KR20080028857A

KR20080028857A - ＥｒｂＢ 수용체 약물에 대한 환자반응을 예측 및 모니터링하는 방법

Info

Publication number: KR20080028857A
Application number: KR1020087005875A
Authority: KR
Inventors: 카주토 니시오; 히데하루 키무라; 카주오 카사하라
Original assignee: 아스트라제네카 유케이 리미티드; 내셔널 캔서 센터
Priority date: 2005-10-05
Filing date: 2005-10-20
Publication date: 2008-04-01
Also published as: BRPI0520530A2; CN101351563A; WO2007039705A1; EP1931798A1; ZA200802854B; NZ566387A; CA2624613A1; IL189705A0; AU2005337051A1; NO20081198L; US20080286785A1; TW200714716A; JP2009511008A

Abstract

본 발명은 (a)환자로부터 생체액 샘플을 제공하는 단계, (b)상기 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계, 및 (c)수용체 내의 타이로신 키나제 활성을 변경시키는 하나 또는 그 이상의 변이의 존재를 상기 DNA로부터 스크리닝하는 단계를 포함하는 하나 또는 그 이상의 ErbB 돌연변이를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

생체액, DNA, 추출, 수용체, 타이로신 키나제, 활성, ErbB, 돌연변이, 검출

Description

ＥｒｂＢ 수용체 약물에 대한 환자반응을 예측 및 모니터링 하는 방법{Method to predict or monitor the response of a patient to an ErbB receptor drug}

본 발명은 표피성장인자 수용체(EGFR)에 작용하는 예를 들면 gefitinib와 같은 ErbB 수용체 약물에 대한 환자의 반응을 예측하거나 모니터링 하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 혈청과 같은 생체액 내의 낮은 농도에서 발생하는 게놈DNA의 변이를 민감하게 선별적으로 스크리닝 할 수 있는 방법을 제공한다. 이 방법은 ErbB 타이로신 키나아제 수용체 활성을 증가시키는 것으로 알려진 돌연변이의 검출에 적합한 것으로 ErbB 수용체 약물처치에 반응하여 상관관계를 나타낸다.

ErbB 수용체는 세포의 생존과 증식을 컨트롤하는 시그널 경로를 조절하는 멤버인 TK 슈퍼패밀리에 속하는 단백질 타이로신 키나제(TKs)이다. ErbB 수용체 패밀리는 서로 밀접하게 연관된 4가지 서브타입으로 구성되어 있다. ErbB1(상피성장인 자수용체 [EGFR], ErbB2(HER2/neu), ErbB3(HER3), 및 ErbB4(HER4)로 구성되어 있다.(Cell.2000:103:211-225).

EGFR로부터 시그널은 예를 들면 표피성장인자(EGF)와 같은 성장인자의 결합에 의해 유발되고 이는 EGFR분자의 이량중합체화 또는 HER2/neu와 같은 다른 관련 수용체와 함께 헤테로 이량중합체화를 유발한다. 수용체의 타이로신 키나제 도메인을 통한 오토인산화 및 트랜스인산화는 다운스트림 인자의 보충과 증식의 활성화 및 세포생존 시그널의 보충을 야기한다(Exp.Cell.Res.2003;284:31-53). 돌연변이에 의해 과발현되거나 활성화될 때 ErbB수용체 타이로신 키나제는 유방암, 비-소세포 폐암(NSCLC), 직장암, 두경부암 및 다른 많은 고형종양의 증식을 유발한다(Exp.Cell.Res.2003;284:122-130). EGFR은 40~80%의 비-소세포 폐암과 많은 다른 상피세포암에서 과발현된다(N.Engl.J.Med.2004;350(21):2129-2139). 항암치료 방법이 이들의 활성을 저해하기 위해 유전자제품을 타겟으로 하여 고안되었다. gefitinib 약품은 예를 들면 ErbB1과 같은 타이로신 키나제 효소의 EGFR 패밀리의 잠재적 저해제이고, 이 약품은 치료하기 어렵고 재발이 쉬운 비-소세포 폐암의 치료를 위해 2002년 7월 5일 일본에서 승인되었다.

상기 처방약에 대한 환자들의 반응은 얼마나 잘 작용하는지(유효성)와 이에 대한 반대작용(부작용)으로 평가된다. gefitinib의 경우 환자들은 타이로신 키나제 저해 치료법에 대해 서로 다른 반응을 보였으며 약10%의 환자만이 급격하고 큰 임 상적 성공반응이 나타났다(N.Engl.J.Med.2004;350(21):2129-2139). 따라서 상기 의약품을 더욱 효과적으로 적용하기 위해서는 의약품을 투여하려는 환자에게 전처리 처치와 의약품을 투여한 후 후처리 처치를 요구한다.

비-소세포 폐암의 환자 중 일부가 gefitinib에 의해 타이로신 키나제 저해반응에 관련된 임상적 치료를 받았을 때 EGFR유전자의 특정변이가 나타남을 발견하였다(Science 2004;304:1497-1500). 이러한 돌연변이는 증가된 성장인자 시그널링을 야기하고 저해제에 대한 민감성을 부여한다(J.Clin.Oncol.23;2493-2501). 그러나 현재까지 신뢰할 수 있게 돌연변이를 측정할 수 있는 오직 한가지 방법은 환자로부터 종양 생검을 통해 샘플조직을 통해 분석하는 것이다. 이는 매우 어려운 절차이고 환자에게 불편할 뿐 아니라 때로는 종양조직을 생검할 수 없는 경우가 발생한다.

환자의 돌연변이를 스크리닝하는데 또 다른 문제는 다수의 야생형 유전자로부터 변이유전자를 검색하는 것의 어려움이다. 이는 또한 낮은 농도의 변이 DNA를 확인하는 것이 임상적으로 종양의 검색을 위해 매우 중요한 것이고 초기 단계의 발견을 통해 환자에게 적합한 치료방법을 제공할 수 있다(Clin Cancer Res.2004;10(7):2379-85). 따라서 ErbB 수용체 약물 투여 환자의 반응을 예견하고 모니터링 할 수 있는 더욱 신뢰적이고 위험성이 적은 방법의 개량이 요구되고 있으며 예를 들면 비록 많지 않은 환자들이라 할지라도 이들에게 더욱 효과적인 치료법 을 제공할 수 있게 된다.

발명의 요약

본 발명자들은 환자의 생체액 샘플 내에 ErbB 수용체 변이를 검출할 수 있는 신뢰할 수 있는 방법을 발견하였다. 이에 따라 ErbB 수용체 의약품으로부터 환자의 반응 또는 생존이익을 예측할 수 있게 되었다. 특히 ErbB 수용체의 타이로신 키나제 활성을 변경하는 돌연변이의 존재는 환자가 약물에 대해 양성적으로 반응함을 나타내며 반면 야생형 대립형질만이 존재시 환자는 ErbB 수용체 약물에 반응하지 않음을 나타내는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면에 따르면 본 발명은 (a)환자로부터 생체액 샘플을 제공하는 단계, (b)상기 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계, 및 (c)수용체내의 하나 또는 그 이상의 변이의 존재를 상기 DNA로부터 스크리닝하는 단계를 포함하는 ErbB 돌연변이를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 ErbB 변이를 검출하는 방법은 바람직하게는 상기 수용체내의 타이로신 키나제 활성을 변화시키는 ErbB 수용체의 하나 또는 그 이상의 변이를 검출하는 단계를 포함한다.

더욱 바람직하게는 상기 ErbB 수용체의 변이 검출방법은 EGFR을 검출하기 위한 것이다.

본 발명의 발명자들은 환자의 생체액 샘플내의 변이의 측정은 생체내에서 ErbB 수용체 약물의 효과를 예측하고 모티터링 할 수 있도록 사용됨을 발견하였다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면 본 발명은 (a)환자로부터 생체액 샘플을 제공하는 단계, (b)상기 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계, 및 (c)수용체내의 타이로신 키나제 활성을 변경하는 하나 또는 그 이상의 변이의 존재를 상기 DNA로부터 스크리닝하는 단계를 포함하는 ErbB 수용체 약물에 대한 환자의 반응을 예측하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면 본 발명은 (a)환자로부터 생체액 샘플을 제공하는 단계, (b)상기 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계, 및 (c)수용체내의 타이로신 키나제 활성을 변경하는 하나 또는 그 이상의 변이의 존재를 상기 DNA로부터 스크리닝하는 단계를 포함하는 ErbB 수용체 약물에 대한 환자의 반응을 모니터링하는 방법을 제공하는 것이다.

당업자에 의해 이해되는 바와 같이 ErbB 수용체 약물의 반응을 모니터링하는 것은 약물을 투여 받은 환자의 반응을 허용하는 것이다. 따라서 이는 환자에 대한 후-처치에 해당하는 것이다. 그러나 반응을 예견하는 것은 ErbB 수용체 약물에 누출되지 않은 환자의 상태를 통한 것으로 이는 전-처치에 해당하는 것이다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면 ErbB 수용체 약물을 투여하는 암환자의 반응을 예측하는 것은 환자의 생존이익을 예견한 것이다.

바람직하게는 상기한 ErbB 의약품의 반응을 예측하는 방법은 (d)오직 야생형 대립형질만이 검출된 환자에 있어서는 의약품이 양성적으로 반응하지 않음에 반해 변이형 및 야생형 모두가 검출된 환자는 ErbB 수용체 약물이 양성적으로 반응함을 결론짓는 단계를 더욱 포함하는 것이다.

본 발명의 또 다른 실시태양에서 단일염기 변이, 작은 프레임-내-결실 또는 염기치환을 검출하기 위해 대립형질 특이 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응의 사용을 통한 스크리닝 방법을 포함하는 것이다.

