CN101693921A - 一种苯丙氨酸羟化酶基因突变的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种苯丙氨酸羟化酶基因突变的检测方法，属于分子生物学技术领域。所述的苯丙氨酸羟化酶基因突变的检测方法，其特征在于，具体步骤为：采集被测者口腔粘膜样本，抽提基因组DNA，基因分型和结果分析。本发明的优点是：简单易行、可重复性高。
Description
技术领域
本发明涉及一种苯丙氨酸羟化酶基因突变的检测方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术
苯丙氨酸羟化酶(phenylalaninehydroxylase，PAH)基因定位于染色体12q22-24.2，全长约90kb，包括13个外显子和12个内含子。外显子长为1353bp的单链，mRNA翻译成含451个氨基酸的酶单体，单体聚合成有功能的PAH酶。PAH基因突变可导致肝脏苯丙氨酸羟化酶缺乏，苯丙氨酸不能正常转化为酪氨酸，从而在肝脏中代谢紊乱，导致患儿出现苯丙酮尿症(phenylketonuria，PKU)。苯丙酮尿症是一种氨基酸代谢异常的常染色体隐性遗传病。在欧美地区的发病率为1/10000，在我国是1/16000，杂合子频率为1/50。
迄今已经发现PKU有440多种致病突变，国内仅发现30余种突变。PAH基因的突变大部分是错义突变，致病突变大多位于外显子或内含子与外显子的交接区，严重影响苯丙氨酸羟化酶基因转录和翻译及蛋白质的异常折叠、聚合，以及加速降解，从而影响苯丙氨酸羟化酶的催化活性。在不同种族和地区人群之间苯丙氨酸羟化酶基因座突变部位及分布具有较大差异。1996年，Guldberg等研究美国PKU患者时发现高频突变等位基因为R408W(18.7％)，IVS12+1G＞A(7.8％)。Johannes等检测546例PKU，其中411例德国人，65例土耳其人，发现91种突变，最常见的突变是R408W(22％)和IVS12+1G＞A(12％)，并指出欧洲苯丙氨酸羟化酶基因突变有明显地区差异，如南欧常见突变为IVS10-1G＞A(10％～20％)、东欧为R408W-H2(巴厘岛80％以上)、北欧为IVS12+1G＞A(丹麦37％)或R408W-H1。在亚洲人的苯丙酮尿症的突变基因的研究中，Yoshiyuki等研究41例日本PKU，发现高频突变位点为R413P(30.5％)和R243Q(7.3％)，并发现外显子5和6的大片缺失。而韩国常见的几种突变是R243Q(12％)、IVS4-1G＞A(10.1％)、EX6-96A＞G(10.1％)。中国人的PKU发生率和基因突变存在地区差异，中国北方人群PAH最常见的突变是R243Q(22.1％)，其次是EX6-96A＞G、R111X、R413P和Y356X。而台湾PKU的发病率和突变图谱与大陆存在很大的差异，台湾中以轻型PKU为主，突变以R241C和R408Q最常见，发生率分别为32％和14％；其次是R243Q，且发病率低于大陆人群的发病率。
现有检测PAH基因突变的方法主要是限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)和单链构象多态性(PCR-SSCP)。PCR-RFLP是利用多种限制性内切酶对基因扩增产物进行酶切，不同的片断将产生不同的电泳图谱，但这种方法只能用于检测单一位点，且这个位点必须恰好是可以酶切的，存在一定局限性。PCR-SSCP是根据单链DNA分子在中性聚丙酰胺凝胶中电泳时由于不同的立体构象造成不同的泳动速率，产生不同的条带来判断突变的存在，但此法只能检测基因变异的存在，而不能确定突变的部位和内容。
我们应用的直接测序方法可以对PCR产物直接进行DNA序列分析，明确突变位点，是现有基因突变检测方法中最直接最准确的方法，且可以实现机械化自动化，使测序工作更加简便快捷。
综上所述，苯丙氨酸羟化酶的基因突变位点和形式多种多样，具有明显人种和地域的差异，中国人PKU患者的总的突变发现约30多种，常见的突变位于外显7和12，分别为R413P(25％)和R243Q(18％)。应用直接测序方法检测苯丙氨酸羟化酶基因常见突变位点的研究，有利于建立PKU的基因诊断，以便于实现PKU的早期诊断和产前筛查。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单易行的苯丙氨酸羟化酶基因突变的检测方法。
为了达到上述目的，本发明的技术方案是提供一种苯丙氨酸羟化酶基因突变的检测方法，其特征在于，具体步骤为：
步骤1.采集被测者口腔粘膜样本；
步骤2.基因组DNA的抽提方法：
