CN112162042B - 超高效液相色谱串联质谱测定血浆中amg510浓度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种超高效液相色谱串联质谱测定血浆中分子靶向药AMG 510浓度的方法，包括：配制标准曲线工作液，配制内标物工作液；将0‑5μL标准曲线工作液分别加入空白血浆补足至20μL，涡旋制成标准曲线血浆样品，加入内标物工作液和甲醇，涡旋，离心，取上清液，进行UPLC‑MS/MS定量分析，绘制标准曲线；精密吸取20μL的待测血浆，样本前处理方法同上，按照当批次的标准曲线测定AMG 510的浓度。本发明首次测定抗非小细胞肺癌分子靶向药物AMG 510的血药浓度，灵敏度高、专属性强、快速、重现性好，可进一步推广至临床高通量检测或监测AMG 510浓度，提高癌症患者的获益风险比。

Description

超高效液相色谱串联质谱测定血浆中AMG510浓度的方法

技术领域

本发明涉及检测药物浓度的方法。更具体地说，本发明涉及一种超高效液相色谱串联质谱测定血浆分子靶向药AMG 510浓度的方法。

背景技术

近年来，随着抗肿瘤分子靶向药物在临床广泛应用，以表皮生长因子受体(EGFR)、间变淋巴瘤激酶(ALK)重排、血管内皮生长因子受体(VEGFR)等为代表的酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)显著提高了晚期癌症患者的获益风险比。KRAS基因位于12号染色体，是RAS家属的一个原癌基因，是细胞内信号传导通路中重要的“开关”。一旦它打开，将会活化多种分裂、增殖因子，包括c-Raf和PI3K。正常情况下，KRAS会和GTP结合，把GTP的最末一个磷酸基切掉，让它变成GDP。在把GTP变成GDP后，KRAS就关闭失活。但是KRAS基因突变后，KRAS蛋白持续保持活化状态，不再依赖上级信号的刺激，处于与GTP持续结合的状态，导致下游的信号通路异常活跃，从而促进细胞的生长与增值。KRAS突变位点作为最常见的致癌基因之一，存在于约25％的所有癌症中。其中KRAS(G12C)占所有KRAS突变的40％以上，且在肺癌中高度显性(约占13％)。

AMG 510是首个针对KRAS(G12C)基因突变的晚期癌症患者中进行临床试验的抑制剂。早期研究结果表明，在非小细胞肺癌(NSCLC)中，90％的患者疾病可得到控制(n＝10)，5例患者接受AMG 510治疗后肿瘤缩小，另外4例肿瘤停止生长。随访了34例NSCLC患者，在可评价有效性队列13例患者中7例患者获得部分缓解，6例患者疾病稳定，提示疾病控制率为100％。另外，临床前研究结果显示，AMG 510与PD-1抑制剂联用后免疫活性小鼠肿瘤生长受到显著抑制，提示两者联用可能发挥协同作用。目前，AMG 510正在进行临床Ⅱ-Ⅲ期研究，尚无更多有效性数据披露。

众所周知，血浆药物浓度及暴露量信息对于评价药物的有效性、安全性及耐受性至关重要。药物浓度是发挥药效的基础，同时也是导致药物疗效不佳、毒性增大的重要因素之一。通过定期监测患者的血药浓度有助于预测疗效及可能的不良反应，显著提高患者的获益风险比、从而实现个体化精准用药。然而，关于AMG 510的超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)定量检测方法未见报道。因此，建立一种准确、快速、高通量的方法用于测定血中AMG 510药物浓度是非常必要和需要的。为满足临床前和临床高通量检测、血药浓度监测的要求，本领域亟需无特殊的设备要求、高通量、样品需求少、方便、快速的测定AMG 510浓度的UPLC-MS/MS方法。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种超高效液相色谱串联质谱测定血浆分子靶向药AMG 510浓度的方法，将为后续临床常规治疗药物监测奠定技术基础。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种超高效液相色谱串联质谱测定血浆AMG 510浓度的方法，包括：

