CN111593097A - 基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物、试剂、检测方法和系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物、试剂、检测方法和系统。所述基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物为根据维生素D受体基因Fok1(rs2228570)SNP位点多态性设计的引物和探针；基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的试剂、检测方法和系统分别为采用了所述基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物的试剂、检测方法和系统。本发明提供的所述基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物解决了现有技术的Fok1位点多态性检测存在设备昂贵、气溶胶污染、步骤繁琐等技术问题。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物、试剂、检测方法和系统。
背景技术
维生素D受体基因(vitamin D(1,25-dihydroxyvitamin D3) receptor,VDR),定位于12q13.11，全长63.5kb，有11个外显子，mRNA 长4,775nt，编码428个氨基酸残基组成的维生素D受体(VDR)蛋白，是维生素D3的核激素受体，该蛋白也是胆石酸的第二受体。VDR 属于转录调控因子，为类固醇激素/甲状腺类激素受体超家族的成员，作为配体诱导性复制因子发挥作用。该蛋白对基因表达的调节主要通过一系列代谢反应通路，包括免疫反应通路和肿瘤激活通路。
多项国内外研究证实，VDR基因与钙等金属离子在体内的吸收代谢，从而与骨折、骨质疏松、维生素D依赖性II型佝偻病等疾病有显著相关性。Fok1(rs2228570)，是维生素D受体唯一已知的可改变蛋白质结构单核苷酸多态性，具有种群差异性。该位点的基因型与人牙龈成纤维细胞和牙周韧带细胞转录激活、冠状动脉疾病、II型糖尿病、儿童牛奶蛋白过敏、结核易感性、云南白族人群特发性低枸橼酸尿症、中国汉族人群高脂血症等有关。Fok1(rs2228570)位于12 号染色体的47879112位置上，主要有TT、CT、CC三个基因型。
目前常用的针对Fok1(rs2228570)多态性检测方法有：
1、基于PCR扩增和单碱基延伸后，用MassARRAY或者一代测序仪进行SNP基因型的分型。存在设备昂贵；PCR扩增和单碱基延伸后，均需要一轮酶切消化，步骤繁琐、人力和试剂耗材的投入大；PCR扩增产物需要开盖处理，极易造成室内气溶胶污染，影响结果的准确性等问题。
2、利用两个正向引物及一个反向引物，PCR扩增后，经凝胶电泳在紫外光下见到根据片段大小区分开的产物条带，根据条带的有无判断目标SNP位点的基因型。存在相同的气溶胶污染的问题；并且在结果判断环节，需要凝胶电泳，而涉及到制胶、点样、跑胶、成像等诸多繁琐的环节，容易出错的同时，人力投入更大；以及结果以图片的形式呈现，判读过程依赖主观因素，容易出错的问题。
发明内容
为解决现有技术的Fok1位点多态性检测存在设备昂贵、气溶胶污染、步骤繁琐等技术问题，本发明提供一种解决上述问题的基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物。
一种基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物，包括根据维生素D受体基因Fok1(rs2228570)SNP位点多态性设计的引物和探针，序列如下：
VDR基因Fok1(rs2228570)正向扩增引物：
CTGGCCCTGGCACTGACTCTGGCTCT；
VDR基因Fok1(rs2228570)反向扩增引物：
GGTCAAAGTCTCCAGGGTCAGG；
VDR基因Fok1(rs2228570)基因型T探针：
5’-CTTACAGGGATGGAG-3’；
VDR基因Fok1(rs2228570)基因型C探针：
5’-CTTACAGGGACGGAG-3’。
所述基因型T探针5’端的荧光基团为VIC，3’端的淬灭基团为 Quencher和MGB。所述基因型C探针5’端的荧光基团为FAM，3’端的淬灭基团为Quencher和MGB。
引物和探针以混合液的形式存在，其比例为：(所述正向扩增引物：所述反向扩增引物：所述基因型T探针：所述基因型C探针：水) ＝(10:10:4:4:192)。
一种基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的试剂，包括所述基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物，以及进行Q-PCR反应所需的试剂。
一种基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的检测方法，包括以下步骤：
步骤一：提取获得待测样本DNA；
步骤二：将所述待测样本DNA、所述基于探针法实现维D受体Fok1 位点准确分型的试剂，按Q-PCR反应的步骤操作进行反应。
一种基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的系统，包括：