采用硅胶吸附法抽提步骤1中的被测者口腔上皮细胞样本的基因组DNA，抽提时间为2-3小时，采用电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，肉眼见清晰白色条带即进入下一步检测；
步骤3.基因分型：
将每一个被测者样本分别放入2个反应孔，2个反应孔分别检测PAH基因7号以及12号外显子突变情况，采用PGR技术进行扩增、凝胶电泳技术检测纯度以及测序技术对这些位点基因型进行确定；
步骤3-1，反应体系配置：
在每一个反应孔中加入PCR标准反应体系，标准反应体系的引物浓度为10uM，反应体系总体积为20ul，由PCR试剂5ul，正向引物和反向引物各0.4ul，20ng/μl的步骤2得到的PAH DNA模板3μl和去离子水11.2ul组成；
PAH基因第7外显子正向和反向引物：
正向引物：tctttcttcttttcatccbtcc
反向引物：aacctcattcttcaaatctcca
PAH基因第12外显子正向和反向引物：
正向引物：ctcagttcgctacgacccatac
反向引物：ttgtccaagacctcaatcaata
步骤3-2，PCR反应条件：
将反应孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为95℃预热15分钟；再进行35个循环的95℃、45秒；60℃、45秒；72℃、60秒；72℃、7分钟后，降温至4℃；
步骤3-3，将反应孔在PCR扩增仪反应后的产物进行电泳检测，肉眼见清晰白色条带即进入下一步：
a.1％琼脂糖凝胶插小号孔梳子；
b.2000bpDNA标记物6ul；
c.步骤3-2的PCR产物4ul加入电泳缓冲液1ul；
d.电泳电压：120v；
e.电泳时间：20min拍摄一张电泳图；30min拍摄一张电泳图；PAH基因第7外显子目的条带在330bp左右；PAH基因第12外显子目的条带在400bp左右；
步骤3-4，纯化：
在每一个反应孔中加入反应体系，反应体系总体积为7ul，由去离子水ddH2O 3.825ul、PCR产物纯化试剂SAP 0.05ul、PCR产物纯化试剂EXON1 0.125ul和步骤3-3的PCR产物3ul组成；终浓度：PCR产物纯化试剂SAP 0.2U/7ul、PCR产物纯化试剂EXON1 2.5U/7ul；
反应条件为：37℃、60min；80℃、15min；4℃恒温保存；
步骤3-5，将纯化后的每一个反应孔用ABI 3730测序仪进行测序；
步骤3-5-1，从-20度冰箱中取出步骤3-4的PCR纯化产物、测序试剂BigDye、四种dNTP、1uM测序引物，7号以及12号外显子测序引物分别为：tctttcttcttttcatccbtcc和ctcagttcgctacgacccatac；
步骤3-5-2，记录日期、所作反应的PCR纯化产物名、所用引物、反应体系、测序试剂用量和PCR反应条件；
步骤3-5-3，取一块反应板，标上模板名、测序引物名和日期；
步骤3-5-4，在每一个反应孔中加入反应体系，反应体系由0.5ul的BigDye、1.4ul的dNTP、2ul的测序引物、3ul的PCR纯化产物和0.1ul的去离子水ddH2O组成；体系分装好后，上离心机，达900转/分即停；
步骤3-5-5，将反应板放在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为预热96℃、10秒；再进行25个循环的96℃、10秒；50℃、5秒；60℃、4分钟；60℃、4分钟后，降温至4℃恒温保存；
步骤3-5-6，扩增结束后，在每孔加入1ul 125mM乙二胺四乙酸EDTA；
步骤3-5-7，再在每孔加入无水乙醇15ul于室温进行沉淀，不得超过24小时；
步骤3-5-8，将96孔板放入冰冻离心机，3650转/分，4℃离心30分钟；
步骤3-5-9，倒去上清液，将96孔板离心，达800转即停，再在每孔加30ul 70％乙醇，3650转/分，4℃离心15分钟，倒去上清液，将96孔板离心，达800转即停，将残余酒精风干，室温放置20分钟；
步骤3-5-10，每孔加入8ul 95％甲酰胺与ddH2O混合物；
步骤3-5-11，在ABI 3730上进行结果读取，用软件Chromas查阅测序检测结果：第7以及第12外显子都2类结果，即正常结果和突变结果；
步骤4，结果分析：
1.未检出突变：您的检测结果中未发现PAH基因第7以及第12号外显子上存在突变；
2.检出突变：您的检测结果中发现PAH基因第7或第12号外显子上存在突变。
