JP2017538404A - 癌を診断及び/又は観察するための循環無細胞rnaの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2014年11月14日に出願された米国仮特許出願第62/080,022号、2015年9月4日に出願された同第62/214,756号、及び2015年9月28日に出願された同第62/233,935号の利益を主張するものであり、その内容をその全体について参照により本明細書に援用する。
本発明は、様々な型の癌を診断する及び/又は観察するための無細胞核酸、特に無細胞RNAの使用に関する。
ヒト血中の無細胞(cf)核酸、DNAとRNAの両方、の存在は、1940年後半には知られていて、試験されていた。これらの分子が血流中に放出される機構は、まだそこまで明らかになっていなかった。それは、様々な組織由来の細胞のアポトーシスやネクローシスの結果であり得るか、或いは、RNAの場合には、核酸は、血中に分泌される小胞内に含まれるか、又はその中のRNアーゼから保護され得る。無細胞DNA(cfDNA)の有用性は最近、癌を診断すること及び癌治療の応答を観察することの両方の能力で強く実証された。次世代配列決定法などのPCRベースの配列決定技術における最近の進展が、cfDNAの変異を検出すること、そしてそれにより、癌の素因突然変異、並びに癌のドライバー突然変異を認識することを可能にした。従来の腫瘍組織生検では、記号論理的又は医学的根拠が得られないことも多い。転移癌患者からの腫瘍組織サンプルが入手できないときには、液体生検検体(例えば、血液)が、転移性病巣のうちの1つの生検検体に伴う疼痛、危険、及び費用なしに迅速に実行できる代替手段を提供する(Bettegowda C et al. Detection of Circulating Tumor DNA in Early- and Late-Stage Human Malignancies. Sci Transl Med 2014; 6, (224))。腫瘍組織生検と比較して、血液検体を採取する相対的な容易さが、現在、腫瘍DNAの連続分析を容易に行うこと、そしてそれにより、腫瘍が初期治療に順応して、再発し始めた場合に、薬剤抵抗性クローンの出現を追跡することを可能にした。そして、患者のcfDNAの再分析が、出現した新しい癌ドライバー突然変異の確認に役立ち、そして、新しく指図される治療法が設計されるのを可能にするだろう。
本発明は、とりわけ、様々な型の癌を診断する及び/又は観察するのに有用となり得る希少種を確認する、無細胞核酸、特に無細胞RNA(cfRNA)の改良された検出のための組成物、方法、及びシステムを提供する。本明細書中で更に詳しく述べられた理由のために、様々な実施形態において、RNA種は、様々な型の癌を診断及び/又は観察するために、DNA種よりも使用しやすい可能性がある。一般的に、RNAの突出した種を検出する能力は周知である。しかしながら、増強された感度を用いて少数(希少)種のRNAを検出する能力は、これまで事実上解決されていない問題である。
本発明の実施は、別の方法で示されない限り、当業者に周知の分子生物学、微生物学、細胞生理学、生化学、核酸化学、及び免疫学の従来技術を利用する。斯かる技術は、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, fourth edition (Sambrook et al., 2012) and Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook and Russel, 2001), (jointly referred to herein as "Sambrook"); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987, including supplements through 2014); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Antibodies: A Laboratory Manual, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (Greenfield, ed., 2014), Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000, (including supplements through 2014) and Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells (Makrides, ed., Elsevier Sciences B.V., Amsterdam, 2003)などの文献において完全に説明されている。
