CN108531600A

CN108531600A - 一种用于检测外周血egfr基因t790m突变的特异性引物和探针及试剂盒

Info

Publication number: CN108531600A
Application number: CN201810489633.1A
Authority: CN
Inventors: 曾骥孟; 唐乃平; 龚剑; 方月; 许晓玲
Original assignee: Jiangsu Yinuowan Cell Clinic Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Yinuowan Cell Clinic Co Ltd
Priority date: 2018-05-21
Filing date: 2018-05-21
Publication date: 2018-09-14

Abstract

本发明公开了一种用于检测外周血EGFR基因T790M突变的特异性引物和探针及试剂盒，该引物和探针包括如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6所示的突变型检测正向引物、目的基因检测探针、内控检测正向引物、内控检测探针、共用反向引物和野生型特异性结合的PNA。本发明的试剂盒和检测方法对EGFR T790突变检测具有特异性强、灵敏度高、操作简便等特点，适用于外周血等突变含量低的样本，为肺癌新药Tagrisso对T790M突变患者治疗提供用药指导，具有很好的应用前景。

Description

一种用于检测外周血EGFR基因T790M突变的特异性引物和探针及试剂盒

技术领域

本发明属于生物科学和生物技术领域，特别涉及到检测外周血EGFR基因T790M突变的特异性引物和探针及试剂盒。

背景技术

EGFR 是上皮生长因子（EGF）细胞增殖和信号传导的受体。EGFR的突变或缺失导致的EGFR下游细胞信号通路的异常激活或EGFR的超表达导致的下游细胞信号通路的异常激活是许多肿瘤发生的重要原因是，尤其是非小细胞肺癌。因此，FDA相继批准了一系列针对于EGFR突变的非小细胞肺癌靶向药物，如吉非替尼、厄洛替尼、奥希替尼等。但是吉非替尼、厄洛替尼作为非小细胞肺癌靶向治疗的一线药物在治疗5-9个月以后一般都会产生耐药突变，其中主要是T790M突变的耐药突变。奥希替尼是一种不可逆的三代EGFR-TKI，可以选择性地抑制EGFR敏感突变和T790M耐药突变。2017年3月，奥希替尼在华上市，开创了EGFR TKI耐药后T790M阳性患者的精准治疗新时代。随着泰瑞沙的上市，如何敏感、准确地检测T790M突变成为临床关注的热点。

目前，组织活检是检测癌症基因突变的主要方法，但组织活检技术在癌症的诊断和治疗过程中具有一定的局限性。首先，组织活检属于有创操作，会给患者带来很大的痛苦，有部分患者由于病情等原因难以实施组织活检。另外由于肿瘤组织存在异质性，仅针对某个部位的肿瘤组织进行取样检测，并不能反映患者的整体情况，但对所有的肿瘤组织都取样检测又不切实际。同时，组织活检由于不能进行反复多次操作，无法实现对肿瘤遗传信息的实施监控，准确掌握肿瘤发生发展的动态过程。近年来，血浆中的游离肿瘤DNA（CtDNA）被认为是一种可检测肿瘤基因突变的生物样本。它的优势在于：安全无创；在肿瘤患者病程发展的各个阶段都可获取，从而实现对患者治疗效果及病情发展的动态检测。

目前针对ctDNA的检测方法主要包括ARMS法、数字PCR法和二代测序法，由于ctDNA在血液中的含量很少，而ctDNA中具有T790M突变的DNA的量更是少之又少，因此对检测方法的灵敏度和特异性要求非常高。数字PCR具有较高的灵敏度，但通量小，设备昂贵，操作复杂，造成临床推广困难。二代测序ctDNA分析技术具有高灵敏度，高通量的优点，同时可检测未知突变，但同样也存在设备昂贵，成本高，操作复杂等缺点，不适宜针对T790M单点突变进行检测。目前ARMS法的灵敏度普遍在1%左右，仍无法满足在低含量样本中检测突变基因的需要，因此需要寻求一种灵敏度更高、特异性更强、操作简单，成本相对低廉的突变检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测外周血EGFR基因T790M突变的特异性引物及探针组合物及其应用。

