CN112195229B

CN112195229B - 同时检测多个辐射敏感性相关snp位点的试剂盒

Info

Publication number: CN112195229B
Application number: CN202010929474.XA
Authority: CN
Inventors: 张阳东; 邓致荣; 江其生; 吕进; 郭宝石; 胡红芳; 苏璞; 殳晓强; 郭惠民
Original assignee: Rocket Force Characteristic Medical Center of PLA
Current assignee: Rocket Force Characteristic Medical Center of PLA
Priority date: 2020-09-07
Filing date: 2020-09-07
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2040-09-07
Also published as: CN112195229A

Abstract

本发明公开了一种同时检测辐射敏感性相关多种基因多个单核苷酸多态性(SNP)位点的试剂盒及其应用。本发明通过设计每个位点的扩增引物和单碱基延伸引物，通过多重PCR和多重单碱基延伸反应，进而进行质谱分析其特异性的产物，判定每一个位点的基因型，其检测特异性强、灵敏度高，同时具有快速、稳定、高通量、价格低廉且操作简便等特点，可应用于科研、涉核人员辐射敏感性的筛查。

Description

同时检测多个辐射敏感性相关SNP位点的试剂盒

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，涉及一种同时检测辐射敏感性相关多种基因多个单核苷酸多态性(SNP)位点的试剂盒及其应用。本发明通过设计每个位点的扩增引物和单碱基延伸引物，通过多重PCR和多重单碱基延伸反应，进而进行质谱分析其特异性的产物，判定每一个位点的基因型。

背景技术

经过几十年的努力，我国的核技术产业已进入快速发展期，核技术目前已广泛应用于工业、农业、医疗、环保、军事等领域。民用核技术应用中最为大家熟知的是核电站，我国已建成近五十台核电机组，并有几十台核电机组正在建设中。除了核电站，民用核技术还包括以带电粒子加速器、放射性同位素为辐射源的辐射技术应用和以放射性同位素为载体的辐射、示踪技术应用等。民用核技术应用不仅可以加快推动相关产业转型升级，还可以产生巨大的经济效益和社会效益。

核辐射作用于机体，可使生物大分子发生激发和电离，导致多种生物学效应。在核事故和一次性大剂量照射情况下，公认为染色体畸变与剂量有相应的关系，染色体畸变损伤是反映辐射剂量和效应的敏感指标。但是人体对电离辐射的反应有较大差异，即使是在暴露辐射环境相同、辐射防护条件一致的情况下，同一职业群体所表现出的染色体受损情况亦有很大差别，有人染色体损伤明显，有人却不发生损伤。可见个体易感因素在辐射损伤发生中的作用不可忽视。而长期接触低剂量射线，染色体损伤程度无明显加重，可能是小剂量长期照射，机体的损伤与修复基本达到动态平衡，也可能有低剂量辐射诱发的细胞遗传学适应性反应参与。随着分子检测技术的发展，人们认识到个体在应对辐射危害时表现出的辐射敏感性差异，本质是基因对辐射的反应不同。各种辐射导致的DNA损伤主要包括碱基损伤和DNA链断裂，包括单链和双链的断裂,而受损的DNA若不能及时、有效地修复,尤其是双链断裂的修复缺陷,便会引起染色体断裂、细胞凋亡、无节律增殖，甚至形成肿瘤。人类正常细胞中存在一整套复杂、精密的DNA修复系统，及时修复受损DNA，保证细胞正常复制。DNA损伤修复能力的差异是决定该个体遗传损伤易感性的一个重要因素。由于SNP可增加同义或者非同义氨基酸替换，改变该基因所编码的蛋白表达和蛋白活性，一些基因尤其DNA 损伤修复基因多态性决定了个体间电离辐射所致DNA损伤修复能力上的差异，是导致不同个体间辐射敏感性差异的遗传学基础。因此通过基因SNP与辐射损伤之间的关联性研究，探寻发现生物个体的辐射易感基因，可实现早期发现辐射易感个体，降低辐射损伤风险。