別の方法で規定されない限り、本明細書中に使用されるすべて技術用語及び学術用語は、本願発明が関係する当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。
RNAは元々、非常に不安定で、易崩壊性であり、そのため保護的な細胞環境外では安定である又は検出できる可能性が低いと考えられた。DNAがある遺伝子の1つのコピー(又は増幅事象において、複数のコピー)を含んでいるとき、遺伝子の転写が、mRNA形態でその遺伝子の多数のコピーを生じる可能性がある。mRNAは、DNAの転写領域内と同じ遺伝情報を含んでおり、そのため、同じ突然変異が両分子内に存在するはずである。そして、理論的に、ある遺伝子が100回転写されるなら、その突然変異遺伝子の検出感度もまた100倍増強されるはずである。cfRNA分析の成功の決定要素の1つは、診断解析に十分な腫瘍起源のcfRNAが血中に存在するかどうか、そして、それが容易かつ首尾よく単離できるかどうかである。従って、本明細書中に記載した方法論によると、循環核酸からDNAに比べて30〜60倍を超えるほど多くのRNAが検出される結果を得ることが可能である。これは多くの有用性に役立ち、その1つが、腫瘍特異性突然変異を得られたcDNAで検出できることである。
10=K×2-(Ct(EML40ALK)-Ct(βアクチン)(デルタCt既知))
X=K×2-(Ct(EML40ALK)-Ct(βアクチン)(デルタCt未知))
未知の相対発現=X=10×2-デルタCt未知/2-デルタCt既知
CtEML4-ALK=傾き×X(Eml4-ALKの相対発現)+Y切片
Xの解答(未知サンプルの相対発現)
X=相対発現未知サンプル=(Ct未知サンプル−std曲線のY切片)/std曲線の傾き
本発明のいくつかの態様において、本明細書中に記載した組成物及び方法論は、無細胞核酸、特に無細胞RNAを定量するのに使用され得る。定量化は、RNAの主要な種、並びに少数種について達成され得る。正確な診断が直面する難題は、癌療法に対する抵抗性を予測、診断、及び/又は診断の助けとなり得る、並びに/或いは、変異体又は(単数若しくは複数の)抵抗性細胞の出現を示すわずかな(希少な)RNA種の検出である。本発明のいくつかの態様において、検出され得るRNAの少数種は、野性型RNAの約0.01%〜60%に存在している。いくつかの実施形態において、検出され得るRNAの少数種は、野性型RNAの少なくとも約0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、又は1%に存在している。他の実施形態において、検出され得るRNAの少数種は、野性型RNAの少なくとも約2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、又は20%に存在し得る。他の実施形態において、検出され得るRNAの少数種は、野性型RNAの少なくとも約21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、又は30%に存在し得る。他の実施形態において、検出され得るRNAの少数種は、野性型RNAの少なくとも約31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、又は40%に存在し得る。他の実施形態において、検出され得るRNAの少数種は、野性型RNAの少なくとも約41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、又は50%に存在し得る。他の実施形態において、検出され得るRNAの少数種は、野性型RNAの少なくとも約51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、又は60%に存在し得る。上記実施形態のいずれにおいても、検出され得るRNAの少数種は、多くても先に示したパーセンテージのいずれか、及び先に示したパーセンテージのいずれかからの下限と上限の組み合わせを含む範囲内でも存在する。
無細胞核酸、特に無細胞RNAを使用して様々な型の癌を診断及び/又は観察するための組成物、システム及び方法を本明細書中に記載する。cfRNAは、癌に罹患しているか又は癌に罹患していることが疑われる個体(例えば、医師の看護下にある患者)を、彼らがどんな型の癌に罹患しているか決定するための、及び/又は彼らが癌に関連する突然変異(すなわち、癌のバイオマーカー)を有するかどうか決定するために、及び/又は彼らが癌治療に対して抵抗性表現型若しくは抵抗性遺伝子型を有する(又は発現する)か否か決定するために、診断するのに有用である。加えて、本明細書中に開示された組成物、システム、及び方法は、抵抗性表現型又は抵抗性遺伝子型が発現されたときに迅速に検出するために個体を経時的に(例えば、比較的長期間にわたり経時的に)観察するのに使用され得る。cfDNAを使用しても容易に達成できない、診断及び/又は観察の確度と特異性は、cfRNAを使用することによって達成可能である。本明細書中に更に記載したように、発現の範囲が重なることのない癌に罹患している個体と健常人との間のcfRNA計測で見られる統計学的有意差は、癌の検出(早期検出を含む)及び癌の再発の観察に関して利点を提供する。必要に応じて、医師は、癌治療薬又は化合物に対する抵抗性の出現に対処するために適切なステップを採り得る。
