KR20170083563A

KR20170083563A - 암 진단 및/또는 모니터링을 위한 무세포 rna의 사용 방법

Info

Publication number: KR20170083563A
Application number: KR1020177014255A
Authority: KR
Inventors: 캐슬린 다넨버그
Original assignee: 리퀴드 제노믹스, 아이엔씨.
Priority date: 2014-11-14
Filing date: 2015-11-13
Publication date: 2017-07-18
Also published as: EP3218523A4; JP2017538404A; ES2790823T3; US11773447B2; WO2016077709A1; CA2965528A1; US20240011102A1; CN107002132A; EP3218523B1; AU2015346185A1; US20180258489A1; EP3218523A1; IL251875A0

Abstract

본 발명은 암을 진담 및/또는 모니터링하기 위해 유용한 희귀 세포들 및/또는 종들의 향상된 검출을 위하여 무세포 RNA를 사용하기 위한 조성물, 방법, 및 시스템을 제공한다. 본 발명은 암 치료법에 내성이 있거나 그리고/또는 진행되는 내성이 있는 세포들의 조기 검출을 위한 조성물, 방법, 및 시스템을 또한 제공한다.

Description

암 진단 및/또는 모니터링을 위한 무세포 RNA의 사용 방법 {USE OF CIRCULATING CELL-FREE RNA FOR DIAGNOSIS AND/OR MONITORING CANCER}

본 출원에 대한 상호 참조(CROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS)

본 출원은 2015 년 11 월 14 일 출원된 미국 가출원 제 62 / 080,022 호, 2015 년 9 월 4 일 출원된 62 / 214,756 및 2015 년 9 월 28 일 출원된 62/233,935의 이익을 주장하며, 이들의 내용은 전체로서 참조에 의해 본원에 통합된다

본 발명은 무세포 핵산의 사용과 관련되고, 상세하게는 다양한 유형들의 암을 진단 및/또는 모니터링하기 위한 무세포 RNA의 사용과 관련된다.

인간 혈액에서 DNA와 RNA의 무세포 핵산의 존재는 1940 년대 후반부터 알려지고 연구되어왔다. 이러한 분자들이 혈류로 방출되는 메커니즘은 아직까지는 명확하지 않다. 그것은 다른 조직에서 세포의 세포사멸(apoptosis)과 괴사의 결과일 수 있거나 또는 RNA의 경우, 핵산은 혈액에 분비 소낭의 RNases에 포함되어 보호될 수 있습니다. 암을 진단하고 암 치료의 반응을 모니터링하는 능력으로 무세포 DNA (cfDNA)의 유용성은 최근에 강력하게 입증되었다. 차세대 시퀀싱과 같은 PCR 기반 시퀀싱 기술의 최근의 개발들은 cfDNA에서 돌연변이를 검출하여 암 전조 돌연변이들(cancer pre-disposition mutations) 및 암 유발자 돌연변이들(cancer driver mutations)를 확인하는 것을 가능하게 했다. 통상적인 종양 조직 생검(tumor tissue biopsies)은 로지스틱(logistic) 또는 의학적 이유들로 획득할 수 없는 경우가 많다. 전이 암 환자의 종양 조직 검체(tumor tissue specimens)를 구할 수 없는 경우, 혈액 생검 (liquid biopsies)은 전이 병변 중 하나인 생검으로 인한 통증, 위험 및 비용 없이 신속하게 시행할 수 있는 대안을 제공한다 (Bettegowda C et al. 조기 및 후기 단계의 인간 악성 종양에서의 순환 종양 DNA의 검출(Detection of Circulating Tumor DNA in Early- and Late-Stage Human Malignancies). Sci Trans I Med 2014, 6, (224). 종양 조직 생검과 비교하여 혈액 샘플들을 얻는 것이 상대적으로 쉽기 때문에 종양 DNA의 연속적 분석을 쉽게 수행할 수 있으므로, 종양이 초기 치료에 적응되고 재발하기 시작할 때 약물 내성 클론들의 출현을 추적할 수 있다. 환자의 cfDNA의 재-분석은 출현된 새로운 암 유발자 돌연변이를 인식하여, 새로운 직접적인 치료법이 설계되는 것을 가능하게 한다.

한가지 과제는 cfDNA 분석의 민감성이었다 - 많은 경우에 cfDNA가 검출될 수 없기 때문에 종양 조직에 존재하는 돌연변이는 혈액에서 발견될 수 없다. 따라서, 해결되어야 할 한가지 문제점은 개선된 검출 방법으로서, 특히 생물학적 샘플에서 세포의 전체 개체군의 작은 일부인 희소한 세포들의 개체군에 대하여 낮은 수준의 무세포 핵산, 예를 들어, 무세포 RNA (cfRNA) 검출될 수 있다. 희소한 유형의 세포에 대해 증가된 민감도를 달성하는 솔루션은 내성 세포, 예를 들어 하나 이상의 암 치료제(들)에 내성을 나타내는 암을 가진 개체들에서 발견되는 세포를 진단 및/또는 모니터링하는데 특히 유용하다.

또 다른 과제는 표준량의 혈장으로 수행될 수 있는 희귀 종들의 고감도 검출이 환자로부터 수집된다는 점이다. 검출 가능한 cfDNA를 갖는 환자들의 비율은 수집된 혈장의 양으로부터 현재 얻을 수 있는 최대치를 나타낸다. 낮은 분비(secretion)의 경우, 검출 가능한 cfDNA를 분리하기 위해 점점 더 많은 혈장을 사용하려고 시도할 수 있지만, 이러한 접근법은 실용적이지 않다. 따라서, 돌연변이 검출에 사용된 방법의 개선은 더 높은 백분율로 종양을 분석하는 것을 가능하게 할 수 있다.

또한, 최근에, 종양은 하나의 종양 부위에 관한 정적 정보를 생성하는 종양 생검으로 샘플링된다. 하나의 종양 부위는 암 치료에 대한 개체의 저항 상태를 나타낼 수 없다. 유사하게, 한 번에 하나의 정적 스냅 샷은 암 치료법에 대한 저항성 또는 이러한 저항성으로 발전할 가능성에 대한 현재의 상태를 나타낼 수 없다. 희귀 종들의 검출에 대한 감도가 증가되도록 종양을 샘플링하는 비 침습적 방법이 필요하다. 또한, 이러한 방법은 암 치료에 대한 잠재적 저항 단계들로 발달하는 경우에 종양에 대한 동적 정보를 제공할 수 있어야 한다. 본 명세서에 기술된 본 발명은 모든 전술한 내용을 제공하고 추가적인 이점을 또한 제공한다.

본 명세서 전반에 걸쳐서, 다양한 간행물, 특허, 특허 출원 및 다른 참고 문헌이 인용된다. 이들 간행물, 특허, 특허 출원 및 기타 참고 문헌은 모두 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 인용되어 있다.

Bettegowda C et al. 조기 및 후기 단계의 인간 악성 종양에서의 순환 종양 DNA의 검출(Detection of Circulating Tumor DNA in Early- and Late-Stage Human Malignancies). Sci Trans I Med 2014, 6, (224)

본 발명은 다양한 유형의 암을 진단 및/또는 모니터링하기 위해 유용할 수 있는 희귀 종들을 식별하기 위한 무세포(cell-free) 핵산, 그 중에서도, 특히 무세포 RNA (cfRNA)의 향상된 검출을 위한, 조성물, 방법 및 시스템을 제공한다.

따라서, 일 양상에서, 본 발명은 암이 있거나 암이 있는 것으로 의심되는 개체로부터의 생물학적 샘플에서 암과 연관된 하나 이상의 바이오 마커들을 식별하는 방법을 제공하고, 상기 방법은, (a) 고체 지지체(solid support)를 사용하여 상기 생물학적 샘플로부터 RNA를 분리하는 단계 - 상기 생물학적 샘플이 RNA 안정화제와 상호 작용됨 -; (b) RNA가 상기 고체 지지체 상에 있는 동안 상기 생물학적 샘플에 존재하는 DNA를 절단(digest)시키는 단계; (c) 상기 고체 지지체로부터 RNA를 1 회 이상 용리(elute)시키는 단계; (d) 상기 RNA를 cDNA로 역 전사시키는 단계; (e) 암과 연관된 하나 이상의 바이오 마커들을 검출하는데 특이적인 적어도 하나의 프라이머와 상기 cDNA를 반응시키는 단계; 및 (f) 하나 이상의 바이오 마커들이 상기 생물학적 샘플에 존재 하는지를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 바이오 마커의 존재는 상기 개체가 암과 연관된 하나 이상의 바이오 마커들을 갖는지 여부를 식별한다. 일부 실시 예들에서, 상기 단계(c)의 용리는 이중 용리에 대하여 동일한 컬럼(column)을 통해 통과된다. 다른 실시 예들에서, 상기 생물학적 샘플은 상기 암이 있거나 암이 있는 것으로 의심되는 개체로부터의 혈장이다. 다른 실시 예들에서, 상기 혈장은 상기 RNA 안정화제와 상호 작용하는 7일 이내에 처리된다. 다른 실시 예들에서, 랜덤 헥사머들은 상기 RNA를 cDNA로 역 전사하기 위해 단계(d)에서 사용된다. 상기 바이오 마커는 PD-Ll, ERCCl, EGFR, TS, AREG, EREG, VEGFR2, EML4ALK, ROSl, RET, c-Met, FGFRl, KRAS, BRAF, NRAS, Her-2, PIK3CA, KIT, GNAQ, 및GNA11로 이루어진 그룹에서 선택되는 유전자 또는 융합 전사 또는 유전자 발현의 돌연변이이다. 다른 실시 예들에서, 상기 암은 암, 폐암, 흑색 종, 위암, 식도암, 유방암, 난소 암, 육종, 신장 세포, 전립선, 위장관 간질 종양 (GIST) 및 췌장암으로 이루어진 그룹에서 선택된다.

다른 양상들에서, 본 발명은 암이 있거나 암이 있는 것으로 의심되는 개체로부터의 생물학적 샘플에서의 무세포(cell-free) cell-free RNA (cfRNA)에서의 화학 요법에 대한 내성과 연관된 하나 이상의 체세포 돌연변이(들)의 검출 감도를 증가시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은, (a) 고체 지지체(solid support)를 사용하여 상기 생물학적 샘플로부터 RNA를 분리하는 단계 - 상기 생물학적 샘플이 RNA 안정화제와 상호 작용됨 -; (b) RNA가 상기 고체 지지체 상에 있는 동안 상기 생물학적 샘플에 존재하는 DNA를 절단시키는 단계; (c) 상기 고체 지지체로부터 RNA를 1 회 이상 용리(elute)시키는 단계; (d) 상기 RNA를 cDNA로 역 전사시키는 단계; (e) 내성과 연관된 체세포 돌연변이(들) 중 하나 이상을 검출하는데 특이적인 적어도 하나의 프라이머와 상기 cDNA를 반응시키는 단계; 및 (f) 하나 이상의 체세포 돌연변이가 상기 생물학적 샘플에 존재 하는지를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 바이오 마커의 존재는 상기 개체가 화학 요법에 대한 내성과 연관된 하나 이상의 체세포 돌연변이 (들)을 갖는지 여부를 식별한다.

