JPWO2011043220A1

JPWO2011043220A1 - 融合遺伝子の測定方法

Info

Publication number: JPWO2011043220A1
Application number: JP2011535352A
Authority: JP
Inventors: 和也小見
Original assignee: Fujirebio Inc
Current assignee: Fujirebio Inc
Priority date: 2009-10-06
Filing date: 2010-09-28
Publication date: 2013-03-04
Also published as: US20120202214A1; WO2011043220A1; EP2487250A4; EP2487250A1

Abstract

要約未知の融合遺伝子をも網羅してあらゆる融合遺伝子の存在を簡易迅速に検出できる手段が開示されている。本発明の融合遺伝子の測定方法は、生体から分離された試料に対して行なう方法であって、該生体内に存在し得る融合遺伝子を構成する一方の遺伝子について、遺伝子の融合点よりも上流の5'領域及び下流の3'領域の発現をそれぞれ測定し、5'領域の発現と3'領域の発現とを対比することを含む。測定対象となる融合遺伝子は、例えば、ＡＬＫ遺伝子と他の遺伝子の融合遺伝子である。

Description

本発明は、生体内に存在し得る融合遺伝子の測定方法に関する。

癌患者の一部では、融合遺伝子が癌の原因となることが知られている。例えば、受容体型チロシンキナーゼの一つである未分化リンパ腫キナーゼ(Anaplastic Lymphoma Kinase; ALK)遺伝子は、様々な遺伝子と融合することで発がん性を発揮することが知られている（非特許文献５）。

EML4-ALK融合遺伝子は、棘皮動物微小管付随タンパク質様タンパク質4(Echinoderm Microtubule-associated protein-Like 4; EML4)遺伝子の5'側の一部とALK遺伝子の3'側領域が融合した遺伝子であり、一部の非小細胞性肺癌の原因となることが知られている（特許文献１、非特許文献１）。EML4-ALK融合遺伝子を検出する方法としては、EML4-ALK融合遺伝子mRNAをRT-PCR法により増幅する方法が報告されている（非特許文献２）。

EML4-ALK融合遺伝子においては、遺伝子の融合部位の違いにより、少なくとも9種類の異型遺伝子の存在が知られている(非特許文献３)。そのため、全ての融合遺伝子の発現を効率よく簡易に検出するためには、公知の方法では多数のプライマーおよびプローブを用いた複雑なマルチプレックス化が必要となり、多大なコスト、手間がかかってしまうという問題がある。また、ALK遺伝子の融合パートナーとしてはEML4遺伝子以外にも複数の遺伝子が報告されており(非特許文献４、非特許文献５)、今後も新たな融合遺伝子が見出される可能性が高い。各融合遺伝子に特異的なプライマーまたはプローブを設定する公知の方法では、具体的に配列が同定されていない未知の融合遺伝子の検出は不可能である。

特開２００８−２９５４４４号

Nature 2007; 448:561-566 Clin. Can. Res. 2008; 14:6618-6624 J. Clin. Oncol. 2009; 27:1-4 Clin. Can. Res. 2009; 15:3143-3149 Biochem. J. 2009; 420:345-361

従って、本発明の目的は、未知の融合遺伝子をも網羅できる簡易な融合遺伝子検出系を提供することにある。

本願発明者は、鋭意研究の結果、EML4-ALK融合遺伝子の本質が「X（任意の遺伝子）＋ALK遺伝子の3'領域（キナーゼドメインを含む）」であることに着目し、融合点を境にしてALK遺伝子の5'側の領域及び3'側の領域の発現量を測定することで、融合パートナーの種類を問わず、あらゆる融合遺伝子の存在を簡易迅速に検出できることを見出し、さらに、５０種以上のプライマーセットを検討して、内部標準も含めて同時増幅が可能で且つ非特異増幅の少ないプライマーの組み合わせも見出し、本願発明を完成した。

