CN112746095B - 一种用于检测hla-b*58:01基因的试剂盒及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测HLA‑B*58:01基因的试剂盒及其方法,涉及基因检测技术领域,该试剂盒包括核酸组合1;所述核酸组合1包括核苷酸序列如SEQ ID No.1~2所示的第一引物对。该引物对是针对HLA‑B*58:01基因的特异性位点、区域进行设计的,单个反应即可完成HLA‑B*58:01基因的有效检测,且检测的准确性高,大幅度降低了假阴性和假阳性结果的出现。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域,具体而言,涉及一种用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒及其方法。
背景技术
主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex,MHC)是一组编码动物主要组织相容性抗原的基因群的统称,人类的MHC被称为人类白细胞抗原(HumanLeukocyte Antigen,HLA)。HLA基因定位于人类第6号染色体短臂上,由一群密切连锁的复等位基因组成,包含约360万个碱基对,长约4MB,是当前已知的人类染色体中基因密度最高、多态性最为丰富的区域。HLA是细胞表面分子,主要参与T细胞活化的已加工过的抗原肽的呈递并在其中起重要作用,构成机体最重要的免疫系统之一。
HLA包含HLA-I、HLA-II和HLA-III,也称作MHC-I、MHC-II和MHC-III。HLA-I主要包括HLA-A、HLA-B、HLA-C,位于HLA复合体远离着丝粒的一端;HLA-II主要包括HLA-DR、HLA-DQ及HLA-DP,位于HLA复合体近着丝粒的一端;III类基因区位于二者之间。世界卫生组织HLA因子命名委员会命名的相关HLA等位基因已达到28000多个(2020.12),在HLA-I和HLA-II等位基因家族中HLA-B的多态性最显著。HLA基因复合体不仅是多基因的而且是多等位基因的,HLA基因的多态性决定了在个体间可以产生高度多样化的HLA蛋白,也决定了不同个体处理和呈递同一种抗原的能力不同,从遗传水平上调控免疫应答功能,从而使不同个体对同一种抗原的免疫应答可表现出个体差异。这种个体差异或产生保护性免疫,或形成免疫耐受,或出现自身免疫倾向,或表现为HLA相关疾病。
药物不良反应(Adverse Drug Reaction,ADR)己经成为许多国家重要的致病甚至致死原因,皮肤不良反应是药物不良反应中的重要一部分,约占药物不良反应的三分之一。皮肤不良反应在临床上最常见的主要包括轻度的斑丘疹(MPE)、Stevens-Johnson综合征(SJS)、中毒性表皮坏死松懈症(TEN)。其中SJS和TEN是严重的皮肤和黏膜反应,可导致永久性残疾甚至致命,SJS致死率约为5%,TEN致死率则高达25~50%。皮肤不良反应大部分患者主要和以下这些药物相关:别嘌呤醇(Allopurinol)、卡马西平(Carbamazepine)、奥卡西平(Oxcarbazepine)、苯妥英(Phenytoin)、拉莫三嗪(Lamotrigine)、苯巴比妥(Phenobarbital)以及磺胺类抗菌素等。
研究表明,中国大陆高尿酸血症的患病率13.3%,患病人数已经超过1.2亿;中国大陆痛风的患病率为1.1%,患病人数已经超过1700万。别嘌呤醇(Allopurinol)为次黄嘌呤的异构体,是黄嘌呤氧化酶的抑制剂,主要用于阻止次黄嘌呤和黄嘌呤代谢为尿酸,从而减少尿酸的生成,是高尿酸血症和痛风患者降尿酸治疗的一线用药。
别嘌呤醇疗效显著、价格低廉,但在中国人群中使用时易发生别嘌醇超敏反应,研究表明中国台湾地区超敏反应发生率为2.7%,别嘌醇超敏反应一旦发生,致死率高达30%。研究表明,别嘌呤醇不良反应的发生与HLA-B*58:01存在明显相关性,而汉族人群携带HLA-B*58:01基因型的频率为10%~20%。HLA-B*58:01等位基因与别嘌呤醇引发的SJS或TEN的强相关性在中国(包括台湾和香港地区)、泰国、新加坡、韩国等国家地区的多个研究小组的汉族人群中得到证实。几乎所有副反应的患者都是HLA-B*58:01的携带者,而别嘌呤醇耐受者中只有15%左右的HLA-B*58:01携带者。国内外相关指南均指出,亚裔人群在使用别嘌呤醇之前应进行HLA-B*58:01基因检测,对于HLA-B*58:01阳性患者,均不推荐使用别嘌呤醇。
目前,HLA等位基因分型的常用方法主要包括:
基于测序分型的聚合酶链式反应法(PCR-SBT),PCR-SBT直接测序法是公认的HLA基因分型方法的"金标准",其通过一对扩增引物、多个测序引物和组特异性测序引物进行DNA序列分析,使用特定软件分析确定基因型别。其主要应用于HLA基因分型,具有特异性强、灵敏度高等优点。但PCR-SBT存在着操作繁琐、耗时长,测序结果会出现套峰,会出现模棱两可的结果,不利于结果的判读;
序列特异性寡核苷酸探针法(PCR-SSOP),PCR-SSOP技术先通过对HLA等位基因的多态区域进行扩增,并对产物进行标记,然后针对扩增产物设计不同的寡核苷酸探针固定在膜上,将产物与膜上的特异性探针杂交并显色,根据信号判断实验结果。该技术特异性较强、灵敏度较高,需要的样本量少。由于其所用的载体大多为膜或微滴定板,且需大量探针及单独的杂交反应,因此流程繁琐,难以标准化和自动化。
序列特异性引物PCR技术(PCR-SSP),PCR-SSP技术是根据HLA等位基因特异性序列设计引物,直接扩增基因组DNA,通过凝胶电泳检测扩增产物,根据产物的有无和DNA片段大小来判断HLA基因型。该技术条件容易掌握、操作简便,需要的样本量少、对血液条件要求不高,适用于临床对于已知HLA序列的快速检测应用等优势;但由于PCR-SSP技术需使用凝胶电泳实验,因此该技术在操作中易造成二次污染、时间长,同时在PCR过程中多对引物易造成二聚体等非目的基因产物,从而易造成假阳性结果等。
环介导等位基因扩增反应(LAMP),LAMP在等温条件下高度特异、高效且快速地扩增DNA。在目的DNA序列上,这种方法主要采用一种具有链置换性质的DNA聚合酶和4条特异性引物来识别DNA靶序列上的6个特异区域,从而进行循环扩增。靶序列的扩增反应需要在等温条件下进行大约1小时,可实现指数倍数的扩增。LAMP灵敏度高,临床使用时不需特殊仪器,操作简单,在63℃-65℃之间的恒温条件下即可完成DNA序列的扩增。但LAMP技术在操作时不能避免二次开盖,容易形成气溶胶造成污染,并且假阳性问题比较严重。
实时荧光定量PCR(RT-PCR),RT-PCR是在PCR过程中加入了荧光基团或者荧光染料指示剂,对PCR产物进行标记跟踪,利用信号积累实时监测PCR反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析和计算。RT-PCR在反应的对数期检测,分析起始点产物的量、实时监测荧光信号、动力学范围广、有效鉴别非特异性扩增和突变、可以相对定量和绝对定量。因此,该技术灵敏度高、特异性强、能进行多重反应、自动化程度高、污染性小、具有实时性和准确性。
目前,国内HLA-B*58:01等位基因的检测技术以PCR-SSP和RT-PCR这两种方法为主,检测目标分为检测HLA-B*58:01的关联位点和直接检测HLA-B*58:01基因两种。由于HLA-B等位基因数量庞大、结构复杂,目前可查的HLA-B*58:01基因检测专利及相关试剂盒多采用检测HLA-B*58:01等位基因连锁SNP位点的方法(CN109251973A、CN106701934B、CN110923314A、CN108977524A、CN105296616A、CN105296650B、CN106929591A),然而实现SNP连锁分析法检测,首先满足的条件是SNP与HLA等位基因必须完全连锁。之前有报道认为在日本人群中SNP位点rs9263726与HLA-B*58:01存在完全连锁关系,然而这种连锁存在着种群差异,研究表明,在中国人群中rs9263726与HLA-B*58:01并非完全连锁的,因此基于SNP连锁分析法开发的HLA分型检测试剂在中国人群中使用时,易出现假阴性和假阳性结果,故不适合中国人群使用。直接进行HLA-B*58:01基因检测的方法相较于SNP连锁位点的更加准确、可靠。
目前可查的直接检测HLA-B*58:01基因的专利多使用PCR-SSP法(CN103805701A、CN103484533A、CN104017898)或多探针Taqman法(CN105950766B、CN109517891A、CN108624676A),但基于这些方法开发的试剂成本高,操作复杂,且检测的模板只能是纯化后的核酸,必须核酸纯化的步骤,整个检测流程一般在3个小时以上,在临床推广上不太理想。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒及其方法。
本发明是这样实现的:
第一方面,本发明实施例提供了一种用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒,其包括核酸组合1;