本发明对PAH基因第7以及第12号外显子上进行检测，相应位点特异性引物的设计以及用于序列测定的实验方案、试剂以及报告生成系统，通过同时检测分析个体的PAH基因第7以及地12号外显子上是否存在突变来提供一种用于辅助诊断苯丙酮尿病的检测方。采集样本的类型为口腔粘膜上皮细胞，采用硅胶吸附法抽提DNA具有所需样品量少，抽提质量稳定，抽提产物纯度高，操作简便的特点。
利用本发明对超过100例以上中国人群样本的检测结果显示，根据上述方法进行的PAH基因第7以及第12号外显子上基因型检测检出率可达99％以上，结果可重复性达到100％。
本发明的优点是：简单易行、可重复性高，适合于早期诊断、产前筛查苯丙酮尿症。
附图说明
图1为7个样本第7外显子PCR后产物的电泳结果图；
图2为7个样本第12外显子PCR后产物的电泳结果图；
图3为PAH基因第7号外显子实验无突变结果示意图；
图4为PAH基因第12号外显子实验无突变结果示意图；
图5为PAH基因第7号外显子实验有突变结果示意图；
图6为PAH基因第12号外显子实验有突变结果示意图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例
一种用于苯丙酮尿症辅助诊断的细胞分子遗传学检测方法，具体步骤为：
步骤1.采集被测者口腔粘膜样本；
步骤2.基因组DNA的抽提方法：
采用硅胶吸附法抽提步骤1中的被测者口腔上皮细胞样本的基因组DNA，抽提时间为2-3小时，采用电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，肉眼见清晰白色条带即进入下一步检测；
步骤3.基因分型：
将每一个被测者样本分别放入2个反应孔，2个反应孔分别检测PAH基因7号以及12号外显子突变情况，采用PCR技术进行扩增、凝胶电泳技术检测纯度以及测序技术对这些位点基因型进行确定；
步骤3-1，反应体系配置：
在每一个反应孔中加入PCR标准反应体系，标准反应体系的引物浓度为10uM，反应体系总体积为20ul，由PCR试剂(天根生化KT202-12)5ul，正向引物和反向引物各0.4ul，20ng/μl的步骤2得到的PAH DNA模板3μl和去离子水11.2ul组成；
PAH基因第7外显子正向和反向引物：
正向引物：tctttcttcttttcatccbtcc
反向引物：aacctcattcttcaaatctcca
PAH基因第12外显子正向和反向引物：
正向引物：ctcagttcgctacgacccatac
反向引物：ttgtccaagacctcaatcaata
步骤3-2，PCR反应条件：
将反应孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为95℃预热15分钟；再进行35个循环的95℃、45秒；60℃、45秒；72℃、60秒；72℃、7分钟后，降温至4℃；
步骤3-3，将反应孔在PCR扩增仪反应后的产物进行电泳检测，肉眼见清晰白色条带即进入下一步：图1为7个样本第7外显子PCR后产物的电泳结果图；图2为7个样本第12外显子PCR后产物的电泳结果图；
a.1％(重量浓度)琼脂糖凝胶插小号孔梳子；
b.2000bpDNA标记物(天根生化MD114-02)6ul；
c.步骤3-2的PCR产物4ul加入电泳缓冲液(天根生化RT201-01)1ul；
d.电泳电压：120v；
e.电泳时间：20min拍摄一张电泳图；30min拍摄一张电泳图；PAH基因第7外显子目的条带在330bp左右；PAH基因第12外显子目的条带在400bp左右；
步骤3-4，纯化：
在每一个反应孔中加入反应体系，反应体系总体积为7ul，由去离子水ddH2O 3.825ul、PCR产物纯化试剂SAP 0.05ul、PCR产物纯化试剂EXON1 0.125ul和步骤3-3的PCR产物3ul组成；终浓度：PCR产物纯化试剂SAP 0.2U/7ul、PCR产物纯化试剂EXON12.5U/7ul；
反应条件为：37℃、60min；80℃、15min；4℃恒温保存；
步骤3-5，将纯化后的每一个反应孔用ABI 3730测序仪进行测序；
步骤3-5-1，从-20度冰箱中取出步骤3-4的PCR纯化产物、测序试剂BigDye(PEApplied Biosystems 4337574)、四种dNTP、1uM测序引物，7号以及12号外显子测序引物分别为：tctttcttcttttcatccbtcc和ctcagttcgctacgacccatac；
步骤3-5-2，记录日期、所作反应的PCR纯化产物名、所用引物、反应体系、测序试剂用量和PCR反应条件；
步骤3-5-3，取一块反应板，标上模板名、测序引物名和日期；
