CN108342457A

CN108342457A - Hla-b5801等位基因的检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN108342457A
Application number: CN201810280007.1A
Authority: CN
Inventors: 胡锦; 张凤笑
Original assignee: Foshan Shunde Hui Jin Chuangxing Biomedical Technology Co Ltd
Current assignee: Foshan Shunde Hui Jin Chuangxing Biomedical Technology Co Ltd
Priority date: 2018-04-01
Filing date: 2018-04-01
Publication date: 2018-07-31
Anticipated expiration: 2038-04-01
Also published as: CN108342457B

Abstract

本发明涉及HLA‑B5801等位基因的检测试剂盒及其应用，本发明试剂盒包括检测HLA‑B5801等位基因的qPCR引物和探针，使用本发明引物和探针克服了现有的qPCR方法只能使用多条引物和探针才能把HLA‑B5801等位基因的序列覆盖全，导致qPCR反应体系复杂，结果不稳定的不足。本发明试剂盒使用简单、准确性高、过程可监控、结果快速，而且无电泳过程，利于临床的推广及普及。

Description

HLA-B5801等位基因的检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及分子诊断领域，特别涉及HLA-B5801等位基因的检测试剂盒及其应用。

背景技术

高尿酸血症是嘌呤代谢异常，血尿酸生成过多或排泄障碍导致的代谢性疾病，不仅是痛风的主要危险因素，同时也是代谢综合征的重要组成部分，影响心脏、肾脏等脏器功能，是高血压、冠心病的独立危险因素，也是慢性肾功能不全的重要危险因素，对人类健康造成严重危害。

别嘌呤醇等黄嘌呤氧化酶抑制剂，可以减少体内尿酸合成，临床应用于高尿酸血症、痛风和痛风性关节炎等疾病的防治。在对于尿酸生成过多、对排尿酸药物过敏或无效，以及不宜使用排尿酸药物(如有肾功能不全)的原发性和继发性痛风病人，别嘌呤醇是最为适合的药物。所述的别嘌呤醇自1963年起用于临床，其疗效得到了广泛肯定，但有近5％的别嘌呤醇服用患者会出现严重的皮肤不良反应，约占药疹病例的11.94％。严重不良反应包括包括Steven-Johoson综合征(SJS)和中毒性表皮坏死松懈症(TEN)。SJS综合征表现为严重的多形性红斑，可累及皮肤与粘膜，包括口、鼻、眼、阴道、尿道、胃肠道和下呼吸道粘膜，患者甚至有失明危险，进一步发展则形成中毒性表皮坏死松懈症，全身粘膜溃烂，在红斑上发生松弛性大泡或表皮剥离；若遇轻度触碰或牵拉可导致表皮大面积剥离。据报道，SJS/TEN致死率可达30％～50％。研究发现，中国人群中HLA-B5801等位基因与黄嘌呤氧化酶抑制剂引起严重皮肤过敏反应强相关。携带HLA-B5801等位基因的中国汉族患者服用别嘌醇发生皮肤过敏反应的风险较未携带有此基因型的汉族人群风险比增加339倍。美国风湿病学会痛风指南指出中国汉族人和泰国人应用别嘌呤醇药物前应做HLA-B5801等位基因检测。人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，简称HLA)复合体是当前已知的人类染色体中基因密度最高，也是多态性最为丰富的区域。通过基因分析方法区分HLA区域的基因分型，在器官移植、个体化用药方面发挥了巨大作用。

荧光定量PCR方法(qPCR)由于其方法的便捷性，在HLA基因分型上有广泛的应用。特别是分析HLA-B5801等位基因型，荧光定量PCR方法已经见于文献报道和其他的一些专利资料。由于HLA-B5801等位基因序列的丰富性，现有的qPCR方法只能使用多条引物才能把HLA-B5801等位基因的序列覆盖全，导致qPCR反应体系复杂，结果不稳定。

发明内容

本发明为了克服上述提到的qPCR方法中的缺陷，本发明提供一种HLA-B5801等位基因的检测试剂盒，所述试剂盒包括检测HLA-B5801等位基因的以下PCR引物和探针：HLA-B5801上游引物：5'-atgtcccggcccggccgy-3'(SEQ ID NO:1)；HLA-B5801下游引物：5'-caggttctctcggtaagtrt-3'(SEQ ID NO:2)；和HLA-B5801探针序列：5'-ccgcttcatcgcagtgggctacgtg-3'(SEQ ID NO:3)；简并碱基r表示a/g碱基，y表示c/t碱基。

在一种实施方式中，所述HLA-B5801探针序列的荧光发光基团为FAM，荧光淬灭基团为MGB。

在一种实施方式中，所述扩增内参基因为人RPP30基因；RPP30上游引物：5'-gatttggacctgcgagc-3'(SEQ ID NO:4)，RPP30下游引物：5'-ggttggccaggcgcgaag-3'(SEQID NO:5)；和RPP30探针的序列为：5'-ctgacctgaaggctct-3'(SEQ ID NO:6)。

在一种实施方式中，所述RPP30探针序列的荧光发光基团为VIC，荧光淬灭基团为MGB。

在一种实施方式中，所述检测试剂盒还包括阴性对照和阳性对照；所述阴性对照为水，所述阳性对照为含有HLA-B5801基因的人类基因组DNA溶液。

在一种实施方式中，本发明提供上述检测试剂盒在进行HLA-B5801等位基因检测和/分型中的应用。

为了使得设计的荧光定量PCR能覆盖以上的所有等位基因位点，本发明是在对已知的HLA-B5801多个亚型序列进行大量分析和研究后，取一致序列为荧光定量PCR引物、探针设计的模板。在此基础上，本发明提供一对带有简并碱基的引物，并且在保证最低简并度的情况下，能最大程度覆盖HLA-B*5801基因型序列。并且通过TaqMan探针和该简并引物配合，可以在一次qPCR反应中即可准确检出HLA-B*5801等位基因；并且采用荧光PCR法检测样本，可以根据扩增曲线的有无直接判读样本的阴阳性。

