KR20190129094A

KR20190129094A - cfRNA에 대한 액체 생검(LIQUID BIOPSY FOR cfRNA)

Info

Publication number: KR20190129094A
Application number: KR1020197030315A
Authority: KR
Inventors: 캐슬린 단넨버그; 샤루즈 라비자데; 조슈아 어셔; 욜란다 제이미스
Original assignee: 난토믹스, 엘엘씨
Priority date: 2017-03-17
Filing date: 2018-03-15
Publication date: 2019-11-19
Also published as: EP3596231A1; AU2018234821A1; US20200102618A1; CA3056700A1; JP2020511137A; IL269402A; WO2018170329A1; CN110431238A; SG11201908129PA

Abstract

cfRNA는 질병 관련 유전자의 발현 수준을 확인하고 정량하기 위해 사용되며, 추가로 이러한 유전자 변화의 비-침습적 모니터링을 가능하게 한다. 또한, 질병 관련 유전자의 정량적 분석은 치료가 질병 관련 유전자의 존재에 의해 좌우되는 경우 치료 반응의 예측을 가능하게 할 것이다.

Description

cfRNA에 대한 액체 생검(LIQUID BIOPSY FOR cfRNA)

본 출원은 2017년 3월 17일에 출원된 제62/473,273호, 2017년 6월 20일에 출원된 제62/522,509호 및 2017년 12월 1일에 출원된 제62/593,534호의 일련 번호를 갖는, 본 출원인의 공동 계류 중인 US 가출원들에 대한 우선권을 주장한다.

발명의 분야

본 발명의 분야는, 특히 종양 세포로부터의 순환 자유 RNA(cfRNA)와 관련하여, cfRNA의 검출 및 정량 시스템 그리고 방법이다.

배경 기술에는 본 발명의 이해에 있어 유용할 수 있는 정보가 포함된다. 이는 본원에 제공된 임의의 정보가 선행 기술이거나 본원에서 청구되는 발명에 관련된다거나, 명시적으로 또는 묵시적으로 참조되는 임의의 공보가 선행 기술이라고 인정하는 것이 아니다.

본원에서 모든 공보 및 특허 출원은 각각의 개별 공보 또는 특허 출원이 참조로 포함된다고 구체적이고 개별적으로 나타내는 것과 같이 동일한 정도로 참조로 포함된다. 포함된 참고문헌에서 용어의 정의 또는 사용이 본원에 제공된 그 용어의 정의와 일치하지 않거나 반대인 경우, 본원에 제공된 그 용어의 정의가 적용되며, 참고문헌에서 그 용어의 정의는 적용되지 않는다.

지난 십 년 동안, 암 치료법은 수술과 방사선이 조합된 일반 항암화학치료법 기반 치료법으로부터 환자들에 걸친 종양의 유전적 변동성을 고려하는 보다 개인화된 치료로 변화해왔다. 따라서, 이제 치료 계획은 보다 표적화된 치료법을 가능하게 하는 분자 마커의 확인을 종종 필요로 한다. 여러 경우에 있어, 이러한 정보는 암 조직 생검으로부터 다양한 핵산 분자의 분석에 의해 수득된다. 그러나, 조직 생검은 종종 최초 진단 또는 수술로 제한되며, 이후 생검은 환자에게 상당한 위험 및 불편을 초래하는 경향이 있다. 또한, 종양 조직 생검은 샘플링 편향이라는 점에서, 그리고 치료법 과정 동안 환자에서 종양 마커로서 핵산 분자를 모니터링하는 능력이 제한된다는 점에서 문제가 되는 경향이 있다.

종양 및 비-종양 세포로부터의 핵산 분자가 혈액으로부터 수득될 수 있다는 것이 알려졌으나(예컨대, 문헌[Clin Canc. Res. (1999) Vol 5, 1961-1965; Canc Res. (1977) 37:646-650] 참고), 이들 핵산이 임의의 담체 또는 다른 구조와 연관되거나 결합되는지의 여부는 명확하지 않았다. 실제로, 보다 최근에 RNA가 순환 종양 세포(예컨대, WO 2017/180499 참고), 엑소좀(예컨대, WO 2015/082372 참고) 및 담체 단백질(예컨대, WO 2010/079118, 또는 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. (1985) 82, 3455] 참고)을 포함하는 다양한 원천으로부터 유래할 수 있다는 것이 발견되었다.

유감스럽게도, 아마도 RNA의 상이한 위치/다양한 담체 또는 다른 구조와의 회합으로 인해, 순환 핵산의 정확한 정량은 종종 문제가 되었다. 예를 들어, 세포 비함유 RNA를 사용하는 신경모세포종에서의 질병 상태 검출은 전체 세포 RNA 분석에 대한 신뢰할 수 있는 대안이 아닌 것으로 나타났다(예컨대, 문헌[Pediatr Blood Cancer. 2010 Jul 1;54(7):897-903] 참고). 마찬가지로, WO 2016/077709에 기재된 바와 같이 이의 특정 회합과 무관하게 혈중 돌연변이되거나 부적절하게 융합된 유전자로부터 상대적으로 소량의 cfRNA를 검출할 수 있지만, 이러한 RNA의 검출량들은 상당히 상이했다. 또한, 임의의 검출된 양이 세포 내 생리적 현실의 반영인지 특정 관심 RNA의 안정성의 함수인지의 여부는 알려지지 않은 채로 남아있었다. 예를 들어, '709 공보에서의 데이터는 PD-1/PD-L1을 인코딩하는 cfRNA의 양이 종종 매우 가변적이며 샘플, 환자 질환 및 다른 요인에 의해 좌우될 수 있음을 시사한다. 결과적으로, 항-PD-1/PD-L1 치료법에 대한 암 환자의 적격성을 결정하기 위한 예후제 및/또는 표시인자로 PD-L1 cfRNA 발현 수준을 사용하는 것은 현재까지 보고된 바 없었다.

따라서, 생물학적 유체로부터 핵산을 분석하는 여러 방법이 당분야에 알려져 있지만, 이들 중 전부 또는 거의 전부가 다양한 단점을 가지고 있다. 따라서, cfRNA 분석을 위한 개선된 시스템 및 방법에 대한 필요성이 남아 있다.

본 발명의 주제는 치료 반응을 예측하고, 치료를 추적하고, 및/또는 암을 진단하기 위해 하나 이상의 cfRNA의 cfRNA 수준을 사용하는 다양한 조성물 및 방법에 대한 것이다. 특히 바람직한 양태에서, 본 발명자들은 소정의 암에 대한 치료 반응을 예측하는 소정의 cfRNA, 특히 PD-L1 및 HER2에 대한 발현 역치 수준이 결정될 수 있다는 것을 발견하였다.

본 발명의 주제의 일 양태에서, 개인으로부터 혈액을 수득하고 혈액으로부터 cfRNA를 단리하는 단계로서, cfRNA가 체크포인트 억제 유전자를 인코딩하는 단계 및 정량적 PCR 방법을 사용하여 cfRNA를 정량하는 추가 단계가 포함되는, 체크포인트 억제제를 이용한 치료에 대해 암을 갖는 개인의 치료 반응을 예측하는 방법. 이어서 cfRNA의 양이 역치 수준 초과인 경우, 양성 치료 반응이 예측된다.

바람직한 구현예에서, 체크포인트 억제제는 PD1 또는 PD-L1에 대한 항체이며 cfRNA는 PD-L1 cfRNA이다. 또한, cfRNA를 단리하는 단계는 RNA 안정화 및 세포 보존 중 적어도 하나를 사용하는 것이 일반적으로 바람직하다. 가장 전형적으로, 정량적 PCR 방법에는 바람직하게는 β-액틴을 내부 표준으로 하는 실시간 PCR이 포함된다. PD-L1이 정량되는 경우, 역치 수준은 β-액틴 대비 PD-L1에 대해 10 초과의 ΔΔCT일 수 있다. 추가로, 요망되는 경우, 적어도 하나의 제2 cfRNA가 정량적 PCR 방법을 사용하여 정량될 수 있다. 본 발명의 주제에 제한되지 않으면서, 고려되는 제2 cfRNA는 TIM3 또는 LAG3, 종양 및 환자 특이적 돌연변이를 갖는 유전자, 종양 연관 유전자, 또는 암 특이적 유전자를 인코딩할 수 있다.

본 발명의 주제의 또 다른 양태에서, 본 발명자들은 또한 개인으로부터 혈액을 수득하고 혈액으로부터 cfRNA를 단리하는 단계로서, cfRNA가 체크포인트 억제 유전자를 인코딩하거나 cfRNA가 종양 연관 또는 암 특이적 유전자를 인코딩하거나 cfRNA가 종양 및 환자 특이적 돌연변이를 갖는 유전자를 인코딩하는, 단계; 정량적 PCR 방법을 사용하여 cfRNA를 정량하는 단계; 및 cfRNA의 양을 이용하여 환자 기록을 업데이트하는 단계를 포함하는, 암을 갖는 개인의 치료를 모니터링하는 방법을 고려한다.

예를 들어, 적합한 체크포인트 억제 유전자에는 PD-L1, TIM3, 또는 LAG3이 포함되며, 종양 연관 또는 암 특이적 유전자에는 CEA, MUC1, 브라큐리(brachyury), HER2, PCA3, 또는 AR-V7이 포함되며, 종양 및 환자 특이적 돌연변이를 갖는 적합한 유전자는 바람직하게는 네오에피토프(neoepitope)를 인코딩한다. 상기 주지된 바와 같이, cfRNA를 단리하는 단계가 RNA 안정화 및 세포 보존을 사용하며, 정량적 PCR 방법에 실시간 PCR(예컨대, 내부 표준으로 β-액틴을 사용)이 포함되는 것이 일반적으로 바람직하다. 환자 기록은 cfRNA의 양이 β-액틴 대비 HER2에 대해 5 초과의 ΔΔCT이거나 β-액틴 대비 PCA3에 대해 10 초과의 ΔΔCT인 경우 업데이트될 수 있다.

본 발명의 주제의 또 다른 양태에서, 본 발명자들은 개인으로부터 혈액을 수득하고 혈액으로부터 cfRNA를 단리하는 단계로서, cfRNA가 PCA3 또는 안드로겐 수용체의 스플라이스 변이체 7을 인코딩하는, 단계; 정량적 PCR 방법을 사용하여 cfRNA를 정량하는 추가 단계; 및 cfRNA 양이 역치 수준을 초과하는 경우 개인이 암을 갖는 것으로 진단하는 추가 단계를 포함하는, 전립샘암을 검출하는 방법을 고려한다. 가장 전형적으로, 개인은 PCA3 cfRNA의 양이 β-액틴 대비 10 초과의 ΔΔCT인 경우 암을 갖는 것으로 진단된다.