步骤3-5-4，在每一个反应孔中加入反应体系，反应体系由0.5ul的BigDye、1.4ul的dNTP、2ul的测序引物、3ul的PCR纯化产物和0.1ul的去离子水ddH2O组成；体系分装好后，上离心机，达900转/分即停；
步骤3-5-5，将反应板放在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为预热96℃、10秒；再进行25个循环的96℃、10秒；50℃、5秒；60℃、4分钟；60℃、4分钟后，降温至4℃恒温保存；
步骤3-5-6，扩增结束后，在每孔加入1ul 125mM乙二胺四乙酸EDTA；
步骤3-5-7，再在每孔加入无水乙醇15ul于室温进行沉淀，不得超过24小时；
步骤3-5-8，将96孔板放入冰冻离心机，3650转/分，4℃离心30分钟；
步骤3-5-9，倒去上清液，将96孔板离心，达800转即停，再在每孔加30ul 70％(重量浓度)乙醇，3650转/分，4℃离心15分钟，倒去上清液，将96孔板离心，达800转即停，将残余酒精风干，室温放置20分钟；
步骤3-5-10，每孔加入8ul 95％(重量浓度)甲酰胺与ddH2O混合物；
步骤3-5-11，在ABI 3730上进行结果读取，用软件Chromas查阅测序检测结果：第7以及第12外显子都2类结果，即正常结果和突变结果；第7号外显子与第12号外显子都有2类结果，即正常结果和突变结果；图3为PAH基因第7号外显子R243Q实验正常结果示意图；图4为PAH基因第12号外显子R413P实验正常结果示意图；图5为PAH基因第7号外显子实验有突变结果示意图；图6为PAH基因第12号外显子实验有突变结果示意图；被测者PAH基因第7号外显子与第12号外显子的图片与上述正常结果相同，均有突变。步骤4.最后得出检测结果，给出结果分析如下表：
序列表
<110>上海中优医药高科技有限公司
<120>一种苯丙氨酸羟化酶基因突变的检测方法
<160>3
<210>1
<211>500
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>mutation
<222>(175)
<223>n＝a或g
<400>1
agcagcgagg cagacatctg aagccaagtc tgcctagcgt caaagcctat gtccctgggc 60
agttatgtgt actactccac tacctaaagg tctcctagtg cctctgactc agtggtgatg 120
agctttgagt tttctttctt cttttcatcc cagcttgcac tggtttccgc ctccnacctg 180
tggctggcct gctttcctct cgggatttct tgggtggcct ggccttccga gtcttccact 240
gcacacagta catcagacat ggatccaagc ccatgtatac ccccgaaccg tgagtactgt 300
cctccagcta ccagttgcca ggcacaatga gcgccatctt ttcctgctgc aagaatgagg 360
tttgggttca ttgctggctg gtccacagga ctagttgtct ctccatccaa gtagatagac 420
cagactgatt ggagatttgg tcatcctgtg agactgtttg ctggtagtac taaaaacaat 480
tcatctattc tggagatttg 500
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PAH基因第7号外显子序列扩增的正向引物。
<400>2
tctttcttct tttcatccbt cc 22
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PAH基因第7号外显子序列扩增的反向引物。
<400>3
aacctcattc ttcaaatctc ca 22
<210>4
<211>500
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>mutation
<222>(277)
<223>n＝c或g
<400>4
ggggactaaa taaacatgtg tatatatgtg tttgtacata cacatacaca catacagagg 60
cttcccaaga agactcatta aaactccatt ccccccgcct cagccctggc tgttgaagac 120
