FI95398C - Menetelmä ihmisen nuhaviruksen serotyypittämiseksi - Google Patents

Description

95398

Menetelmä ihmisen nuhaviruksen serotyypittämiseksi Förfarande för serotypning av mänskans rhinovirus

Esillä olevan keksinnön kohteena on virusten karaketerisoin-5 timenetelmä.

Tähän mennessä on kuvattu yli 100 serotyyppiä ihmisten nuha-viruksille (HRV), jotka pääasiallisesti ovat syynä vilustu-missairauksiin (Stott & Killington, 1972; Cooney et ai., 10 1982; Hamparian et ai., 1987). Vaikka nuhavirusinfektioiden aiheuttamat sairaudet eivät tavallisesti itse ole laadultaan vakavia, heikentynyt organismi voi saada sekundääri-infektioita; nämä sekundääri-infektiot ovat taloudellisesti ja sosiaalisesti merkityksellisiä. Tämän virusryhmän ymmärtämi-15 sessä tapahtuneista edistysaskeleista huolimatta tehokas rokottaminen ei ole tähän mennessä aina ollut varma johtuen serotyyyppien lukumäärästä. Nuhaviruksen diagnoosiin sekä sen serotyypin määrittämiseen, joka kiertää tietyssä populaatiossa, voidaan nykyään päästä vain kalliin serologisen tyypittä-20 misn kautta (Cooney et ai., 1982; Keliner et ai., 1988).

Esillä olevan keksinnön tavoitteena on kehittää viruksille, erityisesti nuhaviruksille yksinkertaistettu tyypitysmenetel-mä.

25 Tähän mennessä on määritetty 4 HRV-kannan RNA-genomien nuk-leotidisekvenssit (Hughes et ai., 1988), HRV2 (Skern et ai., 1985), HRV14 (Stanway et ai., 1984; Callahan et ai., 1985) ja HRV89 (Duechler et ai., 1987). Sekvenssien analyysi antoi 30 tuloksena, että tämän ja muiden pikornavirusgenomien 5'-koo-daamattornilla alueilla on merkittäviä alueita, joissa sekvenssit ovat identtisiä (Rivera et ai., 1988). Neljässä tähän mennessä sekvensoidussa nuhavirusserotyypissä on säilynyt kaksi tällaista lohkoa (hakassekvenssiä). Näissä lohkoissa on 35 yhden kerran 23 identtistä nukleotidiä, nimittäin nukleotidien * 531-553 välillä (1. hakassekvenssi) sekä yhden kerran 21 identtistä nukleotidiä nukleotidien * 161-181 välillä (2.

2 95398 hakassekvenssi). Ellei toisin ole mainittu, tarkoittavat asemanumerot HRV2:n numerointia (Skern et ai. 1985).

Keksinnön mukaisesti käytettiin näiden alueiden oligonukleo-5 tidejä nuhavirusserotyyppisten sekvenssien laajentamiseen äskettäin kehitetyn PCR-reaktion avulla (Polymerase Chain Reaction; Saiki et ai., 1988). Tämä "Polymerase Chain Reaction" mahdollistaa myös tuntemattomien DNA-sekvenssien entsy-maattisen laajentamisen in vitro. Tähän tarkoitukseen käyte-10 tään kahta oligonukleotidiprimeeriä, jotka sijaitsevat laajennettavan DNA-fragmentin vieressä. Nämä primeerit on rakennettu niin, että toinen sitoutuu (+)-jousteeseen ja toinen (-)-jousteeseen, ja orientoitu niin, että DNA-polymeraasi suorittaa DNA-synteesin primeerien välillä sijaitsevan alueen 15 yli. Toistamalla useita kertoja, ensisijaisesti kolmeen kertaan asti, sykli, joka muodostuu kolmesta vaiheesta: 1.) DNA:n lämpödenaturointi; 2.) primeerien sitominen komplement-teihin sekvensseihin; 3.) pidentämällä DNA-polymeraasilla (DNA-fragmentin määrä kaksinkertaistuu jokaisessa syklissä), 20 voidaan monistaa eksponentiaalisesti primeerien välissä sijaitseva DNA-fragmentti. PCR-reaktio voidaan automatisoida mieluummin käyttämällä termostabiilia DNA-polymeraasia, esimerkiksi Thermus aquaticus-bakteerista saatua.

25 Kuten voitiin osoittaa, näiden alueiden konservoituminen ulottuu jo rakenteellisesti selvitettyjen nuhavirusserotyyp-pien lisäksi myös vähintään kolmeen tähän mennessä rakenteellisesti tuntemattomaan serotyyppiin. Yllättäen oli mahdollista muodostaa PCR-reaktion ja spesifisten primeerien 1 ja 2 30 avulla nuhavirusten HRV1A, HRV49 ja HRV70 DNA-fragmentti ;· (kuvio 1) .

