JP2019187413A - ループス腎炎の検出またはそのリスクを予測する方法およびその応用 - Google Patents

Abstract

【課題】ループス腎炎の検出またはその罹患リスクを予測する方法を提供する。【解決手段】本発明の方法は、ループス腎炎の罹患が疑われる対象からサンプルを取得し、体外試験により前記サンプルの少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するステップと、前記サンプルの前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルがループス腎炎を罹患していない対象から取得したサンプルの対応するｍｉＲＮＡの発現レベルより低い場合、前記ループス腎炎の罹患が疑われる対象がループス腎炎を罹患または罹患するリスクが有ることを判断するステップと、を含む。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年４月２３日に出願された米国特許出願番号第６２／６６１４４９号の利益を主張し、その開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、ループス腎炎の検出またはそのリスクを予測する方法、およびその応用に関する。

全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ 、ＳＬＥ）は、出産年齢の女性によく発症する自己免疫疾患である。患者によって症状は異なるが、中枢神経系、心臓、肺、腎臓などの主要な臓器系に達すると致命的になることがある。この状況は、ループス腎炎と呼ばれる。ループス腎炎は、泡立った尿（ｆｏａｍｙ ｕｒｉｎｅ）および下肢浮腫などの症状を引き起こし、その他にも口腔潰瘍、関節痛（ａｒｔｈｒａｌｇｉａ）、関節炎（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、リンパ節腫脹（ｌｙｍｐｈａｄｅｎｏｐａｔｈｙ）や発疹（ｒａｓｈｅｓ）などの全身症状を引き起こす。

しかし、これらの症状は軽度且つ非特異的症状である場合がある。これらの症状が検出されず、治療が遅れると、１０％近くのループス腎炎患者が不可逆的な腎障害または末期腎疾患を発症する可能性がある。全身性エリテマトーデス患者では、ループス腎炎を引き起こす可能性が高く、死亡に至る主な原因である。ループス腎炎を検出して早期治療が成功すると、腎不全に至るリスクが大幅に減らすことができる。したがって、正確な検出と早期治療は、ループス腎炎の有効管理において非常に重要である。伝統的なループス腎炎の診断は、患者の症状を観察した医師の判断にのみ依存しているが、最近では、わずかの少数のサイトカインに基づくバイオマーカープラットフォームが開発された。さらに、多くの感染症がループス腎炎に似た症状を発現するため、ループス腎炎の診断が複雑になり、ループス腎炎の最適な治療時期を見逃す可能性がある。

以前の研究は、血液内のマイクロＲＮＡが疾患のバイオマーカーとして機能し得ることが見出されている。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、長さが典型的には２１〜２５ヌクレオチドであり、タンパク質翻訳の阻害またはｍＲＮＡの劣化を促進するように、ｍＲＮＡの３末端の非コード領域（３’−ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ， ３’−ＵＴＲｓ）に結合することによって作用する、進化的に保存された非コードＲＮＡ分子である（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ Ｓ （２００４）． Ｔｈｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２： Ｄ１０９−１１１を参照）。しかし、現在のｍｉＲＮＡバイオマーカーに関する研究は、臨床診断にはあまり応用されていない。したがって、ｍｉＲＮＡを使用するループス腎炎を早期検出および確認する診断方法を開発する需要が満たされてないため、本発明はこの需要および他の需要を満たすことを課題とする。

前記課題に基づいて、本発明の目的は、ループス腎炎の罹患を検出、またはその罹患リスクを予測して治療遅延を避けるように、ループス腎炎の検出またはその罹患リスクを予測する方法を提供することである。

一実施例において、本発明はループス腎炎の検出またはその罹患リスクを予測する方法を提供する。その方法は、（Ａ）ループス腎炎の罹患が疑われる対象からサンプルを取得し、体外試験により前記サンプルの少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するステップと、（Ｂ）前記サンプルの前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルがループス腎炎を罹患していない対象から取得したサンプルの対応するｍｉＲＮＡの発現レベルより低い場合、前記ループス腎炎の罹患が疑われる対象がループス腎炎を罹患または罹患するリスクが有ることを判断するステップと、を含み、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ−１２５ａ−５ｐ、およびｍｉＲＮＡ−２２１−３ｐからなる群から選択される。