すなわち、本発明は、生体から分離された試料に対して行なう方法であって、該生体内に存在し得る融合遺伝子を構成する一方の遺伝子について、遺伝子の融合点よりも上流の5'領域及び下流の3'領域の発現をそれぞれ測定し、5'領域の発現と3'領域の発現とを対比することを含む、融合遺伝子の測定方法を提供する。また、本発明は、配列表の配列番号３及び４にそれぞれ示される塩基配列から成る5'領域検出用プライマーセットと、配列番号５及び６にそれぞれ示される塩基配列から成る3'領域検出用プライマーセットとを含む、ＡＬＫ遺伝子と融合した融合遺伝子の検出試薬を提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号３及び４にそれぞれ示される塩基配列から成る5'領域検出用プライマーセットと、配列番号２０及び２１にそれぞれ示される塩基配列から成る3'領域検出用プライマーセットとを含む、ＡＬＫ遺伝子と融合した融合遺伝子の検出試薬を提供する。

本発明により、生体内に存在し得る融合遺伝子を融合パートナーの種類にかかわらず網羅的に検出できる新規な方法が提供された。本発明の方法によれば、わずか2箇所の遺伝子領域の発現量を測定することで、あらゆる融合パートナーとの融合遺伝子を検出することが可能となり、様々な種類の融合遺伝子の検出にかかっていた手間とコストを大幅に軽減できる。例えば、ALK遺伝子の融合遺伝子には、ALK遺伝子のキナーゼドメインを含む3'側領域とEML4遺伝子等との融合遺伝子が知られているが、本発明の方法によれば、ALK遺伝子のうちの上流側の領域が失われている融合遺伝子であればいかなるものでも検出できるため、未だ具体的に存在が同定されていない新規な融合遺伝子についても検出可能であり、この点も大きな利点である。とりわけ、本願発明者が完成した特定のプライマーセットによれば、内部標準も含めてシングルチューブでPCRを実施でき、簡易迅速なALK融合遺伝子検出系として極めて有利である。EML4-ALK融合遺伝子等の融合遺伝子は、各種がん患者の一部において存在が認められており、このような融合遺伝子発現患者に対しては融合遺伝子産物の活性を阻害する阻害剤を処方することががんの治療上有用であり得る。本発明の方法により、がん患者由来の細胞、組織又は体液中での融合遺伝子の発現の有無を確認することで、阻害剤処方対象患者を選択することができるため、本発明の方法はとりわけがん治療の分野で有用である。

実施例１において、H2228細胞（EML4-ALK融合遺伝子陽性、ALK遺伝子陰性）、A549細胞（EML4-ALK融合遺伝子陰性、ALK遺伝子陰性）、SK-N-DZ細胞（EML4-ALK融合遺伝子陰性、ALK遺伝子陽性）から抽出したRNAサンプルについて、ALK遺伝子の5'領域と3'領域の発現を測定した結果である。実施例２において、H2228細胞、A549細胞、SK-N-DZ細胞性から抽出したRNAサンプルについて、ALK遺伝子の5'領域と3'領域および内部標準遺伝子TBP遺伝子を同時に増幅、電気泳動した結果である。実施例３において、H2228細胞、A549細胞、SK-N-DZ細胞性から抽出したRNAサンプルについて、ALK遺伝子の5'領域と3'領域および内部標準遺伝子TBP遺伝子を同時に増幅し、増幅産物を蛍光プローブにより測定した結果である。

本発明で測定対象となる融合遺伝子とは、同一染色体上又は異なる染色体間で転座（逆位も包含する）が生じ、ある遺伝子の一部が他の遺伝子の一部と融合して一つの遺伝子として存在するものである。通常であればある組織中では発現しないはずの遺伝子が、染色体の転座の結果、その組織中で発現できる他の遺伝子のプロモーター領域と融合して発現してしまい、しばしばがん等の各種疾患を生じることが知られている。公知の融合遺伝子の多くは、そのように、各種疾患との関連で異常遺伝子として同定されたものである。本発明で測定対象となる融合遺伝子も、それを構成する遺伝子の一方は、通常、正常組織では本来全長が発現しないが、融合によって該組織でその一部領域が発現可能になる遺伝子であり、この遺伝子の5'領域と3'領域の発現を測定する。もっとも、該遺伝子が正常組織で全長を発現していたとしても、後述する通り、5'領域と3'領域の発現量の比率により、融合遺伝子の発現の有無や発現量を調べることができるので、融合遺伝子の条件は上記に限定されない。