다른 양상들에서, 본 발명은 암이 있거나 암이 있는 것으로 의심되는 개체의 가능성을 결정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은, (a) 고체 지지체(solid support)를 사용하여 상기 생물학적 샘플로부터 RNA를 분리하는 단계 - 상기 생물학적 샘플이 RNA 안정화제와 상호 작용됨 -; (b) RNA가 상기 고체 지지체 상에 있는 동안 상기 생물학적 샘플에 존재하는 DNA를 절단시키는 단계; (c) 상기 고체 지지체로부터 RNA를 1 회 이상 용리(elute)시키는 단계; (d) 상기 RNA를 cDNA로 역 전사시키는 단계; (e) 암과 연관된 하나 이상의 바이오 마커를 검출하는데 특이적인 적어도 하나의 프라이머와 상기 cDNA를 반응시키는 단계; 및 (f) 암과 연관된 하나 이상의 바이오 마커들이 상기 생물학적 샘플에 존재 하는지를 검출하는 단계를 포함하고, 상기 바이오 마커의 존재가 상기 암을 갖는 개체의 가능성을 결정한다.

다른 양상들에서, 본 발명은 암이 있거나 암이 있는 것으로 의심되는 개체의 가능성을 진단하는 것을 돕는 방법을 제공하고, 상기 방법은, (a) 고체 지지체(solid support)를 사용하여 상기 생물학적 샘플로부터 RNA를 분리하는 단계 - 상기 생물학적 샘플이 RNA 안정화제와 상호 작용됨 -; (b) RNA가 상기 고체 지지체 상에 있는 동안 상기 생물학적 샘플에 존재하는 DNA를 절단시키는 단계; (c) 상기 고체 지지체로부터 RNA를 1 회 이상 용리(elute)시키는 단계; (d) 상기 RNA를 cDNA로 역 전사시키는 단계; (e) 암과 연관된 하나 이상의 바이오 마커들을 검출하는데 특이적인 적어도 하나의 프라이머와 상기 cDNA를 반응시키는 단계; 및 (f) 암과 연관된 하나 이상의 바이오 마커들이 상기 생물학적 샘플에 존재 하는지를 검출하는 단계를 포함하고, 상기 바이오 마커의 존재가 상기 암을 갖는 개체의 가능성의 진단을 돕는다.

임의의 실시 예들에서, 상기 단계(c)의 용리는 이중 용리에 대하여 동일한 컬럼을 통해 통과된다. 임의의 실시 예들에서, 상기 생물학적 샘플은 상기 암이 있거나 암이 있는 것으로 의심되는 개체로부터의 혈장이다. 다른 실시 예들에서, 상기 혈장은 상기 RNA 안정화제와 상호 작용하는 7일 이내에 처리된다. 임의의 실시 예들에서, 랜덤 헥사머들은 상기 RNA를 cDNA로 역 전사하기 위해 단계(d)에서 사용된다. 임의의 실시 예들에서, 상기 체세포 돌연변이는 PD-Ll, ERCCl, EGFR, TS, AREG, EREG,VEGFR2, EML4ALK, ROSl, RET, c-Met, FGFRl, KRAS, BRAF, NRAS, Her-2, PIK3CA, KIT, GNAQ, 및GNA11로 이루어진 그룹에서 선택되는 유전자 또는 융합 전사 또는 유전자 발현이다. 임의의 실시 예들에서, 상기 바이오 마커는 PD-Ll, ERCCl, EGFR, TS, AREG, EREG, VEGFR2, EML4ALK, ROSl, RET, c-Met, FGFRl, KRAS, BRAF, NRAS, Her-2, PIK3CA, KIT, GNAQ, 및GNA11로 이루어진 그룹에서 선택되는 유전자 또는 융합 전사 또는 유전자 발현의 돌연변이이다. 임의의 실시 예들에서, 상기 암은 암, 폐암, 흑색 종, 위암, 식도암, 유방암, 난소 암, 육종, 신장 세포, 전립선, 위장관 간질 종양 (GIST) 및 췌장암으로 이루어진 그룹에서 선택된다.

본 발명은 다양한 유형의 암을 진단 및/또는 모니터링하기 위해 유용할 수 있는 희귀 종들을 식별하기 위한 무세포(cell-free) 핵산, 그 중에서도, 특히 무세포 RNA (cfRNA)의 향상된 검출을 위한, 조성물, 방법 및 시스템을 제공한다. 본원에 상세히 설명된 이유로, 다양한 실시 예들에서 RNA 종들은 다양한 유형들의 암을 진단 및/또는 모니터링하기 위해 DNA 종보다 사용하는 것이 더 나을 수 있다. 유명한 RNA 종들을 검출하는 능력은 일반적으로 잘 알려져 있다. 그러나, 증가된 민감도를 갖는 소수의 (또는 희귀한) RNA 종들을 검출하는 능력은 지금까지 효과적으로 해결되지 못한 문제이다.

일반적으로 RNA는 임상 및 실험실 셋팅에서 함께 동작하기가 어렵다는 것이 인정된다. 다수의 참고 문헌들은 RNA 분해 및 RNA 처리와 관련한 문제점을 문서화하고 있다. 본원에 개시된 발명은 이러한 기존의 문제점을 극복하고, 민감하고, 신속하며, 정확한 방법으로 희소한 RNA 종들을 검출하는 방법을 제공하며, (정적 진단 및/또는 모니터링 대신에) 동적 진단 및/또는 모니터링을 위하여 유용한 정보를 제공한다.

도 1은 대장 암 환자의 혈장에서 추출된 무세포 RNA로부터의 ERCC1 및 KRAS 대 베타 액틴의 상대적인 발현을 나타낸다.
도 2는 결장암 환자 혈장에서의 ERCC1 발현을 나타낸다.
도 3은 KRAS에 대한 카피 수 분석 및 예상 빈도의 G12D 및 G12V KRAS 돌연변이들의 다양한 대립 형질 단편들에 대한 DNA 분석을 나타낸다.
도 4는 환자의 KRAS G12D 돌연변이의 분석을 나타낸다. 동일한 환자의 RNA에 무세포 DNA에서 결정된 특정 KRAS 돌연변이가 반영된다.
도 5A 및 5B 는 디지털 PCR을 사용하는 환자의 KRAS G12D 돌연변이의 분석을 나타낸다. G12D KRAS 돌연변이는 다른 플랫폼을 사용하여 다시 검증되었다. 몇몇 군집들(populations)이 도면에 나열되고, 상부 좌측에서 시계 방향으로 - (1) KRAS G12D 돌연변이 PCR 증폭, (2) KRAS G12D 돌연변이 및 야생형 PCR 증폭, (3) KRAS 야생형 PCR 증폭, 및 (4) 돌연변이 PCR 증폭 PCR 증폭.
도 6은 RNA와 DNA 사이의 신호 관계를 나타낸다. 대장 암 환자의 혈장에서 추출한 역 전사된 mRNA (cDNA)의 중간 PCR 신호는 대응하는 DNA보다 약 7 배 더 높음이 발견되었다.
도 7은 컬럼 cDNA 정제 방법을 이용한 결과를 나타낸다. DNA에 비해 RNA의 신호가 더 향상된다. RNA의 수율은 DNA보다 약 60 배 더 높다.
도 8은 비소 세포성 폐암 (NSCLC) 환자 및 건강한 대조군에 대한 상대적인 PD-L1 발현의 결과들을 나타낸다.
도 9는 NSCLC 환자 및 건강한 대조군에 대한 상대적인 ERCC1 발현의 결과를 나타낸다.
도 10은 비소 세포성 폐암 환자 및 건강한 대조군에서의 전체 핵산 (중간 값으로 정규화된 β- 액틴 CT들에서의 ctRNA)의 결과를 나타낸다.
도 11은 DNA와 mRNA 사이의 신호 관계를 도시한다. 중간 DNA 신호는 59.63 ng/5 mL (5.88 - 2016.0 ng/5 mL 범위)이다. 중간 mRNA 신호는 608.49 ng / 5 niL (111.1 - 6312.02 ng / niL 범위)이다.
도 12는 특정 환자에서의 상대적인 KRAS G12D 발현 결과를 나타낸다. KRAS G12D의 PCR 분석에 의해 β- 액틴을 기준으로 발현이 측정되었다.
도 13A는 치료 전 무 반응과 높은 반응의 환자들에서 무세포 RNA (cfRNA)에 대한 전처리 PD-L1 발현을 나타낸다. 도 13B는 반응하는 환자에서 치료 과정 동안의 cfRNA에서 PD-L1 발현의 예상되는 감소를 나타낸다.
도 14A는 결장 직장암 (CRC), 비소 세포성 폐암 (NSCLC) 환자들 및 건강한 개체들의 상대적 빈도를 나타내고, CRC 환자의 17.4 %, NSCLC 환자의 50 % 및 건강한 개체들의 0 %가 PD-L1 유전자 발현의 상대적 증가를 가짐을 나타낸다. 도 14B는 상대적인 PD-L1 유전자 발현 수준이 PD-L1 양성 CRC와 비소 세포성 폐암 환자간에 유사하다는 것을 나타낸다
도 15A는 대장 암을 치료하는 동안 KRAS G12V에 대한 cfDNA를 모니터링하는 대립 형질의 증가를 레고나페닙/세툭시맙 (Regorafenib/Cetuximab)과 비교하여 나타낸다. 도 15B는 치료 과정에서 시간이 지남에 따라, Regorafenib/Cetuximab으로 대장 암을 치료하는 동안 cfRNA에서 PD-L1의 상대적 발현이 감소함을 나타낸다. 도 15C는 대장 암을 Regorafenib/Cetuximab으로 치료하는 동안 시간 경과에 따른 ERCCl의 상대적인 발현을 나타낸다.
도 16은 PD-L1, ERCCl 및 KRAS G12D에 대한 FOLFOX 및 크리조티닙(crizotinib)을 이용한 치료 동안 결장 직장암 환자들에서 cfRNA의 상대적인 유전자 발현을 나타낸다.
도 17은 ERC1 및 KRAS G12D에 대한 FOLFIRI/ 베바시주맙(Bevacizumab) 및 Regorafenib/Cetuximab를 이용한 치료 동안 대장 암 환자들에서의 cfRNA에서의 상대적 유전자 발현을 나타낸다.
도 18은 KRAS (적색), NRAS (녹색), BRAF (황색) 또는 무 (청색) 돌연변이들을 갖는 환자의 ERCC1의 상대적인 발현을 나타낸다.
도 19는 위암 환자에서 PD-L1 및 HER2의 무세포 RNA에서 모니터링되는 상대적인 발현을 나타낸다.

