CN109097463B

CN109097463B - 一种用于检测hla-a*24:02等位基因的特异性引物探针组合、试剂盒及检测方法

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Publication number: CN109097463B
Application number: CN201811077394.5A
Authority: CN
Inventors: 王会娟; 张婷婷; 王燕霞; 张利荣; 康星; 陈超
Original assignee: Northwestern University
Current assignee: Northwestern University
Priority date: 2018-09-15
Filing date: 2018-09-15
Publication date: 2021-08-06
Anticipated expiration: 2038-09-15
Also published as: CN109097463A

Abstract

本发明提出一种用于检测HLA‑A*24:02等位基因的特异性引物探针组合、试剂盒及检测方法，具体是在使用TaqMan探针检测法的基础上，设计了两对高特异性扩增HLA‑A*24:02等位基因的引物探针组合：上游引物Fp1：5’‑GGTTCTC ACACCCTCCA GATGATGGT‑3’下游引物Rp1:5’‑CTCCAGGTATCTGCGGAGCACG‑3’探针probe1：5’‑FAM‑CCACTTGCGCTTGGTGATCTGAGCC–BHQ2‑3’上游引物Fp2：5’‑CTCGTCCC CAG GCTCCCTC‑3’下游引物Rp2:5’‑CACCGGCCTCGCTCTGGT‑3’探针probe2:5’‑CY5‑GAAGGCCCACTCACAGACTGACCGAG–BHQ2‑3’FAM为6‑carboxyfluorescein；Cy5为Cyanine5；BHQ2为Black Hole Quencher‑2；将两对特异性引物、探针与内参基因引物、探针加入同一管中进行多重荧光PCR反应，通过荧光扩增曲线分析结果。本发明具有特异性高、灵活快速、高通量、无污染、分辨率高、可实时监测反应进程等特点，可适用于人体外周血、唾液中全基因组DNA样本HLA‑A*24:02的检测。

Description

一种用于检测HLA-A*24:02等位基因的特异性引物探针组合、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于药物基因组学和基因诊断领域，具体涉及一种用于检测HLA-A*24:02等位基因的特异性引物探针组合。

背景技术

卡马西平(CBZ)，拉莫三嗪(LTG)，苯妥英钠(PHT)是临床上常用的一类结构相似的芳香族抗癫痫药物(AEDs)，据统计全世界约有1％的使用人群。AEDs是最常见的易引起药疹反应的药物，CBZ、LTG、PHT所导致的药疹发生率分别为3.7％、4.8％、5.9％。严重药疹反应如Stevens-Johnson综合征(SJS)和中毒性表皮坏死松懈症(TEN)，致死率高达20-50％^[1,2]。近年来研究发现，芳香族抗癫痫药物导致的药疹反应与个体遗传易感性密切相关，其中人类白细胞抗原(HLA)的遗传多态性得到了最广泛的关注^[3]。

在HLA基因家族中，HLA-B*1502是首个被证实的与南方汉族和东南亚人群中CBZ所致SJS/TEN显著相关的分子标志物。诸多研究表明，对于多数亚洲人来说，HLA-B*15:02阳性携带者发生卡马西平所致严重药疹反应的风险是HLA-B*15:02阴性携带者的2000倍之多。因此，国际权威机构建议在用药前对亚裔患者的HLA-B*15:02携带情况进行检测以指导药物的合理使用。然而，临床上陆续报道了一些服用CBZ所致SJS/TEN同时HLA-B*15:02为阴性的患者，在中国南方汉族中，这一比例达到30％，说明HLA-B*15:02分子标志物不足以完全准确的预测患者发生严重药疹的风险。此外，能够预测LTG和PHT所致严重药疹反应的分子标志物尚不清楚。最近的研究发现，HLA-A*24:02与南方汉族人群中AEDs所致SJS/TEN显著相关(p＝1.02×10^-5)。在HLA-B*15:02阴性且发生CBZ所致SJS/TEN的患者中，HLA-A*24:02的发生率显著高于对CBZ耐受的患者，说明HLA-A*24:02可以作为一个独立的预测CBZ所致SJS/TEN的分子标志物.且HLA-A*24:02还与LTG和PHT所致SJS/TEN显著相关。说明HLA-A*24:02可作为中国南方汉族人群一个常见的预测AEDs所致SJS/TEN的风险因子。另外，在韩国人群的研究中也证实了HLA-A*24:02与LTG所致中度皮疹的相关性。因此，对于临床上拟使用AEDs药物治疗的患者，除了对HLA-B*15:02检测外，还应该对HLA-A*24:02的携带状况进行检测，以提高预测的准确性，最大程度的降低不良反应发生的风险。

