CN105074009B - Egfr抑制剂的敏感性的预测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种EGFR抑制剂的敏感性的预测方法,其包括:(a)确定工序,该工序用以确定从受试者中采集的血液样品中是否存在KRAS基因来源的核酸或其蛋白质,以及确定该血液样品中的上述KRAS基因来源的核酸或其蛋白质是野生型还是变异型;以及,(b)判断工序,在上述工序(a)中,若在上述血液样品中检测到野生型KRAS基因来源的核酸或其蛋白质而没有检测到变异型KRAS基因来源的核酸或其蛋白质,则判断上述受试者的肿瘤对EGFR抑制剂敏感的可能性高,若在上述血液样品中检测到变异型KRAS基因来源的核酸或其蛋白质,则判断上述受试者的肿瘤对EGFR抑制剂不敏感的可能性高。
Description
技术领域
本发明涉及一种通过检查从受试者中以微侵袭(微创)方式采集的生物样品中的KRAS蛋白质的基因型来预测该受试者对EGFR抑制剂的敏感性的方法。
本申请基于2013年3月19日在日本提出的特愿2013-057033号申请主张优先权,并在此援引其内容。
背景技术
表皮生长因子受体(EGFR)是包含EGFR(ErbB-1)、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)以及Her4(ErbB-4)在内的且非常密切相关的受体ErbB家族的成员。ErbB家族是在细胞的生长、分化以及生存中发挥重要作用的成长因子受体的1型酪氨酸激酶家族。对这些受体的激活而言,典型的是通过特异性配体结合来引起,且在受体家族成员之间形成异源或同源二聚体。随后,使其发生酪氨酸激酶结构域的自身磷酸化。
EGFR的激活,除了会诱导癌细胞的持续增殖和抑制作为生存中重要过程的细胞凋亡,还会诱导受体酪氨酸激酶的激活以及介导细胞的增殖、运动性、粘附性、浸润性和对化疗的耐受性的一系列下游信号传导现象。
另外,含有EGFR和HER2的该家族成员与细胞转化直接相关。因此,作为抗癌剂,目前正在开发以EGFR作为靶点的分子靶向药物。迄今为止,已进行了抗EGFR抗体和小分子EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)这两种主要类型的EGFR抑制剂的临床试验。西妥昔单抗(Cetuximab)等抗EGFR抗体被设计成与EGFR的细胞外域结合以阻碍EGFR下游的信号的激活。西妥昔单抗(其作为抗体225也是公知的,参见专利文献1)是针对表达出高水平的野生型EGFR的A431细胞进行制作而成。与此相对比,吉非替尼(化合物ZD1839,易瑞沙)和厄洛替尼(化合物OSI-774,特罗凯)等小分子TKI会竞争用于结合在EGFR酪氨酸激酶的细胞内催化结构域的ATP。其结果是,阻碍了EGFR自身磷酸化和下游信号。
近年来,在临床上逐渐明确了作为大肠癌的分子靶向药物的西妥昔单抗、帕尼单抗的治疗有效性与突变的KRAS基因或其蛋白质之间的关系、作为肺癌的分子靶向药物的吉非替尼、厄洛替尼的治疗有效性与突变的EGFR基因或其蛋白质之间的关系、以及作为ALK抑制剂的克唑替尼的治疗有效性与伴随易位的融合基因或其蛋白质之间的关系。在这些药物的使用中,包含检查KRAS突变在内的伴随诊断(companion diagnostic)受到关注。具体而言,在CRYSTAL(FOLFIRI)试验的III期(Phase III)大肠癌患者中,KRAS野生型患者在西妥昔单抗并用时的有效率为59.3%,与此相比,KRAS变异型患者在西妥昔单抗并用时的有效率为36.2%,针对KRAS变异型患者的西妥昔单抗的有效率戏剧性地达到了较低的结果(例如,参见非专利文献1)。随后,在OPUS(FOLFOX)试验的II期(Phase II)大肠癌患者中,也证明了西妥昔单抗对KRAS变异型患者的有效率极低而对野生型患者是有效的。根据这些试验效果,确定了在大肠癌患者中的突变KRAS基因成为EGFR抑制剂的治疗效果预测因子(例如,参见非专利文献2)。另外,还报告了,KRAS野生型组的治疗效果也差的情况下,BRAF、PIK3CA中存在变异的临床试验结果。然而,目前的情况是作为超过KRAS的超级无应答者(supernon-responder)证据还很少。
在通过KRAS的基因诊断来进行的EGFR抑制剂治疗方面,存在如下3个与来自受试者的样品和耐药性有关的问题。
第一个问题是,在不进行外科切除的病例中,虽然在KRAS基因诊断中使用活检标本,但其可靠性没有得到确认。另外,活检取材对于患者而言是侵袭性的,在切除原发灶后,多数情况下无法再切除复发肿瘤。因此,人们期待一种可替代直接检查肿瘤组织中的KRAS状况(KRAS的基因型)的方法的可靠性高的诊断标志物。
第二个问题是不局限于转移灶与原发灶中的变异状况一致的情况。
渡边等人报告了43例大肠癌患者中有15例为变异型患者,而原发灶与转移灶的一致率为88.4%(参见非专利文献3)。即,原发灶与转移灶的KRAS变异状况不一致的情况约占一成。另一方面,S.Gattenlohner等报告了EGFR抑制剂治疗中原发灶和转移灶的变化。对21例转移性大肠癌患者在治疗前后的状况进行了研究,其结果是有20例(95.2%)没有发生改变。发生变化的一例是异质性且为多发性病例(参见非专利文献4)。
第三个问题是在EGFR抑制剂治疗中变异型克隆增加的可能性、即对EGFR抑制剂的耐受性的获得。Diaz Jr等人在24例原发灶为野生型的大肠癌病例中,在开始进行EGFR抑制剂治疗后,检测到血浆中DNA的突变KRAS基因。其结果是,报告了从9例病例(37.5%)中检测到突变的KRAS基因,而且在全部病例中在投药后至少第26周以前都观察到变异,在检测到细胞外DNA变异的同时或者在观察以后,获得了耐受性。进而,他们提出,通过以高灵敏度检测到血清中突变的KRAS基因,能够推测获得了EGFR抑制剂的耐受性,且可改换成例如MEK抑制剂等其他药剂(参见非专利文献5)。另外,Misale等人还提出,通过以高灵敏度检测血浆中的KRAS基因变异,可预测对EGFR抑制剂的敏感性,以及在检测到血浆中的KRAS基因变异的情况下,可改换成除EGFR抑制剂以外的其他药剂(参见非专利文献6)。即,在非专利文献5和6中记载了,通过利用在循环DNA中也会检测到受试者的转移灶中存在的KRAS这一点,检查血液中的KRAS的状况。另外,还记载了由此可检查该转移灶对EGFR抑制剂的敏感性且可预测在将EGFR抑制剂供给该受试者的情况下的有效性的内容。