本発明はまた、出現する抵抗性突然変異が検出できるような高感度検出を達成するための組成物も提供する。一態様において、システムは、生物学的サンプル(血漿など)を単離するための試薬、(単数若しくは複数の)RNA安定化剤、(単数若しくは複数の)抽出カラム、(単数若しくは複数の)溶出溶液だけでなく、逆転写に必要とされる試薬、並びに腫瘍/癌バイオマーカーに特異的なプライマー/プローブを含むことを条件とする。いくつかの実施形態において、システムは、方法論に関する取扱説明書を含むキットである。任意選択で、システムは、正常又は野生型の転写産物について突然変異、融合転写物、及び他の希少な転写産物のRNA収量の計算に関する取扱説明書を含む。
いくつかの実施形態において利用された無細胞RNA抽出、逆転写及びPCR増幅手順の代表的なプロトコールを以下に記載する。以下で記載したプロトコールは、市販のキット及び/又は試薬に付いてきた製造業者の取扱説明書に記載されていなかった発明者によってなされた改変を含む。
1)(RNA安定化剤の入った)Streck(登録商標)RNA BCTチューブ内に患者から採血する。
2)患者から採血後7日以内に、遠心分離にかけて、他の血液層と無細胞RNA血漿とを分離する。
3)最上層を慎重にピペット操作で取り除くことによって、白血球層から血漿層を取り除く。
4)血漿のスピンダウンによって約1〜3mlの血漿を抽出する。
・RNA安定化血液全体から血漿を分離した直後に抽出することによって、RNAの最大量が回収される。
5)余分な血漿を1mlのアリコートで−80℃にて冷凍する。
6)核酸の抽出を次のようにしておこなった:
a.QIAamp(登録商標)Circulating Nucleic Acid Kitの使用
i.単離すべきサンプル数に対して必要とされる分量で、キットに含まれたバッファー:ACB、ACW1、及びBuffer ACW2を調製し、
ii.キットに記載された反応あたりの分量でバッファーACLに担体RNA(1μg)を加え、
iii.プロテイナーゼKと血漿を60℃にて1時間インキュベートし、
iv.バッファーACBを溶解物に加え、
v.氷上で5分間インキュベートし、
vi.QIAampミニカラムに混合物を加え、真空を用いて通過した液体を吸い出し、
vii.600μlのBuffer ACW1をQIAamp Mini Columnに加える。真空ポンプを用いてカラムを通過した液体を吸い出し、
viii.750μlのBuffer ACW2をQiaAmp Miniカラムに加える。真空を使用して通過した液体を吸い出し、
ix.カラムの中心に60μlのリボヌクレアーゼ不含デオキシリボヌクレアーゼを直接加え、そして、カラム上で室温にて15分間インキュベートすることによって、カラム上でDNAのデオキシリボヌクレアーゼ消化を実施する。
b.2.5μlのデオキシリボヌクレアーゼストック、10μlのRDDバッファー、87.7μlの水(リボヌクレアーゼ不含)を使用したリボヌクレアーゼ不含デオキシリボヌクレアーゼ(Qiagen Cat No.79254)の調製
i.先の(6)(a)のステップvii及びviiiを繰り返し、
a.600μlのBuffer ACW1をQIAamp Mini Columnに加える。真空ポンプを用いてカラムを通過した液体を吸い出し、
b.750μlのBuffer ACW2をQiaAmp Miniカラムに加える。真空を使用して通過した液体を吸い出し、
ii.追加ステップ:
1.750μlのエタノール(96〜100%)をQIAampミニカラムに加える。真空を用いて通過したエタノールを吸い出し、
2.遠心分離によって水気がなくなるまで2mlの清潔なチューブ内でミニカラムを遠心分離にかけ、
3.56℃にて10分間加熱することによってカラムを更に乾燥させる
iii.溶出ステップ
1.製造業者は、QIAamp Mini膜の中心に30〜150μlのバッファーAVEを配置し、室温にて3分間インキュベートし、そして2,000×gにて1分間遠心分離して、核酸を溶出することによって、溶出が実施されると提案した。
2.製造業者はまた、RNeasy Clean upカラムにを使用した更なる浄化を用いれば、DNAが、デオキシリボヌクレアーゼ不含リボヌクレアーゼを使用して溶出溶液中で消化されることも提案した。結果:この手順は、失敗するか、或いは非常にわずかしか若しくはまったくRNA又は結果として生じるcDNAが得られないことがわかった。