共济失调性毛细血管扩张症突变基因(ATM)是DNA损伤修复的重要基因之一，在信号转导过程中发挥作用。ATM的突变和失活可使此基因生物功能的不稳定性增加，在DNA双链断裂修复过程中发生障碍，从而表现出对辐射的高度敏感。赵君彦等以放射作业人员为研究对象，通过染色体畸变和SNP的相关性研究，结果显示ATM基因 rs189037位点与放射作业人员发生染色体损伤的风险相关，其GA/AA基因型可能是职业性小剂量辐射的敏感基因型。大量的研究结果显示ATM基因rs189037、rs373759、 rs4988044、rs1801516和rs228590位点与肿瘤的易感性和肿瘤放射治疗时发生的放射性损伤相关。

人类X线修复交叉互补基因(XRCC)是碱基切除修复、单链断裂修复系统中重要的DNA修复基因，是DNA完整性的关键。其中XRCC1在辐射损伤过程中发挥重要作用。 XRCC1缺陷的细胞对电离辐射敏感。国内王良群等的研究结果显示XRCC1基因 rs1799782位点的CT/TT基因型可能是辐射致染色体损伤的危险因素。国外的研究结果显示XRCC1基因rs25487位点与放射敏感性相关，rs2682585多态性与乳腺癌放射治疗后皮肤毒性和纤维化也密切相关。XRCC3参加DNA双链断裂的同源重组修复过程，在维持染色体稳定性和DNA损伤修复方面扮演重要角色。XRCC3基因rs861539位点可能影响蛋白质结构的非保守性多态，通过引起同源重组修复途径缺陷，导致双链断裂的修复机制竞争性地转向非同源末端连接机制，这会降低基因组稳定性并影响细胞修复辐射损伤的能力，进而影响DNA损伤的发生风险。有研究结果显示XRCC3基因rs861539 等位基因频率与受辐射人员的微核率相关，变异型多态性可能会增加受辐射人员的 DNA损伤。

机体代谢产生的过氧化氢可直接造成DNA氧化损伤，并最终形成具有强致突变能力的8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-OHdG),造成DNA的损伤。8-羟基鸟嘌呤糖苷酶(hOGG1)基因编码产物是碱基切除修复途径的重要蛋白，其利用糖苷酶特异性切除和修复8-OHdG，在DNA氧化损伤修复过程以及维持DNA完整性方面起着至关重要的作用。实验证明 hOGG1基因rs1052133位点的野生基因型与接触低剂量电离辐射的医疗人员外周血淋巴细胞微核率相关。

放射性肺损伤是胸部肿瘤放射治疗中的常见并发症，放射性肺损伤主要表现为炎症，随着放射次数的增加炎症会逐渐导致肺纤维化，影响患者的肺功能。转化生长因子β1(TGF-β1)是由多种细胞分泌的、具有调控细胞生长、发育和分化等广泛生物学效应的关键细胞因子，是第一个被确认的放射性肺损伤敏感性基因。TGF-β1及其通路中的蛋白对辐射毒性有显著影响。既往研究显示TGF-β1基因rs1800469、rs1982073 和rs1146634位点与发生放射性肺损伤的风险相关。

O-6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)是DNA损伤直接修复中最重要的一种酶，可切除DNA上的甲基及其它一些小的烷基，同时发挥转移酶和甲基接受体的作用，将甲基从O-6-甲基鸟嘌呤转移到自身的半胱氨酸残基上，使DNA链上的鸟嘌呤复原，在突变发生之前中和这种损伤作用。Christine L等通过对暴露于切尔诺贝利核电站事故辐射尘中的白俄罗斯儿童乳突状甲状腺癌(PTC)病例进行研究，结果显示MGMT基因 rs2296675位点是PTC的危险因素。另有研究结果发现MGMT基因rs12769288位点与射线暴露甲状腺癌和甲状腺微小癌相关。

γH2AX焦点形成实验是一种间接检测早期DNA双链断裂损伤的方法。DNA损伤识别修复因子(XPA)是一种进化保守的DNA修复酶，其主要作用是识别受损的DNA。XPA 基因多态性可能会影响其蛋白质的功能进而改变个体DNA损伤修复的能力，XPA基因 rs3176683位点与γH2AX水平相关。DNA连接酶4(LIG4)是DNA双链断裂非同源末端链接修复通路中一个重要的修复因子。Mumbrekar KD等的结果显示XRCC6基因rs2267437 位点和辐射敏感性相关而LIG4的rs1805388位点与辐射抵抗相关。