采用甲醇溶解AMG 510配制多个浓度的标准曲线工作液，采用甲醇溶解卡马西平内标物配制成内标物工作液；

将0-5μL的AMG 510多个浓度的标准曲线工作液分别加入大鼠空白血浆补足至20μL，涡旋制成多个浓度的标准曲线血浆样品，加入10μL内标物工作液和50μL甲醇，涡旋，0-4℃下离心，取上清液，进行UPLC-MS/MS定量分析，以血浆样品中AMG 510浓度为横坐标，以峰面积与卡马西平内标物峰面积的比值为纵坐标，绘制线性范围分别为0.5-500ng/mL的标准曲线；

精密吸取20μL的待测血浆，加入绘制标准曲线时等量的内标物工作液、甲醇，涡旋，0-4℃下离心，取上清液，进行UPLC-MS/MS定量分析，在所述标准曲线上读取测得的AMG510峰面积与内标物峰面积的比值对应的AMG 510浓度；

液相条件为：色谱柱为Waters XBrige C₁₈，内径2.1mm、柱长50mm、粒径3.5mm，流速0.4mL/min，进样体积2μL，分析时间3min，柱温为40℃，洗针溶液为体积比为1:1:1:1的异丙醇、乙腈、甲醇和水的混合溶液，流动相的有机相为含有质量分数为0.1％的甲酸的乙腈，水相为含有质量分数为0.1％的甲酸的水，梯度洗脱设置为0-0.1min、0.1-1.2min、1.2-2.2min、2.2-3min有机相与水相的体积比分别为1:9、9:1、1:0、1:9；

质谱条件为：采用电喷雾离子源的多反应监测模式，正离子扫描模式，多反应监测模式，AMG 510的母、子离子对的质荷比为m/z 561.4→317.1(定性)、m/z 561.4→134.1(定量)、内标的母、子离子对的质荷比为m/z 237.0→194.1，每个多反应监测模式通道的扫描时间为200ms，质谱的离子化温度为550℃、气帘气20psi、雾化气和辅助气均为55psi、离子化电压为5500V、入口电压为10eV、碰撞室出口电压为13eV。

优选的是，采用甲醇溶解AMG 510配制成浓度为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL的标准曲线工作液，采用甲醇溶解卡马西平内标物配制成浓度为10ng/mL的内标物工作液。

优选的是，精密吸取2μL标准曲线工作液，加入18μL空白血浆，加入10μL内标物工作液。

优选的是，涡旋震荡1min，4℃下13500rpm离心10min。

优选的是，采用甲醇溶解AMG 510配制多个浓度的质控工作液，采用甲醇溶解卡马西平内标物配制成内标物工作液；

将0-5μL多个浓度的质控工作液分别加入空白血浆补足至20μL，涡旋制成多个浓度的质控血浆样品，加入10μL内标物工作液和50μL甲醇涡旋，0-4℃下离心，取上清液，进行UPLC-MS/MS定量分析，校正所述标准曲线，使至少2/3的质控样品的准确度在标示值的±15％内，且每一浓度水平至少50％样品应符合这一标准。

