CN101654702A - Kras基因突变筛查评估分子靶向药物疗效的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及KRAS基因突变筛查评估分子靶向药物疗效的检测方法，其特征在于，具体步骤为：采集被测者血清或肿瘤组织样本，进行基因组DNA的抽提，对KRAS基因第2号外显子进行检测，相应位点特异性引物的设计以及用于序列测定的实验方案、试剂以及报告生成系统，通过同时检测分析个体的KRAS基因第2号外显子是否存在突变，来评估用于治疗癌症个体的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂类药物的有效性。本发明的优点是可用于癌症个体表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂类药物的应用。
Description
技术领域
本发明涉及KRAS基因突变筛查评估分子靶向药物疗效的检测方法，通过检测分析个体的KRAS基因第2号外显子上是否存在突变来评估用于治疗癌症个体的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂类药物的有效性，属于药物检测技术领域。
背景技术
表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)如阿瓦斯丁(AVASTIN)，特罗凯(Erlotinib)，吉非替尼(irressa)，西妥昔单(Erbitux)等能通过抑制肿瘤发生、发展中必须的表皮生长因子受体酪氨酸激酶阻断肿瘤细胞的信号传导，从而达到抑制肿瘤细胞的增生、侵袭、转移、血管生成并促进肿瘤细胞的调亡。KRAS基因参与EGFR信号通路的下游，研究发现15％～30％的肺腺癌KRAS基因突变。
KRAS基因是编码一个GTP结合蛋白的癌基因，其表达产物是细胞表面受体如EGFR等信号传导通路上的重要蛋白。正常情况下，KRAS蛋白不存在活性，但在细胞受到外界刺激后激活EGFR等信号通路时，KRAS被活性EGFR等酪氨酸激酶磷酸化后而活化，而活化后的KRAS可以激活该信号通路中的下游信号蛋白。KRAS基因在很多癌中都发生了突变，约30-50％的直肠癌，90％以上的胰腺癌，10-20％的肺癌等都含有KRAS突变，而几乎所有的突变都发生在编码子12和13(位于第2外显子)位置上，这些突变破坏了KRAS蛋白内在的GTPase活性，从而使得KRAS蛋白处于持续活性状态。众多的研究表明，对于KRAS突变的肿瘤患者，对这些基因靶向药物的疗效不佳，这主要是由于KRAS是EGFR信号通路的下游蛋白，突变KRAS的持续激活与EGFR活性是否被抑制有关。因此通过对KRAS基因的突变检测可以对EGFR-TKI药物的治疗效果做出一定的评估。
发明内容
本发明的目的通过检测分析个体的KRAS基因第2号外显子上是否存在突变来评估用于治疗癌症个体的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂类药物的有效性。
为实现以上目的，本发明的技术方案是提供一种表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂疗效的检测方法，其特征在于，具体步骤为：
步骤1.采集被测者血清或肿瘤组织样本；
步骤2.基因组DNA的抽提方法：
采用硅胶吸附法抽提步骤1被测者DNA，抽提时间为2-3小时，采用电泳凝胶成像法对DNA浓度和纯度作检测，肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；
步骤3.基因分型：
将每一个被测者样本分别放入一个反应孔，采用PCR技术进行扩增、凝胶电泳技术检测纯度、测序技术对这些位点的基因型进行确定：
步骤3-1，反应体系配置：
在每一个反应孔中加入PCR标准反应体系，标准反应体系的引物浓度为10uM，反应体系总体积为20ul，其中，PCR试剂5ul，正向引物和反向引物各0.4ul，20ng/μl的步骤2得到的DNA模板3μl，去离子水11.2ul；
KRAS基因第2外显子正向和反向引物：
正相引物：cgatggaggagtttgtaaatga
反向引物：tgaaacccaaggtacatttcag
步骤3-2，PCR反应条件：