바람직하게는, 단일염기 변이, 작은 프레임-내-결실 또는 염기치환을 검출하기 위해 대립형질 특이 프라이머를 사용하여 실시간 중합효소 연쇄반응(실시간 -PCR)의 사용을 통한 스크리닝 방법을 포함하는 것이다.

본 발명의 또 다른 실시태양에서 상기 ErbB 의약품의 반응을 예측하는 방법 은 야생형 대립형질을 검출하기 위한 첫번째 프라이머쌍과 변이형질을 검출하기 위한 두 번째 프라이머쌍으로 구성되어 있고 각각의 프라이머쌍 중 하나의 프라이머는 (a)특정 변이에 특이한 대립형질을 지닌 터미널 3'뉴클레오티드를 포함한 프라이머, 및 (b)프라이머의 3'말단에 가능한 추가 미스매치로 구성되어 있다.

바람직하게는 각각의 쌍의 하나의 프라이머는 (a)프라이머 서열과 목적서열을 위한 특이한 추가서열을 지닌 단일분자 또는 핵산 듀플렉스 프로브 (b)단일분자 또는 핵산 듀플렉스 내의 퀀처(quencher)분자와 인접하는 프로브의 5'말단에 부착된 형광 레포터 염료 (c)상기 프로브의 한쪽 말단에 있는 하나 또는 그 이상의 비-코딩 뉴클레오티드 잔기 (d)목적서열의 증폭시 상기 레포터 염료와 퀀처분자는 서로 분리되는 특성을 지닌 것이다.

바람직하게는 프로브는 상품명 Scorpion 프로브이다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서 야생형 서열수준대비 약 10%의 변이서열이 존재함을 검출할 수 있는 기술을 제공하는 것이다. 더욱 바람직하게는 검출할 수 있는 변이서열은 야생형 서열대비 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.1%, 또는 0.01%의 변이를 검출할 수 있는 기술을 제공하는 것이다.

상기한 형광 프로브 시스템은 다른 시스템에 비해 신속하고 효과적인 검출 뿐아니라 증폭된 타켓에 결합할 수 있는 분리되지 않은 프로브의 장점을 지닌다. 본 발명은 EGFR변이의 검출을 위해 사용되는 방법의 민감성을 증진시키기 위한 ARMS 증폭시스템내의 상품명 Scorpion 프로브를 사용함을 특징으로 한다(실시예4를 보라).

본 방법에 기술된 생체액은 바람직하게는 혈액, 혈청, 혈장, 땀 또는 타액 중 하나이다. 가장 바람직하게는 생체액은 혈청이다.

EGFR 변이와 NSCLC 진전과의 관계를 규명한 종래의 연구들은 소급하는 방법으로 이루어져 치료시작 후에 종양샘플을 수술적으로 제거시킨 후 샘플내의 변이를 측정하는 것이었다. 그러나 이러한 방법은 초기단계의 환자의 경우 NSCLC 종양을 수술적으로 채취하기 어려울 뿐 아니라 처치 이전에 환자의 잠재적 선별을 위한 적절한 방법으로는 시도될 수 없었던 것이다.

그러나 본 발명은 종양 표본이 아닌 암환자의 샘플로부터 EGFR 변이를 검출하는 방법을 제공하는 것이다. 생체액의 채취는 암환자의 EGFR 변이를 분석하기 위한 종례의 방법에 비해 덜 위험하다. 종양 샘플의 채취에 반해 예를 들면 혈청 샘플은 더 쉽게 채취할 수 있으며 반복적으로 시험가능하다. 더욱이 종양세포는 순환시 DNA를 분비하는 것으로 알려져 있기 때문에 암환자의 혈청 DNA내의 변이와 미세한 변화를 검출하는 것은 혈청과 혈장을 이용하는 것이 더욱 바람직하다(Cancer Res.1999:59(1):67-70).

본 발명의 또다른 실시태양에서 ErbB 수용체 약물은 ErbB 수용체 타이로신 키나제 저해제이다. 바람직하게는 ErbB 수용체 약물은 EGFR 타이로신 키나제 저해제이다. 바람직한 방법으로 EGFR 타이로신 키나제 저해제는 gefitinib, erlotinib(Tarceva, OSI-774, CP-358774), PKI-166,EKB-569, HKI-272(WAY-177820), lapatinib(GW2016,GW-572016,GSK572016), canertinib(CI-1033,PD183805), AEE788, XL647, BMS 5599626, ZD6474(Zactima) 또는 WO2004/006846 또는 WO2003/082290에 게시되어 있는 화합물이다.

본 발명의 또 다른 실시태양에서 ErbB 수용체 약물은 EGFR 저해제이다. 바람직하게는 EGFR 저해제는 cetuximab(Erbitux, C225), matuzumab(EMD-72000), panitumumab(ABX-EGF/rHuMAb-EGFR), MR1-1, IMC-11F8 또는 EGFRL11에서 선택된 항-EGFR 항체를 지닌 것이다.

바람직하게는 ErbB 수용체 약물은 단일치료법 또는 다른 약물과 혼용하여 사용할 수 있다.

바람직한 실시태양에서 EGFR 타이로신 키나제 저해제 약물은 gefitinib, erlotinib(Tarceva, OSI-774,CP-358774), PKI-166,EKB-569, HKI-272(WAY-177820), lapatinib(GW2016,GW-572016, GSK572016), canertinib(CI-1033,PD183805), AEE788, XL647, BMS 5599626, ZD6474(Zactima) 또는 WO2004/006846 또는 WO2003/082290에 게시되어 있는 화합물이다.

본 발명의 변이는 핵산의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 발생한다. 변이는 ErbB 수용체의 타이로신 키나제 도메인 내에서 발생한다. 바람직하게는 변이는 EGFR의 타이로신 키나제 도메인 내에서 발생한다. 특히 변이는 표5에 나타난 EGFR의 변이 내에서 발생한다. 특히 변이는 ATP 결합부위 주변인 EGFR의 18, 19, 20 또는 21의 엑손 부위에서 발생한다. 변이는 표5에 나타난 EGFR의 변이 내에서 발생한다. 가장 바람직한 실시태양에서 변이는 EGFR의 엑손 19내에서 E746_A750del 또는 엑손 21의 L858R로 나타난다.

EGFR의 엑손 18~21내에 약 30개의 변이가 폐암세포 표본에서 검출되었다. 종양 표본 내에서 검출된 NSCLC 관련 EGFR 변이는 엑손 19의 15bp 크기의 뉴클레오티드 프레임에 결실(E746_A750del)과 엑손 21의 858번째 코돈인 루신이 알기닌으로 치환되는 점 돌연변이(L858R)이다. 약 90%의 변이가 이들 변이들이다(Cancer Res. 2004;64:8919- 8923, Proc. Natl. Acad. Sci USA 2004;101 :13306-13311).

환자들은 백혈병, 다발성 골수종 또는 림프종과 같은 비고형암 뿐만 아니라 예를 들면 담즙, 골수, 방광, 뇌/CNS, 신경교아종, 유방, 대장, 경추, 피부, 위장, 두경부, 간, 폐, 근육, 신경, 기생성, 난소, 췌장, 늑막/복막, 전립선, 신장, 피부, 고환, 갑상선, 자궁 및 질 종양 등의 고형암 환자를 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시태양은 (e)ErbB 수용체의 하부 시그널링 경로내의 성분에서 하나 또는 그 이상의 변이를 지닌 DNA를 스크리닝하는 단계를 더욱 포함하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 두 번째 측면은 야생형 대립형질을 검출하기 위해 사용되는 첫 번째 프라이머쌍과 ErbB 수용체 변이 대립형질을 검출하기 위해 사용되는 두 번째 프라이머쌍으로 구성된 조성물에 있어서, 상기 프라이머쌍의 하나의 프라이머는 (a)특정 변이의 특이한 대립형질을 지닌 3'말단 뉴클레오티드를 지닌 프라이머 (b)프라이머의 3'말단에 추가적으로 미스매치 될 수 있는 가능성 (c)프라이머 서열과 목적 서열을 위한 추가적 특이 서열을 모두 포함하는 단일 분자 또는 핵산 듀플렉스 프로브 (d)단일분자 또는 핵산 듀플렉스 내의 퀀처(quencher)분자와 인접하는 프로브의 5'말단에 부착된 형광 레포터 염료 (e)상기 프로브의 한쪽 말단에 있는 하나 또는 그 이상의 비-코딩 뉴클레오티드 잔기 (f)목적 서열의 증폭시 상기 레포터 염료와 퀀처 분자는 서로 분리되는 특성을 지닌 것이다.

본 발명의 세 번째 측면은 ErbB 약물에 대한 환자의 반응을 예측하기 위한 생체액으로 수행되는 에세이내의 ErbB 수용체 특이 프라이머의 사용 방법을 제공하 는 것이다.

바람직하게는 상기 기재된 사용방법은 ErbB 약물에 대한 환자의 반응을 예측하기 위한 생체액의 시험을 위한 조성물의 제조방법을 포함한다.

바람직하게는 상기 기재된 사용방법은 (a)샘플로부터 DNA를 추출하는 단계 (b)수용체내의 타이로신 키나제 활성을 변경하는 하나 또는 그 이상의 DNA 변이의 존재를 스크리닝하는 단계를 더욱 포함하는 방법을 제공하는 것이다.