3.製造業者は、カラム上でのデオキシリボヌクレアーゼ処置が機能しないであろうと強く示唆した。発明者らは、溶液中でDNAを逆転写し、そして消化する別の市販品:Quantitect Reverse Transcriptionキットの製造業者の提案に従って試してみた。結果:このQuantitect Reverse Transcriptionキットは、βアクチンプライマー/プローブを用いてPCR増幅したとき、非常にわずかしか若しくはまったく、結果として生じるcDNAシグナルを生じなかった。
4.発明者らは、同じバッファーを用いて2回溶出し、次に、
a.60μlのバッファーAVEをQIAamp Mini膜の中心に配置し、室温にて3分間インキュベートし、20,000×gにて1分間遠心分離し、回収チューブから溶出液を取り出し、それをQIAmp Mini膜上に再び戻し、更に3分間インキュベートし、そして遠心分離して、溶出した。
b.DNAがカラム上で消化されたので、浄化は必要なかった。
5.次に、RNAを、VILO逆転写酵素キット(Life Technologies)及びランダム六量体プライマーを使用してcDNAに逆転写し、続いて、室温にて10分間ランダム六量体を結合させ、42℃にて60分間伸長させ、85℃にて15分間酵素を熱不活化した。
a.結果として生じるcDNAを、製造業者の取扱説明書に従ってZYMO ssDNA及びRNA浄化カラムを使用して精製した。これは、いくつかの実施形態においておこなうことができる。
b.βアクチンプライマー/プローブを使用したcDNAのPCRを、RNAの相対量を決定するために使用した。RNA濃度のQUBIT測定値は、RNAが存在しないような様相を呈した。
6.可能であればイントロンを埋めることによって、DNAよりむしろRNA配列を増幅するように開発されたプライマー/プローブを使用して、結果として生じるcDNAをPCR増幅した。
7.RTなし対照(非逆転写RNA)を、サンプル中の増幅可能DNAの存在を除外するために実施した。
8. 別の実施形態において、ロボット抽出技術を、患者血漿からRNAを単離するのに使用した。
大腸癌患者からの血液を、RNA安定剤の入ったチューブ(Streck製のRNA BCTチューブ)の中に採血し、そして、室温にて一晩保存した。血漿を遠心分離によって分離し、そして、RNAを、Qiagen Circulating Nucleic Acids核酸キットを使用して抽出した。相対遺伝子発現を、ERCC1、KRAS WT、及びβアクチンに特異的なプライマーを用いたリアルタイムTaqmanプラットフォーム(ABI7900)を使用して決定した。標準的なハウスキーピング遺伝子であるβアクチンのPCR産物と、それぞれERCC1及びKRAS WT特異的プライマーからのPCR産物のレベルとの間でデルタCT法を使用して計算をした。結果を、結腸癌患者の血漿から抽出された無細胞RNA由来のERCC1及びKRAS対βアクチンの相対発現を示す図1に示す。図18は、KRAS(赤色)、NRAS(緑色)、BRAF(黄色)突然変異を有するか、又は突然変異を有していない(青色)患者におけるERCC1発現を示す。
この実施例に記載の実験は、デオキシリボヌクレアーゼ消化後に血漿中に残された残留DNAからERCC1シグナルが得られる可能性があるか評価した。図2の上部は、cDNAに逆転写されたRNAを使用したPCR発現パネルを示す。下のパネルは、逆転写したRNAを使用しないサンプル増幅の負の結果を示す。上部パネルの発現アッセイに貢献するであろう残留DNAのあらゆる増幅が、逆転写していないRNAを使用したシグナルを生じさせたであろう。PCRシグナルは、RNA特異的であり、逆転写していないRNA(RTなし)はバックグラウンドPCRシグナルを作り出さないことを更に示す。
この実施例に記載の実験は、遺伝子発現を計測するのに使用されるサンプルのDNA内のKRAS突然変異状態を評価した。図3に示されているように、このデータは、研究におけるサンプルが、結腸癌におけるKRASの遺伝子突然変異頻度を一般的に反映することを示すために作成された。KRAS突然変異異型の期待度数は、このサンプルセット、並びにKRAS基準である野生型遺伝子レベルの状況において見出される。結腸癌で最も頻繁なKRAS突然変異異型は、KRAS G12Dであり、続いてG12Vであり、そして、頻繁が低いのがG13Dであった。統計的に、G12D及びG12V突然変異は、この少数の患者の中で確認されるはずであるが、一方で、より多数の患者が、G13D突然変異の確認を必要としているであろう。KRAS基準DNAを、突然変異のない遺伝子領域を使用してPCR増幅した。すべての患者サンプルが、KRAS基準DNA配列を含んでいなければならない。
この実施例において、図4で示されるように、無細胞DNAから決定される特異的なKRAS突然変異は、同じ患者のRNAに反映された。無細胞DNAは、腫瘍から血流中に滲出した。この実施例では、無細胞RNAが腫瘍からの無細胞DNAを反映する場合、そのとき、遺伝子の突然変異状態は、これらの2つの核酸が一致しているはずであるという仮説を確認した。これは、大腸癌患者1037人の分析に関する場合であった。