优选的是，采用甲醇溶解AMG 510配制成浓度为10ng/mL、200ng/mL、4μg/mL的质控工作液。

优选的是，精密吸取2μL质控工作液，加入18μL空白血浆，加入10μL内标物工作液和50μL甲醇。

本发明至少包括以下有益效果：

第一、AMG 510是一种酞嗪类化合物，其化学名称为4-[(S)-4-丙烯酰-2-甲基哌嗪-1-基]-6-氟-7-(2-氟-6-羟基苯基)-1-(2-异丙基-4-甲基吡啶-3-基)吡啶(2.3-d)嘧啶-2(1H)-酮，分子式为C₃₀H₃₀F₂N₆O₃，相对分子质量为560.59。AMG 510通过特异地、不可逆地将KRAS锁定在非活跃的GDP结合状态，破解了“KRAS不可成药”魔咒。基于该化合物本身的特殊性及尽可能全面定量AMG 510的血药浓度，本发明通过逐个优化色谱分离条件，克服了定量测定过程中的诸多关键环节。例如，通过添加不同的流动相调节剂获得最佳的色谱峰。本发明尝试了文献报道的三氟乙酸和乙酸铵等添加剂，但是结果显示当添加甲酸时AMG510及内标的色谱峰型对称且实现基线分离。另外，AMG 510化合物结构中存在许多双键及氟原子，对于质谱电离方式我们尝试了电喷雾电离(ESI)和大气压化学电离(APCI)进行离子化，最终ESI克服了极性及难挥发的劣势，呈现较好的电离效果。再者，本发明建立的定量检测方法的定量下限为纳克级，显著高于常规的高效液相色谱法的微克级，并且无需其他相关特殊仪器，因此适合用于临床高通量、同时检测和监测药物浓度，从而实现个体化精准治疗。本发明的技术方案适用于医学实验室检测，由于其快速准确的特点，极有可能发展为相关检测的行业标准乃至国家标准，具有重要的意义和价值。

第二、目前常规抗肿瘤分子靶向药物血药浓度监测多采集癌症患者静脉全血4mL，经过低速离心后获得约2mL血浆/血清样本。若通过监测人体内血药浓度调整用药及疗效观察时将会采集多次的静脉全血，这不仅增加了晚期癌症患者的有创采血风险及负担，而且对于定量检测血样本的需求体积而言相对浪费，因此显著降低了癌症患者的获益。在本发明的方法中，首次采用更少的血液样本体积，血浆样本体积仅为20μL，即需要收集患者的全血样本约50μL，对于极度虚弱的患者可以通过采集指端末梢血进行血药浓度检测和监测，保证检测结果准确性的前提下最大程度降低患者的血液体积，显著降低了晚期癌症患者的有创伤负担。此外，本方明建立的定量分析结果显示，实验中所用体积能满足准确定量检测的需要，基于此优势，本发明方法特别适合于晚期肿瘤患者身体状态较差时、临床采集血液样本体积较少时的定量测定，有利于临床治疗药物监测的应用及推广。

第三、RAS基因家族是近40年肿瘤治疗研究的主题，它包含了人类癌症中最常见的突变癌基因。在这个家族中，KRAS是最普遍的变异，在实体瘤中尤为常见，而KRAS(G12C)的特殊突变存在于大约13％的非小细胞肺癌、3％至5％的结直肠癌和1％至2％的众多其他实体瘤中。由于KRAS(G12C)蛋白上缺乏传统的小分子结合口袋，该蛋白一直被认为是“不可成药”的。作为目前全球首个靶向KRAS(G12C)的抑制剂，早期临床试验结果均提示AMG 510治疗多种实体瘤(肺癌、结直肠癌、胰腺癌、阑尾和子宫内膜癌等)疗效显著。截止目前，临床Ⅱ-Ⅲ期试验正在进行，评价AMG 510与化疗药物头对头的疗效比较。然而，对于定量测定AMG 510的血药浓度的UPLC-MS/MS尚无任何报道，且同靶点同类别其他药物的定量测定方法无可借鉴的参考，因此，准确测定药物浓度对于评价疗效、不良反应及潜在的获得性耐药发挥重要作用。本发明通过克服化合物本身、检测灵敏度要求高、方法耐受性好等多种瓶颈问题成功建立了高通量、快速高效的UPLC-MS/MS方法，并按照2020年版《中国药典》四部9012《生物样品定量分析方法验证指导原则》进行方法学的验证，保证如准确度、精密度、稳定性、提取回收率等指标符合要求。为了验证本发明方法的推广性，将建立的方法用于大鼠药动学研究，成功获得大鼠的药物暴露信息及其他药动学参数。因此，鉴于目前针对KRAS(G12C)靶点研发新的化合物或药物越来越多，本发明建立的定量测定方法不仅为行业内测定血药浓度提供重要技术参考，同时将助力未来以KRAS其他位点突变研发新药奠定基础，最终提高癌症患者获益、延长生存时间、提高生活质量。