일반 기법들

본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 핵산 화학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제 4 판 (Sambrook et al., 2012) 및 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제 3 판 (Sambrook and Russel, 2001) (본원에서 "Sambrook"으로 함께 지칭됨); 분사 생물학의 현재의 프로토콜들(Current Protocols in Molecular Biology) (F.M. Ausubei et al., 1987, 2014 년까지 보충 교재 포함); PCR : 폴리메라이제 연쇄 반응(The Polymerase Chain Reaction), (Mullis et al., eds., 1994); Antibodies : A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (Greenfield, ed., 2014), Beaucage et al. 2000 년 뉴욕의 John Wiley & Sons, Inc. (2014 년까지의 보충 교재 포함) 및 포유 동물 세포에서의 유전자 전달 및 발현(Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells) (Makrides, Elsevier Sciences BV, Amsterdam, 2003).

정의들

본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다

본원에 사용된 용어 "생물학적 샘플"은 개체 (예: 환자)로부터 취해진 임의의 샘플을 포함한다. 생물학적 샘플의 예들은 혈액, 혈장, 조직 샘플, 혈청 및 체액을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다

본원에 사용되는 바와 같이, "단백질"이라는 용어는 폴리 펩타이드, 펩타이드, 폴리 펩타이드의 단편(fragment)들 및 융합 폴리 펩타이드를 포함한다.

본원에 사용되는 바와 같이, "a," "an," 및 "the"는 문맥 상 달리 지시하지 않는 한, 복수 참조를 포함한다.

본 명세서 전반에 걸쳐 주어진 모든 최대 수치 한정은, 이러한 보다 낮은 수치 한정이 본 명세서에서 명시적으로 기재된 것처럼, 모든 낮은 수치 한정을 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서 전반에 걸쳐 주어진 모든 최소 수치 한정은, 보다 높은 수치 한정들이 본 명세서에 명시적으로 기재된 것처럼, 모든 높은 수치 한정을 포함할 것이다. 본 명세서 전반에 걸쳐 제시된 모든 수치 범위는 보다 좁은 수치 범위가 모두 여기에 명시적으로 기재된 것처럼 이러한 보다 넓은 수치 범위 내에 속하는 모든 더 좁은 수치 범위를 포함할 것이다. 또한 일련의 숫자들을 인용하는 경우에 해당 범위 내에 속하는 숫자는 또한 각각의 숫자가 명시적으로 기재된 것처럼 포함된다.

증가 된 RNA 검출을 위한 조성물 및 방법

RNA는 원래 매우 불안정하고 쉽게 분해될 수 있다고 생각되었으므로, 보호성 세포 환경 밖에서는 안정적이거나 검출되지 않을 가능성이 높다. DNA가 하나의 사본 (또는 증폭의 경우에는 여러 사본)을 포함하고 있는 반면, 유전자의 전사는 mRNA의 형태로 그 유전자의 많은 사본들을 만들어낼 것이다. mRNA는 DNA의 전사된 영역과 동일한 유전 정보를 포함하므로, 두 분자들 모두 동일한 돌연변이가 있어야 한다. 이론적으로, 유전자가 100 번 전사되면 변이된 유전자의 검출 민감도는 또한 100 배 증가해야 한다. cfRNA 분석의 성공을 결정하는 한가지 요인은 진단 분석을 위한 종양 발생(tumor-originated) cfRNA가 혈액에 존재하는 지 여부와 상기 cfRNA가 쉽고 성공적으로 분리(isolate)될 수 있는지 여부이다. 따라서, 본원에 기술된 방법을 따르면, 순환 핵산의 DNA보다 30 내지 60배만큼 많은 RNA가 검출되는 경우에 결과들을 획득하는 것이 가능하다. 이것은 많은 활용들에 유용하며, 그 중 하나는 종양 특이적인 돌연변이들이 생성된 cDNA에서 검출 될 수 있다는 것이다.

예시 1에서 예시된 바와 같이, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 아래의 방법에 따라 무세포 RNA, 특히 소량 또는 희소 RNA 종들을 검출할 수 있다. 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 여전히 본 발명의 범위 내에 있는 다양한 치환들 및 적은 편차들이 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 암이 있거나 암이 있는 것으로 의심되는 개체로부터, 생물학적 샘플 (예: 혈액)이 획득된다. 일부 실시 예들에서, 암이 있거나 암이 있는 것으로 의심되는 개체는 한 명 이상의 의사의 치료를 받고 있는 환자이다. 생물학적 샘플은 RNA 안정화제로 혼합, 접촉, 상호 작용 및/또는 처리된다. 다양한 예시적인 RNA 안정화제들이 사용될 수 있다. 다양한 RNA 안정화제들이 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 무세포 플라스마 RNA의 샘플 채취, 안정화 및 전달을 위한 표준화된 방법 중 하나는 Streck의 Cell-Free RNA BCT®이다. 사용될 수 있는 다른 RNA 안정화제에는 Biomatrica RNA Guard (Biomatrica) <http://www.biomatrica.com/rnagardblood_tube.php>, Paxgene 혈액 RNA 튜브 (Becton Dickinson) <http: // www.preanalytix.com/products/blood/RNA/paxgene-blood-rna-tube>, Tempus 혈액 RNA 튜브 (Life Tech) <http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4342792> Blood /Bone/Marrow(Roche)RNA/DNA안정화제 시약 (Roche) <http://lifescience.roche.com/shop/products/rna-dna-stabilization-reagent-for-blood-bone-marrow>을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

혈장은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 다양한 방법 (예를 들어, 원심 분리, 방사 등)에 의해 다른 혈액 층으로부터 분리될 수 있다. 일 실시 예에서, 혈장 층은 버피 코팅으로부터 제거된다. 분리 타이밍은 개체의 채취된 혈액으로부터 짧은 시간 내에 있을 수 있다. 일부 실시 예들에서, 시간 주기는 약 1 분, 2 분, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 분 내에 있다. 다른 실시 예들에서, 상기 주기는 약 10-15 분, 15-30 분, 30-45 분, 45-70 시간, 1-24 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일 및 7 일 이내이다. 부가적인 혈장은 필요에 따라 다른 시간에서 냉동 및 사용될 수 있다.

일부 실시 예들에서, 혈장은 RNA 안정화제와 상호 작용하는 약 1 분, 2 분, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 분 이내에 처리된다. 다른 실시 예들에서, 시간 주기는 약 10-15 분, 15-30 분, 30-45 분, 45 분 -1 시간, 1-24 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일 및 7 일 이내이다.

핵산 (예를 들어, RNA)은 생물학적 샘플, 예를 들어, 혈장으로부터 추출된다. RNA를 추출할 수 있는 다양한 방법들이 사용될 수 있다. 예시 1의 예시적인 프로토콜이 사용될 수 있다. 다른 상업적으로 이용 가능한 키트들이 RNA를 추출하기 위해 사용될 수 있다. 일 실시 예에서, 추출은 컬럼과 같은 고체 지지체를 사용한다. 일 실시 예에서, DNA는 DNAse 분해를 사용하여 컬럼 상에서 분해될 수 있고, 용리는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 표준 기술에 의해 달성될 수 있다. 예시적인 프로토콜은 예시1에서 발견될 수 있다. 한 실시 예에서, 컬럼으로부터의 동일한 용리 물은 이중 용리 단계를 위해 다시 동일한 컬럼을 통해 통과된다. 또 다른 실시 예에서, 상기 방법론은 혈액을 RNA 안정화제와 접촉시키고, 혈액으로부터 분리 한 후 3 일 이내에 혈장을 처리하고, 온 - 칼럼 DNAse 분해를 사용하고, 컬럼으로부터 2 회 (또는 그 이상) RNA를 용리시키는 조합을 갖는다.

생성된 RNA는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 표준 방법에 의해 cDNA로 역 전사 될수 있다. 예시적인 프로토콜은 예시 1에서 발견될 수 있다. 랜덤 헥사머(hexamer)들이 사용될 수 있다. 특히, 핵산의 다중 음이온 성질로 인한 정전기적 반발력을 감소시켜 뉴클레오티드의 표적에 대한 친화성을 또한 증가시키기 위하여 역 전사 효소 프라이머에 부가될 수 있는 ZIP 핵산과 같은 클램핑 시퀀스들을 선택적으로 사용하여 cDNA로 변환되는 경우에 RNA의 추가적인 증폭이 발생될 수 있다.

생성된 cDNA가 정제되고 분석을 위하여 사용될 수 있다. PCR 및 기타 증폭 기법이 종양 및 암, 종양 및 암과 연관된 유전자, 및/또는 암 및 종양에서 보이는 융합 전사체에 특이적인 바이오 마커를 검출하는데 사용될 수 있다. 암과 연관된 특정 유전자의 유전자 발현이 검출 및 정량화될 수 있으며 암과 종양의 진단을 예측, 결정, 진단 또는 보조하는 데 사용될 수 있다.

특정 화학 요법 제제들에 의해 표적이 되는 다수의 중요한 융합 전사들이 있다. 이들은 EML4-ALK, RET 및 ROS1의 융합 파트너들이 포함된다. 혈액-기반 분석법은 PCR에 의해 DNA를 측정하여 전사 융합체들을 검출 할 수 없다. 혈액 내 mRNA의 검출은 약물 민감성에 대응하기 때문에 융합 검출을 위한 환자들을 모니터링하기 위한 능력을 향상시키고 원래의 화학 요법에 대한 저항성과 다른 요법에 대한 민감성을 일으킬 수 있는 이러한 융합체들의 특정 돌연변이들의 출현을 향상시킬 것이다

내부 조절제(예: 베타 액틴, 하우스 키핑 유전자)와 비교하여 RNA의 수율을 정량화하기 위한 다양한 알고리즘들이 사용될 수 있다. 일 실시 예에서, 관심 유전자의 상대적인 발현은 (해당 유전자에 대한 특이 적 프라이머를 사용하여) 관심 유전자의 PCR주기 임계치(Cts) 마이너스 베타 액틴과 같은 안정적으로 발현된 하우스 키핑 유전자의 PCR주기 임계 의 차이를 통해 결정될 수 있다. 이러한 정량화 방법은 상대 정량화의 델타 Ct 방법으로 지칭된다. 내인성 기준(endogenous reference)과 캘리브레이터에 대하여 정규화된 표적의 양은 2^- ^{delta,deltaCt}이다. ABIUser Bulletin#2:ABI 7700 시퀀스 검출 시스템(Sequence Detection System) December 11, 1997 (updated 10/2001) <http://www3.appliedbiosystems. com/ cms/ groups/mcb_support/ documents/generaldocuments/cms_040980.pdf>에 의해 주어진다. 예를 들어, EML4-ALK 융합 mRNA의 상대적인 발현은 상수 (K) x 2-^(Ct( ^EML40ALK ^{)-Ct (Beta Actin)}로 발현될 수 있다.

