CN102108408B - 用于检测i型糖尿病易感性的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测I型糖尿病易感性的试剂盒，它检测与I型糖尿病关系密切的三个基因：PTPN22基因、CTLA-4基因和VDR基因。可同时检测SNP位点包括：PTPN22基因的rs2476601位点、CTLA-4的rs231775位点、VDR的rs2228570位点。利用本试剂盒，通过检测一组与I型糖尿病易感性相关的基因及位点，利用特异性引物和探针，通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术，可清晰的判断受检人群是否携带“I型糖尿病易感基因”，将I型糖尿病易感人群从人群中筛选出来，改变不良的生活习惯，达到预防的目的。

Description

用于检测I型糖尿病易感性的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种疾病易感性检测用的试剂盒、尤其是一种检测I型糖尿病易感性的试剂盒，通过检测PTPN22、CTLA-4和VDR的单核苷酸多态性位点(SNP)，来预测个体对I型糖尿病的易感性。

背景技术

糖尿病是常见病、多发病，其患病率正随人民生活水平的提高、人口老化和生活方式的改变迅速增加。据世界卫生组织(WHO)估计，全球目前有超过1.5亿糖尿病患者，到2025年这一数字将增加一倍。我国现有糖尿病患者3千万，居世界第2位。糖尿病已成为发达国家中继心血管病和肿瘤之后的第三大非传染性疾病，对社会和经济带来沉重的负担，是严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题。根据WHO和国际糖尿病联盟(IDF)专家组的建议，糖尿病可分为1型、2型、其他特殊类型及妊娠糖尿病四种。研究表明，1型糖尿病占糖尿病总发病人数的7％～10％，且近年来该病的发病率呈逐年上升趋势。

糖尿病的病因和发病机制较为复杂，至今尚未完全明了。目前认为1型糖尿病(type 1 diabetes，T1DM)是一种在遗传与环境相互作用下，以T细胞介导的特异性胰岛β细胞自身免疫性破坏为主要发病机制的一种疾病。1型糖尿病具有多基因遗传背景，易感性十分复杂，疾病的发生是多种基因相互作用、相互影响的结果。近年来，随着对1型糖尿病相关基因的研究日趋深入，证实了多种基因在I型糖尿病的发生发展中的作用，为I型糖尿病的早期诊断和治疗提供了理论依据。

蛋白酪氨酸磷酸酶22(protein tyrosine phosphatase N22，PTPN22)基因位于人染色体1p13，编码淋巴特异性酪氨酸磷酸酶(Lyp)。PTPN22基因620密码子编码精氨酸(Arg)，1858C变异为1858T(rs2476601)后，620密码子编码色氨酸(Trp)，携带Arg620的Lyp能通过SH3结构域与CSK激酶(C端Src酪氨酸激酶)构成复合物，抑制T细胞激活，而携带Trp620的Lyp不能形成复合物，从而1858T杂合子个体可能减少了Lyp-Csk复合物的形成，因此在病毒感染或其他免疫压力下，高反应性的T细胞更易产生针对自身抗原的破坏性免疫反应，增加1型糖尿病的患病风险。

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associatedantigen 4，CTLA-4)基因位于染色体2q33，编码T细胞表面的一种膜蛋白。研究表明，只有激活的T细胞才表达CTLA-4分子，并与抗原递呈细胞膜上的B7分子结合，传递负性调节信号，终止T细胞活化和抑制免疫反应的进行，对T细胞增生起负性调节作用。研究表明CTLA-4基因外显子1第17密码子49位点A/G多态性(rs231775)，导致CTLA-4信号肽区域内的苏氨酸变为丙氨酸，与机体免疫应答的过度激活相关，是1型糖尿病的独立危险因素之一。

维生素D受体(vitamin-D receptor，VDR)基因定位于人染色体12q12-q14，现发现有14个外显子，总长度约为75kb。VDR与1，25-(OH)₂-VitD3形成复合物之后，常与其它的核受体形成异二聚体，抑制白细胞介素、干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α等的产生以及T细胞的增殖。VDR基因存在FokI A/G多态性(rs2228570)，启动编码产生一3个氨基酸长度的VDR蛋白，可能与1型糖尿病的发病有关。