提取模块，用于提取获得待测样本DNA；
检测模块，用于将所述待测样本DNA、所述基于探针法实现维D 受体Fok1位点准确分型的试剂，按Q-PCR反应的步骤操作进行反应。
相较于现有技术，本发明通过采用所述基于探针法实现维D受体 Fok1位点准确分型的引物组合物，根据维生素D受体基因 Fok1(rs2228570)SNP位点多态性设计，上述序列的引物探针组合在有非特异性扩增的情况下，根据AT互换、GC互换的规则，调整引物 GC含量为60±2％，且调整后的引物Tm峰值单一，对引物序列进行改造而成的引物和探针。使检测通过一步Q-PCR即可完成，优点在于：
1.简单高效：一次Q-PCR反应，操作简单，时长2～3小时；2. 可推广性强，所涉及的主设备是实时荧光定量PCR仪，价格相对便宜，大部分机构均可配备；3.结果准确，结果的呈现以数字形式，不受主观判断的影响，客观真实；4.兼容性好，结果可以直接入相应的表格中，进行快速判读，样本处理能力强；5.污染风险小，PCR结束后无需开盖处理，不会产生气溶胶，不会造成假阳性。
由于Quencher是淬灭基团，它和荧光基团同时存在于一条DNA 链上时，荧光基团不能发出荧光。因此正常情况下，设备不能检测到荧光信号。而在进行Q-PCR反应时，探针特异性地结合到SNP位点，反应液中所包含的DNA聚合酶把探针从目的片段上剪切至反应液中，相应探针上的荧光基因也随之与淬灭基团Quencher分离，被设备所捕获，从而检测出目的SNP的具体基因型。
附图说明
图1是采用本发明提供的基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物进行检测得到的Melt Curve显示图；
图2是采用本发明提供的基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物进行检测得到的位点多态性分型效果图；
图3是图2的表格形式图；
图4是采用现有技术进行检测得到的Melt Curve显示图；
图5是采用现有技术进行检测得到的位点多态性分型效果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物包括：
VDR基因Fok1(rs2228570)正向扩增引物：
CTGGCCCTGGCACTGACTCTGGCTCT(对应为序列表中的SEQ No.1)；
VDR基因Fok1(rs2228570)反向扩增引物：
GGTCAAAGTCTCCAGGGTCAGG(对应为序列表中的SEQ No.2)；
VDR基因Fok1(rs2228570)基因型T探针：
5’-CTTACAGGGATGGAG-3’(对应为序列表中的SEQ No.3)；
VDR基因Fok1(rs2228570)基因型C探针：
5’-CTTACAGGGACGGAG-3’(对应为序列表中的SEQ No.4)。
其中，所述基因型T探针5’端的荧光基团为VIC，3’端的淬灭基团为Quencher和MGB。所述基因型C探针5’端的荧光基团为FAM， 3’端的淬灭基团为Quencher和MGB。
基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的试剂，包括所述基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物，以及 Q-PCR所需试剂，二者的具体组分在下文检测方法中详述。
基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的检测方法，包括以下步骤：
1、DNA提取。采用Crude DNA Extraction Kit(for Blood) (Vazyme)，根据说明书的步骤提取94份DNA(S1～S94)，保存于-20℃备用。
2、准备Q-PCR扩增体系。采用SNP分型反应在试剂ChamQ Geno-SNP Probe MasterMix(Vazyme)，具体如下：
| 试剂 | 体积(μL) |
| TaqProbe 2X Q-PCR Mastermix | 10.0 |
| Primer&Probe Mix | 2.0 |
| nuclease free water | 3.0 |
| Template | 5.0 |
| 总体积 | 20 |
其中，Primer&Probe Mix为所述基于探针法实现维D受体Fok1 位点准确分型的引物组合物。各组分以100pmol/ul的浓度，按 10:10:4:4:192(水)的比例与双蒸水混合而成(如下)。
| 引物探针 | 浓度 | 体积(μL) |
| Fok1(rs2228570)正向引物 | 100pmol/ul | 5.0ul |
| Fok1(rs2228570)反向引物 | 100pmol/ul | 5.0ul |
| Fok1(rs2228570)基因型T探针 | 100pmol/ul | 2.0ul |
| Fok1(rs2228570)基因型C探针 | 100pmol/ul | 2.0ul |
| ddH2O | 96.0ul |
3、Q-PCR扩增。采用Applied Biosystems QuantStudio 5设备按下列程序进行:
4、输出结果。如图1～图3所示，分别是结果的Melt Curve显示图，位点多态性分型效果图及其表格形式。