人类白细胞抗原(HLA)是由人类的主要组织相容性复合体(MHC)基因编码，位于第6号染色体，包括一群密切连锁的复等位基因，是当前已知的人类染色体中基因密度最高，也是多态性最为丰富的区域。目前世界卫生组织HLA因子命名委员会命名的相关HLA等位基因已达到5000多个。此外，不同HLA基因之间的序列存在高度同源性，特定等位基因往往包含多个多态性位点。因此，在进行HLA等位基因分型时，往往需要设计多对扩增引物对一个DNA样品进行多个扩增子的鉴定，从而使得HLA等位基因分型存在一定的难度。

目前基于聚合酶链式反应(PCR)的检测技术，主要包括PCR-SSP(序列特异性引物PCR)、PCR-SSOP(序列特异性寡核苷酸探针)和PCR-SBT(测序分型法)，广泛被用于HLA基因分型检测。然而，这些方法均存在一些缺陷，不能很好满足临床检测的需求。例如，PCR-SSP方法需要通过凝胶电泳对扩增产物进行鉴定，操作繁琐，容易污染，往往会产生假阳性结果；PCR-SSOP技术需要大量的探针以及单独的杂交反应，不具有集成化的优点，洗脱条件比较繁琐，耗时较长，难以标准化和自动化；PCR-SBT虽然是HLA基因分型的金标准技术，但这种方法操作繁琐、周期长、成本高，不利于临床的日常开展。近年来，由于具有快速、简便、灵敏、闭管反应和结果容易读取等优势，实时荧光PCR(Real-time PCR)技术逐渐成为分子生物学实验室常规的基因分型技术。扩增阻滞突变系统(amplification refractorymutation system,ARMS)，又称为等位基因特异性PCR，该方法主要通过等位基因特异性的引物及在引物3’端引入错配碱基通过PCR直接达到特异性区分突变型和野生型基因的目的。将ARMS与基于TaqMan探针的实时荧光PCR相结合，该技术同时兼具了反应的高灵敏度和特异性，同时保留了简便、快速的优势，从而大大提高了基因分型的效率。近两年，已有报道将实时荧光PCR技术应用于HLA-B*15:02等等位基因的分型检测。

然而，由于HLA-A等位基因的亚型仅已知的就有3000多个，并且HLA等位基因序列的具有很强的多样性及很高的同源性，难以简单通过引物设计软件得到针HLA-A*24:02基因的特异性引物和探针组合。建立快速简便可靠的HLA-A*24:02基因检测方法，对于临床指导AEDs药物的使用具有重要意义。

[1]Chave TA,Mortimer NJ,Sladden MJ,Hall AP,Hutchinson PE.Toxicepidermal necrolysis:current evidence,practical management and futuredirections.Br J Dermatol 2005；153:241–253.

[2]Roujeau JC,Stern RS.Severe adverse cutaneous reactions to drugs.NEngl J Med 1994；331:1272–1285.

[3]I.Fricke-Galindo,L.L.A,H.Jung-Cook,M.Lopez-Lopez,Carbamazepineadverse drug reactions,Expert Rev Clin Pharmacol(2018)1-14.

发明内容

本发明研发出一套适宜于荧光PCR反应高特异性扩增HLA-A*24:02等位基因的引物探针组合；在现已有的实时定量PCR检测HLA分型的基础上，提供一种更加简便、快速、高通量、特异性高的可以定性检测HLA-A*24:02等位基因分型的方法，以克服现有技术所存在的缺陷。此检测方法更易于在临床的推广和应用，从而更加有利于HLA-A*24:02基因型指导下的卡马西平安全用药。

在研究本发明时，申请人通过与HLA-A中3000个其它等位基因序列的对比，进行HLA-A*24:02特异性位点和引物设计区域的确定，它们主要位于HLA-A等位基因第2外显子和第3外显子；然后根据特异性位点附近的区域，结合等位基因阻滞突变系统(ARMS)的方法，设计特异性引物以及TaqMan探针。值得注意的是，探针和引物设计的位置能够排除其它HLA-A等位基因的结合、识别，尤其是HLA-A*23:01、HLA-A*24:03、HLA-A*24:07、HLA-A*24:20等位基因。采用TaqMan探针法在荧光定量PCR仪上扩增DNA片段，通过扩增曲线分析结果，来判断未知样本是否携带HLA-A*24:02等位基因。

