CN101004415B

CN101004415B - 一种测定乙型肝炎病毒阿德福韦耐药变异的方法

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Publication number: CN101004415B
Application number: CN2007100365119A
Authority: CN
Inventors: 张继明; 毛日成; 尹有宽; 王新宇
Original assignee: Huashan Hospital of Fudan University
Current assignee: Huashan Hospital of Fudan University
Priority date: 2007-01-16
Filing date: 2007-01-16
Publication date: 2011-07-27
Anticipated expiration: 2027-01-16
Also published as: CN101004415A

Abstract

本发明属医学检验领域，涉及药物耐药基因的检测方法，具体涉及一种测定乙型肝炎病毒阿德福韦耐药变异的方法。本发明方法克服现有技术的缺陷，通过设计特定引物，采用套式PCR方法进行扩增，所获扩增产物使用BglI、BseDI进行酶切反应电泳后，进行限制性片断长度多态性分析。经检测20余例长期使用阿德福韦抗病毒治疗的患者，和已知发生ADV耐药的质粒，与现有技术进行比较，显示结果完全相符。本发明方法可以一次同时检测181位和236位核苷酸变异情况，具有灵敏、特异、简便的特点，适用于阿德福韦酯耐药变异的临床监测工作。

Description

一种测定乙型肝炎病毒阿德福韦耐药变异的方法

技术领域

本发明属医学检验领域，涉及药物耐药基因的检测方法，具体涉及慢性乙肝患者使用阿德福韦酯(ADV)抗病毒治疗后耐药情况的临床监测方法。

背景技术

以拉米夫定(lamivudine)为代表的核苷类似物类抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)药物的临床应用是慢性乙型肝炎治疗史上的里程碑。迄今为止，已经有100多万慢性乙型肝炎患者接受了拉米夫定治疗，使慢性乙型肝炎的治疗取得了巨大的进步。抗HBV药物的广泛应用在为慢性乙型肝炎患者带来福音的同时，也带来了严重的耐药问题。例如拉米夫定治疗1～4年的耐药率可分别高达14％、38％、49％和66％。阿德福韦酯(adefovir dipivoxil)是开环嘌呤类核苷酸类似物，不仅对慢性乙型肝炎患者有较好的疗效，对拉米夫定耐药的HBV也有较好的抑制作用，已被广泛应用于慢性乙型肝炎患者(包括拉米夫定耐药患者)的治疗。尽管HBV对阿德福韦耐药的发生率低于拉米夫定，但长期服用仍有较高的耐药率，对于初治的患者，ADV治疗5年的耐药率分别为0，2％～3％，5.9％～11％，18％，28％；对于LAM治疗失败后换用ADV单药治疗的患者，ADV的耐药率更高，1～2年的耐药率分别为6.4％～17.5％和25.4％。因此，在阿德福韦治疗过程中需要动态监测HBV对阿德福韦的耐药性，一旦发现耐药，可及时改换其他药物，如拉米夫定、恩替卡韦等，防止出现HBV耐药株所致的病情恶化，节省医疗费用。

目前已证实ADV耐药相关的变异主要包括有两种：rtA181V/T/S和rtN236T。对于阿德福韦耐药变异的检测，除了DNA测序分析之外，国外报道可使用聚合酶链反应-限制性片段质量多态分析(PCR-RFMP)、INNO-LiPA探针检测法。测序分析方法需要昂贵的测序仪，检测过程耗时较长，且只有当病毒群中HBV变异株至少占30％以上时(通常需50％以上)，才能检测到变异株，用于变异株检测有较大的局限性，故该方法不宜用于阿德福韦相关耐药变异的早期诊断；PCR-RFMP方法虽然敏感性较高，但需要昂贵的质谱仪等特殊仪器，检测成本较高。因为以上两种方法均需特殊仪器，故难以在临床上广泛应用。而INNO-LiPA探针检测法虽然灵敏度较高，但检测成本较高，难以在我国推广应用。为了适应我国的国情，满足医疗、科研的需要，急需建立快速、简便的检测阿德福韦变异株的方法。

聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-restriction fragment lengthpolymorphism，PCR-RFLP)分析方法是基于PCR和限制性内切酶分析的一种方法，可用于检测各种点突变，较为简便、快速，不需要昂贵的仪器，在中、小医院即可开展，且敏感性和特异性均较高。目前已有用PCR-RFLP分别检测rtA181V/T/S变异或rtN236T变异的报道，但在临床上判断有无阿德福韦耐药时，必须同时检测rtA181V/T/S和rtN236T两种变异形式，如采用PCR-RFLP方法检测，需建立两套PCR扩增体系，分两次对HBV DNA模板进行扩增，然后再进行酶切及检测，操作较为繁琐、耗时。目前临床上尚缺少简便、敏感的检测方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种快速、准确的药物耐药基因的检测方法。具体涉及一种测定乙型肝炎病毒阿德福韦耐药变异的方法。

本方法可用以慢性乙肝患者使用阿德福韦酯(ADV)抗病毒治疗后耐药情况的临床监测，判断患者体内存在的病毒株是否发生阿德福韦耐药相关性变异，以决定是否需要及时调整治疗药物。

本发明应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态技术(PCR-RFLP)检测乙型肝炎病毒阿德福韦耐药变异。由于rtA181与rtN236两个位点仅相距54个氨基酸，即理论上应用同一个PCR扩增体系可同时检测rtA181V/T/S和rtN236T变异时，可节省一半的时间和相应的费用。

本发明的目的通过下述方法和步骤实现，

①样品预处理：抽取测试者全血，提取HBV DNA；

②巢式PCR反应：设计引物，以上述抽提的HBV DNA为模板，采用套式PCR方法进行扩增。第1轮上游和下游引物分别为ADV-R-S1和ADV-R-AS1，第2轮PCR上游和下游引物ADV-R-S2和ADV-R-AS2(见表1)，PCR扩增条件均为：94℃预变性5min；94℃30s，56℃1min，72℃45s，循环35次；最后一个循环结束后72℃延伸7min。反应体系为50ul，PCR扩增采用Takara公司的Premix Taq酶。通过PCR反应在RT区181位核苷酸的上游引入错配碱基GCC，在RT区236位氨基酸的下游引入错配碱基GG。由于HBV有8种基因型，而不同基因型HBV毒株的序列在检测区域有所不同，所以本发明在引物设计时兼顾了由于基因型不同而带来的差异，使该种检测方法适应于HBV的所有基因型。

表1是PCR引物名称及序列，表2是PCR反应示意表。

表1

其中，Y(C，T)，R(A，G)，K(G，T)，W(A，T)。

表2

其中，标黑色下划线为错配碱基；通过引入错配碱基，上游通过两轮错配引入了BglI的酶切位点，下游引入了BseDI(SecI)的酶切位点。

③限制性内切酶酶切：对于上述第二轮PCR产物分别使用BglI、BseDI(SecI)进行酶切反应。

其中，BglI的酶切反应温度为37℃，BseDI(SecI)的酶切反应温度为55℃。

④根据酶切产物的电泳结果判断是否存在乙型肝炎病毒阿德福韦耐药变异。

酶切1小时后，酶切产物在3％琼脂糖凝胶上电泳90分钟，在全自动紫外图像分析仪下扫描，对于181位核苷酸变异的患者，BglI不能酶切开，而181位没有发生变异者，可以酶切开；对于236位核苷酸变异的患者，BseDI能够酶切开，而236位没有发生变异者，可以酶切开。

本发明方法所采用仪器为：

PCR扩增仪(PTC-100，Bio-Rad公司)；恒温水浴箱(上海山连实验设备有限公司)；全自动紫外图像分析仪(FR-200A，上海复日科技有限公司)。

本发明方法所采用的主要试剂包括胶回收试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)，PMD18-T Vector TA克隆试剂盒(Takara公司)，Premix Taq酶(Takara公司)，蛋白酶K(Takara公司)，内切酶BglI、SacI、PstI(Takara公司)、BseDI(SecI)(上海生工生物公司)、，感受态细菌DH5α(申能博彩公司)、PCR引物(上海英俊生物技术公司)。