Kaksi konservoituneista alueista johdettua primeeriä antavat sen vuoksi mahdollisuuden käyttää näitä universaalisesti myös 35 tuntemattomien DNA-sekvenssien laajentamiseen. Nämä primeerit, erityisesti 18- ja 14-meeri, ensisijaisesti oligonukle-otidiprimeeri 1 (sekvenssi z 161-178) ja oligonukleotidipri- 3 95398 meeri (komplementtinen sekvenssille * 531-544), jotka on valmistettu tunnetuilla oligonukleotidien synteesimenetelmillä, muodostavat siten perustan keksinnön mukaiselle tyypitys menetelmälle. Virusten tai virusten serotyyppien tyypittämis-5 tä varten on osoitettava tunnusomaisia eroja yksittäisten kohteiden välillä. Edellä jo mainittiin, että tähän mennessä tyypittämisessä on turvauduttu reaktioon vasta-aineiden kanssa ja määritetty ristiaktiivisuudet. Toinen mahdollisuus on rakenne-erojen havaitseminen; eräs menetelmä, jota taval-10 lisesti tuskin voidaan käyttää nopeana ja yksinkertaisena diagnostisena keinona, on rakenteen selvittäminen, joka yleensä kuitenkin on erittäin vaivalloista. Rakenteellisiin eroavaisuuksiin perustuvaa tyypitystä voidaan toisaalta pitää ehdottoman varmana.

15

Julkaisussa Gama et ai. (Juni 1989) kuvataan menetelmä ihmisen nuhaviruksen määrittämiseksi kliinissä näytteissä eri-koisprimeerin avulla, joka sitoutuu ihmisen nuhaviruksen 5 ei-koodaavaan alueeseen. PCR-menetelmällä laajennetaan 380 bp 20 pitkä segmentti nuhavirusgenomista, joka voidaan osoittaa geelielektroskooppisesti.

Gama et ai. ei kuitenkaan kuvaa erilaisten, mutta lähellä toisiaan olevien nuhavirustyyppien eroja restriktiomallin 25 avulla, mikä nyt esillä olevan keksinnön ansiosta on mah dollista.

Esillä olevan keksinnön tavoitteena oli siten kehittää tyypi-tysmenetelmä, joka hyödyntää rakenteellisia eroja eri virus-30 ten välillä.

Tähän tavoitteeseen päästiin siten, että keksinnön mukaisesti käytettiin hyväksi määrättyjä rakenne-erojen "indikaattoreita" .

Nämä "indikaattorit" voivat DNA:n tai RNA:n tapauksessa olla erityisiä restriktioentsyymien tunnistamiskohtia. (Menetelmää 35 4 95398 voidaan sikäli käyttää yleisesti nukleiinihapposekvenssei-hin, että käänteistranskriptaasi voi kääntää RNA:n takaisin DNA:ksi). Ammattimiehelle on tuttua, että restriktioentsyymit ovat yleensä erittäin spesifisiä. Monissa tapauksissa voi jo 5 yhden emäksen muuttuminen erityisen tunnistamissekvenssin sisällä johtaa siihen, että tämä nimenomainen restriktioent-syymi ei enää tunnista sekvenssiä.

Jotta voitaisiin saada esimerkiksi nuhaviruksia varten näitä 10 spesifisiä "indikaattoreita", verrattiin keskenään sekä rakenteellisesti tunnettujen nuhavirusserotyyppien että tähän mennessä rakenteellisesti tuntemattomien nuhavirusserotyyppien laajennettuja fragmentteja.

15 Huolimatta suuresta konservoitumisasteesta, on neljällä rakenteellisesti tunnetulla serotyypillä yllättäen keskenään merkittäviä eroja identtisien hakassekvenssien alueiden välillä. Kunkin serotyypin restriktiokuvioon tästä saatuja tunnusomaisia eroja, joita oli läsnä myös näistä alueista 20 saaduissa laajennetuissa fragmenteissa, käytetään keksinnön mukaisesti keksinnön taustana olevan tavoitteen saavuttamiseen.