将反应孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为预热95℃15分钟；再进行35个循环的95℃、45秒；60℃、45秒；72℃、60秒；72℃、7分钟后降温至4℃；
步骤3-3，将反应孔在PCR扩增仪反应后的产物进行电泳检测，肉眼可见清晰白色条带即可进入下一步；
a.1wt％琼脂糖凝胶插小号孔梳子；
b.2000bp DNA标记物6ul
c.步骤3-2的PCR产物4ul加入电泳缓冲液1ul
d.电泳电压：120v
e.电泳时间：20min拍摄一张电泳图；30min拍摄一张电泳图；
步骤3-4，纯化：
终浓度：PCR产物纯化试剂0.2U SAP+PCR产物纯化试剂2.5U EXON1/7ul；
在每一个反应孔中加入反应体系，反应体系总体积为7ul、去离子水ddH2O 3.825ul、PCR产物纯化试剂SAP 0.05ul、PCR产物纯化试剂EXON1 0.125ul、步骤3-3得到的PCR产物3ul；反应条件为：37℃、60min；80℃、15min；4℃恒温保存；
步骤3-5，将纯化后的每一个反应孔进行测序，引物浓度为1uM，ABI 3730测序仪；
步骤3-5-1，从-20度冰箱中取出步骤3-4的PCR纯化产物、测序试剂BigDye、四种dNTP、1uM测序引物，测序引物：cgatggaggagtttgtaaatga；
步骤3-5-2，记录日期、PCR纯化产物名、测序引物、反应体系、测序试剂用量、PCR反应条件；
步骤3-5-3，取一块反应板，标上DNA模板名、测序引物名、日期；
步骤3-5-4，每个样本需做两个PCR反应，用一个反应孔；
步骤3-5-5，在每一个反应孔中加入反应体系，反应体系为0.5ul的BigDye、1.4ul的dNTP、2ul的测序引物、3ul的PCR纯化产物、0.1ul的去离子水ddH2O；体系分装好后，上离心机，达900转/分即停；
步骤3-5-6，将反应板放在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为预热96℃10秒；再进行25个循环的96℃、10秒；50℃、5秒；60℃、4分钟；60℃、4分钟后降温至4℃恒温保存；
步骤3-5-7，扩增结束后，在每孔加入1ul 125mM乙二胺四乙酸EDTA；
步骤3-5-8，再在每孔加入无水乙醇15ul于室温进行沉淀，不得超过24小时；
步骤3-5-9，将96孔板放入冰冻离心机，3650转/分，4℃离心30分钟；
步骤3-5-10，倒去上清液，将96孔板离心，达800转即停，再在每孔加30ul 70wt％乙醇，3650转/分，4℃离心15分钟，倒去上清液，将96孔板离心，达800转即停，将残余乙醇风干，室温放置20分钟；
步骤3-5-11，每孔加入8ul的95wt％甲酰胺与ddH2O混合物；
步骤3-5-12，在ABI 3730上进行结果读取，用软件Chromas查阅测序检测结果：2类结果，即正常结果和突变结果；
步骤4，结果分析：
1，未检出突变：您的检测结果中未发现KRAS基因第2号外显子上存在突变；
2.检出突变：您的检测结果中发现KRAS基因第2号外显子上存在突变。
本发明对KRAS基因第2号外显子上进行检测，相应位点特异性引物的设计以及用于序列测定的实验方案、试剂以及报告生成系统，通过同时检测分析个体的KRAS基因第2号外显子上是否存在突变来评估用于治疗癌症个体的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂类药物的有效性。
采集样本的类型为血清样本，采用硅胶吸附法抽提血清KRAS DNA具有所需样品量少，抽提质量稳定，抽提产物纯度高，操作简便的特点。
利用本发明对超过100例以上中国人群样本的检测结果显示，根据上述方法进行的KRAS基因第2号外显子上基因型检测检出率可达99％以上，结果可重复性达到100％。本发明的优点是可用于癌症个体的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂类药物的应用。
附图说明
图1为7个样本PCR后产物的电泳结果图；
图2为KRAS基因第2号外显子实验正常结果示意图；
图3为KRAS基因6ly12Ser GGT＞AGT突变结果示意图；
图4为KRAS基因Gly12Arg GGT＞CGT突变结果示意图；
图5为KRAS基因Gly12Cys GGT＞TGT突变结果示意图；