本发明方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术，检测了20余例长期使用阿德福韦抗病毒治疗的患者，并与DNA测序法进行了比较，结果显示完全相符。同时检测了20余例已知发生ADV耐药的质粒，结果也显示完全相符。本发明方法的敏感度高达90％以上，特异性可达100％，明显高于常用的直接测序检测技术。与直接测序法比较，本发明方法灵敏度和精确度高，检测更快速，成本更低，可以一次同时检测181位和236位核苷酸变异情况。

本发明方法具有下述优点：1.高通量检测，2.自动化程度高：能减轻劳动强度，提高检测效率，3.灵敏度和特异性均较高，4.快速且成本较低：每份标本的检测时间不超过1天，平均费用约为50元人民币，5.检测结果直观易判断。

附图说明

图1是本发明方法质粒检测电泳图，其中，

(A)为野毒株；(B)为181位核苷酸变异质粒；(C)为236位核苷酸变异质粒。

图2是本发明方法血清检测电泳图，

其中，A患者血清病毒群中，大部分HBV毒株的181位和236位发生了耐药相关性变异；B患者血清病毒群中HBV毒株的181位没有发生变异，而236位发生耐药相关性变异；C患者血清病毒群中HBV毒株的181位没有发生变异，但大多数HBV毒株的236位发生了耐药相关性变异。

图3是本发明方法耐药株敏感性检测电泳图，

其中，A图中181位核苷酸变异株占据病毒群的比例逐渐增加，B图中236位核苷酸变异株占据病毒群的比例逐渐增加，检测方法敏感性达到90％以上。

图4是A患者HBV-DNA直接测序所见，与本方法检测结果一致。

图5是本方法与DNA测序法检测26例长期使用阿德福韦抗病毒治疗的患者结果比较，结果显示完全相符，其中本方法灵敏性更高，可以检测到更多患者存在着ADV耐药相关性变异。

具体实施方式

实施例1

(1)以经典碱裂解—酚/氯仿抽提方法抽提患者血清中的HBV DNA 100μl血清加入300μl TES液(10mM Tris-HCl，pH8.0，5mM EDTA，0.5％SDS，50μgProtease K)，混匀，65℃消化3小时，等体积苯酚/氯仿及氯仿抽提各一次，上清加入2倍体积无水乙醇、1/10体积3M醋酸钠(pH4.8)沉淀DNA，70％乙醇漂洗一次，将DNA溶于20μl灭菌双蒸水中，于-70℃保存备用。

(2)PCR-RFLP检测方法的设计ADV耐药相关性变异主要涉及2个氨基酸的变化，即181位和236位。在设计PCR-RFLP检测方法前必须了解编码RT区181、236位及其邻近氨基酸的核苷酸序列的多态性分析。为此，本发明在GenBank中下载不同基因型(A～H型)HBV全基因，比较RT区编码181、236位及其邻近氨基酸的核苷酸序列的多态性，以了解HBV的自然变异情况，为引物设计及内切酶的选择提供依据。通过序列分析发现，编码181位氨基酸(即丙氨酸，alanine，A)的密码子GCT在不同基因型HBV中是非常保守的，发生ADV耐药后，GCT可突变为GTT(编码缬氨酸，valine，V)、ACT(编码苏氨酸，threonine，T)或TCT(编码丝氨酸，serine，S)，从而引起rtA181V、rtA181T或rtA181S变异。然而，在HBV野毒株核苷酸序列中，编码236位氨基酸(即天冬酰胺，asparagine，N)的密码子可发生同义突变(AAT或AAC)，而耐药变异株的密码子迄今为止仅发现一种，即ACC。由于181位和236位氨基酸相距较近，本方法设计两条套式PCR错配引物(见表1)，通过两轮PCR扩增使181位氨基酸上游的核苷酸序列中引入错配碱基GCC，从而使野毒株HBV序列中含有BglI内切酶位点，而rtA181V/T/S变异株则无此内切酶位点；使236位氨基酸下游的核苷酸序列中引入错配碱基GG，从而使rtN236T变异株序列中含有BseDI(SecI)内切酶位点，而HBV野毒株则无此内切酶位点。由于HBV有8种基因型，而不同基因型HBV毒株的序列在检测区域有所不同，本发明在引物设计时兼顾了由于基因型不同而带来的差异，使该种检测方法适应于HBV的所有基因型。