특별히 달리 정의하지 않으면 본 명세서에 사용되는 과학적 용어는 당업자간에 일반적으로 통용되는 것과 동일한 의미를 지닌다(예를 들면, 세포배양, 분자유전학, 핵산화학, 혼성화 기술 및 생화학 등이다). 분자 유전학 및 생화학적 방법에 관한 표준 기술은 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc.; Guthrie et al., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Vol. 194, Academic Press, Inc., (1991); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, Calif.); McPherson et al., PCR Volume 1 N. Y.; Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed.; E. J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N. J.에 기재된 사항을 참조하시오. 또한 다음 문헌 등은 본 발명에 참고문헌으로 사용된 것이다. Oxford University Press, (1991), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2nd Ed. (R. I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, N. Y.) 및 Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E. J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N. J.등이다.

바이오마커

다양한 생물학적 표지가 의학 및 독물학의 생화학적 분자생물학적 적용을 위해 확인되고 연구되었다. 조직 및 생체액에서 바이오마커를 검출할 수 있으나 혈액은 바이오마커 연구에 사용되는 가장 보편적인 생체액이다(Proteomics 2000;1 :1-13, Physiol. 2005;563:23-60).

바이오마커는 정상적 생물학적 과정, 병리학적 과정 또는 치료제 투여에 대한 약리학적 반응을 측정하는 지표로서 객관적으로 측정되고 평가될 수 있는 것으로 설명된다. 바이오마커의 존재 또는 수준이 어떤 측면에서 질병 또는 그 상태와 밀접한 관련이 있는 것으로 특정 조건 하에 측정하는 지표로서 확인할 수 있는 것이다. 이때 바이오마커의 존재 또는 수준 또는 수준의 변화를 통해 질병의 상태 또는 그 질병을 치료하기 위해 사용되는 약물의 반응에 대한 민감성 또는 그 형태 등을 나타내는 것이다. 이때 바이오마커와 상태간에 상호관련성은 정성적, 정량적 또는 정량 정성적으로 측정할 수 있다. 일반적인 바이오마커는 화합물, 화합물의 일부 또는 일군의 화합물이다. 이러한 화합물은 생물체 내에서 단백질, 펩타이드, 핵산 또는 다른 화합물로서 생성되고 검출될 수 있다.

바이오마커는 예측할 수 있는 능력을 부여하고 예를 들면 질병의 특정 상태, 형태, 수준 및 존재를 예측하거나 측정할 수 있도록 고안된 것이다. 이때 특정 미생물체 또는 독소 등의 수준을 통해서도 측정할 수 있다. 또한 특정 질병의 상태 에 대한 감수성 예를 들면 유전학적 감수성을 측정하거나 특정 치료법 예를 들면 약물치료에 대한 반응을 측정할 수 있다. 미래의 의약품 발견 및 개발에 바이오마커의 중요성이 연구개발 계획의 더욱 효율적 수행을 위해 더욱 증대되고 있다. 바이오마커는 진단제, 질병의 진전 또는 모니터링, 임상 결과의 예측과 치료의 모니터링 등에 사용될 수 있다. 예를 들면 특정 암, 특정 심혈관 질환 및 면역학적 질환의 확인을 위한 다양한 바이오마커 연구가 시도되고 있다.

본 발명에 사용되는 용어 'ErbB 수용체 약물'은 EGFR, ErbB2 (HER), ErbB3 및 ErbB4을 포함하는 타이로신 키나제 수용체의 ErbB 패밀리에 작용하는 약물을 의미하는 것이다. 하나의 실시태양에서 ErbB 수용체 약물은 ErbB 수용체 타이로신 키나제 저해제이다. 또 다른 실시태양에서 ErbB 수용체 약물은 EGFR 타이로신 키나제 저해제이다. EGF 수용체 타이로신 키나제 저해제의 예를 들면 gefitinib, Erlotinib (OSI-774, CP-358774), PKM 66, EKB-569, HKI-272 (W AY- 177820), lapatinib (GW2016, GW-572016), canertinib (CM 033, PD183805), AEE788, XL647, BMS 5599626 등을 들 수 있으며 또한 WO2004/006846, WO2003/082831 또는 WO2003/082290에 개시된 화합물 등이나 이에 한정하는 것은 아니다. 특히 gefitinib (Iressa™으로 알려진 코드번호 ZD1839호 및 Chemical Abstracts Registry Number 184475-35-2)는 국제 특허 공개 WO 96/33980으로 공지되어 있으며 이는 ErbBl과 같은 타이로신 키나제 효소의 표피성장인자 수용체(EGFR) 패밀리의 잠재적 저해제이다.

본 발명의 실시태양에서 ErbB 수용체 약물은 예를 들면 cetuximab (C225), matuzumab (EMD-72000), panitumumab (ABX-EGF/ rHuMAb-EGFr), MR1 -1 , IMC-11 F8 또는 EGFRL11와 같은 항-EGFR 항체인 것이다. ErbB 수용체 약물은 본 발명에서 단일 치료법 또는 이와 동일하거나 다른 종류의 의약품과 함께 투여하여 사용할 수 있다. 특히 EGF 수용체 타이로신 키나제 저해제는 gefitinib이다.

'생존'은 환자에 있어서 '전체생존'과 '진행 없는 생존'을 포함하는 것으로 전체생존(OS)은 gefitinib 투여 이후 사망까지의 기간을 의미하는 것이다. 한편 진행 없는 생존은 gefitinib 투여 이후 병의 새로운 진전 또는 사망까지의 기간을 나타내는 것이다.

'반응'은 Response Evaluation Criteria in Solid Tumours (RECIST)에 기재된 방법에 따라 측정되는 것이며 환자를 2개의 군으로 나누어 분류하고 이는 안정한 질병에 부분적 반응을 보이는 그룹과 진전된 질병의 징후를 보이는 그룹이다.

'증폭'은 핵산 내의 목적 핵산 부위를 특이적으로 증폭시키는 핵산 반응을 의미한다. 중합효소 연쇄반응(PCR)이 대표적인 증폭반응이다.

'암'은 악성 신생물로 세포의 변형을 야기하는 악성 신생물의 증식을 의미하는 것이다. 이러한 세포변형은 유전적 변이를 포함하고 본 발명에 있어서는 이러한 변형은 여기에 기술된 Erb 유전자 하나 또는 그 이상의 변형에 따른 유전자 변이를 포함한다.

'프로브'는 단일 스트랜드 서열-특이 올리고 뉴클레오타이드로서 검출하고자 하는 대립형질의 목적 서열에 상보적인 서열을 의미한다.

'프라이머'는 단일 스트랜드 DNA 올리고 뉴클레오타이드 서열 또는 증폭하려고 하는 핵산 스트랜드에 상보적인 프라이머 연장 생성물의 초기 합성부분으로 작용할 수 있는 특정 프라이머를 의미한다. 프라이머의 길이와 서열은 연장 생성물의 합성이 시작될 수 있는 부분을 지닌 것이다.

본 발명은 ErbB 핵산 변이를 기술한다. 'ErbB 수용체 변이'라는 용어는 타이로신 키나제 수용체의 ErbB 패밀리의 어느 멤버를 코드화 할 수 있는 핵산을 나타내는 것으로 사용된다. 'ErbB 수용체'라는 용어는 알려진 모든 인간 ErbB 수용체의 동족체, 변이체 뿐만 아니라 ErbB 수용체 동족체로 간주되기에 충분한 상동성을 지닌 ErbB 수용체 패밀리 멤버를 나타낸다. 바람직하게는 서열번호 1로 알려진 EGFR 서열을 지닌 핵산을 의미한다.

'핵산'은 모든 폴리뉴클레오티드를 포함하고 엄격한 조건하에서 혼성화 될 수 있는 것으로 천연에서 존재하는 핵산 또는 그의 상보체 등이다. 이때 '엄격한 혼성화 조건'은 다음과 같은 것을 의미한다. 50% 포름아마이드를 포함하는 용액으로 42℃에서 하룻밤 배양시키고 5x SSC (750 mM NaCI, 75 mM 트리소디움 사이트레이트), 50 mM 인산나트륨(pH 7.6), 5x Denhardt's solution, 10% 덱스트란 설페이트 및 20 pg/ml 변성, sheared 연어 정자 DNA 조건 하에서 약 65℃에서 0.1 x SSC로 세척하는 조건이다.

핵산을 검출하기 위한 방법

본 발명에서 의약품 처치 후 반응을 예측하기 위해 ErbB 수용체를 코드화하는 변이 핵산의 검출방법이 사용되었다. ErbB 수용체 유전자의 변이는 DNA 레벨에서 발생하기 때문에 본 발명은 게놈 DNA 및 이들의 전사체와 단백질 등을 검출하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 변이가 실제로 개체 내에서 발현되었는지를 확인하기 위하여 게놈 DNA의 변이는 이의 전사체 또는 폴리펩타이드를 사용하여 확인하는 것이 바람직하다.

게놈 핵산의 변이는 증폭된 핵산의 단편내의 이동성 쉬프트에 근거한 기술로 검색하는 것이 유용하다. 예를 들면 Chen et a/., Anal Biochem 1996 JuI 15;239(1 ):61-9 에는 경쟁적 이동성 쉬프트 에세이에 의해 단일 염기의 변이를 검출하는 방법이 게시되어 있다. 또한 Marcelino et ai., BioTechniques 26(6): 1134-1148 (June 1999)에 기재된 방법은 상업적으로 적용 가능한 바람직한 방법으로 모세관 헤테로듀플렉스 분석법이 미스매치된 염기의 존재 결과에 따라 이동성 쉬프트 방법으로 모세관 내에서 듀플렉스 핵산을 통해 변이를 측정하는 것이 게시되어 있다.

시료의 분석을 통한 핵산의 일반화를 위해서는 핵산의 증폭이 요구된다. 많은 증폭방법은 효소연쇄반응이며 예를 들면 중합효소 연쇄반응, 리가제 연쇄반응 또는 셀프-서스테인드(self-sustained) 시퀀스 전사 반응 등이다. 또는 염색체의 일부를 클론화하여 벡터에 전사시키는 방법 등이다. 바람직하게는 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭하는 것이 바람직하다.