Koska HRV1A:sta, HRV49:sta ja HRV70:sta ei ollut käytettä-25 vissä mitään sekvenssi-informaatiota, määritettiin DNA-sek- venssi HRV1A:n ja HRV49:n laajennetuista fragmenteista, jotta saataisiin selville, onko mukana tunnusomaisia restriktiokoh-tia. Tämä tulos korreloi hyvin näiden parien välisen risti-reaktiivisuuden kanssa (Cooney et ai., 1982). Kuvioissa 2a ja 30 2b on esitetty nämä erot HRV2:n ja HRV49:n sekvenssien välil-:* lä ja HRV1A:n ja HRV1B:n sekvenssien välillä. 241 sekvenssoi- dun emäsparin sisällä voitiin havaita yhteensä 15 vaihtunutta emästä ja kaksi deleetiota HRV2:n ja HRV49:n välillä. 210 bp alueella, joka analysoitiin HRVIArsta ja HRV1B:sta, voitiin 35 havaita yhdeksän emäksen vaihtumista ja yksi insertio. Nämä muutokset johtivat kummassakin tapauksessa yhden tai useamman restriktiokatkaisukohdan muodostumiseen tai häviämiseen (kts.

il lii i HiIti I 1 i ffl 5 95398 kuvio 2). Tämän laajentamiskokeen avulla voitiin myös osoittaa, että jokaiselle serotyypille voidaan valita tunnusomaisia katkaisukohtia.

5 Keksinnön mukaisen tavoitteen saavuttamista varten valittiin sellaisia restriktioentsyymejä, joilla serotyypit voidaan tunnistaa ilman epäilyksiä; taulukossa 1 on annettu valitut entsyymit sekä nuhavirussysteemin fragmenttikohdat. DNA-fragmenttien vertailu osoitti, että HRV:n, HRV49:n ja HRV89:n 10 fragmenteilla oli Banll-entsyymille yksi katkaisukohta (kuvio 3a), mutta HRV1A:n, HRV1B:n ja HRV14:n fragmenteilla ei yhtään (kuvio 3b). Tätä entsyymiä käyttämällä voidaan serotyypit siten ensisijaisesti jakaa kahteen erilliseen ryhmään ja helpottaa näin serotyyppien tunnistamista: jokaisen sero-15 tyypin laajennetut fragmentit pilkottiin BanII:lla ja tuotteet analysoitiin polyakryyliamidigeeleillä. Myös eripituiset fragmentit, jotka saatiin HRV2:lla ja HRV89:lla, mahdollistavat näiden serotyyppien tunnistamisen, kuten on osoitettu kuviossa 3a. HRV2:n tunnusomainen Hindlll-kohta sekä HRV89:n 20 tunnusomainen Rsal-kohta vahvistivat tämän identifioinnin.

HRV2 voitiin erottaa HRV49:sta puuttuvan Hindlll-kohtansa avulla.

Serotyypit, joilla ei ole lainkaan Banll-kohtia (kuvio 3b), 25 identifioitiin seuraavasti: HRV14 identifioitiin EcoRI-kohtansa avulla. HRVlB:lla ja HRVlA:lla on kummallakin yksi BglII-kohta samassa paikassa; HinPI-kohdan mukanaolo HRVTA:ssa teki tällöin mahdolliseksi erottaa yksiselitteisesti kummatkin serotyypit.

30

Keksinnön mukaisesti on siten yllättäen mahdollista tyypittää myös tuntemattornia viruksia. Siten oli esimerkiksi mahdollista yksiselitteisesti tunnistaa HRV2, HRV4 9 ja HRV89 kuuden serotyypin läsnäolosta sokkokokeessa pilkkomalla BanII:lla ja 35 sen jälkeen HindIII:lla.

6 95398

Tietopankkien tutkiminen tosin osoitti, että keksinnön mukaiset primeerit soveltuvat myös kaikkien tyypin 1 ja 2 poliovi-ruskantojen RNA:n laajentamiseen, mutta vain tyypin 3 kannan 23127 (Cameron 1988). Lisäksi on tunnettua, että potilaat, 5 joille on annettu Sabin-rokotetta, erittävät poliovirusta nenän membraaneista; keksinnön mukaisessa tyypityskokeessa laajennettiin siten myös tyyppien 1 ja 2 RNA. Kun kuitenkin otetaan huomioon nuhavirusten ja poliovirusten väliset huomattavat erot, niin polioviruksella on tunnusomaisia restrik-10 tiokohtia, jotka eivät tee mahdolliseksi väärintulkintaa.

Primeerejä voidaan toisaalta myös kuitenkin käyttää edullisesti tutkittaessa U/C-vaihtumisen nopeutta polioviruksen asemassa 472. Tämän vaihtumisen on osoitettu olevan syynä virulenssiin ja siihen, että sitä esiintyy ihmisillä Sabin-15 kantojen yhteydessä (Cann et ai., 1984). Stringenteissä laajentamisolosuhteissa on odotettavissa, että koksakkia-virukset amplifikoituvat näiden primeerien kanssa.