(3)PCR-RFLP检测以抽提的血清HBV DNA为模板，采用套式PCR方法进行扩增。第1轮上游和下游引物分别为ADV-R-S1和ADV-R-AS1，第2轮PCR上游和下游引物ADV-R-S2和ADV-R-AS2，PCR扩增条件均为：94℃30s，56℃60s，72℃45s，共35个循环，反应体系为50ul。PCR扩增采用Premix Taq酶。取5ul第二轮PCR产物采用3％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，于222bp出出现荧光条带者为阳性。

再进行酶切反应：20ul BglI酶切反应体系内含第二轮PCR产物10ul，BglI1OU，酶切缓冲液2ul，于37℃酶切1小时；29ul BseDI酶切反应体系内含第二轮PCR产物10ul，BseDI10U，酶切缓冲液2ul，于55℃酶切1小时。将10ul酶切产物以3％琼脂糖凝胶电泳90分钟，在全自动紫外图像分析仪(FR-200A，上海复日科技有限公司)下观察。将标本与酶切前的PCR产物相比即可判定是否变异。

酶切后电泳显示，A患者血清病毒群中，大部分HBV毒株的181位和236位发生了耐药相关性变异；B患者血清病毒群中HBV毒株的181位没有发生变异，而236位被完全酶切，发生了耐药相关性变异；C患者血清病毒群中HBV毒株的181位没有发生变异，但大多数HBV毒株的236位发生了耐药相关性变异(见图3)。

实施例2

验证本方法的敏感性实验-含ADV耐药相关变异的RT区基因片段的克隆

在HBV聚合酶RT区A-E基序两侧设计PCR引物(表3)，以上述抽提的HBV DNA为模板，采用套式PCR方法进行扩增。第1轮上游和下游引物分别为RTS1和RTAS1，第2轮PCR上游和下游引物RTS2和RTAS2，PCR扩增条件均为：94℃30s，56℃60s，72℃45s，共35个循环，反应体系为50ul。PCR扩增采用Premix Taq酶。PCR产物经胶回收纯化后直接测序。采用PMD18-T Vector TA克隆试剂盒，筛选含目的片段的克隆，质粒鉴定采用SacI和PstI双酶切及测序分析方法。3个患者各取了10个克隆质粒测序，结果显示：A患者181位发生了耐药相关性变异的有9个，占90％；236位发生了耐药相关性变异的有6个，占60％。B患者181位没有发现耐药相关性变异，236位发生了耐药相关性变异的有10个，占100％。C患者181位没有发现耐药相关性变异，236位发生了耐药相关性变异的有9个，占90％。该结果与使用PCR-RFLP方法检测完全一致。表3是在HBV聚合酶RT区A-E基序两侧设计的PCR引物表。

表3

Claims

1.一种测定乙型肝炎病毒阿德福韦耐药变异的方法，其特征是通过下述步骤：

①样品预处理：抽取测试者全血，提取HBV DNA；

②巢式PCR反应：设计引物，以上述抽提的HBV DNA为模板，采用套式PCR方法进行扩增；所述的引物是：

③限制性内切酶酶切：对获得的PCR产物分别使用BglI、BseDI进行酶切反应，其中，BglI的酶切反应温度为37℃，BseDI的酶切反应温度为55℃；

④根据酶切产物的电泳结果判断乙型肝炎病毒阿德福韦耐药变异。

2.按权利要求1所述的方法，其特征是所述的步骤2的引物ADV-R-S1或ADV-R-S2中Y是C和T。

3.按权利要求1所述的方法，其特征是所述的步骤2的引物ADV-R-AS2中R是A和G，K是G和T，W是A和T。

4.按权利要求1所述的方法，其特征是所述的步骤2的PCR扩增条件均为：94℃预变性5min；94℃30s，56℃1min，72℃45s，循环35次；最后一个循环结束后72℃延伸7min，反应体系为50ul，PCR扩增采用Premix Taq酶。