1型糖尿病是遗传易感个体在环境因素影响下发生的慢性自身免疫紊乱。PTPN22基因、CTLA-4基因和VDR基因的多态性与机体的免疫功能紊乱有关，与1型糖尿病的易感、发生密切相关。由于1型糖尿病的基因背景非常复杂，不同的易感基因之间可能存在相互作用。某一易感基因对1型糖尿病的影响可由于其他基因的作用而改变，如果同时对多种易感基因进行分析，则有助于阐明各种易感基因之间的相互作用机制及其对1型糖尿病的影响。

现有技术检测I型糖尿病易感人群，采用杂交芯片法或玻璃板芯片法，以及利用taqman探针，该方法准确率低、假阴性和假阳性率较高，且不能批量检测；另一种直接测序法，虽准确率高，但其成本高、同样不能实现批量检测，因此现有方法均无法满足大规模基因筛选的要求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，通过检测一组与I型糖尿病易感性的检测试剂盒，利用特异性引物和探针，通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术，综合检测和分析受检人群是否携带“I型糖尿病易感基因”，将I型糖尿病易感人群从人群中筛选出来，改变不良的生活习惯，达到预防的目的。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于检测I型糖尿病易感的检测试剂盒，它检测与I型糖尿病关系密切的三个基因：PTPN22基因、CTLA-4基因和VDR基因。

包括下述SNP位点：PTPN22基因的rs2476601位点、CTLA-4的rs231775位点、VDR的rs2228570位点。

所述的用于检测白血病易感的基因组合，用于针对所述位点设计特异性的引物对和探针。

所述的用于检测I型糖尿病易感的基因组合设计的特异性引物，所述的特异性引物对的序列如下，用于进行多重PCR扩增，能同时扩增出上述3个位点的基因片段：

针对rs2476601位点：

CATGCCCATCCCACACTTT(SEQ ID NO：1)

TCCACTTCCTGTATGGACACCT(SEQ ID NO：2)

针对rs231775位点：

AGCCATGGCTTGCCTTG(SEQ ID NO：3)

CAGAAGACAGGGATGAAGAGAAG(SEQ ID NO：4)

针对rs2228570位点：

AAGTCTCCAGGGTCAGGCAG(SEQ ID NO：5)

TCTGACCGTGGCCTGCTT(SEQ ID NO：6)

所述的用于检测白血病易感的基因组合设计的特异性探针，其特征在于，所述的特异性探针序列如下，能同时对3个位点进行检测分型：

针对rs2476601位点：

ACGCACGTCCACGGTGATTTTGAAATCCCCCCTCCACTTCCTGTA(SEQ ID NO：7)

针对rs231775位点：

GGATGGCGTTCCGTCCTATTGCACAAGGCTCAGCTGAACCTGGCT(SEQ ID NO：8)

针对rs2228570位点：

CGTGCCGCTCGTGATAGAATGGCCTGCTTGCTGTTCTTACAGGGA(SEQ ID NO：9)

所述的引物或探针，用于通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术特异性检出白血病易感基因。

本试剂盒的组分和含量包括：

250ul 10×PCR反应缓冲液，

20ul 10mM dNTP混合液，

450ul 25mM MgCl₂溶液，

45ul(5U/ul)Taq DNA聚合酶，

50ul特异性引物(6条)混合液(10uM each)，

15ul特异性延伸探针(3条)混合液(10uM)，

90ul ExoI(10U/ul)，

450ul SAP(1U/ul)，

140ul 10×SAP反应缓冲液，

1700ul Extension Dilution Buffer，

90ul 10×Extension Mix，

10ul DNA polymerase，

3500ul Hybridization Solution，

200ul Hybridization Additive，

2500ul 20×Wash Buffer 1，

800ul 64×Wash Buffer 2，

一个384孔12重微阵列芯片

去离子水20ml，

本试剂盒供380人份检测应用，试剂盒保存温度为-20℃。

本发明的有益效果是：(1)分型结果准确性高达99％以上，重复性好，没有假阳性影响；(2)同时检测多个SNP位点，检测成本低；(3)通量高，可一次对384个样本进行检测；(4)操作简便；(5)灵敏度高，每次检测的DNA用量仅2ng。本发明通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术，利用特异性引物和探针对单核苷酸多态性(SNP)的基因分型准确率超过99％。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。下列实施例中未注明具体条件的实验放大，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。