많은 목적물질을 증폭시키는 방법이 문헌에 나타나 있으며 일반적인 방법의 예를 들면 Landegren, U., et al., Science 242:229- 237 (1988) and Lewis, R., Genetic Engineering News 10:1 , 54-55 (1990)에 게시되어 있다. 이 증폭방법은 본 발명에 사용할 수 있고 중합효소 연쇄반응(PCR)을 포함하고, PCR in situ, 리가제 증폭반응(LAR), 리가제 혼성화, Qbeta 박테리오파지 리플리카제, 전사기반 증폭시스템(TAS), 시퀀싱 전사를 통한 게놈 증폭(GAWTS), 핵산서열 기반 증폭 (NASBA) 및 in situ 혼성화 등이 사용될 수 있다. 다양한 증폭기술에 사용하는 프라이머는 통상의 방법에 따라 제작된다.

중합효소 연쇄반응(PCR)

PCR은 미국 특허 제 4,683,195호 및 미국 특허 제4,683,202호에 등록되어 있는 핵산 증폭방법이다. PCR은 프라이머 연장 반응에 근거하여 DNA 중합효소의 반복적인 사이클링을 통해 구성된다. 목적 DNA는 가열하여 변성되고 목적서열의 DNA를 증폭시키기 위한 2개의 올리고 뉴클레오티드를 통해 혼성화 시키는 것이다. 이 올리고 뉴클레오티드는 DNA 중합효소의 프라이머가 된다. DNA는 프라이머 연장을 통해 복제된다. 열변성 사이클을 반복함에 따라 프라이머 혼성화와 연장에 따라 목적 DNA는 2~4시간 동안에 백만 배 이상 증폭될 수 있다. PCR은 분자생물학에 매우 유용한 도구이며 증폭의 결과를 결정하는 기술과 결합하여 사용할 수 있다. PCR의 장점은 목적 DNA의 양을 백만 배 내지 십억 배로 약 4시간 이내에 증폭시킴으로써 민감성을 증진시킬 수 있는 것이다. PCR은 진단 방법에 관한 책에서 이미 알려진 핵산증폭 기술이다(Mok et al., (1994), Gynaecologic Oncology, 52: 247-252).

셀프-서스테인드 서열전사(3SR)

셀프-서스테인드 서열전사(3SR)은 TAS의 변이이며 이는 핵산 주형의 등온 증폭을 포함하는 것이다. 이는 역전사효소(RT)의 시퀀셜라운드(sequential rounds), 중합효소와 뉴클레아제 활성을 이용하여 적절한 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 통해 작동된다(Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874). RNA/DNA 헤테로듀플렉스의 RNA를 효소 퇴화시켜 열변성 대신 사용한다. RNase H와 다른 효소를 반응에 첨가시키고 모든 단계는 추가 시약 첨가없이 동일한 온도에서 이루어진다. 이 방법에 따르면 42℃에서 한시간 동안 10⁶ 내지 10⁹의 증폭이 가능하다.

리게이션 증폭(LAR/LAS)

리게이션 증폭반응 또는 리게이션 증폭 시스템은 DNA 리가제와 4개의 올리고 뉴클레오티드, 2개의 목적 스트랜드를 사용한다. 이 방법은 Wu, D. Y. and Wallace, R. B. (1989) Genomics 4:560에 게시되어 있으며 올리고 뉴클리오티드는 목적 DNA의 인접 서열에 혼성화되고 리가제에 의해 결합된다. 이 반응은 열변성과 싸이클 반복을 요구한다.

Qβ리플리카제

이 방법에 있어서 박테이오파지Qβ의 RNA 리플리카제는 단일 스트랜드 RNA를 복제하고 이는 Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197에 게시된 바와 같이 목적 DNA를 증폭하기 위해 사용된다. 첫 번째로 목적 DNA는 T7 프로모터와 Qβ 5' 서열 영역을 포함하는 프라이머에 의해 혼성화된다. 이 프라이머를 이용하여 역전사효소는 그 과정 중에 5'말단에 프라이머와 cDNA를 서로 연결할 수 있도록 작용시킨다. 얻어진 헤테로듀플렉스 열변성된다. 다음에 Qβ 3'서열 영역을 포함하는 두 번째 프라이머는 cDNA 합성의 두 번째 단계를 시작한다. 이는 Qβ박테이오파지의 5' 및 3'말단 뿐 만 아니라 활성 T7 RNA 중합효소 결합부위를 지닌 이중가닥 DNA를 수득되게 한다. R7 RNA 중합효소는 이중가닥 DNA를 새로운 RNA로 전사시키며 이는 Qβ의 유사체이다. 세척 및 비혼성화 프로브를 제거시킨 후 새로운 RNA를 목적물로부터 용출시키고 이는 Qβ리플리카제에 의해 복제된다. 이 반응은 약 20분 동안에 10⁷배의 증폭이 가능하다.

또 다른 증폭기술이 본 발명에서 적용될 수 있다. 예를 들면 롤링써클 증폭(Lizardi et a/., (1998) Nat Genet 19:225)이 RCAT™으로 상업화 된 키트를 이용하여 증폭가능하고 이때 DNA 중합효소에 의해 유도되며 순환 올리고뉴클레오티드 프로브가 등온 조건하에서 선형 또는 지오메트리 카이네틱스에 의해 복제될 수 있다.

적절하게 고안된 2개의 프라이머의 존재시 지오메트리 증폭이 DNA 스트랜드 배치 및 하이퍼브랜칭을 통해 발생하고 한시간 내에 10¹² 또는 그 이상의 증폭이 가능하다.

만약 단일 프라이머가 사용된다면 RCAT는 수 분내에 수천개의 중복적으로 링크된 목적 DNA 카피의 선형 체인을 생성할 수 있다.

또 다른 기술로는 스트랜드 디스플레이스먼트 증폭(SDA; Walker et al., (1992) PNAS (USA) 80:392)이 사용될 수 있으며 이는 특정 목적물에 유일하게 한정된 서열이 증폭되는 것이다. 열 싸이클링에 의존하는 다른 기술과는 달리 SDA는 일련의 프라이머를 사용하는 등온 반응이다. DNA 중합효소와 제한효소는 특정 핵산 서열을 대수적으로 증폭시킨다.

SDA는 목적 생성 페이즈와 대수 증폭 페이즈로 구성되어 있다.

목적 생성에서는 이중가닥 DNA가 열변성되어 2개의 단일가닥 카피로 전환된다. 일련의 특정하게 제조된 프라이머는 DNA 중합효소와 결합한다. 이때 염기서열의 복사를 위해 프라이머를 증폭시키고 범퍼 프라이머가 새로 생성된 가닥을 배위시킨다. 그 후 목적물은 대수증폭이 가능한 형태로 전환되고 대수증폭 반응은 변경된 목적물(단일가닥 부분 DNA 스트랜드와 제한효소 인식부위)을 통해 시작된다.

증폭 프라이머는 각각의 상보적 DNA 서열의 각각의 스트랜드에 결합되어 있다. DNA 중합효소는 3'말단으로부터 프라이머를 연장하기 위한 위치를 확인하기 위해 사용하며 각각의 뉴클레오티드를 첨가하기 위해 주형으로서 변경된 목적물을 사용한다. 연장된 프라이머는 각각의 말단에 제한효소 인식부위를 지닌 이중가닥 DNA 세그먼트를 형성하게 한다.

제한효소는 그 인식 부위에 이중가닥 DNA 세그먼트를 결합시킨다. 제한효소는 이중말단 세그먼트의 오직 하나의 가닥을 절단시킨 후에 인식 부위로부터 분리되어 닉(nick)을 형성한다. DNA 중합효소는 닉을 인식하고 이미 전에 생성된 가닥을 배위시켜 부위로부터 스트랜드를 연장시킨다. 인식 부위는 반복적으로 닉되고 제한효소에 의해 복원된다. DNA 폴리머라제는 목적 세그먼트를 포함하는 DNA 스트랜드의 연속적 배위를 가능하게 한다.

각각의 배위되는 가닥은 상기 프라이머를 이용하여 증폭시키기 위해 어닐링된다. 이 과정은 반복되고 닉킹, 연장 및 새로운 DNA 가닥의 배위가 반복됨에 따라 원래 DNA 목적물은 대수적으로 증폭된다.

핵산이 증폭된 후에 단일 염기 변이를 검출하기 위한 다양한 기법들이 가능하다. 그 중 하나는 Single Stranded Conformational Polymorphism (SSCP)이다. SSCP 검출법은 전기영동을 통해 대조 DNA와 비교하여 단일 가닥 변이 DNA의 변종을 검출하는 방법이다. 변이는 단일 가닥 DNA의 컨포메이션 변화에 의해 유발되고 이는 모빌리티 쉬프트를 변화시킨다. 형광 SSCP는 프라이머에 형광 표지를 부착하여 사용한다. 대조와 변이 DNA는 형광 표지된 프라이머를 사용하여 증폭된다. 증폭된 DNA는 변성되고 단일 가닥 DNA 분자를 생성하기 위해 냉각되며 이는 비-변성겔전기영동법에 의해 측정된다.

화학적 미스매치 절단(CMC)은 하이드록시아민, 오스미움테트로옥사이드 및 피페리딘의 결합을 통한 DNA 미스매치 염기쌍을 절단하고 인식하는 것에 근거한다. 그러므로 대조 DNA와 변이 DNA는 형광 표지 프라이머와 함께 증폭된다. 증폭물은 혼성화되고 미스매치된 T 염기는 오스미움테트로옥사이드와 결합되며, 미스매치된 C 염기는 하이드록시아민과 결합되고 피페리딘은 변이 염기의 부위를 절단시킨다. 절단된 단편은 전기영동을 통해 검출할 수 있다.

