JP6520705B2 - Ｅｇｆｒ阻害剤感受性予測方法 - Google Patents

Description

本発明は、被験者から低侵襲的に採取された生体サンプル中のＫＲＡＳ蛋白質の遺伝子型を調べることにより、当該被験者のＥＧＦＲ阻害剤に対する感受性を予測する方法に関する。
本願は、２０１３年３月１９日に日本に出願された特願２０１３−０５７０３３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）及びＨｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）を含む非常によく関連した受容体のＥｒｂＢファミリーのメンバーである。ＥｒｂＢファミリーは、細胞の成長、分化、及び生存において重要な役割を担う成長因子レセプターの１型チロシンキナーゼファミリーである。これらのレセプターの活性化は、典型的には特異的リガンド結合を介して起こり、レセプターファミリーメンバー間でヘテロ又はホモ二量体を形成する。それに引き続いて、チロシンキナーゼドメインの自己リン酸化を生じさせる。

ＥＧＦＲの活性化は、癌細胞の継続的な増殖及び生存に重要なプロセスであるアポトーシスの阻害に加えて、受容体チロシンキナーゼの活性化、ならびに細胞の増殖、運動性、付着、浸潤及び化学療法に対する耐性を仲介する一連の下流のシグナル伝達事象を導く。
また、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２を含むこのファミリーのメンバーは細胞形質転換に直接関係している。このため、抗癌剤として、ＥＧＦＲを標的とする分子標的薬が開発されている。現在までに、抗ＥＧＦＲ抗体及び低分子ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）の２つの主なタイプのＥＧＦＲ阻害剤の臨床試験が行われた。セツキシマブなどの抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合し、ＥＧＦＲ下流のシグナリングの活性化をブロックするようにデザインされた。セツキシマブ（抗体２２５としてもまた公知である、特許文献１参照。）は、高レベルの野生型ＥＧＦＲを発現するＡ４３１細胞に対して作製された。これとは対照的に、ゲフィチニブ（化合物ＺＤ１８３９、イレッサ）やエルロチニブ（化合物ＯＳＩ−７７４、タルセバ）などの低分子ＴＫＩは、ＥＧＦＲチロシンキナーゼの細胞内触媒ドメインへの結合するためのＡＴＰを競合する。その結果、ＥＧＦＲ自己リン酸化及び下流のシグナリングを阻害する。

近年、大腸癌の分子標的薬であるセツキシマブやパニツムマブの治療奏効性と突然変異したＫＲＡＳ遺伝子又はそのタンパク質との関係、肺癌の分子標的薬であるゲフィチニブ、エルロチニブの治療奏効性と突然変異したＥＧＦＲ遺伝子又はそのタンパク質との関係、並びにＡＬＫ阻害剤であるクリゾチニブの治療奏効性と転座を伴う融合遺伝子又はそのタンパク質との関係が臨床的に明らかになってきている。これらの薬剤の使用において、ＫＲＡＳの突然変異を検査することが包含されているコンパニオン診断が注目されている。具体的には、ＣＲＹＳＴＡＬ（ＦＯＬＦＩＲＩ）試験のＰｈａｓｅ III大腸癌患者のうち、ＫＲＡＳ野生型患者のセツキシマブ併用時の奏効率は５９．３％であったのに対して、ＫＲＡＳ変異型患者のセツキシマブ併用時の奏効率は３６．２％であり、ＫＲＡＳ変異型患者に対するセツキシマブ奏効率が劇的に低い結果となった（例えば、非特許文献１参照。）。その後、ＯＰＵＳ（ＦＯＬＦＯＸ）試験のＰｈａｓｅ II大腸癌患者においても、ＫＲＡＳ変異型患者において、セツキシマブ奏効率が極端に低く、野生型患者にセツキシマブが有効であることが証明された。これらの治験結果から大腸癌患者における突然変異したＫＲＡＳ遺伝子がＥＧＦＲ阻害剤の治療効果予測因子になることが決定付けられた（例えば、非特許文献２参照。）。ＫＲＡＳ野生型群でも治療成績が悪い場合は、ＢＲＡＦやＰＩＫ３ＣＡに変異が存在している臨床試験結果も報告されている。しかしながら、ＫＲＡＳを超えるｓｕｐｅｒ ｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒとしてはまだエビデンスが少ないのが現状である。

ＫＲＡＳの遺伝子診断によるＥＧＦＲ阻害剤治療を行う上では、被験者からのサンプリングと薬剤耐性に関連した以下の３つの臨床的な問題がある。第１の問題は、外科的切除を行わない症例では、ＫＲＡＳ遺伝子診断に生検標本を用いるが、その信頼性は確認されていないことである。また、生検取得は患者にとって侵襲的であり、原発巣切除後、再発腫瘍は再切除できないケースも多い。このため、腫瘍組織中のＫＲＡＳのステイタス（ＫＲＡＳの遺伝子型）を直接調べる方法に代替可能な、信頼性の高い診断マーカーが望まれている。

第２の問題は、転移巣と原発巣で変異ステイタスが一致するとは限らないことである。
渡邉らは、大腸癌患者４３症例のうち１５例が変異型患者で、原発巣と転移巣の一致率は８８．４％と報告している（非特許文献３参照。）。つまり、約１割は、原発巣と転移巣のＫＲＡＳ変異ステイタスが一致しないことになる。一方、ＥＧＦＲ阻害剤治療中の原発巣と転移巣の変化については、Ｓ．Ｇａｔｔｅｎｌｏｈｎｅｒらが報告している。転移性大腸癌２１症例の治療前後のステイタスを検討した結果、２０例（９５．２％）で変化なしだった。変化のあった１例はヘテロジェナイティーがあり、かつ多発例であった（非特許文献４参照。）。

第３の問題は、ＥＧＦＲ阻害剤治療中に変異型クローンが増加する可能性、すなわちＥＧＦＲ阻害剤に対する耐性の獲得である。Ｄｉａｚ Ｊｒらは、原発巣が野生型の大腸癌２４症例のうち、ＥＧＦＲ阻害剤治療を開始後、血漿中のＤＮＡの突然変異したＫＲＡＳ遺伝子を検出した。その結果、９症例（３７．５％）から突然変異したＫＲＡＳ遺伝子を検出し、全ての症例で投与後少なくとも２６週目までに変異が観察され、細胞外ＤＮＡの変異検出と同時、あるいは観察以降に耐性を獲得していたことを報告している。さらに、彼らは、血清中の突然変異したＫＲＡＳ遺伝子を高感度に検出することにより、ＥＧＦＲ阻害剤の耐性獲得を推測でき、例えばＭＥＫ阻害剤など別の薬剤に切り替えることが可能であると提案をしている（非特許文献５参照。）。また、Ｍｉｓａｌｅらも、血漿中のＫＲＡＳ遺伝子変異を高感度に検出することで、ＥＧＦＲ阻害剤に対しての感受性を予測すること、及び血漿中のＫＲＡＳ遺伝子変異が検出された場合には、ＥＧＦＲ阻害剤ではなく他の薬剤へ切り替えることを提案している（非特許文献６参照。）。つまり、非特許文献５及び６には、被験者の転移巣に存在するＫＲＡＳが、循環ＤＮＡ中でも検出されることを利用し、血液中のＫＲＡＳのステイタスを調べることが記載されている。また、これにより、当該転移巣のＥＧＦＲ阻害剤に対する感受性を調べ、当該被験者にＥＧＦＲ阻害剤を投与した場合の奏効性を予測し得ることが記載されている。

