JP6100685B2 - 血中dnaの定量的検出による悪性新生物の病勢の進行を評価する方法 - Google Patents
血中dnaの定量的検出による悪性新生物の病勢の進行を評価する方法 Download PDFInfo
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Description
本実施形態に係る悪性新生物を治療するための薬剤が投与されている被験者において、当該悪性新生物の病勢の進行を評価する方法は、上述したように、(1)前記被験者由来の血中DNAにおいて、正常なマーカー遺伝子を有するDNA分子に対する前記薬剤の活性化マーカーとなる活性化変異を有するDNA分子の割合を決定する工程と、(2)前記被験者由来の血中DNAにおいて、正常なマーカー遺伝子を有するDNA分子に対する前記薬剤の耐性マーカーとなる耐性変異を有するDNA分子の割合を決定する工程と、(3)前記(2)の工程で得た値と、前記(1)の工程で得た値とを比較することによって、前記被験者における悪性新生物が前記薬剤での治療に対して耐性を得ているか否かを評価する工程と、を有することを特徴とするものである。
例えば、以下においては非小細胞肺癌患者を例として説明する。非小細胞肺癌は肺癌の一種であり、上皮成長因子受容体(epidermal growth factor receptor,EGFR)が関与していることが明らかになっている。EGFRとは、分子量約17万の膜貫通型糖タンパクであり、癌の増殖、維持に関与していることが明らかとなっており、非小細胞肺癌をはじめとして様々な癌でその発現が確認されている。EGFRは非活性化状態では一量体として存在するが、EGFなどの増殖因子が受容体に結合すると二量体を形成し、細胞内領域にあるチロシンキナーゼ部位においてATPを利用することで受容体細胞内領域のチロシン残基をリン酸化させる。その結果、シグナル伝達経路の下流に位置するタンパク質のチロシンリン酸化を連鎖的に引き起こし、増殖シグナルが核まで伝達することで細胞周期をG1期からS期へと進行させ細胞の増殖をもたらす。さらにEGFRチロシンキナーゼの活性化は、細胞内のTGF−α、bFGFなどの増殖因子の産生を亢進させ、自己分泌あるいは傍分泌経路により細胞の増殖を刺激するとともに、血管内皮細胞成長因子VEGFの産生を亢進して癌の血管新生を促進する。これら一連の変化により癌の悪性度が増し病勢の進行がもたらされると考えられている。
上述の通り、本発明の一実施形態において、非小細胞肺癌患者が有するEGFRにおけるゲフィチニブへの活性化変異と耐性変異とを定量的に分析することによって、当該患者の病勢の進行度を評価することが可能となる。また、本発明に係る方法の対象となる疾患は非小細胞肺癌に限られるものではなく、慢性骨髄性白血病/イマチニブ、肺癌(肺腺癌)/crizotinib等のように、特定の疾患に作用する薬剤が知られており、その疾患の原因遺伝子(又は活性化変異)と耐性変異が存在する任意の疾患において適用可能である。
本発明の一実施形態では、悪性新生物を治療するための薬剤が投与されている被験者において、当該悪性新生物の病勢の進行を評価する方法に使用されるキットであって、前記活性化変異を検出するために用いられるプライマーセットと、前記耐性変異を検出するために用いられるプライマーセットとを有することを特徴とする、キットが提供される。
(実験手法および材料)
以下に、本発明において用いる実験手法および材料について説明する。なお、本実施形態において、以下の実験手法を用いているが、これら以外の実験手法を用いても、同様の結果を得ることができる。
1−1.健常提供者及び肺癌患者の血漿からのDNAの抽出および精製
まず、4〜5mlの血液(スピッツ2本、EDTA入り)を、15mlの遠沈管に入れ、大型遠心機LX−120で800G×10分遠心した。遠心すると、血液が3層(血漿、白血球、赤血球)に分離するため、白血球を吸い込まないように血漿を2mlのエッペンチューブに回収した。次に、残った細胞成分を取り除くため、16000G×10分遠心した。そして、遠心後の上澄みを血漿サンプルとして回収した(1.2ml)。続いて、Agencourt Genfind V2を用いて血漿400ulに対して精製を行った。まず、Lysisバッファー液800μlにProteinase K18μlと血漿400μlとを加え、混合した。そしてこの混合液を37℃で10分間インキュベートした。次に、Binding bufferを600μl加え、十分にピペッティングし、その後、室温で5分間インキュベートした。そして、この溶液をマグネットにセットし、Wash Buffer 1で2回、及びWash Buffer 2で2回洗浄した。Wash Bufferを十分に取り除き、Elution Bufferを20μl加え、DNAを溶出した。