복수의 폐암 샘플들을 통해 각각의 EML4-ALK 융합 상대 발현 수준 2-^{(Ct(EML40ALK)-Ct (Beta Actin)}의 중간값에 대한 전체 개수를 생성하는 승수 상수 K가 설정된다 알려지지 않은 샘플들에서 EML4-ALK의 상대적인 발현은 알려진 대조 샘플을 이용하여 알려지지 않은 샘플의 결과물을 발현을 위한 설정 값과 비교하여 결정될 수 있다. 알려진 샘플 값을 10으로 설정하고 K를 임의로 100으로 설정하면 알려지지 않은 (Unknown)샘플의 상대 발현 (Relative Expression) X는 다음 공식에 따라 계산된다:

각각의 PCR 플레이트를 동작시키기 위하여, 알려진 샘플에 대한 값이 정확히 설정 지점, 10에 유지되도록, 알려진 샘플의 상대적인 발현에서의 플레이트 변형들에 대하여 승수 K의 값이 PCR 플레이트에 대하여 보정되기 위하여 조정될 수 있다.

다른 실시 예에서, 융합 없이 일정량의 DNA로 스파이크된 알려진 양의EML4-ALK 융합 DNA 단편들을 채택하는 PCR 산물의 표준 곡선이 대조를 위한 알려진 샘플들의 상대적인 발현을 EML4-ALK의 알려진 발현들과 비교하여 대조로서 동작하기 위해 채택될 수 있다. Y 축 상의 알려진 샘플들의 Cts 대 X 축 상의 알려진 EML4-ALK 대조의 log10상대적인 발현의 플롯이 다음의 방정식에 의해 설명되는 선형 커브를 생성할 것이다:

소수 또는 희귀 종들의 정량화

본 발명의 일부 양상들에서, 본원에 설명된 조성물 및 방법은 무세포 핵산, 특히 무세포 RNA를 정량화하는데 사용될 수 있다. RNA의 소수 종들뿐만 아니라 주요 종들에 대하여 정량화가 달성될 수 있다. 정확한 진단에 직면하는 문제는 암 치료에 대한 내성의 진단을 예측, 진단 및/또는 보조하거나 돌연변이 또는 내성 세포의 출현을 나타낼 수 있는 소수의 (또는 희소한) RNA 종들의 검출이다. 본 발명의 일부 양상들에서, 검출 될 수 있는 소량의 RNA 종들은 야생형 RNA의 약 0.01 % 내지 60 %에 존재한다. 일부 실시 예들에서, 검출될 수 있는 RNA의 소수 종들은 야생형 RNA의 적어도 약 0.01 %, 0.02 %, 0.03 %, 0.04 %, 0.05 %, 0.06 %, 0.07 %, 0.08 %, 0.09 %, 0.1 %, 0.2 %, 0.3 %, 0.4 %, 0.5 %, 0.6 %, 0.7 %, 0.8 %, 0.9 % 또는 1 %로 존재한다. 다른 실시 예들에서, 검출될 수 있는 RNA의 소수 종들은 야생형 RNA의 적어도 약 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12%, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 % 또는 20 %로 존재한다. 다른 실시 예들에서, 검출될 수 있는 RNA의 소수 종들은 야생형 RNA의 적어도 약 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 % 또는 30%로 존재한다. 다른 실시 예들에서, 검출될 수 있는 RNA의 소수 종들은 야생형 RNA의 적어도 약 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 % 또는 40 %로 존재한다. 다른 실시 예들에서, 검출될 수 있는 RNA의 소수 종들은 야생형 RNA의 적어도 약 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 % 또는 50%로 존재한다. 다른 실시 예들에서, 검출될 수 있는 RNA의 소수 종들은 야생형의 적어도 약 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 % 또는 60 %로 존재한다. 상기 실시 예들 중 어느 것에서도, 검출될 수 있는 RNA의 소수 종들은 기껏해야 상기 언급된 백분율 중 임의의 백분율, 및 상기 나타낸 백분율 중 임의의 백분율의 하한 및 상한의 조합을 포함하는 범위에 존재한다.

종양학 진단 및/또는 모니터링을 위한 무세포 RNA의 사용

본원에는 무세포 핵산, 특히 무세포 RNA를 사용하여 다양한 유형의 암을 진단 및/또는 모니터링하기 위한 조성물, 시스템 및 방법이 설명된다. cfRNA는 암의 유형을 결정하고 암 관련 돌연변이가 있는지 여부를 결정 (예: 암 바이오 마커) 및/또는 암 치료제에 내성 발현형이나 저항성 유전자형이 있는지 (또는 진행 중인지) 결정하기 위하여 암이 있거나 암이 있는 것으로 의심되는 개체 (예: 의사의 치료를 받는 환자)을 진단하는 데 유용할 수 있다. 또한, 본원에 개시된 조성물, 시스템 및 방법은 저항성 발현형(resistant phenotype) 또는 내성 유전자형(resistant genotype)이 출현하고 있는 경우를 신속하게 검출하기 위하여 시간이 경과 (예를 들어 세로 방향(longitudinal course))에 따라 개체를 모니터링하는 데 사용될 수 있다. cfDNA를 사용하여 쉽게 달성되지 않는 진단 및/또는 모니터링의 정확성과 특이성은 cfRNA를 사용하여 달성될 수 있다. 본원에서 추가로 설명된 바와 같이, 암을 갖는 개체와 건강한 개체 사이의 cfRNA 측정에서 발현 범위의 중첩 없이 관찰된 통계적으로 중요한 차이는 암의 검출 (조기 발견 포함) 및 암의 재발 모니터링에 이점을 제공한다. 필요에 따라, 의사는 암 치료제나 화합물(들)에 대한 저항성을 해결하기 위해 적절한 조치를 취할 수 있다.

혈액 DNA에서의 돌연변이 검출의 특이성은 100 %에 근접할 수 있으므로, 즉. 즉, 혈액 DNA에서 발견 된 돌연변이는 실제 종양 조직에서 얻은 DNA의 돌연변이를 거의 항상 반영한다. 그러나, 현재의 cfDNA 분석의 민감도는 일반적으로 100 % 미만이다; 즉, 많은 경우에 cfDNA가 검출되지 않기 때문에 종양 조직에 존재하는 돌연변이가 혈액에서 발견될 수 없다. 예를 들어, 한 연구에서, 진행성 췌장암, 난소 암, 대장 직장암, 방광암, 위 식도암, 유방암, 흑색 종, 간세포 암 및 두 경부암을 가진 환자의 75 % 이상에서 cfDNA가 발견되었지만, 1 차 뇌, 신장, 전립선 또는 갑상선 암에서는 50 % 보다 적었고, 반면에, 국소 종양 환자에서는 대장 암, 위 식도암, 췌장암, 유방선 암 환자의 73 %, 57 %, 48 %, 50 %에서 cfDNA가 검출되었다 (Bettagowda , 2012).

이론에 구속되지 않고서도, cfDNA 비 검출은 다음과 같은 비-한정적인 이유 때문일 수 있다. 1) 일부 암은 혈류로 DNA를 분비하지 않으며, 2) 모든 종양들은 일부 cfDNA를 분비하지만 일부 종양들로부터 방사되는DNA의 양은 현재의 기술로는 검출하기에 너무 작다. 이론에 구속되지 않고서도, 종양들의 특징은 세포가 급속히 턴 오버되고, 형성되는 경우에 급속히 죽으므로, 후자가 암 환자들의 혈액에서 발견되는 일반적으로 높은 수준의 핵산을 설명할 수 있다. 또한, 종양에 의한 cfDNA 분비는 매우 광범위하게 변하는 것으로 알려져 있다. 특별히 고안된 고감도 검출 방법을 사용한 한 연구에서 샘플 당 1.3에서 23,000 개의 돌연변이 템플릿들 (샘플 당 중간(median) 99돌연변이 템플릿; 10 번째와 90 번째 백분위 수 사이의 범위, 3-2,837)에 이르는 18 명의 모든 대장 암 환자에서 cfDNA가 발견되었다. 이러한 연구는 "대부분의 이전 연구는 현재 연구에서 평가된 많은 대상들에서 발견되는 낮은 수준의 cfDNA을 검출하기에 충분히 고감도 기술을 사용하지 않았다"고 결론을 맺었다 (Diehl F et al. 종양 역학을 평가하기 위한 순환 돌연변이(Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics), Nat Med. 2008; 14 : 985-990] 참조).

본원에 설명 된 바와 같이, cfRNA의 사용은 DNA 분석에서 획득될 수 없는 잠재적으로 유용하고 가치 있는 정보에 액세스할 수 있는 기회를 제공한다. mRNA 발현이 정상 세포에서 고도로 조절되는 반면에, 암으로의 진행에서 점차적으로 조절되지 않게 된다. 따라서, 이론에 구속되지 않고서도, 정상 조직에서 고도로 발현되지 않는 종양들에서 고도로 발현되는 많은 유전자가 있어야 한다. 초기 연구에서 tyrosinase mRNA는 암 환자의 혈청에서 높은 수준으로 검출될 수 있지만 비-암 개체에서는 그렇지 않다는 것을 보여 주었다 (Kopreski MS 외, 악성 흑색 종 환자의 혈청에서의 종양 전달자 RNA의 검출(Detection of tumor messenger RNA in the serum of patients with malignant melanoma). Clin Cancer Res. 1999, 8: 1961-5). 타이로시나아제(tyrosinase) mRNA와 마찬가지로 다른 종양 mRNA는 다른 악성 종양의 혈청과 혈장에서도 나타난다. 다른 연구에서, 타이로시나아제 티미딜레이트 합성효소(thymidylate synthase: TS) 환자의 발현은 88 명의 환자와 26 명의 대조군의 혈장에서 정량적 PCR로 측정되었다. TS mRNA는 47 %의 환자에서 혈장에서 검출되어 건강한 대조군들과 중요한 차이를 보였다. 특히 혈장 내 TS mRNA를 가진 환자는 그렇지 않은 환자보다 종양 조직에서 TS의 수치가 높았다.