本发明的另一目的是提供一种高灵敏度和高特异性的检测血液中EGFR基因T790M突变的试剂盒。

本发明的又一目的在于提供一种检测外周血EGFR基因T790M突变的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

本发明提供一种用于检测外周血EGFR基因T790M突变的特异性引物及探针组合物，该组合物包括突变型检测正向引物、目的基因检测探针、内控检测正向引物、内控检测探针、共用反向引物和野生型特异性结合的PNA；上述特异性引物及探针的序列如下：

突变型检测正向引物序列: TCACATCCACAGTGTAGCTCATATT（SEQ ID NO:1）；

目的基因检测探针序列: TCGGCTGCCTCCTGGACTAT（SEQ ID NO:2）；

内控检测正向引物序列: TCCGGGAACACAAAGACAATTAT（SEQ ID NO:3）；

内控检测探针序列: AGTACCTGCTCAACTGGTGTGTG（SEQ ID NO:4）；

共用反向引物序列: TTCCCTGATTACCTTTGCGAT（SEQ ID NO:5）；

野生型特异性结合的PNA序列: CTCATCACGCAGCTCA（SEQ ID NO:6）；

所述目的基因检测探针5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团；所述内控检测探针5’端标记ROX荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团；所述野生型特异性结合的PNA 5’端进行NH₂修饰，3’端进行COOH修饰。

上述引物探针设计，采用了ARMS、MGB和PNA联合技术。

等位基因特异性扩增(A11eles specific amplification，ASA)-又称扩增阻碍突变系统(Amplification refractory mutation system，ARMS)，利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3’碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，从而检测出突变，该法省去了探针杂交操作。

MGB探针是针对Taqman探针荧光淬灭不彻底的问题设计的一种新型探针，它的3’端采用了非荧光性的淬灭基团，这种淬灭基团在吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本地信号的干扰。此外，MGB探针的3’端还链接了一个二氢环化吲哚卟啉三肽，可以大大稳定探针与模板的杂交，升高探针Tm值，使较短的探针同时能够达到较高的Tm值，同时短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近，淬灭效果更好，荧光背景更低，使得信噪比更高，MGB探针在检测单碱基突变时具有明显的优势。

肽核酸(PNA)是具有类多肽骨架的DNA类似物，PNA的主链骨架是由N(2-氨基乙基)-甘氨酸与核酸碱基通过亚甲基羰基连接而成的。PNA可以特异性地与DNA或RNA杂交，形成稳定的复合体。在体系中加入野生型特异性结合的PNA，使其与野生型模板稳固结合，阻碍T790M突变型ARMS引物对野生型模板的非特异性扩增，增加检测的特异性。

本发明通过ARMS、MGB和PNA联合技术，对肿瘤患者外周血中提取的游离DNA为检测样本检测的灵敏度可达0.1~1%，实现了针对血液游离DNA样本的低含量突变的高灵敏度和高特异性的检测。

本发明还提供上述的引物及探针组合物在检测外周血EGFR基因T790M突变或制备用于检测外周血EGFR基因T790M突变的试剂盒中的应用。

一种用于检测外周血EGFR基因T790M突变的试剂盒，该试剂盒包括上述的引物及探针组合物。该试剂盒中还包含PCR技术常用试剂、T790M阳性对照和阴性对照。所述的PCR技术常用试剂包括10ÍPCR缓冲液、无菌水、dNTP、MgCl₂和Ex Taq酶。

所述的试剂盒可同时检测突变基因和内控，突变基因由FAM信号指示，内控由ROX信号指示，由于ctDNA多为160bp左右的小片段，内控选择的区域紧邻突变基因所在区段，因此可真实反映突变基因的量。