제한 단편 폴리모르피즘에 근거한 기술(RFLPs)이 사용될 수 있다. 다수의 단일 뉴클레오티드 폴리모르피즘(SNPs)는 통상적인 RFLP 분석을 사용할 수 없지만 프라이머-유도 제한 분석 PCR(PIRA-PCR)은 SNP 의존적 방법으로 PCR 프라이머를 이용하여 제한부위에 도입될 수 있다. PIRA-PCR에 사용되는 프라이머는 적당한 제한부위를 도입한 것으로 분석에 사용할 수 있도록 고안된 것이다. 예를 들면 Xiaiyi eif a/., (2001) Bioinformatics 17:838-839에 기재된 사항을 참조하시오.

또한 WAVE 분석에 근거한 기법이 사용될 수 있다(Methods MoI. Med. 2004; 108: 173-88). DNA 단편 부석 시스템은 단일 뉴클레오티드 폴리몰피즘의 검출을 위해 사용될 수 있으며 온도-조절 액체 크로마토그래피와 고성능 매트릭스를 통하여 검출할 수 있다(Genet Test. 1997-98;1 (3):201-6).

실시간 PCR 즉 정량적 PCR, 실시간 정량적 PCR 또는 RTQ-PCR로 알려진 방법이 DNA 증폭과 정량화를 동시에 달성할 수 있다(Expert Rev. MoI. Diagn. 2005(2):209-19). DNA는 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭된다. 증폭의 각각의 라운드 이후에는 DNA가 정량 될 수 있다. 정량을 위한 일반적인 방법은 이중 가닥 DNA와 인터칼레이트되는 형광 염료를 사용하는 방법이다. 또한 변이 DNA 올리고 뉴클레오타이드(프로브로 불림)가 상부적 DNA와 혼성화시 형광 발색된다.

Scorpion® 프라이머로 알려진 특정 프라이머가 신속한 DNA 증폭 시스템에 매우 유용하게 사용될 수 있다. 이 프라이머는 단일 분자내에 특정 목적 서열을 지닌 프로브와 결합되어 있다. 또한 단일 분자 카이네틱스로 형광 검출 시스템에서 사용 가능하다(Nucl. Acids Res. 2000;28:3752-3761 ). 이는 Molecular Beacons and TaqMan®과 같은 다른 형광 프로브 시스템에 비해 많은 장점을 지니고 증폭된 목적물과 결합된 프로브의 분리를 요구하지 않으며 매우 신속하고 효율적으로 검출 할 수 있다. 다른 검출 방법과 비교하여 Scorpion®은 보다 우수한 분자간 프로브 시스템을 수행할 수 있다(Nucl. Acids Res 2000;28:3752-3761). 특히 빠른 싸이클링 조건하에서 유용하다. Scorpion® 프라이머의 하나의 구조 형태는 목적 프로브 서열 측면에 6 염기 주위에는 상보적 스템 서열로 된 헤어핀 루프 컴포메이션을 지니고 있는 형상이다(Nat. Biotechnol. 1999;17:804-807). 스템은 형광 레포터 염료(5'말단에 부착된)와 함께 위치를 제공하며 이는 퀀처 분자와 매우 근접하게 위치해 있다. 이러한 컴포메이션 내에서 아무런 시그널도 생성되지 않는다. PCR-블로커는 3'말단 Scorpion® 형상을 형성하기 위해 프라이머 서열로부터 헤어핀 루프를 분리시킨다. 블로커는 특정한 목표물의 부재시 헤어핀 루프의 펼침(unfolding)을 유도한다. PCR 동안에 프라이머로부터 통상적인 연장이 발생한다. 이어서 변성과 어닐링 단계를 거쳐 헤어핀 루프는 펼쳐진다. 만약 정확한 목적물질이 증폭된다면 프로브 서열은 새로 합성된 스트랜드에 다운스트림내에 프라이머의 특정 타겟 서열과 결합한다. 이 새로운 구조는 종래의 헤어핀 루프보다 열적으로 더욱 안정한 것이다. 형광 시그널은 발생되고 이는 형광 염료가 더 이상 퀀처와 근접하지 않기 때문이다. 형광 시그널은 목적 DNA의 양에 비례하여 발생한다.

한편 또다른 Scorpion® 프라이머는 2개의 상보적 표지 올리고뉴클레오티드의 듀플렉스를 포함한다. 듀플렉스의 하나의 올리고뉴클레오티드는 5'말단 레포터 염료로 표지되어 있고 블로커 논코딩 뉴클레오티드와 PCR 프라임 엘레멘트와 함께 움직인다. 반면 다른 뉴클레오티드는 3'말단의 퀀처 염료가 표지되어 있다. 이 반응의 메카니즘은 Scorpion® 헤어핀 프라이머와 기본적으로 동일한 것이다. 실시간 정량적 PCR 동안에 5'말단의 레포터와 3'말단 퀀처 염료는 서로 분리되고 이에 따라 형광 발상이 크게 증가한다.

Scorpion®은 Amplification Refractory Mutation System(ARMS)와 결합하여 사용할 수 있다(Nucl. Acids Res. 1989;17:2503-2516, Nat. Biotechnol. 1999;17:804- 807). 이는 단일 염기 변이가 검출 가능하게 한다. 적절한 PCR 조건하에서 3'말단 프라이머에 위치한 단일 염기 미스매치는 완전한 매치된 대립형질의 증폭에 충분하다(Newton et al., 1989). 이는 매우 관련된 종 속에서 오류를 유발한다. 상기한 프라이머를 이용한 증폭 시스템의 근거로는 3'잔기의 미스캐치된 올리고 뉴클레오티드는 적절한 PCR 조건 하에서 프라이머로 작용하지 않는 것이다. 증폭 시스템은 아가로즈겔 전기영동 후에 반응 혼합물의 검사시 제노 타입만이 검출되게 할 것이다. 로커스 내의 헤테로 자이고트와 각각의 대립형질의 호모 자이고트 간에는 명백하게 구별할 수 있는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법이다. ARMS는 제한효소 분해, 대립형질 특이 올리고 뉴클레오티드 또는 PCR 생성물의 서열분석과 같은 단계를 요구하지 않는다.

도 1은 EGFR Scorpion 키트를 사용하여 E746_A750del 및 L858R 변이를 측정하기 위한 민감도를 나타낸 것이다. (a)10,000 pg (10⁴), 1 ,000 pg (10³), 100 pg (10²), 10 pg (10¹) 및 1 pg (10⁰)의 다양한 부피의 표준 DNA와 E746_A750del이 사용되었다. 야생형 표준 DNA와 증류수(D.W.)가 음성 대조군으로 본 시험에 사용되었다. (b) E746_A750del이 다양한 농도로 사용되었다. 1 pg 내지 10,000 pg 농도의 E746_A750del이 야생형 DNA 표준품 10,000 pg과 1 :1 (10⁰), 1 :10 (10^-1), 1 :100 (10^-2), 1 :1 ,000 (10^-3) 및 1 :10,000 (10^-4)의 비율로 혼합되었다. (c)첫 번째 곡선과 두 번째 유도 곡선은 10,000 pg의 부피에서 E746_A750del과 DNA 표준품을 나타내는 곡선이다. 두 번째 유도 곡선은 성장커브의 기울기에 따른 변화율을 나타낸다. threshold 사이클은 두 번째 유도 곡선의 최고점에서 사이클의 수를 정의한다(도1c의 수직선). (d) 각각의 커브의 Ct를 플로팅하여 표준 DNA 부피의 로그함수로써 표준 곡선을 유도하였다(도1 A 및 1 B 참조).

도 2는 폐암 세포주의 게놈 DNA내 E746_A750del의 검출결과를 나타낸 것이 다. (a)E746_A750del을 지닌 PC-9 세포주와 A431을 지닌 야생형을 나타낸다. (b)L858R을 지닌 11_18 세포주와 A431을 지닌 야생형을 나타낸다.

도 3은 진전없는 생존(A)과 전체의 생존(B)을 비-소세포폐암에서 EGFR 변이 상태에 따른 경과를 나타낸 것이다.

(실시예 1) 임상시험 및 혈청 샘플의 채취

본 발명의 gefitinib의 단일 투여 치료법의 임상 2단계에서 함께 수행된 것이다. 본 발명은 인체를 대상으로 하는 바이오 메디컬 연구의 헬싱키 선언의 권고사항에 의해 윤리적으로 적합한 심사와 승인을 거쳐 수행된 것이다. 비-소세포폐암(NSCLC)의 ⅢB기 Ⅳ기 환자를 대상으로 조직학적 또는 세포학적으로 일본에서 수행되었다. gefitinib는 모든 환자들에게 1일 250mg 용량으로 경구 투여되었다. 약효는 "Response Evaluation Criteria in Solid Tumours (RECIST)" guidelines에 의해 측정되었다(J. Natl. Cancer Inst. 2000;92:205-216).

28명의 환자가 2002년 10월 23일부터 2003년 8월 3일 사이에 등록되었다(표1). 모든 환자는 반응을 측정하였고 전체 생존(overall survival)과 진행 없는 생 존(progression free survival)을 측정하였다. 27명의 환자로부터 혈액 샘플 2ml가 gefitinib 투여 이전에 채취되었다. 혈청 DNA를 27명의 샘플로부터 추출하였으며 그 농도는 최대 1720 ng/ml이었다.

