TW201944070A - 用於檢測狼瘡性腎炎或評估狼瘡性腎炎風險的方法及其應用 - Google Patents
用於檢測狼瘡性腎炎或評估狼瘡性腎炎風險的方法及其應用Info
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Abstract
本發明提供一種用於檢測狼瘡性腎炎或評估狼瘡性腎炎風險的方法，該發法包含以下步驟：體外測定個體的測試樣本選自以下至少一miRNA的表達水平，以及將測試樣本中的至少一miRNA與無狼瘡性腎炎的測試樣本中的對應miRNA的表現量進行比較，其中當測試樣本中的至少一miRNA的表達水平低於無狼瘡性腎炎的樣本中對應的miRNA時，則表示該個體患有狼瘡性腎炎或具有罹患狼瘡性腎炎的風險。
Description
相關申請案的交互參照
本申請案主張於2018年4月23日提出之美國臨時申請案第62/661,499號之優先權效益，其全部內容於此併入作為參考。
本發明係關於一種用於檢測狼瘡性腎炎或評估狼瘡性腎炎風險的方法及其應用。
全身性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)為經常影響育齡婦女的自體免疫性疾病，雖然症狀不同，但如果到達主要器官系統，例如中樞神經系統、心臟、肺臟或腎臟，則可能致命。此狀況稱為狼瘡性腎炎(lupus nephritis, LN)。狼瘡性腎炎會呈現有泡沫性尿液(foamy urine)及下肢水腫等症狀，以及例如口腔潰瘍、關節痛(arthralgia)與關節炎(arthritis)、淋巴腺病(lymphadenopathy)和皮疹(rashes)等其他全身性表現。
然而，這些症狀可能表現輕微且非特異性。如果這些症狀未被發現且延遲治療，則近10%的狼瘡性腎炎患者可能發展成不可逆的腎損害和末期腎病。在全身性紅斑狼瘡患者中，狼瘡性腎炎是發病率甚至是死亡率的主要原因。成功檢測到狼瘡性腎炎和早期治療可以顯著降低腎衰竭的風險。因此，正確檢測和早期治療對於有效管理狼瘡性腎炎是非常重要的。傳統上，診斷狼瘡性腎炎僅依賴於醫生基於觀察患者症狀來進行判斷，直到最近，僅發展了少數的基於細胞介質的生物標誌平台。此外，許多傳染性疾病表現出類似於狼瘡性腎炎的症狀，因此使狼瘡性腎炎的診斷複雜化並導致狼瘡性腎炎的最佳及時的治療延遲。
先前研究已指出血液的微小RNA可具有作為疾病生物標誌的功能。微小RNA(miRNA)是進化的保守且非編碼RNA分子，其通常長度為21至25個核苷酸，且藉由結合至mRNA的3端未轉譯區(3’-untranslated regions, 3’-UTRs)來作用，而可抑制蛋白質轉譯或促進mRNA降解(參照Griffiths-Jones S (2004). The 微小RNA Registry. 核酸s research 32: D109-111)。然而，現今的miRNA生物標誌的研究較少應用於臨床診斷。因此，利用miRNA發展出早期檢測和確認狼瘡性腎炎的檢測方法的需求仍未被滿足，而本發明滿足該需求和其他需求。
有鑑於上述問題，本發明之目的就是在提供一種用於檢測狼瘡性腎炎或預測罹患狼瘡性腎炎的風險之方法，以早期確認狼瘡性腎炎或預測狼瘡性腎炎的風險而避免狼瘡性腎炎的治療延遲。
在一實施例中，本發明揭露一種用於個體中的檢測狼瘡性腎炎或預測罹患狼瘡性腎炎的風險之方法，其包含以下步驟：(a)自疑似患有狼瘡性腎炎之個體取得測試樣品，體外測定該測試樣品中的至少一miRNA的表達水平，至少一miRNA係選自由miRNA-146a-5p、miRNA-125a-5p及miRNA-221-3p；以及(b)若測試樣品中的至少一miRNA的表達水平相對於無狼瘡性腎炎測試樣本中的對應的miRNA的表達水平較低時，則識別該個體患有狼瘡性腎炎或具有罹患狼瘡性腎炎的風險。
較佳地，該測定步驟可包含測定miRNA-146a-5及miRNA-125a-5p的表達水平。
較佳地，該miRNA的表達水平可藉由即時PCR進行測定。
較佳地，該miRNA的表達水平可藉由特定於miRNA的寡核苷酸探針進行測定。