为实现以上发明目的，本发明的技术方案如下。

本发明提出的用于荧光PCR高特异性扩增HLA-A*24:02等位基因的特异性引物探针组合，包括：

上游引物Fp1：5’-GGTTCTC ACACCCTCCA GATGATGGT-3’

下游引物Rp1:5’-CTCCAGGTATCTGCGGAGCACG-3’

探针probe1：5’-FAM-CCACTTGCGCTTGGTGATCTGAGCC–BHQ2-3’

上游引物Fp2：5’-CTCGTCCC CAG GCTCCCTC-3’

下游引物Rp2:5’-CACCGGCCTCGCTCTGGT-3’

探针probe2:5’-CY5-GAAGGCCCACTCACAGACTGACCGAG–BHQ2-3’

其中，FAM为6-carboxyfluorescein；Cy5为Cyanine5；BHQ2为Black HoleQuencher-2。

相应的，上述特异性引物探针组合可以用于制备针对HLA-A*24:02等位基因的检测试剂盒。

一种检测HLA-A*24:02等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR方法，主要包括以下环节：

(1)针对HLA-A*24:02等位基因设计特异性引物和探针，即上述引物探针组合；并设计内参基因的引物和探针；

(2)获得抽提的待测样本基因组DNA；

(3)在同一个反应体系中，将待测样本基因组DNA与所述引物探针组合以及内参基因的引物和探针按照确定比例混合；

(4)通过Applied Biosystem 7500或者ViiA^TM7 Real-Time PCR System进行实时定量荧光PCR检测，其中分别利用FAM，VIC和CY5通道进行三通道荧光采集；

(5)分析判断待测样本是否携带HLA-A*24:02等位基因。

基于上述方案，本发明还进一步作如下优化设计：

环节(1)中设计内参基因β-actin引物和探针为：

上游引物Actin-F:5’-CAGCAGATGTGGATCAGCAAG-3’

下游引物Actin-R:5’-GCATTTGCGGTGGACGAT-3’

探针probe:5’-VIC-AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC–BHQ2-3’

其中，VIC为4,7,2′-trichloro-7′-phenyl-6-carboxyfluorescein，BHQ2为BlackHole Quencher-2。

使用Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa)进行扩增，所述反应体系以10μL计，则包括：5μL Premix Ex Taq(2×)，HLA-A*24:02第一条特异性上游引物Fp1 400nM，下游引物Rp1400nM，特异性探针probe1 200nM,第二条特异性上游引物Fp2 500nM，下游引物Rp2500nM，特异性探针probe2 200nM,以及ACTB基因特异性上游引物250nM，下游引物250nM，探针100nM；然后加入待测样本基因组DNA约10ng-50ng，补充PCR等级的水至终体积10μL；扩增程序为：95℃预变性30s；95℃5s～10sec，64℃34s～40sec，共计40个循环。

本发明的优点主要有：

1、节省耗材和时间、操作简单、通量高

基于本发明设计的特异性引物探针组合并结合TaqMan探针实时荧光PCR反应特点，可以很大程度上节省实验时间和耗材，检测过程只需要50min～1h，操作也简单易行，整个实验可以在2小时内全部完成。采用本发明方法与HLA等位基因分型“金标准”PCR-SBT测序进行方法学对比，57例样本结果完全吻合；同时，使用本发明方法，可一次同时高通量进行96例或384例样本的检测，因此，可完全使用本发明进行HLA-A*24:02等位基因检测，适用于临床分子诊断。

2、结果可靠、灵敏度高

本发明中，只需10ng～20ng基因组DNA便可进行准确的HLA-A*24:02基因分型检测。其中，最低检测样本量为0.05ng。

3、检测方法灵活、无污染

本发明方法较传统的HLA等位基因分型方法，未涉及多重扩增、重复开盖等二次污染的可能。本发明可直接根据探针的荧光曲线判断扩增产物，不涉及任何对人体有毒害作用的化学试剂，操作简便、耗时短、安全、无污染。