ERCC家族基因主要包括ERCC1、ERCC2(也称为XpD)、ERCC3(也称为XpB)、 ERCC4(也称为XpF)和ERCC5(也称为XpG)，它们参与DNA修复和重组。XpD是最重要的DNA修复蛋白之一，在碱基切除修复途径和基础转录中起着重要作用。腺苷酸二磷酸核糖转移酶(ADPRT)是DNA修复途径中重要的修复基因，可通过对DNA缺口进行识别来修复DNA单链的断裂损伤。其中，位于该基因17外显子的rs1136410位点可发生非同义突变，造成编码产物ADPRT酶催化结构域空间构象发生改变，使得其活性降低、 DNA修复能力下降。通过对生活在高浓度氡环境的DNA修复基因的SNP进行分析发现， XpD基因rs13181位点的GG基因型，XpG基因rs17655位点的GG基因型和ADPRT基因 rs1136410位点的TC基因型是辐射敏感性的标志物。XpD基因rs13181位点与放疗后辐射损伤发生风险间也存在显著关联。

4D磷酸二酯酶(PDE4D)是一类能特异性水解环磷酸腺苷(cAMP)的磷酸二酯酶。研究认为，PDE4D表达增加可造成cAMP的活性下降，而cAMP的减少可引起血管平滑肌增生和移行以及序贯受损处局部炎性反应加剧的作用，促进动脉粥样硬化的形成与致血管粥样斑块的不稳定性增加，进而增加心脑血管疾病的风险。研究发现参加切尔诺贝利核电站受辐射的救援人员冠心病的发病时间提早、患冠心病的风险增。PDE4D 基因rs966221位点的TT基因型和辐照导致心肌梗死的发生风险相关。

补体是机体免疫的一部分，帮助抵御外来成分及微生物入侵。补体因子H(CFH) 是补体系统一个重要的组成成分，在补体系统中扮演着重要的负反馈作用。研究发现CFH基因rs2708896和rs10951937位点是射线暴露甲状腺癌和甲状腺微小癌的危险因素。mutS同源蛋白6基因(MSH6)是重要的错配修复系统。MSH6基因rs1042821位点的杂合型是甲状腺癌的遗传危险因素。

辐射导致分子生物学水平的损伤可通过遗传影响下一代的健康。辐射损伤特别是长期接触低剂量射线对涉核人员的影响已日益引起关注。目前国内外有关电离辐射与SNP的相关性研究多集中在某一基因的单个或几个位点在肿瘤患者接受放射性治疗中产生的放疗敏感性和辐射损伤风险的研究，且研究不同基因时所参考的辐射损伤的标准不同，因而基因与基因之间及基因与辐射敏感性之间的交互作用研究较少，很难建立一个多基因多位点的辐射敏感性评价体系。因此急需建立一种快速、稳定、高通量、价格低廉且操作简便的检测方法，筛选与辐射损伤敏感性相关的SNP，根据SNP 的基因型建立涉核岗位作业人员遴选方案，评价辐射敏感性的风险程度，从而早期发现辐射易感个体，进而达到预防职业病的效果。

发明内容

虽然本发明所涉及的辐射敏感性相关基因位点已经被现有技术所公开和报道，但是，如何建立可同时检测多个辐射敏感性相关SNP的检测试剂盒具有重要的社会价值和军事价值。

本发明中可以一孔检测17种基因中的28个变异位点。对于多个变异位点同时检测，在设计中需要同时考虑blast家族基因片段各位点引物的特异性，即，对于同一基因挨得比较近的位点，PCR引物不能跨两个位点；又要求多个变异位点pcr引物扩增保持同步进行，且扩增效率相对一致。如何设计多个变异位点一孔检测没有现成的方法，需要本领域的技术人员付出创造性的劳动才能够实现。