融合遺伝子の好ましい具体例としては、ALK遺伝子、ABL遺伝子、レチノイン酸受容体遺伝子、SSX遺伝子、AML1遺伝子等の遺伝子と他の遺伝子との融合遺伝子を挙げることができる。例えば、ALK遺伝子は、受容体型チロシンキナーゼをコードする遺伝子であるが、そのキナーゼドメインを含む3'側の領域が他の遺伝子の5'側の領域と融合した各種の融合遺伝子が公知であり、これらが発がん性を発揮することが知られている（非特許文献５等参照）。もっとも、本発明の範囲は、これらの具体例にのみ限定されず、がん等の各種疾患と関連性のある融合遺伝子の他、疾患との関連性のない各種の天然の融合遺伝子も包含される。

ALK遺伝子（配列番号１、GenBank NM_004304）は、ヒト第2番染色体上に存在する、29のエクソンから成る遺伝子であり、キナーゼドメインは4256nt〜5083nt（第4256番塩基〜第5083番塩基の意）である。配列番号１に示すALK遺伝子の各エクソン領域を下記表1に示す。ALK遺伝子と他の任意の遺伝子との融合遺伝子（以下、単に「ALK融合遺伝子」ということがある）としては、非特許文献５に記載されるように、各種の融合パートナーとの融合遺伝子が知られている。公知のALK融合遺伝子の一例を配列表の配列番号９〜１８に示す。配列番号９〜１７がEML4-ALK融合遺伝子の塩基配列であり、配列番号１８がKIF5B-ALK融合遺伝子の塩基配列である。これらのALK融合遺伝子は、ALK遺伝子のキナーゼドメインを含むエクソン２０〜２９の領域が、他の遺伝子のプロモーター領域を含む5'側領域と融合しており、非小細胞性肺癌患者の一部において発現している。エクソン２０の5'末端部が他の遺伝子と融合しているもののほか（配列番号９〜１２、１４、１８）、隣接するイントロン領域が数十bp程度付加された状態で融合しているもの（配列番号１５、１６）、エクソン２０の5'末端領域が数十bp〜百数十bp程度欠失した状態で融合しているもの（配列番号１３、１７）も知られている。上記に好ましい具体例として挙げたALK遺伝子以外の各遺伝子も、GenBank等のデータベースに登録され配列が公知であり、融合遺伝子の例も公知であるため、当業者であればALK融合遺伝子と同様に本発明の方法を適用できる。

本発明の方法では、融合遺伝子を構成する一方の遺伝子にのみ着目し、該遺伝子の融合点よりも上流の5'領域及び下流の3'領域の２箇所の発現を測定する。本明細書において、5'領域及び3'領域を測定すべき、融合遺伝子を構成する一方の遺伝子を、便宜的に「対象遺伝子」と呼ぶことがある。なお、「測定」には、検出、定量、半定量が包含される。

ここで、「融合点」とは、融合により失われる領域と融合遺伝子中に含まれる領域との境界部分をいい、融合遺伝子中にあっては異なる2つの遺伝子が融合している境界部分ということもできる。例えば、配列番号９〜１２、１４、１８に示すALK融合遺伝子の場合、ALK遺伝子中のエクソン２０の5'末端（すなわち配列番号１における4080nt）が融合点である。

測定する5'領域と3'領域は、それぞれ融合点よりも上流及び下流の領域から選択すればよい。ただし、公知のALK融合遺伝子が例示するように、融合点は必ずしも遺伝子中のただ１点にのみ限定されず、同じ遺伝子の組み合わせから成る同一の融合遺伝子のバリアント間でも数十塩基程度又はそれ以上その位置が相違し得る。従って、測定すべき5'領域は、公知の融合点のうちで最も5'側にある融合点よりも上流の領域から選択することが望ましく、3'領域についても同様に、公知の融合点のうちで最も3'側にある融合点よりも下流の領域から選択することが望ましい。そして、具体的に同定されていない未知のバリアントをも網羅する観点からは、これらの最も上流又は下流の融合点から十分に離れた領域、例えば200塩基程度、好ましくは500塩基以上離れた領域から選択することが好ましい。