요망되는 경우, 종양 및 환자 특이적 돌연변이를 갖는 유전자, 종양 연관 유전자, 암 특이적 유전자, 또는 체크포인트 억제 유전자를 인코딩하는 제2 cfRNA가 적어도 정량될 수 있다. 따라서, 이러한 제2 유전자에는 PD-L1, LAG3, TIM3, AR-V7, PSA 및 PSMA가 포함된다.

본 발명의 주제의 또 다른 양태에서, 본 발명자들은 또한 PD-L1 음성 암으로 진단받은 개인에게 약물을 투여하는 단계; 혈액으로부터 cfRNA를 단리함으로써 개인의 치료를 모니터링하는 단계로서, cfRNA가 PD-L1을 인코딩하는, 단계; 정량적 PCR 방법을 사용하여 cfRNA를 정량하는 단계; 및 cfRNA의 검출 시 치료에 체크포인트 억제제를 포함시키는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 고려한다.

이러한 방법에서, 전형적으로 PD-L1 음성 암이 고형 암(예컨대, 유방암)이고/이거나 약물이 아피니토르인 것이 고려된다. 가장 전형적으로, cfRNA를 정량하는 단계는 실시간 PCR을 사용하며, cfRNA가 검출되고 경시적으로 증가하는 경우 체크포인트 억제제를 포함시킨다. 이러한 방법의 추가로 바람직한 양태에서, cfRNA가 검출되고 cfRNA 수준이 β-액틴 대비 10 초과의 ΔΔCT인 경우 체크포인트 억제제를 포함시킨다.

또한, 본 발명자들은 개인의 혈액 중에서 별개의 cfRNA 분자의 양을 결정하는 단계로서, cfRNA 분자가 별개의 체크포인트 억제 유전자(예컨대, PD-L1, TIM3, LAG3)를 인코딩하는 단계가 포함되는, 환자에서 면역 특징부를 결정하는 방법을 또한 고려한다. 전형적으로, 결정하는 단계는 체크포인트 억제제, 항암화학치료 약물, 면역 치료 약물 및 방사선 치료 중 적어도 하나를 이용한 치료 전에 또는 치료 동안 수행된다.

본 발명의 주제의 다양한 목적, 특성, 양태 및 장점은 동일한 번호가 동일한 요소를 나타내는 첨부 도면의 그림과 함께, 바람직한 구현예의 하기 상세한 설명으로부터 더 명백해질 것이다.

도 1은 건강한 대상체 및 암으로 진단받은 대상체에 있어서 cfDNA 및 cfRNA에 대한 혈장 농도를 비교하는 그래프를 도시한다.
도 2a는 다양한 암 유형에 걸쳐 PD-L1 cfRNA에 대한 혈장 농도를 비교하는 그래프를 도시한다.
도 2b는 건강한 대상체에 있어서 PD-L1 cfRNA에 대한 혈장 농도를 나타내는 그래프를 도시한다.
도 2c는 PD-L1 cfRNA에 있어서 혈장 농도에 대한 선형 범위를 나타내는 그래프를 도시한다.
도 3a는 임상 시험에서 폐암 환자에 대한 PD-L1 cfRNA의 상대 발현을 나타내는 그래프를 도시한다.
도 3b는 임상 시험에서 폐암 환자에 대한 IHC에 의해 측정되는 PD-L1 발현을 나타내는 데이터를 도시한다.
도 4는 니볼루맙에 대한 비-반응자 및 반응자에 있어서 PD-L1 cfRNA 수준을 나타내는 그래프 및 치료 동안의 PD-L1 cfRNA 수준과 함께, 폐 종양 샘플의 대응하는 IHC 염색을 도시한다.
도 5a는 PD-L1 cfRNA 수준을 PD-L1 IHC에 의해 결정되는 PD-L1 상태와 연관시키는 그래프를 도시한다.
도 5b는 PD-L1 cfRNA 수준을 PD-L1 cfRNA 수준에 대한 임상적으로 관련된 발현 역치를 실증하는 니볼루맙 반응 상태와 연관시키는 그래프를 도시한다.
도 6a 내지 도 6d는 암으로 진단받은 대상체 및 치료를 진행 중인 대상체의 PD-L1 cfRNA 수준에 대한 혈장 농도를 비교하는 그래프를 도시한다.
도 7은 항-PD1/PD-L1 조성물을 이용한 치료를 제시하는, 아피니토르를 이용한 치료의 함수로서 PD-L1 cfRNA 수준을 예시하는 그래프를 도시한다.
도 8은 암 치료 반응 상태를 전반적 cfRNA/베타-액틴 cfRNA와 연관시키는 그래프를 도시한다.
도 9a는 cfRNA 수준에 의해 측정되는 PD-L1 및 HER2의 상대적 공동-발현을 나타내는 그래프를 도시한다.
도 9b는 HER2 cfRNA 수준을 HER2 cfRNA 수준에 대한 임상적으로 관련된 발현 역치를 실증하는 HER2 IHC/FISH에 의해 결정되는 HER2 상태와 연관시키는 그래프를 도시한다.
도 10은 cfRNA 수준에 의해 측정되는 위암에서의 PD-L1 및 HER2의 상대적 공동-발현을 나타내는 그래프를 도시한다.
도 11은 퍼투주맙/트루스투주맙 치료 반응을 HER2 cfRNA 수준과 연관시키는 그래프를 도시한다.
도 12는 선택된 체크포인트 관련 유전자에 대한 cfRNA 특징부를 도시한다.
도 13은 AR-V7 cfRNA가 적합한 마커임을 시사하는 전립샘암 환자에서 AR-V7 cfRNA 수준 및 AR cfRNA 수준에 대한 예시적 결과를 도시한다.
도 14는 PCA3 cfRNA가 적합한 마커임을 시사하는 비-전립샘암 및 전립샘암 환자에서 PCA3 cfRNA 수준에 대한 예시적 결과를 도시한다.

본 발명자들은 cfRNA가 진단, 치료의 모니터링을 위한 민감하고, 선택적이며, 정량적인 마커로 채택될 수 있고, 심지어 환자의 반복 샘플링 및 비-침습적 샘플링을 가능하게 하는 탐색 도구로 채택될 수 있다는 것을 발견하였다. 가장 바람직한 양태에서, cfRNA는 세포 온전성을 보존하고 cfRNA 및/또는 ctDNA를 안정화하는 조건 하에 가공되는 전혈로부터 단리된다. 특히, cfRNA 대 이러한 세포 보존 조건 하에 전혈 가공 동안 손상된 비-종양 세포로부터 방출되는 RNA의 비는 임상적으로 의미있는 결과를 제공할 수 있는 정량적 분석을 수행하기에 충분히 높다. 일단 비-핵산 성분으로부터 분리된 후, 이어서 순환 핵산은 바람직하게는 실시간 정량적 PCR을 사용하여 정량된다. 따라서, 본 발명자들은 또한 혈중 cfRNA의 단리, 모니터링 및 정량을 위한 키트, 시약 및 지침, 그리고 특히 아래에서 보다 상세히 추가 논의되는, 특정 유전자에 대한 cfRNA의 존재를 정량적으로 결정하기에 적합한 프라이머에 대한 올리고뉴클레오티드를 고려한다.

당연히 그리고 아래에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 하나 이상의 요망되는 핵산이 특정한 질병, 질병 단계, 특정 돌연변이에 대해 선택될 수 있거나, 심지어 개인 돌연변이 프로필 또는 발현된 네오에피토프의 존재에 기반하여 선택될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 대안적으로, 특정한 유전자의 새로운 돌연변이 또는 발현 변화에 대한 탐색 또는 스캐닝이 요망되는 경우, 실시간 정량적 PCR이 환자 cfRNA 트랜스크립톰의 적어도 일부를 커버하도록 RNAseq에 의해 대체되거나 보충될 수 있다. 또한, 분석은 종양 또는 전이를 생검할 필요 없이 동적 사진을 수득하기 위한 반복 샘플링과 함께 경시적으로 또는 정적으로 수행될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

상이한 관점에서, 일반적으로 본 발명자들은 발현을 확인하고 정량하며 지금까지 생검 조직의 단백질-기반 분석에 의해서만 가능했던 질병의 표시인자 및/또는 유도인자 변화의 비-침습적 모니터링을 가능하게 하는 순환 종양 RNA(cfRNA)의 혈액-기반 RNA 발현 시험을 위한 다양한 방법 및 조성물을 발견하였다. 예를 들어, 고려된 시스템 및 방법은 질병의 표시인자 및/또는 유도인자의 변화 모니터링, 및/또는 항암화학치료법에 대한 내성 출현과 연관될 수 있는 약물 표적의 변화 확인을 가능하게 한다. 유리하게는, 고려된 시스템 및 방법은 오믹스 플랫폼에 의해 확인된 변경이 본원에 제시된 시스템 및 방법에 의해 비-침습적으로, 분자적으로 모니터링되는 강력한 일차 분석/모니터링 조합 도구를 확립하기 위해 다른 오믹스 분석 플랫폼, 및 특히 GPS Cancer(전체 게놈 또는 엑솜 시퀀싱, RNA 서열 및 발현 분석 그리고 정량적 단백질 분석을 제공함)와 통합된다.

일부 구현예에서, 본 발명자들은 유전자와 암의 알려진 연관성 및/또는 환자에서의 암 조직의 이전 오믹스 분석 중 적어도 하나에 기반하여 암 관련 유전자를 선택하는 단계가 포함되는, 환자에서 (예컨대, 고형)암의 상태를 결정하는 방법을 고려한다. 또 다른 단계에서, 암 관련 유전자의 cfRNA는 환자의 체액(예컨대, 전혈, 혈청, 또는 혈장)에서 정량되며, 추가 단계에서 cfRNA의 양은 암 상태와 연관된다. 대안적으로 또는 암 관련 유전자에 부가하여, 다른 cfRNA가 또한 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 암 상태는 약물을 이용한 치료에 대한 암의 감수성, 또는 환자에서의 암의 존재 또는 부재일 수 있다. 가장 전형적으로, 암 관련 유전자는 암 연관 유전자, 암 특이적 유전자, 또는 환자 및 종양 특이적 네오에피토프를 인코딩하는 유전자(GPS 암 오믹스 분석을 사용하여 결정될 수 있음)이다. 추가로 고려되는 양태에서, 아래에서 더 상세히 기재되는 바와 같이, 정량하는 단계에 RNA 안정화 및 세포 보존 하의 cfRNA의 단리가 포함될 것이고/것이거나 정량하는 단계에 cfRNA로부터 제조되는 cDNA의 실시간 정량적 PCR이 포함된다.