有鉴于此，本发明提供一种高效的辐射敏感性相关基因位点变异的检测检测试剂盒，在单个反应体系中，通过扩增辐射敏感性相关的17种基因28个变异位点，再在变异位点处进行单碱基延伸，使用ddNTP作为延伸原料，使在变异位点处延伸一个碱基。延伸的产物经过脱盐纯化后进一步通过飞行时间质谱检测，不同位点、不同变异所延伸的产物分子质量不同，其在真空管中飞行的速度不同，借以来判断产物分子质量的大小，从而判断位点的基因型。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明的目的在于提供一种检测辐射敏感性相关基因位点变异的试剂盒，所述辐射敏感性相关基因位点选自下述17种基因28个突变位点中的15个以上，优选为20 个以上，进一步优选为全部28个突变位点；所述28个突变位点选自ATM基因rs189037、 rs373759、rs4988044、rs1801516和rs228590位点；XRCC1基因rs2682585、rs25487 和rs1799782位点；XRCC3基因rs861539和rs1799794位点；XRCC6基因rs2267437 位点；hOGG1基因rs1052133位点；TGF-β1基因rs1800469、rs1982073和rs1146634 位点；TNF-α基因rs1800629位点；GSTP-1基因rs1695位点；PDE4D基因rs966221位点；XpD基因rs13181位点；XpG基因rs17655位点；ADPRT基因rs1136410位点；LIG4 基因rs1805388位点；XPA基因rs3176683位点；CFH基因rs2708896和rs10951937 位点；MGMT基因rs2296675和rs12769288位点；MSH6基因rs1042821位点；所述 28个突变位点的检测试剂分别含有SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2，SEQID NO.3与 SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.8，SEQID NO.9与SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11与SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.13与SEQ ID NO.14，SEQ ID NO.15与SEQ ID NO.16，SEQ ID NO.17与SEQ ID NO.18，SEQ ID NO.19与SEQ IDNO.20，SEQ ID NO.21与SEQ ID NO.22，SEQ ID NO.23与SEQ ID NO.24，SEQ ID NO.25与SEQID NO.26，SEQ ID NO.27与SEQ ID NO.28，SEQ ID NO.29与SEQ ID NO.30，SEQ ID NO.31与SEQ ID NO.32，SEQ ID NO.33与SEQ ID NO.34，SEQ ID NO.35与SEQ ID NO.36，SEQ IDNO.37与SEQ ID NO.38，SEQ ID NO.39与SEQ ID NO.40，SEQ ID NO.41与SEQ ID NO.42，SEQID NO.43与SEQ ID NO.44，SEQ ID NO.45与SEQ ID NO.46，SEQ ID NO.47与SEQ ID NO.48，SEQ ID NO.49与SEQ ID NO.50，SEQ ID NO.51与SEQ ID NO.52，SEQ ID NO.53与SEQ IDNO.54，SEQ ID NO.55与SEQ ID NO.56所示的引物对；所述试剂盒含有上述与待测突变位点相对应的引物对，并且所述试剂盒中的引物对为同一包装。本发明通过合理设计引物对，使得引物通过同一包装在在一个孔里进行多个多态性位点的同时扩增和检测，并且其检测特异性强、灵敏度高、相互之间不产生干扰，可应用于科研、涉核人员辐射敏感性的筛查。

优选的，所述28个突变位点的检测试剂还包括单碱基核酸引物，所述单碱基核酸引物分别如SEQ ID NO.57～SEQ ID NO.84所示。

优选的，所述试剂盒还包括PCR扩增试剂，所述PCR扩增试剂包含10×PCR Bufferwith 20mM，25mM MgCl₂，25mM dNTP Mix，0.5μM Primer Mix和5U/μl PCR Enzyme。

优选的，所述试剂盒还包括SAP酶消化处理试剂，所述SAP酶消化处理包括SAPBuffer和SAP Enzyme。

优选的，所述试剂盒还包括单碱基延伸反应试剂，所述单碱基延伸反应试剂包括iPLEX Buffer、iPLEX Termination mix、Extend Primer Mix和iPLEX Enzyme。

