CN104059989A - 1型糖尿病易感位点rs231775的检测方法及试剂盒 - Google Patents

1型糖尿病易感位点rs231775的检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测1型糖尿病易感位点的方法及试剂盒，所述方法包括如下步骤：(1)提取样品的基因组DNA，扩增样品的CTLA-4基因外显子中包含rs231775位点的区域，得到扩增产物；(2)使用HRM分析技术检测扩增产物中SNP位点的基因型。采用HRM分析技术对扩增后的CTLA-4基因外显子中包含rs231775位点的区域进行基因型分析，该方法操作简单、快速，使用成本低，结果准确，可以实现批量检测；使用上述试剂盒可以清晰的判断受检人群是否携带1型糖尿病易感基因，将1型糖尿病易感人群从人群中筛选出来，改变不良的生活习惯，达到预防的目的。

Description

1型糖尿病易感位点rs231775的检测方法及试剂盒
【技术领域】
本发明涉及一种1型糖尿病易感性的检测方法及试剂盒，更具体的说是通过测定与1型糖尿病相关基因细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic Tlymphocyte-associatedantigen4，CTLA-4)的单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)预测受试者对于1型糖尿病的易感性，该方法可用于疾病的辅助诊断、治疗和新药开发，属于分子生物学和医学领域。
【背景技术】
糖尿病是常见病、多发病，其患病率正随人民生活水平的提高、人口老化和生活方式的改变迅速增加。据世界卫生组织(WHO)估计，全球目前有超过1.5亿糖尿病患者，到2025年这一数字将增加一倍。我国现有糖尿病患者3千万，居世界第2位。糖尿病已成为发达国家中继心血管病和肿瘤之后的第三大非传染性疾病，对社会和经济带来沉重的负担，是严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题。根据WHO和国际糖尿病联盟(IDF)专家组的建议，糖尿病可分为1型、2型、其他特殊类型及妊娠糖尿病四种。研究表明，1型糖尿病占糖尿病总发病人数的1％～10％，且近年来该病的发病率呈逐年上升趋势。
糖尿病的病因和发病机制较为复杂，至今尚未完全明了。目前认为1型糖尿病(type I diabetes，T1DM)是一种在遗传与环境相互作用下，以T细胞介导的特异性胰岛β细胞自身免疫性破坏为主要发病机制的一种疾病。1型糖尿病具有多基因遗传背景，易感性十分复杂，疾病的发生是多种基因相互作用、相互影响的结果。近年来，随着对1型糖尿病相关基因的研究日趋深入，证实了多种基因在1型糖尿病的发生发展中的作用，为1型糖尿病的早期诊断和治疗提供了理论依据。
细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4基因位于染色体2q33，编码T细胞表面的一种膜蛋白。研究表明，只有激活的T细胞才表达CTLA-4分子，并与抗原递呈细胞膜上的B7分子结合，传递负性调节信号，终止T细胞活化和抑制免疫反应的进行，对T细胞增生起负性调节作用。研究表明CTLA-4基因外显子I第17密码子49位点A/G多态性(rs231775)，导致CTLA-4信号肽区域内的苏氨酸变为丙氨酸，与机体免疫应答的过度激活相关，是1型糖尿病的独立危险因素之一。
现有技术检测1型糖尿病易感人群，采用杂交芯片法或玻璃板芯片法，以及采用taqman探针，前两种方法准确率低、假阴性和假阳性率较高，且不能批量检测；另一种直接测序法虽然准确率高，但其成本也很高，同样很难实现批量检测。
因此，有必要提出一种新的检测方法以解决上述问题。
【发明内容】
本发明的主要目的是提供一种辅助诊断1型糖尿病的方法，该方法操作简单、快速，使用成本低，结果准确，可以实现批量检测。
本发明的另一目的是提供一种用于检测1型糖尿病易感位点的试剂盒，该试剂盒包括PCR引物及含有该引物的试剂盒，其可以实现扩增与HRM分析。
为了解决上述问题，本发明采用的技术方案是：一种检测1型糖尿病易感位点的方法，包括如下步骤：(1)提取样品的基因组DNA，扩增样品的CTLA-4基因外显子中包含rs231775号位点的区域，得到扩增产物；(2)使用HRM分析技术检测扩增产物中SNP位点的基因型。
进一步的，CTLA-4基因的rs231775位点的基因型带有GG时，该CTLA-4基因所属样品的测试者对于1型糖尿病的易感性高于基因型不带GG的测试者。
进一步的，使用特异性引物扩增样品的CTLA-4基因外显子中包含rs231775位点的区域，该特异性引物是指针对CTLA-4基因上rs231775号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含上述SNP位点的DNA片段的引物对。
进一步的，所述特异性引物具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
进一步的，使用HRM分析技术直接检测扩增后包含上述SNP位点的DNA片段的引物对的基因型。
进一步的，将扩增后包含上述SNP位点的DNA片段的引物对转移至分析装置，然后使用HRM分析技术对该引物对的基因型进行分析。
进一步的，所述1型糖尿病易感位点的检测方法在体外非诊断性检测1型糖尿病易感性方面的应用。