一方、がんの薬剤耐性の打開策として、ＥＧＦＲ阻害剤の再投与に関する臨床試験が行われている。ＥＧＦＲ阻害剤を再投与することにより、再投与しない場合と比較して、ＰＦＳ（無増悪生存期間）の有意な延長が認められている。これは、ＥＧＦＲ阻害剤治療中に変異型クローンが増殖し、腫瘍が前記ＥＧＦＲ阻害剤に対して耐性を獲得するが、別治療に切り替えることで、その変異型クローンが相対的に減少し、その時点でＥＧＦＲ阻害剤を再投与することで、再奏効するという考え方である。実際に、セツキシマブがヒト患者の腫瘍に対して奏効性が低下した時点で、別療法で一定期間治療後、再度セツキシマブによる治療を行う、リチャレンジの前向き試験が行われており、その途中経過がＤ Ｓａｎｔｉｎｉらによって報告されている（非特許文献７参照。）。当該報告では、ＫＲＡＳ野生型患者の１ｓｔライン治療でセツキシマブを投与し、奏効性が低下した時点で別の抗癌治療（例えば、ＸＥＬＯＸ、ＦＯＬＦＯＸなどの化学療法など）に切り替え、一定の期間経過後にさらにセツキシマブを再度投与している。この前向き試験では、ＫＲＡＳ野生型患者に限ってＰＦＳが延長され、顕著な延命効果が確認された。

米国特許第４，９４３，５３３号明細書

Cutsem，et．al.，The New England Journal of Medicine，2009，vol.360，pp.1408−1417． Bokemeyer，et．al.，Annals of Oncology，2011，vol.22(7)，pp.1535−1546. Watanabe，et．al.，Diseases of the Colon and Rect，2011，vol.54，pp.1170−1178. Gattenlohner，et．al.，New England Journal of Medicine，2009，vol.360(8)，pp.835. Diaz Jr，et．al.，Nature，2012，vol. 486，pp.537−540. Misale，et．al.，Nature，2012，vol.486(7404)，pp.532−536． Santini，et．al.，Annals of Oncology，2012，vol.23，pp.2313−2318.

本発明は、ＥＧＦＲ仲介性腫瘍（癌）の患者のＥＧＦＲ阻害剤に対する感受性を、当該患者の腫瘍組織におけるＫＲＡＳのステイタスにかかわらず、当該患者の末梢血中のＫＲＡＳのステイタスを指標として予測する方法に関する。

本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究した。その結果、ＥＧＦＲ仲介性腫瘍（癌）の患者において、腫瘍組織中のＫＲＡＳのステイタスと末梢血中のＫＲＡＳのステイタスとが一致しないケースがあること、腫瘍組織中においてＫＲＡＳの変異型が検出されないが、末梢血中に変異型のＫＲＡＳが検出された患者では、ＥＧＦＲ阻害剤の奏効性が低いことを見出し、本発明を完成させた。

本発明の第一態様に係るＥＧＦＲ阻害剤感受性予測方法は、（ａ）被験者から採取された血液サンプル中に、ＫＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が存在するか否か、及び当該血液サンプル中の前記ＫＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が、野生型か変異型かを決定する工程と、（ｂ）前記被験者の腫瘍から採取された組織検体又は細胞検体中に、野生型のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出され、かつ変異型のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出されなかった場合に、前記工程（ａ）において、前記血液サンプル中に、変異型のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出された場合には、前記被験者の腫瘍はＥＧＦＲ阻害剤感受性ではない可能性が高いと判定する工程と、を有する。
前記第一態様において、血液サンプルが採取された時点において、前記被験者の腫瘍から採取された組織検体又は細胞検体に、野生型のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出され、かつ変異型のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出されなかったが、前記血液サンプル中に、変異型のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出された場合に、前記被験者の腫瘍はＥＧＦＲ阻害剤感受性ではない可能性が高いと判定してもよい。
前記第一態様において、前記被験者が、過去に腫瘍部分の外科的切除処置を受けたことがあってもよい。
前記第一態様において、前記被験者が、過去にＥＧＦＲ阻害剤を投与されたことがあってもよい。
前記第一態様において、前記被験者が、過去に前記ＥＧＦＲ阻害剤に対して薬剤耐性を示していてもよい。
前記第一態様において、前記血液サンプルが、前記ＥＧＦＲ阻害剤を投薬された後６０日間が経過した被験者から採取されたものであってもよい。
前記第一態様において、前記被験者が、ＥＧＦＲ阻害剤の投薬処置を受けた後に、当該ＥＧＦＲ阻害剤投薬処置とは異なる他の抗腫瘍療法を受けた腫瘍患者であり、前記血液サンプルが、前記腫瘍患者が再び前記ＥＧＦＲ阻害剤投薬処置を受けようとする前に採取されたものであってもよい。
前記第一態様において、前記他の抗腫瘍療法が化学療法剤の投薬治療であってもよい。
前記第一態様において、前記化学療法剤が、フルオロウラシル、フォリン酸、オキサリプラチン、イリノテカン、シタラビン、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキセート、ブレオマイシン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ミトキサントロン、カンプトセシン、トポテカン、テニポシド、コルセミド、コルヒチン、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、及びタモキシフェンからなる群より選択される１種又は２種以上であってもよい。
前記第一態様において、前記他の抗腫瘍療法が放射線治療であってもよい。
前記第一態様において、前記他の抗腫瘍療法が、前記被験者に既に投薬されたＥＧＦＲ阻害剤とは異なる種類の分子標的薬剤の投薬治療であってもよい。
前記第一態様において、前記分子標的薬剤が、セツキシマブ、パニツムマブ、ベバシヅマブ、ゲフィニチブ、エルロチニブ、レゴラフェニブ、クリゾチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、エベロリムス、トラスツズマブ、ラパチニブ、及びリツキシマブからなる群より選択される１種又は２種以上であってもよい。
前記第一態様において、前記他の抗腫瘍療法が、前記分子標的薬剤の投薬治療と、化学療法剤の投薬治療との併用療法であってもよい。
前記第一態様において、前記腫瘍が、再発性腫瘍であってもよい。
前記第一態様において、前記腫瘍が、転移巣であってもよい。
前記第一態様において、前記腫瘍が、原発巣であってもよい。
前記第一態様において、前記腫瘍が、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、肝癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、食道癌、頭頸部癌、子宮癌、及び子宮頸癌からなる群より選択される１種又は２種以上であってもよい。
前記第一態様において、前記腫瘍が、前記被験者の体内の複数個所に存在していてもよい。
前記第一態様において、前記変異型が、ＫＲＡＳタンパク質のＧ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｓ２、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｃ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ａ１４６Ｔ、及びＡ１４６Ｖからなる群より選択される１又は２以上であってもよい。
前記第一態様において、前記血液サンプル中のＫＲＡＳの存在の有無、及び野生型か変異型かの決定を、当該血液サンプル中の循環ＤＮＡから、野生型のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸が検出されるか否か、及び変異型のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸が検出されるか否かを調べることにより行ってもよい。
前記第一態様において、前記血液サンプルが、末梢血液、血清、血漿であってもよい。
前記第一態様において、前記血液サンプル中のＣＥＡが５ｎｇ／ｍＬ以下であってもよいし、又は前記血液サンプル中のＣＡ１９−９の値が３７．０Ｕ／ｍＬ以下であってもよい。