샘플 채취 및 DNA 추출

26명의 NSCLC 환자로부터 gefitinib 투여 이전에 채취하였다. 분리된 혈청은 -80℃에서 사용시까지 보관하였다. 혈청 DNA를 추출하였고 Qiamp Blood Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 정제하고 프로토콜에 따라 변형하였다.모든 샘플이 처리될 때까지 반복적으로 컬럼을 수행하였다. 얻어진 DNA는 멸균 증류수 완충액 50㎕로 용출시켰다. 추출된 DNA의 농도와 순도는 스펙트로포토미터를 이용하여 결정하였다. 추출된 DNA는 사용시까지 -20℃에서 보관하였다.

(실시예 2) Scorpion 프라이머의 사용 및 증폭 저항 변이 시스템(ARMS)을 이용한 EGFR 변이내의 E746_A750del 및 L858R 변이의 검출

EGFR Scorpion ^TM 키트의 감수성

EGFR Scorpion 키트의 감수성을 측정하기 위한 준비 실험이 수행되었다(도 1). 1 pg 내지 10,000 pg의 부피의 E746_A750del 스트랜드 DNA를 사용하여 측정된 곡선는 모두 45 싸이클까지 증가되었다(도 1a). 야생형 표준 DNA와 물이 음성 대조군으로 사용되었을 때 곡선은 증가하지 않았으며 50 싸이클에 도달할 때까지 편평하게 유지되었다(도 1a). 희석된 E746_A750del 표준 DNA를 사용하여 야생형 표준 DNA와 10⁰ 내지 10^-5 비율로 혼합시켰을 때 E746_A750del 존재시 45 싸이클에 이를 때 곡선을 증가하였다(도 1b). 측정된 부피 내에서 표준 곡선은 선형이었으며 0.997과 0.987의 r² 수치를 나타내었다. 곡선의 기울기는 모두 평행하였다(도 1c). 희석된 E746_A750del 표준 DNA와 야생형 DNA의 Ct는 모든 부피의 E746_A750del 표준 DNA 부피에서 매우 근접하였다. 비록 희석된 E746_A750del 표준 DNA와 야생형 DNA의 형광 피크 수준은 야생형 DNA 표준을 첨가하지 않은 경우보다 10^-3보다 낮은 정도로 낮았으나 E746_A750del의 존재를 명확하게 검출할 수 있었다. 1pg까지의 양에서 E746_A750del을 포함한 DNA의 커브는 야생형 EGFR DNA의 인터퓨젼에 의해 영향 받지 않았다. 인간 암세포주의 게놈 DNA를 이용한 세포단위 실험에서 PC-9 세포로부터 유래된 DNA 시그널이 검출되었고 A431 세포로부터는 예측한 시그널이 검출되지 않았다(도 2).

실시간 PCR 반응을 통한 변이를 검출하기 위하여 ARMS^TM 와 Scorpion^TM로 불리는 두가지 기술을 EGFR Scorpion^TMKit (DxS Ltd, Manchester, UK)에 적용하여 사 용하였다. E746_A750del, L858R와 엑손 19 및 엑손 21의 야생형을 검출하기 위한 4가지 scorpion 프라이머가 사용되었으며 DxS Ltd (Manchester, UK)에 의해 합성되었다. E746_A750 del 및 L858R의 scorpion 프라이머 서열은 젠뱅크에 기탁된 EGFR (접근 번호: AY588246)를 기초로 하여 수행하였다. 1μl의 주형 DNA, 7.5μl의 반응 완충액 혼합물, 0.6ml의 프라이머 혼합물과 0.1ml의 Taq 중합효소를 사용하여 25㎕ 부피로 모든 반응은 수행되었다. 모든 시약은 키트내 포함되어 있었다. 실시간 PCR은 SmartCycler® II (Cepheid, Sunnyvale, CA)를 사용하여 다음 조건하에 수행되었다. 95℃에서 10분간 변성, 95℃에서 30초씩 50회 싸이클링, 62℃에서 각각의 싸이클 수행 후 60초간 형광 판독(480nm 및 520nm의 여기조건에서 FAM을 통해 측정한다). 데이터 분석은 Cepheid SmartCycler software (Ver. 1.2b)를 사용하여 수행되었다. 문턱 싸이클(Ct)은 2차 유도 곡선의 최고 피크를 나타내는 싸이클로 정의한다. 이는 성장 커브의 최대 곡률점을 의미한다. Ct와 최대 형광(F1)이 결과를 해석하기 위해 사용되었다. 양성 결과는 다음과 같이 정의한다: Ct ≤45 및 Fl >50이다. 이러한 분석은 각각의 샘플별로 2회 수행하였다. E746_A750del의 감수성 측정을 확인하기 위하여 EGFR Scorpion Kit내에 포함되어 있는 표준 DNA를 사용하였다. 1 , 10, 100, 1 ,000 또는 10,000 pg 부피로 E746_A750del와 표준 DNA를 사용하고 10,000 pg의 야생형 표준 DNA와 1 , 10, 100, 1 ,000 또는 10,000 pg 부피의 표준 DNA와 E746_A750del이 사용되었다. 정량화를 위해 표준 곡선은 알려진 표준품의 DNA 부피의 로그에 대해 Ct 싸이클수로 플로팅하여 작성되었다. 선형 상 관관계지수(R²)와 기울기 공식이 계산되었다. 양성 대조군으로 DNA는 E746_A750del를 지닌 일본인 선암 PC-9 세포주로부터 추출되었으며 야생형 엑손 19를 지닌 표피 양암종 A431 세포주와 10,000 pg의 이들 DNA가 사용되었다.

ARMS에 의해 검출된 혈청 DNA의 EGFR 변이 상태

27명의 NSCLC 환자로터 유래된 혈청 DNA내의 E746_A750del 또는 L858R를 측정하였다. 모든 혈청 샘플로부터 야생형 엑손 19와 엑손 21을 검출하였다. 12명의 환자의 샘플로부터 A750del가 발견되었다. 1명의 환자에게서 L858R가 검출되었다(도 2). 결론적으로 27명의 환자 중 13명에서 EGFR 변이가 검출되었다(48.1%). 혈청내 EGFR 변이를 지닌 23명의 환자 중에서 원래 종양의 조직학적 서브타입은 표3a에 요약한다. 23명중 11명이 선암인 경우였다(47.8%). 편평상피암 환자 2명 중 1명은 EGFR 변이에 양성을 나타내었다. EGFR 변이 상태는 통계학적으로 조직학적 형질과는 상관관계를 나타내지 않는다. EGFR 변이는 남자환자보다 여자환자의 치료에서 더욱 빈번하게 검출되었다. 즉 여자 10명 중 7명(70%)이 남자 17명 중 6명(29.4%)가 검출되었다(표3b).

혈청내 EGFR 변이상태와 gefitinib의 반응성

부분적 반응(PR)또는 안정한 질병 상태(SD)를 나타내는 환자의 샘플에서 보다 빈번한 EGFR 변이가 관찰되었다(17명 중 11명, 75%). 반면 질환이 진전되는 환자의 샘플에서는 거의 EGFR 변이가 관찰되지 않았다(10명 중 2명, 18%). p=0.046, Fisher's exact test(표 3c).

(실시예 3) 혈청 내 EGFR 변이 상태와 생존 효과

통계학적 분석

Fisher 테스트가 다른 특성들과 함께 NSCLC 환자의 EGFR 변이의 존재를 비교하기 위해 사용되었다. 이때 다른 특성들로는 성, 종양형태 및 gefitinib 반응성이다. gefitinib 반응성에 대한 분석에 관해서는 환자들을 2개의 그룹으로 나누었으며 부분적 반응 또는 안정한 상태의 질병(PR/SD)와 진전되는 질병(PD)를 RECIST 기준에 의해 그룹화하였다. 표준 로그 랭크 테스트를 사용하여 전반적 생존과 진전 없는 생존에 관한 Kaplan Meier 곡선을 비교하였다. 전반적 생존(OS)은 gefitinib 투여 초기로부터 어떤 원인에 의해 사망할 때까지의 시간을 나타낸다. 분석기간 내에 생존하고 있는 환자를 마지막 관찰 단계까지 감시하였다. 진전 없는 생존(PFS)은 gefitinib 투여 초기로부터 병이 악화되는 첫 번째 징후를 보일 때까지 또는 어떤 원인에 의해 사망할 때까지의 시간을 나타낸다. 분석기간 내에 생존하고 있는 환자를 마지막 관찰 단계까지 감시하였다. AP 수치 0.05는 통계학적으로 중요성을 지니는 것으로 판단된다. 통계학적 분석은 Stat View software package, version 5.0을 통해 수행되었다.

gefitinib를 투여한 모든 환자의 진전 없는 생존(PFS) 평균치는 98일이었으며 전반적 생존(OS) 평균치는 306일 이었다. 혈청내의 EGFR 변이를 지닌 환자의 진전 없는 생존 평균치가 EGFR 변이가 없는 환자의 진전 없는 생존 평균치보다 길게 나타났다(200일 대 46일) P = 0.005(도 3a). 혈청내의 EGFR 변이를 지닌 환자의 전반적 생존 평균치가 EGFR 변이가 없는 환자의 전반적 생존 평균치보다 길게 나타났으나(611일 대 232일) P = 0.078(도 3b) 통계학적으로 유의성을 지닌 것은 아니다. 이 결과는 혈청 EGFR 변이가 진전 없는 생존과 전반적 생존의 예측 지표로서 뿐 만아니라 gefitinib 투여에 대한 환자의 반응의 예측 지표로 사용될 수 있음을 나타낸다.

(실시예 4) 직접 서열 방법에 의해 분석된 혈청 EGFR 변이와 ARMS와의 비교

E746_A750del의 변이는 27명의 환자 중 10명에게서 혈청 DNA 추출에 의한 직접 서열 방법에 의해 검출되었다(37.0%).