所述核酸组合1包括核苷酸序列如SEQ ID No.1~2所示的第一引物对。
第二方面,本发明实施例提供了一种用于检测HLA-B*58:01基因的方法,所述方法包括采用如前述实施例所述的用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒对待测样本进行qPCR检测;
所述方法不以疾病的诊断或检测为直接目的。
本发明具有以下有益效果:
本发明提供了一种用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒及其方法,该试剂盒包括核酸组合1;所述核酸组合1包括核苷酸序列如SEQ ID No.1~2所示的第一引物对。该引物对是针对HLA-B*58:01基因的特异性位点、区域进行设计的,单个反应即可完成HLA-B*58:01基因的有效检测,且检测的准确性高,大幅度降低了假阴性和假阳性结果的出现。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1提供的HLA-B*58:01特异性区域;
图2为本发明实施例1提供的用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒对于空白对照的检测结果图;
图3为本发明实施例1提供的用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒对于阳性对照的检测结果图;
图4为本发明实施例1提供的用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒对于阴性样本的检测结果图;
图5为本发明实施例1提供的用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒对于阳性样本的检测结果图;
图6为本发明实施例1提供的用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒对于空白对照的检测结果图;
图7为本发明实施例1提供的用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒对于阳性对照的检测结果图;
图8为本发明实施例1提供的用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒对于阴性样本的检测结果图;
图9为本发明实施例1提供的用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒对于阳性样本的检测结果图;
其中,图2-图5为天隆Gentier 48E仪器检测结果;图6-图9为ABI Viia 7仪器检测结果;
图10为本发明验证例1中样本S002 PCR-SBT分型结果(B*15:18,B*58:01);
图11为本发明验证例1中试剂盒对HLA-B*58:01阳性样本FAM通道的检测结果图;
图12为本发明验证例1中试剂盒对HLA-B*58:01阳性样本VIC-HEX通道的检测结果图;
图13为本发明验证例1中试剂盒对HLA-B*58:01阴性样本的检测结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
首先,本发明实施例提供了一种用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒,其包括核酸组合1;所述核酸组合1包括核苷酸序列如SEQ ID No.1~2所示的第一引物对。
发明人经一系列创造性劳动,分析研究HLA-B*58:01基因的特点,设计了上述核酸组合1,其通过单个反应即可完成HLA-B*58:01基因的检测,降低了检测成本,方便操作,且检测的有效性高,特异性好。
本文中的“HLA-B*58:01”中的58是等位基因组别的代码,01是特异等位基因的代码。
本文中的“核苷酸序列如SEQ ID No.1~2所示的第一引物对”是指:第一引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,第一引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQID No.2所示;后续的第二引物对依次类推。
优选地,所述核酸组合1还包括核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的第一探针。