cctgctctag ggaggtgtcc gtgttcctaa aaaagaagta aaatgccact gagaactctc 180
ttaagactac ctttctccaa atggtgccct tcactcaagc ctgtggtttt ggtcttagga 240
actttgctgc cacaatacct cggcccttct cagttcncta cgacccatac acccaaagga 300
ttgaggtctt gaacaatacc cagcagctta agattttggc tgattccatt aacagtaagt 360
aatttacacc ttacgaggcc actcggtttc tcagtaatcg aagactgtct ttccctacca 420
tcgccatagg aaaaataata aatttattga aatatttaat taaggagaaa agcacctcca 500
tgtaagccat gggttcattg
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PAH基因第12号外显子序列扩增的正向引物。
<400>5
ctcagttcgc tacgacccat ac 22
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PAH基因第12号外显子序列扩增的反向引物。
<400>6
ttgtccaaga cctcaatcaa ta 22
Claims (1)
1.一种苯丙氨酸羟化酶基因突变的检测方法，其特征在于，具体步骤为：
步骤1.采集被测者口腔粘膜样本；
步骤2.基因组DNA的抽提方法：
采用硅胶吸附法抽提步骤1中的被测者口腔上皮细胞样本的基因组DNA，抽提时间为2-3小时，采用电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，肉眼见清晰白色条带即进入下一步检测；
步骤3.基因分型：
将每一个被测者样本分别放入2个反应孔，2个反应孔分别检测PAH基因7号以及12号外显子突变情况，采用PCR技术进行扩增、凝胶电泳技术检测纯度以及测序技术对这些位点基因型进行确定；
步骤3-1，反应体系配置：
在每一个反应孔中加入PCR标准反应体系，标准反应体系的引物浓度为10uM，反应体系总体积为20ul，由PCR试剂5ul，正向引物和反向引物各0.4ul，20ng/μl的步骤2得到的PAH DNA模板3μl和去离子水11.2ul组成；
PAH基因第7外显子正向和反向引物：
正向引物：tctttcttcttttcatccbtcc
反向引物：aacctcattcttcaaatctcca
PAH基因第12外显子正向和反向引物：
正向引物：ctcagttcgctacgacccatac
反向引物：ttgtccaagacctcaatcaata
步骤3-2，PCR反应条件：
将反应孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为95℃预热15分钟；再进行35个循环的95℃、45秒；60℃、45秒；72℃、60秒；72℃、7分钟后，降温至4℃；
步骤3-3，将反应孔在PCR扩增仪反应后的产物进行电泳检测，肉眼见清晰白色条带即进入下一步：
a.1％琼脂糖凝胶插小号孔梳子；
b.2000bpDNA标记物6ul；
c.步骤3-2的PCR产物4ul加入电泳缓冲液1ul；
d.电泳电压：120v；
e.电泳时间：20min拍摄一张电泳图；30min拍摄一张电泳图；PAH基因第7外显子目的条带在330bp左右；PAH基因第12外显子目的条带在400bp左右；
步骤3-4，纯化：
在每一个反应孔中加入反应体系，反应体系总体积为7ul，由去离子水ddH2O 3.825ul、PCR产物纯化试剂SAP 0.05ul、PCR产物纯化试剂EXON10.125ul和步骤3-3的PCR产物3ul组成；终浓度：PCR产物纯化试剂SAP 0.2U/7ul、PCR产物纯化试剂EXON12.5U/7ul；
反应条件为：37℃、60min；80℃、15min；4℃恒温保存；
步骤3-5，将纯化后的每一个反应孔用ABI 3730测序仪进行测序；
步骤3-5-1，从-20度冰箱中取出步骤3-4的PCR纯化产物、测序试剂BigDye、四种dNTP、1uM测序引物，7号以及12号外显子测序引物分别为：tctttcttcttttcatccbtcc和ctcagttcgctacgacccatac；
步骤3-5-2，记录日期、所作反应的PCR纯化产物名、所用引物、反应体系、测序试剂用量和PCR反应条件；
