KR20200019227A

KR20200019227A - NSCLC에서의 치료법에 대한 반응을 모니터링하기 위한 혈장 중 PD-L1 및 ERCC1의 무세포 순환 RNA(cfRNA) 발현의 용도(USE OF CELL-FREE CIRCULATING RNA (cfRNA) EXPRESSION OF PD-L1 AND ERCC1 IN PLASMA TO MONITOR RESPONSE TO THERAPY IN NSCLC)

Info

Publication number: KR20200019227A
Application number: KR1020207001844A
Authority: KR
Inventors: 캐슬린 단넨버그; 조슈아 어셔; 샤루즈 라비자데
Original assignee: 난토믹스, 엘엘씨
Priority date: 2017-06-20
Filing date: 2018-06-19
Publication date: 2020-02-21
Also published as: WO2018236811A1; CA3067998A1; AU2018289369A1; EP3642351A1; US20200377955A1

Abstract

ERCC1 cfRNA의 정량적 수준이 백금계 약물로의 치료를 받는 환자에서 암의 질병 상태에 대한 임상 반응을 모니터링/예측하기 위해 사용된다. 가장 전형적으로, 암은 NSCLC이며 환자는 백금계 약물로 치료받는다. 치료에 면역 체크포인트 억제제가 또한 포함되는 경우, PD-L1 cfRNA가 치료 결과를 추가 예측하기 위해 정량될 수 있다.

Description

NSCLC에서의 치료법에 대한 반응을 모니터링하기 위한 혈장 중 PD-L1 및 ERCC1의 무세포 순환 RNA(cfRNA) 발현의 용도(USE OF CELL-FREE CIRCULATING RNA (cfRNA) EXPRESSION OF PD-L1 AND ERCC1 IN PLASMA TO MONITOR RESPONSE TO THERAPY IN NSCLC)

본 출원은 2017년 6월 20일에 출원된 공동 계류 중인 미국 특허 가출원 제62/522,615호에 대한 우선권 및 2017년 10월 10일에 출원된 공동 계류 중인 미국 특허 가출원 제62/570,199호에 대한 우선권을 주장한다.

발명 분야

본 발명의 분야는 암 치료법에 대한 치료 반응을 예측하고 모니터링하는 조성물 및 방법이며, 특히 이는 비-소세포 폐암(NSCLC)에서의 치료 반응의 분석을 위한 PD-L1 및 ERCC1에 대한 cfRNA의 용도에 관한 것이다.

배경 기술에는 본 발명의 이해에 있어 유용할 수 있는 정보가 포함된다. 이는 본원에 제공된 임의의 정보가 선행 기술이거나 본원에서 청구되는 발명에 관련된다거나, 명시적으로 또는 묵시적으로 참조되는 임의의 공보가 선행 기술이라고 인정하는 것이 아니다.

본원에서 모든 공보 및 특허 출원은 각각의 개별 공보 또는 특허 출원이 참조로 포함된다고 구체적이고 개별적으로 나타내는 것과 같이 동일한 정도로 참조로 포함된다. 포함된 참고문헌에서 용어의 정의 또는 사용이 본원에 제공된 그 용어의 정의와 일치하지 않거나 반대인 경우, 본원에 제공된 그 용어의 정의가 적용되며, 참고문헌에서 그 용어의 정의는 적용되지 않는다.

지난 수십 년 동안, 암 치료를 개선하려는 시도는 주로 새로운 항암제의 스크리닝, 개발, 다중-약물 조합, 및 방사선 치료법에서의 진보에 초점을 맞춰왔다. 보다 최근 접근에서는, 개인화된 치료 전략을 설계하기 위해 종양의 개체 변동성이 고려된다. 정밀 의약의 하나의 중요한 목표는 치료 효과 및 예후에 관여되는 요인을 분석함으로써 치료법 선택을 시사하는 분자 마커, 특히 핵산 마커를 확인하는 것이다.

종양 및 비-종양 세포로부터의 핵산 분자가 혈액으로부터 수득될 수 있다는 것이 알려졌으나(예컨대, 문헌[Clin Canc. Res. (1999) Vol 5, 1961-1965; Canc Res. (1977) 37:646-650] 참고), 이들 핵산이 임의의 담체 또는 다른 구조와 연관되거나 결합되는지의 여부는 명확하지 않았다. 실제로, 보다 최근에 RNA가 순환 종양 세포(예컨대, WO 2017/180499 참고), 엑소좀(예컨대, WO 2015/082372 참고) 및 담체 단백질(예컨대, WO 2010/079118, 또는 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. (1985) 82, 3455] 참고)을 포함하는 다양한 원천으로부터 유래할 수 있다는 것이 발견되었다. 유감스럽게도, 아마도 RNA의 상이한 위치/다양한 담체 또는 다른 세포하위 구조와의 회합으로 인해, 순환 핵산의 정확한 정량은 종종 문제가 되었다. 예를 들어, 무세포 RNA를 사용하는 신경모세포종에서의 질병 상태 검출은 전체 세포 RNA 분석에 대한 신뢰할 수 있는 대안이 아닌 것으로 나타났다(예컨대, 문헌[Pediatr Blood Cancer. 2010 Jul 1;54(7):897-903] 참고).

WO 2016/077709는 다양한 cfRNA 및 cfDNA 종의 측정을 교시한다. 이의 특정 회합과 무관하게 혈중 돌연변이되거나 부적절하게 융합된 유전자로부터 상대적으로 소량의 cfRNA를 검출할 수 있지만, 이러한 RNA의 검출량들은 상당히 상이했다. 또한, 임의의 검출된 양이 세포 내 생리적 현실의 반영인지 특정 관심 RNA의 안정성의 함수인지의 여부도 알려지지 않은 채로 남아있었다. 예를 들어, '709 공보에서의 데이터는 PD-1/PD-L1을 인코딩하는 cfRNA의 양이 종종 매우 가변적이며 샘플, 환자 질환 및 다른 요인에 의해 좌우될 수 있음을 시사한다. WO 2016/077709는 치료법 동안의 다양한 시점에 NSCLC 환자로부터 다양한 cfRNA 및 cfDNA 종의 측정을 추가로 교시한다. 특히 임의의 계층화 없이, ERCC1 발현은 NSCLC 환자의 100%(10/10명) 및 대조군의 67%(6/9명)에서 검출되었고, 검출된 것들의 상대 발현에서 유의차는 관찰되지 않았다. 실제로, '709 출원의 발명자들은 ERCC1 발현이 암 환자 및 건강한 개인에 걸쳐 발현 수준에서 유의차를 나타내지 못한 유전자를 예시한다고 결론지었다. 결과적으로, cfRNA를 검출하고 정량하는 다양한 방법이 알려져 있지만, 특정 약물을 이용하여 질병 상태(예컨대, 진행성 질병(PD), 안정한 질병(SD), 부분 반응(PR))에 대한 암의 치료 결과를 모니터링하거나 예측하는 방법의 사용은 확인하기 어려웠다.

따라서, 생물학적 유체로부터 핵산을 분석하는 여러 방법이 당분야에 알려져 있지만, 이들 중 전부 또는 거의 전부가 다양한 단점을 가지고 있다. 따라서, cfRNA를 사용하여 질병 상태에 대해 암의 치료 결과를 모니터링하거나 예측하기 위한 개선된 시스템 및 방법에 대한 필요성이 여전히 남아 있다.

본 발명의 요지 사안은 암으로 진단받은 환자의 체액에서 ERCC1 cfRNA의 발현을 정량하는 조성물 및 방법에 대한 것이다. 특히, 본 발명자들은 ERCC1 cfRNA 양이 백금계 약물로 치료를 받는 환자에서 암의 질병 상태에 대한 임상 반응을 모니터링하거나 예측하기 위해 사용될 수 있음을 발견하였다.