为了解决上述问题，本发明采用的另一技术方案是：一种用于检测1型糖尿病易感位点的试剂盒，其可以对CTLA-4基因外显子中包含rs231775号位点的区域进行扩增及HRM技术分析。
进一步的，所述试剂盒包括特异性扩增CTLA-4基因外显子中包含rs231775位点的区域的特异性引物。
进一步的，所述特异性引物具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
进一步的，试剂盒的组分及含量包括5ul2X LightCycler480HighResolution Melting Master Mix、1.2ul25mM MgCl2溶液、1ul2μM PrimerMix、1ul5ng/μl左右DNA、1.8ul H2O、具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的特异性引物。
进一步的，所述试剂盒在检测1型糖尿病易感性方面的应用。
与现有技术相比较，本发明具有以下优点：采用HRM分析技术对扩增后的CTLA-4基因外显子中包含rs231775位点的区域进行基因型分析，该方法操作简单、快速，使用成本低，结果准确，可以实现批量检测。
【附图说明】
图1是CTLA-4基因rs231775位点基因型的HRM检测结果；
图2是Tapman探针法截图，显示了rs231775的一种SNP基因型的探针检测结果。
【具体实施方式】
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人、分子克隆、实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照厂商所建议的条件。
本发明提供了一种1型糖尿病易感位点的检测方法及试剂盒，所述方法包括如下步骤：(1)提取样品的基因组DNA，扩增样品的CTLA-4基因外显子中包含rs231775号位点的区域，得到扩增产物；(2)使用HRM分析技术检测扩增产物中SNP位点的基因型。该1型糖尿病易感位点的检测方法及检测试剂盒还可以用于检测1型糖尿病的易感性。
所述的rs231775位于CTLA-4的外显子中(片段重叠群contig：NT_005403.17位置54942132A＞G)，其中，脱氧核糖核酸(DNA)序列编号：rs231775位置基于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；引物1基于SEQID NO：2所示的核苷酸序列；引物2基于SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；扩增产物3基于SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
经过多年研究证明了CTLA-4基因单核苷酸多态性位点rs231775与1型糖尿病密切相关，而且发现了它的新功能：CTLA-4基因单核苷酸多态性位点rs231775位于CTLA-4外显子中的基因型的改变将导致1型糖尿病的发病风险升高，其中关联研究结果显示，在CTLA-4基因rs231775A→G在病例和对照组中的分布存在显著性差异(p＜0.05)，该SNP多态性可改变转录因子结合位点。
CTLA-4基因的详细序列可参见登录号为rs231775的核苷酸序列(可参见网址http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
实施例1：荧光PCR检测
一、实验材料
LightCycler480荧光定量PCR仪购自瑞士罗氏(Roche)公司，聚合酶链反应液(LightCycler480High Resolution Melting Master)由瑞士罗氏(Roche)公司定制合成。
二、引物及探针设计与合成：
以CTLA-4基因外显子的部分序列为模板，使用Primer Premier5软件分析引物，并由上海生工生物工程有限公司定制合成。
检测用引物：
CTLA-4基因rs231775上游引物序列：5′-CTTGGATTTCAGCGGCACA-3′(SEQ ID NO：2)
CTLA-4基因rs231775下游引物序列：5′-
GAAGAGAAGAAAAAACAGGAGAGTG-3′(SEQ ID NO：3)
三、样本检测：
实验共检测50例1型糖尿病病例和50例正常对照人群，每例收集血样标本约2ml，用酚/氯仿抽屉基因组DNA，抽提结果用微量紫外/可见光分光光度计(Thermo Fisher公司)检测。
按如下体系进行荧光PCR扩增，最后用roche lc480software1.5扫描并聚类分析
384孔板(ul)
LightCycler480High Resolution Melting Master Mix(2X) 5
MgCl2(25mM) 1.2
Primer Mix(2μM) 1
DNA(5ng/μl左右) 1
H2O 1.8
反应总体积 10
四、基因型检测结果：
基因组DNA抽提的检测结果：
所有样本的基因组DNA符合检测要求(260/280＞1.8，浓度＞10ng/ul)
实施例2：Taqman法检测CTLA-4基因rs231775位点的基因型
用Taqman法检测CTLA-4基因rs231775位点。挑选上述病例-对照组样本各10例进行Taqman分型实验，判断rs231775的基因型。
一、实验方法
Taqman探针方法使用美国应用生物系统公司的Taqman探针，苏州新海生物科技有限公司的Taqman Mix。
按如下体系进行PCR扩增，最后用roche lc480software1.5扫描并聚类分析
384孔板(ul)