Tämän nopean, keksinnön mukaisen menetelmän käytettävyys 20 virusten tyypitykseen tekee mahdolliseksi esimerkiksi kiertävien nuhavirusserotyyppien identifioinnin väestön keskuudessa ja helpottaa näin epidemiatutkimuksia. Jonkin viruksen läsnäolo määritetään siten, että nenän eritehuuhtelut viedään aina rutiinimaisesti HeLa-soluihin, mikä on välttämätöntä, jotta 25 jatkoanalyyseihin saataisiin riittävä määrä. Tässä kuvatuissa kokeissa tarvittava ainemäärä amplifikointikoetta varten on suuruudeltaan sama kuin mitä saadaan yhden Passage-tapahtuman jälkeen; kuitenkin on suositeltavaa käyttää suoraan nenän eritehuuhteluita, esimerkiksi Gama'n et ai. (1988) kuvaamalla 30 tavalla. Tässä käytetyillä primeereillä oli jopa mahdollista laajentaa RNA:n, joka oli eristetty yhdestä ainoasta plakis- * ta, cDNA. Pian ilmoitettiin, että oligonukleotidejä, jotka olivat komplementtisia nuhavirusten 5'-ei-koodaavien alueiden sekvenssien kanssa, voitiin käyttää osoittamaan yli 50 sero-35 tyypin nuhavirus-RNA nenän eritehuuhteissa (Bruce et ai., 1988). Tässä kuvattuja primeerejä on mahdollista käyttää samankaltaisessa hybridisointimäärityksessä herkkyyden paran- Λ IM » «III II i f» .f 7 95398 tamiseen ja jotta voitaisiin erottaa eri serotyypit toisistaan .

Yhteenvetona todettakoon: voitiin osoittaa, että PCR-reak-5 tiota voidaan käyttää yhdessä kahden primeerin kanssa laajentamaan erilaisten nuhavirusserotyyppien DNA-fragmenttia. Kohdistamalla näihin laajennettuihin fragmentteihin erilaisia spesifisiä restriktioentsyymejä voitiin sen jälkeen erottaa erilaiset serotyypit toisistaan. Esillä olevan keksinnön 10 kohteena on menetelmä, jolla voidaan tyypittää viruksia, joilla on eri serotyyppien kesken ryhmittymä konservoituneita sekvenssiblokkeja, erityisesti nuhaviruksia.

Aluksi on kuitenkin sekvensoitava tällaisten virusten, joilla 15 ei ole tunnettua restriktioentsyymikuviota, laajennetut DNA:t ja identifioitava serotyyppi vasta-aineiden avulla. Tällä tavoin on mahdollista koota luettelo esimerkiksi kaikkien nuhavirusserotyyppien restriktioentsyymikuvioista. Tämä katalogi voidaan säännöllisesti ja jatkuvasti saattaa ajan 20 tasalle ja joka ajan myötä tekee vasta-ainetyypityksen tarpeettomaksi. Tällä tavoin karakterisoitavissa olevia viruksia ovat esimerkiksi: HIV, suu- ja sorkkatautivirus, ekkoviruk-set, koksakkiavirukset.

25 Tämän katalogin ja keksinnön mukaisen menetelmän avulla on * ' siten mahdollista karakterisoida ja tyypittää virukset no peasti .

Esillä olevan keksinnön kohteena on siten virusten karakte-30 risointimenetelmä, tunnettu siitä, että a) Viruksen RNA muunnetaan cDNA:ksi, b) cDNA laajennetaan "Polymerase Chain Reaction"-reaktion . 35 avulla sekvenssi-identtiseltä alueelta saatujen primee- rien 1 ja 2 läsnäollessa, 8 95398 c) laajennettu DNA analysoidaan eri restriktioentsyymien avulla ja d) saatua restriktiokuviota verrataan tunnettujen virusten 5 restriktiokuvioon.

Yleisprimeeri 1 voidaan johtaa ensisijaisesti identtisen nukleotidin 1. hakassekvenssistä, primeeri 2 ensisijaisesti nuhavirusten 2. hakassekvenssistä. Keksinnön mukaisessa mene-10 telmässä käytetään ensisijaisesti vaiheessa a) primeeriä 2.

Keksinnön mukainen menetelmä sopii erityisesti nuhavirusten, ensisijaisesti ihmisen nuhavirusten karakterisoimiseen. Tällöin käytetään primeerinä 1 HRV2:n sekvenssin * 161-178 15 oligonukleotidejä ja primeerinä 2 HRV2:n sekvenssin * 531-544 kanssa komplementtisiä oligonukleotidejä.

Nuhavirusten karaketrisointiin ovat erityisen sopiviksi rest-riktioentsyymeiksi osoittautuneet Banll, Hindlll, RsaI, 20 EcoRI, Bill, PvuII, Drain ja HinPI.

Keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää virusten, erityisesti nuhavirusten, aivan erityisesti ihmisten nuhavirusten tyypittämiseen.