較佳地，該測試樣品可選自由生物檢體、血液、血漿、血清、淋巴液、骨髓、唾液及其組合所組成之群組。
本發明亦提供一種用以識別待測試治療劑抑制狼瘡性腎炎細胞的體外方法，其包含以下步驟：(a)在待測試治療劑與一或多個狼瘡性腎炎細胞接觸之前，測定接觸前的細胞中的至少一miRNA的表達水平，至少一miRNA係選自由miRNA-146a-5p、miRNA-125a-5p及miRNA-221-3p所組成的群組；以及(b)在待測試治療劑與一或多個狼瘡性腎炎細胞接觸之後，測定接觸後的細胞中的對應於步驟(a)的miRNA的表達水平，其中在待測試治療劑與一或多個狼瘡性腎炎細胞接觸之後的miRNA中的一或多個的表達水平相對於待測試治療劑與一或多個狼瘡性腎炎細胞接觸之前的對應的miRNA的表達水平增加時，則表示待測試治療劑對於治療狼瘡性腎炎為有效的。
本發明更提供一種用以確定抑制所需個體的狼瘡性腎炎的治療有效性的方法，其包含以下步驟：(a)向一個體提供至少一部分治療之前，測定自個體取得的第一樣品中的至少一miRNA的表達水平，至少一miRNA係選自由miRNA-146a-5p、miRNA-125a-5p及miRNA-221-3p所組成的群組；以及(b)向個體提供至少一部分的治療後，自個體取得第二樣品，體外測定第二樣品中的步驟(a)對應的miRNA的表達水平，其中在第二樣品中的miRNA的一或多個的表達水平相對於第一樣品中對應的miRNA的表達水平增加時，則表示該治療對於狼瘡性腎炎為有效的。
如本文所使用，冠詞「一(a)」以及「一(an)」指稱冠詞的語法對象的一個或一個以上(即，至少一個)。
在申請專利範圍中用語「或(or)」是用於表示「及/或(and/or)」，除非明確指出僅涉及替代方案或替代方案是相互排斥的，否則本揭露支持僅涉及替代方案和「及/或(and/or)」的定義。
如在本說明書與申請專利範圍中所使用的用語「包括(comprising)」(及任意形式的包括，例如「包括(comprise)」及「包括(comprises)」)、「具有(having)」(及任意形式的具有，例如「具有(have)」及「具有(has)」)、「包含(including)」(及任意形式的包含，例如「包含(includes)」及「包含(include)」)或「含有(containing)」(及任意形式的含有，例如「含有(contains)」及「含有(contain)」) 是包容性或開放式的，而不排除額外未列舉的元件或方法步驟。
如本文所使用的可互換用語「微小RNA (microRNA)」、「miR」或「miRNA」係指未處理的(例如，前體)或處理的(例如，成熟(mature))RNA轉錄形成的miR基因。微小RNA為內生性非編碼的單股RNA，其負調節真核生物中的基因表達，且構成一類新穎的基因調節子(Chua, et al. (2009) Curr. Opin. Mol. Ther. 11:189-199)。個別miRNA已在不同的生物體中進行識別和定序，並且其已被命名。 本文提供了miRNA的名稱及其序列。
本文所有數值可理解為由「約(about)」修飾。如本文所使用的用語「約」是指涵盖± 10%的變異。
「較高(higher)」或「較低(lower)」miRNA表達為相對用語，且可藉由比較測試樣品中的miRNA表達水平與已知的無狼瘡性腎炎個體的參考庫(亦即，對照個體)的miRNA表達水平來確定。
如本文所使用的用語「測試樣品」係指包含miRNA的樣品。樣本可用於檢測感興趣的miRNA存在及/或表達水平。任何細胞、細胞群、細胞片段或細胞產物可以與本發明主張的申請標的的方法使用，儘管與正常對照相比，預測含有miRNA差異表達的生物流體和器官是最適合的。在一些實施例中，測試樣品是相對容易獲得的，例如血液或其成分。測試樣品的非限制例包含生物檢體(腎臟檢體)、體液(例如，血液、血清、血漿、淋巴液、唾液或腦脊髓液)、骨髓、細胞(例如，血球細胞)及組織(例如，腎臟組織)。
