CN111500719B - Ighmbp2基因用作预测辐射敏感性的分子标志物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域,涉及IGHMBP2基因用作预测辐射敏感性的分子标志物的用途。利用本发明的IGHMBP2基因用作预测辐射敏感性的分子标志物的用途,能够通过IGHMBP2基因rs1249463位点是否突变效率高、成本低的进行辐射敏感性的预测。

Description

IGHMBP2基因用作预测辐射敏感性的分子标志物的用途
技术领域
本发明属于生物检测技术领域,涉及IGHMBP2基因用作预测辐射敏感性的分子标志物的用途。
背景技术
目前,放射疗法仍然是现代癌症治疗的主要手段,大约50%的癌症患者需要放射治疗。但是,接受相同剂量放射治疗,患者表现出的放射毒性不同:少数人没有明显的毒性作用,大多数人在临床上有轻度或中度的毒性反应,而少数人导致严重的正常组织并发症,甚至可能危及生命。因此,有必要寻找一种与放射敏感性相关的分子标志物用于预测患者是否为放射敏感性(或放射抗性)个体。
放射敏感性的预测是为了能够针对个别患者量身定制放射治疗方案以改善预后,从而一方面可以降低辐射剂量以降低对敏感个体的毒性,另一方面可以提高辐射剂量以使更多的抗辐射患者得到有效治疗。这将最大程度地控制肿瘤,同时最大程度地减少对患者的正常组织的损害。此外,在我国大约有20万的放射工作人员,放射工作人员在日常工作时要长期接受职业照射,对放射工作人员进行放射敏感性的预测有助于预防和减少职业伤害。
IGHMBP2 rs1249463位点位于11号染色体68904009处,等位基因为T>C,该位点所在基因是编码解旋酶超家族成员,该成员与免疫球蛋白mu链开关区的特定DNA序列结合。该基因的突变会导致患有I型呼吸窘迫的脊髓性肌萎缩。
单核苷酸多态性标记(SNP)是“第三代DNA遗传标记”,在人类基因组中存在300万个,被认为是应用前景最好的遗传标记物。SNP可以真实反映遗传差异,并与正常组织中辐射诱发的毒性有关。
发明内容
本发明的目的是提供IGHMBP2基因用作预测辐射敏感性的分子标志物的用途,以能够通过IGHMBP2基因rs1249463位点是否突变效率高、成本低的进行辐射敏感性的预测。
为实现此目的,在基础的实施方案中,本发明提供IGHMBP2基因用作预测辐射敏感性的分子标志物的用途,即IGHMBP2基因作为分子标志物用于制备预测辐射敏感性的检测试剂盒的用途。
在一种优选的实施方案中,本发明提供IGHMBP2基因rs1249463突变位点用作预测辐射敏感性的分子标志物的用途,即IGHMBP2基因rs1249463突变位点作为分子标志物用于制备预测辐射敏感性的检测试剂盒的用途。
本发明的IGHMBP2基因的序列如SEQ ID NO.1所示,突变位点为IGHMBP2基因的rs1249463位点(A到G的突变),突变后的IGHMBP2基因的序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的有益效果在于,利用本发明的IGHMBP2基因用作预测辐射敏感性的分子标志物的用途,能够通过IGHMBP2基因rs1249463位点是否突变效率高、成本低的进行辐射敏感性的预测。
具体实施方式
通过如下的实施例对本发明的实施作进一步说明,但本发明的实施方式并不局限于如下的实施例。
实施例1:
1、利用全外显子捕获测序技术初步筛选预测辐射敏感性的分子标志物
1)样本的采集照射及染色体畸变分析
采集20-30岁健康成年男性外周血,给予0、2Gy 60Coγ射线照射。对2Gyγ射线照射样本进行染色体畸变分析,将人群分为敏感组、一般组、抗性组。照射后血样培养52h后收获染色体,制片。每个样本分析200个中期分裂相。
2)外周血基因组DNA提取
提取0Gy照射样本的基因组DNA。采用北京天跟生化科技有限公司血液基因组DNA提取试剂盒,按照产品说明书进行全血基因组DNA提取,具体步骤见说明书。取样核酸定量检测A260/280在1.70~1.90之间,质量满足实验要求,可进行后续实验。
3)全外显子捕获测序
测序数据首先进行数据过滤,去掉低质量数据,获得Clean Reads。测序需达到清洁Reads率>90%,清洁碱基>20G,清洁碱基率>90%,Q20>98%,实验样本符合要求。
4)生物信息分析
Clean Reads与参考基因组比对,筛选差异SNP位点。参考基因组版本:GRCh37(hg19),ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp/technical/reference/human_g1k_v37.fasta.gz。利用生物信息分析,筛选出IGHMBP2rs1249463位点,见表1。
表1初步筛选出的预测辐射敏感性的位点
SNP位点 基因 SNP位点位置 等位基因
rs1249463 IGHMBP2 chr11:68904009 A/G
2、利用基质辅助激光解吸电离质谱技术对初步筛选位点进行实验验证
1)利用北京天跟生化科技有限公司血液基因组DNA提取试剂盒(非离心柱型;目录号:DP319),按照产品说明书进行人全血基因组(血液来源于20-30岁健康男性志愿者)DNA提取。
2)采用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的扩增引物对,特异性反应体系(5μl反应体系包括0.95μl H2O、0.625μl PCR Buffer(10×)、0.325μlMgCl2(25mM)、1μl dNTP(2.5mM)、1μl引物、0.1μl HotstarTaq(5U/μL))进行PCR反应,反应程序为:94℃,15min;[94℃,20sec,56℃,30sec]45个循环;72℃,4min。反应产物4℃保存。