大阪府立成人病センター研究所に提供された肺癌組織検体を用いた。なお、これらの症例は以前の研究により、ダイレクトシークエンスあるいはSNaPshot反応を用いて、EGFRの代表的な変異(欠失変異、点変異(L858R、G719A、L861Q、T790M))を確認している。この肺癌サンプルからゲノムDNAの抽出を行った。まずLysis Buffer(50mM NaCl,20mM EDTA,10mM Tris−HCl pH7.5,0.2%SDS)1mL、Proteinase K(20mg/mL,Roche)10μLの溶液に入れられた凍結検体をMixer Mill MM 300(QIAGEN)で破砕し、さらにLysis Buffer 2mL、Proteinase K 20μLを加え、55℃で3時間撹拌した。次にPhenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1(nacalai tesque)を3mL加え、1時間室温で攪拌した後、2,500rpmで20分間遠心した。遠心後上層をとり、99.5%エタノール(Wako)7.5mL,10mg/mL glycogen(Invitrogen)5μLを加えて混合し、−20℃で一晩静置した後、3,500rpmで30分間遠心を行った。遠心後、上清を除いてペレットをD.W.300μLで溶出し、Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1(nacalai tesque)を等量加えて混合した後、13,000rpmで10分間遠心を行った。遠心後、上層をとり、Chloroformを等量加えて混合し、13,000rpmで10分間遠心を行った。遠心後、上層をとり99.5%エタノール(Wako)を2.5当量、3M NaOAcを1/10当量加えて混合し、15,000rpmで30分間遠心を行った。遠心後、上清を除き75%エタノールでペレットを洗浄後、上清を除き、10分間室温で乾燥させた。得られたペレットに10〜50μLのD.W.を加え、O.D.(260nm)に基づいてDNAの濃度を測定した。
BEAMingの定量性を確認するため、T790M mutant−typeであった肺癌サンプルを用いて、様々な割合でmutant−typeを含むテンプレートを作製した。まず凍結検体からTRIZOL(Invitrogen)を用いてAGPC法(32)によりtotalRNAを抽出した。このRNAからSuperscript III逆転写酵素(Invitrogen)、E.coli DNA polymerase (Invitrogen)を用いて2本鎖cDNAを合成し、Zero Blunt PCR cloning Kit(Invitrogen)によるクローニングを行った。その後シークエンスで各配列を確認することで、100%wild−type、100%mutant−typeのtemplate DNAを作製した。このDNAを鋳型としてPCRを行い、濃度を調整後種々の割合でサンプルを混合することでmutant−type 100%、10%、1%、0.1%、0.01%、0%のtemplate DNAを作製した。
3−1.標的領域の増幅
ゲノムDNAから目的allele部位を含む約100bpをPCRによって増幅した(図1A)。PCRに用いるプライマーは遺伝子特異的な配列に加えてその5’側にBEAMing共通に用いられるTag(Tag 1,5’−tcccgcgaaattaatacgac−3’(配列ID番号:1)、Tag 2,5’−gctggagctc−tgcagcta−3’(配列ID番号:2))を付けた配列で設計した(primer 1;5’−tcccgcgaaattaatacgacgcat−ctgcctcacctccac−3’(配列ID番号:3),primer 2;5’−gctggagctctgcagctatgcctccttctgcatggtat−3’(配列ID番号:4))。