上記態様のＥＧＦＲ阻害剤感受性予測方法によれば、被験者に対する侵襲性が低い生体サンプルから、被験者のＥＧＦＲ阻害剤に対する感受性を精度よく予測することができる。

本発明の一実施形態に係るＥＧＦＲ阻害剤感受性予測方法（以下、「本発明に係る感受性予測方法」ということがある。）は、腫瘍組織中のＫＲＡＳのステイタスにかかわらず、血中のＫＲＡＳのステイタスを指標として、ＥＧＦＲ阻害剤の感受性を予測することを特徴とする。
血中のＫＲＡＳが野生型であり、変異型が検出されなかった被験者は、腫瘍組織中のＫＲＡＳが野生型か変異型かにかかわらず、ＥＧＦＲ阻害剤に対する感受性は高いと予測される。逆に、血中から変異型のＫＲＡＳが検出された被験者は、腫瘍組織中のＫＲＡＳが野生型か変異型かにかかわらず、ＥＧＦＲ阻害剤に対する感受性は低いと予測される。

従来、腫瘍組織中に突然変異したＫＲＡＳ遺伝子又はそのタンパク質（突然変異したＫＲＡＳ遺伝子由来のタンパク質）が存在すれば、ＥＧＦＲ阻害剤が奏効しないことが知られていた。さらに、ＥＧＦＲ仲介性腫瘍（癌）の患者において、腫瘍組織のみならず血中からもＫＲＡＳ蛋白質又はＫＲＡＳ遺伝子のｍＲＮＡが検出されることも知られていたが、この血中のＫＲＡＳのステイタスは、腫瘍組織中のＫＲＡＳのステイタスと一致すると考えられていた。しかしながら、この従来の知見に反して、血中のＫＲＡＳのステイタスと腫瘍組織中のＫＲＡＳのステイタスは一致しない場合がある。この場合には意外にも、腫瘍組織のＥＧＦＲ阻害剤の奏効性は、腫瘍組織中のＫＲＡＳのステイタスよりも、血中のＫＲＡＳのステイタスに基づく。

実際に後記実施例１に示すように、再発大腸癌患者についての臨床結果の分析において、原発巣と転移巣の両方とも突然変異したＫＲＡＳ遺伝子は観察されなかったにもかかわらず、血中の循環ＤＮＡから変異型のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸が検出された再発大腸癌患者では、ＥＧＦＲ阻害剤であるセツキシマブによる腫瘍縮小効果が観察されなかった。また、原発巣と転移巣のいずれにおいても腫瘍組織中に変異型のＫＲＡＳが検出されなかったにもかかわらず、血中に変異型のＫＲＡＳが検出された再発大腸癌患者では、ＥＧＦＲ阻害剤に応答しない腫瘍であった。

つまり、腫瘍組織中に突然変異したＫＲＡＳ遺伝子の存在が認められなくても、末梢血中の循環ＤＮＡから突然変異したＫＲＡＳ遺伝子が検出された被験者は、ＥＧＦＲ阻害剤に対する感受性が低く、ＥＧＦＲ阻害剤の奏効性が低いと予測することができる。同様に、原発巣と転移巣の腫瘍組織中に突然変異したＫＲＡＳ遺伝子の存在が認められなくても、末梢血中の循環ＤＮＡから突然変異したＫＲＡＳ遺伝子の存在が同定された場合、腫瘍はＥＧＦＲ阻害剤に応答しない腫瘍であり、ＥＧＦＲ阻害剤の再投与が奏効しないことを予測できる。このように、腫瘍組織中のＫＲＡＳのステイタスではなく、血中のＫＲＡＳのステイタスを指標とするほうが、ＥＧＦＲ阻害剤に対する感受性を精度よく予測できることは、本発明者らによってはじめて見出された知見である。

すなわち、本発明に係る感受性予測方法は、被験者のＥＧＦＲ阻害剤感受性を予測する方法であって、下記工程（ａ）と工程（ｂ）とを有することを特徴とする。
（ａ）被験者から採取された血液サンプル中に、ＫＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が存在するか否か、及び当該血液サンプル中のＫＲＡＳが、野生型か変異型かを決定する工程と、（ｂ）前記工程（ａ）において、前記血液サンプル中に、野生型のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出され、かつ変異型のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出されなかった場合には、前記被験者の腫瘍はＥＧＦＲ阻害剤感受性である可能性が高いと判定し、前記血液サンプル中に、変異型のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出された場合には、前記被験者の腫瘍はＥＧＦＲ阻害剤感受性ではない可能性が高いと判定する工程。

本発明に係る感受性予測方法において検出する変異型のＫＲＡＳは、例えば挿入、逆位、欠失、及び／又は点突然変異のような全ての形態の突然変異を包含する。これらの突然変異したＫＲＡＳ遺伝子は、一つの対立遺伝子（ヘテロ接合性）又は双方の対立遺伝子（ホモ接合性）にそれぞれ見出される野生型ＫＲＡＳとは異なり、体細胞性又は生殖系列で見出され得る変異型ＫＲＡＳである。体細胞突然変異は、ある種の組織、例えば腫瘍組織でのみ生じ、生殖細胞系列で遺伝しない。生殖系列突然変異は、任意の体組織で見出すことができる。

本発明に係る感受性予測方法において検出する変異型のＫＲＡＳとしては、ＫＲＡＳ遺伝子のエクソン２〜４上のコドン１２、１３、６１、及び１４６のうちの１又は２以上のアミノ酸置換を伴う突然変異したＫＲＡＳが好ましい。具体的には、例えば、ＫＲＡＳタンパク質のＧ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１２Ｓ２、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｃ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ａ１４６Ｔ、及びＡ１４６Ｖからなる群より選択される１又は２以上の変異を有する変異型ＫＲＡＳが挙げられる。各変異型の核酸（遺伝子）突然変異の態様を表１に示す。また、ＫＲＡＳのアミノ酸配列を配列番号１に、ＫＲＡＳのエクソン２上のコドン１２を含む遺伝子配列を配列番号２に、ＫＲＡＳのエクソン３上のコドン６１を含む遺伝子配列を配列番号３に、ＫＲＡＳのエクソン４上のコドン１４６を含む遺伝子配列を配列番号４に、それぞれ示す。

本発明に係る感受性予測方法においては、工程（ａ）において、腫瘍組織中のＫＲＡＳのステイタスではなく、血液サンプル中のＫＲＡＳのステイタスを調べる。血液サンプルとしては、末梢血液自体であってもよく、血清や血漿であってもよい。血液サンプルは、腫瘍組織よりも低侵襲的に被験者から採取することができるため、再発腫瘍患者のように、腫瘍組織の生体サンプルの採取が困難な被験者についても、ＥＧＦＲ阻害剤に対する感受性を予測することができる。また、血液サンプルは被験者から経時的に採取することもできるため、本発明に係る感受性予測方法は、腫瘍が再発したかどうかのモニタリングにも好適である。

なお、前記血液サンプルは、原発性腫瘍、転移性腫瘍、再発性腫瘍にかかわらず、腫瘍が初期の段階に被験者から採取されたものが好ましい。具体的には、本発明に係る感受性予測方法において用いられる血液サンプルは、ＣＥＡが５ｎｇ／ｍＬ以下である、又はＣＡ１９−９の値が３７．０Ｕ／ｍＬ以下であるものが好ましい。