优选地,所述试剂盒还包括用于检测内参基因的核酸组合2。核酸组合2用于检测内参基因,内参基因在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测基因的表达水平变化时常用于作为参照物,以保证实验结果的准确性。在一些实施例中,对内参基因不作具体限制,只要能够满足内参基因的功能即可。
优选地,所述内参基因为GAPDH,所述核酸组合2包括核苷酸序列如SEQ ID No.4~5所示的第二引物对。
优选地,所述核酸组合2还包括核苷酸序列如SEQ ID No.6所示探针2。
优选地,所述试剂盒还包括PCR反应液。本文中的“PCR反应液”是指用于PCR扩增时所需要的试剂或试剂的组合。
优选地,所述试剂盒还包括预处理试剂A和预处理试剂B;
所述预处理试剂A包括:蔗糖、Tris-HCl、MgCl2、Triton-X-100和水;
所述预处理试剂B包括:NaCl、Tris-HCL、NaOH、EDTA、SDS和水。
预处理试剂A和预处理试剂B的作用在于,在对待测样本进行qPCR之前,对全血样本进行预处理,以使预处理后的待测样本可以省略核酸提取步骤的基础上,直接进行qPCR扩增,有效加快实验的进程。
此外,本发明实施例还提供了一种用于检测HLA-B*58:01基因的方法,所述方法包括采用如前述任意实施例所述的用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒对待测样本进行qPCR检测;
所述方法不以疾病的诊断或检测为直接目的。
针对现有HLA等位基因分型检测中存在的问题,本申请的发明人基于国际免疫遗传学数据库(The International ImMunoGeneTics Information System,IMGT)中最新的HLA基因序列信息,考虑不同引物探针设计的位置、序列特异性、涵盖的等位基因数量等因素,进行特异性引物和探针设计;结合本发明实施例提供的试剂盒以及方法,最快可在1小时内获得HLA-B*58:01基因的检测结果。
优选地,所述待测样本为血液样本。
本文中的“血液样本”同全血样本,全血样本可来源于哺乳动物或非哺乳动物。
优选地,在进行所述qPCR之前,所述方法包括:将所述血液样本与预处理试剂A混合,对混合产物进行离心,将去除上清液后的离心产物与预处理试剂B混合;
所述预处理试剂A包括:蔗糖、Tris-HCl、MgCl2、Triton-X-100和水;
所述预处理试剂B包括:NaCl、Tris-HCL、NaOH、EDTA、SDS和水。
在对血液样本进行PCR检测之前,需要进行核酸提取,而常规的核酸提取流程通常需要耗时60~90min。发明人经一系列研究,提供一种对血液样本的处理方法,经预处理后,血液样本能够在省略核酸提取步骤的情况下,直接进行PCR扩增,预处理的过程简单快速,仅需要5min即可完成,在不影响PCR扩增和检测的基础上,显著加快了血液样本的检测流程,降低了检测成本,适于广泛的临床检测应用。
优选地,在所述血液样本与所述预处理试剂A混合后的溶液中,所述蔗糖的终浓度为200~400mM,所述Tris-HCl的终浓度为1~20mM,所述MgCl2的终浓度为1~10mM,所述Triton-X-100的终浓度为1%~5%。
在一些实施例中,所述蔗糖的终浓度可以为200mM、220mM、240mM、260mM、280mM、300mM、320mM、340mM、360mM、380mM或400mM;所述Tris-HCl的终浓度为1mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、12mM、14mM、16mM、18mM或20mM;所述MgCl2的终浓度可以为1mM、2mM、4mM、6mM、8mM或10mM;所述Triton-X-100的终浓度为1%、2%、3%、4%或5%。
离心产物与预处理试剂B混合的溶液中,所述NaCl的终浓度为80~120mM,所述Tris-HCL的终浓度为30~70mM,所述NaOH的终浓度为30~70mM,所述EDTA的终浓度为0.1~10mM,所述SDS的终浓度为0.001%~0.05%。
在一些实施例中,所述NaCl的终浓度可以为80mM、90mM、100mM 110mM或120mM;所述Tris-HCL的终浓度可以为30mM、40mM、50mM、60mM或70mM;所述NaOH的终浓度为30mM、40mM、50mM、60mM或70mM;所述EDTA的终浓度可以为0.1mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM;所述SDS的终浓度为0.001%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%或0.05%。