25 «

Piirustuksissa:

Kuvio 1: PCR-tuotteiden polyakryyliamidigeenianalyysi. Erät amplifikoitua cDNA:ta, joka saatiin RNAista, joka 30 oli eristetty raakalysaattipreparaateista (serotyy- pit IB, 2, 49, 70 ja 89) tai nuhaviruksella infek-toiduista HeLa-lysaateista (serotyypit IA ja 14). Serotyypit on annettu vyöhykkeiden yläpuolella; m: markkeri-DNA; c: kontrollit, joissa käytetty infek-35 toimattomista HeLa-soluista eristettyä RNAtta. Sekä kolmen markkerifragmentin että laajennetun fragmentin koot (emäspareina) on annettu.

Il 1 UI·» B.lli lii·* 9 95398

Kuvio 2: Ihmisen nuhavirusserotyyppien lähisukuisuus 5'-ei- koodaavilla alueilla.

a) HRV2 ja HRV49 5

Kuviossa on esitetty nukleotidin 241-490 HRV2-sek-venssi. Alapuolella on annettu tämän ja HRV49-sekvenssin (määritetty nukleotideistä vastaten 241:a -382:a) väliset erot.

10

b) HRV1A ja HRV1B

Kuviossa on annettu nukleotidin 203-412 HRVlB-sek-venssi. Alapuolella on annettu tämän ja HRVlA-sek-15 venssin (määritetty vastaavalta alueelta) väliset erot.

Viivalla on merkitty nukelotidin deleetio. Käytetyt restriktiokohdat on annettu.

20

Kuvio 3: Laajennetun DA:n restriktioentsyymillä pilkkomisel la saatujen fragmenttien polyakryyliamidigeeliana-lyysi.

25 A) Banll-positiiviset serotyypit B) Banll-negatiiviset serotyypit

Laajennetut DNA-fragmentit pilkottiin taulukossa 1 30 annetuille entsyymeille. Serotyypit ja entsyymit on . annettu yksittäisten vyöhykkeiden yläpuolella.

« ·

Lyhennykset: Ba: Banll; Bg: Bglll; Dr: Dralll; Ec: EcoRI; Hi: HinPI; Hd: Hindlll; Pv: PvuII; Rs: RsaI ; 35 m: markkeri. Markkerin koot on annettu emäspareina.

10 95398

Materiaalit ja menetelmät

Raakalysaatti-preparaattien valmistaminen HRV-kannoista 5 Kaikki virusserotyypit saatiin ATCCrlta ja plakki puhdistettiin HeLa-soluja (Ohio-kanta) viljeltiin 150 cm2 T-kolveissa ja infektoitiin HRV-kannoilla noin 1 MOI-kertoimella Skern'in et ai. (1984) kuvaamalla tavalla. Virusten määrä oli tavallisesti 109 PFU 30 mlrssa mediumia. Solut lyysattiin kahdella 10 pakastus/sulatussyklillä, minkä jälkeen alustasta poistettiin solujäännökset sentrifugoimalla alhaisella nopeudella. Virus väkevöitiin alustasta polyetyleeniglykoli 6000:11a (PEG) ja suspendoitiin uudelleen 1 ml:aan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta. Käytettäessä infektoituja HeLa-lysaatteja jätettiin 15 PEG-saostus pois.

Virus-RNA:n käänteistranskriptaasi RNA valmistettiin käsittelemällä 0,1 - 0,5 ml PEG-väkevöityä 20 virussuspensiota tai 0,5 ml väkevöimätöntä suspensiota 1 % SDS:11a ja 10 mM EDTA:lla. Fenoli/kloroformiuuton jälkeen lisättiin 2 μg kantaja-tRNA:a ja RNA saostettiin etanolilla. cDNA valmistettiin lisäämällä RNA-preparaatin koko määrään 10 pikomoolia primeeriä 2 ja 10 yksikköä käänteistranskrip-25 taasia (super RT, Anglian Biotechnology) 20 /il lopputilavuu-dessa valmistajan ohjeiden mukaan. Aluksi cDNA puhdistettiin uuttamalla fenolilla ja kloroformilla ja saostamalla etanolilla; myöhemmissä kokeissa PCR (Polymerase Chain Reaction)-reaktiossa käytettiin suoraan cDNA-seosta.

30 .: "Polymerase Chain Rection" "Polymerase Chain Reaktion" (PCR) suoritettiin 50 /il kokonaistilavuudessa käyttämällä 100 pikomoolia primeeriä 1 ja 35 primeeriä 2, 0,4 mM kutakin neljää dNTP:a, 2 yksikköä Thermus aquaticus DNA-polymeraasia (Cetus) Cetus Corp.-yhtiön pusku-.. rissa ja Torgersen'in et ai. (1989) kuvaamaa laitetta 30 ίΐ . sai a;iu liist i 1X 95398 syklin verran säätöjen ollessa 92°C (2 min.), 40°C (3 min.) ja 70°C (3 min.). 10 μΐ reaktioseosta analysoitiin suoraan 6-prosenttisella polyakryyliamidigeelillä (Maniatis et ai., 1982). Restriktioanalyysit suoritettiin laajennetun DNA:n 5 erissä käyttämällä taulukossa 1 annettuja entsyymejä; tuotteet analysoitiin 6-prosenttisella polyakryyliamidigeelillä.