例えば、融合遺伝子としてALK融合遺伝子を測定する場合、上記したように、公知のALK融合遺伝子の多くは、ALK遺伝子のエクソン20及びその下流の領域が融合パートナーと融合しているので、5'領域はALK遺伝子のエクソン19及びその上流側の領域内から選択し、3'領域はALK遺伝子のエクソン20及びその下流側の領域内から選択すればよい。そして、公知のALK融合遺伝子の中には、エクソン20のうちの5'末端側49bpまでが失われているものが存在するため（配列番号１３）、このバリアントの融合点である4129nt（配列番号１を基準とした位置。融合点の位置の表現については以下同様。）よりも下流側の領域から3'領域を選択することが望ましい。具体的には、5'領域として、ALK遺伝子（配列番号１）のうちの1nt〜4079nt内の領域、3'領域として4129nt〜6222nt内の領域を選択することが望ましい。また、未知のALK融合遺伝子の中には、エクソン20の5'末端側がより多く欠失しているものが存在する可能性も考えられるため、ALK融合遺伝子を網羅的に検出する観点からは、3'領域は、公知の融合点のうちで最も3'側にある融合点である4129ntの融合点から十分に離れた領域、例えば200bp程度以上、好ましくは500bp程度以上離れた領域であることが好ましい。また、3'領域は、ALK遺伝子のキナーゼドメインから選択することも好ましい。例えば、下記実施例では、5'領域として配列番号１の2486nt〜2629ntの領域、3'領域として配列番号１の4801nt〜4865ntもしくは4775nt〜4939ntの領域の発現をそれぞれ測定している。もっとも、本発明はこのような具体例に限定されない。

本発明で用いられる試料は、生体から分離されたタンパク質試料又は核酸試料であり、好ましくは核酸試料である。中でも、生体から採取された細胞、組織、血液等の試料から抽出された全RNA試料等のRNA試料であることが好ましい。RNA試料は、cDNAに逆転写して用いることができる。RNAの抽出やcDNAの合成はそれ自体周知の常法であり、市販のキットを用いて容易に行なうことができる。逆転写反応のプライマーにはランダムヘキサマーを用いることが望ましい。

5'領域及び3'領域の発現の測定は、例えば、タンパク質試料について、5'領域と3'領域をそれぞれ特異的に認識する抗体を用いて免疫測定することによっても実施し得るが、本発明では、RNA試料について、対象遺伝子から転写されるmRNA又はこのmRNAから合成されたcDNAの5'領域及び3'領域を測定することにより行なうことが好ましい。このようなmRNA又はcDNAの測定法としては、プライマーを用いた核酸増幅法、及びプローブを用いたハイブリダイゼーション法を挙げることができる。核酸増幅法としては、RT-PCR、リアルタイムPCRやNASBA法等を挙げることができる。ハイブリダイゼーション法としては、ノーザンブロット、in situハイブリダイゼーションの他、固相化プローブを用いたアレイ解析法等を挙げることができる。これらの手法自体は周知の常法であり、本発明ではいずれの手法を用いてもよい。なお、免疫測定それ自体や、所望の領域を特異的に認識する抗体の作製方法も、周知の常法である。

プライマー及びプローブとしては、対象とする5'領域及び3'領域のそれぞれに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドが用いられる。ここで、「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイズの条件下において、対象とするmRNA又はcDNAとのみハイブリダイズし、その他の核酸とは実質的にハイブリダイズしないという意味である。通常のハイブリダイズの条件下とは、通常のＰＣＲのアニーリングやプローブによる検出に用いられる条件下のことをいい、例えば、Taqポリメラーゼを用いたＰＣＲの場合には、50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 8.3〜9.0)、1.5mM MgCl₂といった一般的な緩衝液を用いて、54℃〜60℃程度の適当なアニーリング温度で反応を行なうことをいい、また、例えばノーザンハイブリダイゼーションの場合には、5 x SSPE、50％ホルムアミド、5 x Denhardt's solution、0.1〜0.5％SDSといった一般的なハイブリダイゼーション溶液を用いて、42℃〜65℃程度の適当なハイブリダイゼーション温度で反応を行なうことをいう。ただし、適当なアニーリング温度又はハイブリダイゼーション温度は、上記例示に限定されず、プライマー又はプローブとして用いるポリヌクレオチドのTm値及び実験者の経験則に基づいて定められ、当業者であれば容易に定めることができる。また、「実質的にハイブリダイズしない」とは、全くハイブリダイズしないか、するとしても対象領域にハイブリダイズする量よりも大幅に少なく、相対的に無視できる程度の微量しかハイブリダイズしないという意味である。そのようなポリヌクレオチドは、当業者であれば、公知の配列情報を参照して適宜設計し調製することができる。配列情報は、GenBank等のデータベースから容易に入手可能である。例えば、ALK遺伝子の塩基配列であれば、GenBankにアクセッション番号NM_004304で登録されており、本願配列表にも配列番号１として記載されている。

