CN102108392A - 乙肝病毒核苷类似物耐药变异遗传检测 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测个体乙肝病毒核苷类似物耐药变异遗传的试剂盒。该试剂盒包括检测拉米夫定和替比夫定耐药变异位点RT基因YMDD位点、阿德福韦酯耐药变异位点P基因rtN236T位点、恩替卡韦耐药变异位点rtM204V、rtL180M、rtT184、rtS202和rtM250位点多态性的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR常规组件等。本发明的试剂盒通过检测核苷类似物药物用药靶向位点基因多态性来评估个体乙肝病毒核苷类似物耐药性。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测个体乙肝病毒核苷类似物耐药变异遗传的试剂盒，通过检测核苷类似物药物用药靶向位点基因多态性来评估个体乙肝病毒核苷类似物耐药性。
背景技术
病毒性肝炎是由多种肝炎病毒引起的，以肝脏损害为主的一组全身性疾病。按病原学分类目前有甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎和戊型肝炎。病毒性肝炎的病原体是肝炎病毒，目前已证实甲、乙、丙、丁、戊五型肝炎病毒是病毒性肝炎的致病因子。我国是乙型肝炎的高发区，全球慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者多达3.6亿，我国占1.2亿，其中有3000万是慢性乙型肝炎患者。
乙肝病毒HBV每24h可复制1012-1013拷贝。HBV虽然属于DNA病毒，但其复制过程并非DNA-DNA的直接复制过程，而是经过前基因组RNA的中间过程，即DNA-RNA-DNA的复制过程。在前基因组RNA逆转录为负链DNA的过程中，HBV逆转录酶由于缺乏严格的校正机制，导致HBV复制过程中核苷酸错配率较高，介于其他DNA病毒和RNA病毒之间，大约为1/105。HBV复制的这种拖成和特点，决定了同一患者体内不同的HBV株基因序列之间也存在差别，因此，每一个患者体内的病毒都是由存在基因序列差异的病毒株组成的动态变化的病毒群，即HBV以准种(quasispecies)的形式存在。HBV病毒有些位点的变异，可能是致死性的，发生这种变异的HBV不能存活。有些位点的变异对其复制能力没有显著影响，但很多位点变异导致子代病毒复制能力降低或增强。不同基因序列的病毒株在病毒群中所占的相对比例，一方面取决于病毒株自身的复制能力，另一方面也受到机体免疫系统或药物的选择压力的影响。
乙肝病毒核苷类似物主要有拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦和替比夫定。核苷(酸)类似物的作用机制：核苷(酸)类似物进入机体后形成三磷酸活性成分，与机体天然的脱氧三磷酸核苷(dNTP)竞争性结合到HBV聚合酶上。但由于三磷酸化的核苷(酸)类似物不具备天然的dNTP的结构，而使HBV的DNA链合成终止，这是核苷(酸)类似物抑制HBV复制的机制。但如果患者体内的HBV序列发生变异，导致产生的HBV聚合酶与核苷(酸)类似物结合力降低，那么变异的HBV即不受核苷(酸)类似物的抑制或抑制能力下降，因此在继续应用核苷类似物治疗的情况下，野生株病毒因对核苷(酸)类似物敏感而继续被抑制，变异株病毒因具备一定的复制能力，而且对核苷(酸)类似物不敏感而逐渐替代野生株，成为体内HBV的优势株，从而导致患者对于核苷(酸)类似物的耐药。
拉米夫定是一种胞嘧啶核苷衍生物(3’硫胞嘧啶核苷左旋异构体)，是一种口服的2’3’双脱氧核苷酸。它能抑制乙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒的逆转录酶的活性，又不损伤细胞线粒体，实验研究和临床试验都证明拉米夫定一可迅速降低HBV DNA的浓度，改善肝脏组织的病变。长期应用拉米夫定可诱导HBV变异，产生耐药性，使血清中已经阴转的HBV DNA重新出现，甚至伴有病情复发。耐药的发生率平均为24％。拉米夫定治疗相关的变异多发生于HBV DNA聚合酶的活性区域，即YMDD位点附近，并可涉及附近区域。
阿德福韦酯是阿德福韦的亲脂性口服前体，其肠道吸收率和生物利用度都较高，口服后在非特异性酯酶水解作用下迅速转化为阿德福韦。阿德福韦是一种无环单磷酸脱氧腺苷类似物，在体内进一步转化为有活性的双磷酸阿德福韦而起抗病毒作用。实验研究和临床试验都证明阿德福韦酯可迅速降低HBVDNA的浓度，减轻肝脏组织的病变。目前已知的阿德福韦酯耐药主要原因为rtN236T位点变异。rtN236T变异则是由P基因第836位碱基A到C点突变引起，即发生了碱基间氢键的变化。