优选地,所述离心的转速为8000~12000rpm,时间为0.5~3min。在一些实施例中,离心的转速可以为8000rpm、9000rpm、10000rpm、11000rpm或12000rpm;离心的时间可以为0.5min、1min、2min或3min。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本发明提供了一种用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒,其包括核酸组合1、核酸组合2、PCR反应液、预处理试剂A和预处理试剂B。
1、核酸组合1和核酸组合2的配制。
具体请参照表1。
表1引物和探针
备注:F为上游引物,R为下游引物,P为探针;
HLA-B5801-P的3’端连接有FAM荧光基团,5’端连接有BHQ1荧光淬灭基团;
GAPDH-P的3’端连接有HEX荧光基团,5’端连接有BHQ1荧光淬灭基团。
具体地,通过对IPD-IMGT/HLA数据库中HLA-B位点7560个等位基因的序列比对,进行HLA-B*58:01特异位点的分析,并根据特异区域的序列特征设计用于RT-PCR检测的ARMS引物及TaqMan探针。共得到2个HLA-B*58:01特异性区域及1个保守区,均位于HLA-B等位基因的第2号外显子(见图1)。
核酸组合1是根据2个特异区域设计的,上游引物HLA-B5801-F位于HLA-B基因c.190~c.209处,核心位点为c.206C和c.209A,并在引物3’端倒数第3位引入错配碱基a,增加扩增特异性;下游引物HLA-B5801-R位于HLA-B基因c.256~c.277处,核心位点为c.256G和c.259G,并在引物3’端倒数第3位引入错配碱基t,增加扩增特异性;检测探针HLA-B5801-P基于保守区设计,位于HLA-B基因c.223~c.245处。
核酸组合2是用于检测内参基因GAPDH的引物对及探针。
2、预处理试剂A和预处理试剂B。
参照表2,以配制500mL全血样本的预处理试剂A为例:在1个1000mL的灭菌试剂瓶中依次加入蔗糖54.786g、1M Tris-HCl(pH8.0)溶液5mL、1M MgCl2溶液2.5mL、Triton-X-100 5mL,加入400mL灭菌超纯水溶解试剂,然后使用灭菌超纯水定容至500mL,轻轻颠倒混匀后室温保存备用。
表2全血样本快速处理试剂-组分A
组分 | 终浓度 | 用量/500mL |
蔗糖 | 320mM | 54.786g |
Tris-HCl(1M,PH8.0) | 10mM | 5mL |
MgCl<sub>2</sub>(1M) | 5mM | 2.5mL |
Triton-X-100 | 1% | 5mL |
灭菌超纯水 | / | 400mL |
定容至 | 500mL |
参照表3,以配制10mL全血样本的预处理试剂B为例:在1个15mL的无菌离心管中依次加入1M NaCl溶液1000μL、1M Tris-HCl(pH8.0)溶液500μL、1M NaOH溶液500μL、0.5MEDTA(pH8.0)溶液20μL、10%SDS溶液10μL,然后加入7970μL灭菌超纯水,轻轻颠倒混匀后室温保存备用。
表3全血样本快速处理试剂-组分B
组分 | 终浓度 | 体积/10mL |
NaCl(1M) | 100mM | 1000μL |
Tris-HCl(PH8.0,1M) | 50mM | 500μL |
NaOH(1M) | 50mM | 500μL |
EDTA(pH8.0,0.5M) | 1mM | 20μL |
10%SDS | 0.01% | 10μL |
灭菌超纯水 | / | 7970μL |
3、qPCR反应液。
参照表4,以配制1mL 2×qPCR Mix混合液(PCR反应液)为例:在1个1.5mL的无菌离心管中依次加入10×PCR缓冲液200μL、1M海藻糖溶液400μL、DMSO溶液60μL、10mg/mL BSA溶液20μL、25mM dNTP溶液16μL、5μM ROX溶液16μL、100mM MgCl2溶液34μL、5U/μL热启动Taq酶80μL,然后加入174μL灭菌超纯水,颠倒混匀,长期储存于-20℃,短期保存可保存于4℃。
表4 2×qPCR Mix混合液
4、试剂盒的制备。
(1)配制HLA-B*58:01qPCR反应的试剂:可按照表5要求的体积依次将2×qPCRMix、HLA-B5801-F、HLA-B5801-R、HLA-B5801-P、GAPDH-F、GAPDH-R、GAPDH-P和灭菌ddH2O加入到8联排荧光PCR反应管中;也可根据试剂需求量,按照表5要求的体积等比例放大后配制HLA-B*58:01qPCR反应的试剂,然后按照18μL/反应管将试剂分装于8联排荧光PCR反应管中。分装有HLA-B*58:01qPCR反应试剂的8联管,于-20℃避光保存。
