CN101654714B - 一组用于识别乙型肝炎病毒耐药性的pcr引物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于识别乙型肝炎病毒耐药性的检测方法，其特征在于，具体步骤为：采集被测者血清样本，进行血清HBV DNA的抽提，对乙型肝炎病毒P基因区进行检测，相应位点特异性引物的设计以及用于序列测定的实验方案、试剂以及报告生成系统，通过同时检测分析个体的HBV P基因区9个位点的基因型来识别乙型肝炎病毒核苷酸类药物的耐药性。本发明的优点是可用于乙型肝炎患者核苷酸类药物的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于识别乙型肝炎病毒耐药性的检测方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术
全球至少有3.5亿人携带乙型肝炎病毒(HBV)，约有30％的感染者转化为慢性乙型肝炎，其中有3000万慢性乙肝患者在中国。乙型肝炎不仅可以导致肝硬化，而且是肝癌的原发病因，已经被WTO列为第9死因。
核苷酸类药物已广泛应用于乙型肝炎患者的抗病毒治疗，包括拉米夫定(Lamivudine，LAM)，阿德福韦酯(Adefovir，ADV)，恩替卡韦(Entecavir，ETV)，替比夫定(Telbivudine，LdT)和泛昔洛韦(Famciclovir，FCV)等，这些药物主要作用于HBV DNA复制环节，通过抑制HBV逆转录酶活性，阻止病毒核酸的复制，降低HBV DNA载量，进而产生疗效。虽然这些药物对绝大多数病人来说初期使用效果都很明显，但随着治疗时间的加长，疗效会逐渐散失以致最后完全无效。统计表明，拉米夫定耐药的发生率第1年为15％，以后逐年增加，分别为42％、53％、70％；阿德福韦酯第1年未见耐药报道，第2～5年分别为3％、11％、18％、29％；恩替卡韦、替比夫定、泛昔洛韦也相继有耐药的报道，且同时服用多种核苷酸类药物可以导致多重耐药的发生。造成这种情况的主要原因是病毒在不停的变异，在逆转录酶基因上的一些特定变异会导致其表达产物逆转录酶躲避对应药物的抑制，从而使其变异病毒能够存活并繁殖。
HBV是双链DNA分子，约3200个碱基组成，基因组由S、C、P、X四个开放阅读框组成，其中P基因区编码HBV DNA聚合酶，分为末端蛋白区、间隔区、逆转录酶区和RnaseH区四个区。其逆转录酶区长度为344个氨基酸，序列为349～692，即rt1～rt344，此区在HBV DNA的合成和逆转录过程中起重要作用，是病毒复制的关键部位，它又被分为A到E五个活性部位，A、C、D区为三磷酸核苷结合和催化位点，B、E区可能参与RNA模板和启动子定位。
目前认为，HBV对核苷酸类药物耐药性的产生多与HBV P基因区变异有关，并且HBVP基因区变异是多位点的。拉米夫定耐药多由HBV逆转录酶C区YMDD基序中蛋氨酸(M)被异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)取代引起，常和B区一个额外的L180M变异相伴，即变异位点 为rtL180M+rtM204V、rtM204I，田德英等对服用拉米夫定治疗慢性乙肝的102例患者进行HBV YMDD变异检测，39例HBV DNA阳性耐药者中YMDD变异22例，变异率为56.4％，并与用药时间长短有关，9-17个月和18-30个月变异检出率分别为51.7％和70％，提示YMDD变异是HBV对拉米夫定耐药的原因之一。阿德福韦酯耐药与逆转录酶B区rtA181T和D区rtN236T变异有关，体外药敏试验表明，单一rtA181T、rtN236T变异可使HBV对阿德福韦酯敏感性分别下降4.3倍和7倍，而rtA181T+rtN236T联合变异可使药物敏感性下降18倍。刘峰等在51例接受阿德福韦酯治疗(10mg/d，疗程＞12月)发生病毒突破的慢性乙肝患者中，检出37例患者血清HBV存在rtA181T和/或rtN236T变异，耐药变异检出率高达72.55％。Colonno R等报道在拉米夫定耐药患者中有7％(13/189)在接受恩替卡韦治疗48周时在原有拉米夫定耐药基因变异的基础上出现恩替卡韦耐药基因变异，位点为B区rtT184A、C区rtS202I和E区rtM250V。替比夫定治疗引起的常见临床耐药位点为rtM204I，体外实验表明，替比夫定对单独的rtM204V变异株仍保持敏感，但对单独rtM204I变异和含有rtL180M+rtM204V的双重变异株均不敏感。泛昔洛韦治疗突破相关病例鉴定出变异的为B区rtV173L、rtL180M和C区rtV207E/I，体外评价FCV对野生株和变异株的抗病毒活性显示：rtV207E/I对FCV耐受性最高。