3)利用SAP反应液(2μl SAP反应液包括1.53μlH2O、0.17μl SAP Buffer(10×)、0.3μl SAP酶(1U/μL))对步骤2)的反应产物进行处理,处理程序为:37℃,40min;85℃,5min。处理产物4℃保存。
4)采用SEQ ID NO.5的延伸引物对步骤3)的处理产物进行延伸反应,
2μl反应体系包括0.755μl H2O、0.2μl iPlex Buffer(10×)、0.2μl iPlexTermination mix、0.041μl iPlex enzyme、0.804μl引物。
反应程序为:94℃,30s;[94℃,5s,(52℃,5s,80℃,5s)5个循环]40个循环;72℃,3min。延伸产物4℃保存。
5)对步骤4)的延伸产物进行纯化。取6mg树脂均匀覆盖384孔板,放置20min。将含有步骤4)的延伸产物的384孔板1000rpm离心1min,每孔加入25μL去离子水,倒置在树脂板上,然后反置将树脂板扣在384孔板上,敲击使树脂落入384孔板,封膜。以384孔板的长轴为轴心,翻转384孔板20分钟,3500rpm、5分钟离心后备用。
6)检测基因位点的基因型:将步骤5)处理后的样品转移至MassARRAYSpectroCHIP芯片(SAMSUNG公司,MassArray TM Nanodispenser),放入质谱仪(SEQUENOM公司,MassARRAY compact System)进行检测,结果如表2。
表2实验验证结果
Figure GDA0003594324810000041
3、利用基质辅助激光解吸电离质谱技术对实验验证位点进行人群验证
1)样本的采集照射及染色体畸变分析
采集20-30岁健康成年男性外周血,给予0、2Gy 60Coγ射线照射。对2Gyγ射线照射样本进行染色体畸变分析,将人群分为敏感组、一般组、抗性组。培养52h后收获染色体,制片。每个样本分析200个中期分裂相。
2)外周血基因组DNA提取
提取易感组与不易感组0Gy照射样本的基因组DNA。采用北京天跟生化科技有限公司血液基因组DNA提取试剂盒,按照产品说明书进行全血基因组DNA提取,具体步骤见说明书。取样核酸定量检测A260/280在1.70~1.90之间,质量满足实验要求,可进行后续实验。
3)质谱法检测
对样本进行人群验证,该位点进一步得到验证。
4)统计分析
利用Hardy-Weinberg平衡检验对IGHMBP2基因rs1249463位点进行检验,P>0.05,说明样本具有群体代表性,结果见表3。
利用logistic回归分析在不同遗传模型下IGHMBP2基因rs1249463位点与辐射敏感性的相关性。共显性模型下,TC基因型和CC基因型在敏感组与一般组差异显著(TC:p=0.050,OR=0.100,95%CI=0.010-0.950;CC:p=0.020,OR=0.030,95%CI=0.000-0.550);显性模型下敏感组与一般组差异显著(p=0.03,OR=0.120,95%CI=0.020-0.790),结果见表4。
表3Hardy-Weinberg平衡检验结果
Figure GDA0003594324810000051
表4logistic回归分析结果
基因型 P OR 95%CI
TT - 1 -
TC 0.050 0.100 0.010-0.950
CC 0.020 0.030 0.000-0.550
TT VS CT+CC 0.030 0.120 0.020-0.790
因此,筛选IGHMBP2基因rs1249463位点作为预测辐射敏感性的分子标记物。TC基因型与CC基因型是预测辐射敏感性的基因型,可作为人员预测辐射敏感性的一项指标。
显然,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若对本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其同等技术的范围之内,则本发明也意图包含这些改动和变型在内。上述实施例或实施方式只是对本发明的举例说明,本发明也可以以其它的特定方式或其它的特定形式实施,而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此,描述的实施方式从任何方面来看均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由附加的权利要求说明,任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。
序列表
<110> 中国辐射防护研究院
<120> IGHMBP2基因用作预测辐射敏感性的分子标志物的用途
<130> -
<141> 2020-03-24
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1001
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
cacgcacgca gccggccctg gacgcactgg aggggaaggg actctctgct tatgcccagc 60
ccgccgctgg ccggatcggg ggcagccagt gcacctgact catgctgccg gggcctgact 120
gagaatgggc gcaaaccatg tttactgaat gaataaggga aagggctgct aactcgctgc 180
gggtggaact ggggtcgggg ccagggccca ggagtgtaag cttagtgggg ggtctcgggt 240