Taqman Mix 5
Taqman Probe 0.1
DNA(5ng/μl左右) 1
H2O 3.9
反应总体积 10
二、实验结果
Taqman分型结果截图如图2所示。
最终，20例的Taqman分型结果与LightCycler480荧光PCR的HRM分析结果完全一致。
三、CTLA-4基因rs231775基因型和肺癌易感的关联分析
CTLA-4基因rs231775在1型糖尿病病人和对照中分布的比较采用RxCχ2检验.用SPSS软件进行统计分析，检测结果的SPSS软件分析结果如下表所示：
实施例3：1型糖尿病易感位点的检测试剂盒
本发明提供的检测试剂盒可以对CTLA-4基因外显子中包含rs231775位点的区域进行扩增及HRM技术分析，该检测试剂盒可以检测1型糖尿病的易感性，其包含有可扩增出CTLA-4基因外显子中包含rs231775位点的特异性引物及其他PCR-HRM相应试剂，PCR扩增与HRM分析的组分含量相同。
检测试剂盒供50人份检测应用，于-20℃避光保存，其组分及含量包括：
5ul2X LightCycler480High Resolution Melting Master Mix
1.2ul25mM MgCl2溶液
1ul2μM Primer Mix
1ul5ng/μl左右DNA
1.8ul H2O
具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的特异性引物各0.2uM。
本发明具有实用性的例证：
检测该个体的CTLA-4基因中rs231775位点的基因型，以此判断该个体患1型糖尿病的发病风险是否高于普通人群。
CTLA-4基因中rs231775位点的多态性可直接用于1型糖尿病的个性化治疗。
检测CTLA-4基因中rs231775位点的基因型也可用于诊断1型糖尿病。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用做参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。
本发明的技术内容和技术特点已揭示如上，然而熟悉本领域的技术人员仍可能基于本发明的教示及揭示进行种种不背离本发明精神的替换和修饰。因此，本发明的保护范围应不限于实施方式所揭示的内容，而包括各种不背离本发明的替换和修饰，均为本专利申请权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种1型糖尿病易感位点的检测方法，其特征在于：包括步骤：
(1)提取样品的基因组DNA，扩增样品的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)基因外显子中包含rs231775位点的区域，得到扩增产物；和
(2)使用高分辨熔解曲线(high-resolution melt，HRM)分析技术检测扩增产物中单核苷酸多态性(SNP)位点的基因型。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：CTLA-4基因的rs231775位点的基因型带有GG时，该CTLA-4基因所属样品的测试者对于1型糖尿病的易感性高于基因型未带有GG的测试者。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：使用特异性引物扩增样品的CTLA-4基因外显子中包含rs231775位点的区域，该特异性引物是指针对CTLA-4基因上rs231775号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含上述SNP位点的DNA片段的引物对。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述特异性引物具有SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：使用HRM分析技术直接检测扩增后包含上述SNP位点的DNA片段的引物对的基因型。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于：将扩增后包含上述SNP位点的DNA片段的引物对转移至分析装置，然后使用HRM分析技术对该引物对的基因型进行分析。
7.一种用于检测1型糖尿病易位点的试剂盒，其特征在于：对CTLA-4基因外显子中包含rs231775号位点的区域进行扩增及HRM技术分析。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括特异性扩增CTLA-4基因外显子中包含rs231775位点的区域的特异性引物。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述特异性引物具有SEQID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒的组分及含量包括5ul2X LightCycler480High Resolution Melting Master Mix、1.2ul25mMMgCl2溶液、1ul2μM Primer Mix、1ul5ng/μl左右DNA、1.8ul H2O、具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的特异性引物。
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