본 발명의 요지 사안의 일 양태에서, 본 발명자들은 백금계 약물로 치료를 받는 환자에서 암의 질병 상태에 대한 임상 반응을 모니터링하거나 예측하는 방법을 고려한다. 가장 전형적으로, 이러한 방법에는 암(예컨대, 폐암, 예컨대, NSCLC)으로 진단받은 환자의 체액에서 ERCC1 cfRNA의 상대 발현을 정량하는 단계가 포함될 것이다.

일부 구현예에서, ERCC1 cfRNA의 상대 발현은 베타-액틴 RNA 또는 유니버설 인간 참조(Universal Human Reference) RNA 대비 정량된다. 요망되는 경우, ERCC1 cfRNA의 상대 발현이 안정한 질병을 시사하는 수준 초과인 경우 표시가 생성될 수 있다(예컨대, 표시로 백금계 약물로의 치료에 대한 내성 또는 반응의 부재가 예측됨). 대안적으로, 또는 부가적으로, 표시는 ERCC1 cfRNA의 상대 발현이 안정한 질병을 시사하는 수준 이하인 경우 생성될 수 있다. 이러한 경우, 표시로 백금계 약물로의 치료에 대한 부분 또는 완전 반응이 예측될 수 있다.

고려되는 방법에는 또한 암으로 진단받은 환자의 체액에서 PD-L1 cfRNA의 상대 발현을 정량하는 단계가 포함될 수 있으며, 예를 들어 환자는 체크포인트 억제제로의 치료를 추가로 받는다. 또한, 본원에 재시되는 방법이 ERCC1 cfRNA의 상대 발현을 정량하는 단계의 적어도 1주 후, 체액에서 ERCC1 cfRNA의 상대 발현을 정량하는 두 번째 단계를 또한 포함할 수 있음이 고려된다. 따라서, 요망되는 경우, ERCC1 cfRNA의 동적 변화가 체액에서 ERCC1 cfRNA의 상대 발현을 정량하는 단계를 사용하여 검출될 수 있다.

고려되는 추가 구현예에서, 상대 발현이 1.5 이하인 경우 질병 상태는 부분 반응이고, 상대 발현이 1.8 내지 2.8인 경우 질병 상태는 안정한 질병이고/질병이거나 상대 발현이 3.8 이상인 경우 질병 상태는 진행성 질병이다.

따라서, 그리고 상이한 관점으로부터, 본 발명자들은 또한 백금계 약물로 치료를 받는 환자에서 암의 질병 상태에 대한 임상 반응을 모니터링하거나 예측하기 위한 ERCC1 cfRNA의 용도를 고려하며, 여기서 ERCC1 cfRNA는 환자의 체액 샘플에서 생체외 정량적으로 측정된다.

예를 들어, 암이 폐암인 경우, 백금계 약물은 카보플라틴일 수 있다. 가장 전형적으로, ERCC1 cfRNA는 적어도 하나의 참조 유전자(예컨대, 베타 액틴 또는 유니버설 인간 참조 RNA)의 발현 대비 상대 발현으로 정량적으로 측정된다. 또한 고려되는 용도에는 환자의 체액 샘플에서 생체외 PD-L1 cfRNA를 정량적으로 측정하는 단계가 추가로 포함될 수 있으며, 특히 환자는 체크포인트 억제제로의 치료를 또한 받는다.

본 발명의 주제의 다양한 목적, 특성, 양태 및 장점은 첨부 도면과 함께, 바람직한 구현예의 하기 상세한 설명으로부터 더 명백해질 것이다.

도 1은 백금계 치료법에 반응하여 NSCLC를 갖는 폐암 환자에서의 상대 ERCC1 발현을 도시하는 예시적 그래프이다.
도 2는 백금계 치료법에 반응하여 NSCLC를 갖는 폐암 환자에서의 상대 ERCC1 발현을 도시하는 또 다른 예시적 그래프이다. 수평 막대는 막대에 인접한 정량값을 갖는 ERCC1 중앙값 발현을 표시한다.
도 3은 상이한 질병 상태에 걸친 ERCC1 발현 차이 및 통계 분석의 그래프이다.
도 4는 백금계 치료법 동안 NSCLC를 갖는 폐암 환자에서 경시적인 ERCC1 발현을 도시하는 그래프이다.
도 5는 상이한 질병 상태에 걸쳐 백금계 치료법 동안 NSCLC를 갖는 폐암 환자에서 ERCC1 cfRNA의 동적 변화를 도시하는 그래프이다.
도 6은 그래프에 표시된 바와 같이 체크포인트 억제제로의 면역 치료법에 대해 부분 반응(PR)을 갖는 폐암 환자에서 경시적인 PD-L1 발현을 도시하는 그래프이다.

방사선 평가 또는 잔여 종양이나 새로운 전이로부터의 생검 이외의 수단에 의해 종양 반응을 평가하는 것에 대한 필요성은 충족되지 않았다. 유리하게는, cfRNA(종양 세포로부터 유래되고 생물학적 유체에서 순환 RNA로 확인되는 무세포 RNA)가 암 환자의 혈장으로부터 추출될 수 있고, 이제 본 발명자들은 특히 참조 유전자(예컨대, 환자에서 총 cfRNA에 대한 프록시로서의 β-액틴)의 발현의 맥락에서, 하나 이상의 특정 유전자의 유전자 발현의 동적 변화 측정이 질병 검출을 위해서뿐만 아니라 조영 전에 질병 상태를 평가하고/평가하거나 항-종양 치료법에 대한 결과를 예측하기 위해 사용될 수 있음을 발견하였다. 상이한 관점으로부터, 본 발명자들은 cfRNA가 진단, 치료의 모니터링을 위한 민감하고, 선택적이며, 정량적인 마커로 채택될 수 있고, 심지어 환자의 반복 샘플링 및 비-침습적 샘플링을 가능하게 하는 탐색 도구로 채택될 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 고려된 시스템 및 방법은 오믹스 플랫폼에 의해 확인된 변경이 본원에 제시된 시스템 및 방법에 의해 비-침습적으로, 분자적으로 모니터링되는 강력한 일차 분석/모니터링 조합 도구를 확립하기 위해 다른 오믹스 분석 플랫폼, 및 특히 GPS 암(전체 게놈 또는 엑솜 시퀀싱, RNA 서열 및 발현 분석 그리고 정량적 단백질 분석을 제공함)와 통합됨이 또한 주지되어야 한다.

예를 들어 그리고 아래에서 보다 상세히 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 ERCC1 cfRNA 수준이 (전형적으로 하우스키핑 또는 다른 참조 유전자(들)에 대한 cfRNA의 발현 수준 대비) 백금계 약물(예컨대, 카보플라틴)로의 치료에 대한 내성 또는 반응의 부재를 예측하기 위해 사용될 수 있음을 발견하였다. 보다 구체적으로, 본 발명자들은 4.2의 ERCC1 발현 및 베타-액틴 간 역치 차이가 백금계 약물로의 치료의 성공(예컨대, 안정한 질병(SD), 부분(PR) 또는 완전 반응(CR)) 가능성의 예측 또는 평가에 대한 컷오프로 사용될 수 있음을 발견하였다. 또한, ERCC1 이외의 여러 발현 수준도 단독으로 또는 ERCC1 cfRNA 측정과의 조합으로 적합하게 간주됨이 인식되어야 한다. 따라서, 하나 이상의 요망되는 핵산이 암 검출, 질병 단계의 확인, 암에 연관되거나 환자 특이적일 수 있는 특정 돌연변이의 확인에서 정량적 cfRNA 분석을 위해 선택될 수 있음이 이해되어야 한다. 대안적으로, 특정 유전자의 새로운 돌연변이 또는 발현 변화에 대한 탐색 또는 스캐닝이 요망되는 경우, 실시간 정량적 PCR이 환자의 트랜스크립톰의 적어도 일부를 커버하도록 RNAseq에 의해 대체될 수 있다. 또한, 분석이 정적으로 또는 종양 또는 전이의 생검에 대한 필요성 없이 다이내믹 사진을 수득하기 위해 반복되는 샘플채집으로 시간 경과에 걸쳐 수행될 수 있음이 이해되어야 한다.