另一方面,作为癌症的耐药性问题的突破口,进行了与EGFR抑制剂的再给药相关的临床试验。其确认了,在再给药EGFR抑制剂的情况下与不进行再给药相比,显著延长了PFS(无进展生存期)。其想法是,在进行EGFR抑制剂治疗中,变异型克隆增殖,获得肿瘤对上述EGFR抑制剂的耐受性,但通过改换成其他治疗方法以使其变异型克隆相对减少,并在此时再给药EGFR抑制剂,由此再次奏效。实际上,进行了如下再给药的前瞻性研究,即在西妥昔单抗对人的肿瘤患者的有效性降低时,使用其他疗法进行一定时期的治疗,随后再使用西妥昔单抗进行治疗,对此D Santini等人报告了中间过程(参见非专利文献7)。在该报告中,在KRAS野生型患者的首选治疗(first line therapy)中给药西妥昔单抗,并在有效性降低时改换为其他抗癌治疗方法(例如,XELOX、FOLFOX等化疗方法等),经过一定时间后,再给药西妥昔单抗。在该前瞻性试验中,只有KRAS野生型患者的PFS得到延长,并确认有显著的延长寿命的效果。
现有技术文献
专利文献:
专利文献1:美国专利第4943533号说明书。
非专利文献1:Cutsem,et.al.,The New England Journal of Medicine,2009,vol.360,pp.1408-1417;
非专利文献2:Bokemeyer,et.al.,Annals of Oncology,2011,vol.22(7),pp.1535-1546;
非专利文献3:Watanabe,et.al.,Diseases of the Colon and Rect,2011,vol.54,pp.1170-1178;
非专利文献4:Gattenlohner,et.al.,New England Journal of Medicine,2009,vol.360(8),pp.835;
非专利文献5:Diaz Jr,et.al.,Nature,2012,vol.486,pp.537-540;
非专利文献6:Misale,et.al.,Nature,2012,vol.486(7404),pp.532-536;
非专利文献7:Santini,et.al.,Annals of Oncology,2012,vol.23,pp.2313-2318。
发明内容
发明要解决的课题
本发明涉及一种预测方法,其中,不论该患者的肿瘤组织中的KRAS的状况如何,以该患者的外周血(末梢血液)中的KRAS的状况作为指标,预测EGFR介导性肿瘤(癌)的患者对EGFR抑制剂的敏感性。
解决课题的方法
为了解决上述课题,本发明人等进行了精心研究。其结果发现,在EGFR介导性肿瘤(癌)的患者中,存在肿瘤组织中的KRAS的状况和外周血中的KRAS的状况不一致的情况,而且,对于在肿瘤组织中没有检测到KRAS的变异型而在外周血中检测到变异型KRAS的患者而言,EGFR抑制剂的有效性低,从而完成了本发明。
本发明的第一方面的EGFR抑制剂的敏感性的预测方法,包括:(a)确定工序,该工序用以确定从受试者中采集的血液样品中是否存在KRAS基因来源的核酸或其蛋白质,以及确定该血液样品中的上述KRAS基因来源的核酸或其蛋白质是野生型还是变异型;以及,(b)判断工序,在上述工序(a)中,若在上述血液样品中检测到野生型KRAS基因来源的核酸或其蛋白质而没有检测到变异型KRAS基因来源的核酸或其蛋白质,则判断上述受试者的肿瘤对EGFR抑制剂敏感的可能性高,若在上述血液样品中检测到变异型KRAS基因来源的核酸或其蛋白质,则判断上述受试者的肿瘤对EGFR抑制剂不敏感的可能性高。
在上述第一方面中,即使在从上述受试者的肿瘤采集的组织标本或细胞标本中检测到KRAS基因来源的核酸或其蛋白质与从上述血液样品中检测到的上述KRAS基因来源的核酸或其蛋白质的基因型不同的情况下,在上述工序(b)中,若从上述受试者中采集的上述血液样品中检测到上述变异型的KRAS基因来源的核酸或其蛋白质,则也可判断上述受试者的上述肿瘤对EGFR抑制剂不敏感的可能性高。
在上述第一方面中,上述受试者也可以是在过去接受过肿瘤部分的外科切除治疗的情况。
在上述第一方面中,上述受试者也可以是在过去服用过EGFR抑制剂的情况。
在上述第一方面中,上述受试者也可以是在过去表现出对上述EGFR抑制剂的耐药性的情况。
在上述第一方面中,上述血液样品也可以是从给药上述EGFR抑制剂后经过了60天的受试者中采集的血液样品。
在上述第一方面中,上述受试者也可以是在接受EGFR抑制剂的给药治疗之后接受与该EGFR抑制剂给药治疗不同的其他抗肿瘤疗法的肿瘤患者,上述血液样品也可以是上述肿瘤患者在要再次接受上述EGFR抑制剂给药治疗之前所采集的样品。
在上述第一方面中,上述其他抗肿瘤疗法也可以是化疗药物的给药治疗。
在上述第一方面中,上述化疗药物可以是选自于由氟尿嘧啶、亚叶酸、奥沙利铂、伊立替康、阿糖胞苷、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、博莱霉素、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、阿霉素、米托蒽醌、喜树碱、托泊替康、替尼泊苷、秋水仙胺、秋水仙碱、紫杉醇、长春碱、长春新碱以及他莫昔芬所组成的组中的一种或两种以上。
在上述第一方面中,上述其他抗肿瘤疗法也可以是放射线治疗。
在上述第一方面中,上述其他抗肿瘤疗法也可以是与已给药于上述受试者的EGFR抑制剂不同种类的分子靶向药物的给药治疗。
在上述第一方面中,上述分子靶向药物可以是选自于由西妥昔单抗、帕尼单抗、贝伐单抗、吉非替尼、厄洛替尼、瑞格非尼、克唑替尼、舒尼替尼、索拉非尼、依维莫司、曲妥单抗、拉帕替尼以及利妥昔单抗所组成的组中的一种或两种以上。
在上述第一方面中,上述其他抗肿瘤疗法也可以是上述分子靶向药物的给药治疗和化疗药物的给药治疗的联合疗法。
在上述第一方面中,上述肿瘤可以是复发性肿瘤。
在上述第一方面中,上述肿瘤也可以是转移灶。
在上述第一方面中,上述肿瘤也可以是原发灶。
在上述第一方面中,上述肿瘤也可以是选自于由大肠癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、食道癌、头颈部癌、子宫癌以及子宫颈癌所组成的组中的一种或两种以上。