RT-PCR法およびリアルタイムＰＣＲによる測定法の具体的な例としては、下記実施例に記載される方法が挙げられる。すなわち、各種細胞から抽出したＲＮＡ試料からランダムヘキサマーを用いてｃＤＮＡを調製した後、該cDNAを鋳型とし、ALK遺伝子等の対象遺伝子の5'領域および3'領域をそれぞれ特異的に増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより、対象遺伝子の各領域の発現を測定することができる。リアルタイムPCRでは、蛍光標識プローブを用いた検出法も公知であり、増幅産物の泳動工程を省略してより簡便迅速な検出が可能になる。本発明でも、各領域の増幅断片に特異的にハイブリダイズする蛍光標識プローブを調製して用いることができる。5'領域と3'領域とで波長が異なる蛍光標識を用いれば、蛍光波長によって増幅断片を区別して測定できる。そのような蛍光標識プローブの調製も、当業者であれば容易に行なうことができ、その具体例が下記実施例に記載されている。ここで、「特異的に増幅する」とは、対象領域のみを増幅するか、あるいは対象外の領域も増幅するが、対象領域の増幅量と比較してごく微量であり、相対的に無視できる程度にしか増幅しないことを意味する。5'領域内に特異的にハイブリダイズするプライマーのセットは、5'領域を特異的に増幅するプライマーセットである。増幅するサイズは当業者が適宜選択することができるが、増幅時間の短縮化や泳動による分離等の観点から、通常は1000bp以下であり、好ましくは30bp〜500bp程度である。例えば、対象遺伝子がALK遺伝子の場合、プライマーセットの具体例を挙げると、5'領域を特異的に増幅するプライマーセットとしては配列番号３及び４に示すプライマーセット、3'領域を特異的に増幅するプライマーセットとしては配列番号５及び６に示すプライマーセットもしくは配列番号２０及び配列番号２１に示すプライマーセットが挙げられるが、これらに限定されない。また、蛍光標識プローブの具体例として、配列番号３及び４のプライマーセットと組み合わせて使用可能な配列番号１９に示す塩基配列から成るALK5'領域特異的プローブ、配列番号２０及び２１のプライマーセットと組み合わせて使用可能な配列番号２２に示す塩基配列から成るALK3'領域特異的プローブが挙げられるが、これらに限定されない。

核酸増幅法においては、１種類もしくは複数種類の内部標準遺伝子を測定してもよい。内部標準遺伝子としては、GAPDH遺伝子、ACTB遺伝子、HPRT1遺伝子、HMBS遺伝子、TBP遺伝子などが周知であり、本発明でもこれらを用いることができる。内部標準遺伝子についても蛍光標識プローブを調製して用いることができる。下記実施例ではTBP遺伝子を内部標準として用いており、そのためのプライマーセットの塩基配列は配列番号７及び８もしくは配列番号２３及び２４に示されているが、これらに限定されるものではない。また、TBP遺伝子特異的プローブの具体例として、配列番号２３及び２４のプライマーセットと組み合わせて使用可能な配列番号２５に示す塩基配列から成るプローブが挙げられるが、これに限定されない。

