎖オリゴヌクレオチドである請求の範囲第２６項記載の方法。
２８．アダプター分子が、アダプター分子と連結された任意の核酸配列の核酸増幅のためにプライマーとのハイブリダイゼーシヨンを可能にする配列をも含む請求の範囲第２６項又は第２７項記載の方法。
２９．核酸分類方法において使用するための試薬を含み、かつ核酸配列末端認識手段として一本鎖末端延長を有する二本鎖オリゴヌクレオチドの形のアダプター分子の集団を含むキット。
３０．核酸増幅工程において用いるプライマーをも含み、かつアダプター分子の少なくともいくつかがプライマーがそれらにプライマーハイブリダイゼーションするための配列を含むところの請求の範囲第２９項記載のキット。
３１．請求の範囲第２９項又は第３０項記載のキットであって、（ａ）アダプター分子の核酸配列末端認識手段が所定の塩基を認識し、かつ該塩基の存在が選択のための基礎を形成でき、及び／又は（ｂ）（もしあるならば）プライマーがそれらの配列中に所定の塩基を含み、かつ該塩基の存在が選択のための基礎を形成できる、ところのキット。
３２．アダプター分子が、使用において、該アダプター分子に連結された核酸配列の索引付けを可能にするばかりではなく、該核酸配列の方向性をも確定するところの核酸配列を含む請求の範囲第２９項〜第３１項のいずれか一つに記載のキット。
３３．アダプター分子の少なくともいくつかが、核酸配列に連結されたときに該アダプター分子の固相上への固定化を可能にする手段を含むところの請求の範囲第２９項〜第３２項のいずれか一つに記載のキット。
３４．更に、核酸切断試薬、場合によりエンドヌクレアーゼ、例えばＦｏｋ１を含む請求の範囲第２９項〜第３３項のいずれか一つに記載のキット。
３５．核酸分類方法において用いるアダプター分子の集団であって、アダプター分子が所定の塩基を認識する核酸配列末端認識手段を含み、かつそれにより、該所定の塩基の選ばれた一つが認識されるところのサブセットの選択に基づいて、該アダプター分子に連結された核酸配列の分類を可能にする集団。
３６．核酸配列の分類方法であって、該核酸は、それぞれが所定のヌクレオチド塩基を含む配列への連結に対して特異性を示すアダプター分子の集団に連結され、かつ得られた連結された配列の分類は塩基のための選択に基づいているところの方法。
３７．以下のいずれかの一つにおいて、請求の範囲第１項、第１１項又は第３６項のいずれか一つに記載の方法を用いる方法、（ａ）核酸配列の混合物から選ばれた核酸配列の量の増強、（ｂ）核酸配列の多型性の調査、（ｃ）核酸配列の配列決定、（ｄ）調べられる試料中に存在する選択された配列の量を増強することにより、核酸ハイブリダイゼーションプローブの使用を容易にする、（ｅ）製造された元の多重配列プローブのサブセットを、それらを分類することによりプローブとして別々に用いることにより、プローブとして用いられることができる種々の核酸配列の数を増加させる、（ｆ）クローンの同定又はマッピングのために核酸ライブラリーの個々のメンバーをフィンガープリンティングすること、（ｇ）ＰＣＲプローブとして用いるために適合されそして選別された配列のセットを製造すること、（ｈ）核酸配列の集団中での、目的の前もって選択されたフラグメント又は配列の同定、（ｉ）２以上の核酸配列集団試料中での核酸配列の頻度の比較。