本発明に係る感受性予測方法において、感受性が予測されるＥＧＦＲ阻害剤は、ヒトをはじめとする動物において、ＥＧＦＲ阻害作用を有する物質であれば特に限定されず、抗ＥＧＦＲ抗体であってもよく、ＴＫＩであってもよい。具体的には、抗ＥＧＦＲ抗体としては、セツキシマブ（製品名：エルビツツクス（Ｅｒｂｉｔｕｔｕｘ）（登録商標）、Ｉｍｃｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）及びパニツムマブ（製品名：ＡＢＸ−ＥＧＦ、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。また、ＴＫＩとしては、ＡＴＰと競合する低分子、例えばエルロチニブ（製品名：タルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）（登録商標）、ＯＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ゲフィチニブ（製品名：イレッサ（Ｉｒｅｓｓａ）（登録商標）、Ａｓｔｒａ−Ｚｅｎｅｃａ）、Ｄｖｉｒ等、Journal of Cell Biology，vol.113，pp.857−865（1991）に記載されたチロホスチン類；米国特許第５６７９６８３号明細書に開示された三環系ピリミジン化合物；Ｐａｎｅｋ等、Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，vol.283，pp.1433−1444（1997）に開示された化合物６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（４−（２−ジエチルアミノエトキシ）フェニルアミノ）−８−メチル−８Ｈ−ピリド（２，３−ｄ）ピリミジン−７−オン（ＰＤ１６６２８５として知られている。）が挙げられる。本発明に係る感受性予測方法においては、これらのＥＧＦＲ阻害剤のうち、１種又は２種以上に対する感受性を予測することが好ましい。中でも、セツキシマブ又はパニツムマブに対する感受性を予測することが好ましい。

本発明に係る感受性予測方法において、ＥＧＦＲ阻害剤の感受性を予測する対象となる腫瘍は、ＥＧＦＲ仲介性腫瘍（癌）すなわち、腫瘍形成にＥＧＦＲがある役割を担っている腫瘍であれば特に限定されない。当該腫瘍には、脳、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、胃、卵巣、結腸直腸、前立腺、膵臓、乳房、肺、外陰部、甲状腺、結腸直腸、食道、肝臓の癌、肉腫、膠芽細胞腫、頭頸部、白血病及びリンパ性悪性疾患が含まれる。より詳細には、神経芽細胞腫、腸癌（例えば、直腸癌、大腸癌、家族性大腸ポリポーシス癌及び遺伝性非ポリポーシス大腸癌）、食道癌、口唇癌、喉頭癌、下咽頭癌、舌癌、唾液腺癌、胃癌、腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺動脈乳頭癌、腎臓癌、腎実質癌、卵巣癌、頸癌、子宮体癌、子宮内膜癌、絨毛癌、膵臓癌、前立腺癌、精巣癌、乳癌、尿管癌、メラノーマ、脳腫瘍（例えば、膠芽細胞腫、星状細胞腫、髄膜腫、髄芽細胞腫及び末梢神経外胚葉性腫瘍）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病骨（ＡＭＬ）、慢性髄性白血病（ＣＭＬ）、成人Ｔ細胞白血病、肝細胞癌、胆嚢癌、気管支癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、多発性骨髄腫、基底細胞腫、奇形腫、網膜芽細胞腫、脈絡膜メラノーマ、精上皮腫、横紋筋肉腫、頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｎｇｅｏｍａ）、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、ユーイング肉腫及び形質細胞腫が含まれ得る。本発明に係る感受性予測方法において予測対象となる腫瘍としては、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、肝癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、食道癌、頭頸部癌、子宮癌、及び子宮頸癌からなる群より選択される１種又は２種以上であることが好ましい。

本発明に係る感受性予測方法において、ＥＧＦＲ阻害剤の感受性を予測する対象となる腫瘍は、原発巣（原発性腫瘍）であってもよく、転移巣（転移性腫瘍）であってもよい。
また、再発性腫瘍であってもよい。さらに、腫瘍が、被験者の体内の複数個所に存在していてもよい。

本発明に係る感受性予測方法においては、再発性腫瘍についてのＥＧＦＲ阻害剤の感受性を予測することが好ましい。例えば、過去に腫瘍部分の外科的切除処置を受けたことがある被験者や、過去にＥＧＦＲ阻害剤を投与されたことがある被験者から採取された血液サンプルを用いることにより、再発性腫瘍や転移巣のＥＧＦＲ阻害剤感受性を予測することができる。なお、被験者が過去にＥＧＦＲ阻害剤を投与されたことがある場合には、ＥＧＦＲ阻害剤を投薬された後６０日間が経過した後に採取された血液サンプルを用いることが好ましい。ＥＧＦＲ阻害剤治療の治療期間中に、当該ＥＧＦＲ阻害剤に対する感受性を予測しながら治療を行うためには、本発明に係る感受性予測方法を継続的に実施することが好ましい。通常、腫瘍マーカー検査のための採血は月に１回程度であり、ＣＴ検査は３カ月に１回程度であることとのバランスから、本発明に係る感受性予測方法は６０日間程度ごとの実施が好ましいと考えられるためである。

また、本発明に係る感受性予測方法において用いられる血液サンプルは、過去にＥＧＦＲ阻害剤に対して薬剤耐性を示していた被験者から採取されたものであってもよい。過去にＥＧＦＲ阻害剤に対して薬剤耐性を示していた被験者であっても、血液サンプルから変異型のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出されなかった場合には、当該被験者はその血液サンプルが採取された時点において、ＥＧＦＲ阻害剤に対する感受性があると判定できる。そのため、ＥＧＦＲ阻害剤を服用することにより、腫瘍縮小効果が得られる可能性が高いと判定できる。逆に、血液サンプルから変異型のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出された場合には、当該被験者はその血液サンプルが採取された時点において、ＥＧＦＲ阻害剤に対する感受性が低く、ＥＧＦＲ阻害剤を服用しても腫瘍縮小効果が得られない可能性が高いと判定できる。

本発明に係る感受性予測方法は、ＥＧＦＲ阻害剤をリチャレンジする被験者から採取された血液サンプルに対して行うことも好ましい。ここで、「ＥＧＦＲ阻害剤をリチャレンジする被験者」とは、ＥＧＦＲ阻害剤の投薬処置を受けた後に、当該ＥＧＦＲ阻害剤投薬処置とは異なる他の抗腫瘍療法を受けており、その後に再度のＥＧＦＲ阻害剤の投薬処置を受けようとする被験者を意味する。ＥＧＦＲ阻害剤投与により耐性を獲得する場合があるが、リチャレンジ前に予め血中のＫＲＡＳのステイタスを調べることにより、リチャレンジにおけるＥＧＦＲ阻害剤の奏効性を予測することができる。すなわち、リチャレンジ前に被験者から採取された血液サンプルから変異型のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出されなかった場合には、当該被験者はＥＧＦＲ阻害剤に対する感受性があり、ＥＧＦＲ阻害剤をリチャレンジすることにより腫瘍縮小効果が得られる可能性が高いと判定できる。逆に、血液サンプルから変異型のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出された場合には、当該被験者はＥＧＦＲ阻害剤に対する感受性が低く、ＥＧＦＲ阻害剤をリチャレンジしても腫瘍縮小効果が得られない可能性が高いと判定できる。