まず、抽出したゲノムDNA 1.5μg(血漿の場合血漿300μL分)に、10×PCR buffer for KOD−plus−(TOYOBO)5μL、2mM dNTP(TOYOBO)5μL、25mM MgSO4(TOYOBO)2μL、KOD−plus−(TOYOBO)1μL、10pmol/μL primer 1,2mix 2μLを加え、全量が50μLになるようD.W.で調整した。Gene Amp PCR System 9700 Thermal Cycler(Applied Biosystems)を用いて94℃2分で変性させた後、94℃15秒、62℃10秒、68℃15秒を30サイクル、72℃5分のPCRを行った。得られたPCR産物をMinElute PCR Purification Kit(QUIAGEN)を用いて精製し、O.D.(260nm)に基づいて濃度を測定した。
streptavidinでコートされたビーズにエマルジョンPCR時にプライマーとなるdual biotinylated probeを結合させた(図1B)。このオリゴヌクレオチドにはその5’末端にPEG(polyethylene glycol)18 spacerとthymidine塩基を挟んで二重にbiotinを修飾した(Integrated DNA Technologies)。biotinとavidinの親和力は非常に強く、不可逆的な結合を形成するためビーズ表面上で数多くのプライマーを強固に結合させることが可能である。
WE09(Degussa)420μL、mineral oil(SIGMA−ALDRICH)1,200μL、DEC(Degussa)4,380μLをvortex mixtureで攪拌した後、室温で30分間静置した。
emulsifier−oilとPCR溶液で乳化した溶液中で、その水滴中に2−3−1で調整したPCR増幅産物一つ、2−3−2で調整したビーズ一個入るよう溶液を調整し、ビーズに結合させたDNAタグをプライマーとしてPCRを行った(図1C.D)。
ビーズに結合したDNA鎖に対して、文献に従い、二種類の配列特異的な蛍光標識法を検討した。
ビーズに結合したDNAのallele部位に対して一塩基伸長法(single base extension,SBE)で異なる蛍光を標識した。SBE法とは、対象とするallele部位に対して一塩基上流までの配列に相補的なプローブをハイブリダイズさせ、その後蛍光標識したddNTPをDNAポリメラーゼによる酵素反応によって取り込ませるという手法である(図2A)。この手法は配列特異性の高い酵素反応を用いるため、allele識別能が高くSNPタイピング技術などとして数多く用いられている。
ビーズに結合したDNAのallele部位に対して配列特異的ハイブリダイゼーション(allele specific hybridization,ASH)で異なる蛍光を標識した。ASH法はallele部位を中央に置いたオリゴヌクレオチドに対してそれぞれ異なった蛍光を5’末端に標識したプローブを作製し、ハイブリダイゼーションによって配列特異的に標的部位にプローブを結合させる手法である(図2B)。本研究ではmutant−type DNA配列に相補的なプローブ(mutant−type ASH probe;5’−atgagctgcatgatg−ag−3)(配列ID番号:9)にはAlexa647による蛍光修飾を、wild−type DNA配列に相補的なプローブ(wild−type ASH probe;5’−tgagctgcgtgatgag−3’)(配列ID番号:10)にはAlexa488による蛍光修飾を5’末端に行った(Gene design Inc.)。尚、プローブの塩基数は融解温度(Tm値)に基づいてそれぞれ17bp、16bpとした。ASH法は非酵素反応であるため、反応毎のばらつきが少なくその標識率も高いと考えられるが、SBE法に比べallele識別能が低くミスマッチでのハイブリダイゼーションも数多く反応すると考えられる。そこでプローブのallele部位に相補鎖認識能を向上させるlocked nucleic acid(LNA)を用いることとした。この2種の蛍光プローブに加えて、mutant−type、wild−typeの共通配列に相補的なプローブ(biotinylated probe;5’−cggacatagtccaggag−3’)(配列ID番号:11)を作製し、その5’末端にbiotinを修飾した(Gene design Inc)。