本发明的目的之二在于提供所述试剂盒用于检测辐射敏感性相关基因的方法，包括如下步骤：

所述试剂盒用于检测辐射敏感性相关基因的方法，包括如下步骤：

1)制备待测样本基因组DNA，所以样本为来源于人的血液、唾液、口腔拭子、发根；

2)以提取的基因组DNA为模板，SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.56所示引物混合一管后进行多重PCR扩增，扩增产物进行SAP酶消化处理，再使用SEQ ID NO.57～SEQ ID NO.84所示单碱基延伸引物混合一管后进行单碱基延伸反应，反应结束后使用基质辅助激光解离吸附电离飞行时间质谱，最后Typer软件分析检测位点的基因型。

优选的，步骤2)中，所述PCR扩增的条件为95℃预变性2min；95℃变性30s， 60℃退火30s，72℃延伸60s，45个循环；72℃后延伸5min。

优选的，所述SAP酶消化处理的条件为37℃保温40min；85℃保温5min。

优选的，所述单碱基延伸反应的条件为95℃预变性30s；95℃变性5sec，52℃退火5sec，80℃延伸5sec，共40个循环，每个循环中插入退火和延伸5个循环；最后 72℃后延伸3min。

本发明的有益效果在于：本发明通过大量文献，筛选与辐射损伤敏感性相关的基因。通过设计多重PCR扩增引物和单碱基延伸引物，结合基质辅助激光解吸附飞行时间质谱技术，实现了在一个孔里进行28个多态性位点的同时检测，并且其检测特异性强、灵敏度高，同时具有快速、稳定、高通量、价格低廉且操作简便等特点，可应用于科研、涉核人员辐射敏感性的筛查。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图并进行说明：

图1为ATM基因相关位点质谱分析图(A：rs189037；B：rs373759；C：rs4988044； D：rs1801516；E：rs228590)

图2为XRCC1基因相关位点质谱分析图(A：rs2682585；B：rs25487；C：rs1799782)

图3为XRCC3基因相关位点质谱分析图(A：rs861539；B：rs1799794)

图4为XRCC6基因相关位点质谱分析图(A：rs2267437)

图5为hOGG1基因相关位点质谱分析图(A：rs1052133)

图6为TGF-β1基因相关位点质谱分析图(A：rs1800469；B：rs1982073；C：rs1146634)

图7为TNF-α基因相关位点质谱分析图(A：rs1800629)

图8为GSTP-1基因相关位点质谱分析图(A：rs1695)

图9为PDE4D基因相关位点质谱分析图(A：rs966221)

图10为XpD基因相关位点质谱分析图(A：rs13181)

图11为XpG基因相关位点质谱分析图(A：rs17655)

图12为ADPRT基因相关位点质谱分析图(A：rs1136410)

图13为LIG4基因相关位点质谱分析图(A：rs1805388)

图14为XPA基因相关位点质谱分析图(A：rs3176683)

图15为CFH基因相关位点质谱分析图(A：rs2708896；B：rs10951937)

图16为MGMT基因相关位点质谱分析图(A：rs2296675；B：rs12769288)

图17为MSH6基因相关位点质谱分析图(A：rs1042821)

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

基于大量研究和实验，最终选择了17个基因的28个变异位点：ATM(rs189037、rs373759、rs4988044、rs1801516、rs228590)，XRCC1(rs2682585、rs25487、rs1799782)，XRCC3(rs861539、rs1799794)，XRCC6(rs2267437)、hOGG1(rs1052133)，TGF-β1(rs1800469、rs1982073、rs1146634)，TNF-α(rs1800629)，GSTP-1(rs1695)，PDE4D(rs966221)，XpD(rs13181)，XpG(rs17655)，ADPRT(rs1136410)，LIG4(rs1805388)， XPA(rs3176683)，CFH(rs2708896、rs10951937)，MGMT(rs2296675、rs12769288)， MSH6(rs1042821)，这些位点覆盖了辐射敏感性常见变异位点。

通过设计覆盖以上位点的多重PCR引物和单碱基延伸引物，结合基质辅助激光解离吸附飞行时间质谱技术，进行位点的高效、准确、低成本、快速的检测，设计的引物序列如表1所示，单碱基延伸引物如表2所示：