表5 HLA-B*58:01qPCR反应试剂
组分 | qPCR反应终浓度 | 体积 |
2×qPCR Mix | 1× | 10μL |
HLA-B5801-F(10μM) | 0.75μM | 1.5μL |
HLA-B5801-R(10μM) | 0.75μM | 1.5μL |
HLA-B5801-P(10μM) | 0.25μM | 0.5μL |
GAPDH-F(10μM) | 0.30μM | 0.6μL |
GAPDH-R(10μM) | 0.30μM | 0.6μL |
GAPDH-P(10μM) | 0.075μM | 0.15μL |
灭菌ddH<sub>2</sub>O | / | 3.15μL |
总体积 | / | 18μL |
(2)HLA-B*58:01基因快速检测试剂盒组装:试剂盒规格为24人份/盒,试剂盒试剂组分包括:
预处理试剂A体积30mL,装于30mL无菌试剂瓶中,室温保存;
预处理试剂B体积3mL,装于5mL无菌离心管中,室温保存;
HLA-B*58:01qPCR反应试剂24人份,共包括3条8联排荧光PCR反应管,-20℃避光保存;
阳性对照品为5ng/μL的HLA-B*58:01阳性DNA,体积20μL,装于0.6mL无菌离心管中,-20℃保存;
空白对照品为灭菌超纯水,体积60μL,装于0.6mL无菌离心管中,-20℃保存。
5、样本检测。
(1)样本预处理:取100μL全血样本,置于1.5mL离心管中,加入1mL预处理试剂A,轻柔颠倒混匀10~15次;10000rpm离心1min,弃去上清液;加入100μL预处理试剂B,涡旋混匀30秒,瞬时离心后备用。处理好的样本,可以4℃短期保存,长期保存置于-20℃。
(2)加样:根据需要检测的样本数量n计算所需8联管孔数(n+2),从冰箱中取出所需8联管,置于96孔管架上,8联管的管盖尾端朝向左上方;按照2μL/反应孔,将处理好的样本、阳性对照品、空白对照平依次加入到对应的孔位;加样完毕后,盖紧8联管盖,涡旋3秒或用手指轻弹两下8联管底部进行混匀,瞬时离心备用。
(3)上机:取出加样后的八联管,放置在仪器样品槽相应位置,并记录放置顺序。按照表6设置仪器扩增相关参数,并开始进行PCR扩增。对ABI7500及ABI ViiA7,荧光通道选择FAM和VIC,天隆Gentier 48E机型荧光通道选择FAM和HEX。反应结束后,根据扩增曲线划定合适基线和荧光阈值,参考荧光定量PCR仪相应机型的用户指南,读取Ct(FAM)及Ct(HEX/VIC),进行基因型判读。
表6仪器核酸扩增参数
(4)结果分析:
①空白对照检测结果:本试剂盒中空白对照为无菌超纯水,FAM及VIC/HEX通道应无扩增信号或Ct值>33(图2和图6);
②阳性对照检测结果:FAM及HEX(VIC)通道Ct值≤33,扩增曲线有明显指数增长期(图3和图7);
③样品检测结果判读:当空白对照和阳性对照结果均合格,且检测样本Ct(HEX/VIC)≤33时,通过Ct(FAM)值对HLA-B*58:01检测结果进行判读,当Ct(FAM)≤33时,样本为HLA-B*58:01阳性(图5和图9),当Ct(FAM)>33时,样本为HLA-B*58:01阴性(图4和图8)。
验证例1
1、准确性验证
对比实验使用“金标准”的PCR-SBT直接测序法进行。108例全血样本采用常州金麦格生物技术有限公司生产的核酸提取试剂盒进行全基因组DNA提取,基因组DNA浓度应≥30ng/μL,纯度OD260/280应为1.7~2.0。检测合格的基因组DNA样本用于后续PCR-SBT扩增测序。
依据IPD-IMGT/HLA数据库中HLA-B位点等位基因的序列信息,设计2条PCR扩增引物及8测序引物用于HLA-B基因Exon 1~Exon 7的扩增和测序(见表7)。
表7 HLA-B基因分型检测扩增引物及测序引物
PCR扩增上游引物HLA-B-F,位于HLA-B基因的5’端非编码区;下游引物HLA-B-R位于HLA-B基因Intron 7区;扩增产物长度~2757bp,PCR扩增程序为:95℃预变性5min;95℃变性20sec,63℃退火30sec,72℃延伸3min,共进行35个循环;72℃终延伸7min。
PCR扩增产物直接送上海生工进行Sanger测序,测序引物为HLA-B-Ex2F、HLA-B-Ex2R、HLA-B-Ex3F、HLA-B-Ex3R、HLA-B-Ex4F、HLA-B-Ex4R、HLA-B-Ex5F、HLA-B-Ex5R。测序结果使用HLA分型软件进行判读。