恩替卡韦为鸟嘌呤核苷类似物，对乙肝病毒(HBV)多聚酶具有抑制作用。它能够通过磷酸化成为具有活性的三磷酸盐，三磷酸盐在细胞内的半衰期为15小时。适用于病毒复制活跃，血清转氨酶ALT持续升高或肝脏组织学显示有活动性病变的慢性成人乙型肝炎的治疗。恩替卡韦耐药相关变异是在rtM204V+rtL180M变异基础上，再联合rtT184、rtS202或rtM250三个位点中至少一个位点的氨基酸替代变异。
替比夫定，其化学名为：1-((2S，4R，5S)-4-羟基-5-羟甲基四氢呋喃2-yl)-5-甲基-1H-嘧啶-2，4-二酮；为天然胸腺嘧啶脱氧核苷的自然L-对映体，是人工合成的胸腺嘧啶脱氧核苷类抗乙肝病毒HBV药物，对HBV复制有强大的抑制作用，优于拉米夫定，且耐药基因突变率低于拉米夫定。对人类DNA聚合酶无影响，对哺乳动物无细胞毒反应，故耐受良好。替比夫定与拉米夫定同属于L-核苷(酸)类似物，因此与拉米夫定具有几乎相同的耐药性位点，即YMDD位点突变为YIDD。
发明内容
本发明提供一种检测个体乙肝病毒核苷类似物耐药变异遗传靶向位点基因多态性的试剂盒。
该试剂盒包括：检测拉米夫定和替比夫定耐药变异位点RT基因YMDD位点多态性的特异性引物对及特异性荧光探针对，检测阿德福韦酯耐药变异位点P基因rtN236T位点多态性的特异性引物对及特异性荧光探针对，检测恩替卡韦耐药变异位点rtM204V、rtL180M、rtT184、rtS202和rtM250位点多态性的特异性引物对及特异性荧光探针对，Taq酶，dNTP混合液，MgCl2溶液，反应缓冲液，去离子水。
本试剂盒中所述的特异性引物和荧光探针对于本领域的普通技术人员来说是能够轻易完成设计的，特异性引物和荧光探针对可用常规的DNA合成技术进行合成。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例 检测试剂盒的使用
步骤1：DNA模板的抽取
用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。
步骤2：荧光定量PCR反应
使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，进行荧光定量PCR反应，反应的体系为总体积10μl，包含浓度为20ng/μl的DNA模板2μl、1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液、0.1μl 25mM dNTP混合液、0.6μl 25mMMgCl2溶液、0.025μl(5units/μl)Taq DNA聚合酶、20μM的有义引物和反义引物各0.225μl、10μM的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0.25μl，去离子水5.325μl。
在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50℃、2分钟，95℃、10分钟，进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。
步骤4：基因型分析
根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。
熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根据不同序列探针荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。
Claims (1)
1.一种检测个体乙肝病毒核苷类似物耐药变异遗传的试剂盒，其特征在于：包括检测RT基因YMDD位点、P基因rtN236T位点、rtM204V、rtL180M、rtT184、rtS202和rtM250位点多态性的特异性引物对及特异性荧光探针对，Taq酶，dNTP混合液，MgCl2溶液，荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水。
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|---|---|---|---|---|
| CN102286643A (zh) * | 2011-08-26 | 2011-12-21 | 李艳 | 一种检测乙型肝炎病毒耐药突变的试剂盒 |
| CN101654714B (zh) * | 2009-08-10 | 2012-06-20 | 上海中优医药高科技有限公司 | 一组用于识别乙型肝炎病毒耐药性的pcr引物 |
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2009
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Non-Patent Citations (3)
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