용어 cfRNA에는 전장 RNA뿐만 아니라 전장 RNA의 단편(50개 내지 150개 염기, 15개 내지 500개 염기, 또는 500개 내지 1,000개 염기 이상의 길이를 가질 수 있음)이 포함됨이 주지되어야 한다. 따라서, cfRNA는 RNA의 일부를 나타낼 수 있고, 이는 전장 RNA(전형적으로 mRNA)의 100% 내지 80%, 또는 80% 내지 60%, 또는 60% 내지 40%, 또는 40% 내지 20%, 또는 그 미만일 수 있다. 또한, 용어 cfRNA가 전형적으로 종양-유래 RNA(비-종양 세포로부터의 RNA와 대치되어)를 나타내며 이에 따라 cfRNA가 고형 종양, 혈액 유래 암, 순환 종양 세포, 및 엑소좀에서 유래될 수 있음이 이해되어야 한다. 그러나 가장 전형적으로, cfRNA는 막에 의해 봉입되지 않을 것이다(그리고 이렇게 순환 종양 세포 또는 엑소좀에서 유래될 것임). 또한, cfRNA가 종양에서 고유하게(예컨대, 약물 내성의 함수로서 또는 치료 방식에 반응하여, 스플라이스 변이체로 등) 발현될 수 있거나 유전자의 돌연변이된 형태로(예컨대, 융합 전사체로, 단일-염기 또는 다중-염기 돌연변이를 갖는 유전자의 전사체로 등) 발현될 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 그리고 상이한 관점으로부터, 고려되는 cfRNA에는 특히 대응하는 비-종양 세포 대비 종양 세포에 고유하거나, 대응하는 비-종양 세포 대비 종양 세포에서 유의미하게 과발현되거나 저발현되거나(예컨대, 적어도 3배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 10배), 대응하는 비-종양 세포 대비 돌연변이(예컨대, 네오에피토프를 야기하는 미스센스 또는 논센스 돌연변이)를 갖는 전사체가 포함된다.

가장 전형적으로, 적합한 조직원에는 전혈이 포함되며, 이는 바람직하게는 혈장 또는 혈청으로 제공된다. 따라서, 바람직한 구현예에서, ctDNA 및/또는 ctRNA는 아래에서 추가 논의되는 바와 같이 세포 온전성 및 ctRNA의 안정성을 보존하는 조건 하에 가공되는 전혈 샘플로부터 단리된다. 대안적으로, 다양한 다른 체액은 또한 ctDNA 및/또는 ctRNA가 이러한 유체에 존재하는 한 적절한 것으로 간주됨이 주지되어야 한다. 적절한 유체에는 타액, 복수, 척수액, 소변, 또는 임의의 다른 유형의 체액이 포함되며, 이는 신선한, 화학적으로 보존된, 냉장된 또는 냉동된 것일 수 있다.

환자의 체액은 cfRNA 분석 목적에 따라 임의의 요망되는 시점(들)에 수득될 수 있다. 예를 들어, 환자의 체액은 ctDNA 및/또는 ctRNA 데이터를 암의 예후와 연관시키기 위해 환자가 종양을 갖는 것으로 확인되기 전에 및/또는 후에 및/또는 이후 주기적으로(예컨대, 매주, 매월 등) 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 환자의 체액은 암 치료(예컨대, 화학치료법, 방사선치료법, 약물 치료, 암 면역치료법 등) 전에, 동안, 및/또는 후에 환자로부터 수득될 수 있다. 치료 유형 및/또는 암 유형에 따라 변할 수 있지만, 환자의 체액은 암 치료의 적어도 24시간, 적어도 3일, 적어도 7일 후 수득될 수 있다. 정확한 비교를 위해, 암 치료 전 환자로부터의 체액은 암 치료 시작 전 1시간 이내, 6시간 이내, 24시간 이내, 1주 이내에 수득될 수 있다. 또한, 환자 체액의 복수의 샘플은 암 치료 전 및/또는 후의 기간 동안(예컨대, 7일 동안 24시간 후 1일 1회 등) 수득될 수 있다. 따라서, 여러 샘플이 예정 간격(예컨대, 매일, 매주, 2주마다, 매월 등)의 경과에 걸쳐 채취되는 경우, 동적 변화가 평가되고 질병 상태를 시사하는 경향성이 확인되거나 치료 반응이 예측될 수 있다.

예를 들어, 본원에 제시된 분석을 위해, 각각 RNA 또는 DNA 안정화제를 함유하는 무세포 RNA BCT® 튜브 또는 무세포 DNA BCT® 튜브 내로 채혈된 전혈 10 ㎖의 시료를 얻었다. 유리하게는, cfRNA는 7일 동안 무세포 RNA BCT 튜브 내의 전혈 중에서 안정한 반면 ctDNA는 14일 동안 무세포 DNA BCT 튜브 내의 전혈 중에서 안정하여, cfRNA 또는 cfDNA의 분해 없이 전세계 각 지역으로부터 환자 샘플을 수송하기 위한 시간을 허용한다.

또한, cfRNA가 혈액 세포를 용해시키지 않거나 실질적으로 용해시키지 않을(예컨대, 1% 이하, 또는 0.1% 이하, 또는 0.01% 이하, 또는 0.001% 이하를 용해시킬) RNA 안정화제를 사용하여 단리되는 것이 일반적으로 바람직하다. 상이한 관점으로부터, RNA 안정화 시약은 시약이 혈액과 조합된 후 혈청 또는 혈장 중 RNA 양의 실질적 증가(예컨대, 10% 이하, 또는 5% 이하, 또는 2% 이하, 또는 1% 이하의 전체 RNA 증가)를 야기하지 않을 것이다. 마찬가지로, 이들 시약은 또한 혈액에서 세포의 물리적 온전성을 보존하여 혈액 세포에서 확인되는 세포 RNA의 방출을 감소시키거나 심지어 제거할 것이다. 이러한 보존은 분리되었을 수 있거나 분리되지 않았을 수 있는 수집된 혈액 형태일 수 있다. 덜 바람직한 양태에서, 고려되는 시약은 2일, 보다 바람직하게는 적어도 5일, 가장 바람직하게는 적어도 7일 동안 혈액 이외의 수집된 조직에서 cfDNA 및/또는 cfRNA를 안정화할 것이다. 당연히, 여러 다른 수집 방식이 또한 적절한 것으로 간주되며, cfRNA 및/또는 cfDNA가 적어도 부분적으로 정제되거나 고체상에 흡착되어 추가 가공 전에 안정성을 증가시킬 수 있음이 인식되어야 한다.

