CN102146438A

CN102146438A - 用于检测酒精性肝病易感性的试剂盒

Info

Publication number: CN102146438A
Application number: CN 201010600143
Authority: CN
Inventors: 韩俊领; 刘志霈; 周毓玲; 杜宏伟; 李楠; 靳霞; 刘蓉华
Original assignee: TIANJIN BINHAI UNION GENE TECHNOLOGY Co Ltd; XIEHE STEM CELL GENE ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: TIANJIN BINHAI UNION GENE TECHNOLOGY Co Ltd; XIEHE STEM CELL GENE ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2010-12-22
Filing date: 2010-12-22
Publication date: 2011-08-10

Abstract

本发明公开了一种用于检测酒精性肝病易感性的试剂盒，它检测与酒精性肝病关系密切的三个基因：乙醇脱氢酶的ADH2基因、乙醛脱氢酶的ALDH2基因和细胞色素P4502E1的CYP2E1基因。可同时检测SNP位点包括：ADH2基因的rs1229984位点、ALDH2的rs671位点和CYP2E1的rs2031920位点。利用本试剂盒，通过检测一组与酒精性肝病易感性相关的基因及位点，利用特异性引物和探针，通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术，可清晰的判断受检人群是否携带“酒精性肝病易感基因”，将酒精性肝病易感人群从人群中筛选出来，改变不良的生活习惯，达到预防的目的。

Description

用于检测酒精性肝病易感性的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种疾病易感性检测用的试剂盒，尤其是一种检测酒精性肝病易感性的试剂盒，通过检测ADH2、ALDH2、CYP2E1的单核苷酸多态性位点(SNP)，来预测个体对白血病的易感性。

背景技术

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是由于长期饮酒导致的肝损害，表现为3种形式，即酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝硬化。这三种形式可单独或混合存在。据统计，全世界约有1500万-2000万人酗酒，其中约10％-20％(150万～400万)有不同程度的酒精性肝病。在我国，随着人民生活水平的不断提高，经济条件的改善，近年来ALD的发病率也呈逐年上升趋势，酒精已成为继病毒之后导致肝损伤的第二大原因。

饮酒后乙醇主要在小肠吸收，其中90％～95％在肝内代谢。乙醇在肝脏内被胞质内的ADH和微粒体内的CYP2EI为主的微粒体乙醇氧化系统分解为乙醛。在通常情况下，以ADH为主起作用；而慢性习惯性饮酒者摄入酒精后则诱导CYP2EI，乙醇由CYP2EI进行代谢。生成的乙醛，主要经过ALDH代谢为乙酸，后者进入三羧酸循环，代谢为二氧化碳和水。ADH、ALDH和CYP2EI均有遗传多态性，不同基因个体表达的酶活性不同，因而影响机体对乙醇的敏感性。

迄今为止，ADH已明确有7种同工酶(ADH1～7)，其中ADH2在肝脏的酒精代谢过程中起着重要的作用。人类ADH2基因位于4号染色体，有3个等位基因：ADH2*1型等位基因在欧美血统人群中最为常见，其表达产物缺乏乙醇脱氢酶活性，诱导代谢乙醇的能力较低；ADH2*2型等位基因最常见于亚洲血统人群，其表达产物的生物活性是ADH2*1的40倍，因此具有ADH2*2基因型酶的个体代谢乙醇的速度快。ADH2*3仅见于非洲血统的人群。ADH2*2基因型个体乙醇代谢速度较快，容易引起其代谢产物乙醛的蓄积，体内过量的乙醛不仅可以直接损害肝细胞，导致脂肪在肝细胞内堆积，还可以通过激活Kupffer细胞生成大量细胞因子而引起炎症。

人类ALDH基因家族中有12个成员，其中ALDH2是和嗜酒密切相关并具有多态性的主要代谢酶，在亚洲人群有高度遗传多态性。ALDH2基因位于染色体12q24.2，有2个等位基因ALDH2*1和ALDH2*2。ALDH2*1为野生型，表达产物具有生物活性，而ALDH2*2基因型在第12外显子出现碱基替换(G→A)导致ALDH2第487位发生谷氨酸和赖氨酸的替换，从而使ALDH2丧失酶活性，使乙醛在体内蓄积，体内过量的乙醛会增加ALD的患病风险。