Sekvensointiin käytettiin Sanger'in dideoksisekvensointi-menetelmää (Sanger et ai., 1977). PCR-reaktion jälkeen saatu 10 kaksijousteinen DNA elektroeluoitiin polyakryyliamidigeelistä ja sekvensoitiin valmistajan ohjeiden mukaisesti käyttämällä primeerejä 1 ja 2 ja modifoitua T7-polymeraasia (Pharmacia). DNA-sekvenssien tietokoneanalyysi suoritettiin käyttämällä Isono'n modifioitua Staden-ohjelmaa (Isono, 1982).

15

Tulokset HRV1B:n (Hughes et ai., 1988), HRV2:n (skern et ai., 1985) ja HRV89:n (Duechler et ai., 1987) nukleotidisekvenssien vertai-20 lu osoitti nukleotidien φ 161 ja 181 tai Φ 531 ja 553 (numerointi HRV2:n mukaisesti, Skern et ai., 1985) välisten alueiden olevan identtisiä. Näillä neljällä serotyypillä on yllättäen merkittviä eroja identtisten hakassekvenssien näiden alueiden välillä. Näistä johtuvia jokaisen serotyypin rest-25 riktiokuvioiden tunnusomaisia eroja, joita on myös näistä alueista lähtevissä laajennetuissa fragmenteissa, käytetään keksinnön mukaisesti keksinnön tavoitteena olevan tehtävän ratkaisemiseen. Tätä varten syntetisoitiin kaksi primeeriä: oligonukleotidiprimeeri 1 (sekvenssi * 161-178: CAAGCACT-30 TCTGTTTCCC ja oligonukleotidiprimeeri 2 (komplementtinen . . * 531-544 kanssa; ACTACTTTGGGTGT). cDNA valmistettiin virus- . :\ RNA:sta ja laajennettiin edellä kuvatulla tavalla käyttämällä primeerejä 1 ja 2.

35 Kuviossa 1 on esitetty polyakryyliamigeelianalyysi amplifi- kointikokeessa, jossa käytettiin 7 erilaista HRV-serotyyppiä. Kaikissa tapauksissa muodostettiin lähes 380 bp DNA-fragment - 12 95398 ti (joka vastaa kummankin primeerin välistä etäisyyttä). Näin voitiin osoittaa, että primeerit kykenevät sitoutumaan myös cDNA:aan sekä HRVlA:aan ja myös HRV49:aan ja HRV7Oraan, mikä viittaa siihen, että vastaavat sekvenssit ovat mukana myös 5 näissä serotyypeissä. Koska käytettävissä ei ollut mitään sekvenssi-informaatiota HRVIArsta, HRV49:sta ja HRV70:sta, DNA-sekvenssi määritettiin HRV1A:n ja HRV49:n laajennetuista fragmenteista, jotta saataisiin selville, onko mukana tunnusomaisia restriktiokohtia. HRV49:n sekvenssille saatiin 10 241 bp ja HRV1A:lie 210 bp. Tietokoneanalyysi osoitti, että HRV49:n sekvenssi on hyvin lähellä HRV2:n sekvenssiä ja HRV1A:n sekvenssi HRV1B:n sekvenssiä (HRV49-sekvenssin tarkkuuden parantamiseksi sekvensointireaktiot suoritettiin käyttämällä primeeriä 1 ja 2 plasmidissa, joka sisältää HRV2:n 15 5'-ei-koodaavan alueen, jolloin erot ovat todettavissa yk siselitteisesti). HRV2:n ja HRV49:n sekvenssien sekä HRV1A:n ja HRV1B:n sekvenssien väliset erot on esitetty kuvioissa 2A ja 2B. HRV2:n ja HRV49:n välillä voitiin 241 sekvenssoidun emäsparin sisällä havaita yhteensä 15 emäksen vaihtumista ja 20 2 deleetiota. 210 bp sekvenssissä, joka analysoitiin HRV1A:sta ja HRV1B:sta, voitiin havaita 9 emäksen vaihtumista ja 1 insertio. Nämä muutokset johtivat kummassakin tapauksessa yhden restriktiokatkaisukohdan muodostumiseen tai häviämiseen (kuten kuviossa 2 on esitetty) HRV2:n suhteen HRV49:ssa 25 menetettiin yksi Hindlll-kohta ja saatiin yksi Dralll-kohta). Tämän amplifikointikokeen avulla voitiin myös osoittaa, että jokaiselle serotyypille voidaan valita tunnusomaiset kat-kaisukohdat.