好ましくは、前記測定ステップは、ｍｉＲＮＡ−１４６ａ−５およびｍｉＲＮＡ−１２５ａ−５ｐの発現レベルを測定することを含む。

好ましくは、前記ｍｉＲＮＡの発現レベルは、リアルタイムＰＣＲ法によって測定する。

好ましくは、前記ｍｉＲＮＡの発現レベルは、前記ｍｉＲＮＡに特定されるオリゴヌクレオチドプローブによって測定する。

好ましくは、前記サンプルは、生物検体、血液、血漿、血清、リンパ液、骨髄、唾液またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。

本発明は、治療薬候補がループス腎炎を罹患する細胞を抑制することをスクリーニングするインビトロ方法をさらに提供する。その方法は、（Ａ）治療薬候補がループス腎炎を罹患する１つまたは複数の細胞に接触する前に、前記細胞の少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するステップと、（Ｂ）前記治療薬候補が前記ループス腎炎を罹患する１つまたは複数の細胞に接触した後に、前記細胞が前記ステップ（Ａ）に対応するｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するステップと、を含み、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ−１２５ａ−５ｐ、およびｍｉＲＮＡ−２２１−３ｐからなる群から選択され、前記治療薬候補が前記ループス腎炎を罹患する１つまたは複数の細胞に接触した後の前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルが、前記治療薬候補が前記ループス腎炎を罹患する１つまたは複数の細胞に接触する前の前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルより増加する場合、前記治療薬候補がループス腎炎の治療に有効であることを判断する。

本発明は、治療を必要とする対象のループス腎炎を抑制するための治療の有効性を判断する方法をさらに提供する。その方法は、（Ａ）対象に少なくとも１つの治療を提供する前に、前記対象から第一サンプルを取得し、前記第一サンプルの少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルをインビトロ方法によって測定するステップと、（Ｂ）前記対象に少なくとも１つの前記治療を提供した後に、前記対象から第二サンプルを取得し、前記第二サンプルの前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルをインビトロ方法によって測定するステップと、を含み、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ−１２５ａ−５ｐ、およびｍｉＲＮＡ−２２１−３ｐからなる群から選択され、前記第二サンプルの前記ｍｉＲＮＡの発現レベルが前記ステップ（Ａ）に対応するｍｉＲＮＡの発現レベルより増加する場合、前記治療がループス腎炎に有効であることを判断する。

本明細書に使用される単数形「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、複数形の指示対象をも含むものとする（すなわち、少なくとも１つ）。

特許請求の範囲において、「または（ｏｒ）」という用語は一般に、その内容が別途明らかに示されていない限り、本開示には「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を含む意味において用いられる。

本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（および含むの任意の形態、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（および有するの任意の形態、例えば「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（および含むの任意の形態、例えば「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」）または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（および含有するの任意の形態、例えば「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」）という用語は、包含的または非限定的であり、追加の、記載されていない要素または方法工程を除外しない。

本明細書に使用される交換可能な用語「マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）」、「ｍｉＲ」または「ｍｉＲＮＡ」は、加工されていない（例えば、前駆体）、または加工された（例えば、成熟（ｍａｔｕｒｅ））ＲＮＡから転写して形成したｍｉＲ遺伝子である。マイクロＲＮＡは、真核生物における遺伝子発現を負に調節し、新規クラスの遺伝子調節因子を構成する内因性の非コード一本鎖ＲＮＡである（Ｃｈｕａ， ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． １１：１８９−１９９）。それぞれのｍｉＲＮＡは、さまざまな生物で既に同定および配列決定され、命名されている。本明細書では、ｍｉＲＮＡの名前とその配列を提供する。

本明細書の全体にわたって、すべての数値は「約（ａｂｏｕｔ）」で修飾された値として理解されるであろう。本文に使用される「約」は、±１０％の誤差を含むことを示す。

「より高い（ｈｉｇｈｅｒ）」または「より低い（ｌｏｗｅｒ）」ｍｉＲＮＡ発現レベルは、相対的な用語であり、既知のループス腎炎が罹患していない対象のデータベース（すなわち、コントロール対象）におけるｍｉＲＮＡの発現レベルと比較することによって確定することができる。

本明細書で使用される「試験サンプル」という用語は、ｍｉＲＮＡを含むサンプルを指す。このサンプルは、目的のｍｉＲＮＡの存在および／または発現レベルを検出するように使用されることができる。任意の細胞、細胞集団、細胞断片または細胞産物は、本発明が主張する発明の方法を使用することができるが、ｍｉＲＮＡの発現レベル差別を含む体液または器官は最適である。いくつかの実施例において、試験サンプル（例えば、血液またはその成分など）は、比較的容易に入手可能なものである。試験サンプルの非限定的な例は、生物検体（腎臓サンプル）、体液（例えば、血液、血清、血漿、リンパ液、唾液、または脳脊髄液）、骨髄、細胞（例えば、血球）、および組織（例えば、腎臓組織）である。