使用PCR-SBT技术对108例血液样本进行HLA-B基因分型检测,分型结果见表8。
表8 108例临床血液样本HLA-B*58:01基因检测结果
由结果可知,其中12例样本携带HLA-B*58:01基因,96样本例不携带HLA-B*58:01基因,即HLA-B*58:01阳性样本12例、阴性样本96例,阳性样本S002 PCR-SBT分型结果见图10。
108例全血样本使用本发明实施例1提供的用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒进行全血样本快速处理及荧光定量检测,统计样本Ct(FAM)和Ct(HEX)值,依据试剂盒结果判读标准对检测结果进行判读;检测结果与PCR-SBT结果一致的判定统计为真阳/阴性,不一致的统计为假阳/阴性,并计算阴性符合率、阳性符合率及总符合率。
使用本发明用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒,空白对照、阳性对照及样本Ct(VIC/HEX)均合格,108例样本检测结果均有效。共检出HLA-B*58:01阳性样本12例,HLA-B*58:01阴性样本96例,检测结果与预期结果完全一致,阴性符合率、阳性符合率及总符合率均为100%(表9)。
本发明HLA-B*58:01基因检测试剂盒进行单样本检测理论耗时~1小时,使用PCR-SBT法进行单样本检测理论耗时>8小时。实际应用中,使用本发明试剂盒检测同时对108例全血样本进行HLA-B*58:01基因检测,总耗时~4.5小时,单样本平均耗时~2.5分钟;而使用PCR-SBT法对108例全血样本进行检测,总耗时>16小时,单样本检测平均耗时>8.9分钟;因此,本发明的HLA-B*58:01基因检测试剂盒,与PCR-SBT方法相比,在进行全血样本的HLA-B*58:01基因检测时,在检测总耗时及单样本耗时方面具有明显的优势。
表9本发明试剂盒与PCR-SBT法HLA-B*58:01检测结果比对
2、灵敏度验证
选取1例HLA-B*58:01阳性样本及1例HLA-B*58:01阴性样本,采用常州金麦格生物技术有限公司生产的核酸提取试剂盒进行全基因组DNA提取,基因组DNA浓度应≥50ng/μL,纯度OD260/280应为1.7~2.0。
定量后的DNA样本,依次稀释至40ng/μL、20ng/μL、10ng/μL、5ng/μL、2.5ng/μL、1.25ng/μL,稀释后的样本作为模板,使用本发明的HLA-B*58:01基因检测试剂盒进行检测,计算试剂盒灵敏度。
灵敏度验证结果表明,使用本发明HLA-B*58:01基因检测试剂盒进行检测时,40ng/μL、20ng/μL、10ng/μL、5ng/μL、2.5ng/μL、1.25ng/μL的阳性及阴性样本均可准确检出(表10、图11-图13),本发明试剂盒的灵敏度可达到1.25ng/μL。
表10本发明HLA-B*58:01基因检测试剂盒灵敏度验证结果
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 为朔医学数据科技(北京)有限公司
<120> 一种用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒及其方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gccgcgagtc cgaggacaga 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccttcatgtt ccgtgtctct cc 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tggatagagc aggaggggcc gga 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgttccaata tgattccacc cat 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atttccattg atgacaagct tcc 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tccatggcac cgtcaaggct ga 22
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
acgcacccac ccggactca 19