表1、多重PCR引物

表2、单碱基延伸引物

本实施例中所用到的试剂：天根全血抽提试剂盒(DP348-02)、

Pro，PCRReagent And

Kit CPM(10x384)。多重PCR和延伸引物合成自上海百力格生物技术有限公司，每管5OD。

样本制备：

a)标本采集：全血标本为常规取5ml静脉血于EDTA抗凝管中，取血后可立即检测，也可于4℃保存后续使用。

b)全血基因组DNA的提取：参考天根全血抽提试剂盒(DP348-02)提取说明书步骤，提取后DNA的吸光度OD260/280在1.7-2.0之间，然后将样本稀释至10ng/μL，以用于下一步PCR反应。

引物稀释：

a)多重扩增的引物干粉后用超纯水溶解制备成100μM贮存液，混合使每一条扩增引物的终浓度为0.5μM。

b)延伸引物的干粉用超纯水溶解制备成500μM的贮存液，混合配制后在质谱仪上调整至每一个引物峰高相对均一为止，即最低峰高大于最高峰高的二分之一。

检测方法：

a)PCR扩增：

配制如下反应体系：

PCR扩增程序：95℃预变性2min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s， 42个循环；72℃后延伸5min。

SAP酶消化处理，酶切反应体系如下：

将其加入至第一轮5μL的反应产物中，共7μL，进行如下反应：37℃保温40min； 85℃保温5min；

单碱基延伸反应，配制如下反应体系：

将其加入至上一轮7μL的反应产物中，共9μL，进行如下反应：95℃预变性30s； 95℃变性5sec，52℃退火5sec，80℃延伸5sec，共40个循环，每个循环中插入退火和延伸5个循环；最后72℃后延伸3min。

延伸反应结束后，往产物里加入16μL超纯水。本次实验使用的是带有芯片准备模块的全自动384孔模块系统(DP-TOF飞行时间质谱检测系统)。将其转移到飞行时间质谱仪的芯片准备模块，将一块芯片也放入模块，设置好程序，机器自动进行产物脱盐、点样芯片，和产物飞行步骤。飞行结束后，在机器自带的软件分析数据。

实施例1、特异性实例

该实施例选用8例全血样本，分别用本研究的方法测试，以及sanger测序的方法进行验证，验证结果与本方法100％一致。

以一例结果为例，质谱法检测的结果如下表3所示：

表3、质谱法检测结果

同时用测序的金标准方法如下：

1)样本制备操作方法与上述相同

2)PCR扩增试剂使用：Promega的Go Taq Hot Start Polymerase

3)引物制备

A)针对每一个位点设计相应的特异性引物

B)28对引物合成自上海百力格生物技术有限公司，每管1OD。

C)每管引物稀释至10μM

针对每个位点分别进行PCR扩增

4)将PCR产物送去杭州尚亚生物科技有限公司进行测序，测序结果分析见下表4

表4、测序结果

以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。对一般领域的技术人员而言，在不背离本发明实质精神的前提下对它所做的任何显而易见的改动，都将构成对本发明专利权的侵犯，将承担相应的法律责任。

序列表

<110> 中国人民解放军火箭军特色医学中心

<120> 同时检测多个辐射敏感性相关SNP位点的试剂盒

<160> 84

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 1

acgttggatg taggtagctg cgtggctaac 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 2

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<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 3

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<210> 4

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<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 4

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<210> 5

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<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 5

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<210> 6

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<212> DNA

<213> 人(human)

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<212> DNA

<213> 人(human)

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<212> DNA

<213> 人(human)

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人(human)

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acgttggatg atcgtgcgta aggagtgggt 32

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<213> 人(human)