图6为KRAS基因Gly12Asp GGT＞GAT突变结果示意图；
图7为KRAS基因Gly12Ala GGT＞GCT突变结果示意图；
图8为KRAS基因Gly12Val GGT＞GTT突变结果示意图；
图9为KRAS基因Gly13Asp GGC＞GAC突变结果示意图；
图10为实施例被测者定位KRAS基因Gly12Val GGT＞GTT位置实验突变结果示意图。
具体实施方式
下面结合实施例来具体说明本发明。
实施例
一种表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂疗效的检测方法，具体步骤为：
步骤1.采集被测者血清或肿瘤组织样本；
步骤2.基因组DNA的抽提方法：
采用硅胶吸附法抽提步骤1被测者DNA，抽提时间为2-3小时，采用电泳凝胶成像法对DNA浓度和纯度作检测，肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；
步骤3.基因分型：
将每一个被测者样本分别放入一个反应孔，采用PCR技术进行扩增、凝胶电泳技术检测纯度、测序技术对这些位点的基因型进行确定：
步骤3-1，反应体系配置：
在每一个反应孔中加入PCR标准反应体系，标准反应体系的引物浓度为10uM，反应体系总体积为20ul，其中，PCR试剂(天根生化KT202-12)5ul，正向引物和反向引物各0.4ul，20ng/μl的步骤2得到的DNA模板3μl，去离子水11.2ul；
KRAS基因第2外显子正向和反向引物：
正相引物：cgatggaggagtttgtaaatga
反向引物：tgaaacccaaggtacatttcag
步骤3-2，PCR反应条件：
将反应孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为预热95℃15分钟；再进行35个循环的95℃、45秒；60℃、45秒；72℃、60秒；72℃、7分钟后降温至4℃；
步骤3-3，将反应孔在PCR扩增仪反应后的产物进行电泳检测，肉眼可见清晰白色条带即可进入下一步；
a.1wt％琼脂糖凝胶插小号孔梳子；
b.2000bp DNA标记物6ul
c.步骤3-2的PCR产物4ul加入电泳缓冲液1ul
d.电泳电压：120v
e.电泳时间：20min拍摄一张电泳图；30min拍摄一张电泳图；
7个样本PCR后产物，25ng/ul的电泳结果图，目的条带800bp左右；
如图1所示，为7个样本PCR后产物的电泳结果图。
步骤3-4，纯化：
终浓度：PCR产物纯化试剂0.2U SAP+PCR产物纯化试剂2.5U EXON1/7ul；
在每一个反应孔中加入反应体系，反应体系总体积为7ul、去离子水ddH2O 3.825ul、PCR产物纯化试剂SAP(promega M8201)0.05ul、PCR产物纯化试剂EXON1(NEBM0293V)0.125ul、步骤3-3得到的PCR产物3ul；反应条件为：37℃、60min；80℃、15min；4℃恒温保存；
步骤3-5，将纯化后的每一个反应孔进行测序，引物浓度为1uM，ABI 3730测序仪；
步骤3-5-1，从-20度冰箱中取出步骤3-4的PCR纯化产物、测序试剂BigDye(PEApplied Biosystems 4337574)、四种dNTP、1uM测序引物，测序引物：cgatggaggagtttgtaaatga；
步骤3-5-2，记录日期、PCR纯化产物名、测序引物、反应体系、测序试剂用量、PCR反应条件；
步骤3-5-3，取一块反应板，标上DNA模板名、测序引物名、日期；
步骤3-5-4，每个样本需做两个PCR反应，用一个反应孔；
步骤3-5-5，在每一个反应孔中加入反应体系，反应体系为0.5ul的BigDye、1.4ul的dNTP、2ul的测序引物、3ul的PCR纯化产物、0.1ul的去离子水ddH2O；体系分装好后，上离心机，达900转/分即停；
步骤3-5-6，将反应板放在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为预热96℃10秒；再进行25个循环的96℃、10秒；50℃、5秒；60℃、4分钟；60℃、4分钟后降温至4℃恒温保存；
步骤3-5-7，扩增结束后，在每孔加入1ul 125mM乙二胺四乙酸EDTA；