なお、ＥＧＦＲ阻害剤をリチャレンジする前に受ける他の抗腫瘍療法としては、公知の抗腫瘍療法の中から、被験者の病態等に応じて適宜選択して用いることができる。当該他の抗腫瘍療法としては、具体的には、放射線治療、化学療法剤の投薬治療、既に投薬されたＥＧＦＲ阻害剤とは異なる種類の分子標的薬剤の投薬治療等が挙げられる。当該他の抗腫瘍療法としては、１又は２以上の抗腫瘍療法の併用療法であってもよい。例えば、本発明に係る感受性予測方法としては、分子標的薬剤の投薬治療と、化学療法剤の投薬治療との併用療法が好ましい。

前記化学療法剤としては限定されず、細胞毒性又は細胞分裂阻害性を有する化合物であり得る。具体的には、（ｉ）代謝拮抗剤、例えばフルオロウラシル、シタラビン、フルダラビン、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、又はメトトレキセート；（ｉｉ）ＤＮＡ断片化剤、例えば、ブレオマイシン；（ｉｉｉ）ＤＮＡ架橋剤、例えば、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、又はナイトロジェンマスタード；（ｉｖ）インターカレート剤、例えばアドリアマイシン（ドキソルビシン）、又はミトキサントロン；（ｖ）タンパク合成阻害剤、例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ、シクロヘキシミド、ピューロマイシン、又はジフテリア毒素；（ｖｉ）トポイソメラーゼＩ毒、例えばカンプトセシン、又はトポテカン；（ｖｉｉ）トポイソメラーゼＩＩ毒、例えばエトポシド（ＶＰ−１６）、又はテニポシド；（ｖｉｉｉ）微小管関連剤、例えばコルセミド、コルヒチン、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔｅｘｅｌ）、ビンブラスチン、又はビンクリスチン；（ｉｘ）キナーゼ阻害剤、例えば、フラボピリドール、スタウロスポリン、ＳＴＩ５７１（ＣＰＧ５７１４８Ｂ）、又はＵＣＮ−０１（７−ヒドロキシスタウロスポリン）；（ｘ）様々な治験薬、例えばチオプラチン（ｔｈｉｏｐｌａｔｉｎ）、ＰＳ−３４１、フェニルブチレート、ＥＴ−１８−ＯＣＨ３、又はファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（Ｌ−７３９７４９、Ｌ−７４４８３２）；ポリフェノール類、例えばケルセチン、レスベラトロール、ピセタノール、エピガロカテキン没食子酸塩、テアフラビン類、フラバノール類、プロシアニジン類、ベツリン酸及びその誘導体；（ｘｉ）ホルモン、例えばグルココルチコイド又はフェンレチニド；（ｘｉｉ）抗ホルモン、例えばタモキシフェン、フィナステライド、又はＬＨＲＨアンタゴニストが含まれる。また、フォリン酸、オキサリプラチン、イリノテカン、ダウナルビシン、タキソテール、及びマイトマイシンＣも含まれる。前記他の抗腫瘍療法においては、これらの化学療法剤のうち１種のみを用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。

本発明に係る感受性予測方法を、ＥＧＦＲ阻害剤投与処置後に化学療法剤の投薬治療を行い、その後さらにＥＧＦＲ阻害剤のリチャレンジを予定している被験者から採取された血液サンプルに対して行う場合、当該化学療法剤としては、フルオロウラシル、フォリン酸、オキサリプラチン、イリノテカン、シタラビン、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキセート、ブレオマイシン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ミトキサントロン、カンプトセシン、トポテカン、テニポシド、コルセミド、コルヒチン、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、及びタモキシフェンからなる群より選択される１種又は２種以上であることが好ましい。

前記分子標的薬剤としては、具体的には、セツキシマブ、パニツムマブ、ベバシヅマブ、ゲフィニチブ、エルロチニブ、レゴラフェニブ、クリゾチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、エベロリムス、トラスツズマブ、ラパチニブ、及びリツキシマブからなる群より選択される１種又は２種以上が挙げられる。

前記工程（ａ）においては、血液サンプル中のＫＲＡＳのステイタスは、タンパク質レベルで決定してもよく、核酸レベル（ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ）で決定してもよい。本発明に係る感受性予測方法においては、高感度に検出可能であることから、ＫＲＡＳ遺伝子由来核酸を測定対象とすることが好ましい。具体的には、前記血液サンプル中のＫＲＡＳの存在の有無、及び野生型か変異型かの決定を、当該血液サンプル中の循環ＤＮＡから、野生型及び変異型のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸が検出されるか否かを調べることにより行うことが好ましい。ＫＲＡＳ遺伝子由来核酸とは、ＫＲＡＳ遺伝子のゲノムＤＮＡの全長若しくはその部分、ＫＲＡＳ遺伝子のｍＲＮＡの全長若しくはその部分、前記ｍＲＮＡの全長若しくはその部分を鋳型として得たｃＤＮＡ、又はこれらをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等によって人工的に増幅させた増幅産物等が挙げられる。

血液サンプル中のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸の検出や、検出されたＫＲＡＳ遺伝子由来核酸の遺伝子型の決定は、常法により行うことができる。

例えば、血液サンプル中のＫＲＡＳの存在やそのステイタスは、血液サンプル中に含まれているＫＲＡＳ遺伝子由来核酸を、デジタルＰＣＲを用いて検出することによって決定できる。特にバイオラッド社のドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）の技術（Hindson，et.al.，Analytical Chemistry，2011，vol.83（22），pp. 8604−8610）を利用することにより、高感度に検出することができる。ドロップレットの数が多ければ多いほど、解析精度が高くなる。０．０１％の突然変異を検出する性能を担保するためには、一つの突然変異を検出するために１０，０００ドロップレットが必要である。そのために、ＰＣＲのマスターミックス中の界面活性剤濃度を規定することが好ましい。例えば、ＤＮＡ伸長酵素などの保存液として用いられるエチレングリコール又はグリセロールは、終濃度で０．１５％以下に、又はＴｒｉｔｏｎ−Ｘは、終濃度０．０００３％以下であることが好ましい。上記界面活性剤が、前記終濃度以上になるとドロップレットによるエマルジョン数が激減し、高感度に突然変異を検出することが困難になる。

また、血液サンプルから得られた核酸及び核酸断片を用いて、第１ＰＣＲを１５〜５０サイクル行うことにより、当該核酸中に含まれるであろう変異型ＫＲＡＳのアリルコピー数の絶対量を増加させた後、１０６コピー数程度に希釈してから、公知の突然変異検出方法を行うことも好ましい。当該方法によれば、反応系に存在する変異型の全体数を増加させるため、突然変異の種類が増えても、変異型のアリルが物理的に存在せずに検出不能となる可能性を下げることができる。さらに、当該方法を、前記のデジタルＰＣＲと組み合わせてもよい。

その他の方法としては、例えば、血液サンプル中の核酸を鋳型としたＰＣＲ等により、ＫＲＡＳ遺伝子中の変異部位をコードする領域を含む断片を増幅した後、この増幅産物に対して、ＫＲＡＳの特定の遺伝子型に特異的にハイブリダイズ可能なプローブを接触させて会合体が形成されたか否かを高感度に検出する方法が挙げられる。ハイブリダイゼーションを行う前に、前記増幅産物の希釈物に対してエマルジョンＰＣＲを行うことも好ましい。