따라서, 일 양상에서, cfRNA를 사용하는 mRNA (유전자 발현) 측정은 하나 이상의 암 관련 유전자(들) 및/또는 대립 유전자 및/또는 돌연변이의 비정상적인 발현을 검출하는데 유용할 수 있다. 이러한 검출은 질병의 존재 (또는 부재)를 진단하거나 암의 상태를 평가하는 데 사용될 수 있다. 일 실시 예에서, 무세포 mRNA 수준은 DNA와 비교하여 더 높다.

"액체 생검 (Liquid Biopsy)"- 말초 혈액을 사용하여 고체 악성 종양의 유전 정보에 대한 정보를 적시에 획득하고, 모든 종양 부위의 동적 DNA 및 RNA 정보를 포함하고, 생검 영역에만 한정되는 것은 아니다.

다른 실시 예에서, 유전자 발현은 또한 화학 요법의 경과를 모니터링하는데 유용할 수 있다. DNA는 대체로 변이(alterations)의 관점에서 (즉, DNA의 새로운 돌연변이가 나타나는 데 오랜 시간이 걸릴 수 있음) 정적인 분자(static molecule)이지만, 유전자 발현의 변화는 수 일 또는 수 시간 내에 신속하게 발생할 수 있으므로 약물의 영향으로 유발된 것과 같은 종양의 변화를 평가하는 신속하고 고감도의 수단을 제공할 수 있다.

정상 또는 야생형 전사체에 대한 희귀 또는 비정상 전사체의 상대적인 발현 (증가, 감소 또는 정적 수준)에 대한 연속적인 값은 개체 (예: 환자)의 혈장에서 시간에 따라 측정될 수 있다. 발현의 상향 또는 하향 경향들은 특정 화학 요법에 대한 환자의 결과와 링크될 수 있다.

화학 요법은 암 유형, 병기 및 환자 유전학에 따라 다를 수 있다. 화학 요법은 특정 종양 발현형에 맞추어질 수 있다. 본 발명의 방법은 치료 전, 치료 전 및 치료 후 특정 화학 요법에 대한 반응을 모니터링하는이데 사용될 수 있다. 화학 요법 처방의 예로는 nivolumab을 이용한 PD-L1 양성 암의 치료; Regorafenib/Cetuximab; crizotinib; FOLFOX; FOLFORI/Bevacizumab; and Regorafinib/ C etuximab을 이용한 CRC의 치료가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

또 다른 실시 예에서, 본 발명은 약물 반응 결정 인자 유전자의 발현을 정량적으로 결정하기 위해 약물의 효과를 예측할 수 있으므로 치료 결정을 내리는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 최근의 연구에 따르면 HER2 양성 유방암은 진보된 HER2가 다양한 양의 HER-2를 발현하고 가장 높은 발현 수준을 보이는 환자가 허셉틴 ®보다 현저히 낮은 생존율을 나타냈다 (Baselga J, et al. 종양 바이오 마커들과 EMILIA 효능 사이의 관계(Relationship between tumor biomarkers and efficacy in EMILIA), HER2-양성 전이성 유방암에서의 trastuzumab emtansine (T-DM1)의 phase III 연구. AACR 2013; 초록 LB-63). 또한, PIK3CA에서 lapatanib과 같은 항 HER-2 약물의 효과를 약화시키는 활성화 돌연변이는 허셉틴 ® 치료에 아무런 영향을 미치지 않았다. 이 유방암 환자의 HER-2 조직 수치가 cfRNA에 반영되면 조직 생검보다는 혈액 추출법을 사용하여 HER-2의 발현 및 PIK3의 돌연변이 상태에 대한 정보를 얻을 수 있다. (4) 일부의 암 관련 바이오 마커 및/또는 유전자 (예: Her-2)의 경우, 카피 넘버는 다양할 수 있다. 이러한 변이는 RNA로만 검출 될 수 있다. (5) DNA 분석의 또 다른 문제점은 일부 화학 치료제가 RNA로부터 단지 분석될 수 있고 DNA에서 측정될 수 없는 유전자 융합들의 경우를 목표로 한다는 것이다. 이들 표적의 비-한정적인 예들은 유전자 융합들 (예: EML4-ALK, ROS1, RET)이다. 또 다른 예로, EGFR 억제제에 대한 T790M-매개 내성과 같은 2차 변화를 갖는 환자들에게 비가역적 티로신 키나아제 억제제(TKI: tyrosine kinase inhibitors)가 유망한 대안인 것으로 보인다.

치료를 받는 환자의 혈장에서 이들 유전자들의 각 변이형 또는 출현하는 내성 돌연변이의 발현들의 측정은 최적의 환자 치료에 중요할 수 있다. 이러한 유전의 융합들의 신속하고 정확한 진단이 발생하는 경우에 환자를 돕기 위해 이러한 유전자들의 특정 융합들 또는 돌연변이에서만 활성화되는 특정 약물들이 사용(deploy)될 수 있다. 치료를 받는 환자들의 재검사(re-biopsy)는 이러한 환자들에게는 실용적이지 않다. 이는 본원에서 설명된 cfRNA 방법을 사용하여 달성될 수 있다.

따라서, 본원에서 설명된 방법론에 따라 측정될 수 있는 화학요법에 대한 응답과 연관된 유전자의 비-한정적인 예는 EGFR, KRAS, BRAF, NRAS, JAK2, ALK, PDGFRA, IDH1, IDH2 및 KIT가 포함된다. 본 발명의 일부 양상들에서, 바이오 마커는 PD-L1, ERCC1, EGFR, TS, AREG, EREG, VEGFR2, EML4ALK, ROS1, RET, c-Met, FGFR1, KRAS, BRAF, NRAS, Her-2, PIK3CA, KIT, GNAQ, 및 GNA11 로 이루어진 그룹에서 선택된 융합 전사체의 돌연변이이다

본 발명의 일부 실시 예들에서, 개체는 결장 직장암, 폐암 (예를 들어, 비소 세포성 폐암), 흑색 종, 위암, 식도암, 유방암, 난소 암, 육종, 신장 세포, 전립선, 위장 간질 종양 (GIST) 및 췌장암을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심된다. 다른 실시 예들에서, 검출 및/또는 정량화된 유전자는 아래의 표 1에 열거된다.

다른 실시 예들에서, 검출 및/또는 정량화된 유전자 및/또는 돌연변이는 아래의 표 2에 열거된다.

종양에 의해 혈류로 방출된 무세포 DNA (cfDNA)는 초기 종양 특이 적 돌연변이들의 비침습적 식별을 가능하게 한다. 그러나, 종양들의 모든 분자 변화들이 DNA 돌연변이들과 관련되는 것은 아니다; 많은 경우에, 또한 특정 유전자 (예를 들어, 유전자 발현)의 양이 중요하다. 일 실시 예에서, 암 환자에서 유전자 발현을 모니터링하기 위해 혈액 내로 방출된 무세포 RNA (cfRNA)의 사용이다. 특정 실시 예에서, PD-1/PD-L1 경로는 유망한 치료 표적이며, 항-PD-L1 제제들은 다양한 종양 유형들에서 활성을 촉진하는 것을 나타내었다

특정 유전자 (예를 들어, PD-L1)에 대한 세포 RNA 양을 평가하기 위해, 혈장은 환자 수집 혈액에서 분획(fractionate)될 수 있다. 혈액을 분획하는 방법은 당해 기술 분야에서 알려져 있으며, Cohn 방법 (예: 냉각 에탄올 분획화), 크로마토그래피 또는 이들의 조합에 의한 분획화를 비 -한정적인 예시들로서 포함한다. 특정 유전자를 정량화하기 위해 유전자 특이적 프라이머와 함께 정량적 RT-PCR이 사용될 수 있다. 관심 유전자에 대한 유전자 양은 건강한 지원자들에 비교될 수 있다. 본원에서 위에서 설명된 바와 같은, 예를 들어, β-액틴과 같은 하우스 키핑 유전자들은 전체 RNA를 나타내는 분모 유전자들(denominator genes)로서 사용될 수 있다.

당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 암의 검출 및/또는 진단을 위한 특정 유전자의 발현을 측정하기 위해 본원에 기재된 개시를 사용할 수 있다. 본원에서 더욱 상세하게 설명되는 바와 같이, 일부 암 바이오 마커는 암을 가진 개체들과 건강한 개체들 사이의 cfRNA 측정에 대해 통계적으로 중요한 차이를 나타낸다. 암을 가진 개체들과 건강한 개체들 사이의 발현 범위에 비 중첩은, 예를 들어 암의 검출 (조기 검출을 포함) 및 암의 재발에 대한 모니터링과 같은 복수의 사용을 가능하게 한다.

조성물, 키트 , 및 시스템

본 발명은 또한 출현하는 저항 돌연변이들이 검출될 수 있도록 매우 고감도 검출을 달성하기 위한 조성물을 제공한다. 일 양상에서, (혈장과 같은) 생물학적 샘플, RNA 안정화제(들), 추출 컬럼(들), 용리 용액(들)을 분리하기 위한 시약뿐만 아니라 역 전사에 필요한 시약 및 종양/암 바이오 마커에 특이적인 프라이머들/프로브들을 포함하는 시스템이 제공된다. 일부 실시 예들에서, 시스템은 상기 방법론에 대한 지침들을 포함하는 키트이다. 선택적으로, 시스템은 정상 또는 야생형 전사체들에 대한 돌연변이체, 융합된 전사체 및 다른 희귀 전사체의 RNA 수율을 계산하기 위한 지침들을 포함한다.

아래의 예시들은 본 발명을 예시하기 위한 목적일 뿐이고, 본 발명의 범위를 임의의 방식으로 한정하도록 의도된 것은 아니다.

예시 1

아래는 일부 실시 예들에서 활용된 무세포 RNA 추출, 역 전사 및 PCR 증폭 절차를 위한 예시적인 프로토콜들을 설명한다. 아래에 설명된 프로토콜들은 상업적으로 이용 가능한 키트들 및/또는 시약들과 함께 제조사의 지침서에 설명되지 않은 발명자들에 의해 이루어진 수정들을 포함한다.

1) (RNA 안정화제를 이용하여) Streck® RNA BCT 튜브 (RNA 안정제 포함)로 환자의 혈액을 추출한다.

2) 환자의 혈액을 채취한 지 7 일 이내에 다른 혈액 층들에서 무세포 RNA 혈장을 원심 분리하여 분리한다.

3) 상단 층에서 조심스럽게 피펫팅하여 버피 코팅에서 혈장 층을 제거한다.

4) 혈장 스핀 다운 시 약 1-3 ml의 혈장을 추출한다.