この実施例において、そして、図5で示されているように、我々は、野性型対立遺伝子に対してKRAS突然変異対立遺伝子のパーセンテージを算定できた。この研究の目的のために、我々は、この患者サンプル中のG12D KRAS突然変異の存在をバリデートするための第二のプラットフォーム及び第二のアッセイを使用した。
カラムcDNA浄化法を使用して、DNAを越えるRNAのシグナルを更に増強した。理論に縛られることなく、浄化法は、逆転写反応における阻害物質を減少させることによってRNAのシグナルを高め、そして、cDNAを濃縮した。図7に示したように、RNAの収量はDNAより最大60倍高かった。cDNA(RNA)対DNAの比例体積あたりの相対βアクチンCTsによって計測した収量を、同じ患者血漿から抽出した。サイクリングパラメーター及び逆転写酵素浄化反応を、RNAシグナルを増強するように調整した。
腫瘍によって血流中に放出された無細胞DNA(cfDNA)は、初期の腫瘍特異性突然変異の非侵襲性識別を可能にする。しかしながら、腫瘍におけるすべての分子変化がDNA突然変異を伴うというわけではなく;多くの場合、それはまた、重要な特定の遺伝子(すなわち、遺伝子発現)の量でもある。NSCLC患者のPD−L1遺伝子発現を観察するために、血液中に放出された無細胞RNA(cfRNA)を計測した。PD−1/PD−L1経路が有望な処置標的であり、抗PD−L1剤がさまざまな腫瘍型で活性を助長することが示された。
非小細胞肺癌(NSCLC)において、標的化処置アプローチに関して臨床的結果を有するいくつかの遺伝的変化が確認されてきた。EGFR突然変異に関する場合、2以上の処置方針のための選択肢が既に存在している。EGFR阻害剤に対するT790M媒介性抵抗性のような二次的変化を伴う患者に関して、非可逆性チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)が有望な代替手段であることがわかった。しかしながら、これらの選択肢は、患者が侵襲的手技を必要とする高い死亡率の影響を受けやすい全身腫瘍組織量の増大ような変化がなくなった証明に限定され得る。いわゆる「液体生検検体」−固形悪性腫瘍における遺伝情報に関する適時の情報を得るために末梢血を使用すること−が、この問題に対する緊急に必要な解決法であると思われる。素早いターンアラウンド(turn around)の見込み及び幅広い利用可能性を確保する方法が必要である。
この実施例では、本発明の方法を、疾病の進行と処置を通じた動態的試験に利用する。図13Bは、応答患者の一連の処置を通じたcfRNAのPD−L1発現における予想された減少を示す。
Claims (17)
- 癌に罹患しているか又は罹患していることが疑われる個体由来の生物学的サンプル中の癌に関連する1若しくは複数のバイオマーカーを確認するための方法であって、以下の:
a.固体支持体を使用して、生物学的サンプルからRNAを単離し、ここで、該生物学的サンプルをRNA安定化剤と相互作用させ;
b.RNAが固体支持体上に存在している間に、生物学的サンプルから既存のDNAを消化し;
c.固体支持体から少なくとも一度、RNAを溶出し;
d.RNAをcDNAに逆転写し;
e.cDNAを、癌に関連する1若しくは複数のバイオマーカーを検出するために特異的な少なくとも1つのプライマーと反応させ;そして
f.1若しくは複数のバイオマーカーが生物学的サンプル中に存在するか否か決定すること、ここで、該バイオマーカーの存在により、該個体が癌に関連するバイオマーカーを有するか否か確認する、を含む方法。 - 前記ステップ(c)の溶出液が、二重溶出のために同じカラムに通される、請求項1に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、癌に罹患しているか又は罹患していることが疑われる個体由来の血漿である、請求項1又は2のいずれか1項に記載の方法。
- 前記血漿が、RNA安定化剤と相互作用させた後7日以内に加工される、請求項3に記載の方法。
- 前記ランダム六量体が、RNAをcDNAに逆転写するためにステップ(d)で使用される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記バイオマーカーが、PD−L1、ERCC1、EGFR、TS、AREG、EREG、VEGFR2、EML4ALK、ROS1、RET、c−Met、FGFR1、KRAS、BRAF、NRAS、Her−2、PIK3CA、KIT、GNAQ、及びGNA11から成る群から選択される遺伝子又は融合転写物の突然変異、或いは遺伝子発現である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記癌が、癌、肺癌、黒色腫、胃癌、食道癌、乳癌、卵巣癌、肉腫、腎臓細胞癌、前立腺癌、消化管間質腫瘍(GIST)、及び膵臓癌から成る群から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 癌に罹患しているか又は罹患していることが疑われる個体由来の生物学的サンプル中の無細胞RNA(cfRNA)における、化学療法に対する抵抗性に関連する1若しくは複数の体細胞突然変異の検出感度を増強する方法であって、以下の:
a.固体支持体を使用して、生物学的サンプルからRNAを単離し、ここで、該生物学的サンプルをRNA安定化剤と相互作用させ;
b.RNAが固体支持体上に存在している間に、生物学的サンプルからの既存のDNAを消化し;
c.固体支持体から少なくとも一度、RNAを溶出し;
d.RNAをcDNAに逆転写し;
e.cDNAを、抵抗性に関連する体細胞突然変異の少なくとも1つを検出するために特異的な少なくとも1つのプライマーと反応させ;そして、
f.1若しくは複数の体細胞突然変異が生物学的サンプル中に存在するか否かを決定すること、ここで、(単数若しくは複数の)体細胞突然変異の存在により、個体が化学療法に対する抵抗性に関連する1若しくは複数の体細胞突然変異を有するか否か確認する、を含む方法。 - 他の態様において、本発明は、癌に罹患しているか又は罹患していることが疑われる個体の可能性を特定する方法であって、以下の:
a.個体由来の生物学的サンプルからRNAを単離し、ここで、該生物学的サンプルをRNA安定化剤と相互作用させ;
b.RNAが固体支持体上に存在している間に、生物学的サンプルから既存のDNAを消化し;
c.固体支持体から少なくとも一度、RNAを溶出し;
d.RNAをcDNAに逆転写し;
e.cDNAを、癌に関連する1若しくは複数のバイオマーカーを検出するために特異的な少なくとも1つのプライマーと反応させ;そして、
f.癌に関連する1若しくは複数のバイオマーカーが生物学的サンプル中に存在するか否かを決定すること、ここで、該バイオマーカーの存在が、該個体が癌に罹患している可能性を特定する、を含む方法。 - 他の態様において、本発明は、癌に罹患しているか又は罹患していることが疑われる個体の可能性の診断を支援する方法であって、以下の:
a.個体由来の生物学的サンプルからRNAを単離し、ここで、該生物学的サンプルをRNA安定化剤と相互作用させ;
b.RNAが固体支持体上に存在している間に、生物学的サンプルから既存のDNAを消化し;
c.固体支持体から少なくとも一度、RNAを溶出し;
d.RNAをcDNAに逆転写し;
e.cDNAを、癌に関連する1若しくは複数のバイオマーカーを検出するために特異的な少なくとも1つのプライマーと反応させ;そして、
f.癌に関連する1若しくは複数のバイオマーカーが生物学的サンプル中に存在するか否かを決定すること、ここで、該バイオマーカーの存在が、該個体が癌に罹患している可能性の診断を支援する、を含む方法。 - 前記ステップ(c)の溶出液が、二重溶出のために同じカラムに通される、請求項8〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、癌に罹患しているか又は罹患していることが疑われる個体由来の血漿である、請求項8〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記血漿が、RNA安定化剤と相互作用させた後7日以内に加工される、請求項12に記載の方法。
- 前記ランダム六量体が、RNAをcDNAに逆転写するためにステップ(d)で使用される、請求項8〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記体細胞突然変異が、PD−L1、ERCC1、EGFR、TS、AREG、EREG、VEGFR2、EML4ALK、ROS1、RET、c−Met、FGFR1、KRAS、BRAF、NRAS、Her−2、PIK3CA、KIT、GNAQ、及びGNA11から成る群から選択される遺伝子又は融合転写物、或いは遺伝子発現である、請求項8に記載の方法。
- 前記バイオマーカーが、PD−L1、ERCC1、EGFR、TS、AREG、EREG、VEGFR2、EML4ALK、ROS1、RET、c−Met、FGFR1、KRAS、BRAF、NRAS、Her−2、PIK3CA、KIT、GNAQ、及びGNA11から成る群から選択される遺伝子又は融合転写物の突然変異、或いは遺伝子発現である、請求項9又は10に記載の方法。
- 前記癌が、癌、肺癌、黒色腫、胃癌、食道癌、乳癌、卵巣癌、肉腫、腎臓細胞癌、前立腺癌、消化管間質腫瘍(GIST)、及び膵臓癌から成る群から選択される、請求項8〜10のいずれか1項に記載の方法。
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