30 Keksinnön mukaisen tavoitteen saavuttamiseksi valittiin sel-·: laisia restriktioentsyymejä, joilla voitiin serotyypit tun- :' nistaa varmuudella; taulukossa 1 on esitetty valitut entsyy mit ja fragmenttikohdat. HRV1A:n ja HRV49:n suhteen voitiin todeta, että tuntemattomalla alueella ei ollut muita kohtia 35 vastaaville entsyymeille. DNA-fragmenttien vertailu osoitti, että HRV2:n, HRV49:n ja HRV89:n fragmenteilla on Banll-ent-.. syymillä yksi katkaisukohta (kuvio 3a), mutta HRV1A:n, 95398 13 HRVlB:n ja HRV14:n fragmenteille ei lainkaan (kuvio 3b). Tätä entsyymiä käyttämällä voidaan serotyypit jakaa ensisijaisesti kahteen ryhmään: serotyyppien tunnistamisen yksinkertaistamiseksi pilkottiin kunkin serotyypin laajennetut fragmentit 5 Banll:11a ja tuotteet analysoitiin polyakryyliamidigeeleillä. Kuten kuviossa 3a on osoitettu, näiden serotyyppien identifioinnin mahdollistavat myös eripituiset fragmentit, jotka saatiin HRV2:lla ja HRV89:lla. Tunnusomaiset HRV2:n HindHI-kohta ja HRV89:n Rsa-kohta vahvistivat identifioinnin (96 bp 10 RsaI-fragmenttia ei voitu nähdä tällä geelillä liiallisen heikkoutensa vuoksi). HRV2 ja HRV49 voitiin erottaa toisistaan siitä, että HRV49:ssa ei ollut Hindlll-kohtaa.

Serotyypit, joilla ei ole yhtään BanXI-kohtaa (kuvio 3b), 15 voitiin identifioida seuraavasti: HRV14 tunnistettiin EcoRI-kohdasta (pilkkoutuminen oli osittaista). HRVlB:lla ja HRVlA:lla on kummallakin yksi Bglll-kohta samassa paikassa; kummankin serotyypin yksiselitteisen erottamisen mahdollisti tällöin yhden HinPI-kohdan läsnäolo HRVlA:ssa. Koska HinPI.

20 11a saatiin vain kaksi fragmenttia, kuviossa 2 merkattujen kohtien on oltava ainoita laajennetussa fragmentissa.

14 95398

Kirjallisuusviitteet

Bruce, C.B., Al-Nakib, W., Tyrell, D.A.J. ja Almond, J.W.

(1988). Synthetic oligonucleotides as diagnostic probes.

5 Lancet. 8601, 53.

Callahan, P.L., Mizutani, S. ja Colonno, R.J. (1985).

Molecular cloning and complete sequence determination of RNA sequence of human rhinovirus type 14. Proc. Natl. Acad.

10 Sei. U.S.A.. 82 732-736.

Cameron, G.N. (1988). The EMBL data library. Nucleic Acids Res. . 16, 1865-1867.

15 Cann, A., Stanway, G., Hughes, P.J., Evans, D.M.A.,

Schild, C.C. ja Almond, J.W. (1984). Reversion to neurovirulence of the live-attenuated Sabin type 3 oral poliovirus vaccine. Nucleid Acids Res.. 12. 7787-7792.

20 Cooney, M.K., Fox, J.P. ja Kenney, G.E. (1982).

Antigenic groupings of 90 rhinovirus serotypes. Infect.

Imm.. 37, 642-647.

Duechler, M., Skern, T., Sommergruber, W., Neubauer, Ch., 25 Gruendler, P., Fogy, I., Blaas, D. ja Kuechler, E. (1987).

Evolutionary relationships within the human rhinovirus genus; comparison of serotypes 89, 2 and 14.

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 84, 1605-2609.

30 Gama, R.E., Hughes, P.J., Bruce, C.B. ja Stanway, G.

·'. (1988) . Polymerase chain reaction amplification of rhino- • · ? virus nucleic acids from clinical material.

Nucleic Acids Res.. 16, 9346.

35 15 95398

Hamparian, V.V., Colonno, R.J., Cooney, M.K., Dick, E.C., Gwaltney, J.M. , Jr. Hughes, J.H., Jordan, W.S., Kapikian, A.Z., Mogabgab, W.J., Monto, A., Philips, C.A., Riickert, 5 R.R.,Schieble, J.H., Stott, E.J. jaTyrell, D.A.J., (1987).

A collaborative report: Rhinoviruses - Extension of the numbering system from 89 to 100. Virology, 159, 191-192.

Hughes, P.J., North, C., Jellis, C.H., Minor, P.D. ja 10 Stanway, G. (1988). The nucleotide sequence of human rhino-virus IB: molecular relatioships within the rhinovirus genus. J. Gen. Virol., 69, 49-58.