在其他實施例中，可以建立預後或診斷的miRNA水平的閾值變化程度，並且可以簡單地將患者測試樣品中指標物的水平變化程度與水平的閾值變化程度進行比較。本揭露的申請標的的miRNA水平的較佳水平閾值變化為約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約50%、約60%、約75%、約100%及約150%。
miRNA表達水平的測定係指定量存在於樣品中的miRNA的量。特定或任何miRNA表達水平的測定可利用該當技術領域中已知的任何方法或本文所述的方法完成，例如藉由即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)、北方墨點分析法。miRNA表達水平的測定包含測定成熟形式的miRNA或與miRNA表達相關的前體形式的表達。。
在特定實施例中，至少一miRNA的水平利用北方墨點分析法定量。例如，全細胞RNA可在核酸萃取緩衝液存在下藉由均質，接著離心而從細胞中純化。沉澱核酸，並以DNase移除DNA並沉澱。接著，RNA分子根據標準技術藉由瓊脂糖凝膠的凝膠電泳分離並轉移至硝酸纖維素濾膜。RNA藉由加熱以固定於濾膜上。特定RNA的檢測和定量是利用適當的標誌DNA或RNA探針與所探討的RNA互補來完成。例如，參照Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., eds., 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Chapter 7，其全部內容於此併入作為參考。
在部分實施例中，理想為使用微陣列。微陣列是核酸、蛋白質、小分子、細胞或其他物質的微觀且有序的陣列，可以對複雜的生化樣品進行平行分析。該技術提供各種具有已知序列訊息的寡核苷酸或多核苷酸作為探針，以發現樣品中的互補股並與之雜交，從而藉由選擇性結合捕獲互補股。探針包含與標靶miRNA的至少部分互補或實質上互補的寡核苷酸或多核苷酸序列。「互補(complementary)」係指兩個核酸股的區域之間的序列互補性的廣義概念。已知的是，如果殘基是胸腺嘧啶或尿嘧啶，則第一核酸區域的腺嘌呤殘基可與和第一區域反平行的第二核酸區域的殘基形成特定的氫鍵(「鹼基配對(base pairing)」)。相似地，已知的是，如果殘基是鳥嘌呤，則第一核酸區域的胞嘧啶殘基可與和第一區域反平行的第二核酸區域的殘基進行鹼基配對。核酸的第一區域與相同或不同核酸的第二區域互補，如果當兩個區域以反平行方式排列時，則第一區域的至少一核苷酸殘基可與第二區域的殘基鹼基配對。較佳地，第一區域包含第一部分且第二區域包含第二部分，因此當第一部分及第二部分以反平行方式排列時，第一部分的核苷酸殘基的至少約50%、較佳地至少約75%、至少約90%或至少約95%可與第二部分的核苷酸殘基鹼基配對。更佳地，第一部分的所有核苷酸殘基可與第二部分的核苷酸殘基鹼基配對。
miRNA的微陣列分析例如可根據該當技術領域中已知的任何方法完成。在一實施例中，RNA是自例如白血球細胞或樣本的細胞萃取，小RNA(small RNA)(18至26個核苷酸)是利用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳從總RNA進行尺寸選擇。將寡核苷酸連接子連接到小RNA的5'和3'末端，並將得到的連接產物使用作為10個擴增循環的RT-PCR反應的模板。義股(sense strand)PCR引子具有連接至其5’端的螢光團，因而螢光標誌PCR產物的義股。接著，將PCR產物變性並與微陣列雜交。與陣列上對應的miRNA捕獲探針序列互補的標靶核酸的PCR產物將通過鹼基配對與固定捕獲探針的點雜交。當使用微陣列雷射掃描儀激發時，該點將發出螢光。接著，使用許多陽性和陰性對照以及陣列數據標準化方法，根據特定miRNA的拷貝數評估各點的螢光強度，其用以評估特定miRNA的表達水平。關於本文揭露的miRNA，該探針可與標靶miRNA或多核苷酸序列100%互補。然而，只要探針可與標靶多核苷酸特異性結合並從樣品中捕獲，則該探針不需沿著標靶多核苷酸的完整長度與標靶多核苷酸完全互補。