1DNA的提取：

取受检者外周静脉血，加入同等体积的细胞裂解液，裂解两次，充分裂解白细胞，离心弃上清后加入蛋白酶K缓冲液和蛋白酶K(50ug/ml)，65℃孵育10分钟，异丙醇沉淀、75％乙醇洗涤两次，晾干后溶于适量TB溶液中。

2PCR扩增

取受检者的基因组DNA提取液加入96孔板中，进行多重PCR扩增：

反应总体积5ul，其中10M mol/L dNTPs 0.0375ul，10×PCR Buffer0.5ul，25mmol/L MgCl₂ 1ul，模板DNA 30ng，3重引物混合液10uM/Leach0.025ul，Amplitaq Gold(5U/ul)0.1ul，补足水到5ul。置于PCR仪上反应：预变性94℃1min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，40个循环；Hold 4℃。

扩增引物混合液包括下列引物：

1F CATGCCCATCCCACACTTT(SEQ ID NO：1)

1R TCCACTTCCTGTATGGACACCT(SEQ ID NO：2)

2F AGCCATGGCTTGCCTTG(SEQ ID NO：3)

2R CAGAAGACAGGGATGAAGAGAAG(SEQ ID NO：4)

3F AAGTCTCCAGGGTCAGGCAG(SEQ ID NO：5)

3R TCTGACCGTGGCCTGCTT(SEQ ID NO：6)

3纯化

在PCR扩增产物中加入0.2ul ExoI，1ul SAP，0.3ul 10×SAP反应缓冲液和1.5ul去离子水。将96孔板放入PCR仪中进行纯化，纯化程序：37℃30min，96℃10min，Hold 4℃。

4引物延伸反应

纯化后的PCR产物中加入延伸反应混合物：extension Dilution Buffer3.76ul，延伸探针混合液(1010uM/L each)0.03ul，20×Extension Mix 0.2ul，DNA聚合酶0.02ul，去离子水3ul。将装有延伸反应混合物的96孔板再次放入PCR仪中进行延伸反应，反应程序：Hold 96℃3min；94℃20sec，40℃11sec，46个循环；Hold 4℃。

延伸探针混合液包含下列探针：

1P ACGCACGTCCACGGTGATTTTGAAATCCCCCCTCCACTTCCTGTA(SEQ ID NO：7)

2P GGATGGCGTTCCGTCCTATTGCACAAGGCTCAGCTGAACCTGGCT(SEQ ID NO：8)

3P CGTGCCGCTCGTGATAGAATGGCCTGCTTGCTGTTCTTACAGGGA(SEQ ID NO：9)

以上延伸探针5’端具有与微阵列芯片地址引物对应的地址序列。

5延伸反应结束后，加入杂交液可与微阵列芯片进行杂交反应。

孵育温度42℃，孵育时间2小时。

6激光扫描检测荧光信号

本发明将上述3个与1型糖尿病易感、发生密切相关的基因进行组合，通过大量的筛选数据表明所述3个基因：PTPN22基因、CTLA-4基因和VDR基因，如3个基因都有位点发生突变，则患1型糖尿病的概率最高；2基因发生突变次之；1个或没有基因发生突变，患1型糖尿病的概率较小。