(전체 RNA 안정화 혈액에서 혈장을 분리한 직후 최대 RNA 량을 추출하여 회수한다.)

5) -80 ℃에서 1ml 분량의 과다 혈장(excess plasma)을 동결시킨다.

6) 핵산의 추출은 다음과 같이 이루어졌다:

a. QIAamp® 순환 핵산 키트(Circulating Nucleic Acid Kit)를 사용

i. 키트에 포함된 완충액을 준비한다: 분리할 샘플들의 수에 필요한 부피의 ACB, ACW1 및 완충액 ACW2

ii. 키트에 설명된 반응 당 부피에서 완충액 RNA에 캐리어 RNA (1ug)를 추가한다.

iii. 단백질 분해 효소(Proteinase) K와 혈장을 60 ℃에서 1 시간 동안 배양한다.

iv. 균(lysate)에 완충액 ACB 추가한다.

v. 얼음 위에서 5 분 동안 배양(incubate)한다.

vi. 혼합물을 QIAamp 소형 컬럼에 적용하고 진공 상태로 액체를 통과시킨다.

vii. QIAamp 미티 컬럼에 600ul의 완충액 ACW1을 적용한다. 진공 펌프로 칼럼을 통해 액체를 추출한다.

viii. 750 ul의 완충액ACW2를 QiaAmp 소형 컬럼에 적용한다. 진공을 이용하여 액체를 추출한다.

ix. 실온에서 15 분 동안 컬럼 상에서 배양하고 컬럼 중앙에 60ul RNA 분해 효소(RNAse) 없는(Free) DNA 분해 효소(DNAse)를 직접 첨가하여 DNA의 컬럼 DNAse 분해를 수행한다.

b. 2.5ul DNAse 비축(stock), 10ul RDD 완충액, 87.7ul 물 (RNAse 없음)을 사용하여 RNAse 없는 DNAse (Qiagen 카탈로그 번호 79254)를 준비한다.

i. 위의 (6) (a)의 vii과 vii 단계를 반복한다.

a. QIAamp 소형 컬럼에 600ul의 완충액 ACW1을 적용한다.

진공 펌프로 칼럼을 통해 액체를 추출하다.

b. 750 ul의 완충액 ACW2를 QiaAmp 소형 컬럼에 적용한다. 진공을 이용하여 액체를 추출하다.

ii. 추가 단계들:

1. 750 ul 에탄올 (96-100 %)을 QIAamp 소형 컬럼에 적용한다. 진공 상태에서 에탄올을 추출한다.

2. 깨끗한 2ml 튜브에 소형 컬럼을 원심 분리에 의해 원심 분리하여 건조시킨다

3. 56 ° C의 열을 가하여 10 분간 더 건조시킨다.

iii. 용리 단계

1. 제조사는 완충액 AVE 30 ~ 150 ㎕를 QIAamp 소형 멤브레인의 중앙에 놓고 실온에서 3 분간 배양하고, 2,000 x g에서 1 분간 원심 분리하여 핵산을 용리시켜 용리가 수행되어야 함을 제안했다.

2. 제조사는 또한 RNeasy 제거(Clean up) 컬럼을 사용하여 DNAse free RNAse를 사용하여 용리 액에서 DNA를 절단(digest)시킬 것을 제안했다. 결과 : 이 과정은 실패한 것으로 밝혀졌으며 RNA가 거의 없거나 cDNA가 거의 생성되지 않았다.

3. 제조사는 온-컬럼 DNAse 처리가 효과가 없을 것이라고 강하게 주장했다. 발명자들은 또 다른 상업적으로 이용 가능한 제품에 대한 제조업 자의 제안을 따르려고 시도했다: 퀀티텍트 역 전사 키트(Quantitect Reverse Transcription kit)은 용액에서 DNA를 용액에서 절단할 뿐만 아니라 역 전사시킨다. 결과 : Quantitect Reverse Transcription 키트는 베타 액틴 프라이머/프로브로 PCR 증폭 하는 경우 cDNA 신호를 거의 생성하지 않는다.

4. 본 발명자는 동일한 완충액으로 2 회 용출시킨 다음,

a. QIAamp 소형 멤브레인의 중앙에 60ul 완충액 AVE를 넣고 3 분 동안 실온에서 배양하고, 1 분 동안 20,000 x g에서 원심 분리하고 수집 튜브에서 용리액을 제거한 후, 다시 QIAmp 소형 멤브레인에 올려 놓고 다시 3 분 동안 원심 분리하여 용리시킨다.

b. DNA가 컬럼에서 절단되었기 때문에 제거 작업이 필요하지 않았다.

5. 다음에 VILO 역 전사 효소 키트 (Life Technologies) 및 랜덤 헥사 머 프라이머를 사용하여, RNA를 cDNA로 역 전사시킨 후, 랜덤 헥사머를 실온에서 10 분간 b결합(bBinding), 42 ℃에서 60 분간의 연장, 85 ℃에서 15 분 동안 열로 효소를 사멸시키는 것이 뒤따른다.

a. 생성된 cDNA는 제조사의 지침에 따라 ZYMO ssDNA 및 RNA 제거 컬럼들(cleanup columns)을 사용하여 정제되었다. 이는 일부 실시 예들에서 행해질 수 있다.

b. RNA의 상대적 양을 결정하기 위해 베타-액틴 프라이머/프로브들을 이용한 cDNA의 PCR이 사용되었다. RNA 농도의 QUBIT 판독 결과 RNA가 나타나지 않았다.

6. 가능한 경우 인트론들을 스패닝하여 DNA보다 오히려RNA 서열을 증폭시키기 위해 개발된 프라이머/프로브들로 생성된 cDNA가 PCR 증폭되었다.

7. RT 대조군들 (비 -역 전사 RNA들)은 샘플 내에서 증폭 가능한 DNA의 존재를 배제하도록 실시되지 않았다.

8. 다른 실시 예에서, 로봇 추출 기법들이 환자 혈장으로부터 RNA를 분리하는데 사용되었다.

RNA와 RNA 처리 방법의 안정성과 관련하여 제조사에 의해 알려진 것과 현재의 최첨단 기술과는 달리, RNA 추출 절차는 RNA 안정화 혈액 추출 튜브, 온-컬럼DNAse 절단, 이중 RNA (수율을 증가시키기 위해 첫 번째 용리액을 컬럼을 통해 다시 통과시킴) 및 BCT 안정화된 혈액으로부터 분리된 혈장의 즉각적인 처리를 이용한다. 동결 상태에서도 혈장내의 RNA는 불안정하다. Streck의 BCT RNA 안정화된 튜브는 RNA가 동결 후 성능 저하되지 않도록 보호한다.

Agilent 사의 유니버설 휴먼 참조 (UHR) RNA와 같은 알려진 농도의 cDNA를 갖는 랜덤 헥사머 및 베타-액틴 프라이머/프로브들을 사용하여 혈장에서 cDNA의 PCR로부터 얻어진 CT들을 비교함으로써 RNA (역 전사 된 cDNA)의 수율을 결정하는 알고리즘이 개발되었다. 일반적으로, 알려지지 않은 샘플의 상대적인 발현을 결정하기 위해, 알려진 대조군 cDNA에 대한 값이 알려지지 않은 샘플들의 각각의 PCR 동작들에 포함되도록 설정된다. 섹션 00033에 설명된 델타-델타 Ct 방법은 상대적인 발현의 계산에 사용된다. 상기 대조군들은 구입된 (UHR과 같은) 셀 라인 RNA일 수 있거나 또는 cDNA의 합성 단편(fragment)들은 각각의 관심 유전자에 대하여 야생형 또는 정상 대조군 cDNA에 스파이크될 수 있다.

랜덤 헥사머들을 사용하여 역전 사로 인해 생성되는 cDNA 스트랜드(strand )를 증폭시키는데 프라이머 및 프로브들이 사용되었다

예시 2

대장 암 환자의 혈액을 RNA 안정화제 (Streck의 RNA BCT 튜브)를 포함하는 튜브 내부에 넣고 실온에서 밤새 보관했다. 혈장을 원심 분리로 분리하고 RNA는 Qiagen 순환 핵산(Circulating Nucleic Acids) 키트를 사용하여 추출되었다. ERCC1, KRAS WT 및 베타 액틴에 특이적인 프라이머를 갖는 실시간 Taqman 플랫폼 (ABI 7900)을 사용하여 상대적 유전자 발현이 결정되었다. 표준 하우스-키핑 유전자, 베타 액틴에 대한 PCR 산물들과 ERCC1 및 KRAS WT 특이적 프라이머들 각각에서의 PCR 산물들 사이에 델타 CT 방법을 사용하여 계산들이 이루어졌다. 대장 암 환자의 혈장에서 추출한 무세포 RNA의 ERCC1과 KRAS 대 베타 액틴의 상대적인 발현을 보여주는 결과들이 도 1에 나타난다. 도 18은 KRAS (적색), NRAS (녹색), BRAF (황색) 또는 비 (청색) 돌연변이들을 갖는 환자에서의 ERCC1 발현을 나타낸다.

예시 3

이 예시에서 설명된 실험은 ERCC 1 신호가 DNAse 절단 후 혈장에 남아있는 잔류 DNA로부터 유도될 수 있는 가능성을 평가했다. 도2의 상단 부분은 cDNA로 역-전사되었던 RNA를 사용하는 PCR 발현 패널을 나타낸다. 하단 패널은 비-역-전사된 RNA를 사용하여 샘플을 증폭시킨 음성(negative) 결과들을 나타낸다. 상부 패널을 통한 발현 분석에 기여했을 임의의 잔류 DNA의 증폭은 비-역 -전사 RNA를 사용하여 신호를 생성하였을 것이다. PCR 신호는 RNA 특이적이며 비-역-전사 RNA (no-RT)가 백그라운드 PCR 신호를 생성하지 않음을 나타낸다.

예시 4

이 예시에서 설명된 실험은 유전자 발현을 측정하기 위해 사용된 샘플들의 DNA에서 KRAS 돌연변이 상태를 평가 하였다. 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 상기 연구에서의 샘플들이 대장 암에서 KRAS의 유전적 돌연변이 빈도를 일반적으로 반영하는 것을 나타내기 위하여 이러한 데이터가 생성되었다. KRAS 참조 야생형 유전자 수준들의 출현(appearance)뿐만 아니라 이러한 세트의 샘플들에서 예상되는 빈도의 KRAS 돌연변이 변이가 발견되었다. 대장 암에서 가장 흔한 KRAS 돌연변이는 KRAS G12D 이었고, 그 다음으로 G12V와 덜 빈번한 G13D이었다. 통계적으로, G12D 및 G12V 돌연변이들은 이러한 소수의 환자들에서 식별되었어야 하는 반면에, G13D 돌연변이를 식별하는 데 더 많은 수의 환자들이 필요하다. KRAS 참조 DNA는 돌연변이가 없는 유전자의 영역을 사용하여 PCR 증폭되었다. 모든 환자 샘플들은 KRAS 참조 DNA 서열을 포함해야 한다.