在上述第一方面中,上述肿瘤可存在于上述受试者体内的多个位置。
在上述第一方面中,上述变异型可以是选自于由KRAS蛋白质的G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13D、G12S2、G13A、G13S、G13V、G13R、G13C、Q61H、Q61L、Q61R、A146T以及A146V所组成的组中的一种或两种以上。
在上述第一方面中,可以通过检查是否从上述血液样品中的循环DNA中检测到野生型KRAS基因来源的核酸、以及是否检测到变异型KRAS基因来源的核酸,从而确定该血液样品中是否存在KRAS、以及确定其是野生型还是变异型。
在上述第一方面中,上述血液样品可以是外周血、血清、血浆。
在上述第一方面中,上述血液样品中的CEA可为5ng/mL以下,或者上述血液样品中的CA19-9的值可为37.0U/mL以下。
发明效果
基于上述方面的EGFR抑制剂的敏感性的预测方法,能够从对受试者侵袭性低的生物样品中精度良好地预测受试者对EGFR抑制剂的敏感性。
具体实施方式
本发明一实施方式的EGFR抑制剂的敏感性的预测方法(下面也称作“本发明的敏感性预测方法”)的特征在于,不论肿瘤组织中的KRAS的状况如何,以血中的KRAS的状况作为指标来预测EGFR抑制剂的敏感性。
对于血中的KRAS为野生型且没有被检测到变异型的受试者而言,不论其肿瘤组织中的KRAS是野生型还是变异型,都预测其对EGFR抑制剂的敏感性高。相反地,对于从血中检测到变异型KRAS的受试者而言,不论其肿瘤组织中的KRAS是野生型还是变异型,都预测其对EGFR抑制剂的敏感性低。
以往,已知若肿瘤组织中存在突变的KRAS基因或其蛋白质(突变的KRAS基因来源的蛋白质)则EGFR抑制剂不会奏效。而且,还已知从EGFR介导性肿瘤(癌)患者的肿瘤组织和血中都检测到了KRAS蛋白质或KRAS基因的mRNA,但认为该血中的KRAS的状况与肿瘤组织中的KRAS的状况一致。然而,与该以往的认识相反,血中的KRAS的状况与肿瘤组织中的KRAS的状况有时会不一致。此时,令人意外的是,对于肿瘤组织中的EGFR抑制剂的有效性而言,与肿瘤组织中的KRAS的状况相比,其更取决于血中的KRAS的状况。
实际上,如后述的实施例1所示,在针对复发大肠癌患者的临床结果的分析中,尽管在原发灶和转移灶两者中都未观察到突变的KRAS基因,但在从血中的循环DNA中检测到变异型KRAS基因来源的核酸的复发大肠癌患者中,并未观察到作为EGFR抑制剂的西妥昔单抗所产生的肿瘤缩小效果。另外,尽管在原发灶和转移灶中的任一种肿瘤组织中都未检测变异型KRAS,但在从血中检测到变异型KRAS的复发大肠癌患者中,其肿瘤不对EGFR抑制剂进行响应。
即,对于未明确肿瘤组织中存在突变的KRAS基因而从外周血中的循环DNA中检测到突变的KRAS基因的受试者而言,能够预测其对EGFR抑制剂的敏感性低,而且EGFR抑制剂的有效性低。同样地,即使未明确原发灶和转移灶的肿瘤组织中存在突变KRAS基因,也能够在从外周血的循环DNA中观测到存在突变KRAS基因的情况下,预测肿瘤是不对EGFR响应的肿瘤,而且EGFR抑制剂的再给药没有奏效。由此,以血中的KRAS状况而不是肿瘤组织中的KRAS状况作为指标,能够精度良好地预测对EGFR抑制剂的敏感性,这是本发明人等首先发现而提出的见解。
即,本发明的敏感性预测方法是预测受试者对EGFR抑制剂的敏感性的方法,其特征在于,包括下述工序(a)和工序(b)。
(a)确定工序,该工序用以确定从受试者中采集的血液样品中是否存在KRAS基因来源的核酸或其蛋白质、以及确定该血液样品中的KRAS是野生型还是变异型;以及,(b)判断工序,在上述工序(a)中,若在上述血液样品中检测到野生型KRAS基因来源的核酸或其蛋白质而没有检测到变异型KRAS基因来源的核酸或其蛋白质,则判断上述受试者的肿瘤对EGFR抑制剂敏感的可能性高,若在上述血液样品中检测到变异型KRAS基因来源的核酸或其蛋白质,则判断上述受试者的肿瘤对EGFR抑制剂不敏感的可能性高。
在本发明的敏感性预测方法中进行检测的变异型KRAS,包括诸如插入、倒位、缺失和/或点突变等所有形式的突变。这些突变KRAS基因是可在体细胞性或生殖种系中发现的变异型KRAS,与分别在一个等位基因(杂合性)或两个等位基因(纯合性)中发现的野生型KRAS不同。体细胞突变只在某种组织例如肿瘤组织中产生,而不通过生殖细胞系进行遗传。生殖种系突变能够在任意身体组织中发现。
作为在本发明的敏感性预测方法中检测的变异型KRAS,优选进行伴随有KRAS基因的外显子2~4上的密码子12、13、61以及146中的一个或两个以上的氨基酸取代的突变而成的KRAS。具体而言,例如,可举出具有选自于由KRAS蛋白质的G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13D、G13A、G12S2、G13S、G13V、G13R、G13C、Q61H、Q61L、Q61R、A146T以及A146V所组成的组中的一种或两种以上的变异的变异型KRAS。将各变异型的核酸(基因)突变方式示于表1中。另外,分别地,将KRAS的氨基酸序列示于序列号1,将含有KRAS的外显子2上的密码子12的基因序列示于序列号2,将含有KRAS的外显子3上的密码子61的基因序列示于序列号3,将含有KRAS的外显子4上的密码子146的基因序列示于序列号4。
表1
氨基酸取代 | 核酸突变 | 外显子 |
G12A | 5571G>C | 2 |
G12C | 5570G>T | 2 |
G12D | 5571G>A | 2 |
G12R | 5570G>C | 2 |
G12S | 5570G>A | 2 |
G12V | 5571G>T | 2 |
G12S2 | 5570G>T,5570G>C | 2 |
G13D | 5574G>A | 2 |
G13A | 5574G>C | 2 |
G13V | 5574G>T | 2 |
G13R | 5573G>C | 2 |
G13S | 5573G>A | 2 |
G13C | 5573G>T | 2 |
Q61H | 23579A>C | 3 |