4、成本低、经济适用

由于本发明具有高通量的特点，因此使得本发明中每个反应管的成本低；同时，此技术适用于检测人类全血、组织等全基因组DNA样本，较经济适用。

附图说明

图1为利用FAM通道,CY5通道和VIC通道对1例HLA-A*24:02阳性样本和1例阴性样本进行实时定量扩增的结果。

图2为将20ng HLA-A*24:02阳性样本通过系列稀释后在FAM荧光通道中的实时定量扩增曲线，样本系列稀释倍数为1：0，1：1，1：4，1：20，1：40，1：200，1：400，其中，HLA-A*24:02阴性样本和NTC在检测灵敏度实验中作为对照。

图3为20ng HLA-A*24:02阳性样本通过系列稀释后在CY5荧光通道中的实时定量扩增曲线，样本系列稀释倍数为1：0，1：1，1：4，1：20，1：40，1：200，1：400，其中，HLA-A*24:02阴性样本和NTC在检测灵敏度实验中作为对照。

图4为SBT测序结果示意图。

具体实施方式

本发明在使用TaqMan探针检测法的基础上，设计了两对高特异性扩增HLA-A*24:02等位基因的引物探针组合。在此基础之上，使用内参基因ACTB的引物及探针，将两对目的基因特异性引物、探针与内参基因引物、探针加入同一管中进行多重荧光PCR反应，通过荧光扩增曲线分析结果。本发明具有特异性高、灵活快速、高通量、无污染、分辨率高、可实时监测反应进程等特点，可适用于人体外周血、唾液中全基因组DNA样本HLA-A*24:02的检测。

一、TaqMan探针法检测HLA-A*24:02等位基因

1、DNA样本的提取及稀释

按常规方法获得用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的真空采血管采集静脉血后，使用QIAamp DNA Mini Blood Kit(德国Qiagen公司)试剂盒提取DNA；将已提取的DNA使用NanoDrop 2000进行浓度测定(A_260/280＝1.95～2.15)。用上述方法，提取57例蓝田汉族DNA样本并测得相对的浓度，然后使用PCR等级的H₂O将样本稀释至10ng/μL。

2、设计引物和探针

在多态性位点集中的区域，利用ARMS方法设计HLA-A*24:02的特异性引物，第一条特异性上游引物Fp1：5’-GGTTCTC ACACCCTCCA GATGATGGT-3’，下游引物Rp1：5’-CTCCAGGTATCTGCGGAGCACG-3’，探针probe1:5’-FAM-CCACTTGCGCTTGGTGATCTGAGCC-BHQ2-3’，第二条特异性上游引物Fp2：5’-CTCGTCCCCAGGCTCCCTC-3’,下游引物Rp2:5’-CACCGGCCTCGCTCTGGT-3’：，探针probe2:5’-CY5-GAAGGCCCACTCACAGACTGACCGAG-BHQ2-3’；另外在β-actin基因上设计内参引物，上游引物Actin-F:5’-CAGCAGATGTGGATCAGCAAG-3’，下游引物Actin-R:5’-GCATTTGCGGTGGACGAT-3’，以及配套的荧光探针probe:5’-VIC-AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC–BHQ2-3’。

其中，FAM为6-carboxyfluorescein；CY5为Cyanine dyes 5；VIC为4,7,2′-trichloro-7′-phenyl-6-carboxyfluorescein，BHQ2为Black Hole Quencher-2；MGB为Minor Groove Binder。

委托武汉某公司合成。

3、样本检测

在荧光定量PCR仪上，将目的基因和内参基因(ACTB)的引物、探针同时加入一个管中，分别利用FAM通道，VIC通道与CY5通道进行三通道荧光采集；使用Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa)进行扩增，反应体系(10μL)包括：5μL Premix Ex Taq(2×)，HLA-A*24:02第一条特异性上游引物Fp1 400nM，下游引物Rp1 400nM，特异性探针probe1 200nM,第二条特异性上游引物Fp2 500nM，下游引物Rp2 500nM，特异性探针probe2 200nM,以及ACTB基因特异性上游引物250nM，下游引物250nM，探针100nM；然后加入待测样本基因组DNA约10ng-50ng，补充PCR等级的水至终体积10μL；用于检测HLA-A*24:02基因型的扩增程序：95℃预变性30s；95℃5s～10sec，60℃34s～40sec，共计40个循环。