他の実施例では、予後または診断用ｍｉＲＮＡレベルの閾値変化の程度を確立することができ、患者試験サンプル中の指標物レベルの変化程度を閾値レベルの変化程度と簡単に比較することができる。本開示の発明のｍｉＲＮＡ発現レベルにおける好ましい閾値レベルの変化は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約５０％、約６０％、約７５％、約１００％および約１５０％である。

ｍｉＲＮＡ発現レベルの測定は、サンプル中に存在するｍｉＲＮＡの量を定量することである。特定または任意のｍｉＲＮＡ発現レベルの測定は、当分野に周知または本文に開示される方法、例えばリアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロット分析などによって達成することができる。ｍｉＲＮＡ発現レベルの測定は、成熟形態のｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡに関連する前駆体形態の発現レベルを含む。

特定の実施例において、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルはノーザンブロット分析法によって定量化される。例えば、全細胞ＲＮＡは、核酸抽出緩衝液の存在下で均質化され、そして遠心分離によって細胞から精製することができる。核酸を沈殿させ、ＤＮＡをＤＮａｓｅで除去して沈殿させる。次に、ＲＮＡ分子を標準技術に従ってアガロースゲル上でのゲル電気泳動により分離し、そしてニトロセルロースフィルターに移す。ＲＮＡは加熱によってフィルター上に固定される。特定のＲＮＡの検出および定量化は、研究中のＲＮＡに相補的な適切なマーカーＤＮＡまたはＲＮＡプローブの使用によって達成される。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋら、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年、第７章を参照し、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、マイクロアレイを使用することが望ましい。マイクロアレイは、核酸、タンパク質、小分子、細胞、または他の物質の微視的に整列されるアレイであり、複雑な生化学サンプルの並行分析を可能にするものである。この技術は、既知の配列情報が知られているオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをプローブとして提供することにより、サンプル中の相補鎖を発見してそれとハイブリダイズして、選択的結合によって相補鎖を捕捉する。プローブは、標的ｍｉＲＮＡに対して少なくとも一部の相補的または実質的に相補的なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含む。「相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」とは、２つの核酸鎖の領域間の配列相補性の広い概念を指す。残基がチミンまたはウラシルである場合、第一核酸領域のアデニン残基は、第一領域に対して逆平行である第二核酸領域の残基と特異的水素結合（「ベースペアリング」（ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ））を形成し得ることが知られている。同様に、残基がグアニンである場合、第一核酸領域のシトシン残基は、第一領域に対して逆平行である第二核酸領域の残基と塩基対合することができることが知られている。核酸の第一領域は、同一または異なる核酸の第二領域と相補的であり、２つの領域が逆平行に配置されている場合、第一領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基は第二の領域の残基塩基と対合し得る。好ましくは、第一領域は第一部分を含み、第二領域は第二部分を含み、第一部分および第二部分が逆平行に配置される場合、第一部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも７５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が第二部分のヌクレオチド残基と塩基対合することができる。より好ましくは、第一部分のすべてのヌクレオチドが、第二部分のヌクレオチド残基と塩基対合する。

ｍｉＲＮＡのマイクロアレイ分析は、例えば当該分野で公知の任意の方法に従って達成し得る。一実施例では、ＲＮＡは白血球細胞またはサンプルの細胞から抽出され、低分子量ＲＮＡ（１８〜２６ヌクレオチド）は変性ポリプロピレングアナミンゲル電気泳動を用いて全ＲＮＡからサイズによって分離される。オリゴヌクレオチドリンカーを小分子ＲＮＡの５’および３’末端に連結し、得られた連結産物を１０サイクルのＲＴ−ＰＣＲ反応の増幅鋳型として使用する。センス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）ＰＣＲプライマーはその５’末端に結合した発蛍光団を有し、したがって蛍光マーカーはＰＣＲ産物のセンス鎖をマークする。次いでＰＣＲ産物を変性させ、そしてマイクロアレイにハイブリダイズさせる。アレイ上の対応するｍｉＲＮＡ捕捉プローブの配列に相補的な標的核酸のＰＣＲ産物は、塩基対合によって捕捉プローブを固定化する点とハイブリダイズする。マイクロアレイレーザースキャナーを使用して励起すると、その点は蛍光を発する。次に、特定のｍｉＲＮＡの発現レベルを評価するために、多数の正および負の対照ならびにアレイデータ正規化法を用いて、各点の蛍光強度を特定のｍｉＲＮＡのコピー数に基づいて評価する。本明細書中に開示されるｍｉＲＮＡに関して、プローブは標的ｍｉＲＮＡまたはポリヌクレオチド配列に対して１００％相補的であり得る。しかしながら、プローブが標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し、そしてサンプルから捕捉できる限り、プローブは標的ポリヌクレオチドの全長に沿って標的ポリヌクレオチドに完全に相補的である必要はない。