Isono, K. (1982). Computer programs to analyse DNA and 15 amino acid sequence data. Nucleic._Acids_.—Res. , 10, 85 - 89.

Kellner, G., Popow-Kraupp, T., Kundi, M., Binder, C.,

Mallner, H., Kunz, C. (1988). Contribution of rhinovirus 20 respiratory infections in childhood: a prospective study in a mainly hospitalized infant population. J. Med. Virola, 25, 455-469.

Maniatis, T., Fritsch, F. ja Sambrook, J. (1982). Molecular 25 cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, New York.

Rivera, V.M., Welsh, J.D. ja Maizel, J.V. (1988). Comparative sequence analysis of the 5'non-coding region of enteroviruses 30 and rhinoviruses. Virology 165, 42-50.

Saiki, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Scharf, St.J., Higuchi, R., Horn, G.T., Mullis, K.B. ja Erliche, H.A.

(1988). Primer directed enzymatic amplification of DNA with 35 a thermostable DNA polymerase. Science 239, 487 - 491.

5 16 95398

Sanger, F., Nickley, S. ja Coulson, A.R. (1977). DNA sequencing with chan-terminating inhibitors. Proc. Natl.

Acad. Sei. U.S.A., 74, 5463-5467.

Skern, T., Sommergruber, W., Blaas, D., Pieler, Ch. ja Kuechler, D. (1984) . Relationship of human rhinovirus strain 2 and poliovirus as indicated by comparison of the polymerase gene regions. Virology 136, 125-132.

10

Skern, T., Sommergruber, W., Blaas, D., Grunedler, P., Fraundorfer, F., Pieler, Ch., Fogy, I. ja Kuechler, B.

(1985). Human Rhinorivus 2: complete nucleotide sequence and proteolytic processing signals in the capsid protein region.

15 Nucleic Acids Res.. 13, 2111-2126.

Stanway, G., Hughes, P.J., Mountford, R.C., Minor, P.D. ja Almond, J.W. (1984) . The complete nucleotide sequence of a common cold virus: human rhinovirus 14. Nucl. Acids. Res..

20 12, 7859-7875.

Stott, E.J. ja Killington, R.A. (1972). Rhinoviruses. Ann.

Rev. Microbiol.. 26, 503-525.

25 Torgersen, H., Blaas, D. ja Skern, T. (1989). Low cost apparatus for primer-directed DNA amplification. Anal.

Biochem.. 176, 33-35.

» · • · • · !1 lit 1 III I! I I I SI i 17 95398

Taulukko 1:

Nuhavirus-serotyyppien identifioinnissa käytetyt restrik-tiokohdat. Luvut tarkoittavat emäspareja. Viiva merkitsee 5 sitä, että kyseiselle entsyymille ei ole yhtään restriktio-kohtaa. Nu tarkoittaa sitä, että restriktiokohta tosin oli mukana, mutta sitä ei käytetty.

Serotyyppi 10 HRV1A HRV1B HRV2 HRV14 HRV49 HRV89

Ban II - - 255 - 255 298

Bgl II 281 281 - 106 106 15 Dra III - 212 172

Eco Rl 215 165

Hin PI 208 - NU - NU - 20 179

Hind III - - 297 87

Pvu II NU 260 127 25 Rsa NU - NU 294 94 • ·

Claims (2)

95398

1. Menetelmä ihmisen nuhaviruksen serotyypittämiseksi, tunnettu siitä, että: 5 a) tehdään tyypitettävästä ihmisen nuhaviruksen RNA sekvenssistä cDNA-kopio; b) saatu cDNA PCR-monistetaan ensimmäisellä primeerillä CAAGCACTTCTGTTTCCC ja toisella primeerillä ACACCCAAAG-TAGT 10 c) pilkotaan mainittu cDNA ja restriktioanalysoidaan mainitut pilkotut cDNA-fragmentit, jolloin restriktio-analyysiin kuuluu yhden tai useamman restriktioentsyy-mien käyttö, joka on valittu ryhmästä, johon kuuluu Banll, Hindlll, RsaI, EcoRI, Bglll, PvuII, Dralll ja

15 HinPI yhdistelmänä mainittujen pilkottujen cDNA-frag menttien kanssa restriktiokartan muodostamiseksi; ja d) verrataan mainittua restriktiokarttaa ainakin yhteen toiseen ihmisen nuhaviruksen restriktiokarttaan mainitun ihmisen nuhaviruksen serotyypin määrittämiseksi. 20

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet -t u siitä, että ihmisen nuhavirus on valittu ryhmästä, jonka muodostaa: HRV1A, HRV1B, HRV2, HRV14, HRV49 ja HRV89. 25 1 Il I· t lilli I I ( *1 . · 19 95398