乙型肝炎病毒在人体内由于受自然选择压力、人体免疫力和抗病毒药物治疗等因素的影响，常常出现变异。这些变异可能导致HBV出现免疫逃逸，致病性发生改变以及对药物产生耐药性，从而给临床诊断和治疗造成困难。HBV DNA聚合酶基因突变检测，会在对核苷酸类药物的选择及疾病预后的判断中发挥重要作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于识别乙型肝炎病毒耐药性的检测方法，用于乙型肝炎患者核苷酸类药物的应用。
为实现以上目的，本发明的技术方案是提供一种用于识别乙型肝炎病毒耐药性的检测方法，其特征在于，具体步骤为：
步骤1.采集被测者血清样本；
步骤2.基因组DNA的抽提方法：
采用硅胶吸附法抽提步骤1中的被测者血清样本中的HBV DNA，抽提时间为2-3小时，采用电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；
步骤3.基因突变检测：将每一个被测者的HBV DNA样本放入1个反应孔，检测HBV P 基因区，采用PCR技术进行扩增、凝胶电泳技术检测纯度、测序技术进行基因突变检测：
步骤3-1，反应体系配置：
在每一个反应孔中加入PCR标准反应体系，标准反应体系的正向引物和反向引物浓度皆为10uM，反应体系总体积为20ul，其中，PCR试剂5ul，正向引物和反向引物各0.4ul，步骤2得到的20ng/μl的被测者血清样本中的HBV DNA模板3μl，去离子水11.2ul；
检测HBV P基因DNA 301-1200正向引物和反向引物如下：
正向引物：ttcctcttcatcctgctgct
反向引物：gttggcgagaaagtgaaagc
步骤3-2，采用PCR技术进行扩增：
将1个反应孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为95℃预热15分钟；再进行35个循环的95℃、45秒；60℃、45秒；72℃、60秒；72℃、7分钟后降温至4℃；
步骤3-3，将1个反应孔在PCR扩增仪反应后的产物进行电泳检测，肉眼可见清晰白色条带即可进入下一步；
a.1wt％琼脂糖凝胶插小号孔梳子；
b.2000bp DNA标记物5ul；
c.PCR产物4ul加入电泳缓冲液1ul；
d.电泳电压：120v；
e.电泳时间：20min拍摄一张电泳图，30min拍摄一张电泳图；
步骤3-4，纯化：
终浓度：PCR产物纯化试剂0.2U SAP+PCR产物纯化试剂2.5U EXON1/7ul；
在每一个反应孔中加入反应体系，反应体系总体积为7ul、去离子水ddH2O 3.825ul、PCR产物纯化试剂SAP 0.05ul、PCR产物纯化试剂EXON1 0.125ul、步骤3-3得到的PCR产物3ul；反应条件为：37℃、60min；80℃、15min；4℃恒温保存；
步骤3-5，将纯化后的每一个反应孔进行测序，引物浓度为1uM，ABI 3730测序仪：
步骤3-5-1，从-20度冰箱中取出步骤3-4得到的PCR纯化产物、测序试剂BigDye、四种dNTP、1uM测序引物，测序引物：ttcctcttcatcctgctgct；
步骤3-5-2，记录日期、PCR纯化产物名、测序引物、反应体系、测序试剂用量、PCR反应条件；
步骤3-5-3，取一块反应板，标上DNA模板名、测序引物名、日期；
步骤3-5-4，每个样本做一个PCR反应，用一个反应孔；
步骤3-5-5，在每一个反应孔中加入反应体系，反应体系为0.5ul的BigDye、1.4ul的dNTP、2ul的测序引物、3ul的PCR纯化产物、0.1ul的去离子水ddH2O；体系分装好后，上离心机，达900转/分即停；
步骤3-5-6，将反应板放在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为预热96℃10秒；再进行25个循环的96℃、10秒；50℃、5秒；60℃、4分钟；60℃、4分钟后降温至4℃恒温保存；
步骤3-5-7，扩增结束后，在每孔加入1ul 125mM乙二胺四乙酸；
步骤3-5-8，再在每孔加入无水乙醇15ul于室温进行沉淀，不得超过24小时；
步骤3-5-9，将96孔板放入冰冻离心机，3650转/分，4℃离心30分钟；