다른 구현예에서, 본 발명자들은 또한 환자로부터 체액을 수득하고 적어도 하나의 체크포인트 억제 관련 유전자에 대해 체액 중의 cfRNA를 정량하는 단계가 포함될 수 있는, 체크포인트 억제제를 이용한 치료를 위해 환자를 선택하는 방법을 고려한다. 다른 적합한 cfRNA 중에서, 특히 고려되는 cfRNA에는 PD-L1 및 HER2를 인코딩하는 것들이 포함된다. 당연히, cfRNA가 전체 유전자를 인코딩할 필요는 없지만, 연구되는 유전자의 단편일 수 있다는 것이 인식되어야 한다. 이어서 cfRNA의 양은 그 양을 가능한 치료 결과와 연관시키는 역치 값에 대해 비교된다. 결과적으로 그리고 다른 옵션 중에서, 치료 결과는 하나 이상의 체크포인트 억제제(예컨대, PD-1, PD-L1, TIM3, 및/또는 LAG3에 대한 항체 또는 항체 단편)를 이용한 치료 및/또는 다양한 수용체(예컨대, EGFR, ERCC1, IGF1, HER2 등)를 표적화하는 항체를 이용한 치료에 관련될 수 있다.

따라서, 본 발명자들은 또한 환자의 혈액 샘플 중에서 제1 및 제2 마커의 cfRNA 양을 결정하는 단계가 포함되는, 암을 치료하는 다양한 방법을 고려하며, 여기서 제1 마커는 체크포인트 억제 관련 유전자이고, 제2 마커는 암 연관 유전자, 암 특이적 유전자, 또는 환자 및 종양 특이적 네오에피토프를 인코딩하는 유전자 중 하나이다. 이러한 방법에서 제1 및 제2 마커의 양이 (예컨대, 양으로) 연관된다는 것이 추가로 고려된다. 이어서 제2 마커의 양이 체크포인트 억제제를 이용한 치료를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 제1 마커는 PD-1 또는 PD-L1(또는 다른 체크포인트 억제 관련 마커)이며 제2 마커는 HER2이다. 마찬가지로, 제1 마커는 PD-1 또는 PD-L1(또는 다른 체크포인트 억제 관련 마커)이며, 제2 마커는 네오에피토프를 인코딩하는 cfRNA이다.

다른 구현예에서, 본 발명자들은 또한 환자의 혈액 샘플에서 복수의 마커의 cfRNA 양을 결정하는 단계가 포함되는, 환자에서 면역 특징부를 결정하는 방법을 고려하며, 여기서 복수의 마커는 체크포인트 억제 관련 유전자를 포함한다. 가장 전형적으로, 결정하는 단계는 체크포인트 억제제, 항암화학치료 약물, 면역 치료 약물 및 방사선 치료 중 적어도 하나를 이용한 치료 전에 또는 치료 동안 수행된다. 또한, 고려되는 방법은 적어도 하나의 공동자극 마커의 cfRNA 양을 결정하는 단계, 및/또는 결정된 양에 기반하여 치료 계획을 생성하거나 업데이트하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

일반적으로, cfRNA 분석이 cfRNA를 함유하는 임의의 체액을 사용하여 수행된다는 것이 고려된다. 따라서, 적합한 체액에는 전혈, 혈장, 혈청, 림프액 타액, 복수, 척수액, 소변 등이 포함되며, 이들 각각은 신선하거나 보존/냉동될 수 있다. 그러나, cfRNA 분석이 생물학적 샘플로 전혈을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 전혈은 별다른 환자 불편 없이 쉽게 수득되며 단순하고 효과적인 방식으로 가공될 수 있다. 아래에서 더 상세히 추가로 기재되는 바와 같이, 본 발명자들은 전혈로부터 세포 제거를 위해 사용되는 프로토콜이 RNA의 안정성 및 수율에 상당한 영향을 준다는 것을 발견하였다. 특히, 본 발명자들은 세포가 세포의 온전성을 유지하는 조건 하에 전혈로부터 제거되는 경우 정량적 cfRNA 분석이 유의미하게 개선됨을 발견하였다. 임의의 이론 또는 가설에 구애받고자 하지 않고, 본 발명자들은 혈중 비-종양 세포의 세포 용해가 비-cfRNA의 방출에서 실질적인 기여 인자임을 고려한다. 또한, 소정의 RNA 안정화제는 또한 백혈구 및 적혈구에 유해한 효과를 미칠 수 있고, 이와 같이 비-cfRNA의 혈장 내로의 방출에 기여한다.

예를 들어, 본원에 제시된 분석을 위해, 각각 RNA 또는 DNA 안정화제를 함유하는 세포-비함유 RNA BCT® 튜브 또는 세포-비함유 DNA BCT® 튜브(둘 모두 Streck Inc.,7002 S. 109^th St., La Vista NE 68128에서 상업적으로 이용 가능함) 내로 채혈된 전혈 10 mL의 시료를 얻었다. 유리하게는, cfRNA는 7일 동안 세포-비함유 RNA BCT 튜브 내의 전혈 중에서 안정한 반면 ctDNA는 14일 동안 세포-비함유 DNA BCT 튜브 내의 전혈 중에서 안정하여, cfRNA 또는 ctDNA의 분해 없이 다양한 위치로부터 환자 샘플을 수송하기 위한 시간을 허용한다. 그러나, RNA 안정화 제제가 실질적인 세포 용해(예컨대, 3% 이하, 1% 이하, 또는 0.1% 이하, 또는 0.01% 이하, 또는 0.001% 이하의 백혈구 및/또는 적혈구를 용해)를 야기하지 않는 한 여러 대안적인 수집 튜브 및 조성물이 또한 적합한 것으로 간주된다는 것이 주지되어야 한다. 상이한 관점에서, 적합한 RNA 안정화 시약은 시약이 혈액과 조합된 후 혈청 또는 혈장 중 RNA 양의 실질적 증가(예컨대, 10% 이하, 또는 5% 이하, 또는 2% 이하, 또는 1% 이하의 전체 RNA 증가)를 야기하지 않을 것이다. 당연히, 여러 다른 또는 추가 수집 방식이 또한 적절한 것으로 간주되며 cfRNA 및/또는 ctDNA가 적어도 부분적으로 정제되거나 일시적으로 고체상에 흡착되어 추가 가공 전에 안정성을 증가시킬 수 있다는 것이 인식되어야 한다.

혈장의 분획화 및 ctDNA와 cfRNA의 추출은 여러 방식으로 수행될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 예시적인 바람직한 일 양태에서, 10 mL 튜브 내의 전혈이 혈장을 분획화하기 위해 20분 동안 1600 rcf에서 원심분리된다. 적절한 원심분리 속도는 알려진 환산에 따라 다양한 회전자에 대해 계산될 수 있다(예컨대, RCF=1.1118 × 10^-5× rpm², 식 중 r은 회전자 반지름(단위: cm)임). 이어서 이렇게 수득된 혈장은 세포 파편을 제거하기 위해 10분 동안 16,000 rcf에서 추가 원심분리된다. 당연히, 원심분리가 실질적인 세포 용해를 야기하지 않는 한/혈액 세포의 온전성을 유지하는 한(예컨대, 모든 세포의 3% 이하, 또는 1% 이하, 또는 0.1% 이하, 또는 0.01% 이하, 또는 0.001% 이하의 용해), 다양한 대안적 원심분리 프로토콜이 또한 적합한 것으로 간주된다. 이어서 cfDNA 및 cfRNA가 Qiagen 또는 다른 상업적으로 이용 가능한 시약을 사용하여 요망되는 부피(예컨대, 2 mL)의 혈장으로부터 추출될 수 있다. 이어서 모든 단리된 ctDNA 및/또는 cfRNA는 바람직하게는 바-코드화된 매트릭스 저장 튜브에서 유지된다(예컨대, DNA는 -4℃에서 저장되고, RNA는 -80℃에서 저장되거나, cDNA로 역전사된 후 -4℃에서 저장됨).

cfRNA의 정량은 여러 방식으로 수행될 수 있고, 고려되는 방법에는 디지털 PCR 방법에 의한 정량, 외부 표준을 사용하는 절대 정량 방법 및 가장 전형적으로 내부 표준을 사용하는 상대 정량 방법(예컨대, 2^ΔΔCt로 표현됨)이 포함된다. 예를 들어, 실시간 qPCR 증폭은 2 ㎕ cDNA, 프라이머 및 프로브를 함유하는 10 ㎕ 반응 혼합물 중에서 검정을 사용하여 수행될 수 있다. β-액틴은 ct-cDNA의 투입 수준에 대한 내부 표준으로 사용될 수 있다. 알려진 농도의 분석물질 각각을 이용한 샘플의 표준 곡선뿐만 아니라 각각의 유전자에 대한 양성 및 음성 대조군이 각각의 PCR 플레이트에 포함될 수 있다. 이어서 시험 샘플은 핵산을 함유하는 매트릭스 튜브 상의 2D 바코드를 스캐닝하여 확인된다. 각 개별 환자의 혈액 샘플에 대해 β-액틴의 Ct 값이 감산된 각각의 분석물질에 대한 정량적 PCR(qPCR) 증폭으로부터 유도된 Ct 값으로부터 델타 Ct(dCT)를 계산하였다. 환자 시료의 상대 발현은 유전자 발현 값 10으로 설정된 유니버설 인간 참조(Universal Human Reference) RNA의 연속 희석액의 델타 Ct의 표준 곡선을 사용하여 계산된다(델타 CT가 각 분석물질의 log 농도에 대해 도식화된 경우). ctDNA는 유사한 방식으로 분석될 수 있다.