本发明试剂盒克服了现有的qPCR方法只能使用多条引物和探针才能把HLA-B5801等位基因的序列覆盖全，导致qPCR反应体系复杂，结果不稳定的不足。本发明试剂盒使用简单、准确性高、过程可监控、结果快速，而且无电泳过程，利于临床的推广及普及。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1是本发明检出的HLA-B5801阳性样本(图1a)和阴性样本(图1b)的荧光定量结果展示图；长散点线条表示HLA-B5801探针，短散点线表示内参基因RPP30探针。

具体实施方式

为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合以下实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。

实施例一.已有HLA-B5801基因型的序列比对分析

为克服上述提到的qPCR方法中的缺陷，本发明提供一对带有简并碱基的引物，并且在保证最低简并度的情况下，能最大程度覆盖HLA-B5801基因型序列。并且通过TaqMan探针和该简并引物配合，可以在一次qPCR反应中即可准确检出HLA-B5801等位基因。

目前已知B-58:01有如下亚型：B*58:01:01:01，B*58:01:01:02，B*58:01:02，B*58:01:03，B*58:01:04，B*58:01:05，B*58:01:06，B*58:01:07，B*58:01:08，B*58:01:09，B*58:01:10，B*58:01:11，B*58:01:12，B*58:01:13，B*58:01:14，B*58:01:15，B*58:01:16，B*58:01:17，B*58:01:18，B*58:01:19，和B*58:01:20。

为了使得设计的荧光定量PCR能覆盖以上的所有等位基因位点，本发明人对以上各个亚型序列进行比对分析，取一致序列为荧光定量PCR引物、探针设计的模板。

本发明中涉及的引物、探针序列如下表1。

表1.HLA-B*5801等位基因进行qPCR方法检测的引物和探针

名称	序列(5’-3’)	Tm值	简并度
				5801上游引物	atgtcccggcccggccgy	56.7～58.1	2
5801下游引物	caggttctctcggtaagtrt	56.6～57.8	2
				5801探针	ccgcttcatcgcagtgggctacgtg	68.4

其中简并碱基R表示A/G碱基；Y表示C/T碱基。

为了监测qPCR反应体系是否正常工作，还同时加入了内参基因人的RPP30基因，RPP30基因的引物、探针如下表2：

表2.内参基因RPP30基因进行qPCR方法检测的引物和探针

名称	序列(5’-3’)	Tm值
			上游引物	gatttggacctgcgagc	59.6
下游引物	ggttggccaggcgcgaag	58.8
			探针	ctgacctgaaggctct	65.4

其中探针5’端带有荧光报告基团VIC，3’端带有荧光淬灭基团MGB。

实施例二.样品HLA-B5801阳性/阴性的检测

本发明所检测的标本类型外周全血的临床样本，血样在提取基因组DNA后，先通过Sanger测序获得HLA-B5801等位基因不同亚型的序列。

通过以下荧光定量PCR反应体系进行反应，qPCR反应体系使用北京康为世纪生物科技公司的产品，如表3，反应条件如表4。

表3.qPCR方法检测HLA-B5801等位基因的反应体系

表4.qPCR反应条件

在荧光定量PCR仪器ABI7500上，检出HLA-B5801阳性和阴性的荧光定量反应曲线图参见图1。

取20例通过Sanger测序方法确认的HLA-B5801阳性，和20例HLA-B5801阴性样本，用本发明所述方法进行检测，阳性和阴性结果为100％吻合。

应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。

本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

序列表

<110> 佛山市顺德区辉锦创兴生物医学科技有限公司

<120> HLA-B5801等位基因的检测试剂盒及其应用

<130> PF18005

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtcccggc ccggccgy 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caggttctct cggtaagtrt 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccgcttcatc gcagtgggct acgtg 25

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatttggacc tgcgagc 17

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggttggccag gcgcgaag 18

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctgacctgaa ggctct 16

Claims

1.HLA-B5801等位基因的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测HLA-B5801等位基因的以下PCR引物和探针：

HLA-B5801上游引物：5'-atgtcccggcccggccgy-3'；

HLA-B5801下游引物：5'-caggttctctcggtaagtrt-3'；和

HLA-B5801探针序列：5'-ccgcttcatcgcagtgggctacgtg-3'；简并碱基r表示a/g碱基，y表示c/t碱基。

2.根据权利要求1中所述的检测试剂盒，所述HLA-B5801探针序列的荧光发光基团为FAM，荧光淬灭基团为MGB。

3.根据权利要求1中所述的检测试剂盒，所述扩增内参基因为人RPP30基因；RPP30上游引物：5'-gatttggacctgcgagc-3'，RPP30下游引物：5'-ggttggccaggcgcgaag-3'；和RPP30探针的序列为：5'-ctgacctgaaggctct-3'。

4.根据权利要求3中所述的检测试剂盒，所述RPP30探针序列的荧光发光基团为VIC，荧光淬灭基团为MGB。

5.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括阴性对照和阳性对照；所述阴性对照为水，所述阳性对照为含有HLA-B5801基因的人类基因组DNA溶液。

6.权利要求1-5任一所述的检测试剂盒在进行HLA-B5801等位基因检测和/分型中的应用。