いくつかの実施例では、定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用することが望ましい。定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）は、ポリメラーゼ連鎖反応生成物の量を迅速に決定するための改良型ポリメラーゼ連鎖反応である。ｑＲＴ−ＰＣＲは、典型的には、ｍｉＲＮＡなどの遺伝子配列がサンプル中に存在するかどうかを決定するために使用され、そして遺伝子配列が存在する場合、サンプル中のコピー数が決定される。ｍｉＲＮＡを含む核酸分子の発現を決定することができる任意のＰＣＲ方法は、本開示の範囲内に含まれる。当技術分野において公知のｑＲＴ−ＰＣＲ法のいくつかの変形形態には、アガロースゲル電気泳動の使用、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（二本鎖ＤＮＡ色素）の使用、および蛍光レポータープローブが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書中で使用される場合、「同一（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」とは、同じ核酸鎖の２つの領域間または２つの異なる核酸鎖の領域間の類似性をいう。２つの領域中のヌクレオチド残基の位置が同じヌクレオチド残基によって占められている場合、その領域はその位置において相同である。各領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基位置が同じ残基によって占められている場合、第一領域は第二領域と相同である。２つの領域間の相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）は、同じヌクレオチド残基によって占められている２つの領域のヌクレオチド残基の位置の比として表される。一例として、ヌクレオチド配列５’−ＡＴＴＧＣＣ−３’を有する領域は、ヌクレオチド配列５’−ＴＡＴＧＧＣ−３’を有する領域と５０％の相同性を共有する。好ましくは、第一領域は第一部分を含み、第二領域は第二部分を含むため、各部分のヌクレオチド残基の位置の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％または９５％が同じヌクレオチド残基に占められている。より好ましくは、各部分の全てのヌクレオチド残基位置は同じヌクレオチド残基に占められている。

本発明の一実施例によるループス腎炎の検出またはループス腎炎の罹患リスクを予測するように使用されるｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ−１２５ａ−５ｐ、またはｍｉＲＮＡ−２２１−３ｐを含む。

ループス腎炎を検出する方法
この検出方法は、ループス腎炎またはループス腎炎の疑いのある患者の試験サンプルから全ＲＮＡを単離すること、全ＲＮＡ中のｍｉＲＮＡ−１４６ａ〜５ｐ、ｍｉＲＮＡ−１２５ａ〜５ｐ、およびｍｉＲＮＡ−２２１〜３ｐの内の１つまたは複数のｍｉＲＮＡ発現レベルを決定すること、およびｍｉＲＮＡの発現レベルがループス腎炎のない試験サンプル中の対応するｍｉＲＮＡの発現レベルより低い場合、個体はループス腎炎を罹患またはループス腎炎を罹患するリスクがあると判断することを含む。

もう１つの実施例において、治療薬候補がループス腎炎を罹患する細胞を抑制することをスクリーニングするインビトロ方法を提供し、その方法は以下のステップを含む：（Ａ）治療薬候補がループス腎炎を罹患する１つまたは複数の細胞に接触する前に、前記細胞の少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するステップと、（Ｂ）前記治療薬候補が前記ループス腎炎を罹患する１つまたは複数の細胞に接触した後に、前記細胞が前記ステップ（Ａ）に対応するｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するステップと、を含み、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ−１２５ａ−５ｐ、およびｍｉＲＮＡ−２２１−３ｐからなる群から選択され、
前記治療薬候補が前記ループス腎炎を罹患する１つまたは複数の細胞に接触した後の前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルが、前記治療薬候補が前記ループス腎炎を罹患する１つまたは複数の細胞に接触する前の前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルより増加する場合、前記治療薬候補がループス腎炎の治療に有効であることを判断する。