步骤3-5-3，取一块反应板，标上模板名、测序引物名和日期；
步骤3-5-4，在每一个反应孔中加入反应体系，反应体系由0.5ul的BigDye、1.4ul的dNTP、2ul的测序引物、3ul的PCR纯化产物和0.1ul的去离子水ddH2O组成；体系分装好后，上离心机，达900转/分即停；
步骤3-5-5，将反应板放在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为预热96℃、10秒；再进行25个循环的96℃、10秒；50℃、5秒；60℃、4分钟；60℃、4分钟后，降温至4℃恒温保存；
步骤3-5-6，扩增结束后，在每孔加入1ul 125mM乙二胺四乙酸EDTA；
步骤3-5-7，再在每孔加入无水乙醇15ul于室温进行沉淀，不得超过24小时；
步骤3-5-8，将96孔板放入冰冻离心机，3650转/分，4℃离心30分钟；
步骤3-5-9，倒去上清液，将96孔板离心，达800转即停，再在每孔加30ul 70％乙醇，3650转/分，4℃离心15分钟，倒去上清液，将96孔板离心，达800转即停，将残余酒精风干，室温放置20分钟；
步骤3-5-10，每孔加入8ul 95％甲酰胺与ddH2O混合物；
步骤3-5-11，在ABI 3730上进行结果读取，用软件Chromas查阅测序检测结果：第7以及第12外显子都2类结果，即正常结果和突变结果；
步骤4，结果分析：
1.未检出突变：您的检测结果中未发现PAH基因第7以及第12号外显子上存在突变；
2.检出突变：您的检测结果中发现PAH基因第7或第12号外显子上存在突变。
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000049160A1 (en) * | 1999-02-19 | 2000-08-24 | New York State Office Of Mental Health | Phenylalanine hydroxylase gene variants, and amino acid and pterin homeostasis, in the definition, detection, treatment and prevention of psychotic, mood and personality disorders |
| CN1335408A (zh) * | 2000-07-23 | 2002-02-13 | 浙江江南生物科技有限公司 | 苯丙氨酸羟化酶基因突变诊断专用dna芯片 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000049160A1 (en) * | 1999-02-19 | 2000-08-24 | New York State Office Of Mental Health | Phenylalanine hydroxylase gene variants, and amino acid and pterin homeostasis, in the definition, detection, treatment and prevention of psychotic, mood and personality disorders |
| CN1335408A (zh) * | 2000-07-23 | 2002-02-13 | 浙江江南生物科技有限公司 | 苯丙氨酸羟化酶基因突变诊断专用dna芯片 |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 蒋涛: "《PCR-SSCP 检测苯丙氨酸羟化酶外显子7 突变》", 《临床检验杂志》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103509865A (zh) * | 2013-09-22 | 2014-01-15 | 上海中优医药高科技有限公司 | 利用高分辨熔解曲线分析技术检测pah基因突变的方法 |
| CN107523608A (zh) * | 2016-06-22 | 2017-12-29 | 海门中科基因生物科技有限公司 | 一种检测苯丙酮尿症致病基因突变的试剂盒 |
| CN108330190A (zh) * | 2018-03-29 | 2018-07-27 | 徐州市妇幼保健院 | 苯丙氨酸羟化酶基因突变谱检测的特异性引物 |
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