Q61L | 23578A>T | 3 |
Q61R | 23578A>G | 3 |
A146T | 25293G>A | 4 |
A146V | 25294C>T | 4 |
在本发明的敏感性预测方法中,在工序(a)中,检查血液样品中的KRAS的状况而不是肿瘤组织中的KRAS的状况。作为血液样品,可以是外周血本身,也可以是血清、血浆。与肿瘤组织相比,血液样品能够以微侵袭方式从受试者中采集,因此,即使对于像复发肿瘤患者那样难以采集肿瘤组织生物样品的受试者而言,也能够预测其对EGFR抑制剂的敏感性。另外,血液样品能够以随时间推移的方式从受试者采集,因此,本发明的敏感性预测方法也可适用于监测肿瘤是否复发。
此外,对于上述血液样品而言,优选不论原发性肿瘤、转移性肿瘤、复发性肿瘤均在肿瘤的早期阶段从受试者采集的样品。具体而言,对于本发明的敏感性预测方法中所使用的血液样品而言,优选CEA为5ng/mL以下、或者CA19-9的值为37.0U/mL以下。
在本发明的敏感性预测方法中,对于预测敏感性的EGFR抑制剂而言,只要是在包括人在内的动物中具有EGFR抑制作用的物质,就没有特别限定,可以是抗EGFR抗体,也可以是TKI。具体而言,作为抗EGFR抗体,可举出西妥昔单抗(产品名为Erbitutux(注册商标),英克隆系统公司(Imclone Systems Inc.))以及帕尼单抗(产品名为ABX-EGF,安进公司(Abgenix Inc.))。另外,作为TKI,可举出:与ATP竞争的小分子,例如厄洛替尼(产品名为特罗凯(Tarceva)(注册商标),OSI制药(OSI Pharmaceuticals)公司)、吉非替尼(产品名为易瑞沙(Iressa)(注册商标),阿斯利康(Astra-Zeneca)公司)、在“Dvir等,Journal of CellBiology,vol.113,pp.857-865(1991)”中记载的酪氨酸激酶抑制剂类(Tyrphostins);美国专利第5679683号说明书中公开的三环嘧啶化合物;在“Panek等,Journal ofPharmacology and Experimental Therapeutics,vol.283,pp.1433-1444(1997)”中公开的化合物6-(2,6-二氯苯基)-2-(4-(2-二乙氨基)苯氨基)-8-甲基-8H-吡啶并(2,3-d)嘧啶-7-酮(也称作PD166285)。在本发明的敏感性预测方法中,优选预测对这些EGFR抑制剂中的一种或两种以上的敏感性。其中,优选预测对西妥昔单抗或帕尼单抗的敏感性。
在本发明的敏感性预测方法中,作为对EGFR抑制剂的敏感性进行预测的对象的肿瘤而言,只要是EGFR介导性肿瘤(癌)即在肿瘤形成中EGFR起到某些作用的肿瘤,就没有特别限定。在该肿瘤中包括:脑、肝脏、肾脏、膀胱、乳房、胃、卵巢、结肠直肠、前列腺、胰腺、乳房、肺、外阴部、甲状腺、结肠直肠、食道、肝的癌,肉瘤,胶质母细胞瘤,头颈部肿瘤,白血病以及淋巴类恶性肿瘤。进一步详细而言,可以包括:神经母细胞瘤、肠癌(例如,直肠癌、大肠癌、家族性腺瘤性息肉癌以及遗传性非息肉病性大肠癌)、食道癌、唇癌、喉癌、下咽癌、舌癌、唾液腺癌、胃癌、腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、肾癌、肾实质癌、卵巢癌、子宫颈癌、子宫体癌、子宫内膜癌、绒毛膜癌、胰腺癌、前列腺癌、睾丸癌、乳腺癌、输尿管癌、黑色素瘤、脑肿瘤(例如,胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤、髓母细胞瘤以及外周神经外胚层肿瘤)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病骨(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、成人T细胞白血病、肝细胞癌、胆囊癌、支气管癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、多发性骨髓瘤、基底细胞癌、畸胎瘤、成视网膜细胞瘤、脉络膜黑色素瘤、精原细胞瘤、横纹肌肉瘤、颅咽管瘤(craniopharyngeoma)、骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、尤因肉瘤以及浆细胞瘤。作为在本发明的敏感性预测方法中成为预测对象的肿瘤,优选为选自于由大肠癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、食道癌、头颈部癌、子宫癌以及子宫颈癌所组成的组中的一种或两种以上。
在本发明的敏感性预测方法中,作为对EGFR抑制剂的敏感性进行预测的对象的肿瘤,可以是原发灶(原发性肿瘤)也可以是转移灶(转移性肿瘤)。
另外,还可以是复发性肿瘤。而且,肿瘤可存在于受试者体内的多个位置。
在本发明的敏感性预测方法中,优选就复发性肿瘤对EGFR抑制剂的敏感性进行预测。例如,能够通过使用从过去曾接受过肿瘤部分的外科切除治疗的受试者、过去曾被给药过EGFR抑制剂的受试者中采集的血液样品,来预测复发性肿瘤、转移灶对EGFR抑制剂的敏感性。此外,在受试者过去曾被给药过EGFR抑制剂的情况下,优选使用在给药EGFR抑制剂后经过60天之后所采集的血液样品。在EGFR抑制剂治疗的治疗期间,为了一边预测对该EGFR抑制剂的敏感性一边进行治疗,优选持续实施本发明的敏感性预测方法。通常,用于肿瘤标志物检查的血液采样约一个月一次,CT检查约三个月一次,因此,从与之平衡的观点出发认为,优选每60天左右实施一次本发明的敏感性预测方法。
另外,在本发明的敏感性预测方法中所使用的血液样品,可以是从过去曾对EGFR抑制剂表现出耐药性的受试者中所采集的样品。即使是过去曾对EGFR抑制剂表现出耐药性的受试者,若没有从血液样品中检测到变异型KRAS基因来源的核酸或其蛋白质,则能够判断该受试者在其血液样品被采集时对EGFR抑制剂有敏感性。因此,能够判断通过服用EGFR抑制剂而获得肿瘤缩小效果的可能性高。相反地,若从血液样品中检测到变异型KRAS基因来源的核酸或其蛋白质,则能够判断该受试者在其血液样品被采集时对EGFR的敏感性低,而且即使服用EGFR抑制剂也无法获得肿瘤缩小效果的可能性高。