4、结果分析

内参基因作为质控，必须出现荧光扩增曲线；在内参基因观察到扩增曲线的前提下，特异性探针必须在一定的荧光阈值范围内同时出现扩增曲线，则可判断该样本携带HLA-A*24:02等位基因。本发明中，有荧光扩增曲线达到阈值以上，则代表该特异性引物及探针与DNA模板结合，并且引物能够顺利延伸，引物覆盖区域碱基序列与模板序列一致，且探针覆盖范围内碱基也与模板序列一致。

二、HLA-A*24:02基因型特异引物灵敏度检测

1、DNA样本的稀释

取HLA-A*24:02标准品DNA作为试验样品，其浓度为20ng/μL。用PCR等级的H₂O连续稀释样品，即1：1，1：4，1：20，1：40，1：200，1：400，其DNA浓度分别为：10ng/μL，5ng/μL，1ng/μL，0.5ng/μL，0.1ng/μL，0.05ng/uL。

2、设计引物和探针

利用ARMS方法设计HLA-A*24:02的特异性引物，第一条特异性上游引物Fp1：5’-GGTTCTCACACCCTCCAGATGATGGT-3’，下游引物Rp1：5’-CTCCAGGTATCTGCGGAGCACG-3’，探针probe1:5’-FAM-CCACTTGCGCTTGGTGATCTGAGCC-BHQ2-3’，第二条特异性上游引物Fp2：5’-CTCGTCCC CAG GCTCCCTC-3’,下游引物Rp2:5’-CACCGGCCTCGCTCTGGT-3’：，探针probe2:5’-CY5-GAAGGCCCACTCACAGACTGACCGAG-BHQ2-3’；另外在β-actin基因上设计内参引物，上游引物Actin-F:5’-CAGCAGATGTGGATCAGCAAG-3’，下游引物Actin-R:5’-GCATTTGCGGTGGACGAT-3’，以及配套的荧光探针probe:5’-VIC-AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC-BHQ2-3’。

其中，FAM为6-carboxyfluorescein；CY5为Cyanine dyes 5；BHQ2为BlackHoleQuencher-2；MGB为Minor Groove Binder。

委托武汉某公司合成。

3、样本检测

在荧光定量PCR仪上，将目的基因和内参基因(ACTB)的引物、探针同时加入一个管中，分别利用FAM通道，VIC通道与CY5通道进行三通道荧光采集；使用Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa)进行扩增，反应体系(20μL)包括：5μL Premix Ex Taq(2×)，HLA-A*24:02第一条特异性上游引物Fp1 400nM，下游引物Rp1 400nM，特异性探针probe1 200nM,第二条特异性上游引物Fp2 500nM，下游引物Rp1 500nM，特异性探针probe2 200nM,以及ACTB基因特异性上游引物250nM，下游引物250nM，探针100nM；然后加入待测样本基因组DNA约10ng-50ng，补充PCR等级的水至终体积10μL；用于检测HLA-A*24:02基因型的扩增程序：95℃预变性30s；95℃5s～10sec，60℃34s～40sec，共计40个循环。

4、实验结果

HLA-A*24:02标准样品DNA系列稀释后实时扩增结果见图2和图3。由图2可见，标准样品系列稀释倍数1：1，1：4，1：20，1：40，1：200，1：400，其DNA浓度分别为：10ng/μL，5ng/μL，1ng/μL，0.5ng/μL，0.1ng/μL，0.05ng/uL。probe1的Ct值分别为20.9，20.92，24.175，25.88,27.4，33.18，34.104，。probe2的Ct值分别为23.313，24.86，25.407，25.99，29.5，31.319，32.55。由此可知本发明可检测低至0.05ng DNA左右的样本。

验证实验：57例样本进行SBT测序与HLA-A*24:02基因检测方法比较将57例蓝田汉族样本，将其送至GenDx公司进行SBT金标准测序，测序结果用峰图和Excel表格进行展示，以便对本发明实验结果进行复核。将SBT测序结果与本发明的检测方法结果进行比对(见表1)，发现两者之间的阴、阳性符合率均为100％。

表1

本发明在前期还准备了已知为HLA-A*24:02等位基因杂合型的血样标准品，作为检测体系的阴阳性对照。此外，标准品的存在，使得完成HLA-A*24:02等位基因检测方法建立的同时，进一步提高了待检样本判断的准确度。