ctDNA에 관해, 진단 시험에서의 ctDNA의 정확도는 암에 대한 진단 도구로서의 그 채택 이래 의문시되어 왔다는 것이 주지되어야 한다. 질병 진행의 모니터링에서 ctDNA에 의존하지만 특히 질병 존재의 예측에서 ctDNA의 사용을 고려하는 경우, 비정상적으로 높은 위양성율을 갖는 문제가 해결되어야 한다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 건강한 개인은 암 환자와 유사한 양의 전체 ctDNA를 생성하지만, 전체 cfRNA 수준(예컨대, 베타 액틴을 사용하는 정량에 의해 결정됨)은 건강한 개인에서 상당히 낮다. 또한, cfRNA 단리 프로토콜이 실질적인 세포 용해를 야기하지 않는 조건 하에 수행된 경우, 전체 cfRNA 수준은 암 환자와 건강한 개인 간에서 유의미하게 상이하였다. 실제로, 건강한 개인 그룹 간 중복이 존재하지 않았으므로, 암 환자가 이의 전체 cfRNA 수준에 의해 구별될 수 있도록 하였다. 반대로, 암 환자와 건강한 개인에서의 ctDNA의 수준 간에는 중복이 존재하였다. 따라서 이들 2개 군 간에서 ctDNA는 구별할 수 없었다. 추가로 고려되는 방법에서, 전체 cfRNA가 단리되는 경우, 적절한 DN아제(DNAse)를 사용하여(예컨대, DNA의 컬럼-상 소화를 사용하여) cfRNA가 제거되고/되거나 분해될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 마찬가지로, ctDNA가 단리되는 경우, 적절한 RN아제(RNAse)를 사용하여 cfRNA가 제거되고/되거나 분해될 수 있다. 또한, 단리 프로토콜이 아래에서 더 상세히 나타내는 바와 같이 실질적인 세포 용해를 야기하지 않는 조건 하에 수행된 경우, cfRNA(본원에서 PD-L1)에 대한 선형 검출 범위는 유의미하였다.

용어 cfRNA에는 전장 RNA뿐만 아니라 전장 RNA의 단편(50개 내지 150개 염기, 15개 내지 500개 염기, 또는 500개 내지 1,000개 염기 이상의 길이를 가질 수 있음)이 포함된다는 것이 주지되어야 한다. 따라서, cfRNA는 RNA의 일부를 나타낼 수 있고, 이는 전장 RNA(전형적으로 mRNA)의 100% 내지 80%, 또는 80% 내지 60%, 또는 60% 내지 40%, 또는 40% 내지 20% 또는 심지어 그 미만일 수 있다. 또한, 용어 cfRNA는 전형적으로 종양-유래 RNA(비-종양 세포로부터의 RNA와 대치됨)를 나타내고 이에 따라 cfRNA는 고형 종양의 종양 세포, 혈액 유래 암, 순환 종양 세포 및 엑소좀에서 유래될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 그러나 가장 전형적으로, cfRNA는 막에 의해 봉입되지 않을 것이다(그리고 이와 같이 순환 종양 세포 또는 엑소좀에서 유래될 것이다). 또한, cfRNA는 종양에서 독특하게(예컨대, 약물 내성의 함수로 또는 치료 요법에 대해 반응하여, 스플라이스 변이체 등으로) 발현될 수 있거나, 유전자의 돌연변이된 형태로(예컨대, 융합 전사체로, 단일-염기 또는 다중-염기 돌연변이를 갖는 유전자의 전사체 등으로) 발현될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 상이한 관점에서, 고려되는 cfRNA에는 특히 대응하는 비-종양 세포 대비 종양 세포에서 독특하거나, 대응하는 비-종양 세포 대비 종양 세포에서 유의미하게 과발현되는(예컨대, 적어도 3배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 10배), 또는 대응하는 비-종양 세포 대비 돌연변이(예컨대, 네오에피토프를 야기하는 미스센스 또는 논센스 돌연변이)를 갖는 전사체가 포함된다.

따라서, 적합한 표적 핵산에 대해, 적절한 표적에는 특히 질병 및/또는 질병의 치료에 관련되는 유전자가 포함된다는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, 질병 표적에는 하나 이상의 암 연관 유전자, 암 특이적 유전자, 환자 및 종양-특이적 돌연변이를 갖는 유전자(그리고 특히 네오에피토프의 형성을 야기하는 것들), 암 유도인자 유전자 및 암에서 과발현되는 것으로 알려져 있는 유전자가 포함된다. 결과적으로, 적합한 표적에는 '기능적' 단백질(예컨대, 효소, 수용체, 전사 인자 등)을 인코딩하는 것들 및 '비-기능적' 단백질(예컨대, 구조 단백질, 튜불린 등)을 인코딩하는 것들이 포함된다. 상이한 관점에서, 적합한 표적에는 또한 이환 세포 또는 기관에 특이적인 표적(예컨대, 전립샘에 있어서 PCA3, PSA 등), 또는 상이한 암에서 보다 일반적으로 확인되는 표적, 예컨대 KRAS에서의 다양한 돌연변이(예컨대, G12V, G12D, G12C 등) 또는 BRAF에서의 다양한 돌연변이(예컨대, V600E) 등이 포함될 수 있다. 본 발명자들에 의해 검증된 예시적인 표적에는 AKT1, BRAF, CDK6, CYP3A4, ERBB3, FGFR1, JAK1, MAP2K1, AR-V7, ALK, BRCA1, CDKN2A, DDR2, ERBB4, FGFR2, JAK2, MET, AR, ARAF, BRCA2, CTNNB1, OPYD, FGF19, FGFR3, KOR, MTOR, PD-U, ATM, CCND1, CYP2C19, EGFR, FGF3, FLT3, KIT, NRAS, PD-1, BIM, CDK4, CYP2D6, HER2, FGF4, HRAS, KRAS, NRG1, TIM3, NTRK1, PTCH1, SMO, NTRK2, PTEN, STK11, NTRK3, RAF1, LAG3, TP53, PDGFRA, RET, TSC1, PIK3CA, RO-S1, TSC2 및 UGT1A1이 포함된다.

결과적으로, 적합한 치료 표적에는 특정 분자 대상체를 표적화 하는 특정 약물을 이용한 치료에 대한 이환 세포의 감수성을 시사하는 하나 이상의 마커가 포함된다는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어 본원에 제시된 시스템 및 방법은 키나제 억제제에 의해 표적화되는 특정 키나제의 존재 및 발현 수준, 또는 합성 리간드에 의해 표적화되는 특정 신호전달 수용체의 존재 및 발현 수준, 또는 합성 길항제 또는 항체에 의해 표적화되는 특정 체크포인트 수용체의 존재 및 발현 수준 등을 확인하는 데 유용할 수 있으며, 적합한 표적은 또한 아래의 표 1에 나타낸 표시에 의해 그룹화될 수 있다.

알려진 마커, 예컨대 종양 연관 항원 및 종양 특이적 항원에 부가하여, 환자 종양의 선행 오믹스 분석이 하나 이상의 네오에피토프의 존재를 드러낼 수 있다는 것이 또한 이해되어야 한다. 예를 들어, 선행 분석은 바람직하게는 US 9721062에 기재된 바와 같은 증분 동기화 정렬을 사용하고/하거나 RNAseq를 사용하여 전체 게놈 또는 엑솜의 종양 대 매칭된 정상 간 비교에 의해 수행될 수 있다. 또한, 프로테오믹스 분석은 가장 바람직하게는 정량적 질량 분광측정 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 따라서, cfRNA가 이러한 환자 및 종양 특이적 돌연변이(예컨대, 네오에피토프)를 함유하는 경우 환자 및 종양 특이적 방식으로 종양 RNA를 검출하기 위해 cfRNA가 사용될 수도 있다는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, 이러한 검출은 특히 치료가 환자 및 종양 특이적 돌연변이(예컨대, 네오에피토프)를 표적화하는 면역 치료법인 경우, 치료 효과의 모니터링에서 유용할 수 있다. 또 다른 예에서, 환자 및 종양 특이적 돌연변이의 검출은 또한 면역 또는 항암화학치료법으로 치료받을 수 있는 (새로 발생한) 치료 표적을 드러낼 수 있다.

따라서, 고려되는 조성물 및 방법은 질병 연관 마커의 탐색에서, 그리고 보다 전형적으로 치료를 위한 기계론적 표적의 존재에 관한 정보를 수득하기 위해 및/또는 치료를 추적하거나 반응 발달을 예측하기 위해 암 세포 집단에 대한 정량적 프록시 기준선을 수득하기 위해 적합한 표적의 정량에서 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, 고려되는 조성물 및 방법은 표적이 발현으로서의 네오에피토프인 경우 면역치료법에 특히 적합하며 네오에피토프의 양은 치료 표적으로서의 네오에피토프를 검증하고 치료 진행에 대한 프록시 마커로서의 네오에피토프의 발현 및 양을 사용하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, cfRNA는 치료 전에, 치료 동안 및 치료 후에 발현된 네오에피토프의 존재를 확인하기 위해 사용될 수 있고, 이와 같이 개인 기준으로 치료 유효성을 예측하고/하거나 정량하도록 할 수 있다는 것이 주지되어야 한다.

대안적으로 그리고 다른 바람직한 용도 중에서, cfRNA는 체크포인트 억제제(예컨대, PD-1 및 PD-L1을 표적화함)를 이용한 치료에 적합한 환자를 확인하기 위해 정량될 수 있다. 이는 PD-1 및 PD-L1의 수준을 확인하기 위한 편리하고 비-침습적인 방식이 현재 존재하지 않으므로 특히 유용하며, 이는 환자가 체크포인트 억제제(예컨대, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙 등)를 이용한 치료로부터 이익을 얻을 것인지에 관한 정보를 의사에게 제공할 것이다. 실제로, 면역 체크포인트, 예컨대 프로그래밍된 사멸 리간드 1(PD-L1) 또는 그 수용체, 프로그래밍된 사멸 1(PD-1)은 여러 종양 유형에 대한 아킬레스 건인 것으로 나타난다. PD-L1은 종양 세포에 대한 면역 탈출을 제공할 뿐만 아니라 활성화된 T 세포 상에서 아폽토시스 스위치를 켠다. 상기 상호작용을 차단하는 치료법은 몇몇 종양 유형에서 유망한 임상 활성을 실증하였다. 종양 PD-L1 발현 상태는 흑색종(MEL), 신장 세포 암종(RCC) 및 비-소-세포 폐암(NSCLC)을 포함하는 여러 종양 유형에서 예후적인 것으로 나타났다. 또한, 종양 PD-L1 발현은 항-PD-1 항체에 대한 반응과 밀접하게 연관되는 것으로 나타난다. 그러나, PD-L1 발현을 정량하기 위한 표준으로 승인된 일률적인 시험은 없다. 또한, 소수의 항-PD-L1 항체가 임상 시험 단계에 있고 2개는 이미 NSCLC의 치료를 위해 FDA에 의해 허가받았다. 따라서 환자에게 항-PD-L1 면역치료법을 제공하기 전에 PD-L1 발현을 측정하는 것이 중요하다. 이제 본 발명자들은 PD-L1 발현 및 다른 면역 치료법 관련 암 마커가 아래에서 더 상세히 나타내는 바와 같은 다양한 암 유형으로부터 단리된 cfRNA에서의 PD-L1(및 다른 마커) 발현의 빈도 및 수준을 분석함으로써 cfRNA를 사용하여 정량될 수 있다는 것을 발견하였다.