일반적으로 cfRNA는 RNA 안정화 시약을 사용하여 단리되는 것이 바람직하다. 임의의 적합한 RNA 안정화제가 고려되지만, 바람직한 RNA 안정화 시약에는 뉴클레아제 억제제, 보존제, 대사 억제제, 및/또는 킬레이터 중 하나 이상이 포함된다. 예를 들어, 고려되는 뉴클레아제 억제제에는 가장 전형적으로 0.5 wt% 내지 2.5 wt%의 양으로, RNA아제 억제제, 예컨대 디에틸 피로카보네이트, 에탄올, 아우린트리카복실산(ATA), 포름아미드, 바나딜-리보뉴클레오시드 복합체, 마칼로이드, 헤파린, 벤토나이트, 암모늄 설페이트, 디티오트레이톨(DTT), 베타-메르캅토에탄올, 디티오에리트리톨, 트리스(2-카복시에틸)포스펜 하이드로클로라이드가 포함될 수 있다. 보존제에는 디아졸리디닐 우레아(DU), 이미다졸리디닐 우레아, 디메토일올-5,5-디메틸히단토인, 디메틸올 우레아, 2-브로모-2-니트로프로판-1,3-디올, 옥사졸리딘, 나트륨 하이드록시메틸 글리시네이트, 5-하이드록시메톡시메틸-1-1아자-3,7-디옥사바이사이클로[3.3.0]옥탄, 5-하이드록시메틸-1-1아자-3,7디옥사바이사이클로[3.3.0]옥탄, 5-하이드록시폴리[메틸렌옥시]메틸-1-1-아자-3,7-디옥사바이사이클로[3.3.0]옥탄, 사차 아다만틴 또는 이의 임의의 조합이 포함될 수 있다. 대부분의 예에서, 보존제는 약 5 wt% 내지 30 wt%의 양으로 존재할 것이다. 또한, 일반적으로 보존제와 접촉하는 세포의 용해를 감소시키거나 회피하기 위해 보존제에 무질서 유발제 및/또는 세척제가 없는 것으로 고려된다.

적합한 대사 억제제에는 글리세르알데하이드, 디하이드록시아세톤 포스페이트, 글리세르알데하이드 3-포스페이트, 1,3-비스포스포글리세레이트, 3-포스포글리세레이트, 포스포엔올피루베이트, 피루베이트, 및 글리세레이트 디하이드록시아세테이트, 및 나트륨 플루오라이드가 포함될 수 있고, 그 농도는 전형적으로 0.1 wt% 내지 10 wt% 범위이다. 바람직한 킬레이터에는 이차 양이온의 킬레이터, 예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및/또는 에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA)이 포함될 수 있고, 그 농도는 전형적으로 1 wt% 내지 15 wt% 범위이다.

추가적으로, RNA 안정화 시약에는 프로테아제 억제제, 포스파타제 억제제 및/또는 폴리아민이 추가로 포함될 수 있다. 따라서, 전혈에서 ctRNA를 수집하고 안정화하기 위한 예시적인 조성물에는 아우린트리카복실산, 디아졸리디닐 우레아, 글리세르알데하이드/나트륨 플루오라이드, 및/또는 EDTA가 포함될 수 있다. ctRNA 단리를 위한 추가 조성물 및 방법은 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제8,304,187호 및 미국 특허 제8,586,306호에 기재되어 있다.

가장 바람직하게는, ctRNA 안정화를 위해 이러한 고려되는 RNA 안정화제는 혈액 수집, 저장, 수송, 및/또는 원심분리에 적합한 시험관 내에 배치된다. 따라서, 대부분의 전형적인 양태에서, 수집 튜브는 하나 이상의 혈청 분리장치 성분을 또한 포함하는 배출 혈액 수집 튜브로 구성되어 전혈의 세포 함유상 및 실질적으로 무세포상(존재하는 모든 세포의 1% 이하)으로의 분리를 보조한다. 일반적으로, RNA 안정화제는 혈액 세포를 용해시키지 않거나 실질적으로 용해시키지 않는(예컨대, 1% 이하, 또는 0.1% 이하, 또는 0.01% 이하, 또는 0.001% 이하 등으로 용해시키는) 것이 바람직하다. 상이한 관점으로부터, RNA 안정화 시약은 시약이 혈액과 조합된 후 혈청 또는 혈장 중 RNA 양의 실질적 증가를 야기하지 않을 것이다(예컨대, 총 RNA의 10% 이하, 또는 5% 이하, 또는 2% 이하, 또는 1% 이하 증가). 마찬가지로, 이들 시약은 또한 혈액에서 세포의 물리적 온전성을 보존하여 혈액 세포에서 확인되는 세포 RNA의 방출을 감소시키거나 심지어 제거할 것이다. 이러한 보존은 분리되었을 수 있거나 분리되지 않았을 수 있는 수집된 혈액 형태일 수 있다. 일부 양태에서, 고려되는 시약은 2일, 보다 바람직하게는 적어도 5일, 가장 바람직하게는 적어도 7일 동안 혈액 이외의 수집된 조직에서 ctRNA를 안정화할 것이다. 당연히, 수집 튜브(예컨대, 시험관, 칩, 수집 페이퍼, 카트리지 등) 이외의 여러 다른 수집 방식이 또한 적절하게 간주되며, cfRNA가 적어도 부분적으로 정제되거나 고체상에 흡착되어 추가 가공 전에 안정성을 증가시킬 수 있음이 인식되어야 한다.

쉽게 이해될 바와 같이, 혈장의 분획화 및 cfRNA의 추출은 여러 방식으로 수행될 수 있다. 예시적인 바람직한 일 양태에서, 10 ㎖ 튜브 내의 전혈이 혈장을 분획화하기 위해 20분 동안 1600 rcf에서 원심분리된다. 이어서 이렇게 수득된 청정화된 혈장 분획은 세포 파편을 제거하기 위해 분리되고 10분 동안 16,000 rcf에서 원심분리된다. 당연히, 원심분리가 실질적인 세포 용해를 야기하지 않는 한(예컨대, 모든 세포의 1% 이하, 또는 0.1% 이하, 또는 0.01% 이하, 또는 0.001% 이하의 용해를 야기함), 다양한 대안적인 원심분리 프로토콜이 또한 적합한 것으로 간주된다. 이어서 cfRNA는 전형적으로 상업적으로 이용 가능한 Qiagen 시약을 사용하여 2 ㎖의 혈장으로부터 추출된다. 예를 들어, cfRNA가 단리되는 경우, 본 발명자들은 필터 물질에 보유된 DN아제를 포함하는 제2 용기를 사용하였다. 특히, cfRNA에는 또한 miRNA(및 다른 조절 RNA, 예컨대 shRNA, siRNA, 및 인트론 RNA)가 포함되었다. 따라서, 고려되는 조성물 및 방법이 또한 전혈로부터 miRNA 및 다른 RNA의 분석에 적합함이 이해되어야 한다. 모든 핵산은 바람직하게는 바-코드화 매트릭스 저장 튜브에서 유지되었고, RNA는 -80℃에서 저장되거나 cDNA로 역전사된 후 -4℃에서 저장된다. 특히, 이렇게 단리된 ctRNA는 추가 가공 전에 냉동될 수 있다.

cfRNA의 전사 강도(발현 수준)의 정량/결정에 관해, 이러한 분석이 여러 방식으로 수행될 수 있음이 주지되어야 한다. cfRNA의 정량은 여러 방식으로 수행될 수 있고, 고려되는 방법에는 디지털 PCR 방법에 의한 정량, 외부 표준을 사용하는 절대 정량 방법 및 가장 전형적으로 내부 표준을 사용하는 상대 정량 방법(예컨대, 2^ΔΔCt로 표현됨)이 포함된다. 예를 들어, 실시간 qPCR 증폭은 2 ㎕ cDNA, 프라이머 및 프로브를 함유하는 10 ㎕ 반응 혼합물 중에서 검정을 사용하여 수행될 수 있다. β-액틴은 ct-cDNA의 투입 수준에 대한 내부 표준으로 사용될 수 있다. 알려진 농도의 분석물질 각각을 이용한 샘플의 표준 곡선뿐만 아니라 각각의 유전자에 대한 양성 및 음성 대조군이 각각의 PCR 플레이트에 포함될 수 있다. 각 개별 환자의 혈액 샘플에 대해 β-액틴의 Ct 값이 감산된 각각의 분석물질에 대한 정량적 PCR(qPCR) 증폭으로부터 유도된 Ct 값으로부터 델타 Ct(dCT)가 계산될 수 있다. 이어서 환자 시료의 상대 발현이 유전자 발현 값 10으로 설정된 유니버설 인간 참조 RNA의 연속 희석액의 델타 Ct의 표준 곡선을 사용하여 계산될 수 있다(델타 CT가 각 분석물질의 log 농도에 대해 도식화된 경우).