微粒体乙醇氧化系统是一组混合功能的氧化酶系，其催化作用有赖于细胞色素P450的参与，其中CYP2EI与酒精代谢密切相关，被认为是酒精性肝病的易感基因。CYP2EI基因位于人类第10号染色体上，长11413bp，包括9个外显子和8个内含子。CYP2EI基因存在6种限制性内切酶片段长度多态性：Tap I、Rsa I、Dra I、Msp I多态以及5’-端调控区的Rsa I和Pst I多态。其中位于-1019bp位点的5’-端调控区Rsa I位于转录因子结合区域，可能影响基因表达，当发生点突变C→T时，导致肝脏CYP2EI的转录增加，从而促进乙醇代谢，产生损伤肝脏的活性氧物质，与酒精性肝损害有关。

现有技术检测酒精性肝病易感人群，采用杂交芯片法或玻璃板芯片法，以及利用taqman探针，该方法准确率低、假阴性和假阳性率较高，且不能批量检测；另一种直接测序法，虽准确率高，但其成本高、同样不能实现批量检测，因此现有方法均无法满足大规模基因筛选的要求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，通过检测一组与酒精性肝病易感性相关的基因及位点，利用特异性引物和探针，通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术，综合检测和分析受检人群是否携带“酒精性肝病易感基因”，将酒精性肝病易感人群从人群中筛选出来，改变不良的生活习惯，达到预防的目的。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于检测酒精性肝病易感的检测试剂盒，它包括与酒精性肝病关系密切的三个基因的组合：乙醇脱氢酶的ADH2基因、乙醛脱氢酶的ALDH2基因和细胞色素P4502E1的CYP2E1基因。

包括下述SNP位点：ADH2基因的rs1229984位点、ALDH2的rs671位点和CYP2E1的rs2031920位点。

所述的用于检测酒精性肝病易感的基因组合，用于针对所述位点设计特异性的引物对和探针。

所述的用于检测酒精性肝病易感的基因组合设计的特异性引物，所述的特异性引物对的序列如下，用于进行多重PCR扩增，能同时扩增出上述3个位点的基因片段：

针对rs1229984位点：TCACCCCTTCTCCAACACTCT (SEQ ID NO：1)

CTTTATTCTGTAGATGGTGGCTGTA(SEQ ID NO：2)

针对rs671位点：AGTCACCCTTTGGTGGCTAC(SEQ ID NO：3)

CCACCAGCAGACCCTCAAG(SEQ ID NO：4)

针对rs2031920位点：ACAAGTGATTTGGCTGGATTGT(SEQ ID NO：5)

AGAGAATGTTTTTCATTCTGTCTTCT(SEQ ID NO：6)

所述的用于检测酒精性肝病易感的基因组合设计的特异性探针，所述的特异性探针序列如下，能同时对3个位点进行检测分型：

针对rs1229984位点：

ACGCACGTCCACGGTGATTTYAGATGGTGGCTGTAGGAATCTGTC(SEQ ID NO：7)

针对rs671位点：

GGATGGCGTTCCGTCCTATTGGTCCCACACTCACAGTTTTCACTT(SEQ ID NO：8)

针对rs2031920位点：

CGTGCCGCTCGTGATAGAATCCAGTTTCTCCCTCGCTGTTTTTAT(SEQ ID NO：9)

所述的引物或探针，用于通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术特异性检出酒精性肝病易感基因。

本试剂盒的组分和含量包括：

250ul 10×PCR反应缓冲液，

20ul 10mM dNTP混合液，

450ul 25mM MgCl2溶液，

45ul(5U/ul)Taq DNA聚合酶，

50ul特异性引物(6条)混合液(10uM each)，

15ul特异性延伸探针(3条)混合液(10uM)，

90ul ExoI(10U/ul)，

450ul SAP(1U/ul)，

140ul 10×SAP反应缓冲液，

1700ul Extension Dilution Buffer，

90ul 10×Extension Mix，

10ul DNA polymerase，

3500ul Hybridization Solution，

200ul Hybridization Additive，

本发明的有益效果是：(1)分型结果准确性高达99％以上，重复性好，没有假阳性影响；(2)同时检测多个SNP位点，检测成本低；(3)通量高，可一次对384个样本进行检测；(4)操作简便；(5)灵敏度高，每次检测的DNA用量仅2ng。本发明通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术，利用特异性引物和探针对单核苷酸多态性(SNP)的基因分型准确率超过99％。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。下列实施例中未注明具体条件的实验放大，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。