실시예

전혈로부터 crRNA의 단리: 정맥천자에 의해 전혈을 수득하고 각각 RNA 또는 DNA 안정화제를 함유하는 세포-비함유 RNA BCT® 튜브 또는 세포-비함유 DNA BCT® 튜브(Streck Inc.,7002 S. 109^th St., La Vista NE 68128) 내로 10 ml를 수집하였다. 이어서 샘플 튜브를 20분 동안 1,600 rcf에서 원심분리하고, 혈장을 빼내고, 10분 동안 16,000 rcf에서 추가 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다. cfRNA를 단리하기 위해 혈장이 사용되었고, 약간의 변형을 포함해서 제조업체의 프로토콜에 따라 상업적으로 이용 가능한 RNA 단리 키트를 사용하였다. 구체적으로, 칼럼-상 DN아제 소화로 샘플로부터 DNA를 제거하였다.

대안적 접근에서는, 요망되는 경우 DNA 제거를 수용하기 위해 약간 변형된 QiaSymphony 기기(Qiagen, 19300 Germantown Road; Germantown, MD 20874) 상의 로보틱 추출 방법을 사용하여 자동화된 방식으로 cfRNA를 또한 수득하였다. 로보틱 추출은 cfRNA 샘플에서 대략 12% DNA 오염을 유지하였다. 본 발명자들은 동일한 21개 NSCLC 샘플에서 ERCC1(절제 복구 교차-상보적 효소(Excision Repair Cross-Complementing enzyme)) 대 베타 액틴의 상대 발현을 측정하여 2개의 추출 절차 간에 유의미한 차이가 존재하는지의 여부를 결정하였다. 특히, 아래의 표에 나타낸 바와 같이 자동화 공정 및 수동 공정에 의해 생성된 상대 발현에서 통계적 차이는 존재하지 않았다. p=0.4111(페어링된 t-시험; 상기 시험에 있어서 통계적 차이는 p<0.05였음).

Qiagen의 맞춤 키트(QiaSymphony 순환 NA 키트 #1074536)에는 하나의 맞춤 키트에 2개의 바이러스 추출 키트가 포함되었다(바이러스 키트는 QiaSymphony DSP 바이러스/병원체 Midi 키트 버전 1 #937055로 불림). 분석은 Qiagen 기기 상의 단일, 전용 프로그램(맞춤 프로그램 프로토콜 CF 2000S_CR21040_ID993; Qiagen) 내에서 수행하였다.

cfRNA의 정량: 달리 주지되지 않는 한, 내부 대조군으로서의 베타-액틴에 대한 프라이머 페어와 함께 유전자 특이적 프라이머 페어 및 rtPCT를 통한 상대 정량을 사용하여 정량을 수행하였다. 예를 들어, 2 ㎕ cDNA, 프라이머 및 프로브를 함유하는 10 ㎕ 반응 혼합물 중에서 검정을 사용하여 증폭을 수행하였다. ct-cDNA의 투입 수준에 대한 내부 표준으로 β-액틴을 사용할 수 있다. 알려진 농도의 분석물질 각각을 함유하는 샘플의 표준 곡선뿐만 아니라 각각의 유전자에 대한 양성 및 음성 대조군을 각각의 PCR 플레이트에 포함시켰다. 핵산을 함유하는 매트릭스 튜브 상에서 2D 바코드를 스캐닝하여 시험 샘플을 확인하였다. 각 개별 환자의 혈액 샘플에 대해 β-액틴의 Ct 값이 감산된 각각의 분석물질에 대한 정량적 PCR(qPCR) 증폭으로부터 유도된 Ct 값으로부터 델타 Ct(dCT)를 계산하였다. 유전자 발현 값 10으로 설정된 유니버설 인간 참조 RNA의 연속 희석액의 델타 Ct의 표준 곡선을 사용하여 환자 시료의 상대 발현을 계산하였다(델타 CT를 각 분석물질의 log 농도에 대해 도식화했을 경우). 유사한 방식으로 ctDNA를 분석하였다.

각각의 유전자 시험에 있어서 델타 Ct 대 log₁₀ 상대 유전자 발현(표준 곡선)을 수백 개의 PCR 반응 플레이트에 걸쳐 포획하였다(이력 반응). 선형 회귀 분석을 각각의 검정에 대해 수행하고 이후 진행되는 원래 표준 곡선의 단일 지점으로부터 유전자 발현을 계산하는 데 사용하였다.

특히, 도 1에 나타낸 바와 같이, 건강한 공여자 및 암 환자, 비-소세포 암(NSCLC), 10명의 암 및 9명의 건강한 개인으로부터 ctDNA를 정량하였다. 두 집단 간 전체 ctDNA로 통계적 유의차를 관찰할 수 없었다. 대조적으로, 두 집단 간 전체 cfRNA 양(β-액틴에 의해 측정되었음)은 유의미하게 상이하였고, 이는 전체 cfRNA의 측정이 암의 존재에 대한 유효한 표시인자일 수 있음을 시사하였다.

이어서 본 발명자들은 상기 결과가 다양한 다른 암 유형 및 선택된 유전자(예컨대, PD-L1)에 걸쳐 확인될 수 있는지의 여부를 연구하였고 유방암, 결장암, 위암, 폐암 및 전립샘암으로 진단받은 선택된 환자로부터의 혈액 샘플을 분석하였다. 일련의 시험에서, PD-L1cfRNA의 상대 발현을 정량하였고 결과를 도 2a에 도시한다. 흥미롭게도, 도 2a에 나타낸 바와 같이 모든 암이 PD-L1을 발현하지는 않았으며, 다양한 암에서 양성도의 빈도는 고형 조직에서 IHC를 사용하는 PD-L1의 공개된 발현과 일치하였다. PD-L1cfRNA는 도 2b에서 알 수 있듯, 건강한 환자에서는 검출 불가능하였다.

검정 검증 - 정확도: 본 발명의 PD-L1 검정("LiquidGeneDx")에 의해 생성된 결과를 디지털 PCR PD-L1 검정(실험실 개발 참조 방법, 대안적 PD-L1 검출 검정)에 대해 61개의 임상 샘플로부터 비교하여 예시적인 PD-L1 발현 검정의 정확도를 결정하였다. 결과를 사용하여 검정의 임상적 민감도 및 임상적 특이성을 결정하였다. 본 발명의 PD-L1 검정 및 디지털 PCR PD-L1 검정에 의한 정확도 결과를 표 2에 요약한다.

검정 검증 - 검출 한계(LOD): 본 발명의 PD-L1 검정("LiquidGeneDx")의 분석 민감도를 20개 반복물에 의해 95% 검출률로 결정하였다. cfRNA를 환자의 혈장으로부터 추출하고, 랜덤 헥사머를 사용하여 cDNA로 역전사하고, 제조업체의 지침에 따라 10 사이클 동안 PD-L1 및 베타-액틴 프라이머를 함유하는 Thermo Fisher의 사전-증폭 제품 Taqman® Preamp 마스터 혼합물을 사용하여 사전-증폭하였다. 생성된 사전-증폭 cDNA를 PD-L1에 대해 음성인 환자의 혈장으로부터의 cDNA로 2배 증분하여 희석하였다. 증폭 및 성공적인 PCR을 위해 요구되는 최소량의 PD-L1 cDNA에 대한 LiquidGeneDx에 의해 모든 희석 샘플을 검사하였다. 이어서 추정 LOD 수준에서 20개 반복물을 사용하여 최종 LOD를 확인하였다. 상기 연구에서 검출 한계(LOD) 허용 기준은 20개 반복물 모두가 95% 초과 검출률을 생성하는 최저 농도로 결정하였다. 20개 반복물이 95% 초과 검출률을 생성할 수 없는 경우, 그 다음으로 높은 희석 샘플의 농도를 추정 LOD로 사용하여 20개 반복물로 반복실험하였다. LOD 연구 결과의 요약을 표 3에 나타내며, 여기서 *는 최종 LOD를 표시한다.

검정 검증 - 검출 한계(LOD): 정밀도 패널에는 저 양성 PD-L1 샘플, 중간 양성 PD-L1 샘플, 고 음성 PD-L1 샘플, 양성 대조군 및 비-주형 대조군이 포함되었다. 모든 양성 샘플은 PD-L1 양성 암 세포주로부터 제조하였다. 각각의 정밀도 패널은 수행 당 4회씩, 3명의 상이한 운영자(Op)에 의해 총 3일 동안(연속 또는 비-연속) 1일 당 2개 기기에 대해 기기 당 2회 수행하였다. 정밀도 패널의 각 샘플은 3일에 걸쳐 총 48개의 데이터 포인트를 생성하였다. 연구 설계를 표 4에 예시한다.

검정-내 정밀도는 2개 기기, 2명의 운영자, 1일 및 샘플 당 4개 반복물을 사용하여 수행하였다. 모든 반복물에 대한 결과 일치도는 96% 이상이다. 표 5는 검정-내 정밀도의 예시적 요약이다.

2개 기기, 2명의 운영자, 3회 수행을 3일에 걸쳐 수행하였고, 검정-내 정밀도에 대해 4회 수행을 시험하였다. 독립 수행 전체에 걸쳐 모든 반복물에 대한 결과 일치도는 96% 이상에 도달하였다. 결과 요약을 표 6에 기재한다.