PCR 증폭 및 직접 서열 비교

혈청 및 조직 표본으로부터 얻어진 각각의 샘플 2종에 대해 증폭 및 직접 서열 비교를 행하였다. PCR은 15 μl의 주형 DNA, 0.75 유니트의 Ampli Taq Gold DNA 중합효소(Perkin-Elmer, Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ)를 사용하여 25μl 부피로 수행한다. 폴리모르픽마커에 의존하여 2.5 μl의 PCR 완충액, 0.8 mM dNTP, 0.5 μU의 각각의 프라이머 및 다양한 농도의 MgCI₂를 사용한다. 프라이머 세트의 서열과 증폭의 스케줄은 이미 알려진 방법에 의거 수행되었다(Nuc. Acids Res. 1989; 17:2503-2516). 증폭은 thermal cycler (Perkin- Elmer, Foster City, CA)를 사용하여 수행되었다. 서열 분석은 ABI prism 310 (Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여 수행되었다. 이 서열은 인간 EGFR의 젠뱅크(접근 번호:AY588246) 서열과 비교하였다.

혈청 샘플의 PCR 생성물에서 엑손 18, 19, 20 및 21의 점 돌연변이는 관찰 되지 않았다. 직접 서열 분석에 의해 검출된 혈청 EGFR 상태는 통계적으로 상호 연관성을 나타내지 않는다. 뿐만 아니라 조직학적 형태, 성 및 gefitinib의 반응성 역시 상호 연관성이 나타나지 않는다(표 3). 생존이익(PFS: P = 0.277, OS: P = 0.859, suppl data 2)도 상호연관성을 나타내지 않는다. 직접 서열 분석에 의한 EGFR 변이 상태는 그 페어 샘플의 15/27 (55.6%)로 ARMS에 의한 것과 일치하였다. EGFR 변이(E746_A750del)는 4 경우에서 직접 서열 분석에 의해 양성으로 나타났으나 ARMS에서는 음성이었다. 한편 직접 서열 분석에 의해 8 경우에서는 음성이었으 나 ARMS에서는 양성으로 나타났다.

(실시예 5) 종양 내 EGFR 변이와 혈청 내 변이와의 비교

15명의 환자로부터 24개의 종양샘플을 채취하였다.

조직샘플 채취 및 DNA 추출

종양 표본은 Institutional Review Board에 승인된 방법에 따라 채취하였다. 처치 전에 15명의 환자로부터 진단을 위해 20개의 파라핀 블록 종양물질을 채취하였다. 11개 종양 샘플은 폐 생검을 통해 일차적 종양 샘플로 채취되었으며 1개는 수술에 의해 9개는 전이부분에서 채취되었다(골수로부터 4개, 임파절로부터 3개, 뇌로부터 1개, 대장으로부터 1개). 모든 표본은 NSCLC의 진단을 위해 조직학적 검사를 행하였다. 종양샘플의 DNA 추출은 DEXPAT™ kit (TaKaRa Biomedicals, Shiga, Japan)을 통해 수행하였다.

EGFR 내의 엑손 19 및 21의 서열 분석은 동일한 PCR 조건하에서 수행한다. 12명의 환자로부터 종양 샘플이 서열 분석되었고(표4) EGFR 변이가 4 경우 검출되었다(25.0%). 그것 중 3개의 경우 엑손 19내에 15bp 결실 (E746_A750del)이 발견되었고 1 경우 엑손 21 내의 L858R이 발견되었다. EGFR 변이 환자의 조직학적 형태는 선암 3개 및 대형세포암 1개이었다. 4명의 환자의 gefitinib 반응은 부분적 반응(PR) 2명, 안정한 질병(SD) 1명 및 진전되는 질병(PD) 1명이었다. 다른 3개의 샘플은 낮은 PCR 생성물로 인해 충분히 평가되지 못하였다.

종양 샘플과 혈청 샘플의 쌍이 소급하여 11명의 환자로부터 채취되었다(표4). 종양 내의 EGFR 변이 상태는 쌍 샘플 내에서 혈청 내 변이 상태와 상응하였다(8/11 (72.7%)). E746_A750del 변이는 2명의 환자에서 종양세포에서 양성이었으나 혈청에서 음성으로 나타났다. 1명의 환자에서 E746_A750del 변이는 종양세포 내에서는 음성이었으나 혈청에서는 양성으로 나타났다.

SEQUENCE LISTING <110> AstraZeneca and National Cancer Center <120> Method <130> P023820WOP <140> PCT/GB2005/004036 <141> 2005-10-20 <150> PCT/GB2005/003823 <151> 2005-10-05 <160> 2 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 3633 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgcgaccct ccgggacggc cggggcagcg ctcctggcgc tgctggctgc gctctgcccg 60 gcgagtcggg ctctggagga aaagaaagtt tgccaaggca cgagtaacaa gctcacgcag 120 ttgggcactt ttgaagatca ttttctcagc ctccagagga tgttcaataa ctgtgaggtg 180 gtccttggga atttggaaat tacctatgtg cagaggaatt atgatctttc cttcttaaag 240 accatccagg aggtggctgg ttatgtcctc attgccctca acacagtgga gcgaattcct 300 ttggaaaacc tgcagatcat cagaggaaat atgtactacg aaaattccta tgccttagca 360 gtcttatcta actatgatgc aaataaaacc ggactgaagg agctgcccat gagaaattta 420 caggaaatcc tgcatggcgc cgtgcggttc agcaacaacc ctgccctgtg caacgtggag 480 agcatccagt ggcgggacat agtcagcagt gactttctca gcaacatgtc gatggacttc 540 cagaaccacc tgggcagctg ccaaaagtgt gatccaagct gtcccaatgg gagctgctgg 600 ggtgcaggag aggagaactg ccagaaactg accaaaatca tctgtgccca gcagtgctcc 660 gggcgctgcc gtggcaagtc ccccagtgac tgctgccaca accagtgtgc tgcaggctgc 720 acaggccccc gggagagcga ctgcctggtc tgccgcaaat tccgagacga agccacgtgc 780 aaggacacct gccccccact catgctctac aaccccacca cgtaccagat ggatgtgaac 840 cccgagggca aatacagctt tggtgccacc tgcgtgaaga agtgtccccg taattatgtg 900 gtgacagatc acggctcgtg cgtccgagcc tgtggggccg acagctatga gatggaggaa 960 gacggcgtcc gcaagtgtaa gaagtgcgaa gggccttgcc gcaaagtgtg taacggaata 1020 ggtattggtg aatttaaaga ctcactctcc ataaatgcta cgaatattaa acacttcaaa 1080 aactgcacct ccatcagtgg cgatctccac atcctgccgg tggcatttag gggtgactcc 1140 ttcacacata ctcctcctct ggatccacag gaactggata ttctgaaaac cgtaaaggaa 1200 atcacagggt ttttgctgat tcaggcttgg cctgaaaaca ggacggacct ccatgccttt 1260 gagaacctag aaatcatacg cggcaggacc aagcaacatg gtcagttttc tcttgcagtc 1320 gtcagcctga acataacatc cttgggatta cgctccctca aggagataag tgatggagat 1380 gtgataattt caggaaacaa aaatttgtgc tatgcaaata caataaactg gaaaaaactg 1440 tttgggacct ccggtcagaa aaccaaaatt ataagcaaca gaggtgaaaa cagctgcaag 1500 gccacaggcc aggtctgcca tgccttgtgc tcccccgagg gctgctgggg cccggagccc 1560 agggactgcg tctcttgccg gaatgtcagc cgaggcaggg aatgcgtgga caagtgcaac 1620 cttctggagg gtgagccaag ggagtttgtg gagaactctg agtgcataca gtgccaccca 1680 gagtgcctgc ctcaggccat gaacatcacc tgcacaggac ggggaccaga caactgtatc 1740 cagtgtgccc actacattga cggcccccac tgcgtcaaga cctgcccggc aggagtcatg 1800 ggagaaaaca acaccctggt ctggaagtac gcagacgccg gccatgtgtg ccacctgtgc 1860 catccaaact gcacctacgg atgcactggg ccaggtcttg aaggctgtcc aacgaatggg 1920 cctaagatcc cgtccatcgc cactgggatg gtgggggccc tcctcttgct gctggtggtg 1980 gccctgggga tcggcctctt catgcgaagg cgccacatcg ttcggaagcg cacgctgcgg 2040 aggctgctgc aggagaggga gcttgtggag cctcttacac ccagtggaga agctcccaac 2100 caagctctct tgaggatctt gaaggaaact gaattcaaaa agatcaaagt gctgggctcc 2160 ggtgcgttcg gcacggtgta taagggactc tggatcccag aaggtgagaa agttaaaatt 2220 cccgtcgcta tcaaggaatt aagagaagca acatctccga aagccaacaa ggaaatcctc 2280 gatgaagcct acgtgatggc cagcgtggac aacccccacg 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ggctgcaaag ctgtcccatc 3180 aaggaagaca gcttcttgca gcgatacagc tcagacccca caggcgcctt gactgaggac 3240 agcatagacg acaccttcct cccagtgcct gaatacataa accagtccgt tcccaaaagg 3300 cccgctggct ctgtgcagaa tcctgtctat cacaatcagc ctctgaaccc cgcgcccagc 3360 agagacccac actaccagga cccccacagc actgcagtgg gcaaccccga gtatctcaac 3420 actgtccagc ccacctgtgt caacagcaca ttcgacagcc ctgcccactg ggcccagaaa 3480 ggcagccacc aaattagcct ggacaaccct gactaccagc aggacttctt tcccaaggaa 3540 gccaagccaa atggcatctt taagggctcc acagctgaaa atgcagaata cctaagggtc 3600 gcgccacaaa gcagtgaatt tattggagca tga 3633 <210> 2 <211> 1210 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln 20 25 30 Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe 35 40 45 Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn 50 55 60 Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys 65 70 75 80 Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val 85 90 95 Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr 100 105 110 Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn 115 120 125 Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu 130 135 140 His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu 145 150 155 160 Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met 165 170 175 Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro 180 185 190 Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln 195 200 205 Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg 210 215 220 Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys 225 230 235 240 Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp 245 250 255 Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro 260 265 270 Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly 275 280 285 Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His 290 295 300 Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu 305 310 315 320 Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val 325 330 335 Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn 340 345 350 Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp 355 360 365 Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr 370 375 380 Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu 385 390 395 400 Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp 405 410 415 Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln 420 425 430 His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu 435 440 445 Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser 450 455 460 Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu 465 470 475 480 Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu 485 490 495 Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro 500 505 510 Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn 515 520 525 Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly 530 535 540 Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro 545 550 555 560 Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro 565 570 575 Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val 580 585 590 Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp 595 600 605 Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys 610 615 620 Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly 625 630 635 640 Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu 645 650 655 Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His 660 665 670 Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu 675 680 685 Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu 690 695 700 Arg Ile Leu Lys Glu 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Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro 1115 1120 1125 His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln 1130 1135 1140 Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp Ser Pro Ala His Trp Ala 1145 1150 1155 Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp Asn Pro Asp Tyr Gln 1160 1165 1170 Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn Gly Ile Phe Lys 1175 1180 1185 Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln 1190 1195 1200 Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala 1205 1210