本发明的敏感性预测方法,也优选针对从再次给药EGFR抑制剂的受试者中采集的血液样品进行实施。在此,所谓“再次给药EGFR抑制剂的受试者”是指:在接受过EGFR抑制剂的给药治疗后,正在接受与该EGFR抑制剂给药治疗不同的其他抗肿瘤疗法,并计划随后再次接受EGFR抑制剂的给药治疗的受试者。虽然有时在给药EGFR抑制剂的情况下会获得耐受性,但是,通过在再次给药前预先检查血中的KRAS的状况,能够预测再次给药中的EGFR抑制剂的有效性。即,若在再次给药前从采自受试者的血液样品中未检测到变异型KRAS基因来源的核酸或其蛋白质,则能够判断该受试者对EGFR抑制剂有敏感性,而且通过再次给药EGFR抑制剂而获得肿瘤缩小效果的可能性高。相反地,若从血液样品中检测到变异型KRAS基因来源的核酸或其蛋白质,则能够判断即使再次给药EGFR抑制剂也无法获得肿瘤缩小效果的可能性高。
此外,作为再次给药EGFR抑制剂之前所接受的其他抗肿瘤疗法,能够根据受试者的病理状况,从公知的抗肿瘤疗法中适当选择使用。作为上述其他抗肿瘤疗法,具体而言,可举出放射线治疗、化疗药物的给药治疗、与已给药的EGFR抑制剂不同种类的分子靶向药物的给药治疗等。作为所述其他抗肿瘤疗法,也可以是一种或两种以上的抗肿瘤疗法的联合疗法。例如,作为本发明的敏感性预测方法,优选分子靶向药物的给药治疗和化疗药物的给药治疗的联合疗法。
作为上述化疗药物并没有限定,可以是具有细胞毒性或细胞分裂抑制性的化合物。具体而言,包括:(i)代谢拮抗剂,例如,氟尿嘧啶、阿糖胞苷、氟达拉滨、5-氟-2'-脱氧尿苷、吉西他滨、羟基脲或氨甲蝶呤;(ii)DNA断裂剂,例如博来霉素;(iii)DNA交联剂,例如,苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺或氮芥;(iv)嵌入剂,例如,阿霉素(多柔比星)或米托蒽醌;(v)蛋白质合成抑制剂,例如,L-天冬酰胺酶、放线菌酮、嘌呤霉素或白喉毒素;(vi)拓扑异构酶I毒素,例如,喜树碱或托泊替康;(vii)拓扑异构酶II毒素,例如,依托泊苷(VP-16)或替尼泊苷;(viii)微管相关剂,例如,秋水仙碱、秋水仙素、紫杉醇(paclitexel)、长春碱或长春新碱;(ix)激酶抑制剂,例如,黄酮类抗肿瘤药(flavopiridol)、星形孢菌素、STI571(CPG57148B)或UCN-01(7-羟基星形孢菌素);(x)各种临床研究用新药,例如,Thioplatin(含有铂硫键的配合物)、PS-341、Phenylbutyrate(苯丁酸盐(酯))、ET-18-OCH3或法尼基转移酶抑制剂(L-739749,L-744832);多酚类,例如槲皮素、白藜芦醇、白皮杉醇、表没食子儿茶素没食子酸酯、茶黄素类、黄烷醇类、原花青素类、桦木酸及其衍生物;(xi)激素,例如,糖皮质激素或芬维A胺;(vii)抗激素,例如,他莫昔芬、非那雄胺或LHRH拮抗剂。另外,还含有亚叶酸、奥沙利铂、伊立替康、道诺霉素、泰索帝以及丝裂霉素C。在上述其他抗肿瘤疗法中,可以仅使用这些化疗药物中的一种,也可以组合两种以上使用。
针对从接受EGFR抑制剂的给药治疗后进行化疗药物的给药治疗并预定随后进一步再次给药EGFR抑制剂的受试者中采集的血液样品实施本发明的敏感性预测方法的情况下,作为该化疗药物,优选为选自于由氟尿嘧啶、亚叶酸、奥沙利铂、伊立替康、阿糖胞苷、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、博莱霉素、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、阿霉素、米托蒽醌、喜树碱、托泊替康、替尼泊苷、秋水仙胺、秋水仙碱、紫杉醇、长春碱、长春新碱以及他莫昔芬所组成的组中的一种或两种以上。
作为上述分子靶向药物,具体而言,可举出选自于由西妥昔单抗、帕尼单抗、贝伐单抗、吉非替尼、厄洛替尼、瑞格非尼、克唑替尼、舒尼替尼、索拉非尼、依维莫司、曲妥单抗、拉帕替尼以及利妥昔单抗所组成的组中的一种或两种以上。
在上述工序(a)中,血液样品中的KRAS的状况可由蛋白质水平确定,也可由核酸水平(基因组DNA或mRNA)确定。在本发明的敏感性预测方法中,从能够以高灵敏度进行检测的观点出发,优选以KRAS基因来源的核酸作为测定对象。具体而言,优选通过检查是否从该血液样品中的循环DNA中检测到野生型和变异型的KRAS基因来源的核酸来确定上述血液样品中是否存在KRAS,以及确定其是野生型还是变异型。所谓KRAS基因来源的核酸,可举出:将KRAS基因的基因组DNA的全长或其中一部分、KRAS基因的mRNA的全长或其中一部分、上述mRNA的全长或其中一部分作为模板而得到的cDNA;或者,采用聚合酶链反应(PCR)等对它们进行人工扩增而得到的扩增产物。
依照常规方法,能够检测血液样品中KRAS基因来源的核酸,并确定所检测到的KRAS基因来源的核酸的基因型。
例如,对于血液样品中的KRAS的存在及其状况而言,能够通过使用数字PCR以检测到血液样品中所含的KRAS基因来源的核酸来进行确定。特别是通过使用伯乐公司(Bio-Rad社)的液滴数字PCR(ddPCR)技术(Hindson,et.al.,Analytical Chemistry,2011,vol.83(22),pp.8604-8610),能够以高灵敏度进行检测。液滴的数量越多,解析精度越高。为了确保检测到0.01%的突变的性能,每检测一个突变则需要10000个液滴。为此,优选规定PCR的Master Mix预混液中的表面活性剂浓度。例如,作为DNA延伸酶等的保存溶液所使用的乙二醇或甘油的终浓度优选是0.15%以下,或者Triton-X的终浓度优选是0.0003%以下。一旦上述表面活性剂达到上述终浓度以上,由液滴所造成的乳液数量急剧降低,变得很难以高灵敏度检测突变。
另外,也优选:使用从血液样品得到的核酸和核酸片段进行15~50个循环的第一次PCR,由此使该核酸中所含的变异型KRAS的等位基因拷贝数的绝对量增加后,再稀释至106个拷贝数左右,然后实施公知的突变检测方法。基于该方法可使反应体系中存在的变异型的总数增加,因此,即使突变的种类增加,也能够降低在物理上不存在变异型等位基因的情况下不能检测的可能性。进而,也可将该方法与上述数字PCR组合使用。