cgggaaatca aagtgcttct taagggtccc caaacggaac gcgctgccca ggaagtgatg 300
agactgacaa ctcgggaggt ggccaagcag gggacggacg atccctgccc ctgactcgaa 360
gggtcggaga cgaaattccc gccccagact atgaggccga gcccctcgga gactctgccc 420
gggacacggc gggaccgacc gcgagggagc ggcgccggcg gcctcccgta cctgcgctcc 480
tccacctccg cgtctctctc aagctccagc aggtccagtt gcttggtcac gaagctctcc 540
acagctgccg aggccatcgc cgccgccggc ctgggcccct agaagccgac gtcccgcttc 600
tgcgccgggc cggtgttaca gcggaccggt gttccccgcc gggcccgtgc gttacgcacg 660
cggttcgcgt cgtttccgtt tccggccgag gctgcggcca tggcagcatc ttccctgacg 720
gtcaccttag ggcggctggc gtccgcgtgc agccacagca tcctgagacc ttcggggccc 780
ggagcaggtg agacctggga tatgggagga agggaggacg cagagcgagc gctgctccct 840
gcggtctcgc cacgtatgtg cctgggtccg acctggtgcc ttgtgtgttg atcgcatttg 900
tggtgaatat agcacgggtt ttggagtcgg gggaacccag gttcagattt tgattccttc 960
agttagtagc ctgaatactg acaatagccc ttgaactttg g 1001
<210> 2
<211> 1001
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 2
cacgcacgca gccggccctg gacgcactgg aggggaaggg actctctgct tatgcccagc 60
ccgccgctgg ccggatcggg ggcagccagt gcacctgact catgctgccg gggcctgact 120
gagaatgggc gcaaaccatg tttactgaat gaataaggga aagggctgct aactcgctgc 180
gggtggaact ggggtcgggg ccagggccca ggagtgtaag cttagtgggg ggtctcgggt 240
cgggaaatca aagtgcttct taagggtccc caaacggaac gcgctgccca ggaagtgatg 300
agactgacaa ctcgggaggt ggccaagcag gggacggacg atccctgccc ctgactcgaa 360
gggtcggaga cgaaattccc gccccagact atgaggccga gcccctcgga gactctgccc 420
gggacacggc gggaccgacc gcgagggagc ggcgccggcg gcctcccgta cctgcgctcc 480
tccacctccg cgtctctctc gagctccagc aggtccagtt gcttggtcac gaagctctcc 540
acagctgccg aggccatcgc cgccgccggc ctgggcccct agaagccgac gtcccgcttc 600
tgcgccgggc cggtgttaca gcggaccggt gttccccgcc gggcccgtgc gttacgcacg 660
cggttcgcgt cgtttccgtt tccggccgag gctgcggcca tggcagcatc ttccctgacg 720
gtcaccttag ggcggctggc gtccgcgtgc agccacagca tcctgagacc ttcggggccc 780
ggagcaggtg agacctggga tatgggagga agggaggacg cagagcgagc gctgctccct 840
gcggtctcgc cacgtatgtg cctgggtccg acctggtgcc ttgtgtgttg atcgcatttg 900
tggtgaatat agcacgggtt ttggagtcgg gggaacccag gttcagattt tgattccttc 960
agttagtagc ctgaatactg acaatagccc ttgaactttg g 1001
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 3
acgttggatg agcttcgtga ccaagcaact 30
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 4
acgttggatg tacctgcgct cctccacct 29
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 5
ctccgcgtct ctctc 15

Claims (1)

1.IGHMBP2基因 rs1249463突变位点的检测试剂在制备预测辐射敏感性的检测试剂盒中的用途。
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