예시 5

이러한 예시 및 도 4에 도시된 바와 같이, 무세포 DNA에서 결정된 특정 KRAS 돌연변이가 동일한 환자의 RNA에 반영되었다. 무세포 DNA가 종양에서 혈류로 스며 나왔다. 이러한 예시는 무세포 RNA가 종양에서의 무세포 DNA의 반영이라면, 면 유전자에 대한 돌연변이 상태가 이러한 두 핵산들에서 일치해야 한다는 가설을 확인했다. 이는 결장암 환자(1037)의 분석을 위한 경우이다.

환자(1037)의 KRAS G12D 돌연변이의 존재에 대한 추가 분석은 디지털 PCR 기술을 두 번째 플랫폼으로 사용하여 수행될 수 있다.

예시 6

이러한 예시 및 도 5에 도시된 바와 같이, 야생형 대립 형질에 대한 KRAS 돌연변이 대립 유전자의 백분율을 평가할 수 있었다. 이러한 연구의 목적을 위해, 이러한 환자 샘플에서 G12D KRAS 돌연변이의 존재를 확인하기 위해 두 번째 플랫폼과 두 번째 분석을 사용하였다.

도 12는 DNA와 cDNA/RNA의 혈장 mL 당 KRAS G12D의 상대적 양을 나타낸다.

대장 암 환자의 혈장 샘플들에서 KRAS의 돌연변이 상태를 평가하기 위한 야생형 차단제 프라이머가 있거나 또는 없는 대립 형질-특이 PCR 프라이머 프로브들이 사용되었다. 동일한 결과들이 획득되었다.

RNA에서 역 전사된 cDNA의 돌연변이를 측정함에 있어서, 대립 형질-특이 적 PCR 프라이머 프로브들이 사용되었다. 또한, RNA/cDNA의 PCR 증폭으로부터 신호의 민감도를 더욱 향상시키는 야생형 블로커 프라이머들(blocker primers)이 설계되고 사용된다.

RNA 대 DNA의 증가된 신호로부터 증가된 민감도와 특이성이 획득될 수 있다. DNA에서 전사된 다수의 RNA 단편들이 있기 때문에, 게놈 DNA대 RNA로부터 역 전사된 cDNA의 PCR 분석에서 신호가 더 높을 것으로 기대된다. 도 6에서, RNA와 DNA 사이의 신호 관계가 도시된다. 대장 암 환자의 혈장에서 추출된 역 전사된 mRNA (cDNA)의 중간 PCR 신호는 대응하는 DNA보다 약 7 배 더 높았다. 비-역 전사된 mRNA 백그라운드는 무시되었다.

예시 7

DNA에 대한 RNA의 신호를 더욱 향상시키기 위해 컬럼 cDNA 제거 방법들이 사용되었다. 이론에 구속되지 않고, 제거 방법들은 역 전사 반응들에서 저해 물질들을 감소시킴으로써 RNA의 신호를 강화시키고 cDNA를 농축시켰다. 도 7에 도시된 바와 같이, RNA의 수율은 DNA보다 최대 60 배였다. cDNA 대 RNA (RNA)의 비례 체적당 상대 베타-액틴 CT에 의해 측정되는 수율은 동일한 환자 혈장에서 추출되었다. RNA 신호를 증가시키기 위해 순환 파라미터들과 역 전사 효소 제거(clean-up) 반응들이 조정되었다.

예시 8

종양들에 의해 혈류로 방출된 무세포 DNA (cfDNA)는 초기 종양 특이 적 돌연변이들의 비 침습적 식별을 가능하게 한다. 그러나, 종양의 모든 분자 변화들이 DNA 돌연변이들을 포함하는 것은 아니다; 많은 경우들에서, 또한 특정 유전자 (즉, 유전자 발현)의 양이 중요하다. NSCLC 환자들의 PD-L1 유전자 발현을 모니터링하기 위해 혈액으로 방출된 무세포 RNA (cfRNA)가 측정되었다. PD-1 / PD-L1 경로는 유망한 치료 표적이며, 항-PD-L1 제제는 다양한 종양 유형들에서 활성을 촉진시킴을 보였다.

치료 중 여러 시간에 비소 세포성 폐암 환자로부터 혈액 샘플이 수집되었다. 또한, 암이 없는 혈액 샘플들은 건강한 지원자 ("대조군")로부터 획득되었다. 혈액 샘플들로부터 혈장을 분획하고 핵산을 추출하였다. RNA를 랜덤 프라이머를 사용하여 cDNA로 역-전사시킨 다음, 적절한 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 정량적 RT-PCR로 분석하였다. PD-L1의 cDNA를 암 환자들 및 대조군 모두에서 정량화하였다. ERCCl 발현은 비 종양 특이적 유전자의 일례로서 또한 정량화되었고, β-액틴 발현은 전체 RNA를 나타내는 분모 유전자로 사용되었다.

PD-L1 발현이 비소 세포성 폐암 환자의 70 % (7/10 혈장 샘플)의 ctRNA에서 검출되었으나 대조군 (0/9)에서는 검출되지 않았다 (p = 0.0031, Fisher 's Exact Test). (도 8). ERCC1 발현은 NSCLC 환자의 100 % (10/10), 대조군의 67 % (6/9)에서 검출되었으나, 검출된 환자의 상대적인 발현에는 중요한 차이는 없었다 (p = 0.2328, Wilcoxon Rank Sums) (도 9). 암 환자들 및 대조군의 중간 상대 β-액틴 발현들은 각각 15.52 (0.54 - 94.91) 및 0.53 (0 - 1.03)이었다 (p = 0.0008, Wilcoxon Rank Sums) (도 10).

이러한 데이터는 암과 암의 재발을 검출하기 위한 유전자 발현을 측정하기 위해 혈액에서 cfRNA를 사용하고, 치료법을 선택하고 모니터링하는 잠재적 가치를 보여준다. 혈액 내 PD-L1 cfRNA의 존재는 모든 암 환자들에서 발현되는 것은 아니기 때문에 종양 검출 민감도가 100 % 미만이지만 암의 특정 지표 일 수 있다. ERCC1 발현은 암 환자들과 건강한 개체들의 발현 수준에 큰 차이가 없는 유전자를 예시한다. 암 환자들과 건강한 개체들 사이의 총 cfRNA의 중간값(median)의 놀랍게 큰 (약 30 배) 차이는 총 cfRNA가 암의 존재 및 재발 모니터링의 고감도의 예비 지표로 유용할 수 있음을 시사한다.

도 14A는 결장 직장암 (CRC), 비소 세포성 폐암 (NSCLC) 환자들 및 건강한 개체들의 상대적 빈도를 나타내고, CRC 환자의 17.4 %, NSCLC 환자의 50 % 및 건강한 개체들의 0 %가 PD-L1 유전자 발현의 상대적 증가를 가짐을 나타낸다. 도 14B는 상대적인 PD-L1 유전자 발현 수준이 PD-L1 양성 CRC와 비소 세포성 폐암 환자간에 유사하다는 것을 나타낸다.

예시 9

비소 세포성 폐암 (NSCLC: non-small cell lung cancer)에서는 표적 치료 방법들에 대한 임상적 결과들을 갖는 몇 가지 유전적 변화들이 식별되었다. EGFR 돌연변이들에 대하여, 돌연변이들은 이미 한 가지 이상의 치료법에 대한 옵션들이 있다. EGFR 억제제들에 대한 T790M-매개 내성과 같은 2차 변화들을 갖는 환자들에게 비가역적 티로신 키나아제 억제제 (TKI)가 유망한 대안으로 보인다. 그러나, 진행중인 종양을 가진 환자들은 필요한 침습적 절차들로 사망률에 취약할 수 있기 때문에 이러한 옵션들은 이러한 변화의 증거를 누락하는 것으로 한정될 수 있다. 고체 악성 종양에서 유전 정보에 대한 적절한 정보를 획득하기 위해 말초 혈액을 사용하는 소위 "액체 생검 (Liquid Biopsy)" 은 이러한 문제에 대한 긴급히 필요한 해결책으로 보인다. 빠른 턴 어라운드와 광범위한 이용 가능성을 갖는 방법이 필요하다.

혈청에서의 돌연변이 검출 결과의 상관 관계는 이용 가능한 종양 샘플의 측정과 중요하게 상관 관계가 있었다. 또한, 예상되는 빈도는 공표된 유전적 변화들의 발생과 일치되었다. 그러나, T790M 돌연변이들이 예상된 것보다 더 높았기 때문에 암 센터 특정 환자 선택에 기인할 수 있다는 잠재적인 편견이 있었다. 이러한 결과들은 테스트된 신선한 혈액 샘플과 일치하였다. 신선한 샘플의 턴-어라운드는 3 일이었다.

돌연변이 검출은 빠른 턴-어라운드와 높은 민감도 및 특이성을 가진 말초 혈액에서 실현 가능하다. 또한, 신선하거나 저장된 혈청 프로브들이 샘플들로 사용될 수 있다. 이로 인하여 치료 시작까지 짧은 간격으로 인해 신속한 치료 결정과 환자 만족도를 높이는 것이 가능하다. 액체 (예를 들어, 혈청 또는 혈액)로부터 돌연변이를 검출하기 위한 본원에서 설명된 방법은 조직 샘플들을 분석하는 것에 대한 명확하고 의학적으로 필요한 대안이다. 특히, 전신 요법 중 종양의 2 차적 변화의 경우 에 이러한 방법이 중요할 것이다.

예시 10

이러한 예시에서, 본 발명의 방법들은 질병 진행 및 치료를 통한 동적 시험에 활용된다. 도 13B는 반응 환자의 치료 과정 동안 cfRNA에서 PD-L1 발현의 예상되는 감소를 나타낸다.

도 15A는 대장 암을 치료하는 동안 KRAS G12V에 대한 cfDNA를 모니터링하는 대립 형질의 증가를 레고나페닙/세툭시맙 (Regorafenib/Cetuximab)과 비교하여 나타낸다. 도 15B는 치료 과정에서 시간이 지남에 따라, Regorafenib/Cetuximab으로 대장 암을 치료하는 동안 cfRNA에서 PD-L1의 상대적 발현이 감소함을 나타낸다. 도 15C는 대장 암을 Regorafenib/Cetuximab으로 치료하는 동안 시간 경과에 따른 ERCCl의 상대적인 발현을 나타낸다.