<400> 15

acgttggatg cacctgggga tgtcttgttg a 33

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 16

acgttggatg gccagcagcc cacctataat 32

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 17

acgttggatg tgctcacctg gttgatgcac 32

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 18

acgttggatg aatttgacag ccaggcctcc 32

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 19

acgttggatg ataacagact caccggttgg 32

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 20

acgttggatg aggaggtcgt cactaaacag 32

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 21

acgttggatg cgtgaggatg gtatctgcga 32

<210> 22

<211> 31

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 22

acgttggatg acgtgtacga cctgtccaaa g 33

<210> 23

<211> 29

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 23

acgttggatg aggtgctgtt cagtgccga 31

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 24

acgttggatg cctttggaac cctttctgcg 32

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 25

acgttggatg ggagaagagg gtctgtcaac 32

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 26

acgttggatg gagcaattct tacaggtgtc 32

<210> 27

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 27

acgttggatg cctacctttt gccgggagac 32

<210> 28

<211> 31

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 28

acgttggatg tgtcgatagt cttgcaggtg g 33

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 29

acgttggatg tggtaagtgt gagtttagcg 32

<210> 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 30

acgttggatg aggtgaccag tgtgcttaac 32

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 31

acgttggatg ggaggcaata ggttttgagg 32

<210> 32

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 32

acgttggatg tctgggccac tgactgattt 32

<210> 33

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 33

acgttggatg gtggacatgg tgaatgacgg 32

<210> 34

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 34

acgttggatg tgctcacata gttggtgtag 32

<210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 35

acgttggatg atcagattgg aaggatctgc 32

<210> 36

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 36

acgttggatg tcctgtatag gtatgagtcc 32

<210> 37

<211> 29

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 37

acgttggatg aggaaccgtt tatggcccc 31

<210> 38

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 38

acgttggatg agcctggagc agctagaatc 32

<210> 39

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 39

acgttggatg acatgcggtg gatttttggg 32

<210> 40

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 40

acgttggatg ctggtttttg gctctttcgc 32

<210> 41

<211> 32

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 41

acgttggatg agttgacatc gatgggatcc tt 34

<210> 42

<211> 32

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 42

acgttggatg gtgttggacc ttctctgcat gt 34

<210> 43

<211> 31

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 43

acgttggatg cacaaatctg caaaaggaac g 33

<210> 44

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 44

acgttggatg acgagaagat tcatcaccgc 32

<210> 45

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 45

acgttggatg cactagcagt cctagccact 32

<210> 46

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 46

acgttggatg tcagagcaga tcgtctcaac 32

<210> 47

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 47

acgttggatg catgttgggc ccatggtaaa 32

<210> 48

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 48

acgttggatg tgatgttatg ccaggtttag 32

<210> 49

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 49

acgttggatg cagttacaac gcctccacgc 32

<210> 50

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 50

acgttggatg gccatttcgt cgggagtcac 32

<210> 51

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 51

acgttggatg tgagacatag ctgacaccca 32

<210> 52

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 52

acgttggatg agtcagggat ctggacaacg 32

<210> 53

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 53

acgttggatg tatggttagt agtgggaagc 32

<210> 54

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 54

acgttggatg cactgacact ccaatcattc 32

<210> 55

<211> 29

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 55

acgttggatg gacagaacgg ttgggcctt 31

<210> 56

<211> 30

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 56

acgttggatg tccgttgagg ttcttcgcct 32

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 57

actcctctcg cctcctcccg 22

<210> 58

<211> 25

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 58

ctctccagct taagactttc ctatt 60

no 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人(human)