특히 이러한 cfRNA 중심 시스템 및 방법이 마커 및 심지어 질병 유발인자의 변화 모니터링 및/또는 아래에서 보다 상세히 나타낸 바와 같이 출현하는 화학치료법에 대한 내성과 연관될 수 있는 마커 또는 약물 표적의 변화 확인을 허용함이 이해되어야 한다. 예를 들어, 하나 이상의 특정 유전자(예컨대, ERCC1 또는 PD-L1)의 cfRNA 존재 및/또는 양은 환자가 하나 이상의 백금계 약물 또는 체크포인트 억제제에 민감할 수 있는지 여부를 평가하는 진단 도구로 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명자들은 또한 일단 종양이 확인되거나 검출되면, 다양한 시점에 cfRNA의 유형 및/또는 양을 모니터링함으로써 종양의 예후가 모니터링될 수 있음을 고려한다. 일단 확인되면, 적어도 하나가 질병, 질병 상태, 또는 특정 약물로의 치료 가능성을 시사하는 cfRNA는 환자의 체액(전형적으로 전혈, 혈장, 혈청)으로부터 단리되고, cfRNA의 양(그리고 심지어 서브타입)이 결정된다. 아래에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 환자의 체액으로부터 검출된 cfRNA의 양이 질병, 질병 상태, 및 종양의 치료 가능성의 강력한 표시인자일 수 있음을 발견하였다. 예를 들어, 폐암 환자에서 증가된 양의 ERCC1 및/또는 PD-L1은 백금계 약물로의 치료에 대한 내성을 시사하며 체크포인트 억제제로의 치료 성공을 시사하거나 시사할 수 있다.

따라서, cfRNA 정량 결과는 측정된 cfRNA를 생성하는 특정 세포 또는 세포 집단의 존재 또는 부재에 대한 표시인자로서 작용할 수 있을 뿐만 아니라 이러한 세포 또는 세포 집단의 (예컨대, 유전적, 대사, 세포 분열 관련, 괴사, 및/또는 아폽토시스) 상태의 추가 표시인자로서 작용할 수 있음이 이해되어야 한다. 실제로, 다른 오믹스 데이터 및 cfRNA 정량 결과가 경로 분석 및/또는 머신 러닝 모델에서 입력 데이터로 채택되는 경우, 적합한 치료 옵션에 관한 추가 식견이 발견될 수 있다. 예를 들어, 적합한 모델에는 단일 또는 다중 경로에서 경로 활성(또는 경로 성분의 활성)을 예측하는 것들이 포함된다. 따라서, 정량된 cfRNA가 또한 트랜스크립톰 분석으로부터의 RNA 데이터(예컨대, RNAseq 또는 cDNA 또는 RNA 어레이를 통해 수득됨)에 부가적으로 또는 이에 대한 대체로 모델 및 모델링 시스템으로의 입력 데이터로 채택될 수 있다.

특히 cfRNA가 경시적으로 정량되는 경우, 일반적으로 동일한(그리고 일부 경우 새로 확인된) cfRNA의 1회 초과 측정이 수행되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 경시적으로 다회 측정이 특정 마커 유전자를 표적으로 하는 치료 효과의 모니터링에 유익할 수 있다. 따라서, 이러한 측정은 치료 전에/동안 및/또는 후에 수행될 수 있다. 다양한 다른 장점 중에서, 고려되는 시스템 및 방법의 사용은 표적 서열이 이미 사전-확인되어 있고 표적 cfRNA가 생검의 필요성 없이 단순 혈액 평가를 사용해서 쉽게 조사될 수 있으므로 환자의 치료 모니터링 및 심지어 장기 추적을 단순화함이 이해되어야 한다. 이는 미세-전이가 존재하는 경우 또는 종양 또는 전이가 생검을 배제하는 위치에 있는 경우 특히 유리하다.

추가 고려사항, 적합한 cfRNA, 및 방법은 일련 번호 PCT/US18/22747, PCT/US18/30472, 및 PCT/US18/31764를 갖는 본 발명자들의 공동 계류 중인 국제 특허 출원에 기재되어 있다.

실시예

전혈로부터 cfRNA의 단리: 정맥천자에 의해 전혈을 수득하고 각각 RNA 또는 DNA 안정화제를 함유하는 무세포 RNA BCT® 튜브 또는 무세포 DNA BCT® 튜브(Streck Inc.,7002 S. 109^th St., La Vista NE 68128) 내로 10 ㎖를 수집하였다. 이어서 샘플 튜브를 20분 동안 1,600 rcf에서 원심분리하고, 혈장을 빼내고, 10분 동안 16,000 rcf에서 추가 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다. cfRNA를 단리하기 위해 혈장이 사용되었고, 약간의 변형을 포함해서 제조업체의 프로토콜에 따라 상업적으로 이용 가능한 RNA 단리 키트를 사용하였다. 구체적으로, 칼럼-상 DN아제 소화로 샘플로부터 DNA를 제거하였다.

대안적 접근에서는, 요망되는 경우 DNA 제거를 수용하기 위해 약간 변형된 QiaSymphony 기기(Qiagen, 19300 Germantown Road; Germantown, MD 20874) 상의 로보틱 추출 방법을 사용하여 자동화된 방식으로 cfRNA를 또한 수득하였다. 로보틱 추출은 cfRNA 샘플에서 대략 12% DNA 오염을 유지하였다. 본 발명자들은 동일한 21개 NSCLC 샘플에서 베타 액틴 대비 ERCC1(절제 복구 교차-상보적 효소(Excision Repair Cross-Complementing enzyme))의 상대 발현을 측정하여 2개의 추출 절차 간에 유의미한 차이가 존재하는지의 여부를 결정하였다. 특히, 아래의 표에 나타낸 바와 같이 자동화 공정 및 수동 공정에 의해 생성된 상대 발현에서 통계적 차이는 존재하지 않았다. Qiagen의 맞춤 키트(QiaSymphony 순환 NA 키트 #1074536)에는 하나의 맞춤 키트에 2개의 바이러스 추출 키트가 포함되었다(바이러스 키트는 QiaSymphony DSP 바이러스/병원체 Midi 키트 버전 1 #937055로 불림). 분석은 Qiagen 기기 상의 단일, 전용 프로그램(맞춤 프로그램 프로토콜 CF 2000S_CR21040_ID993; Qiagen) 내에서 수행하였다.