검정 검증 - 선형 범위: cfRNA로부터 PD-L1-양성 환자의 cDNA를 풀링된 음성 매트릭스(cfRNA로부터의 PD-L1-음성 cDNA) 내로 희석하여 본 발명의 PD-L1 검정("LiquidGeneDx")의 정량적 선형 범위를 결정하였다. ct RNA를 환자의 혈장으로부터 추출하고, 랜덤 헥사머를 사용하여 cDNA로 역전사하고, 제조업체의 지침에 따라 10사이클 동안 PD-L1 및 베타-액틴 프라이머를 함유하는 Thermo Fisher의 사전-증폭 제품 Taqman® Preamp 마스터 혼합물을 사용하여 사전-증폭하였다. 생성된 사전-증폭 cDNA를 PD-L1에 대해 음성인 환자의 혈장으로부터의 cDNA로 2배 증분하여 희석하였다. 모든 희석 샘플을 LiquidGeneDx PD-L1에 의해 검사하여 그 정량적 선형 범위를 결정하였다. 도 2c는 최종 선형 범위를 나타낸다. 선의 선형 부분은 대략 32.5의 Ct까지 연장된다. 베타-액틴 및 PD-L1 경사도도 일치한다.

검정 검증 - 특이성: TE 완충액 매트릭스에서 인간 PD-L1 세포주 cDNA의 연속 희석에 의해 시험 샘플을 제조하였다. 중간 양성 샘플에 대한 표적 분석물질의 농도는 LOD 농도의 4배였다. 각각의 간섭물질을 함유하는 중간-양성 샘플(각각의 간섭물질을 함유하는 하나의 분석물질)뿐만 아니라 기준선 샘플을 본 발명의 PD-L1 검정("LiquidGeneDx")에 의해 3개씩 검사하였다. 표 7은 간섭물질 목록 및 이의 시험 농도이다. 시험 농도의 상이한 간섭물질을 함유하는 모든 샘플은 여전히 LiquidGeneDx PD-L1 검정에 의해 양성으로 결정되었다.

특히, 시험 농도의 상이한 간섭물질을 함유하는 모든 샘플은 LiquidGeneDx PD-L1 검정에 의해 여전히 양성으로 결정되었다.

본 발명의 PD-L1 검정("LiquidGeneDx")은 암 환자의 혈액에서 PD-L1 유전자 및 다른 유전자의 발현을 검출하기 위한 실시간 PCR 검정으로 설계되었다. 무엇보다도, 이러한 측정은 약물 치료법 이전 및 약물 치료법 동안 특정 약물(예컨대, 항-PD-1 항체)을 이용한, 성공할 것으로 예상되는 치료에 관한 정보를 의사에게 제공할 수 있다는 이점이 있다.

cfRNA가 정확히 정량될 수 있다는 상기 발견에 기반하여, 본 발명자들은 정량된 cfRNA 수준이 통상적 방법, 예컨대 FISH, 질량 분광측정 등에 의해 측정되는 알려진 분석물질 수준과 연관될 것인지의 여부를 결정하고자 하였다. 보다 구체적으로, PD-L1 발현의 빈도 및 강도를 LiquidGenomicsDx를 사용하여 320명의 연속 NSCLC 환자의 혈장으로부터 cfRNA에 의해 측정하고, 조직 IHC 시험을 사용하여, 펨브롤리주맙의 등록 시험(Keytruda)인 키노트 시험(Keynote trial)에서 양성 환자의 빈도와 비교하였다. 특히, 도 3a 및 도 3b에서 알 수 있듯, 키노트 시험에서 NSCLC 환자의 66%(1,475/2,222)가 IHC에 의한 PD-L1의 임의의 발현(1% 초과의 양성 세포)을 가진 반면, PD-L1의 혈액-기반 cfRNA 시험을 받은 NSCLC 환자 중 64%(204/320)가 양성이었다. 특히, 2개의 분석 방법 간 PD-L1 상태에 유의차가 존재하지 않았으나, cfRNA 시험은 정량적 데이터를 산출하였다.

특히, 도 4에서 알 수 있듯, 2명의 선택된 환자(Pt#1 및 Pt#2)의 PD-L1 상태(즉, PD-L1 양성 또는 PD-L1 음성)의 차이도 IHC 분석 및 니볼루맙을 이용한 치료 반응과 잘 연관되었다. 여기서, 2명의 편평 상피 세포 폐암 환자를 항-PD-1 항체 니볼루맙으로 치료하였다. 환자 1은 cfRNA 측정을 사용하여 조직에서 또는 혈액에서 PD-L1 발현을 갖지 않았다. 환자 1은 니볼루맙에 반응하지 않았다. 종양 성장이 CT 스캔에 의해 보고되었고, 환자는 빠르게 숨을 거뒀다. 대조적으로, 환자 2는 cfRNA 측정을 사용하여 기준선에서, 조직 및 혈액에서의 높은 수준의 PD-L1을 가졌다. 환자 2는 약물의 여러 사이클에 걸쳐 지속 반응을 가지며 니볼루맙에 반응하였다. 극적인 종양 수축을 가졌고 CT 스캔에 의해 반응이 보고되었다. 흥미롭게도, 상기 환자의 혈액에서 높은 수준의 유전자 발현(cfRNA에 의해 측정됨)은 3.5주 후 사라졌지만, 환자는 계속 반응하였다.

상기 관찰된 연관성에 기반하여, 본 발명자들은 PD-L1 cfRNA의 발현 수준이 니볼루맙 또는 PD1/PD-L1 신호전달을 간섭하는 다른 치료제를 이용한 치료에 대해 반응 예측을 하는 데 적합한 역치 수준을 제공할 수 있는지의 여부를 연구하기로 했다. 상기 목적을 위해, PD-L1 발현을 cfRNA를 사용하여 NSCLC 환자 혈장에서 측정하고 IHC 상태와 비교하였다. 도 5a는 항-PD-L1 치료제에 의한 치료 반응 상태와, IHC 및 cfRNA에 의한 반응 역치 초과인 PD-L1 발현에 의해 결정되는 PD-L1 상태 간의 연관성을 나타낸다. 치료 반응자인 것으로 결정된 환자는 또한 IHC에 의해 PD-L1 양성으로 결정되었으나, 치료에 대한 비-반응자인 것으로 결정된 모든 환자는 IHC에 의해 PD-L1 음성으로 결정되었다. 특히, 반응 역치가 데이터에 적용되는 경우 PD-L1 cfRNA 수준을 사용하여 반응자 및 비-반응자 간 동일한 분리가 달성될 수 있었다. 상기 예에서, 상대 발현 역치 10이 반응자를 비-반응자로부터 정확히 분리하였다. 도 5b는 β-액틴 대비 PD-L1에 대해 10 초과인 ΔΔCT의 cfRNA 반응 역치가 PD1/PD-L1 체크포인트 억제제(여기서, 니볼루맙)에 대한 양성 반응을 예측한다는 것을 나타낸다. 니볼루맙에 대한 모든 반응자는 치료 전에 역치 수준 초과로 PD-L1을 발현하였다.

본 발명자들은 PD-L1 cfRNA 발현 수준이 진행성 질병(PD), 안정한 질병(SD), 및/또는 부분 반응(PR)에 대한 표시인자로서 다른 암 치료에서 사용될 수 있는지 추가 연구하였다. 상기 목적을 위해, 도 6a 내지 도 6d에서 예시적으로 나타낸 바와 같이 다양한 치료 요법 하에서 치료법의 경과 동안 cfRNA에 의해 측정되는 PD-L1의 동적 변화를 확인하였다. 패널 A는 진행성 질병을 갖는 환자에서 아브락산을 이용한 유방암 치료 경과에 걸친 PD-L1에 대한 상대 발현 수준을 나타낸다. 치료에 대한 반응 부재는 PD-L1 cfRNA의 상승으로 반영되며, CDX-011(글렘바투무맙 베도틴)의 치료를 선호하여 아브락산 치료를 중단하였다. 도 6a에서 알 수 있듯, CDX-011을 이용한 치료는 질병 안정화를 야기하며, 이는 또한 PD-L1 cfRNA의 감소로 반영된다. 마찬가지로, 도 6b에서 알 수 있듯, 폐암 환자를 안정한 질병에서 카보플라틴/알림타 조합 치료법으로 치료하였고, 초기 고수준의 PD-L1 cfRNA는 환자가 부분 반응을 나타냄에 따라 극적으로 감소하였다. 결장암의 경우, 진행성 질병을 갖는 환자를 카페시타빈 및 베바시주맙으로 치료하였다. 치료 동안, 상대 PD-L1 cfRNA 발현이 유의미하게 증가하였다. 5-FU 및 베바시주맙을 이용한 암 치료 시, 도 6c에서 알 수 있듯, 환자는 PD-L1 cfRNA 수준의 동시적인 유의미한 강하와 함께 부분 반응을 가졌다. 따라서, 본 발명자들은 PD-L1 cfRNA의 정량적 수준이 또한 치료 반응을 모니터링하기 위해 정확히 작용할 수 있음을 고려한다.

또 다른 예에서, 본 발명자들은 도 6d에 나타낸 바와 같이, 엑세메스탄/아피니토르를 이용한 치료 시 안정한 질병 유방암을 갖는 환자에서 PD-L1 cfRNA의 급격한 증가를 관찰하였다. 특히, 환자는 치료 전에 측정 가능한 양의 PD-L1 cfRNA를 갖지 않았다. 상기 관찰에 기반하여, 본 발명자들은 아피니토르 치료를 거친 추가 유방암 환자 샘플을 시험하였고 예시적 결과를 도 7에 도시한다. 상대 PD-L1 cfRNA는 PD1/PD-L1 체크포인트 억제제를 이용한 치료에 적합한 수준까지 치료 후 두 번째 채혈 시에 유의미하게 증가하였다는 것이 매우 명백하다. 따라서, 본 발명자들은 또한 암 치료(특히 PD1/PD-L1 체크포인트 억제제 이외의 약물을 사용하는 치료) 후에 적어도 PD-L1 cfRNA를 모니터링하여 PD-L1 cfRNA 발현의 출현을 확인할 수 있고, 이는 PD1/PD-L1 체크포인트 억제제를 이용한 치료의 표시인자로서 작용할 수 있다는 것을 고려한다. 상이한 관점에서, 암 치료 동안 이전에는 검출 불가능한 PD-L1 cfRNA 발현의 검출 및 정량이 PD1/PD-L1 체크포인트 억제제로 환자를 (추가적으로) 치료하기 위한 표시인자로서 사용될 수 있다.