本发明采用单核苷酸延伸技术和微阵列芯片技术相结合的方法，针对上述3个位点，设计一套多重PCR引物，在一个扩增反应中同时扩增携带SNP位点的3个基因片段，根据SNP位点上游5’端23-25bp的序列设计寡核苷酸探针，此探针与序列杂交后3’末端位于snp5’端上游1bp处。检测时聚合酶根据SNP携带的碱基在探针末端结合上一个携带荧光的ddNTP，根据结合的ddNTP不同，其所携带的荧光颜色也不相同，在探针的5’端根据与微阵列芯片结合位置的不同设计有不同的20bp的Tag地址序列，与微阵列芯片上对应的序列互补，延伸后的探针与微阵列芯片上对应区域上的序列杂交，不同的探针结合在芯片的不同区域，通过检测对应位置的荧光，达到同时进行多个SNP分型的目的。

疾病的发生是一个十分复杂的过程，受到多个蛋白和基因的共同影响，其中任何一个酶的改变都会影响疾病的易感性。传统的基因检测疾病的方法受到方法的限制，往往只能对一到两个基因的多态性进行分析，只能覆盖一部份患病风险人群，对于由于其他基因上的多态性造成的疾病患病风险不能及时的预警，检测的准确性因此会大幅降低，受检者不能全面的了解自身疾病的易感情况。

本发明针对一种疾病不同的患病途径检测多个相关的基因和其多态性位点，能更准确更全面的检测受检者不同患病途径的患病风险，能给受检者提出具有针对性和有效地健康建议，及时有效的避免其疾病的发生。

由于本发明使用的检测方法可以高通量，自动化的检测SNP，大幅降低了检测成本，可以对不同患病途径的多个基因同时进行检测，本发明针对I型糖尿不同的患病途径的关键酶基因寻找挑选了3个多态性位点，能更准确更全面的检测受检者不同患病途径的患病风险，能够给受检者提出具有针对性的健康建议，及时有效的避免其疾病的发生。本发明通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术，利用特异性引物和探针对单核苷酸多态性(SNP)的基因分型准确率超过99％，同时检测上述3个基因对检测、比较个体的糖尿病易感性具有重要意义。

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (2)

1.一种用于检测I型糖尿病易感性的试剂盒，其特征在于，包括：同时检测PTPN22基因的rs2476601位点、CTLA-4的rs231775位点、VDR的rs2228570位点的特异性引物及对应的延伸探针，Taq酶，dNTP混合液，MgCl₂溶液，10×PCR反应缓冲液，ExoI,SAP，10×SAP反应缓冲液，ExtensionDilution Buffer，10×Extension Mix，DNA polymerase，HybridizationSolution，Hybridization Additive，20×Wash Buffer1，64×Wash Buffer2，去离子水，微阵列芯片；

所述的特异性引物对是针对PTPN22基因的rs2476601位点、CTLA-4的rs231775位点、VDR的rs2228570位点而设计，能特异性扩增出包括上述SNP位点的DNA片段的引物对，所含的特异性引物对为SEQ ID NO：1，2所示核苷酸序列的引物对、SEQ ID NO:3,4所示核苷酸序列的引物对以及SEQ IDNO:5,6所示核苷酸序列的引物对；

所述的特异性延伸探针是针对PTPN22基因的rs2476601位点、CTLA-4的rs231775位点、VDR的rs2228570位点而设计，能通过单核苷酸延伸和微阵列技术检测出这三个SNPs位点基因型的探针，所含的特异性延伸探针为SEQID NO：7、8和9所示的延伸探针。

2.根据权利要求1所述的用于检测I型糖尿病易感性的试剂盒，其特征在于：试剂盒的组分和含量包含250ul10×PCR反应缓冲液，20ul10mM dNTP混合液，450ul25mM MgCl₂溶液，45ul5U/ul Taq DNA聚合酶，每条10uM的6条特异性引物混合液50ul，每条10uM的3条特异性延伸探针混合液15ul,90ul10U/ul ExoI，450ul1U/ul SAP，140ul10×SAP反应缓冲液，1700ul Extension Dilution Buffer，90ul10×Extension Mix，10ul DNApolymerase，3500ul Hybridization Solution，200ul HybridizationAdditive，2500ul20×Wash Buffer1，800ul64×Wash Buffer2，去离子水20ml，一个供380人份检测应用的384孔12重微阵列芯片，试剂盒保存温度为－20℃。