第四、液相条件优选采用0.1％甲酸(水相)-0.1％甲酸乙腈(有机相)；加入甲酸能够促进被分析物离子化，提高检测的灵敏度，增加了待测物的离子化效果而且有利于消除色谱峰的拖尾现象；此外，在本发明的方法中结合化合物结构特征，采用高柱效的WatersXBrige C₁₈色谱柱(50mm×2.1mm，粒径为3.5μm)，提高了分离效率，实现了每个样品的分析时间仅为3min，显著增加了分析通量，提高了分析速度，有利于大批量临床前和临床样品的快速分析。为了提高检测灵敏度，兼顾目前领域内定量检测的仪器类型，本发明的方法采用高灵敏度、超快速扫描速度的QTRAP 5500质谱系统，定量的检测限为0.05ng/mL，使得本方明方法更具有推广性和通用性。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为AMG 510和内标卡马西平的质谱扫描图；

图2为标准曲线示意图；

图3为特异性考察结果典型色谱图；

图4为AMG 510(10mg/kg)灌胃给药后大鼠药物浓度-时间曲线；

图5为试验样品再分析。

具体实施方式

下面结合实例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

<实例1>

1溶液配制

用于配制溶液的体积和重量可以成比例调整，除特殊声明外所有的溶液均保存于室温条件下。

1.1流动相溶液的配制

有机相(A)：含有质量分数为0.1％的甲酸乙腈。

水相(B)：含有质量分数为0.1％的甲酸水。

流动相选择：实验中为了满足低定量检测范围的要求，我们考察了多种常用流动相中的有机相(如甲醇、乙腈等)和水相，并尝试添加不同比例的溶液增强剂(如0.01％甲酸、0.05％甲酸、0.1％甲酸、0.01％乙酸、0.1％三氟乙酸、5mM甲酸铵、2mM乙酸铵等)。结果发现，当有机相和水相中分别加入甲酸后色谱峰型得以改善，综合流动相的组成、保留时间、色谱峰形、梯度时间等因素，最终确定最有流动相为含0.1％甲酸的乙腈-含0.1％甲酸水。

1.2工作液的配制

分别精密称取10.00mg以上的AMG 510、内标标准品卡马西平于10mL烧杯中，加入少量乙腈溶解后转移至10mL量瓶中，定容得到浓度为1mg/mL的储备液。采用1:1甲醇水逐级稀释得到标准曲线的工作液：5ng/mL，10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL，储存于-80℃冰箱中备用。内标工作液采用甲醇稀释至浓度为10ng/mL。质控工作液分别为：10ng/mL、200ng/mL、4μg/mL。

1.3仪器及试剂

高效液相色谱仪LC-20ADXR串联QTRAP5500质谱检测器，日本岛津公司和AB SCIEX公司；MilliQ-Direct 8超纯水系统，美国密理博公司；固定转角离心机，美国ThermoScientific公司。

AMG 510(纯度>98％，批号：DC2229802，DC Chemical公司购买)、卡马西平(纯度：100％，批号：100142-201706，中国药品生物制品检定所购买)等权威机构合成购买；HPLC级甲醇、乙腈、异丙醇等均购于美国Fisher Scientific公司。其他常规试剂均可从日常商业渠道购买。

实验中发明人首先采用常规的UPLC-MS/MS系统进行初步考察定量分析的可行性，但是结果显示待测物的峰面积矮胖且不对称，改变质谱仪的离子参数(如电压、碰撞能量等)均不能满足低灵敏度的要求，定量下限为微克级别。另外，实验中调整质谱仪的进样体积由5μL增加至20μL仍然不能满足同时定量浓度的要求。另外，我们尝试了不同的电离方式(如电喷雾电离和大气压电离)、不同的流动相组成(如有机相比例、有机相添加剂、水相配比及添加剂等)及质量分数比(90:10，80:20，70:30等)、不同的血浆样本前处理方式(如蛋白沉淀法、液液萃取法、固相提取法等)均无法实现较低的定量限。因此，AMG 510作为新的靶向KRAS(G12C)小分子化合物采用常规的LC-MS/MS系统分析时难度较大，为了保证实验顺利进行，发明人采用分辨力和检测能力更高的超高效液相色谱仪(LC-20ADXR)串联三重四级杆线性离子阱质谱仪(QTRAP 5500)作为最终检测用仪器。AMG 510分子离子质谱图如图1所示。