在一些實施例中，理想為使用定量的RT-PCR。定量的RT-PCR(qRT-PCR) 是修飾之聚合酶鏈反應的修飾，其用於快速測定聚合酶鏈反應產物的量。qRT-PCR通常用於確定樣品中是否存在基因序列，例如miRNA，以及若存在基因序列，則確定樣品中的拷貝數。可以確定包括miRNA的核酸分子表達的任何PCR方法皆落入本揭露的範圍內。該當技術領域中已知的qRT-PCR方法的幾種變化包括但不限於通過瓊脂糖凝膠電泳、使用SYBR Green(雙股DNA染料)以及螢光報導探針的使用。
如本文所使用的「相同(identical)」係指相同核酸股的兩個區域之間或兩個不同核酸股的區域之間的相似性。當在兩個區域中的核苷酸殘基位置是由相同核苷酸殘基所佔有，則該區域在其位置是同源的。若各區域的至少一核苷酸殘基位置是由相同殘基所佔有，則第一區域與第二區域同源。兩個區域之間的同源性(homology)是以相同核苷酸殘基佔有的兩個區域的核苷酸殘基位置的比例表示。作為例子，具有核苷酸序列5'- ATTGCC-3'的區域與具有核苷酸序列5'-TATGGC-3'的區域分享50%同源性。較佳地，第一區域包含第一部分且第二區域包含第二部分，因而各部分的核苷酸殘基位置的至少約50%、較佳地至少約75%、至少約90%或至少約95%由相同核苷酸殘基佔有。更佳地，各部分的所有核苷酸殘基位置是由相同核苷酸殘基佔有。
根據本發明的實施例之用於檢測狼瘡性腎炎或預測罹患狼瘡性腎炎的風險之miRNA包含miRNA-146a-5p、miRNA-125a-5p或miRNA-221-3p。
[表1]
用於檢測狼瘡性腎炎的方法
該檢測方法包含自具有狼瘡性腎炎或疑似患有狼瘡性腎炎的患者的測試樣本分離出總RNA、測定總RNA中的miRNA-146a-5p、miRNA-125a-5p及miRNA-221-3p中的一或多種的miRNA表達水平、以及當該miRNA的表達水平相對於無狼瘡性腎炎測試樣本中的對應miRNA的表達水平較低時，則識別個體患有狼瘡性腎炎或具有罹患狼瘡性腎炎的風險。
在另一實施例中，提供一種用於識別待測試治療劑抑制狼瘡性腎炎細胞的體外(in vitro)方法，其包含以下步驟：(a)將待測試治療劑與一或多個狼瘡性腎炎細胞接觸之前，測定該細胞的miRNA-146a-5p、miRNA-125a-5p及miRNA-221-3p中的一或多種的miRNA表達水平，以及(b)在待測試治療劑與一或多個狼瘡性腎炎細胞接觸之後，測定細胞的對應於該步驟(a)的miRNA的表達水平，當與待測試治療劑接觸後的細胞的miRNA中的一或多個的表達水平相對於與待測試治療劑接觸前的細胞的對應的miRNA的表達水平增加時，則表示待測試治療劑對於治療狼瘡性腎炎為有效的。
在另一實施例中，提供一種用以確定抑制所需個體的狼瘡性腎炎的治療有效性的方法，其包含以下步驟：(a)向個體提供治療之前，體外測定自個體取得的第一測試樣品中的miRNA-146a-5p、miRNA-125a-5p及miRNA-221-3p中的一或多種miRNA的表達水平；以及(b)向個體提供至少一部分的治療後，體外測定自個體取得的第二測試樣品中的步驟(a)中對應的miRNA的表達水平，其中在第二測試樣品中的miRNA的一或多個的表達水平相對於第一測試樣品中對應的miRNA的表達水平增加時，則表示該治療對於狼瘡性腎炎為有效的。
本發明的部分實施例係關於基於測試樣本中的miRNA的表達水平的識別來評估個體是否患有狼瘡性腎炎或具有罹患狼瘡性腎炎的風險的方法。
用於檢測狼瘡性腎炎或預測罹患狼瘡性腎炎風險的套組
本發明亦提供一種套組用於檢測狼瘡性腎炎或預測罹患狼瘡性腎炎風險，該套組包含用於測定個體的測試樣本中的選自由miRNA-146a-5p、miRNA-125a-5p及miRNA-221-3p所組成的群組的至少一miRNA的表達水平的試劑，當該測試樣本中的該至少一miRNA的表達水平低於無狼瘡性腎炎樣本中對應的miRNA的表達水平時，則表示該個體患有狼瘡性腎炎或具有罹患狼瘡性腎炎的風險。