もう１つの実施例において、治療を必要とする対象のループス腎炎を抑制するための治療の有効性を判断する方法を提供し、その方法は以下のステップを含む：（Ａ）対象に少なくとも１つの治療を提供する前に、前記対象から第一サンプルを取得し、前記第一サンプルの少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルをインビトロ方法によって測定するステップと、（Ｂ）前記対象に少なくとも１つの前記治療を提供した後に、前記対象から第二サンプルを取得し、前記第二サンプルの前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルをインビトロ方法によって測定するステップと、を含み、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ−１２５ａ−５ｐ、およびｍｉＲＮＡ−２２１−３ｐからなる群から選択され、前記第二サンプルの前記ｍｉＲＮＡの発現レベルが前記ステップ（Ａ）に対応するｍｉＲＮＡの発現レベルより増加する場合、前記治療がループス腎炎に有効であることを判断する。

本発明のいくつかの実施例は、試験サンプル中のｍｉＲＮＡの発現レベルのスクリーニングに基づいて、個体がループス腎炎を有するか、またはループス腎炎を罹患するリスクがあるかどうかを判断する方法に関する。

ループス腎炎を検出するため、またはループス腎炎を罹患するリスクを予測するためのキット
本発明はまた、ループス腎炎を検出またはループス腎炎を罹患するリスクを予測するためのキットを提供する。そのキットは、試験サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する薬剤を含み、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ−１２５ａ−５ｐ、およびｍｉＲＮＡ−２２１−３ｐからなる群から選択される。前記試験サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルループス腎炎を罹患していない対象から取得したサンプルの対応するｍｉＲＮＡの発現レベルより低い場合、前記対象がループス腎炎を罹患または罹患するリスクがあると判断する。

本発明の実施形態は、以下の実施例によって説明されるが、それらは本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。それどころか、本発明の範囲から逸脱することなく、他の様々な実施形態、変更、および等価物が当業者によって考案され得ることを明確に理解されたい。特に明記しない限り、以下の実施例に記載されている研究では通常の手順に従う。以下に説明する一部の手順は、説明を目的とする。

本発明の研究は２つの部分に分けられる。第一部分は、狼瘡コントロール（ＬＣ）患者６名とループス腎炎（ＬＮ）患者６名をスクリーニンググループとし、サブ世代別シーケンシング（ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ， ＮＧＳ）を介してＬＣとＬＮを区別することができる潜在的なｍｉＲＮＡバイオマーカーモジュール標的の開発をする。「ＬＣ」は、狼瘡を罹患しているが、医師の診断によりループス腎炎を有しない患者であり、狼瘡コントロールとして表され、「ＬＮ」は、狼瘡を罹患し、医師の診断によりループス腎炎を罹患した患者として表される。狼瘡患者１２人全員がステロイドと免疫調節剤を服用しており、研究期間に渡り投薬の変更はない。比較のために、６人の狼瘡コントロール患者が６人のループス腎炎患者の年齢および性別を一致させた。

第２部分の研究は、狼瘡コントロール（ＬＣ）患者５６名およびループス腎炎（ＬＮ）患者２２名を含む検証グループとして合計狼瘡患者７８名を募集した。ＮＧＳ研究の第一部分からの標的ｍｉＲＮＡデータに加えて、発明者は文献レビューを行い、興味のある様々なＲＮＡ標的を選択してこの検証グループでテストする。この部分では、ＬＮ患者とＬＣ患者を区別することができる特定の標的ｍｉＲＮＡを決定するために、各狼瘡患者に対して選択されたｍｉＲＮＡ標的をテストする。ＳＬＥ以外の自己免疫疾患、発熱、または腎臓の感染症に影響を与える可能性のある要素を有する患者は除外される。

臨床評価
７８人を募集する時点で補体レベルおよび抗二重ＤＮＡレベルを収集し、その後定期的に収集した。また、さらなる分析のために、人口統計学的データ、生化学的データ、尿タンパク質レベル、および赤血球沈降速度などの様々な臨床バイオマーカーも収集した。