cfRNA의 정량: 달리 주지되지 않는 한, 내부 대조군으로서의 베타-액틴에 대한 프라이머 페어와 함께 유전자 특이적 프라이머 페어 및 rtPCT를 통한 상대 정량을 사용하여 정량을 수행하였다. 예를 들어, 2 ㎕ cDNA, 프라이머 및 프로브를 함유하는 10 ㎕ 반응 혼합물 중에서 검정을 사용하여 증폭을 수행하였다. ct-cDNA의 투입 수준에 대한 내부 표준으로 β-액틴을 사용할 수 있다. 알려진 농도의 분석물질 각각을 함유하는 샘플의 표준 곡선뿐만 아니라 각각의 유전자에 대한 양성 및 음성 대조군을 각각의 PCR 플레이트에 포함시켰다. 핵산을 함유하는 매트릭스 튜브 상에서 2D 바코드를 스캐닝하여 시험 샘플을 확인하였다. 각 개별 환자의 혈액 샘플에 대해 β-액틴의 Ct 값이 감산된 각각의 분석물질에 대한 정량적 PCR(qPCR) 증폭으로부터 유도된 Ct 값으로부터 델타 Ct(dCT)를 계산하였다. 유전자 발현 값 10으로 설정된 유니버설 인간 참조 RNA의 연속 희석액의 델타 Ct의 표준 곡선을 사용하여 환자 시료의 상대 발현을 계산하였다(델타 CT를 각 분석물질의 log 농도에 대해 도식화했을 경우). 유사한 방식으로 ctDNA를 분석하였다.

각각의 유전자 시험에 있어서 델타 Ct 대 log₁₀ 상대 유전자 발현(표준 곡선)을 수백 개의 PCR 반응 플레이트에 걸쳐 포획하였다(이력 반응). 선형 회귀 분석을 각각의 검정에 대해 수행하고 이후 진행되는 원래 표준 곡선의 단일 지점으로부터 유전자 발현을 계산하는 데 사용하였다.

검정 파라미터 - 정확도: 본 발명의 PD-L1 검정("LiquidGeneDx")에 의해 생성된 결과를 디지털 PCR PD-L1 검정(실험실 개발 참조 방법, 대안적 PD-L1 검출 검정)에 대해 61개의 임상 샘플로부터 비교하여 예시적인 PD-L1 발현 검정의 정확도를 결정하였다. 결과를 사용하여 검정의 임상적 민감도 및 임상적 특이성을 결정하였다. 본 발명의 PD-L1 검정 및 디지털 PCR PD-L1 검정에 의한 정확도 결과를 표 1에 요약한다.

검정 파라미터 - 검출 한계(LOD): 본 발명의 PD-L1 검정("LiquidGeneDx")의 분석 민감도를 20개 반복물에 의해 95% 검출률로 결정하였다. cfRNA를 환자의 혈장으로부터 추출하고, 랜덤 헥사머를 사용하여 cDNA로 역전사하고, 제조업체의 지침에 따라 10 사이클 동안 PD-L1 및 베타-액틴 프라이머를 함유하는 Thermo Fisher의 사전-증폭 제품 Taqman® Preamp 마스터 혼합물을 사용하여 사전-증폭하였다. 생성된 사전-증폭 cDNA를 PD-L1에 대해 음성인 환자의 혈장으로부터의 cDNA로 2배 증분하여 희석하였다. 증폭 및 성공적인 PCR을 위해 요구되는 최소량의 PD-L1 cDNA에 대한 LiquidGeneDx에 의해 모든 희석 샘플을 검사하였다. 이어서 추정 LOD 수준에서 20개 반복물을 사용하여 최종 LOD를 확인하였다. 상기 연구에서 검출 한계(LOD) 허용 기준은 20개 반복물 모두가 95% 초과 검출률을 생성하는 최저 농도로 결정하였다. 20개 반복물이 95% 초과 검출률을 생성할 수 없는 경우, 그 다음으로 높은 희석 샘플의 농도를 추정 LOD로 사용하여 20개 반복물로 반복실험하였다. LOD 연구 결과의 요약을 표 2에 나타내며, 여기서 *는 최종 LOD를 표시한다.

검정 파라미터 - 선형 범위: cfRNA로부터 PD-L1-양성 환자의 cDNA를 풀링된 음성 매트릭스(cfRNA로부터의 PD-L1-음성 cDNA) 내로 희석하여 본 발명의 PD-L1 검정("LiquidGeneDx")의 정량적 선형 범위를 결정하였다. ct RNA를 환자의 혈장으로부터 추출하고, 랜덤 헥사머를 사용하여 cDNA로 역전사하고, 제조업체의 지침에 따라 10사이클 동안 PD-L1 및 베타-액틴 프라이머를 함유하는 Thermo Fisher의 사전-증폭 제품 Taqman® Preamp 마스터 혼합물을 사용하여 사전-증폭하였다. 생성된 사전-증폭 cDNA를 PD-L1에 대해 음성인 환자의 혈장으로부터의 cDNA로 2배 증분하여 희석하였다. 모든 희석 샘플을 LiquidGeneDx PD-L1에 의해 검사하여 그 정량적 선형 범위를 결정하였다. 선의 선형 부분은 대략 32.5의 Ct까지 연장되었다. 베타-액틴 및 PD-L1 경사도는 일치하였다.

환자: 다양한 치료법 하에 대략 6주 간격으로 환자로부터 채혈하였고, 3개월 간격으로 CT 스캔을 수행하였다. 총 cfRNA를 환자 혈장으로부터 추출하여 cDNA로 역전사하였다. β-액틴, ERCC1 및 PD-L1의 수준을 RT-qPCR에 의해 다회 채혈에 걸쳐 정량하고, CT 스캔에 의해 결정되는 환자 반응(PR/SD/PD)과 연관시켰다.

결과: 총 24명의 NSCLC 환자가 1년 임상 연구에 등록하였다. 비-SCC가 87%(21/24명)를 차지하였다. 19명의 환자가 처음 2회의 치료법을 완료하였다. PR을 갖는 1명의 환자가 감소하는 수준의 cfRNA를 가졌고, 10명의 환자가 감소하거나 변화 없이 SD를 달성한 반면, PD를 갖는 6/8명의 환자는 증가하는 수준의 cfRNA를 가졌다. CfRNA 수준은 6/19명의 환자에서 조영 약 4주 전 질병 상태를 예측하였고, 8/19명의 환자에서 질병 상태와 매치되었다(74% 일치도). PD-L1 발현의 동적 변화는 3/4명의 환자에서 니볼루맙에 대한 반응과 연관되었다. SD를 갖는 2/4명의 환자에서, PD-L1은 치료법 후 검출되지 않고 유지된 반면, 1명의 환자는 PD-L1의 손실에도 불구하고 계속 PD를 가졌다. PD-L1은 니볼루맙 치료 상에서 최초에 PD를 가진 환자에서는 검출 불가능하였고 이 환자는 니볼루맙과 방사선으로 1회 치료 후 SD를 달성하였다. ERCC1 발현 변화는 8/8명의 환자에서 백금계 치료법 결과와 연관되었다. 페메트렉시드/카보플라틴 치료 중에 있는, PD를 가진 4/4명의 환자는 ERCC1의 증가를 가졌다. 더 낮거나 감소하는 수준의 ERCC1을 갖는 4/4명의 환자는 PR 또는 SD를 달성하였다. PR을 달성한 유일한 환자에서, 치료 동안 ERCC1이 검출 불가능해졌다.