步骤3-5-10，倒去上清液，将96孔板离心，达800转即停，再在每孔加30ul 70wt％乙醇，3650转/分，4℃离心15分钟，倒去上清液，将96孔板离心，达800转即停，将残余乙醇风干，室温放置20分钟；
步骤3-5-11，每孔加入8ul的95wt％甲酰胺与ddH2O混合物；
步骤3-5-12，在ABI 3730上进行结果读取，用软件Chromas查阅测序检测结果：9个位点各有2种结果，即正常结果和突变结果；
步骤4.结果分析：
1.未检出突变：您的检测结果中未发现HBV P基因区突变位点；
2.检出突变：您的检测结果中存在与HBV核苷酸类药物耐药相关的突变位点。
本发明对乙型肝炎病毒P基因区进行检测，相应位点特异性引物的设计以及用于序列测定的实验方案、试剂以及报告生成系统，通过同时检测分析个体的HBV P基因区9个位点的基因型来识别乙型肝炎病毒核苷酸类药物的耐药性。
采集样本的类型为血清样本，采用硅胶吸附法抽提血清HBV DNA具有所需样品量少，抽提质量稳定，抽提产物纯度高，操作简便的特点。
利用本发明对超过100例以上中国人群样本的检测结果显示，根据上述方法进行的HBVP基因的9个位点基因型检测检出率可达99％以上，结果可重复性达到100％。
本发明的优点是可用于乙型肝炎患者核苷酸类药物的应用。
附图说明
图1为7个样本PCR后产物的电泳结果图
图2为rtV173L位点实验正常结果示意图；
图3为rtV173L位点实验突变结果示意图；
图4为rt L180M位点实验正常结果示意图；
图5为rt L180M位点实验突变结果示意图；
图6为rtA181T位点实验正常结果示意图；
图7为rtA181T位点实验突变结果示意图；
图8为rtT184A位点实验正常结果示意图；
图9为rtT184A位点实验突变结果示意图；
图10为rt S202I位点实验正常结果示意图；
图11为rt S202I位点实验突变结果示意图；
图12为rt M204V/I位点实验正常结果示意图；
图13为rtM204V/I位点实验V突变结果示意图；
图14为rtM204V/I位点实验I突变结果示意图；
图15为rt V207E/I位点实验正常结果示意图；
图16为rtV207E/I位点实验E突变结果示意图；
图17为rtV207E/I位点实验I突变结果示意图；
图18为rt N236T位点实验正常结果示意图；
图19为rt N236T位点实验突变结果示意图；
图20为rt M250V位点实验正常结果示意图；
图21为rt M250V位点实验突变结果示意图；
图22为实施例被测者定位在rt M204V/I位点实验突变结果示意图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例
一种用于识别乙型肝炎病毒耐药性的检测方法，具体步骤为：
步骤1.采集被测者血清样本；
步骤2.基因组DNA的抽提方法：
采用硅胶吸附法抽提步骤1中的被测者血清样本中的HBV DNA，抽提时间为2-3小时，采用电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；
步骤3.基因突变检测：将每一个被测者的HBV DNA样本放入1个反应孔，检测HBV P基因区，采用PCR技术进行扩增、凝胶电泳技术检测纯度、测序技术进行基因突变检测：
步骤3-1，反应体系配置：
在每一个反应孔中加入PCR标准反应体系，标准反应体系的正向引物和反向引物浓度皆为10uM，反应体系总体积为20ul，其中，PCR试剂(天根生化KT202-12)5ul，正向引物和反向引物各0.4ul，步骤2得到的20ng/μl的被测者血清样本中的HBV DNA模板3μl，去离子水11.2ul；
检测HBV P基因DNA 301-1200正向引物和反向引物如下：
正向引物：ttcctcttcatcctgctgct
反向引物：gttggcgagaaagtgaaagc
步骤3-2，采用PCR技术进行扩增：
将1个反应孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为95℃预热15分钟；
再进行35个循环的95℃、45秒；60℃、45秒；72℃、60秒；72℃、7分钟后降温至4℃；
步骤3-3，将1个反应孔在PCR扩增仪反应后的产物进行电泳检测，肉眼可见清晰白色条带即可进入下一步；
a.1wt％琼脂糖凝胶插小号孔梳子；
b.2000bp DNA标记物5ul；
c.PCR产物4ul加入电泳缓冲液1ul；
d.电泳电压：120v；
e.电泳时间：20min拍摄一张电泳图，30min拍摄一张电泳图；