サンプル収集
全血を血漿と血球（すなわち、白血球と赤血球）に分離するために、２５００ｒｐｍ（１５０×ｇ）で２０分間の遠心分離を使用した。白血球を赤血球（ＲＢＣ）から分離するために、４．５％のデキストランを介して、１：５の比で沈降によって白血球を赤血球から分離した。次に、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）密度勾配遠心法を用いて１５００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、白血球を多形核細胞（ｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ， ＰＭＮ）と単核細胞（ＭＮＣ）に分離した。さらに、回収した単核細胞をＤｉｒｅｃｔ−ｚｏｌ ＴＭ ＲＮＡ ＭｉｎｉＰｒｅｐキット（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ）で処理して全ＲＮＡを抽出した後、ＮＧＳおよび／またはｑＰＣＲ分析を行った。

選択したマイクロＲＮＡレベルを確認
マイクロＲＮＡの発現量（ａｂｕｎｄａｎｃｅｓ）を検証するためのインスタントｑＰＣＲ
発明者はＴａｑＭａｎ ＴＭマイクロＲＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｃＤＮＡを調製する。各反応には末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からの２０ｎｇの全ＲＮＡが必要。逆転写反応は、製造元の指示に従ってＶｅｒｉｔｉ ９６ウェルサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。次に、逆転写産物を用いてｑＰＣＲ反応を行い、７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＵＮＧフリーのＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。リアルタイムＰＣＲサイクル条件は、９５℃で１０分間、続いて９５℃で１５秒間の４０サイクルであり、最後に６０℃で１分間キープする。マイクロＲＮＡ発現の存在量を、ΔＣｔ値を用いて決定し、そして小核小体ＲＮＡ Ｕ６を内因性対照として用いた。サンプル中のＵ６、ＲＮＵ２４、ＲＮＵ４４、およびＲＮＵ４８のＣｔ値を事前に測定し、それぞれ標準偏差は０．７７、１．０５、１．２１、および０．８１を計算した。したがって、現在の研究では、Ｕ６が最小の変化が測定された内部標準遺伝子である。

統計分析
この研究における全てのデータは、平均値±標準誤差（ＳＤ）または中央値（四分位範囲）として表される。必要に応じて、カイ二乗検定（Ｃｈｉ−ｓｑｕａｒｅ ｔｅｓｔ）またはフィッシャーの直接確率検定（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ｅｘａｃｔ ｔｅｓｔ）を使用してカテゴリカル変数を比較する。２つのグループ間の連続変数は、スチューデントのｔ検定を使用して比較される。ｐ＜０．０５の場合、変数は統計的に有意であると見なされる。全ての統計分析計算は、ＳＡＳソフトウェアスイート、バージョン９．１（２００２、ＳＡＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ノースカロライナ州）を用いて行った。

結果
第一部分の研究は、狼瘡コントロール（ＬＣ）患者６名およびループス腎炎（ＬＮ）患者６名からなる。以下の基準により、その患者はＳＬＥと診断された：患者は、リウマチ外来診療所で６ヶ月以上観察され、ＳＬＥの診断基準は１９９７年に改訂された１９８２年のアメリカリウマチ学会（ＡＣＲ）のＳＬＥ分類基準に基づいており、ＳＬＥ疾患活性の臨床評価はＳＬＥ疾患活動性指数（ＳＬＥＤＡＩ）に基づいている。

ＮＧＳを用いてマイクロＲＮＡを分析
６名のＬＣ患者および６名のＬＮ患者（性別および年齢が一致した）から収集したＭＮＣのＲＮＡ試料を、ＬＣおよびＬＮの２つのＲＮＡ遺伝子プールを生成するために３つのＬＮおよび３つのＬＣを均一に組み合わせた。ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）サンプル調製プロトコールに従って生成した遺伝子プールを調製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑプラットフォームを使用してシークエンシングした。如Ｋｕｏ ＨＣ， Ｈｓｉｅｈ ＫＳ， Ｍｉｎｇ−Ｈｕｅｙ Ｇｕｏ Ｍ， Ｗｅｎｇ ＫＰ， Ｇｅｒ ＬＰ， Ｃｈａｎ ＷＣ， Ｌｉ ＳＣ． Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ−ｂａｓｅｄ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｐａｎｅｌ ｆｏｒ Ｋａｗａｓａｋｉ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１６； １３８： １２２７−３０． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｊａｃｉ．２０１６．０４．０５０に示されるように、生成された生データを、ｍｉＲＳｅｑ分析を用いて分析し、全体的な配列決定の質を評価し、そしてマイクロＲＮＡ発現プロファイルを決定する。発明者はループス腎炎グループと狼瘡コントロールグループとの間の商数（ｑｕｏｔｉｅｎｔ）を０．８から１．２の間に維持し、そして４１個の標的ｍｉＲＮＡを同定した（表２を参照）。