前記プローブは、例えば放射性同位元素（^３Ｈ、^３２Ｐ、^３３Ｐ等）、蛍光剤（ローダミン、フルオレセン等）又は発色剤で検出可能に標識される。また、当該プローブは、アンチセンスオリゴマー、例えばＰＮＡ、モルホリノ−ホスホロアミデート類、又はＬＮＡであってもよい。なお、当該プローブの塩基長さは、約８ヌクレオチドから約１００ヌクレオチド、又は約１０から約７５、あるいは約１５から約５０、又は約２０から約３０でよい。

血液サンプル中のＫＲＡＳの存在やそのステイタスは、インベーダー法（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｏｌｉｖｉｅｒ， Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７３：１０３−１１０， ２００５）を使用して分析することができる。インベーダー法とは、ＰＣＲなどによって調製された二本鎖ＤＮＡ、あるいはｍＲＮＡに対して、部分的に三重塩基を形成するように、アレルプローブとインベーダーオリゴがハイブリダイゼーションを行う。ここで、アレルプローブの５’末端の一部は、前記二本鎖ＤＮＡやｍＲＮＡと非相補的な配列（フラップ部）を有するように設計されている。一方、インベーダーオリゴは完全にそれらに対して相補的な配列を有している。２種のアレルプローブは、それぞれ野生型、変異型に対して相補的になるように設計されており、上記二本鎖ＤＮＡやｍＲＮＡに対し競合的にハイブリダイゼ−ションを行い、完全相補でハイブリダイゼーションした際に、フラップエンドヌクレアーゼが一部三重塩基になっている部分を認識し、アレルプローブのフラップ部が、同反応系に存在する自己相補型ＦＲＥＴカセットにハイブリダイゼーションする。
この時に、前記の一部三重塩基になる部分ができ、目的の突然変異をフラップエンドヌクレアーゼが切断し、ＦＲＥＴカセット内の蛍光修飾されたＤＮＡ断片が遊離して、ＦＲＥＴ内の消光物質と乖離するために蛍光を発する。理論上、一度切断されたアレルプローブのフラップ部は、別のＦＲＥＴカセットに再度ハイブリダイゼーションすることができ、シグナルが増幅される非常に高感度に突然変異を検出できる手法である。

当該分野で知られているリガーゼ連鎖反応を、ＫＲＡＳ遺伝子中の変異部位をコードする領域を含む断片を増幅させるために使用することができる（例えば、Wu，et.al.，Genomics，1989，vol.4，pp.560−569を参照。）。また、アレル特異的ＰＣＲとして知られている技術を使用することもできる（例えば、Ruano and Kidd，Nucleic Acids Research，1989，vol.17，pp.8392を参照。）。当該技術によれば、特定のＫＲＡＳ突然変異にその３’末端でハイブリダイズするプライマーが使用される。特定のＫＲＡＳ突然変異が存在していない場合は、増幅産物は観察されない。また、Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＲＭＳ）（例えば、欧州特許出願公開第０３３２４３５号、及びNewton et.al.，Nucleic Acids Research，1989，vol.17，pp.7参照。）も使用することができる。

血液サンプル中のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸の検出や、検出されたＫＲＡＳ遺伝子由来核酸の遺伝子型の決定には、遺伝子変異を検出する場合や、遺伝子の挿入及び欠失を検出する場合に使用されるその他の方法も利用することができる。当該方法としては、具体的には、例えば、サンガー法を基礎とするシークエンス解析法を利用し、血液サンプル中のＫＲＡＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ、又はこれらの増幅産物等の塩基配列を直接決定する方法が挙げられる。また、塩基配列の決定は、ＰＣＲを介して行うこともできる。その他、遺伝子又は周りのマーカー遺伝子に対する制限断片長多型（ＲＦＬＰ）プローブを、多型断片におけるアレルの改変又は挿入をスコア付けするために使用することができる。一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）解析もまた、アレルの塩基変化変異体を検出するために使用することができる（Orita et.al.，Proceedings of the National Academy of Sciences，USA，1989，vol.86，pp.2766−2770、及びGenomics，1989，vol.5，pp.874−879）。

なお、血液サンプル中のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸の検出や、検出されたＫＲＡＳ遺伝子由来核酸の遺伝子型の決定に用いられる試薬等をキット化することにより、本発明に係る感受性予測方法をより簡便に行うことができる。当該試薬としては、例えば、血液サンプルから核酸を抽出するための試薬、ポリメラーゼやリガーゼ等の酵素、ＫＲＡＳの特定の遺伝子型に特異的にハイブリダイズ可能なプローブやプライマー（ＫＲＡＳ遺伝子の突然変異の部位又はその隣接部位に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド）等が挙げられる。また、当該キットには、血液サンプル中のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸の検出やその遺伝子型の決定方法についてのプロトコルや、得られたＫＲＡＳの遺伝子型（ステイタス）の結果からのＥＧＦＲ阻害剤感受性の判定基準についての指示が記載された書面等が含まれていてもよい。

本発明に係る感受性予測方法は、ＥＧＦＲ阻害剤の投与処置の適用の有無を判断する際に重要な情報を提供し得る。つまり、本発明に係る感受性予測方法は、臨床医に有用な情報を提供でき、当該方法より得られた情報に基づき、臨床医らは適切な治療方法を決定することができる。

以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されない。

［実施例１］
原発巣を外科的切除した再発性大腸癌患者２３名について、原発巣、転移巣、及び転移巣確認後に採取された血液から調製された血清に含まれるＫＲＡＳについて、ノンシノニマスなアミノ酸置換を伴う突然変異を調べた。

(臨床サンプル)
原発巣の外科的切除手術の術前又は術後に、再発性大腸癌患者の末梢血６ｍＬを採血後、遠心分離処理（３，０００ｒｐｍ、１０分間）を行い、血清成分を得た。さらに、ＩＤ番号９の患者については、転移巣の外科的切除手術の術後にも、末梢血６ｍＬを採血し、同様にして血清成分を得た（サンプル番号１６）。また、一部の患者の原発巣、転移巣のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）切片も実験サンプルとした。なお、本試験は、日本医科大学付属病院内の倫理審査委員会で承認されており、全ての患者からは本研究を包含するインフォームドコンセントを得て行った。本試験における患者情報について表２に示す。表２中、「転移巣」の欄の「−」は、転移巣が確認される前の患者であることを意味する。また、表２中、「セツキシマブ」の欄の「あり」は、転移巣の外科的切除手術後（但し、サンプル番号８とサンプル番号１５は、原発巣の外科的切除手術前）にセツキシマブの投与処置を行ったことを、同欄の「なし」は、同投与処置を行わなかったことを、それぞれ意味する。表２中、「化学療法」の欄は、転移巣の外科的切除手術後のセツキシマブ投与処置時点（但し、サンプル番号２０と２１では、原発巣の外科的切除手術後のセツキシマブ投与処置時点、サンプル番号１６では血液サンプル採取時点）における、化学療法の施行状況を示す。より詳細には、「なし」は投与未定であり、今後投与の可能性がある患者を意味し、「施行前」は施行が予定されていることを意味し、「施行中」は化学療法が奏効しており、投与を続けている状態を意味し、「施行後」は化学療法が奏効していたが、当該時点では投与を終了していることを意味し、「終了後」は化学療法が効かなくなった状態（すなわち、緩和ケアに入っている状態）を意味する。