7个样本PCR后产物，25ng/ul的电泳结果图，目的条带800bp左右；
如图1所示，为7个样本PCR后产物的电泳结果图。
步骤3-4，纯化：
终浓度：PCR产物纯化试剂0.2U SAP+PCR产物纯化试剂2.5U EXON1/7ul；
在每一个反应孔中加入反应体系，反应体系总体积为7ul、去离子水ddH2O 3.825ul、PCR产物纯化试剂SAP(promega M8201)0.05ul、PCR产物纯化试剂EXON1(NEBM0293V)0.125ul、步骤3-3得到的PCR产物3ul；反应条件为：37℃、60min；80℃、15min；4℃恒温保存；
步骤3-5，将纯化后的每一个反应孔进行测序，引物浓度为1uM，ABI 3730测序仪：
步骤3-5-1，从-20度冰箱中取出步骤3-4得到的PCR纯化产物、测序试剂BigDye(PEApplied Biosystems 4337574)、四种dNTP、1uM测序引物，测序引物：ttcctcttcatcctgctgct；
步骤3-5-2，记录日期、PCR纯化产物名、测序引物、反应体系、测序试剂用量、PCR 反应条件；
步骤3-5-3，取一块反应板，标上DNA模板名、测序引物名、日期；
步骤3-5-4，每个样本做一个PCR反应，用一个反应孔；
步骤3-5-5，在每一个反应孔中加入反应体系，反应体系为0.5ul的BigDye、1.4ul的dNTP、2ul的测序引物、3ul的PCR纯化产物、0.1ul的去离子水ddH2O；体系分装好后，上离心机，达900转/分即停；
步骤3-5-6，将反应板放在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为预热96℃10秒；再进行25个循环的96℃、10秒；50℃、5秒；60℃、4分钟；60℃、4分钟后降温至4℃恒温保存；
步骤3-5-7，扩增结束后，在每孔加入1ul 125mM 乙二胺四乙酸；
步骤3-5-8，再在每孔加入无水乙醇15ul于室温进行沉淀，不得超过24小时；
步骤3-5-9，将96孔板放入冰冻离心机，3650转/分，4℃离心30分钟；
步骤3-5-10，倒去上清液，将96孔板离心，达800转即停，再在每孔加30ul 70wt％乙醇，3650转/分，4℃离心15分钟，倒去上清液，将96孔板离心，达800转即停，将残余乙醇风干，室温放置20分钟；
步骤3-5-11，每孔加入8ul的95wt％甲酰胺与ddH2O混合物；
步骤3-5-12，在ABI 3730上进行结果读取，用软件Chromas查阅测序检测结果：9个位点各有2种结果，即正常结果和突变结果；图2为rt V173L位点实验正常结果示意图；图3为rt V173L位点实验突变结果示意图；图4为rt L180M位点实验正常结果示意图；图5为rt L180M位点实验突变结果示意图；图6为rt A181T位点实验正常结果示意图；图7为rtA181T位点实验突变结果示意图；图8为rt T184A位点实验正常结果示意图；图9为rt T184A位点实验突变结果示意图；图10为rt S202I位点实验正常结果示意图；图11为rt S202I位点实验突变结果示意图；图12为rt M204V/I位点实验正常结果示意图；图13为rtM204V/I位点实验V突变结果示意图；图14为rtM204V/I位点实验I突变结果示意图；图15为rt V207E/I位点实验正常结果示意图；图16为rt V207E/I位点实验E突变结果示意图；图17为rt V207E/I位点实验I突变结果示意图；图18为rt N236T位点实验正常结果示意图；图19为rt N236T位点实验突变结果示意图；图20为rt M250V位点实验正常结果示意图；图21为rt M250V位点实验突变结果示意图。
如图22所示，为实施例被测者定位在rt M204V/I位点实验突变结果示意图。
步骤4.最后得出检测报告，给出结果分析，
Claims (2)
1.一组用于识别乙型肝炎病毒耐药性的PCR引物，其特征在于，包括：
检测HBV P基因DNA 301-1200正向引物和反向引物如下：
正向引物：ttcctcttcatcctgctgct；
反向引物：gttggcgagaaagtgaaagc。
2.如权利要求1所述的一组用于识别乙型肝炎病毒耐药性的PCR引物，其特征在于，还包括测序引物：ttcctcttcatcctgctgct。
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