1.4标准曲线和质控血浆样品的配制及前处理

分别吸取2μL系列浓度的标准曲线和质控工作液于Eppendorf管中，然后分别加入空白血浆18μL、内标工作液10μL和50μL甲醇，涡旋30s混匀，配制成浓度为0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500ng/mL的系列标准血浆样品。按照上述相似的方法制备含血质控样本(1、20、400ng/mL)

2液相色谱串联质谱方法条件

液相色谱条件：采用高效的Waters XBrige C₁₈色谱柱(50mm×2.1mm I.D.，粒径为3.5μm)，柱温为40℃。流动相为A相(乙腈，含有0.1％的甲酸)：B相(水，含有0.1％的甲酸)。流速为0.4mL/min，进样量为2μL。洗针液为含异丙醇、乙腈、甲醇和水的混合溶液(1:1:1:1，v/v/v/v)采用梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0-0.1min，90％B；0.1-1.2min，10％B；1.2-2.2min，0％B；2.2-3min，90％B。分析时间为3min，两者的保留时间分别为1.46min和1.57min。

质谱条件：采用电喷雾离子源(Electrospray ionization,ESI)，在正离子电离模式下，选用多反应监测模式(multiple reaction monitoring,MRM)的质谱扫描方式进行测定，每个MRM通道的扫描时间为200ms，主要生成[M+H]⁺准分子离子峰。质谱仪的温度为550℃、气帘气20psi、雾化气和辅助气均为55psi、离子化电压为5500V、入口电压为10eV、碰撞室出口电压为13eV。AMG 510的母、子离子对的质荷比为m/z 561.4→317.1(定性)、m/z561.4→134.1(定量)、内标的母、子离子对的质荷比为m/z 237.0→194.1。

洗脱方式：发明人也比较了等度洗脱和梯度洗脱，结果显示梯度洗脱时色谱峰形和响应均高于等度模式，因此最终设定在3min分析时间内设置梯度，起始梯度为90％的水相，从而保证在有机相比例最高时出色谱峰。另外，我们比较了不同的流速(0.4mL/min和0.5mL/min)、不同的柱温条件(室温、40℃、50℃)、不同的分析时间(3min、4min和5min)、不同的进样体积(5μL、2μL和1μL)。经过多次摸索和优化，确证分析的最佳条件为流动相为乙腈(A)和水(B)(两者均含0.1％甲酸)，采用梯度洗脱的方式，0.4mL/min流速，柱温为40℃，分析时间为3min，进样体积为2μL，两者的保留时间分别为1.46min和1.57min。

质谱离子化方式：实验中发明人根据上述两种待测物和内标的化学结构和理化性质，分别考察了质谱的正离子和负离子电离模式，结果显示正离子模式下待测物和内标的响应较负离子模式改善，因此确定采用质谱的电喷雾模式(ESI)的正离子方式。选择分析的母、子离子对时，结合不同的电离能量和可能的生成的分子片段，采用[M+H]⁺模式分析，通过调整不同的质谱参数后确证最优参数。在ESI离子化方式下，上述两者主要生成[M+H]⁺准分子离子峰。

3生物样本前处理

采用快捷高通量的蛋白沉淀法对血浆样品进行预处理。取1.5mL离心管，加入18μL空白血浆，加入2μL的AMG 510工作液，加入10μL内标工作液，涡旋30s，混合均匀。然后加入50μL甲醇，涡旋震荡约1min，于4℃13500rpm离心10min，吸取上清液样品瓶中，取上清液2μL进样进行UPLC-MS/MS分析，记录质量色谱图及化合物的峰面积，采用内标法计算AMG 510的浓度。