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ccactctaga ccccaagaat ctcacct 27
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggagggaaat ggcctctg 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atggggagtc gtgacctg 18
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ttcagttgag gccaaaatcc 20
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cattttcctc ctcttctcgt gg 22
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tctcaggctg gtcacatgg 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gaaaggaggg gaagatgagg 20
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ctcagggaaa gcaggagcc 19
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
acacttctac ctggggcttg a 21
Claims (8)
1.一种用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒,其特征在于,其包括核酸组合1;
所述核酸组合1由核苷酸序列如SEQ ID No.1~2所示的第一引物对和核苷酸序列如SEQID No.3所示的第一探针组成。
2.根据权利要求1所述的用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括用于检测内参基因的核酸组合2;
所述核酸组合2由核苷酸序列如SEQ ID No.4~5所示的第二引物对和核苷酸序列如SEQID No.6所示探针2组成。
3.根据权利要求1~2任一项所述的用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括PCR反应液。
4.根据权利要求1~2任一项所述的用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括预处理试剂A和预处理试剂B;
所述预处理试剂A包括:蔗糖、Tris-HCl、MgCl2、Triton-X-100和水;
所述预处理试剂B包括:NaCl、Tris-HCL、NaOH、EDTA、SDS和水。
5.一种用于检测HLA-B*58:01基因的方法,其特征在于,所述方法包括采用如权利要求1~4任一项所述的用于检测HLA-B*58:01基因的试剂盒对待测样本进行qPCR检测;
所述方法不以疾病的诊断或检测为直接目的。
6.根据权利要求5所述的用于检测HLA-B*58:01基因的方法,其特征在于,所述待测样本为血液样本。
7.根据权利要求6所述的用于检测HLA-B*58:01基因的方法,其特征在于,在进行所述qPCR之前,所述方法包括:将所述血液样本与预处理试剂A混合,对混合产物进行离心,将去除上清液后的离心产物与预处理试剂B混合;
所述预处理试剂A包括:蔗糖、Tris-HCl、MgCl2、Triton-X-100和水;
所述预处理试剂B包括:NaCl、Tris-HCL、NaOH、EDTA、SDS和水。
8.根据权利要求7所述的用于检测HLA-B*58:01基因的方法,其特征在于,在所述血液样本与所述预处理试剂A混合后的溶液中,所述蔗糖的终浓度为200~400 mM,所述Tris-HCl的终浓度为1~20 mM,所述MgCl2的终浓度为1~10 mM,所述Triton-X-100的终浓度为1%~5%;
离心产物与预处理试剂B混合的溶液中,所述NaCl的终浓度为80~120 mM,所述Tris-HCL的终浓度为30~70 mM,所述NaOH的终浓度为30~70 mM,所述EDTA的终浓度为0.1~10 mM,所述SDS的终浓度为0.001~0.05%;
所述离心的转速为8000~12000 rpm,时间为0.5~3 min。
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