次に、１５個のマイクロＲＮＡ標的を選択し、リアルタイムｑＰＣＲを使用して第二部分のＳＬＥ患者に試験を行った。表３に示すように、末梢単核細胞におけるｍｉＲＮＡの発現が検証される。Ｍｉｒ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、およびｍｉｒ−２２１−３ｐは、それぞれＮＧＳスクリーニング試験と即時ｑＰＣＲ検証試験との間に有意な関連関係を示し、その３つのｍｉＲＮＡのすべてがＬＮ患者グループとＬＣ患者グループとの間に有意差を示した（全てｐ＜０．０５）。しかし、文献レビューから選択されたｍｉＲＮＡ中の１つのｍｉＲ−１９３ｂのみがＬＮグループとＬＣグループとの間に有意差を示した（ｐ＜０．０５）が、研究の始めに行われたＮＧＳスクリーニング研究には、その差は有意ではなかったことを証明した。

臨床マーカーとスクリーニングされた３つのマイクロＲＮＡとの間の関連性
臨床的白血球、好中球、リンパ球、およびクレアチニンレベルは、ｍｉｒ−１４６ａ−５ｐと有意に関連している（表４を参照、すべてｐ＜０．０５）。これら４つの臨床マーカーは、ループス腎炎を有する狼瘡患者とループス腎炎を有しない狼瘡患者との間で有意に異なる６つのマーカーから派生したものである（表４参照、すべてｐ＜０．０５）。ｍｉｒ−１４６ａ−５ｐと、アルブミンレベルおよび尿中タンパク質／クレアチニン比には相関しておらず（表４）、すなわち、ｍｉｒ−１４６ａ−５ｐは、アルブミンおよび尿中タンパク質／クレアチニン比のレベルが変化する前にマーカーの役割として変化することを示す（表４）。

ＬＮ患者の初歩縦断追跡研究
ＬＮ患者が治療を受けた後、ＬＮ患者のｍｉｒ−１２５ａ−５ｐは有意に上昇し（ｐ＜０．０５）、そしてｍｉｒ−１４６ａ−５ｐの上昇は統計的有意性に非常に近くなっている（ｎ＝８、ｐ＝０．０５３）。

マイクロＲＮＡの相乗効果：ｍｉＲＮＡ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ−１２５ａ−５ｐ、およびｍｉＲＮＡ−２２１−３ｐ
この研究では、リアルタイムＰＣＲを使用して、標的ｍｉＲＮＡレベルを断面的に確認することにより、ＳＭＡＤ４、ＺＮＦ６５２、ＥＩＦ５Ａ２、ＴＲＡＦ６、ＥＴＳ１、およびＩＲＡＫ１を含むいくつかの標的がｍｉｒ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉｒ−１４６ａ−５ｐとｍｉｒ−２２１−３ｐに抑制されることを確認した。

発明者は、ループス腎炎患者または狼瘡コントロール患者のｍＲＮＡレベルを測定する。ループス腎炎患者のｍＲＮＡレベルが有意に上昇した場合、それは狼瘡コントロールグループではなく、ループス腎炎を引き起こす活性遺伝子でなければならないと仮定されている。その結果は、ＺＮＦ６５２遺伝子およびＥＴＳ１遺伝子において、ループス腎炎患者のｍＲＮＡ発現がより高いことを示した（両方ともｐ＜０．０５）。さらに、狼瘡コントロールグループに比べて、ＴＲＡＦ６遺伝子（ｐ＝０．０５）およびＩＲＡＫ１遺伝子（ｐ＝０．０８）のループス腎炎についての臨界点は有意に高かった。ループス腎炎グループと狼瘡コントロールグループとの間にＣＤ８０ ｍＲＮＡのレベルに差はなかった（ｐ＞０．０５）。

文献レビューと整合すると、ＺＮＦ６５２は３つのｍｉｒ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐおよびｍｉｒ−２２１−３ｐ ｍｉＲＮＡによって抑制され、ループス腎炎におけるＺＮＦ６５２レベルは有意に高かった。結果に示すように、ループス腎炎患者のＰＢＭＣのｍｉｒ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、およびｍｉｒ−２２１−３ｐの３つのｍｉＲＮＡレベルは有意に減少した。３つのマイクロＲＮＡのそれぞれの低力価の組合せは、有意に高いレベルであるＺＮＦ６５２ ｍＲＮＡと関連していた（ｐ＜０．０５）。さらに、ＴＲＡＦ６は、ｍｉＲ−１４６ａ−５およびｍｉｒ−１２５ａ−５ｐによって抑制され、ループス腎炎患者では、ＴＲＡＦ６のｍＲＮＡレベルは有意に高かった（ｐ＝０．０５）。