步骤3-5-8，再在每孔加入无水乙醇15ul于室温进行沉淀，不得超过24小时；
步骤3-5-9，将96孔板放入冰冻离心机，3650转/分，4℃离心30分钟；
步骤3-5-10，倒去上清液，将96孔板离心，达800转即停，再在每孔加30ul 70wt％乙醇，3650转/分，4℃离心15分钟，倒去上清液，将96孔板离心，达800转即停，将残余乙醇风干，室温放置20分钟；
步骤3-5-11，每孔加入8ul的95wt％甲酰胺与ddH2O混合物；
步骤3-5-12，在ABI 3730上进行结果读取，用软件Chromas查阅测序检测结果：2类结果，即正常结果和突变结果；图2为KRAS基因第2号外显子实验正常结果示意图；图3为KRAS基因Gly12Ser GGT＞AGT突变结果示意图；图4为KRAS基因Gly12Arg GGT＞CGT突变结果示意图；图5为KRAS基因Gly12Cys GGT＞TGT突变结果示意图；图6为KRAS基因Gly12Asp GGT＞GAT突变结果示意图；图7为KRAS基因Gly12Ala GGT＞GCT突变结果示意图；图8为KRAS基因Gly12Val GGT＞GTT突变结果示意图；图9为KRAS基因Gly13AspGGC＞GAC突变结果示意图。
如图10所示，为实施例被测者定位KRAS基因Gly12Val GGT＞GTT位置实验突变结果示意图。
步骤4.最后得出检测报告，给出结果分析，大量研究表明KRAS基因第2号外显子的突变与表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂类药物治疗癌症疗效有密切关系。携带这些突变破坏了KRAS蛋白内在的GTPase活性，可能导致EGFR活性发生改变，降低癌症个体的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂类药物治疗效果。
您的检测结果中存在KRAS基因第2号外显子突变位点。
序列表
<110>上海中优医药高科技有限公司
<120>KRAS基因突变筛查评估分子靶向药物疗效的检测方法
<160>3
<210>1
<211>500
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>mutation
<222>(270，271，274)
<223>n＝a或g或c或t
<400>1
tcttaagcgt cgatggagga gtttgtaaat gaagtacagt tcattacgat acacgtctgc 60
agtcaactgg aattttcatg attgaatttt gtaaggtatt ttgaaataat ttttcatata 120
aaggtgagtt tgtattaaaa ggtactggtg gagtatttga tagtgtatta accttatgtg 180
tgacatgttc taatatagtc acattttcat tatttttatt ataaggcctg ctgaaaatga 240
ctgaatataa acttgtggta gttggagctn ntgncgtagg caagagtgcc ttgacgatac 300
agctaattca gaatcatttt gtggacgaat atgatccaac aatagaggta aatcttgttt 360
taatatgcat attactggtg caggaccatt ctttgataca gataaaggtt tctctgacca 420
ttttcatgag tacttattac aagataatta tgctgaaagt taagttatct gaaatgtacc 480
ttgggtttca agttatatgt 500
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于KRAS基因第2号外显子序列扩增的正向引物。
<400>2
cgatggagga gtttgtaaat ga 22
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于KRAS基因第2号外显子序列扩增的反向引物。
<400>3
tgaaacccaa ggtacatttc ag 22
Claims (1)
1、一种KRAS基因突变筛查评估分子靶向药物疗效的检测方法，其特征在于，具体步骤为：