作为其他方法,例如,可举出:通过以血液样品中的核酸作为模板的PCR等对包含编码KRAS基因中的变异部位的编码区域的片段进行扩增后,针对该扩增产物,以高灵敏度检测其是否接触可特异性地与KRAS的特定的基因型杂交的探针而形成了杂合体的方法。也优选在进行杂交之前,对上述扩增产物的稀释物进行乳液PCR。
对上述探针而言,使用例如放射性同位素(3H、32P、33P等)、荧光剂(罗丹明、荧光素等)或发色剂以可检测到的方式进行标记。另外,该探针可以是反义低聚物,例如PNA、吗啉代磷酰胺(morpholino phosphoroamidate)类或LNA。此外,该探针的碱基长度可以是约8至约100个核苷酸或者约10至75个核苷酸、或者约15至约50个核苷酸、或者约20至约30个核苷酸。
对于血液样品中的KRAS的存在及其状况,能够使用侵入法(Michael Olivier,Mutation Research 573:103-110,2005)进行分析。所谓侵入法,是指针对通过PCR等制备的双链DNA或mRNA以使其部分形成三碱基(triple base)的方式进行等位基因探针和侵入寡核苷酸(invader oligo)的杂交。此时,等位基因探针的5’末端的一部分被设计成具有不与上述双链DNA、mRNA互补的序列(翼部(flap part))。另一方面,侵入寡核苷酸则具有完全与它们互补的序列。两种等位基因探针,被设计成分别对野生型、变异型互补的探针,且在对上述双链DNA、mRNA进行竞争性杂交、以完全互补的方式进行杂交时,侧翼核酸内切酶对一部分成为三碱基的部位进行识别,且等位基因探针的翼部与存在于同一反应体系中的自身互补型FRET基座(FRET cassette、检测用DNA基质)进行杂交。
此时,形成了上述一部分成为三碱基的部位,侧翼核酸内切酶对目标突变进行切断,且FRET基座内被荧光修饰过的DNA片段发生游离并由于其与FRET内的光猝灭物质分离而发出荧光。理论上,这是一种能够高灵敏度检测突变的方法,其中,被切断了一次的等位基因探针的翼部,还能够再次与其他的FRET基座进行杂交,使信号增幅。
为了扩增含有针对KRAS基因中变异部位进行编码的区域的片段,能够使用该领域中所周知的连接酶链反应(例如,参见Wu,et.al.,Genomics,1989,vol.4,pp.560-569)。另外,也能够使用称为等位基因特异性PCR技术(例如,参见Ruano and Kidd,Nucleic AcidsResearch,1989,vol.17,pp.8392)。基于该技术,使用与特定的KRAS突变在其3’末端进行杂交的引物。在不存在特定的KRAS突变的情况下,观察不到扩增产物。另外,也能够使用扩增阻滞突变系统(Amplification Refractory Mutation System(ARMS))(例如,参见欧洲专利申请公开第0332435号以及“Newton et.al.,Nucleic Acids Research,1989,vol.17,pp.7”)。
为了检测血液样品中的KRAS基因来源的核酸、确定所检测的KRAS基因来源的核酸的基因型,也能够使用在检测基因变异、检测基因的插入以及缺失的情况下所使用的其他方法。作为该方法,具体而言,例如,可举出:使用基于桑格法的序列分析方法,直接确定血液样品中的KRAS基因的基因组DNA或mRNA、或者它们的扩增产物等的碱基序列的方法。另外,也能够通过PCR来确定碱基序列。此外,能够将相对于基因或周围的标记基因的限制性片段长度多态性(RFLP)探针用于针对多态性片段中的等位基因的改变或插入进行比分评价。另外,还能够将单链DNA构象多态性(SSCP)分析用于检测等位基因的碱基变化突变体(“Orita et.al.,Proceedings of the National Academy of Sciences,USA,1989,vol.86,pp.2766-2770”以及“Genomics,1989,vol.5,pp.874-879”)。
此外,通过将检测血液样品中的KRAS基因来源的核酸、确定所检测的KRAS基因来源的核酸的基因型时所使用的试剂等制成试剂盒,能够更简便地实施本发明的敏感性预测方法。作为该试剂,例如,可举出:用来从血液样品中提取核酸的试剂、聚合酶或连接酶等酶,可特异性地与KRAS的特定基因型进行杂交的探针、引物(与KRAS基因突变的部位或其相邻部位进行特异性杂交的寡核苷酸)。另外,在该试剂盒中,也可包括:有关从血液样品中检测KRAS基因来源的核酸、确定其基因型的方法的实验方案,记载有关根据所得到的KRAS基因型(状况)的结果来判断EGFR抑制剂敏感性的标准的说明文件。
本发明的敏感性预测方法可在判断是否适用EGFR抑制剂的给药治疗时提供重要信息。即,本发明的敏感性的预测方法能够为临床医生提供有用的信息;而且,基于由该方法得到的信息,临床医生能够确定合适的治疗方法。
实施例
下面,通过举出实施例对本发明进行具体说明,但本发明并不局限于下述实施例。
[实施例1]
对于外科切除了原发灶的23名复发性大肠癌患者而言,针对从原发灶、转移灶以及转移灶被确认后所采集血液中制备的血清中含有的KRAS,检查了伴随非同义氨基酸置换的突变。
(临床样品)
在原发灶的外科切除手术之前或之后,采集复发性大肠癌患者的外周血6mL,随后进行离心处理(3000rpm,10分钟)得到血清。另外,对于ID编号9的患者,在转移灶的外科切除手术之后,也采集其外周血6mL,以相同方式得到血清成分(16号样品(样品编号16))。另外,也将一部分患者的原发灶、转移灶的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)切片作为实验样品。此外,本试验的实施得到日本医科大学附属医院内的伦理审查委员会的批准,并获得了全部患者的包含本研究在内的知情同意书。将有关本实验的患者信息示于表2中。在表2中,“转移灶”一栏的“—”是指确认有转移灶之前的患者。另外,表2中“西妥昔单抗”一栏的“有”是指在转移灶的外科切除手术之后(其中,对8号样品和11号样品而言,是指原发灶的外科切除手术之前)进行了西妥昔单抗的给药治疗,而同一栏中的“无”是指没有进行同样的给药治疗。表2中,“化疗”一栏示出了在转移灶的外科切除手术后进行西妥昔单抗给药治疗的时间点(其中,在20号和21号样品中是原发灶的外科切除手术后进行西妥昔单抗给药治疗的时间点,而在16号样品中是采集血液样品的时间点)实施化疗的情况。进一步详细而言,“无”是指未决定给药但以后有可能给药的患者,“实施前”是指预定实施,“实施中”是指化疗奏效且继续给药的状态,“实施后”是指化疗奏效但在该时间点停止给药,“结束后”是指化疗不再奏效的状态(即,进入姑息护理的状态)。