1DNA的提取：

取受检者外周静脉血，加入同等体积的细胞裂解液，裂解两次，充分裂解白细胞，离心弃上清后加入蛋白酶K缓冲液和蛋白酶K(50ug/ml)，65℃孵育10分钟，异丙醇沉淀、75％乙醇洗涤两次，晾干后溶于适量TB溶液中。

2PCR扩增

取受检者的基因组DNA提取液加入96孔板中，进行多重PCR扩增：

反应总体积5ul，其中10M mol/L dNTPs 0.0375ul，10×PCR Buffer0.5ul，25mmol/L MgCl₂1ul，模板DNA 30ng，6重引物混合液10uM/L each0.025ul，Amplitaq Gold(5U/ul)0.1ul，补足水到5ul。置于PCR仪上反应：预变性94℃ 1min；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1min，40个循环；Hold 4℃。

扩增引物混合液包括下列引物：

1F TCACCCCTTCTCCAACACTCT(SEQ ID NO：1)

1R CTTTATTCTGTAGATGGTGGCTGTA(SEQ ID NO：2)

2F AGTCACCCTTTGGTGGCTAC(SEQ ID NO：3)

2R CCACCAGCAGACCCTCAAG(SEQ ID NO：4)

3F ACAAGTGATTTGGCTGGATTGT(SEQ ID NO：5)

3R AGAGAATGTTTTTCATTCTGTCTTCT(SEQ ID NO：6)

3纯化

在PCR扩增产物中加入0.2ul ExoI，1ul SAP，0.3ul 10×SAP反应缓冲液和1.5ul去离子水。将96孔板放入PCR仪中进行纯化，纯化程序：37℃ 30min，96℃ 10min，Hold 4℃。

4引物延伸反应

纯化后的PCR产物中加入延伸反应混合物：extension Dilution Buffer3.76ul，延伸探针混合液(1010uM/L each)0.03ul，20×Extension Mix 0.2ul，DNA聚合酶0.02ul，去离子水3ul。将装有延伸反应混合物的96孔板再次放入PCR仪中进行延伸反应，反应程序：Hold 96℃ 3min；94℃ 20sec，40℃ 11sec，46个循环；Hold 4℃。

延伸探针混合液包含下列探针：

1P ACGCACGTCCACGGTGATTTYAGATGGTGGCTGTAGGAATCTGTC(SEQ ID NO：7)

2P GGATGGCGTTCCGTCCTATTGGTCCCACACTCACAGTTTTCACTT(SEQ ID NO：8)

3P CGTGCCGCTCGTGATAGAATCCAGTTTCTCCCTCGCTGTTTTTAT(SEQ ID NO：9)

以上延伸探针5’端具有与微阵列芯片地址引物对应的地址序列。

5延伸反应结束后，加入杂交液可与微阵列芯片进行杂交反应。

孵育温度42℃，孵育时间2小时。

6激光扫描检测荧光信号

同时检测上述3个基因对预测、比较个体的酒精性肝病易感性具有重要意义。本发明将与酒精性肝病易感、发生密切相关的基因进行组合，通过大量的筛选数据表明所述3个基因ADH2、ALDH2和CYP2E1基因，如3个基因都有位点发生突变，则患急性白血病的概率最高；没有基因有位点发生突变患白血病的概率较小。

本发明采用单核苷酸延伸技术和微阵列芯片技术相结合的方法，针对上述3个位点，设计一套多重PCR引物，在一个扩增反应中同时扩增携带SNP位点的3个基因片段，根据SNP位点上游5’端23-25bp的序列设计寡核苷酸探针，此探针与序列杂交后3’末端位于snp5’端上游1bp处。检测时聚合酶根据SNP携带的碱基在探针末端结合上一个携带荧光的ddNTP，根据结合的ddNTP不同，其所携带的荧光颜色也不相同，在探针的5’端根据与微阵列芯片结合位置的不同设计有不同的20bp的Tag地址序列，与微阵列芯片上对应的序列互补，延伸后的探针与微阵列芯片上对应区域上的序列杂交，不同的探针结合在芯片的不同区域，通过检测对应位置的荧光，达到同时进行多个SNP分型的目的。