흥미롭게도, 도 8에서 알 수 있듯, 암의 질병 상태 또한 적어도 어느 정도는 β-액틴 cfRNA와 병렬진행되었다. 6주 내지 8주마다 다양한 치료법 하의 환자로부터 채혈하고, 동시에 CT 스캔을 수행하였다. 전이성 유방암을 갖는 45명의 환자 및 처음 2 사이클의 치료법을 완료한 30명의 환자의 혈장으로부터 cfRNA를 추출하였다: PR을 갖는 6/6명의 환자는 β-액틴 cfRNA 수준의 변화를 나타내지 않거나(NC) 감소(DEC)를 나타내었고, SD를 갖는 13/16명의 환자는 cfRNA 수준에서 NC 또는 DEC를 나타내었고, PD를 갖는 6/8명의 환자는 cfRNA 수준의 증가(INC)를 겪었다. cfRNA를 랜덤 헥사머를 사용하여 cDNA로 역전사하였다. cfRNA 수준을 RT-qPCR에 의해 정량하고 CT 스캔에 의해 결정되는 환자 반응(PR/SD/PD)과 연관시켰다. cfRNA(PD-L1 및 HER2 포함)의 유전자 발현 수준을 채혈 전체에 걸쳐 환자에서 모니터링하였다. 특히, 진행성 질병을 갖는 유방암 환자의 β-액틴 cfRNA 수준은 안정한 질병 및/또는 부분 반응을 갖는 환자의 β-액틴 cfRNA 수준보다 높았다. 따라서, β-액틴 cfRNA 수준의 증가는 질병 상태, 특히 이미 암으로 진단받은 환자에서 진행성 질병의 선도 표시인자로서 작용할 수 있음이 이해되어야 한다.

유방암 샘플의 추가 연구 시, 도 9a에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 또한 종양에서의 HER2 cfRNA가 PD-L1과 공동-발현되거나 공동-조절되는 것으로 나타난다는 점을 발견하였다. 이어서 상기 기준에 따라, 본 발명자들은 IHC-HER2 상태를 cfRNA 수준에 의해 측정되는 HER2의 정량적 상대 발현과 연관시키기 위해 항HER2 항체를 사용하는 면역조직화학 분석(IHC)에 의한 HER2 상태 분류를 사용하였다. 특히, HER2 cfRNA 발현 수준과 IHC HER2 상태 간에 유의미한 연관성(82% 일치)이 존재하였고, 여기서 도 9b에 예시적으로 나타낸 바와 같이, β-액틴 대비 HER2에 대해 5 초과의 ΔΔCT가 적용되었다. 따라서, 상기 제공되는 발현 역치를 사용하여, HER2 상태가 HER2 cfRNA의 검출 및 정량을 사용해서 결정될 수 있다는 것도 고려된다.

추가 실험에서, 도 10에서 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 또한 적어도 일부 위 종양에서의 HER2 cfRNA가 또한 PD-L1과 공동-발현되거나 공동-조절되는 것으로 나타난다는 점을 발견하였다. 이러한 발견은 모든 위암의 약 15%가 HER2를 발현한다고 알려져 있다는 점에서 특히 주목할 만하다. 결과적으로, 본 발명자들은 위암을 갖는 환자에서 HER2 cfRNA를 검출하거나 정량하는 방법을 고려한다. 추가로, 본 발명자들은 또한 cfRNA에 의해 측정되는 하나 이상의 면역 체크포인트 유전자(예컨대, PD-L1, TIM3, LAG3)가 다른 암 특이적 마커 또는 종양 연관 마커(예컨대, CEA, PSA, MUC1, 브라큐리 등)에 대한 프록시 마커로서 사용될 수 있다는 것을 고려한다.

또한 HER2 cfRNA 수준의 정량은 치료를 추적하고, 특히 항-HER2 약물을 이용한 치료가 치료 효과를 갖는지의 여부를 평가하기 위해 채택될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 예를 들어, 도 11에 도시된 바와 같이, 전이성 유방암 환자 코호트 중 2명의 예시적 환자(각각 환자 25 및 12)에서 2개의 항-HER2 약물(퍼투주맙 및 트루스투주맙)에 대한 부분 치료 반응은 양성 반응이 cfRNA의 감소와 직접 연관된다는 것을 나타내었다. 실제로, 과거 3개월의 치료에서 검출 가능한 양의 HER2 cfRNA가 존재하지 않았다.

관찰된 공동-발현 또는 공동-조절에 기반하여, 본 발명자들은 이어서 면역 체크포인트 관련 유전자에 대한 다른 cfRNA 수준이 PD-L1 cfRNA 수준과 연관될 것인지의 여부를 연구하였고, 예시적 결과는 도 12에 도시된다. 여기서, PD-L1, TIM3 및 LAG3에 대한 cfRNA 수준을 전립샘암 환자의 혈액 샘플로부터 측정하였다. 특히 1개를 제외한 모든 샘플에서, 1개를 초과하는 체크포인트 관련 유전자가 강력히 발현되었다. 흥미롭고 중요한 것은, PD-1 또는 PD-L1 억제에 대한 탈출 메커니즘 또는 내성 인자로서 작용하는 것으로 나타난 TIM3, 및 LAG3의 수준이 PD-L1 발현을 종종 모방하므로, PD-1 및 PD-L1에 더하여 모든 체크포인트 단백질을 이해할 필요성을 강조한다는 점이다. 따라서, 면역 체크포인트 관련 유전자에 대한 cfRNA 수준이 면역 특징부 또는 환자를 수득하기 위해 암 환자에 대해 분석될 수 있고, 이어서 하나를 초과하는 체크포인트 억제 약물을 이용한 적절한 치료가 권고될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 유전자에 적합한 역치 값은 상기 PD-L1 및 HER2에 대해 기재된 방법에 따라 확립될 수 있음을 이해할 것이다.

본 발명의 주제의 추가 양태에서, 다양한 대안적 cfRNA 종이 건강한 개인과 암을 앓고 있는 자들을 정량적으로 구별하고/하거나 치료 반응을 예측하는 것으로 실증되었다. 예를 들어, 안드로겐 수용체의 스플라이스 변이체 7(AR-V7)의 검출은 호르몬 치료법을 이용한 전립샘암의 치료를 위해 중요한 고려사항이었다. 따라서 본 발명자들은 호르몬 치료법 내성이 전립샘암 종양 성장 및 AR-V7 cfRNA의 검출 및 정량을 통한 AR-V7의 검출과 연관되는지의 여부를 연구하였다. 도 13은 전립샘암 환자로부터의 혈장을 사용하는 cfRNA 방법을 통한 AR 및 AR-V7 유전자 발현에 대한 예시적 결과를 도시한다. AR-V7을 또한 같은 환자로부터의 CTC로부터 IHC 기술을 사용하여 측정하였다. 특히, CTC로부터의 결과 및 AR-V7에 대한 cfRNA가 일치하였다(데이터는 나타내지 않음).

추가로, 전립샘암 환자로부터의 혈장에서 PCA3 cfRNA가 검출되고 정량되며 비-전립샘암 환자 샘플이 비교적 낮거나 검출 불가능한 수준을 가진 시험에서, PCA3은 전립샘암에 대한 마커로 확인되었다. 비-전립샘암 환자는 NSCLC 및 CRC 환자였다. 도 14에서 알 수 있듯, PCA3은 cfRNA에 의해 2개 군 간에 차별적으로 발현되는 것으로 나타났고(전립샘 및 비-전립샘암 환자 간 비-중복 중앙값), 이는 비-침습적 혈액 기반 cfRNA 시험이 전립샘암을 검출하기 위해 사용될 수 있음을 시사하였다. 다시 한 번, 시험된 집단의 선험적 지식에 기반하여, 발현에 대한 역치 값(여기서, β-액틴 대비 PCA3에 대해 10 초과의 ΔΔCT)이 도 14에서 예시적으로 도시된 바와 같이 확립될 수 있었다.

추가 연구에서, 본 발명자들은 유전자 발현뿐만 아니라 cfRNA를 포함하는 전체 핵산 수준에서의 동적 변화를 측정하기 위한 도구로서, 암 환자(pts)의 혈장으로부터 추출된 전체 세포-비함유 순환 종양 RNA(cfRNA)의 분석을 사용하였다. 이들 분석은 다시 한 번 질병 상태에 대한 식견을 제공하였으며 항-종양 치료법에 대한 결과의 예측을 가능하게 하였다.

보다 구체적으로, 6주 내지 8주마다 다양한 치료(tx) 하에서 pts로부터 채혈하고, 동시에 CT 스캔을 수행하였다. 생성 혈장으로부터 cfRNA를 추출하고 상술한 바와 같이 랜덤 헥사머를 사용하여 cDNA로 역전사하였다. 전체 cfRNA 수준을 RT-qPCR에 의해 정량하고 CT 스캔에 의해 결정된 바와 같이 pt 반응(PR/SD/PD)과 연관시켰다. 상기 연구에서, 총 30명의 폐암 pts가 2년 임상 연구에 등록하였다. 인종분류에는 73%(22/30) 백인, 20%(6/30) 히스패닉, 및 7%(2/30) 기타 인종이 포함되었다. 비-SQCC는 총 87%(26/30)였다. 23명의 pts가 처음 2 사이클의 tx를 완료하였다. 이들 중, 진행성 질병(PD)을 가진 6/8명의 pts는 증가된(INC) 수준의 전체 cfRNA를 나타내었고, 안정한 질병(SD)을 가진 8/12명의 pts는 변화를 나타내지 않거나(NC) 감소된(DEC) 전체 cfRNA를 나타내었고, 부분 반응(PR)을 가진 3/3명의 pts는 DEC 전체 cfRNA를 나타내어 전체 cfRNA와 pt 반응 간의 74% 일치도에 대응하였다. 혈장 cfRNA에서 측정된 PD-L1 발현은 7/10명의 pts에서 조직 발현과 매치되었다. PD-L1이 혈액에서 음성이고 조직에서 양성인 1명의 pt에서, 펨브롤리주맙 치료가 pt에게 진행되었다. 면역치료법(니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙)으로 치료받은 7명의 pts 중에서, PD를 가진 3/3명의 pts는 INC PD-L1 cfRNA 발현을 나타내었고, SD를 가진 3/3명의 pts는 PD-L1 cfRNA에서 NC를 나타내었고, PR을 가진 1명의 pt는 DEC PD-L1 cfRNA를 나타내어, PD-L1 발현 수준과 pt 반응 간의 100% 연관성에 대응하였다. 치료 시, NSCLC pts에서 임상 반응과 혈장 cfRNA 수준에서의 변화(74%) 간에 유의미한 일치가 관찰되었다. pt 혈장에서 PD-L1 발현의 검출은 또한 동일한 pts의 조직으로부터 수득한 결과(70%)와 연관되었다. 표적화된 치료법 상에서, PD-L1 발현 수준은 7/7명의 pts에서의 반응과 연관되었다. 따라서 cfRNA 수준이 tx 반응을 시사할 수 있고 혈장에서의 PD-L1이 면역치료법에 대한 반응을 모니터링하기 위해 사용될 수 있는 것으로 결론지을 수 있다.