原発巣がＫＲＡＳ野生型であるＩＤ番号８とＩＤ番号１５の患者に対して、抗ＥＧＦＲ抗体薬治療を行った。共に、原発巣切除前に抗ＥＧＦＲ抗体薬治療後、原発巣を切除した。ＩＤ番号８の患者に対しては、セツキシマブとＦＯＬＦＯＸ化学療法（フルオロウラシル・フォリン酸・オキサリプラチン）を行った。セツキシマブは、２週間間隔投与法で行い、７８０ｍｇ／ｂｏｄｙを１時間かけて点滴静脈内投与を行った。ＦＯＬＦＯＸ化学療法は、３００ｍｇ／ｂｏｄｙのフォリン酸（ロイコボリン）と１２５ｍｇ／ｂｏｄｙのオキサリプラチンを２時間かけて点滴静脈内投与し、フルオロウラシル（５−ＦＵ）は、６２５若しくは５００ｍｇ／ｂｏｄｙを急速点滴静脈内投与した後、さらに３８００ｍｇ／ｂｏｄｙを２２時間持続点滴静脈内投与した。投与履歴を表３に示す。

サンプルＩＤ番号１５の患者に対しては、パニツムマブ若しくはセツキシマブとＦＯＬＦＯＸ化学療法（フルオロウラシル・フォリン酸・オキサリプラチン）を行った。パニツムマブ若しくはセツキシマブは２週間間隔投与法で行い、パニツムマブは３６０ｍｇ／ｂｏｄｙを、セツキシマブは８００ｍｇ／ｂｏｄｙを１時間かけて点滴静脈内投与を行った。ＦＯＬＦＯＸ化学療法は、３５０ｍｇ／ｂｏｄｙのフォリン酸（ロイコボリン）と、１４５又は１４０ｍｇ／ｂｏｄｙのオキサリプラチンを、２時間かけて点滴静脈内投与し、フルオロウラシル（５−ＦＵ）は、６７５又は６５０ｍｇ／ｂｏｄｙを急速点滴静脈内投与した後、さらに４１１０ｍｇ／ｂｏｄｙを２２時間持続点滴静脈内投与した。投与履歴を表４に示す。

（血清中のＣＥＡ及びＣＡ−１９−９の測定）
血清中のＣＥＡ及びＣＡ−１９−９を、ＣＬＥＩＡ法（化学発光酵素免疫測定法）により測定した。測定結果を表５に示す。

(血清からのセルフリー（ｃｆ）ＤＮＡの単離精製)
血清からのｃｆＤＮＡの単離精製は、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（キアゲン社)を用いて行った。本キットに供した血清サンプルの量は、患者によって異なり、２ｍＬ〜４ｍｌであった。ＤＮＡの単離精製工程は、キットに付属されているインストラクションに従った。スピンカラムからの最終溶出は、ＴＥ緩衝液５０μＬを用いて行った。

（ＦＦＰＥ切片からのＤＮＡの単離精製)
ＦＦＰＥ切片からのＤＮＡ単離精製は、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ＦＦＰＥ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（キアゲン社)を用いて行った。１サンプルにつき、ＦＦＰＥ切片は１０μｍにスライスされたものを３枚用いた。ＤＮＡの単離精製工程は、キットに付属されているインストラクションに従った。スピンカラムからの最終溶出は、ＴＥ緩衝液１００μＬを用いて行った。

(ＤＮＡの定量)
ｃｆＤＮＡ及びＦＦＰＥ切片から単離精製したＤＮＡの定量は、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（登録商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ Ｒｅａｇｅｎｔ ａｎｄ Ｋｉｔｓ（ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）を用いて行った。測定するサンプルは全て、単離したＤＮＡをＴＥ緩衝液で２０倍に希釈したものを用いた。蛍光測定装置は、ＳＡＦＩＲＡ（ＴＥＣＡＮ社）を用いた。

(ダイレクトシークエンシング)
原発巣や転移巣の手術標本、並びに血清中のＫＲＡＳ塩基配列解析は、ダイレクトシークエンシングにて行った。ＫＲＡＳのダイレクトシークエンス用のプライマー配列として、ＫＲＡＳ（フォワード）：５’−ＧＡＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡＡ−３’（配列番号５）、ＫＲＡＳ（リバース）：５’−ＧＴＧＴＧＡＣＡＴＧＴＴＣＴＡＡＴＡＴＡＧＴＣＡ−３’（配列番号６）を用いた。各ＰＣＲ産物の長さは２１４ｂｐであり、ＰＣＲ条件は、９５℃で１０分間の前変性後、９４℃で２０秒間、６０℃で２０秒間、７２℃で３０秒間を１サイクルとして４０サイクル行い、その後７２℃で１０分間の伸長反応を行った。シークエンス解析はＡＢＩ３７３０（アプライドバイオシステムズ、Foster City、CA)を用いて、ビッグダイターミネーター法によるサイクルシークエンシングを行った。結果を表５に示す。表５の「血清」欄中、遺伝子型の語尾の「（術前）」と「（術後）」は、それぞれ原発巣（サンプル番号１６のみ、転移巣）の外科的切除手術の術前又は術後に採取された血清中の遺伝子型であることを意味する。また、表５の「転移巣」の欄中、「−」は、転移巣中のＫＲＡＳの遺伝子型を解析していないことを意味する。

原発巣の手術標本のＫＲＡＳ遺伝子変異（コドン１２，１３）とｃｆＤＮＡ中のＫＲＡＳ遺伝子変異の一致率は、８１．８％であった。また、原発巣とｃｆＤＮＡにおけるＫＲＡＳ遺伝子変異の相関表を表６に示す。表６中、「ｐＤＮＡ」は、原発巣から抽出したＤＮＡを意味する。ＣｏｈｅｎのＫａｐｐａ係数κの算出は、Ｐ(一致率)、Ｐｅ(２つのサンプルの間で結果が偶然に一致した場合の一致率)から、κ＝（Ｐ−Ｐe）／（１−Ｐｅ）に当てはめたところ、κ値は０．５８となった。

特筆すべき点は、原発巣及び転移巣が野生型であったＩＤ番号８及びＩＤ番号１４の患者のｃｆＤＮＡ中からＧ１３Ｄ（１３番目のグリシンがアスパラギン酸に換わっているＫＲＡＳタンパク質）が検出されたことである。さらにＩＤ番号８の患者にＥＧＦＲ阻害剤であるセツキシマブを投与しても、腫瘍縮小効果は見られなかった。当該結果は、腫瘍組織のＫＲＡＳの遺伝子変異ステイタスは、必ずしもＥＧＦＲ阻害剤の治療効果予測因子にならないことを示すものである。一方で、ＩＤ番号１４の患者は、ＣＴ撮像結果から、腫瘍が２０％以上縮小した。なお、腫瘍縮小率（縮小効果）は、ＣＴ画像の腫瘍の直径から算出した。腫瘍が点在する場合は、それらの直径を合計して算出した。

また、ＩＤ番号９の患者の原発巣切除手術前の循環ＤＮＡからは、結果的に原発巣と同様のＫＲＡＳ遺伝子変異(Ｇ１２Ａ)が観察されたが、原発巣切除手術後の循環ＤＮＡ中からは、Ｇ１２Ａは検出されなかった。さらにこの患者の予後は良かった。このことから、血清又は血漿中のｃｆＤＮＡからＫＲＡＳ遺伝子変異を検出することにより、癌患者の予後、あるいは、再発診断に応用できることを示唆するものである。また、癌マーカーであるＣＥＡやＣＡ−１９−９が応答する前に、末梢血中のｃｆＤＮＡを観察することで早期診断にもつながる。