采用该试剂盒检测外周血EGFR基因T790M突变的20ul PCR反应扩增体系如下：

本发明还提供了一种检测外周血EGFR基因T790M突变的方法，包括以下步骤：

（1）提取待检测外周血的DNA样本作为待检测样本；

（2）将阳性对照、阴性对照和步骤（1）提取的DNA样本分别加入上述试剂盒的检测体系中进行实时荧光定量PCR反应；收集FAM和ROX荧光信号；

（3）检测结果判定：

根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果：突变由FAM信号指示，内控由ROX信号指示，通过计算FAM信号与ROX信号的△Ct的大小来判断检测结果，△Ct =CT_FAM-CT_ROX，判断标准为：△Ct≤5 为强阳性，5<△Ct<10为弱阳性，△Ct≥10或无值为阴性。

所述实时荧光定量PCR反应程序如下：

第一阶段：98℃ 2min；

第二阶段：98℃ 10s，55℃ 30s, 40个循环；

信号采集：第二阶段55℃收集FAM和ROX信号。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

通过对ARMS、MGB和PNA三种技术的整合，设计了一种可以用于检测人类外周血EGFR基因T790M突变的试剂盒，相较于现有的EGFR突变检测试剂盒具有更高的灵敏度和特异性，为肿瘤的诊断提供了一种安全无创、高效便捷、成本低廉的新方法。

附图说明

图 1 为灵敏度分析试验结果PCR图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅作为示例。

实施例1：

运用本发明检测EGFR基因T790M突变灵敏度参考品，具体步骤如下：

（一）灵敏度参考品的制备

通过苏州泓迅生物科技股份有限公司合成EGFR T790M重组突变质粒，测定浓度后计算相应拷贝数，用人类外周血野生型DNA（2ng/ul）稀释重组质粒，使突变比例分别为100%，10%，1%，0.1%。

（二）建立QPCR扩增体系：

其中引物序列见SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6：

目的基因检测探针序列: TCGGCTGCCTCCTGGACTAT（SEQ ID NO:2）；

内控检测正向引物序列: TCCGGGAACACAAAGACAATTAT（SEQ ID NO:3）；

内控检测探针序列: AGTACCTGCTCAACTGGTGTGTG（SEQ ID NO:4）；

共用反向引物序列: TTCCCTGATTACCTTTGCGAT（SEQ ID NO:5）；

野生型特异性结合的PNA序列: CTCATCACGCAGCTCA（SEQ ID NO:6）。

在本实施例中，具体反应体系为：

所述实时荧光定量PCR反应条件为：

第一阶段：98℃ 2min;

第二阶段：98℃ 10s, 55℃ 30s, 40个循环。

信号采集：第二阶段55℃收集FAM和ROX信号。

（三）根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果

根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果：突变由FAM信号指示，内控由ROX信号指示，通过计算FAM信号与ROX信号的△Ct的大小来判断检测结果，△Ct =CT_FAM-CT_ROX，按以下标准进行结果判定：