表2
对原发灶为KRAS野生型的ID编号8和ID编号15的患者进行抗EGFR抗体药物治疗。同时,在切除原发灶之前进行抗EGFR抗体药物治疗之后,切除了原发灶。对ID编号8的患者进行西妥昔单抗给药治疗和FOLFOX化疗(氟尿嘧啶、亚叶酸、奥沙利铂)。对于西妥昔单抗而言,采用间隔两周给药法进行给药,以780mg/body(个体)经1小时进行静脉滴注给药。对于FOLFOX化疗而言,经2小时进行静脉滴注给药300mg/body的亚叶酸(Leucovorin:甲酰四氢叶酸)和125mg/body的奥沙利铂,而对于氟尿嘧啶(5-FU)而言,在快速静脉滴注给药625或500mg/body后,再以3800mg/body进行了22小时的持续静脉滴注给药。将给药记录示于表3中。
表3
患者ID.8的EGFR抑制剂治疗 单位:mg/body(个体)
对ID编号15的患者进行帕尼单抗或西妥昔单抗的给药治疗和FOLFOX化疗(氟尿嘧啶、亚叶酸、奥沙利铂)。帕尼单抗或西妥昔单抗是通过间隔两周给药法进行给药,经1小时进行静脉滴注给药360mg/body的帕尼单抗或800mg/body的西妥昔单抗。对于FOLFOX化疗而言,经2小时静脉滴注给药350mg/body的亚叶酸(Leucovorin)和145或140mg/body的奥沙利铂,而对于氟尿嘧啶(5-FU)而言,在快速静脉滴注给药675或650mg/body后,再以22小时进行了4110mg/body的持续静脉滴注给药。将给药记录示于表4中。
表4
患者ID.15的EGFR抑制剂治疗 单位:mg/body
(血清中的CEA和CA-19-9的测定)
通过CLEIA法(化学发光酶联免疫分析法)对血清中的CEA以及CA-19-9进行测定。将测定结果示于表5中。
(从血清中分离和纯化无细胞(cf)DNA)
使用QIAamp循环核酸试剂盒(凯杰(Qiagen)公司)从血清中分离和纯化cfDNA。提供给本试剂盒的血清样品量为2mL~4mL,因患者而异。DNA的分离和纯化工序依照试剂盒中附带的说明书进行。使用50μL的TE缓冲液从旋转柱中进行最终洗脱。
(从FFPE切片中分离和纯化DNA)
使用QIAamp DNA FFPE组织试剂盒(凯杰公司)从FFPE切片中分离和纯化DNA。每一个样品使用3片被切成10μm薄片的FFPE切片。DNA的分离和纯化工序依照试剂盒中附带的说明书进行。使用100μL的TE缓冲液从旋转柱中进行最终洗脱。
(DNA的定量)
使用Quant-iT(注册商标)PicoGreen(注册商标)dsDNA定量试剂和试剂盒(英杰(Invitorogen)公司)对从cfDNA和从FFPE切片中分离纯化的DNA进行了定量。测定用的样品全部用TE缓冲液将所分离的DNA稀释至20倍而成的样品。荧光测定装置使用了SAFIRA(TECAN社)。
(直接测序)
使用直接测序法进行原发灶、转移灶的手术样品以及血清中的KRAS碱基序列分析。作为KRAS直接测序用的引物序列,使用KRAS(正向):5’-GAATGGTCCTGCACCAGTAA-3’(序列号5)、KRAS(反向):5’-GTGTGACATGTTCTAATATAGTCA-3’(序列号6)。各PCR产物的长度为214bp,PCR条件是在95℃下进行10分钟的预变性后,以94℃下20秒、60℃下20秒、72℃下30秒作为一个循环而进行40个循环,随后在72℃温度进行10分钟的延伸反应。对序列分析而言,使用ABI3730(应用生物系统(Applied Biosystems)公司,福斯特城,加利福尼亚,美国(Foster City,CA)),采用终止物标记法(Big Dye Terminator)进行循环测序。将结果示于表5中。表5的“血清”一栏中,基因型的词尾的“(术前)”和“(术后)”分别是指原发灶(仅16号样品为转移灶)的外科切除手术之前或之后所采集的血清中的基因型。另外,表5的“转移灶”一栏中,“—”是指没有对转移灶中的KRAS的基因型进行分析。
表5
原发灶的手术样品的KRAS基因变异(密码子12、13)与cfDNA中的KRAS基因变异的一致率为81.8%。另外,表6中示出了原发灶与cfDNA中的KRAS基因变异的相关表。在表6中,“pDNA”是指从原发灶提取的DNA。对于科恩(Cohen)的Kappa系数κ的计算而言,根据P(一致率)、Pe(两个样品之间在结果偶然一致时的一致率)并套用κ=(P-Pe)/(1-Pe)时,κ值为0.58。
表6
值得特别提及的一点是,从原发灶和转移灶为野生型的ID编号8和ID编号14的患者的cfDNA中检测到G13D(第13个甘氨酸替换为天冬氨酸的KRAS蛋白质)。进而,即使对ID编号8的患者给药作为EGFR抑制剂的西妥昔单抗,也没有观察到肿瘤缩小的效果。该结果显示出,肿瘤组织的KRAS的基因变异状况未必成为EGFR抑制剂的治疗效果的预测因子。另一方面,
根据CT成像结果,ID编号14的患者的肿瘤缩小了20%以上。此外,肿瘤缩小率(缩小效果)是根据CT图像的肿瘤的直径来求出。在肿瘤散布于各处的情况下,对它们的直径进行合计来求出。
另外,从ID编号9的患者的原发灶切除手术前的循环DNA中相应地观察到了与原发灶相同的KRAS基因变异(G12A),而在原发灶切除手术后的循环DNA中未检测到G12A。此外,该患者的预后(prognosis)良好。由此可见,能够通过从血清或血浆中的cfDNA中检测KRAS基因变异来应用于癌症患者的预后或复发诊断中。另外,在作为癌症标志物的CEA、CA-19-9发生响应之前,通过观察外周血中的cDNA,也可用于早期诊断。
此外,在实施例1中的复发大肠癌患者的临床分析中,在原发灶中观测到了突变的KRAS基因的全部患者中,从复发诊断时所采集的血清中也观测到了突变的KRAS基因。根据这一结果,在原发灶切除后的复发诊断中,针对循环中突变的KRAS基因进行鉴定是有用的,而且对于接受过原发灶治疗的受试者而言,通过随时间推移地检查其血液中的KRAS的状况,能够早期确认复发肿瘤的存在(在一些患者中会早于CEA、CA-19-9等现有的生物标志物)。