なお、実施例１における再発大腸癌患者の臨床分析においては、原発巣に突然変異したＫＲＡＳ遺伝子が観察された全患者において、再発診断時に採取された血清中からも突然変異したＫＲＡＳ遺伝子が観察された。当該結果から、原発巣切除後の再発診断において、循環中の突然変異したＫＲＡＳ遺伝子を同定することは有用であること、原発巣に対する治療を受けたことがある被験者について、経時的に血液中のＫＲＡＳのステイタスを調べることにより、再発腫瘍の存在を早期に（患者によっては、ＣＥＡやＣＡ１９−９等の既存のバイオマーカーよりも早期に）確認できる。

また、ＫＲＡＳのコドン６１について、ＫＲＡＳコドン１２，１３が原発組織、及び血清では、野生型であったサンプルに対して再検索をかけたところ、サンプル番号６、１４でＱ６１Ｈ，サンプル番号１２ではＱ６１Ｒが検出された。サンプル番号６、１４は同一患者であり、サンプル１４を採取後、ＰＤ（進行性）に転じた。したがって、血清中のコドン６１のＫＲＡＳ遺伝子変異についても、抗ＥＧＦＲ抗体薬の治療効果予測因子となることがわかった。

本発明に係るＥＧＦＲ阻害剤感受性予測方法は、末梢血サンプルを用いる。このため、原発巣切除したり、バイオプシなどの生検採取することなく、低侵襲に、ＥＧＦＲ阻害剤に対する感受性、ひいてはＥＧＦＲ阻害剤の奏効性を高精度に予測することができる。この低侵襲性と良好な精度の点から、本発明に係るＥＧＦＲ阻害剤感受性予測方法は、癌検診などで、便潜血などに変わる検査方法として広く普及すると考えられる。

Claims (22)

1. （ａ）被験者から採取された血液サンプル中に、ＫＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が存在するか否か、及び当該血液サンプル中の前記ＫＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が、野生型か変異型かを決定する工程と、
   （ｂ）前記被験者の腫瘍から採取された組織検体又は細胞検体中に、野生型のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出され、かつ変異型のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出されなかった場合に、前記工程（ａ）において、前記血液サンプル中に、変異型のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出された場合には、前記被験者の腫瘍はＥＧＦＲ阻害剤感受性ではない可能性が高いと判定する工程と、
   を有する、ＥＧＦＲ阻害剤感受性予測方法。
2. 前記血液サンプルが採取された時点において、前記被験者の腫瘍から採取された組織検体又は細胞検体に、野生型のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出され、かつ変異型のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出されなかったが、前記血液サンプル中に変異型のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出された場合に、前記被験者の腫瘍はＥＧＦＲ阻害剤感受性ではない可能性が高いと判定する、請求項１に記載のＥＧＦＲ阻害剤感受性予測方法。
3. 前記被験者が、過去に腫瘍部分の外科的切除処置を受けたことがある、請求項１又は２に記載のＥＧＦＲ阻害剤感受性予測方法。
4. 前記被験者が、過去にＥＧＦＲ阻害剤を投与されたことがある、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＥＧＦＲ阻害剤感受性予測方法。
5. 前記被験者が、過去に前記ＥＧＦＲ阻害剤に対して薬剤耐性を示していた、請求項４に記載のＥＧＦＲ阻害剤感受性予測方法。
6. 前記血液サンプルが、前記ＥＧＦＲ阻害剤を投薬された後６０日間が経過した被験者から採取されたものである、請求項４又は５に記載のＥＧＦＲ阻害剤感受性予測方法。
7. 前記被験者が、ＥＧＦＲ阻害剤の投薬処置を受けた後に、当該ＥＧＦＲ阻害剤投薬処置とは異なる他の抗腫瘍療法を受けた腫瘍患者であり、
   前記血液サンプルが、前記腫瘍患者が再び前記ＥＧＦＲ阻害剤投薬処置を受けようとする前に採取されたものである、請求項１又は２に記載のＥＧＦＲ阻害剤感受性予測方法。
8. 前記他の抗腫瘍療法が化学療法剤の投薬治療である、請求項７に記載のＥＧＦＲ阻害剤感受性予測方法。
9. 前記化学療法剤が、フルオロウラシル、フォリン酸、オキサリプラチン、イリノテカン、シタラビン、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキセート、ブレオマイシン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ミトキサントロン、カンプトセシン、トポテカン、テニポシド、コルセミド、コルヒチン、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、及びタモキシフェンからなる群より選択される１種又は２種以上である、請求項８に記載のＥＧＦＲ阻害剤感受性予測方法。
10. 前記他の抗腫瘍療法が放射線治療である、請求項７に記載のＥＧＦＲ阻害剤感受性予測方法。
11. 前記他の抗腫瘍療法が、前記被験者に既に投薬されたＥＧＦＲ阻害剤とは異なる種類の分子標的薬剤の投薬治療である、請求項７に記載のＥＧＦＲ阻害剤感受性予測方法。
12. 前記分子標的薬剤が、セツキシマブ、パニツムマブ、ベバシヅマブ、ゲフィニチブ、エルロチニブ、レゴラフェニブ、クリゾチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、エベロリムス、トラスツズマブ、ラパチニブ、及びリツキシマブからなる群より選択される１種又は２種以上である、請求項１１に記載のＥＧＦＲ阻害剤感受性予測方法。
13. 前記他の抗腫瘍療法が、前記分子標的薬剤の投薬治療と、化学療法剤の投薬治療との併用療法である、請求項１１又は１２に記載のＥＧＦＲ阻害剤感受性予測方法。
14. 前記腫瘍が、再発性腫瘍である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＥＧＦＲ阻害剤感受性予測方法。
15. 前記腫瘍が、転移巣である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＥＧＦＲ阻害剤感受性予測方法。
16. 前記腫瘍が、原発巣である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＥＧＦＲ阻害剤感受性予測方法。
17. 前記腫瘍が、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、肝癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、食道癌、頭頸部癌、子宮癌、及び子宮頸癌からなる群より選択される１種又は２種以上である、１〜１６のいずれか一項に記載のＥＧＦＲ阻害剤感受性予測方法。
18. 前記腫瘍が、前記被験者の体内の複数個所に存在している、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のＥＧＦＲ阻害剤感受性予測方法。
19. 前記変異型が、ＫＲＡＳタンパク質のＧ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｓ２、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｃ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ａ１４６Ｔ、及びＡ１４６Ｖからなる群より選択される１又は２以上である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のＥＧＦＲ阻害剤感受性予測方法。
20. 前記血液サンプル中のＫＲＡＳの存在の有無、及び野生型か変異型かの決定を、当該血液サンプル中の循環ＤＮＡから、野生型のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸が検出されるか否か、及び変異型のＫＲＡＳ遺伝子由来核酸が検出されるか否かを調べることにより行う、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のＥＧＦＲ阻害剤感受性予測方法。
21. 前記血液サンプルが、末梢血液、血清、血漿である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のＥＧＦＲ阻害剤感受性予測方法。
22. 前記血液サンプル中のＣＥＡが５ｎｇ／ｍＬ以下である、又は前記血液サンプル中のＣＡ１９−９の値が３７．０Ｕ／ｍＬ以下である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のＥＧＦＲ阻害剤感受性予測方法。