<110>西北大学

<120>一种用于检测HLA-A*24:02等位基因的特异性引物探针组合、试剂盒及检测方法

<160> 9

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>1

GGTTCTC ACACCCTCCA GATGATGTT 26

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>2

CTCCAGGTATCTGCGGAGCCCG 22

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>3

CCACTTGCGCTTGGTGATCTGAGCC 25

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>4

CTCGTCCC CAG GCTCCCCC 19

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

CACCGGCCTCGCTCTGGT 18

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>6

GAAGGCCCACTCACAGACTGACCGAG 26

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>7

CAGCAGATGTGGATCAGCAAG 21

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>8

GCATTTGCGGTGGACGAT 18

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>9

AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC 23

Claims

1.用于荧光PCR反应特异性扩增HLA-A*24:02等位基因的特异性引物探针组合物，包括：

上游引物Fp1：5’-GGTTCTC ACACCCTCCA GATGATGGT-3’

下游引物Rp1:5’-CTCCAGGTATCTGCGGAGCACG-3’

探针probe1：5’-FAM-CCACTTGCGCTTGGTGATCTGAGCC–BHQ2-3’

上游引物Fp2：5’-CTCGTCCC CAG GCTCCCTC-3’

下游引物Rp2:5’-CACCGGCCTCGCTCTGGT-3’

探针probe2:5’-CY5-GAAGGCCCACTCACAGACTGACCGAG–BHQ2-3’

FAM为6-carboxyfluorescein；Cy5为Cyanine5；BHQ2为Black Hole Quencher-2。

2.权利要求1所述的特异性引物探针组合物在制备针对HLA-A*24:02等位基因的检测试剂盒方面的用途。

3.一种检测HLA-A*24:02等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR方法，用于非疾病诊断目的，主要包括以下环节：

(1)针对HLA-*24:02等位基因设计特异性引物和探针，即权利要求1所述的特异性引物探针组合物；并设计内参基因的引物和探针；

(2)获得抽提的待测样本基因组DNA；

(3)在同一个反应体系中，将待测样本基因组DNA与所述特异性引物探针组合物以及内参基因的引物和探针按照确定比例混合；

(4)通过Applied Biosystem 7500或者ViiA^TM 7 Real-Time PCR System进行实时定量荧光PCR检测，其中分别利用FAM、VIC和CY5通道进行三通道荧光采集；

(5)分析判断待测样本是否携带HLA-A*24:02等位基因。

4.根据权利要求3所述的检测HLA-A*24:02等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR方法，其特征在于，环节(1)中设计以下内参基因ACTB引物和探针：

上游引物Actin-F:5’-CAGCAGATGTGGATCAGCAAG-3’

下游引物Actin-R:5’-GCATTTGCGGTGGACGAT-3’

探针probe:5’-VIC-AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC–BHQ2-3’

其中，VIC为4,7,2′-trichloro-7′-phenyl-6-carboxyfluorescein；BHQ2为BlackHole Quencher-2。

5.根据权利要求4所述的检测HLA-A*24:02等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR方法，其特征在于：使用Premix Ex Taq试剂盒TaKaRa，进行扩增，所述反应体系以10μL计，则包括：5μL Premix Ex Taq 2×，HLA-A*24:02等位基因的特异性上游引物Fp1 400nM、下游引物Rp1 400nM、特异性探针probe1 200nM,特异性上游引物Fp2 500nM、下游引物Rp2 500nM、特异性探针probe2 200nM，以及ACTB基因特异性上游引物Actin-F 250nM、下游引物Actin-R 250nM、探针100nM；然后加入待测样本基因组DNA 10ng～50ng，补充PCR等级的水至终体积10μL；扩增程序为：95℃预变性30s；95℃ 5s～10sec，60℃ 34s～40sec，共计35～40个循环。

6.根据权利要求4所述的检测HLA-A*24:02等位基因TaqMan探针实时荧光PCR方法，其特征在于：目的基因和内参基因的特异性引物和探针在荧光PCR仪上加入同一管中进行扩增，但是用三个通道进行荧光的采集；内参基因作为质控，必须出现荧光扩增曲线；在内参基因观察到扩增曲线的前提下，特异性探针必须同时扩增出具有设定荧光值的荧光曲线，则判定待测样本携带有HLA-A*24:02等位基因。