ビーズ懸濁液を5mL Polystyrene Round−Bottom Tube(BD Falcon(登録商標))に移し、TK bufferで希釈して全量を1mLとした。このビーズをFACSCalibur(BD Bioscience)によって解析した。ビーズの流速は概ね5,000events/sに設定し、個々のビーズを488nmアルゴンレーザーと635nm半導体レーザーのデュアルレーザーを用いた3カラーによる測定を行った。まずforward−scatter(FSC)とside−scatter(SSC)のシグナル(図3A)の値を基にsingle beadsのみを選択し、その中でPEのシグナルが検出されたビーズ(図3B)を解析に用いた。得られたデータはCELLQUEST software(BD Bioscience)によって解析した。サンプルにおけるmutant−typeの割合は、wild−typeのシグナルを検出したビーズとmutant−typeのシグナルを検出したビーズの個数から算出した。またビーズのソーティング操作に関しては FACSVantage SE(BD Bioscience)を用いて行った。
DNAとLNAの相補差認識能の比較を行うため、それぞれfullmatch配列とmismatch配列での融解温度(Tm値)を測定した。HPLC精製した互いに相補的な配列のオリゴヌクレオチド(一方に蛍光基修飾)を脱塩後、凍結乾燥し、それぞれを100μMになるように1×Hybridization bufferで溶解し、等量を混合してアニーリングした。アニーリングは、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動および低温(20℃)でのHPLC分析により確認した。その後、UV1650PC/TMSPC−8(島津)を用いて5℃から毎分1℃の割合で99℃まで昇温し、吸光度を測定した。Tm値は微分法により算出した。それぞれの配列は表2に示す。
シークエンス反応にはBig Dye Terminator ver.3.1(Applied Biosystems)を用い、その精製にはAgencourt CleanSEQ(BECKMAN COULTER)を用いた。各塩基配列はABI PRISM 3100 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)を用いて検出し、BioEdit Sequence Alignment Editorにより解析した。
以下に、上述した実験手法および材料を用いた本願発明に係る方法による悪性新生物の病勢の進行の評価を、図面を参照して説明する。
BEAMingの感度について評価するためT790M mutant−type 100%、10%、1%、0.1%、0.01%、0%のtemplate DNAを用いてBEAMingを行った。
本発明者らは、これまでの研究により、SBE法によるBEAMingを成功させている。その結果を図4に示す。BEAMingでは一つのビーズに一つのゲノム由来のPCR産物が結合している。すなわち、蛍光基によって配列分離されたビーズの個数の割合はサンプルに存在するそれぞれのアレル頻度と一致する。
これまでの研究から、SBE法ではビーズ上で蛍光基が取り込まれていないフラグメントが数多く存在することが明らかとなっている(図示せず)。これはBEAMingにおける反応は通常のDNAポリメラーゼの伸長反応と異なり固相上に固定された鋳型に対する反応となるためSBEの反応率が著しく低下することが原因の一つと考えられる。一方、ASH法は化学的な反応となるため、プローブを過剰に加えることによってプローブが結合する方向へ反応を傾けることが可能である。しかしハイブリダイゼーション時のプローブの結合力は配列や溶媒の塩濃度に強く依存するため、正確に蛍光を標識するためにはプローブの配列認識能を強くさせる必要がある。今回はプローブのallele識別部位にLNAを用いた。通常ヌクレオシドの糖部コンフォメーションはN型とS型の平衡状態で存在する。一般にRNA/RNA二重鎖はA型らせん構造をとり、その糖部は主にN型である。一方、DNA/DNA二重鎖はB型らせん構造をとり、糖部は主にS型で存在する。安定な二重鎖を形成させるためには、糖部コンフォメーションがN型あるいはS型で存在することが重要である。LNAは糖部2’位の酸素原子と4’位の炭素原子をメチレン架橋することにより、糖部コンフォメーションを厳密にN型に固定することで二重鎖形成能を大きく向上させた人工核酸アナログである。しかし今回用いるプローブはその5’末端に分子量600程度の異なる蛍光基が標識されているため、その立体障害から配列認識能が低下する可能性がある。そこで今回用いる蛍光プローブとその相補的なオリゴヌクレオチドを用いて、それぞれフルマッチ配列とミスマッチ配列での融解温度(Tm)を測定しその差からLNA導入によるallele識別能効果について評価した。Tm測定とは、温度上昇に伴う紫外部吸収の変化を測定したものでTm 値とは二重鎖DNAの半分が解離する温度であり二重鎖の安定性の指標となる。よってその差(ΔT)をとることで、ハイブリダイズ時の平衡の偏りを評価できる。Tm値測定の結果LNAにおけるΔT(ΔTLNA)とDNAにおけるΔT(ΔTDNA)では1.000℃の温度差が確認された。よってLNAが導入されたプローブは蛍光基が修飾された場合でもallele認識能を向上させることが明らかとなった(図5)。