taatgaaaca gaatattgct tac 25

<210> 60

<211> 28

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 60

agcagatttc tccatgattc atttgtat 30

<210> 61

<211> 24

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 61

gtcagaagaa ccaccagtga atat 26

<210> 62

<211> 17

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 62

aggaagctga ggagggg 19

<210> 63

<211> 27

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 63

accgcatgcg tcggcggctg ccctccc 29

<210> 64

<211> 17

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 64

agatgtcttg ttgatcc 19

<210> 65

<211> 14

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 65

acagctcacg cagc 16

<210> 66

<211> 15

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 66

caagttctca gcagg 17

<210> 67

<211> 27

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 67

tggcccaagt ctccccacct cggccag 29

<210> 68

<211> 25

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 68

ctgttcagtg ccgacctgcg ccaat 27

<210> 69

<211> 17

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 69

tcctgaccct tccatcc 19

<210> 70

<211> 15

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 70

agcggtagca gcagc 17

<210> 71

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 71

cagtgtgctt aaccctactc 22

<210> 72

<211> 28

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 72

gtaggaccct ggaggctgaa ccccgtcc 30

<210> 73

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 73

ggaggacctc cgctgcaaat ac 24

<210> 74

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 74

atctgctgct ggataaacca c 23

<210> 75

<211> 27

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 75

gagcagctag aatcagagga gacgctg 29

<210> 76

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 76

aaagatgaac tttcagcat 21

<210> 77

<211> 26

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 77

tgtccagcag gttgtcaagc atttcc 28

<210> 78

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 78

aaaaggaacg tgagatgcaa ca 24

<210> 79

<211> 18

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 79

ggtgtgccaa gacggtga 20

<210> 80

<211> 26

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 80

ggtttagaat actggagtct cgatca 28

<210> 81

<211> 24

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 81

aggccctcct ctccccagca gctc 26

<210> 82

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 82

ggatctggac aacgaggtct 22

<210> 83

<211> 17

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 83

gaagccaagc tgtttct 19

<210> 84

<211> 26

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 84

catccccgcc tggggaagga gaggcc 28

Claims

1.一种通过飞行时间质谱检测辐射敏感性相关基因位点变异的试剂盒，所述辐射敏感性相关基因位点选自下述17种基因28个突变位点中的20个以上；所述28个突变位点选自ATM基因rs189037、rs373759、rs4988044、rs1801516和rs228590位点；XRCC1基因rs2682585、rs25487和rs1799782位点；XRCC3基因rs861539和rs1799794位点；XRCC6基因rs2267437位点；hOGG1基因rs1052133位点；TGF-β1基因rs1800469、rs1982073和rs1146634位点；TNF-α基因rs1800629位点；GSTP-1基因rs1695位点；PDE4D基因rs966221位点；XpD基因rs13181位点；XpG基因rs17655位点；ADPRT基因rs1136410位点；LIG4基因rs1805388位点；XPA基因rs3176683位点；CFH基因rs2708896和rs10951937位点；MGMT基因rs2296675和rs12769288位点；MSH6基因rs1042821位点；所述28个突变位点的检测试剂分别含有SEQ IDNO.1与SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6，SEQ IDNO.7与SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11与SEQ ID NO.12，SEQ IDNO.13与SEQ ID NO.14，SEQ ID NO.15与SEQ ID NO.16，SEQ ID NO.17与SEQ ID NO.18，SEQID NO.19与SEQ ID NO.20，SEQ ID NO.21与SEQ ID NO.22，SEQ ID NO.23与SEQ ID NO.24，SEQ ID NO.25与SEQ ID NO.26，SEQ ID NO.27与SEQ ID NO.28，SEQ ID NO.29与SEQ IDNO.30，SEQ ID NO.31与SEQ ID NO.32，SEQ ID NO.33与SEQ ID NO.34，SEQ ID NO.35与SEQID NO.36，SEQ ID NO.37与SEQ ID NO.38，SEQ ID NO.39与SEQ ID NO.40，SEQ ID NO.41与SEQ ID NO.42，SEQ ID NO.43与SEQ ID NO.44，SEQ ID NO.45与SEQ ID NO.46，SEQ IDNO.47与SEQ ID NO.48，SEQ ID NO.49与SEQ ID NO.50，SEQ ID NO.51与SEQ ID NO.52，SEQID NO.53与SEQ ID NO.54，SEQ ID NO.55与SEQ ID NO.56所示的引物对；所述试剂盒含有与待测突变位点相对应的引物对，并且所述试剂盒中的引物对为同一包装；所述28个突变位点的检测试剂还包括与待测位点对应的单碱基核酸引物，所述单碱基核酸引物分别如SEQ ID NO.57~ SEQ ID NO.84所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，所述辐射敏感性相关基因位点选自17种基因28个突变位点中的全部28个突变位点。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒还包括PCR扩增试剂，所述PCR扩增试剂包含10×PCR Buffer with 20mM，25mM MgCl₂，25mM dNTP Mix，0.5 μM Primer Mix和5U/µlPCR Enzyme。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒还包括SAP酶消化处理试剂，所述SAP酶消化处理包括SAP Buffer和SAP Enzyme。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒还包括单碱基延伸反应试剂，所述单碱基延伸反应试剂包括iPLEX Buffer、iPLEX Termination mix、Extend Primer Mix和iPLEXEnzyme。

6.权利要求1-5任意一项所述的试剂盒在制备同时检测多个辐射敏感性相关SNP位点的诊断试剂中的应用。