在图2中，左上部分(蓝色)代表纯合的TT型、中部(绿色) 代表杂合的CT型，右下部分(红色)代表纯合的CC型。
请同时参阅图4、图5，分别是采用现有技术进行检测得到的Melt Curve显示图和位点多态性分型效果图。与现有技术相比，采用本发明提供的所述基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物进行检测，获得的峰图单一，特异性好。成功分型的成功率也由 89％左右上升至接近100％。
基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的系统，包括：
提取模块，用于提取获得待测样本DNA；
检测模块，用于将所述待测样本DNA、所述基于探针法实现维D 受体Fok1位点准确分型的试剂，按Q-PCR反应的步骤操作进行反应，输出反应结果；
以及可自动进行Q-PCR操作的设备。所述检测模块依托所述设备按所述基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的检测方法对所述待测样本DNA进行检测；并将结果以可视化数据显示。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。
序列表
<110> 长沙金域医学检验实验室有限公司
<120> 基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物、试剂、检测方法和系统
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<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
ctggccctgg cactgactct ggctct 26
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
ggtcaaagtc tccagggtca gg 22
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
cttacaggga tggag 15
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
cttacaggga cggag 15
Claims (7)
1.一种基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物，包括根据维生素D受体基因Fok1(rs2228570)SNP位点多态性设计的引物和探针，其特征在于，序列如下：
VDR基因Fok1(rs2228570)正向扩增引物：
CTGGCCCTGGCACTGACTCTGGCTCT；
VDR基因Fok1(rs2228570)反向扩增引物：
GGTCAAAGTCTCCAGGGTCAGG；
VDR基因Fok1(rs2228570)基因型T探针：
5’-CTTACAGGGATGGAG-3’；
VDR基因Fok1(rs2228570)基因型C探针：
5’-CTTACAGGGACGGAG-3’。
2.根据权利要求1所述的基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物，其特征在于：所述基因型T探针5’端的荧光基团为VIC，3’端的淬灭基团为Quencher和MGB。
3.根据权利要求1所述的基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物，其特征在于：所述基因型C探针5’端的荧光基团为FAM，3’端的淬灭基团为Quencher和MGB。
4.根据权利要求1至3任一所述的基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物，其特征在于，引物和探针以混合液的形式存在，其比例为：(所述正向扩增引物：所述反向扩增引物：所述基因型T探针：所述基因型C探针：水)＝(10:10:4:4:192)。
5.一种基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的试剂，其特征在于：包括权利要求1至4任一所述的基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物，以及Q-PCR反应所需的试剂。
6.一种基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：提取获得待测样本DNA；
步骤二：将所述待测样本DNA、权利要求1至4任一所述的基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物、以及Q-PCR反应试剂，按Q-PCR反应的步骤操作进行反应。
7.一种基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的系统，其特征在于，包括：
提取模块，用于提取获得待测样本DNA；
检测模块，用于将所述待测样本DNA、权利要求1至4任一所述的基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物、以及Q-PCR反应试剂，按Q-PCR反应的步骤操作进行反应。
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