도 1은 상대 ERCC1 cfRNA 발현에 의한 백금계 치료(여기서는 카보플라틴 치료)에 대한 환자 치료 반응을 도시하는 그래프이다. 그래프로부터 쉽게 알 수 있듯이, 부분 반응군 및 안정한 질병군은 서로 뿐만 아니라 질병 진행으로부터 통계적으로 유의미하게 구별 가능했다. 도 2는 PR, SD, 및 PD의 함수로서 미가공 데이터 및 중앙값 발현을 도시하는 그래프인 반면, 도 3은 추가 데이터 및 분석을 제공한다. 당연히, 상기 표시인자의 검출 및/또는 정량이 cfRNA 검출/정량에 제한될 필요는 없지만, 분석에는 또한 ERCC1 및/또는 PD-1 신호전달을 포함하는 경로가 (탈)활성화를 위해 조사되는 경로 분석이 포함될 수 있음이 또한 이해되어야 한다. 마찬가지로, 추가적인(또는 대안적인) 분석에는 단백질 분석, 그리고 특히 정량적 단백질 분석, 예컨대 질량 분광측정 분석(예컨대, 선택적 반응 모니터링 및 이의 변형)이 포함될 수 있다.

추가 연구에서, 다양한 치료법(체크포인트 억제제와 함께 백금계 치료법 및 면역 치료법) 하에 대략 6주 간격으로 환자로부터 채혈하였고, 3개월 간격으로 CT 스캔을 수행하였다. 총 cfRNA를 환자 혈장으로부터 추출하고 cDNA로 역전사하였다. β-액틴, ERCC1 및 PD-L1의 수준을 RT-qPCR에 의해 다회 채혈에 걸쳐 정량하고, CT 스캔에 의해 결정되는 환자 반응(PR/SD/PD)과 연관시켰다.

총 29명의 NSCLC 환자가 1년 임상 연구에 등록하였다. 비-SCC가 86%(25/29명)를 차지하였다. 23명의 환자가 처음 2회의 치료법을 완료하였다. PR을 갖는 2/3명의 환자가 감소하는 수준의 cfRNA를 가졌고, 10명의 환자가 감소하거나 변화 없이 SD를 달성한 반면, PD를 갖는 7/9명의 환자가 증가하는 수준의 cfRNA를 가졌다. CfRNA 수준은 7/23명의 환자에서 조영 약 4주 전 질병 상태를 예측하였고, 10/23명의 환자에서 질병 상태와 매치되었다(74% 총 일치도). PD-L1 발현의 동적 변화는 6/7명의 환자에서 면역치료법에 대한 반응과 연관되었다. SD를 갖는 2명의 환자에서, PD-L1은 치료법 후 검출되지 않고 유지된 반면, 1명의 환자는 PD-L1의 손실에도 불구하고 PD를 나타내었다. PD-L1은 PD를 갖는 또 다른 환자에서 증가하였고 PR을 갖는 2명의 환자에서 감소하였다. ERCC1 발현 변화는 9/10명의 환자에서 백금계 치료법 결과와 연관되었다. 카보플라틴/페메트렉시드 치료 중에 있는, 4/5명의 PD 환자는 ERCC1의 증가를 가졌고; 더 낮거나 감소하는 ERCC1을 갖는 5/5명의 환자는 PR 또는 SD를 달성하였다.

도면으로부터 쉽게 알 수 있듯이, ERCC1 cfRNA의 양은 경시적으로 다이내믹하게 변화하였고 진행성 질병을 경험하는 실질적으로 모든 환자에서 ERCC1 cfRNA의 유의미한 증가를 가졌다. 반대로, ERCC1 cfRNA는 도 4에 나타낸 바와 같이 안정한 질병 또는 적어도 부분 반응을 경험하는 실질적으로 모든 환자에서 유의미하게 감소하였다. 변화의 통계 분석을 도 5의 그래프에 나타내며, 여기서 ERCC1 cfRNA의 동적 변화가 시사된 바와 같이 질병 상태와 연관됨이 매우 자명하다. 특히, ERCC1 cfRNA의 양의 변화는 진행성 질병과 연관된 반면, ERCC1 cfRNA의 음의 변화는 부분 반응과 연관되었다. 질병 상태가 안정한 질병인 경우, 유의미한 변화는 전반적으로 관찰되지 않았다.

예를 들어, 질병 상태가 부분 반응인 경우, ERCC1 cfRNA의 상대 발현(전형적으로 베타-액틴 대비)은 2.0 이하, 또는 1.8 이하, 또는 1.5 이하, 또는 1.3 이하이다. 질병 상태가 안정한 질병인 경우, ERCC1 cfRNA의 상대 발현(전형적으로 베타-액틴 대비)은 1.5 내지 2.0, 또는 2.0 내지 2.5, 또는 1.8 내지 2.8, 또는 2.0 내지 2.8, 또는 2.2 내지 2.6, 또는 2.2 내지 3.0, 또는 2.5 내지 3.5이다. 상이한 관점으로부터, ERCC1 cfRNA의 상대 발현(전형적으로 베타-액틴 대비)은 전형적으로 1.8 초과, 또는 2.0 초과, 또는 2.4 초과, 또는 2.6 초과, 또는 2.8 초과, 그러나 4.0 미만, 또는 3.8 미만, 또는 3.6 미만, 또는 3.3 미만, 또는 3.0 미만이다. 반면에, 질병 상태가 진행성 질환인 경우, 상대 발현은 전형적으로 3.2 이상, 또는 3.4 이상, 또는 3.8 이상, 또는 4.0 이상, 또는 4.3 이상, 또는 4.5 이상, 또는 4.7 또는 그 초과 이상이다.

유사하게, ERCC1 cfRNA 수준이 경시적으로 측정되는 경우, 적어도 +3, 또는 적어도 +5, 또는 적어도 +7, 또는 적어도 +10, 또는 적어도 +12의 발현 수준(ng/혈장 ㎖)의 차이는 진행성 질병을 시사하는 반면, -1 미만, 또는 -2 미만, 또는 -3 미만, 또는 -5 미만, 또는 -10 x 미만의 발현 수준(ng/혈장 ㎖)의 차이는 적어도 부분 반응을 시사한다. 반면, -1 내지 +1, 또는 -3 내지 +3, 또는 -3 내지 +2, 또는 -5 내지 +1, 또는 -7 내지 0, 또는 -10 내지 0의 발현 수준(ng/혈장 ㎖)의 차이는 안정한 질병을 시사한다. 이러한 변화는 전형적으로 적어도 1개월, 또는 적어도 3개월, 또는 적어도 6개월, 또는 적어도 1년에 걸쳐 관찰된다. 상이한 관점으로부터, 이러한 동적 변화는 전형적으로 치료 시작 및 완결 간에 관찰된다.

이들 환자를 또한 PD-L1 cfRNA 발현 수준에 대해 평가한 경우, PD-L1 cfRNA에 대한 상대 발현 수준이 도 6에서 2명의 환자에 대해 나타낸 바와 같이 긍정적인 치료 반응과 연관됨이 관찰되었다. 여기서, PD-L1 cfRNA의 감소는 부분 반응과 강력히 연관되었다.