Claims

(a)환자로부터 생체액 샘플을 제공하는 단계, (b)상기 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계, 및 (c)수용체내의 하나 또는 그 이상의 변이의 존재를 상기 DNA로부터 스크리닝하는 단계를 포함하는 하나 또는 그 이상의 ErbB 돌연변이를 검출하는 방법
제 1항에 있어서, (a)환자로부터 생체액 샘플을 제공하는 단계, (b)상기 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계, 및 (c)수용체내의 하나 또는 그 이상의 변이의 존재를 상기 DNA로부터 스크리닝하는 단계를 포함하는 하나 또는 그 이상의 ErbB 돌연변이에 대한 환자의 반응을 모니터링하는 방법
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 수용체내의 타이로신 키나제 활성을 변화시키는 ErbB 수용체의 하나 또는 그 이상의 변이를 검출하는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ErbB 수용체의 변이 검출방법은 EGFR을 검출하기 위한 것임을 특징으로 하는 방법
제 1항에 있어서, ErbB 수용체 약물을 투여하는 암환자의 반응을 예측하는 것은 환자의 생존이익을 예견하는 것임을 특징으로 하는 방법
제 1항에 있어서, 상기한 ErbB 의약품의 반응을 예측하는 방법은 (d)오직 야생형 대립형질만이 검출된 환자에 있어서는 의약품이 양성적으로 반응하지 않음에 반해 변이형 및 야생형 모두가 검출된 환자는 ErbB 수용체 약물이 양성적으로 반응함을 결론짓는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스크리닝 방법은 단일염기 변이, 작은 프레임-내-결실 또는 염기치환을 검출하기 위해 대립형질 특이 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 사용함을 특징으로 하는 방법
제 7항에 있어서, 상기 스크리닝 방법은 단일염기 변이, 작은 프레임-내-결 실 또는 염기치환을 검출하기 위해 대립형질 특이 프라이머를 사용하여 실시간 중합효소 연쇄반응(실시간 -PCR)의 사용함을 특징으로 하는 방법
제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 스크리닝 방법은 야생형 대립형질을 검출하기 위한 첫번째 프라이머쌍과 변이형질을 검출하기 위한 두 번째 프라이머쌍을 사용하고, 각각의 프라이머쌍 중 하나의 프라이머는 (a)특정 변이에 특이한 대립형질을 지닌 터미널 3'뉴클레오티드를 포함한 프라이머, 및 (b)프라이머의 3'말단에 가능한 추가 미스매치로 구성되어 있음을 특징으로 하는 방법
제 9항에 있어서, 각각의 쌍의 하나의 프라이머는 (a)프라이머 서열과 목적서열을 위한 특이한 추가서열을 지닌 단일분자 또는 핵산 듀플렉스 프로브 (b)단일분자 또는 핵산 듀플렉스 내의 퀀처(quencher)분자와 인접하는 프로브의 5'말단에 부착된 형광 레포터 염료 (c)상기 프로브의 한쪽 말단에 있는 하나 또는 그 이상의 비-코딩 뉴클레오티드 잔기로 구성되어 있으며 상기 레포터 염료와 퀀처분자는 목적 서열 증폭시 서로 분리됨을 특징으로 하는 방법
제 10항에 있어서, 상기 프로브는 상품명 Scorpion 프로브임을 특징으로 하는 방법
제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 방법은 야생형 서열수준대비 약 10%의 변이서열의 존재를 검출할 수 있는 기술임을 특징으로 하는 방법
제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체액은 혈액, 혈청, 혈장, 땀 또는 타액 중 하나임을 특징으로 하는 방법
제 13항에 있어서, 상기 생체액은 혈청임을 특징으로 하는 방법
제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ErbB 수용체 약물은 ErbB 수용체 타이로신 키나제 저해제임을 특징으로 하는 방법
제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ErbB 수용체 약물은 EGFR 타이로신 키나제 저해제임을 특징으로 하는 방법
제 15항에 있어서, 상기 약물은 gefitinib, erlotinib(Tarceva, OSI-774, CP-358774), PKI-166,EKB-569, HKI-272(WAY-177820), lapatinib(GW2016,GW-572016,GSK572016), canertinib(CI-1033,PD183805), AEE788, XL647, BMS 5599626, ZD6474(Zactima) 또는 WO2004/006846 또는 WO2003/082290에 게시되어 있는 화합물에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법
제 16항에 있어서, 상기 EGFR 타이로신 키나제는 gefitinib임을 특징으로 하는 방법
제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, ErbB 수용체 약물은 cetuximab(Erbitux, C225), matuzumab(EMD-72000), panitumumab(ABX-EGF/rHuMAb-EGFR), MR1-1, IMC-11F8 또는 EGFRL11에서 선택된 항-EGFR 항체를 지닌 것임을 특징으로 하는 방법
제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ErbB 수용체 약물은 단일치료법 또는 다른 약물과 혼용하여 사용할 수 있음을 특징으로 하는 방법
제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이는 핵산의 삽입, 결실 또는 치환임을 특징으로 하는 방법
제 21항에 있어서, 상기 변이는 ErbB 수용체의 타이로신 키나제 도메인 내에서 발생함을 특징으로 하는 방법
제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이는 EGFR의 타이로신 키나제 도메인 내에서 발생함을 특징으로 하는 방법
제 21항에 있어서, 상기 변이는 ATP 결합부위 주변인 EGFR의 엑손 18, 엑손 19, 엑손 20 또는 엑손 21 부위에서 발생함을 특징으로 하는 방법
제 21항에 있어서, 상기 변이는 표5에 나타난 EGFR의 변이 목록에서 발생함을 특징으로 하는 방법
제 23항에 있어서, 상기 변이는 엑손 19내에서 E746_A750del 및 엑손 21의 L858R임을 특징으로 하는 방법
제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 백혈병, 다발성 골수종 또는 림프종과 같은 비고형암, 담즙, 골수, 방광, 뇌/CNS, 신경교아종, 유방, 대장, 경추, 피부, 위장, 두경부, 간, 폐, 근육, 신경, 기생성, 난소, 췌장, 늑막/복막, 전립선, 신장, 피부, 고환, 갑상선, 자궁 및 질 종양 등의 고형암 환자임을 특징으로 하는 방법
제 1항에 있어서, (d)ErbB 수용체의 하부 시그널링 경로내의 성분에서 하나 또는 그 이상의 변이를 지닌 DNA를 스크리닝하는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법
야생형 대립형질을 검출하기 위해 사용되는 첫 번째 프라이머쌍과 ErbB 수용체 변이 대립형질을 검출하기 위해 사용되는 두 번째 프라이머쌍으로 구성된 조성물에 있어서, 상기 프라이머쌍의 하나의 프라이머는 (a)특정 변이의 특이한 대립형질을 지닌 3'말단 뉴클레오티드를 지닌 프라이머 (b)프라이머의 3'말단에 추가적 가능한 미스매치 (c)프라이머 서열과 목적 서열을 위한 추가적 특이 서열을 모두 포함하는 단일 분자 또는 핵산 듀플렉스 프로브 (d)단일분자 또는 핵산 듀플렉스 내의 퀀처(quencher)분자와 인접하는 프로브의 5'말단에 부착된 형광 레포터 염료 (e)상기 프로브의 한쪽 말단에 있는 하나 또는 그 이상의 비-코딩 뉴클레오티드 잔기 (f)목적 서열의 증폭시 상기 레포터 염료와 퀀처 분자는 서로 분리되는 특성을 지님을 특징으로 하는 조성물
ErbB 약물에 대한 환자의 반응을 예측하기 위한 생체액으로 수행되는 에세이내의 ErbB 수용체 특이 프라이머의 사용 방법
ErbB 약물에 대한 환자의 반응을 예측하기 위한 생체액의 시험을 위한 조성물의 제조 방법에 있어서 ErbB 특이 프라이머의 사용 방법
제 30항 또는 제 31항에 있어서, (a)샘플로부터 DNA를 추출하는 단계 (b)수용체내의 타이로신 키나제 활성을 변경하는 하나 또는 그 이상의 DNA 변이의 존재를 스크리닝하는 단계를 더욱 포함하는 방법을 통한 ErbB 특이 프라이머의 사용 방법