5'領域と3'領域の発現を測定した後、各領域の発現を対比する。リアルタイムPCRにより測定した場合には、内部標準遺伝子の発現量で標準化した対象遺伝子の各領域の発現量を対比すればよい。増幅産物を泳動して確認する場合には、バンドの有無又はシグナル強度を対比すればよい。試料が由来する生体組織又は細胞中で、対象遺伝子全長が発現している場合には、5'領域と3'領域の両者の発現が確認される。融合遺伝子のみが発現している場合には、5'領域の発現が確認されず、3'領域の発現のみが確認される。対象遺伝子全長が発現せず、且つ融合遺伝子も発現していない場合には、5'領域及び3'領域いずれも発現が確認されない。対象遺伝子全長及び融合遺伝子の両者が発現している場合には、5'領域と3'領域の両者の発現が確認されることになるが、対象遺伝子全長のみが発現している場合と比較して3'領域の発現量が多くなる。このような場合には、例えば、対象遺伝子全長を発現し、融合遺伝子を発現していない組織や細胞から得た試料をコントロールとして同時に測定し、該コントロール試料での5'領域発現量と3'領域発現量の比率を求め、この比率と試料における発現量の比率とを対比すると、融合遺伝子の発現をより詳細に確認できる。そのようなコントロール試料は、当業者であれば公知の情報に基づいて容易に準備することができる。例えば、ALK遺伝子の場合、ALK遺伝子全長のみを発現し、ALK融合遺伝子を発現しない細胞株として、SK-N-DZ細胞などの細胞株が知られている。以上のように、対象遺伝子の5'領域及び3'領域の発現の有無又は発現量の比率に基づき、融合遺伝子の発現を測定することができる。

例えば、ヒトの肺ではALK遺伝子全長は発現していないが、一部の非小細胞性肺癌患者において、肺癌細胞中でALK融合遺伝子が発現していることが知られている。従って、肺癌患者から採取した肺生検試料から抽出したRNA試料を用いて本発明の方法を実施した場合には、5'領域の発現の有無で融合遺伝子の発現を検出可能である。すなわち、この場合、3'領域の発現のみが認められ、5'領域の発現が認められない患者では、ALK融合遺伝子が存在し発現していると判断できる。血液試料（全血、血清又は血漿）から抽出したRNA試料を用いた場合でも、5'領域及び3'領域の発現の有無又はその比率に基づいて、ALK融合遺伝子を検出することができる。ALK融合遺伝子を発現する肺癌患者では、ALK阻害剤の処方が癌の治療上有用であり、本発明の方法を用いれば、ALK阻害剤の処方対象となる患者を選択することができる。肺癌に限らず、ALK融合遺伝子は各種がんとの関連が知られており、肺癌以外の各種がんでもALK阻害剤の処方が有用であるため、本発明の方法は肺癌以外のがんについても同様に有用である。また、ALK融合遺伝子以外にもがんとの関連が知られている遺伝子が存在し、同様にがん治療のために阻害剤処方が有用であることが知られているので、ALK融合遺伝子以外の融合遺伝子が関連するがんについても同様に有用である。

下記実施例で用いられているALK遺伝子5'領域増幅用プライマーセット（配列番号３、４）及び3'領域増幅用プライマーセット（配列番号５、６もしくは配列番号２０、２１）からなる2組のプライマーセットは、ALK融合遺伝子の検出試薬として特に有用である。該試薬は、プライマーのみから成るものであってもよいし、プライマーの安定化等に有用な各種添加剤等を含んでいてもよい。該試薬はまた、内部標準用プライマーセットをさらに含んでいてもよい。さらにまた、該試薬は、リアルタイムPCR用の蛍光標識プローブをさらに含んでいてもよい。プライマーセット及び蛍光標識プローブについての条件は上記した通りである。とりわけ、上記した2組のプライマーセットと、配列番号７、８もしくは配列番号２３、２４に示す内部標準用プライマーセットとの３組の組み合わせは、本願発明者が50種以上のプライマーセットについて実験を行ない、同時増幅が可能で且つ非特異増幅の少ないものとして選択された好ましい組み合わせであり、この3組の組み合わせによるととりわけ簡便にALK融合遺伝子の存在を検出可能である（下記実施例参照）。

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

実施例１：ＲＮＡサンプルの調製および解析１
H2228細胞（ヒト肺癌由来細胞株、ATCC）、A549細胞（ヒト肺癌由来細胞株、ATCC）、SK-N-DZ細胞（ヒト神経芽腫由来細胞株、ECACC）を２００００細胞／ｃｍ^２の細胞密度となるように６穴培養プレートの培養容器に播種し、2日間培養してサンプルとした。サンプルからのRNA抽出は、市販のRNA抽出キット（Rneasy mini kit、キアゲン社）を用いてマニュアルに従い実施し、RNAサンプルを得た。抽出したRNAサンプルをＲＴプライマー（ランダムヘキサマー、インビトロジェン社）およびSuper Script II逆転写酵素（インビトロジェン社製）にてＤＮＡに逆転写し、ｃＤＮＡサンプルを得た。