따라서, 암, 특히 폐암에 대한 질병 상태가 상대 ERCC1 cfRNA 발현의 정량에 의해서 뿐만 아니라 ERCC1 cfRNA 발현에서의 동적 변화에 의해 백금계 약물(예컨대 카보플라틴, 시스플라틴 등)로의 치료 전에, 동안 및 후에 확인될 수 있음이 인식되어야 한다. 유사한 결과가 PD-L1 cfRNA에 대해 수득되었다. 따라서, cfRNA에서 ERCC1 및 PD-L1 발현이 백금계 치료법 및 면역-치료법에 대한 반응을 모니터링하기 위해 사용될 수 있음이 주지되어야 한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 소정 구현예를 설명하고 청구하기 위해 사용되는, 성분의 양, 특성, 예컨대 농도, 반응 조건 등을 표현하는 수치는 일부 경우 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 일부 구현예에서, 기재된 설명 및 첨부된 청구범위에 나타낸 수치 파라미터는 특정 구현예에 의해 수득이 요망되는 특성에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 일부 구현예에서, 수치 파라미터는 보고된 유효 숫자의 수의 견지에서 그리고 일반 반올림 기법을 적용하여 고려되어야 한다. 본 발명의 일부 구현예의 넓은 범위를 나타내는 수치 범위 및 파라미터에도 불구하고, 특정 예에 나타낸 수치 값은 실시 가능하도록 정밀하게 보고된다. 본 발명의 일부 구현예에 나타낸 수치 값은 이의 각각의 평가 측정에서 확인되는 표준 편차에서 반드시 생기는 소정 오차를 포함할 수 있다.

본원의 설명에서 그리고 후술되는 청구범위를 통해 사용된 바와 같이, 정관사 및 부정관사("a", "an" 및 "the")의 의미에는 문맥 상 명확히 달리 나타내지 않는 한 복수의 참조물이 포함된다. 또한, 본원의 설명에서 사용된 바와 같이, "에서"의 의미에는 문맥 상 명확히 달리 나타내지 않는 한 "에서" 및 "상에서"가 포함된다. 문맥 상 반대로 나타내지 않는 한, 본원에 나타낸 모든 범위는 이의 종결점을 포함하는 것으로 해석되어야 하며, 개방-말단 범위는 상업적으로 실용적인 값을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 유사하게, 값의 모든 목록은 문맥 상 반대로 나타내지 않는 한 중간 값을 포함하는 것으로 고려되어야 한다.

이미 기재된 것들 외에 다수의 더 많은 변형이 본원에서 본 발명의 개념으로부터 벗어나지 않고 가능하다는 점이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 첨부되는 청구범위의 범위를 제외하고, 본 발명의 주제는 제한되지 않는다. 또한, 명세서 및 청구범위 둘 모두의 해석에 있어서, 모든 용어는 맥락과 일치하는 가장 광의의 가능한 방식으로 해석되어야 한다. 특히 용어 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"은 언급되는 요소, 성분, 또는 단계가 명시적으로 언급되지 않는 다른 요소, 성분, 또는 단계와 함께 존재하거나, 이용되거나, 조합될 수 있음을 시사하는 비-배타적 방식으로 요소, 성분, 또는 단계를 언급하는 것으로 해석되어야 한다. 명세서의 청구범위가 A, B, C .... 및 N으로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 것 중 적어도 하나를 언급하는 경우, 텍스트는 A + N, 또는 B + N 등이 아닌, 군으로부터의 하나의 요소만을 청구하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

백금계 약물로 치료를 받는 환자에서 암의 질병 상태에 대한 임상 반응을 모니터링하거나 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법으로서,
암으로 진단받은 환자의 체액에서 ERCC1 cfRNA의 상대 발현을 정량하는 단계를 포함하며;
질병 상태가 안정한 질병 상태, 부분 반응 상태, 및 완전 반응 상태를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 암이 폐암인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, ERCC1 cfRNA의 상대 발현이 베타-액틴 RNA 또는 유니버설 인간 참조 RNA 대비 정량되는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, ERCC1 cfRNA의 상대 발현이 안정한 질병 상태를 시사하는 수준 초과인 경우 표시를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제4항에 있어서, 표시로 백금계 약물로의 치료에 대한 내성 또는 반응의 부재가 예측되는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, ERCC1 cfRNA의 상대 발현이 안정한 질병 상태를 시사하는 수준 이하인 경우 표시를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제6항에 있어서, 표시는 백금계 약물로의 치료에 대한 부분 반응 상태 또는 완전 반응 상태로서 예측되는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 암으로 진단받은 환자의 체액에서 PD-L1 cfRNA의 상대 발현을 정량하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제8항에 있어서, 환자가 추가로 체크포인트 억제제로의 치료를 받는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, ERCC1 cfRNA의 상대 발현을 정량하는 단계의 적어도 1주 후, 체액에서 ERCC1 cfRNA의 상대 발현을 정량하는 두 번째 단계를 추가로 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 체액에서 ERCC1 cfRNA의 상대 발현을 정량하는 단계를 사용하여 ERCC1 cfRNA의 다이내믹 변화를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상대 발현이 1.5 이하인 경우 질병 상태가 부분 반응 상태인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상대 발현이 1.8 내지 2.8인 경우 질병 상태가 안정한 질병 상태인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상대 발현이 3.8 이상인 경우 질병 상태가 진행성 질병 상태인 방법.
제1항에 있어서, ERCC1 cfRNA의 상대 발현이 베타-액틴 RNA 또는 유니버설 인간 참조 RNA 대비 정량되는 방법.
제1항에 있어서, ERCC1 cfRNA의 상대 발현이 안정한 질병 상태를 시사하는 수준 초과인 경우 표시를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제16항에 있어서, 표시로 백금계 약물로의 치료에 대한 내성 또는 반응의 부재가 예측되는 방법.
제1항에 있어서, ERCC1 cfRNA의 상대 발현이 안정한 질병 상태를 시사하는 수준 이하인 경우 표시를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제18항에 있어서, 표시는 백금계 약물로의 치료에 대한 부분 반응 상태 또는 완전 반응 상태로서 예측되는 방법.
제1항에 있어서, 암으로 진단받은 환자의 체액에서 PD-L1 cfRNA의 상대 발현을 정량하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제20항에 있어서, 환자는 추가로 체크포인트 억제제로의 치료를 받은 방법.
제1항에 있어서, ERCC1 cfRNA의 상대 발현을 정량하는 단계의 적어도 1주 후, 체액에서 ERCC1 cfRNA의 상대 발현을 정량하는 두 번째 단계를 추가로 포함하는 방법.
제22항에 있어서, 체액에서 ERCC1 cfRNA의 상대 발현을 정량하는 단계를 사용하여 ERCC1 cfRNA의 다이내믹 변화를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상대 발현이 1.5 이하인 경우 질병 상태가 부분 반응 상태인 방법.
제1항에 있어서, 상대 발현이 1.8 내지 2.8인 경우 질병 상태가 안정한 질병 상태인 방법.
제1항에 있어서, 상대 발현이 3.8 이상인 경우 질병 상태가 진행성 질병 상태인 방법.
백금계 약물로 치료를 받는 환자에서 암의 질병 상태에 대한 임상 반응을 모니터링하거나 예측하기 위한 용도를 가지는 ERCC1 cfRNA로서, ERCC1 cfRNA가 환자의 체액 샘플에서 생체외 정량적으로 측정되며, 질병 상태가 안정한 질병 상태, 부분 반응 상태, 및 완전 반응 상태를 포함하는, ERCC1 cfRNA.
제27항에 있어서, 암이 폐암인, ERCC1 cfRNA.
제27항 또는 제28항에 있어서, 백금계 약물이 카보플라틴인, ERCC1 cfRNA.
제27항 또는 제28항 중 어느 한 항에 있어서, ERCC1 cfRNA가 적어도 하나의 참조 유전자의 발현 대비 상대 발현으로 정량적으로 측정되는, ERCC1 cfRNA.
제27항 또는 제28항 어느 한 항에 있어서, 환자의 체액 샘플에서 PD-L1 cfRNA를 생체외 정량적으로 측정하는 단계를 추가로 포함하는, ERCC1 cfRNA.
제31항에 있어서, 환자는 체크포인트 억제제로의 치료를 받은, ERCC1 cfRNA.