4方法学验证

按照2020年版中国药典四部通则9012《生物样品定量分析方法验证指导原则》对检测方法进行全部验证，以确保检测的准确性、可重复性和稳定性。验证内容包括特异性、精密度和准确度、标准曲线、稳定性、基质效应、回收率等。

5大鼠的药代动力学

无特定病原体(SPF)级SD大鼠，雄性，体重180-220g，北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证：SCXK(京)2019-0008。

为了验证建立方法的通用性及可行性，发明人灌胃给药大鼠AMG 510药物后根据不同采血时间点，描述药物在体内的经时动力学曲线。

大鼠于给药前12h禁食不禁水，按照5mL/kg灌胃给药，给药剂量为10mg/kg。采血时间点为给药前、给药后15min、30min、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、4h、8h，共10个采血点，每管约0.2mL全血。全血样本置于肝素化的离心管中，于3500rpm离心10min，吸取上清血浆，于-80℃冰箱中保存备用。

实验结果显示，发明人所建立的UPLC-MS/MS方法能够准确定量大鼠灌胃AMG 510药物后血浆中药物浓度。如图4所示，本发明方法的标准曲线范围完全覆盖动物的检测浓度范围。本发明方法能够测定给药后8h的AMG 510的血药浓度，方法得到成功的应用和推广。

6实验结果

6.1特异性

本实验考察了不同来源大鼠血浆，制备成特异性样品进行分析。配制双空白样品(不含分析物和内标的处理过基质样品)、空白样品(含内标的处理后基质样品)、定量下限样品。特异性考察结果如附图3(A双空白样本；B空白样本；C定量下限样本；D未知血浆样本)。实验中LLOQ样品中AMG 510、卡马西平的色谱峰信噪比分别为103和80，且不同离子扫描通道无相互干扰。

6.2精密度和准确度

平行配制6个血浆定量下限、低浓度、中浓度、高浓度质控样品的批内和批间的精密度和准确度的结果(表1)表明，该方法精密度和准确度结果均符合生物样本定量检测的要求。

表1方法的精密度和准确度

6.3基质效应和提取回收率

本实验考察了不同来源的大鼠空白血浆，制备低浓度、中浓度和高浓度样品，通过计算基质存在下的峰面积(B，由空白基质提取后加分析物测得)，与基质不存在(以水代替血浆)下的峰面积(C，分析物的纯溶液)比值，计算分析物和内标的基质因子。并通过分析物和内标的基质因子的比值，计算经内标归一化的基质因子，结果见表2。低、中、高浓度质控样品中分析物和内标的基质因子和经内标归一化的基质因子的RSD均低于15％，表明血浆中待测物和内标化合物的测定不受生物基质的影响。分别考察了低、中、高3个浓度质控样品的提取回收率，每个浓度平行6个样品。

表2基质效应和提取回收率

6.4稳定性

本实验考察了AMG 510室温放置24h、制备后室温放置24h、反复冻融3次、工作液-80℃保存10天，结果如表3所示，在常见的稳定性条件下AMG 510均稳定。

表3稳定性

6.5试验样品再分析

为了验证所建立的UPLC-MS/MS方法的耐受性和重现性，我们选取大鼠药时曲线中吸收相和消除相的血浆样本，每只大鼠选取两个时间点样本，共12个样本，采用已建立的方法定量分析，通过在不同天后新建分析批重新分析试验样品，评价实际样品测定的准确度。测定达峰浓度附近和消除相样品。接受标准：至少67％的重复测试，原始分析测得的浓度和重新分析测得的浓度之间的差异在两者均值的±20％范围内。实验结果如图5所示，初测值与复测值之间的偏差均≤±11％之间。以上结果表明，建立的UPLC-MS/MS方法可靠且重现性好。

这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实例。

Claims (7)