疾病的发生是一个十分复杂的过程，受到多个蛋白和基因的共同影响，其中任何一个酶的改变都会影响疾病的易感性。传统的基因检测疾病的方法受到方法的限制，往往只能对一到两个基因的多态性进行分析，只能覆盖一部份患病风险人群，对于由于其他基因上的多态性造成的疾病患病风险不能及时的预警，检测的准确性因此会大幅降低，受检者不能全面的了解自身疾病的易感情况。

本发明针对一种疾病不同的患病途径检测多个相关的基因和其多态性位点，能更准确更全面的检测受检者不同患病途径的患病风险，能给受检者提出具有针对性和有效地健康建议，及时有效的避免其疾病的发生。

由于本发明使用的检测方法可以高通量，自动化的检测SNP，大幅降低了检测成本，可以对不同患病途径的多个基因同时进行检测，本发明针对白血病不同的患病途径的关键酶基因寻找挑选了3个多态性位点，能更准确更全面的检测受检者不同患病途径的患病风险，能够给受检者提出具有针对性的健康建议，及时有效的避免其疾病的发生。本发明通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术，利用特异性引物和探针对单核苷酸多态性(SNP)的基因分型准确率超过99％，同时检测上述3个基因对检测、比较个体的酒精性肝病易感性具有重要意义。

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims

1.一种用于检测酒精性肝病易感性的试剂盒，其特征在于，包括：同时检测ADH2基因的rs1229984位点、ALDH2的rs671位点和CYP2E1的rs2031920位点的特异性引物及对应的延伸探针，Taq酶，dNTP混合液，MgCl₂溶液，10×PCR反应缓冲，ExoI，SAP，10×SAP反应缓冲液，ExtensionDilution Buffer，10×Extension Mix，DNA polymerase，HybridizationSolution，Hybridization Additive，20×Wash Buffer 1，64×Wash Buffer2，去离子水，微阵列芯片。

2.根据权利要求1所述的用于检测酒精性肝病易感性的试剂盒，其特征在于：所述的特异性引物对是针对ADH2基因的rs1229984位点、ALDH2的rs671位点和CYP2E1的rs2031920位点而设计，能特异性扩增出包括上述SNP位点的DNA片段的引物对。

3.根据权利要求1所述的用于检测酒精性肝病易感性的试剂盒，其特征在于：所述的特异性延伸探针是针对ADH2基因的rs1229984位点、ALDH2的rs671位点和CYP2E1的rs2031920位点而设计，能通过单核苷酸延伸和微阵列技术检测出这三个SNPs位点基因型的探针。

4.根据权利要求1所述的用于检测酒精性肝病易感性的试剂盒，其特征在于：所含的特异性引物对选自具有SEQ ID NO：1，2所示核苷酸序列的引物对、具有SEQ ID NO：3，4所示核苷酸序列的引物对、具有SEQ ID NO：5，6所示核苷酸序列的引物对。

5.根据权利要求1所述的用于检测酒精性肝病易感性的试剂盒，其特征在于：所含的特异性延伸探针选自具有SEQ ID NO：7、8、9所示的延伸探针。

6.根据权利要求1所示的用于检测酒精性肝病易感性的试剂盒，其特征在于：试剂盒的组分和含量包含250ul 10×PCR反应缓冲液，20ul 10mM dNTP混合液，450ul 25mM MgCl₂溶液，45ul 5U/ul Taq DNA聚合酶，50ul每条10u的6条特异性引物混合液，15ul每条10uM的3条特异性延伸探针混合液，90ul 10U/ul ExoI，450ul 1U/ul SAP，140ul 10×SAP反应缓冲液，1700ulExtension Dilution Buffer，90ul 10×Extension Mix，10ul DNApolymerase，3500ul Hybridization Solution，200ul HybridizationAdditive，2500ul 20×Wash Buffer 1，800ul 64×Wash Buffer 2，去离子水20ml，一个供380人份检测应用的384孔12重微阵列芯片，试剂盒保存温度为-20℃。