本発明者らは、これまでの研究により肺癌原発巣263症例に対してダイレクトシークエンス、あるいはSNaPshot反応を行いEGFR遺伝子の代表的な変異(欠失変異、点変異(L858R、G719A、L861Q、T790M))を確認している。T790M変異はゲフィチニブ耐性変異、その他の変異はEGFR活性化変異として知られている。SNaPshot反応とは変異検出部位直前までに相補的なプライマーを設計し、蛍光標識したヌクレオチドをDNAポリメラーゼによる伸長反応で取り込ませた後、シークエンサーでその解析を行うという技術である。この手法はダイレクトシークエンスより感度良く検出可能であり、多数のサンプルを同時に処理できる。T790M変異陽性の症例に対して、BEAMingを用いてT790M変異の検出を行った。この解析ではPE positive beads 約500,000個を解析した。その実施例を図8に示す。
以上のように、BEAMingを用いることで血漿中DNAにおける活性化変異および耐性変異を定量的に検出し得ることがわかった。続いて、定量的に得られた活性化変異および耐性変異を用いた病勢の進行の評価を、図9〜図11を用いて説明する。
以上のように、BEAMingを用いることで血漿中DNAにおける活性化変異および耐性変異を定量的に検出することができ、さらに定量的に得られた活性化変異および耐性変異を用いて、患者における病勢の進行の評価ができることがわかった。続いて、BEAMingに替えて次世代シーケンサーを用いた場合の、活性化変異および耐性変異の定量的な検出、およびその定量的な割合に基づいた患者における病勢の進行の評価について説明する。
dH2O 60uL
10×KOD−plus−Buffer 10uL
2mM dNTPs 10uL
25mM MgSO4 4uL
PrimerMix(5uM each) 4uL
KOD−plus− 2uL
血漿DNA(血漿400ulに相当) 10uL
94dC 2分
94dC 15秒
62dC 30秒×40サイクル
68dC 50秒
16dC 保温
Claims (5)
- 悪性新生物を治療するための薬剤が投与されている被験者において、当該悪性新生物の病勢の進行を評価する方法であって、
(1)前記被験者由来の血中DNAにおいて、正常なマーカー遺伝子を有するDNA分子に対する前記薬剤の活性化マーカーとなる活性化変異を有するDNA分子の割合を決定する工程と、
(2)前記被験者由来の血中DNAにおいて、正常なマーカー遺伝子を有するDNA分子に対する前記薬剤の耐性マーカーとなる耐性変異を有するDNA分子の割合を決定する工程と、
(3)前記(2)の工程で得た値を前記(1)の工程で得た値で除算することによって、前記(2)の工程で得た値と、前記(1)の工程で得た値とを比較する工程と、
を有し、前記(3)の工程で得た値が0.0よりも大きくなる場合に、前記被験者における悪性新生物の病勢が進行していることを示すものであり、
前記被験者は非小細胞肺癌患者であり、前記薬剤はEGFR阻害剤であり、前記正常なマーカー遺伝子は正常EGFR遺伝子であり、前記耐性変異はEGFR遺伝子におけるT790Mであることを特徴とする、方法。 - 請求項1記載の方法において、
前記活性化変異は、EGFR遺伝子におけるΔE746−A750、L858R、G719C、G719S、及びG719Aから選択される1若しくはそれ以上の変異である
ことを特徴とする、方法。 - 請求項1記載の方法において、
前記EGFR阻害剤は、ゲフィチニブ又はエルロチニブである
ことを特徴とする、方法。 - 請求項1記載の方法において、
前記(1)及び(2)の工程は、エマルジョンPCRを用いて行われるものである
ことを特徴とする、方法。 - 請求項1記載の方法に使用するためのキットであって、
前記活性化変異を検出するために用いられるプライマーセットと、
前記耐性変異を検出するために用いられるプライマーセットと
を有することを特徴とする、キット。
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