このｃＤＮＡサンプル中に含まれるALK遺伝子の5'領域、3'領域および内部標準遺伝子としてTBP遺伝子をSYBR Green Realtime PCR Master Mix -Plus- （東洋紡社製）を使用したリアルタイムＰＣＲ法にて測定した。プライマーは以下のものを使用した。反応条件は、９６℃１２０秒の熱変性後、９６℃１０秒−アニーリング６０℃３０秒−伸長７２℃３０秒のサイクルとし、サイクル数はリアルタイムPCRをモニターして適宜決定した。プライマーは以下のものを使用した。反応液の組成は、各プライマーを０．８μMの濃度で使用した他は、キットに添付のバッファー等を添付の指示書に従って用いた。
ALK5'領域：
フォワード（cccgcttctgaaagtgctac、配列番号３）、リバース（cccggttttgttctccacta、配列番号４）
ALK3'領域：
フォワード（agaggccttcatggaaggaa、配列番号５）、リバース（atagcagcactccaaaggac、配列番号６）
TBP遺伝子：
フォワード（ccaaggaattgaggaagttgc、配列番号７）、リバース（gtgccataaggcatcattgg、配列番号８）

結果を図１に示す。TBP遺伝子発現量で標準化したALK遺伝子の発現量について、SK-N-DZ細胞における発現量を100%としたときの相対値を示した。SK-N-DZ細胞由来のcDNAサンプルでは、ALK5'領域およびALK3'領域の存在が確認された。即ち、正常な融合していないALK遺伝子のみが存在することを意味する。H2228細胞由来ではALK3'領域のみ存在が確認された。即ち、ALK5'領域は発現しておらず、融合したALK3'領域のみが発現していることを意味する。この結果は、ALK遺伝子の5'領域および3'領域の存在を測定することで、EML4-ALK融合遺伝子の存在が簡易に検出可能であることを示している。

実施例２：ＲＮＡサンプルの調製および解析２
実施例１と同様に各細胞由来のcDNAサンプルを得た。このｃＤＮＡサンプル中に含まれるALK遺伝子の5'領域、3'領域および内部標準遺伝子としてTBP遺伝子をTITANIUM Taq DNA polymerase（タカラバイオ社製）を使用したマルチプレックスＰＣＲ法にて増幅、電気泳動を実施した。プライマーは実施例１と同様のものを使用した。ＰＣＲの反応条件は、９６℃１２０秒の熱変性後、９６℃１５秒−６８℃６０秒を３５サイクルとした。反応液の組成は、各プライマーを０．８μMの濃度で使用した他は、ポリメラーゼに添付のバッファー等を添付の指示書に従って用いた。

結果を図２に示す。SK-N-DZ細胞由来のcDNAサンプルでは、ALK5'領域およびALK3'領域の増幅が確認されたが、H2228細胞ではALK3'領域のみ増幅が確認された。また、すべてのcDNAサンプルで内部標準TBP遺伝子の増幅が確認された。この結果は、ALK遺伝子の5'領域、3'領域および内部標準遺伝子の存在を測定することで、EML4-ALK融合遺伝子の存在を簡易に検出可能であることを示している。

実施例３：
実施例１と同様に各細胞由来のＲＮＡサンプルを得た。このRNAサンプル中に含まれるALK遺伝子の5'領域、3'領域および内部標準遺伝子としてTBP遺伝子をTITANIUM One-Step RT-PCR Kit（タカラバイオ社製）を使用したOne-Step リアルタイムＰＣＲ法にて測定した。プライマーおよび各増幅産物を特異的に検出するプローブは以下のものを使用した。各プローブは、それぞれ３'末端に異なる３波長を有した蛍光物質が標識されており、公知であるグアニン塩基による蛍光消光反応により、増幅産物の存在量を測定可能である。反応条件は、５０℃ １時間、９６℃１２０秒の熱変性後、９６℃１０秒−アニーリング６０℃３０秒−伸長７２℃３０秒のサイクルとし、サイクル数はリアルタイムPCRをモニターして適宜決定した。反応液の組成は、各プライマーを０．８μM、各プローブを０．１μMの濃度で使用した他は、キットに添付のバッファー等を添付の指示書に従って用いた。
ALK5'領域：
フォワード（cccgcttctgaaagtgctac、配列番号３）、リバース（cccggttttgttctccacta、配列番号４）、プローブ（tctccatgtgagctccgaatgtcc、3'末端のシトシン塩基にTAMRA修飾、配列番号１９）
ALK3'領域：
フォワード（atgctgccagttaagtggatg、配列番号２０）、リバース（actggtgacaaactccagaac、配列番号２１）、プローブ（tatgccataccccagcaaaagcaac、3'末端のシトシン塩基にBODIPY FL修飾、配列番号２２）
TBP遺伝子：
フォワード（cttggcgtgtgaagataacc、配列番号２３）、リバース（tgctgcctttgttgctcttc、配列番号２４）、プローブ（ccttacgctcagggcttggcctcc、3'末端のシトシン塩基に5-CR6G修飾、配列番号２５）