另外,对于KRAS的密码子61而言,针对KRAS密码子12、13在原发组织和血清中是野生型的样品再次进行了检查,结果在6号、14号样本中检测到Q61H,在12号样本中检测到Q61R。6号、14号样品属于相同的患者,并且在收集14号样品后,转变为PD(ProgressionDisease,疾病进展)。由此可知,血清中的密码子61的KRAS基因变异也成为抗EGFR抗体药的治疗效果的预测因子。
工业实用性
本发明的EGFR抑制剂的敏感性的预测方法使用了外周血样品。因此,不需要切除原发灶或者进行活组织检查等的活检取材,并且能够以微侵袭方式来预测对EGFR抑制剂的敏感性,进而以高精度预测EGFR抑制剂的作用效果。从这种微侵袭性和良好精度的观点出发,认为本发明的EGFR抑制剂的敏感性的预测方法会作为替代大便潜血等检查方法在癌筛查等方面广泛普及。
Claims (20)
1.试剂在制备预测EGFR抑制剂的敏感性的试剂盒中的用途,用于判断是否适用EGFR抑制剂的给药治疗,所述预测EGFR抑制剂的敏感性包括:
(a)确定工序,该工序用以确定从受试者中采集的血液样品中是否存在KRAS基因来源的核酸或其蛋白质,以及确定该血液样品中的所述KRAS基因来源的核酸或其蛋白质是野生型还是变异型;以及,
(b)判断工序,在所述工序(a)中,若在所述血液样品中检测到野生型KRAS基因来源的核酸或其蛋白质而没有检测到变异型KRAS基因来源的核酸或其蛋白质,则判断所述受试者的肿瘤对EGFR抑制剂敏感的可能性高,若在所述血液样品中检测到变异型KRAS基因来源的核酸或其蛋白质而从采自所述受试者的所述肿瘤的组织标本或细胞标本中没有检测到变异型KRAS基因来源的核酸或其蛋白质,则判断所述受试者的肿瘤对EGFR抑制剂不敏感的可能性高,
并且,所述变异型是选自于由KRAS蛋白质的G12S2、G13A、G13S、G13V、G13R、G13C、Q61H、Q61L、Q61R、A146T以及A146V所组成的组中的一种或两种以上。
2.如权利要求1所述的试剂在制备预测EGFR抑制剂的敏感性的试剂盒中的用途,其中,所述受试者在过去曾接受过肿瘤部分的外科切除治疗。
3.如权利要求1所述的试剂在制备预测EGFR抑制剂的敏感性的试剂盒中的用途,其中,所述受试者在过去曾被给药过EGFR抑制剂。
4.如权利要求3所述的试剂在制备预测EGFR抑制剂的敏感性的试剂盒中的用途,其中,所述受试者在过去表现出对所述EGFR抑制剂的耐药性。
5.如权利要求3所述的试剂在制备预测EGFR抑制剂的敏感性的试剂盒中的用途,其中,所述血液样品是从给药所述EGFR抑制剂后经过60天的受试者中所采集的血液样品。
6.如权利要求1所述的试剂在制备预测EGFR抑制剂的敏感性的试剂盒中的用途,其中,
所述受试者是,在接受过EGFR抑制剂的给药治疗后,接受了与该EGFR抑制剂给药治疗不同的其他抗肿瘤疗法的肿瘤患者,
所述血液样品是所述肿瘤患者在要再次接受所述EGFR抑制剂给药治疗之前所采集的样品。
7.如权利要求6所述的试剂在制备预测EGFR抑制剂的敏感性的试剂盒中的用途,其中,所述其他抗肿瘤疗法是化疗药物的给药治疗。
8.如权利要求7所述的试剂在制备预测EGFR抑制剂的敏感性的试剂盒中的用途,其中,所述化疗药物是选自于由氟尿嘧啶、亚叶酸、奥沙利铂、伊立替康、阿糖胞苷、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、博莱霉素、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、阿霉素、米托蒽醌、喜树碱、托泊替康、替尼泊苷、秋水仙胺、秋水仙碱、紫杉醇、长春碱、长春新碱以及他莫昔芬所组成的组中的一种或两种以上。
9.如权利要求6所述的试剂在制备预测EGFR抑制剂的敏感性的试剂盒中的用途,其中,所述其他抗肿瘤疗法是放射线治疗。
10.如权利要求6所述的试剂在制备预测EGFR抑制剂的敏感性的试剂盒中的用途,其中,所述其他抗肿瘤疗法是与已给药于所述受试者的EGFR抑制剂不同种类的分子靶向药物的给药治疗。
11.如权利要求10所述的试剂在制备预测EGFR抑制剂的敏感性的试剂盒中的用途,其中,所述分子靶向药物是选自于由西妥昔单抗、帕尼单抗、贝伐单抗、吉非替尼、厄洛替尼、瑞格非尼、克唑替尼、舒尼替尼、索拉非尼、依维莫司、曲妥单抗、拉帕替尼以及利妥昔单抗所组成的组中的一种或两种以上。
12.如权利要求10所述的试剂在制备预测EGFR抑制剂的敏感性的试剂盒中的用途,其中,所述其他抗肿瘤疗法是所述分子靶向药物的给药治疗和化疗药物的给药治疗的联合疗法。
13.如权利要求1所述的试剂在制备预测EGFR抑制剂的敏感性的试剂盒中的用途,其中,所述肿瘤是复发性肿瘤。
14.如权利要求1所述的试剂在制备预测EGFR抑制剂的敏感性的试剂盒中的用途,其中,所述肿瘤是转移灶。
15.如权利要求1所述的试剂在制备预测EGFR抑制剂的敏感性的试剂盒中的用途,其中,所述肿瘤是原发灶。
16.如权利要求1所述的试剂在制备预测EGFR抑制剂的敏感性的试剂盒中的用途,其中,所述肿瘤是选自于由大肠癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、食道癌、头颈部癌、子宫癌以及子宫颈癌所组成的组中的一种或两种以上。
17.如权利要求1所述的试剂在制备预测EGFR抑制剂的敏感性的试剂盒中的用途,其中,所述肿瘤存在于所述受试者体内的多个位置。
18.如权利要求1所述的试剂在制备预测EGFR抑制剂的敏感性的试剂盒中的用途,其中,通过检查是否从所述血液样品中的循环DNA中检测到野生型KRAS基因来源的核酸以及是否检测到变异型KRAS基因来源的核酸,从而确定所述血液样品中是否存在KRAS以及确定其是野生型还是变异型。
19.如权利要求1所述的试剂在制备预测EGFR抑制剂的敏感性的试剂盒中的用途,其中,所述血液样品是外周血、血清、血浆。
20.如权利要求1所述的试剂在制备预测EGFR抑制剂的敏感性的试剂盒中的用途,其中,所述血液样品中的CEA是5ng/mL以下,或者所述血液样品中的CA19-9的值是37.0U/mL以下。
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