灵敏度分析：取突变比例分别为100%，10%，1%，0.1%灵敏度参考品加入上述体系中进行扩增反应。结果表明，本发明的灵敏度可检测到0.1%，结果如图1。

实施例2：

运用本发明检测非小型细胞肺癌患者临床血浆样本15例，这些患者T790M突变类型经石蜡包埋肺癌组织检测已确定，具体步骤如下：

（一）游离DNA的提取

按照天根生化科技（北京）有限公司的血清/血浆游离DNA提取试剂盒的使用说明进行操作。

1. 取100 µl - 200 µl血清/血浆到2ml的离心管中，如不足100 µl，加缓冲液GA到100 µl终体积。2. 加入20 µl Proteinase K溶液，涡旋混匀。3. 加入200 µl的缓冲液GB（可加入1 µl Carrier RNA储存液，浓度为1 µg/µl），轻轻颠倒混匀，56℃孵育10 min，并不时摇动样品。4. 简短离心以去除管盖内壁的液滴。5. 加入200 µl的乙醇（96-100%）。如果室温超过25℃，请将乙醇置冰上预冷。轻轻颠倒混匀样品，室温放置5 min，简短离心以去除管盖内壁的液滴。6. 将上一步所得溶液添加到一个吸附柱CR2中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm(~13,400×g)离心30 sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。7. 向吸附柱CR2中加入500 µl缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm(~13,400×g)离心30 sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。8. 向吸附柱CR2中加入600 µl 漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇）12,000 rpm(~13,400×g)离心30 sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。重复操作步骤7。12,000 rpm (~13,400×g)离心2 min，倒掉废液。9. 将吸附柱CR2置于室温放置2-5 min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10.将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50 µl 洗脱缓冲液TB，室温放置2-5 min，12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min，将溶液收集到离心管中。

（二）建立QPCR扩增体系：

将阳性对照(T790M纯突变质粒)、阴性对照(超纯水)和步骤（一）提取的DNA样本分别加入上述试剂盒的检测体系中进行实时荧光定量PCR反应；收集FAM和ROX荧光信号；

反应条件为：

第一阶段：98℃ 2min;

第二阶段：98℃ 10s, 55℃ 30s, 40个循环。

信号采集：第二阶段55℃收集FAM和ROX信号。

（三）根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果

△Ct	结果判定
		△Ct≤5	强阳
5<△Ct<10	弱阳
		△Ct≥10或无值	阴性

结果见下表：

序列表

<110> 江苏医诺万细胞诊疗有限公司

<120> 一种用于检测外周血EGFR基因T790M突变的特异性引物和探针及试剂盒

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcacatccac agtgtagctc atatt 25

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcggctgcct cctggactat 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tccgggaaca caaagacaat tat 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agtacctgct caactggtgt gtg 23

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttccctgatt acctttgcga t 21

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcatcacgc agctca 16

Claims

1.一种用于检测外周血EGFR基因T790M突变的特异性引物及探针组合物，其特征在于，该组合物包括突变型检测正向引物、目的基因检测探针、内控检测正向引物、内控检测探针、共用反向引物和野生型特异性结合的PNA，所述突变型检测正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述的目的基因检测探针具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，所述内控检测正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述的内控检测探针具有如SEQ IDNO:4所示的核苷酸序列，所述共用反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述的野生型特异性结合的PNA具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的引物及探针组合物，其特征在于，所述目的基因检测探针的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团。

3.根据权利要求1所述的引物及探针组合物，其特征在于，所述内控检测探针的5’端标记ROX荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团。

4.根据权利要求1所述的引物及探针组合物，其特征在于，所述野生型特异性结合的PNA的 5’端进行NH₂修饰，3’端进行COOH修饰。

5.权利要求1~4中任意一所述的引物及探针组合物在检测外周血EGFR基因T790M突变或制备用于检测外周血EGFR基因T790M突变的试剂盒中的应用。

6.一种用于检测外周血EGFR基因T790M突变的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1~4中任意一所述的引物及探针组合物。

7.如根据权利要求6所述的用于检测外周血EGFR基因T790M突变的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中还包括10ÍX PCR缓冲液、无菌水、dNTP、MgCl₂和Ex Taq酶。

8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒的20ul检测体系为：

。

9.一种检测外周血EGFR基因T790M突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待检测外周血的DNA样本作为待检测样本；

（2）将阳性对照、阴性对照和步骤（1）提取的DNA样本分别加入权利要求6、7或8所述试剂盒的检测体系中进行实时荧光定量PCR反应；收集FAM和ROX荧光信号；

（3）检测结果判定：

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR反应程序如下：

第一阶段：98℃ 2min；

第二阶段：98℃ 10s，55℃ 30s, 40个循环；

信号采集：第二阶段55℃收集FAM和ROX信号。