이미 기재된 것들 외에 다수의 더 많은 변형이 본원에서 본 발명의 개념으로부터 벗어나지 않고 가능하다는 점이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 첨부되는 청구범위의 범위를 제외하고, 본 발명의 주제는 제한되지 않는다. 또한, 명세서 및 청구범위 둘 모두의 해석에 있어서, 모든 용어는 맥락과 일치하는 가장 광의의 가능한 방식으로 해석되어야 한다. 특히 용어 "포함한다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"은 언급되는 요소, 성분, 또는 단계가 명시적으로 언급되지 않는 다른 요소, 성분, 또는 단계와 함께 존재하거나, 이용되거나, 조합될 수 있음을 시사하는 비-배타적 방식으로 요소, 성분, 또는 단계를 언급하는 것으로 해석되어야 한다. 명세서의 청구범위가 A, B, C .... 및 N으로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 것 중 적어도 하나를 언급하는 경우, 텍스트는 A + N, 또는 B + N 등이 아닌, 군으로부터의 하나의 요소만을 요구하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

개인으로부터의 혈액을 수득하고 혈액으로부터 cfRNA를 단리하는 단계 - cfRNA가 체크포인트 억제 유전자를 인코딩함 -;
정량적 PCR 방법을 사용하여 cfRNA를 정량하는 단계; 및
cfRNA의 양이 선험적으로 결정된 역치 수준 초과인 경우 양성 치료 반응을 예측하기 위한 정보를 제공하는 단계;
를 포함하는,
체크포인트 억제제를 이용한 치료에 대해 암을 갖는 개인의 치료 반응을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
제1항에 있어서,
체크포인트 억제제는 PD1 또는 PD-L1에 대한 항체이며 cfRNA는 PD-L1 cfRNA인,
방법.
제1항에 있어서,
cfRNA를 단리하는 단계는 RNA 안정화 및 세포 보존을 사용하는,
방법.
제1항에 있어서,
정량적 PCR 방법에 실시간 PCR이 포함되는,
방법.
제1항에 있어서,
정량하는 단계는 β-액틴을 내부 표준으로 사용하는,
방법.
제1항에 있어서,
역치 수준이 β-액틴 대비 PD-L1에 대해 10 초과의 ΔΔCT인,
방법.
제1항에 있어서,
정량적 PCR 방법을 사용하여 적어도 제2 cfRNA를 정량하는 단계를 추가로 포함하는,
방법.
제7항에 있어서,
적어도 제2 cfRNA가 TIM3 또는 LAG3을 인코딩하는,
방법.
제1항에 있어서,
적어도 제2 cfRNA를 정량하는 단계를 추가로 포함하며, 적어도 제2 cfRNA는 종양 및 환자 특이적 돌연변이를 갖는 유전자, 종양 연관 유전자, 또는 암 특이적 유전자를 인코딩하는,
방법.
개인으로부터의 혈액을 수득하고 혈액으로부터 cfRNA를 단리하는 단계 - cfRNA가 체크포인트 억제 유전자를 인코딩하거나, cfRNA가 종양 연관 또는 암 특이적 유전자를 인코딩하거나, cfRNA가 종양 및 환자 특이적 돌연변이를 갖는 유전자를 인코딩함 -;
정량적 PCR 방법을 사용하여 cfRNA를 정량하는 단계; 및
cfRNA의 양을 이용하여 환자 기록을 업데이트하는 단계;
를 포함하는,
암을 갖는 개인의 치료 진행을 모니터링하는 방법.
제10항에 있어서,
체크포인트 억제 유전자는 PD-L1, TIM3, 또는 LAG3인,
방법.
제10항에 있어서,
종양 연관 또는 암 특이적 유전자는 CEA, MUC1, 브라큐리(brachyury), HER2, PCA3, 또는 AR-V7인,
방법.
제10항에 있어서,
종양 및 환자 특이적 돌연변이를 갖는 유전자는 네오에피토프를 인코딩하는,
방법.
제10항에 있어서,
cfRNA를 단리하는 단계는 RNA 안정화 및 세포 보존을 사용하는,
방법.
제10항에 있어서,
정량적 PCR 방법에 실시간 PCR이 포함되는,
방법.
제10항에 있어서,
정량하는 단계가 β-액틴을 내부 표준으로 사용하는,
방법.
제10항에 있어서,
cfRNA의 양이 β-액틴 대비 HER2에 대해 5 초과의 ΔΔCT이거나 β-액틴 대비 PCA3에 대해 10 초과의 ΔΔCT인 경우 환자 기록이 업데이트되는,
방법.
개인으로부터 혈액을 수득하고 혈액으로부터 cfRNA를 단리하는 단계 - cfRNA가 PCA3 또는 안드로겐 수용체의 스플라이스 변이체 7을 인코딩함 -;
정량적 PCR 방법을 사용하여 cfRNA를 정량하는 단계; 및
cfRNA 양이 선험적으로 결정된 역치 수준을 초과하는 경우 개인이 암을 갖는 것으로 진단하기 위한 정보를 제공하는 단계;
를 포함하는,
전립샘암을 검출하기 위한 정보를 제공하는 방법.
제18항에 있어서,
PCA3 cfRNA의 양이 β-액틴 대비 10 초과의 ΔΔCT인 경우 개인이 암을 갖는 것으로 진단되는 정보가 제공되는,
방법.
제18항에 있어서,
적어도 제2 cfRNA를 정량하는 단계를 추가로 포함하며, 적어도 제2 cfRNA는 종양 및 환자 특이적 돌연변이를 갖는 유전자, 종양 연관 유전자, 암 특이적 유전자, 또는 체크포인트 억제 유전자를 인코딩하는,
방법.
제20항에 있어서,
제2 cfRNA가 PD-L1, LAG3, TIM3, AR-V7, PSA 및 PSMA를 인코딩하는,
방법.
PD-L1 음성 암으로 진단받은 개인에게 약물을 투여하는 단계;
혈액으로부터 cfRNA를 단리함으로써 PD-L1 음성 암으로 진단받고 그리고 약물을 투여 받은 개인의 치료를 모니터링하는 단계 - cfRNA가 PD-L1을 인코딩함 -;
정량적 PCR 방법을 사용하여 cfRNA를 정량하는 단계; 및
cfRNA의 검출 시 치료에 체크포인트 억제제를 포함시키는 단계;
를 포함하는,
암을 치료하는 방법.
제22항에 있어서,
PD-L1 음성 암은 고형 암인,
방법.
제23항에 있어서,
고형 암은 유방암인,
방법.
제22항에 있어서,
약물은 아피니토르인,
방법.
제22항에 있어서,
cfRNA를 정량하는 단계는 실시간 PCR을 사용하는,
방법.
제22항에 있어서,
cfRNA가 검출되고 경시적으로 증가하는 경우 체크포인트 억제제를 포함시키는,
방법.
제22항에 있어서,
cfRNA가 검출되고 cfRNA 수준이 β-액틴 대비 10 초과의 ΔΔCT인 경우 체크포인트 억제제를 포함시키는,
방법.
개인의 혈액 중에서 별개의 cfRNA 분자의 양을 결정하는 단계 - cfRNA 분자가 구별되는 체크포인트 억제 유전자를 인코딩함-;
를 포함하며,
결정하는 단계는 체크포인트 억제제, 항암화학치료 약물, 면역 치료 약물 및 방사선 치료 중 적어도 하나를 이용한 치료 전에 또는 치료 동안 수행되는,
환자에서 면역 특징부를 결정하는 방법.
제29항에 있어서,
별개의 cfRNA 분자 중 적어도 하나는 PD-L1, LAG3 또는 TIM3을 인코딩하는,
방법.
제29항에 있어서,
양을 결정하는 단계는 실시간 PCR을 포함하는,
방법.
체크포인트 억제제를 이용한 치료에 대해 암을 갖는 개인의 치료 반응을 예측하기 위한 용도를 가지는 cfRNA로서, cfRNA는 체크포인트 억제 유전자를 인코딩하며, cfRNA가 역치 수준 초과인,
cfRNA.
제32항에 있어서,
체크포인트 억제제는 PD1 또는 PD-L1에 대한 항체이며 cfRNA가 PD-L1 cfRNA인,
cfRNA.
제32항에 있어서,
역치 수준이 β-액틴 대비 PD-L1에 대해 10 초과의 ΔΔCT인,
cfRNA.
암을 갖는 개인의 치료를 모니터링하기 위한 용도를 가지는 cfRNA로서, cfRNA가 체크포인트 억제 유전자를 인코딩하거나, cfRNA가 종양 연관 또는 암 특이적 유전자를 인코딩하거나, cfRNA가 종양 및 환자 특이적 돌연변이를 갖는 유전자를 인코딩하는, cfRNA.
제35항에 있어서,
체크포인트 억제 유전자는 PD-L1, TIM3, 또는 LAG3인,
cfRNA.
제35항에 있어서,
종양 연관 또는 암 특이적 유전자는 CEA, MUC1, 브라큐리, HER2, PCA3, 또는 AR-V7인,
cfRNA.
제35항에 있어서,
종양 및 환자 특이적 돌연변이를 갖는 유전자는 네오에피토프를 인코딩하는,
cfRNA.
개인에서의 전립샘암의 검출에서 PCA3 또는 안드로겐 수용체의 스플라이스 변이체 7을 인코딩하는 용도를 가지는 cfRNA.
제39항에 있어서, cfRNA 양이 역치 수준을 초과하는 경우 개인이 전립샘을 갖는 것으로 진단되는, cfRNA.
제40항에 있어서, PCA3 cfRNA에 대한 역치 수준이 β-액틴 대비 10 초과의 ΔΔCT인, cfRNA.