結果を図３に示す。TBP遺伝子の発現量およびALK5'領域およびALK3'領域の発現量について、SK-N-DZ細胞における発現量を100%としたときの相対値を示した。SK-N-DZ細胞由来のＲＮＡサンプルでは、ALK5'領域およびALK3'領域の増幅が確認されたが、H2228細胞ではALK3'領域のみ増幅が確認された。また、すべてのＲＮＡサンプルで内部標準TBP遺伝子の増幅が確認された。この結果は、ALK遺伝子の5'領域、3'領域および内部標準遺伝子の存在を測定することで、EML4-ALK融合遺伝子の存在をＲＮＡサンプルから直接に検出可能であることを示している。

Claims

生体から分離された試料に対して行なう方法であって、該生体内に存在し得る融合遺伝子を構成する一方の遺伝子について、遺伝子の融合点よりも上流の5'領域及び下流の3'領域の発現をそれぞれ測定し、5'領域の発現と3'領域の発現とを対比することを含む、融合遺伝子の測定方法。
融合遺伝子を構成する前記一方の遺伝子がＡＬＫ遺伝子である請求項１記載の方法。
前記5'領域がＡＬＫ遺伝子のエクソン1〜19内のいずれかの領域であり、前記3'領域がエクソン20〜29内のいずれかの領域である請求項２記載の方法。
前記5'領域は、配列番号１に示すＡＬＫ遺伝子配列の1nt〜4079ntの領域内のいずれかの領域であり、前記3'領域はＡＬＫ遺伝子配列の4129nt〜6222ntの領域内のいずれかの領域である請求項３記載の方法。
前記試料がＲＮＡ試料であり、前記発現の測定は、ＡＬＫ遺伝子から転写されたｍＲＮＡ又はこれから合成されたｃＤＮＡの5'領域及び3'領域を測定することにより行なわれる請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
5'領域を特異的に増幅するプライマーセットと、3'領域を特異的に増幅するプライマーセットとを用いたＲＴ−ＰＣＲにより行なわれる請求項５記載の方法。
配列表の配列番号３及び４にそれぞれ示される塩基配列から成る5'領域検出用プライマーセットと、配列番号５及び６にそれぞれ示される塩基配列から成る3'領域検出用プライマーセットとを用いる請求項６記載の方法。
配列番号７及び８にそれぞれ示される塩基配列から成る内部標準用プライマーセットをさらに用いる請求項７記載の方法。
前記生体ががん患者である請求項２ないし８のいずれか１項に記載の方法。
前記生体が肺癌患者である請求項９記載の方法。
配列表の配列番号３及び４にそれぞれ示される塩基配列から成る5'領域検出用プライマーセットと、配列番号５及び６にそれぞれ示される塩基配列から成る3'領域検出用プライマーセットとを含む、ＡＬＫ遺伝子と融合した融合遺伝子の検出試薬。
配列表の配列番号３及び４にそれぞれ示される塩基配列から成る5'領域検出用プライマーセットと、配列番号２０及び２１にそれぞれ示される塩基配列から成る3'領域検出用プライマーセットとを含む、ＡＬＫ遺伝子と融合した融合遺伝子の検出試薬。
配列番号７及び８にそれぞれ示される塩基配列から成る内部標準用プライマーセットをさらに含む請求項１１記載の試薬。
配列番号２３及び２４にそれぞれ示される塩基配列から成る内部標準用プライマーセットをさらに含む請求項１２記載の試薬。