1.超高效液相色谱串联质谱测定血浆AMG 510浓度的方法，其特征在于，包括：

采用甲醇溶解AMG 510配制多个浓度的标准曲线工作液，采用甲醇溶解卡马西平内标物配制成内标物工作液；

将0-5μL的AMG 510多个浓度的标准曲线工作液分别加入大鼠空白血浆补足至20μL，涡旋制成多个浓度的标准曲线血浆样品，加入10μL内标物工作液和50μL甲醇，涡旋，0-4℃下离心，取上清液，进行UPLC-MS/MS定量分析，以血浆样品中AMG 510浓度为横坐标，以AMG510峰面积与卡马西平内标物峰面积的比值为纵坐标，绘制线性范围分别为0.5-500ng/mL的标准曲线；

精密吸取20μL的待测血浆，加入绘制标准曲线时等量的内标物工作液、甲醇，涡旋，0-4℃下离心，取上清液，进行UPLC-MS/MS定量分析，在所述标准曲线上读取测得的AMG 510峰面积与内标物峰面积的比值对应的AMG 510浓度；

液相条件为：色谱柱为Waters XBrige C₁₈，内径2.1mm、柱长50mm、粒径3.5mm，流速0.4mL/min，进样体积2μL，分析时间3min，柱温为40℃，洗针溶液为体积比为1:1:1:1的异丙醇、乙腈、甲醇和水的混合溶液，流动相的有机相为含有质量分数为0.1％的甲酸的乙腈，水相为含有质量分数为0.1％的甲酸的水，梯度洗脱设置为0-0.1min、0.1-1.2min、1.2-2.2min、2.2-3min有机相与水相的体积比分别为1:9、9:1、1:0、1:9；

质谱条件为：采用电喷雾离子源的多反应监测模式，正离子扫描模式，多反应监测模式，AMG 510的母、子离子对的定性质荷比为m/z 561.4→317.1、定量质荷比m/z561.4→134.1、内标的母、子离子对的质荷比为m/z 237.0→194.1，每个多反应监测模式通道的扫描时间为200ms，质谱的离子化温度为550℃、气帘气20psi、雾化气和辅助气均为55psi、离子化电压为5500V、入口电压为10eV、碰撞室出口电压为13eV。

2.如权利要求1所述的超高效液相色谱串联质谱测定血浆AMG 510浓度的方法，其特征在于，采用甲醇溶解AMG 510配制成浓度为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL的标准曲线工作液，采用甲醇溶解卡马西平内标物配制成浓度为10ng/mL的内标物工作液。

3.如权利要求1所述的超高效液相色谱串联质谱测定血浆AMG 510浓度的方法，其特征在于，精密吸取2μL标准曲线工作液，加入18μL空白血浆，加入10μL内标物工作液。

4.如权利要求1所述的超高效液相色谱串联质谱测定血浆AMG 510浓度的方法，其特征在于，涡旋震荡1min，4℃下13500rpm离心10min。

5.如权利要求1-4任一项所述的超高效液相色谱串联质谱测定血浆AMG 510浓度的方法，其特征在于，采用甲醇溶解AMG 510配制多个浓度的质控工作液，采用甲醇溶解卡马西平内标物配制成内标物工作液；

将0-5μL多个浓度的质控工作液分别加入空白血浆补足至20μL，涡旋制成多个浓度的质控血浆样品，加入10μL内标物工作液和50μL甲醇涡旋，0-4℃下离心，取上清液，进行UPLC-MS/MS定量分析，校正所述标准曲线，使至少2/3的质控样品的准确度在标示值的±15％内，且每一浓度水平至少50％样品应符合这一标准。

6.如权利要求5所述的超高效液相色谱串联质谱测定血浆AMG 510浓度的方法，其特征在于，采用甲醇溶解AMG 510配制成浓度为10ng/mL、200ng/mL、4μg/mL的质控工作液。

7.如权利要求6所述的超高效液相色谱串联质谱测定血浆AMG 510浓度的方法，其特征在于，精密吸取2μL质控工作液，加入18μL空白血浆，加入10μL内标物工作液和50μL甲醇。

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