步骤1.采集被测者血清或肿瘤组织样本；
步骤2.基因组DNA的抽提方法：
采用硅胶吸附法抽提步骤1被测者DNA，抽提时间为2-3小时，采用电泳凝胶成像法对DNA浓度和纯度作检测，肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；
步骤3.基因分型：
将每一个被测者样本分别放入一个反应孔，采用PCR技术进行扩增、凝胶电泳技术检测纯度、测序技术对这些位点的基因型进行确定：
步骤3-1，反应体系配置：
在每一个反应孔中加入PCR标准反应体系，标准反应体系的引物浓度为10uM，反应体系总体积为20ul，其中，PCR试剂5ul，正向引物和反向引物各0.4ul，20ng/μl的步骤2得到的DNA模板3μl，去离子水11.2ul；
KRAS基因第2外显子正向和反向引物：
正相引物：cgatggaggagtttgtaaatga
反向引物：tgaaacccaaggtacatttcag
步骤3-2，PCR反应条件：
将反应孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为预热95℃15分钟；再进行35个循环的95℃、45秒；60℃、45秒；72℃、60秒；72℃、7分钟后降温至4℃；
步骤3-3，将反应孔在PCR扩增仪反应后的产物进行电泳检测，肉眼可见清晰白色条带即可进入下一步；
a.1wt％琼脂糖凝胶插小号孔梳子；
b.2000bp DNA标记物6ul
c.步骤3-2的PCR产物4ul加入电泳缓冲液1ul
d.电泳电压：120v
e.电泳时间：20min拍摄一张电泳图；30min拍摄一张电泳图；
步骤3-4，纯化：
终浓度：PCR产物纯化试剂0.2U SAP+PCR产物纯化试剂2.5U EXON1/7ul；
在每一个反应孔中加入反应体系，反应体系总体积为7ul、去离子水ddH2O 3.825ul、PCR产物纯化试剂SAP 0.05ul、PCR产物纯化试剂EXON1 0.125ul、步骤3-3得到的PCR产物3ul；反应条件为：37℃、60min；80℃、15min；4℃恒温保存；
步骤3-5，将纯化后的每一个反应孔进行测序，引物浓度为1uM，ABI 3730测序仪；
步骤3-5-1，从-20度冰箱中取出步骤3-4的PCR纯化产物、测序试剂BigDye、四种dNTP、1uM测序引物，测序引物：cgatggaggagtttgtaaatga；
步骤3-5-2，记录日期、PCR纯化产物名、测序引物、反应体系、测序试剂用量、PCR反应条件；
步骤3-5-3，取一块反应板，标上DNA模板名、测序引物名、日期；
步骤3-5-4，每个样本需做两个PCR反应，用一个反应孔；
步骤3-5-5，在每一个反应孔中加入反应体系，反应体系为0.5ul的BigDye、1.4ul的dNTP、2ul的测序引物、3ul的PCR纯化产物、0.1ul的去离子水ddH2O；体系分装好后，上离心机，达900转/分即停；
步骤3-5-6，将反应板放在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为预热96℃10秒；再进行25个循环的96℃、10秒；50℃、5秒；60℃、4分钟；60℃、4分钟后降温至4℃恒温保存；
步骤3-5-7，扩增结束后，在每孔加入1ul 125mM乙二胺四乙酸EDTA；
步骤3-5-8，再在每孔加入无水乙醇15ul于室温进行沉淀，不得超过24小时；
步骤3-5-9，将96孔板放入冰冻离心机，3650转/分，4℃离心30分钟；
步骤3-5-10，倒去上清液，将96孔板离心，达800转即停，再在每孔加30ul 70wt％乙醇，3650转/分，4℃离心15分钟，倒去上清液，将96孔板离心，达800转即停，将残余乙醇风干，室温放置20分钟；
步骤3-5-11，每孔加入8ul的95wt％甲酰胺与ddH2O混合物；
步骤3-5-12，在ABI 3730上进行结果读取，用软件Chromas查阅测序检测结果：2类结果，即正常结果和突变结果；
步骤4，结果分析：
(1).未检出突变：您的检测结果中未发现KRAS基因第2号外显子上存在突变；
(2).检出突变：您的检测结果中发现KRAS基因第2号外显子上存在突变。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20100224 |