도 16은 PD-L1, ERCCl 및 KRAS G12D에 대한 FOLFOX 및 크리조티닙(crizotinib)을 이용한 치료 동안 결장 직장암 환자들에서 cfRNA의 상대적인 유전자 발현을 나타낸다.

도 17은 ERC1 및 KRAS G12D에 대한 FOLFIRI/ 베바시주맙(Bevacizumab) 및 Regorafenib/Cetuximab를 이용한 치료 동안 대장 암 환자들에서의 cfRNA에서의 상대적 유전자 발현을 나타낸다.

본 발명의 방법은 치료 전, 치료 전, 치료 후 및 투여 후 시점에서 질병 진행 또는 치료 반응을 모니터링하는 비 침습적 방법을 제공한다.

또한, 이러한 방법들은 치료를 위한 추가 표적들을 찾는데 상대적인 유전자 발현을 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 19는 위암 환자에서 PD-L1 및 HER2의 무세포 RNA에서 모니터링되는 상대적인 발현을 나타낸다. 상기 데이터는 치료를 위한 두 개의 추가 표적을 나타내는 초기 모니터링 후 PD-L1 및 HER2 발현의 증가를 나타낸다.

Claims

암이 있거나 암이 있는 것으로 의심되는 개체로부터의 생물학적 샘플에서 암과 연관된 하나 이상의 바이오 마커들을 식별하는 방법에 있어서, 상기 방법은,
a. 고체 지지체(solid support)를 사용하여, 상기 생물학적 샘플이 RNA 안정화제와 상호 작용함으로써, 상기 생물학적 샘플로부터 RNA를 분리(isolate)하는 단계;
b. RNA가 상기 고체 지지체 상에 있는 동안 상기 생물학적 샘플에 존재하는 DNA를 절단(digest)시키는 단계;
c. 상기 고체 지지체로부터 RNA를 1 회 이상 용리(elute)시키는 단계;
d. 상기 RNA를 cDNA로 역 전사시키는 단계;
e. 암과 연관된 하나 이상의 바이오 마커들을 검출하는데 특이적인 적어도 하나의 프라이머와 상기 cDNA를 반응시키는 단계; 및
f. 하나 이상의 바이오 마커들이 상기 생물학적 샘플에 존재 하는지를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 바이오 마커의 존재는 상기 개체가 암과 연관된 하나 이상의 바이오 마커들을 갖는지 여부를 식별하는 것을 특징으로 하는 암 진단 및/또는 모니터링을 위한 무세포 RNA의 사용 방법.
제1항에 있어서,
상기 c단계의 용리는 이중 용리에 대하여 동일한 컬럼을 통해 통과하는 것을 특징으로 하는 암 진단 및/또는 모니터링을 위한 무세포 RNA의 사용 방법.
제1항에 있어서,
상기 생물학적 샘플은 상기 암이 있거나 암이 있는 것으로 의심되는 개체로부터의 혈장인 것을 특징으로 하는 암 진단 및/또는 모니터링을 위한 무세포 RNA의 사용 방법.
제3항에 있어서,
상기 혈장은 상기 RNA 안정화제와 상호 작용하는 7일 이내에 처리되는 것을 특징으로 하는 암 진단 및/또는 모니터링을 위한 무세포 RNA의 사용 방법.
제1항에 있어서,
랜덤 헥사머들은 상기 RNA를 cDNA로 역 전사하기 위해 d단계에서 사용되는 것을 특징으로 하는 암 진단 및/또는 모니터링을 위한 무세포 RNA의 사용 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 바이오 마커는 PD-Ll, ERCCl, EGFR, TS, AREG, EREG, VEGFR2, EML4ALK, ROSl, RET, c-Met, FGFRl, KRAS, BRAF, NRAS, Her-2, PIK3CA, KIT, GNAQ, 및GNA11로 이루어진 그룹에서 선택되는 유전자 또는 융합 전사 또는 유전자 발현의 돌연변이인 것을 특징으로 하는 암 진단 및/또는 모니터링을 위한 무세포 RNA의 사용 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 암은 암, 폐암, 흑색 종, 위암, 식도암, 유방암, 난소 암, 육종, 신장 세포, 전립선, 위장관 간질 종양 (GIST) 및 췌장암으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암 진단 및/또는 모니터링을 위한 무세포 RNA의 사용 방법.
암이 있거나 암이 있는 것으로 의심되는 개체로부터의 생물학적 샘플에서의 무세포(cell-free) cell-free RNA (cfRNA)에서의 화학 요법에 대한 내성과 연관된 하나 이상의 체세포 돌연변이(들)의 검출 감도를 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은,
a. 고체 지지체(solid support)를 사용하여, 상기 생물학적 샘플이 RNA 안정화제와 상호 작용함으로써, 상기 생물학적 샘플로부터 RNA를 분리(isolate)하는 단계;
b. RNA가 상기 고체 지지체 상에 있는 동안 상기 생물학적 샘플에 존재하는 DNA를 절단(digest)시키는 단계;
c. 상기 고체 지지체로부터 RNA를 1 회 이상 용리(elute)시키는 단계;
d. 상기 RNA를 cDNA로 역 전사시키는 단계;
e. 내성과 연관된 체세포 돌연변이(들) 중 하나 이상을 검출하는데 특이적인 적어도 하나의 프라이머와 상기 cDNA를 반응시키는 단계; 및
f. 하나 이상의 체세포 돌연변이가 상기 생물학적 샘플에 존재 하는지를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 바이오 마커의 존재는 상기 개체가 화학 요법에 대한 내성과 연관된 하나 이상의 체세포 돌연변이를 갖는지 여부를 식별하는 것을 특징으로 하는 암 진단 및/또는 모니터링을 위한 무세포 RNA의 사용 방법.
암이 있거나 암이 있는 것으로 의심되는 개체의 가능성을 결정하는 방법으로서, 상기 방법은,
a. 고체 지지체(solid support)를 사용하여, 상기 생물학적 샘플이 RNA 안정화제와 상호 작용함으로써, 상기 생물학적 샘플로부터 RNA를 분리(isolate)하는 단계;
b. RNA가 상기 고체 지지체 상에 있는 동안 상기 생물학적 샘플에 존재하는 DNA를 절단(digest)시키는 단계;
c. 상기 고체 지지체로부터 RNA를 1 회 이상 용리(elute)시키는 단계;
d. 상기 RNA를 cDNA로 역 전사시키는 단계;
e. 암과 연관된 하나 이상의 바이오 마커를 검출하는데 특이적인 적어도 하나의 프라이머와 상기 cDNA를 반응시키는 단계; 및
f. 암과 연관된 하나 이상의 바이오 마커들이 상기 생물학적 샘플에 존재 하는지를 검출하는 단계를 포함하고, 상기 바이오 마커의 존재가 상기 암을 갖는 개체의 가능성을 결정하는 것을 특징으로 하는 암 진단 및/또는 모니터링을 위한 무세포 RNA의 사용 방법.
암이 있거나 암이 있는 것으로 의심되는 개체의 가능성을 진단하는 것을 돕는 방법으로서, 상기 방법은,
a. 고체 지지체(solid support)를 사용하여, 상기 생물학적 샘플이 RNA 안정화제와 상호 작용함으로써, 상기 생물학적 샘플로부터 RNA를 분리(isolate)하는 단계;
b. RNA가 상기 고체 지지체 상에 있는 동안 상기 생물학적 샘플에 존재하는 DNA를 절단(digest)시키는 단계;
c. 상기 고체 지지체로부터 RNA를 1 회 이상 용리(elute)시키는 단계;
d. 상기 RNA를 cDNA로 역 전사시키는 단계;
e. 암과 연관된 하나 이상의 바이오 마커들을 검출하는데 특이적인 적어도 하나의 프라이머와 상기 cDNA를 반응시키는 단계; 및
f. 암과 연관된 하나 이상의 바이오 마커들이 상기 생물학적 샘플에 존재 하는지를 검출하는 단계를 포함하고, 상기 바이오 마커의 존재가 상기 암을 갖는 개체의 가능성의 진단을 돕는 것을 특징으로 하는 암 진단 및/또는 모니터링을 위한 무세포 RNA의 사용 방법.
제8, 9 및 10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 c단계의 용리는 이중 용리에 대하여 동일한 컬럼을 통해 통과하는 것을 특징으로 하는 암 진단 및/또는 모니터링을 위한 무세포 RNA의 사용 방법.
제8, 9 및 10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 생물학적 샘플은 상기 암이 있거나 암이 있는 것으로 의심되는 개체로부터의 혈장인 것을 특징으로 하는 암 진단 및/또는 모니터링을 위한 무세포 RNA의 사용 방법.
제 12 항에 있어서,
상기 혈장은 상기 RNA 안정화제와 상호 작용하여 7일 이내에 처리되는 것을 특징으로 하는 암 진단 및/또는 모니터링을 위한 무세포 RNA의 사용 방법.
제8, 9 및 10항 중 어느 한 항에 있어서,
랜덤 헥사머들은 상기 RNA를 cDNA로 역 전사하기 위해 d단계에서 사용되는 것을 특징으로 하는 암 진단 및/또는 모니터링을 위한 무세포 RNA의 사용 방법.
제8항에 있어서,
상기 바이오 마커는 PD-Ll, ERCCl, EGFR, TS, AREG, EREG, VEGFR2, EML4ALK, ROSl, RET, c-Met, FGFRl, KRAS, BRAF, NRAS, Her-2, PIK3CA, KIT, GNAQ, 및GNA11로 이루어진 그룹에서 선택되는 유전자 또는 융합 전사 또는 유전자 발현의 돌연변이인 것을 특징으로 하는 암 진단 및/또는 모니터링을 위한 무세포 RNA의 사용 방법.
제9항 또는 제10항에 있어서,
상기 체세포 돌연변이는 PD-Ll, ERCCl, EGFR, TS, AREG, EREG,VEGFR2, EML4ALK, ROSl, RET, c-Met, FGFRl, KRAS, BRAF, NRAS, Her-2, PIK3CA, KIT, GNAQ, 및GNA11로 이루어진 그룹에서 선택되는 유전자 또는 융합 전사 또는 유전자 발현인 것을 특징으로 하는 암 진단 및/또는 모니터링을 위한 무세포 RNA의 사용 방법.
제8, 9 및 10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 암은 암, 폐암, 흑색 종, 위암, 식도암, 유방암, 난소 암, 육종, 신장 세포, 전립선, 위장관 간질 종양 (GIST) 및 췌장암으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암 진단 및/또는 모니터링을 위한 무세포 RNA의 사용 방법.