ＺＮＦ６５２およびＴＲＡＦ６のｍＲＮＡ発現レベルによって、ＭｉＲ−１４６ａ−５およびｍｉｒ−１２５ａ−５ｐの組み合わせは、ループス腎炎の検出において相乗効果を有することが証明される。

Claims (7)

1. ループス腎炎の検出またはその罹患リスクを予測する方法であって、
   （Ａ）ループス腎炎の罹患が疑われる対象からサンプルを取得し、体外試験により前記サンプルの少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するステップと、
   （Ｂ）前記サンプルの前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルがループス腎炎を罹患していない対象から取得したサンプルの対応するｍｉＲＮＡの発現レベルより低い場合、前記ループス腎炎の罹患が疑われる対象がループス腎炎を罹患または罹患するリスクが有ることを判断するステップと、を含み、
   前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ−１２５ａ−５ｐ、およびｍｉＲＮＡ−２２１−３ｐからなる群から選択されることを特徴とする、ループス腎炎の検出またはその罹患リスクを予測する方法。
2. 前記測定ステップは、ｍｉＲＮＡ−１４６ａ−５およびｍｉＲＮＡ−１２５ａ−５ｐの発現レベルを測定することを含むことを特徴とする、請求項１に記載のループス腎炎の検出またはその罹患リスクを予測する方法。
3. 前記ｍｉＲＮＡの発現レベルは、リアルタイムＰＣＲ法によって測定することを特徴とする、請求項１に記載のループス腎炎の検出またはその罹患リスクを予測する方法。
4. 前記ｍｉＲＮＡの発現レベルは、前記ｍｉＲＮＡに特定されるオリゴヌクレオチドプローブによって測定することを特徴とする、請求項１に記載のループス腎炎の検出またはその罹患リスクを予測する方法。
5. 前記サンプルは、生物検体、血液、血漿、血清、リンパ液、骨髄、唾液またはそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のループス腎炎の検出またはその罹患リスクを予測する方法。
6. 治療薬候補がループス腎炎を罹患する細胞を抑制することをスクリーニングするインビトロ方法であって、
   （Ａ）治療薬候補がループス腎炎を罹患する１つまたは複数の細胞に接触する前に、前記細胞の少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するステップと、
   （Ｂ）前記治療薬候補が前記ループス腎炎を罹患する１つまたは複数の細胞に接触した後に、前記細胞が前記ステップ（Ａ）に対応するｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するステップと、を含み、
   前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ−１２５ａ−５ｐ、およびｍｉＲＮＡ−２２１−３ｐからなる群から選択され、
   前記治療薬候補が前記ループス腎炎を罹患する１つまたは複数の細胞に接触した後の前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルが、前記治療薬候補が前記ループス腎炎を罹患する１つまたは複数の細胞に接触する前の前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルより増加する場合、前記治療薬候補がループス腎炎の治療に有効であることを判断することを特徴とする、治療薬候補がループス腎炎を罹患する細胞を抑制することをスクリーニングするインビトロ方法。
7. 治療を必要とする対象のループス腎炎を抑制するための治療の有効性を判断する方法であって、
   （Ａ）対象に少なくとも１つの治療を提供する前に、前記対象から第一サンプルを取得し、前記第一サンプルの少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルをインビトロ方法によって測定するステップと、
   （Ｂ）前記対象に少なくとも１つの前記治療を提供した後に、前記対象から第二サンプルを取得し、前記第二サンプルの前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルをインビトロ方法によって測定するステップと、を含み、
   前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ−１２５ａ−５ｐ、およびｍｉＲＮＡ−２２１−３ｐからなる群から選択され、
   前記第二サンプルの前記ｍｉＲＮＡの発現レベルが前記ステップ（Ａ）に対応するｍｉＲＮＡの発現レベルより増加する場合、前記治療がループス腎炎に有効であることを判断することを特徴とする、治療を必要とする対象のループス腎炎を抑制するための治療の有効性を判断する方法。