本發明的實施例藉由以下範例進行描述，其不以任何方式解釋為對其範圍施加限制。反之，應清楚理解的是，在不脫離本發明的精神的情況下，對於所屬領域技術中具有通常知識者而言，在閱讀本說明書之後，可以想到其他各種實施例、修改及其等效物。除非另外說明，在下列範例所述的研究中，遵循常規程序。下文描述的部分程序用於說明性目的。實例
本發明的研究分成兩個部分。第一部分是關於將6位狼瘡對照(LC)和6位狼瘡性腎炎(LN)作為篩選組並用以開發潛在的miRNA生物標誌模組標靶，其可經由次代定序(next generation sequencing, NGS)區分LC與LN。「LC」表示為狼瘡對照，其包含由患有狼瘡但經醫師診斷為不具有狼瘡性腎炎的患者，而「LN」表示為患有狼瘡性腎炎的患者，其包含患有狼瘡且經醫師診斷為患有由狼瘡引起的腎炎的患者。所有12名SLE患者均服用類固醇和免疫修飾藥物，且在整個研究期間不改變服用藥物。為了進行比較，6位狼瘡對照患者與其他6位狼瘡性腎炎患者的年齡和性別匹配。
第二部分的研究招募了78位狼瘡病患作為確認組，其中包含56位狼瘡對照(LC)和22名狼瘡性腎炎(LN)。除了來自第一部分研究NGS組的標靶miRNA數據之外，我們進行文獻回顧並選定感興趣的各種RNA靶標以在該確認組中進行測試。在此部分中，對每位狼瘡患者測試選定的miRNA靶標，以確定可以區分LN患者和LC患者的任何特定靶標miRNA。任何患有SLE以外的自身免疫性疾病、發燒或其他可能影響腎臟傳染性疾病的患者均被排除在外。
臨床評估
78位個體在招募時收集補體水平和抗雙股DNA水平，且接著定期收集。此外，為了進一步分析，亦收集了各種臨床生物標誌、例如人口數據、生化數據、尿蛋白水平和紅血球沉降速率。
樣品收集
我們利用2,500rpm(150×g)離心20分鐘以將全血分離成血漿和血球細胞(即白細胞和紅血球)。藉由4.5％葡聚醣(dextran)沉降以1：5的比例將白血球與紅血球分離，以將白血球自紅血球細胞(RBC)分離。接著，使用Ficoll-Paque(Amersham Pharmacia Biotech)的密度梯度離心以2：1的比例在1500rpm離心30分鐘，以將白血球分離成多形核細胞(olymorphonuclear cell, PMN)和單核細胞(MNC)。進一步地，使用Direct-zolTM
RNA MiniPrep套組(ZYMO RESEARCH)處理收集的單核細胞，以萃取總RNA，接著進行NGS及/或qPCR分析。
確認選定的微小
RNA
水平
即時
qPCR
驗證微小
RNA
表達豐度
(abundances)
我們使用TaqManTM
微小RNA逆轉錄套組(Applied Biosystems)來製備cDNA。每個反應需要來自外周血球單核細胞(PBMC)的總RNA 20ng。按照製造商的說明，使用Veriti 96孔熱循環儀(Applied Biosystems)進行逆轉錄反應。接著，使用逆轉錄產物進行qPCR反應，並使用7500即時PCR系統(Applied Biosystems)和不含UNG的TaqMan Universal PCR Master Mix II(Applied Biosystems)進行定量RT-PCR。即時PCR循環條件為95℃10分鐘，接著以95℃15秒進行40個循環，最後為60℃1分鐘。使用ΔCt值確定微小RNA表達豐度，並以小核仁RNA U6作為內源性對照。我們先前測量了樣品中的U6、RNU24、RNU44及RNU48的Ct值，並觀察到其標準偏差分別為0.77、1.05、1.21和0.81。因此，在目前的研究中，U6是測量到變化最小的內部對照基因。
統計分析
本研究中的所有數據以平均±標準誤差(SD)或中位數(四分位數範圍)表示。必要時，使用卡方檢驗(Chi-square test)或費雪精確性檢定(Fisher's exact test)比較分類變量。使用Student’s t-test比較兩組之間的連續變量。若p
＜0.05，則變量被認為具有統計學意義。所有統計分析計算利用SAS 套裝軟體，9.1版本(2002, SAS Statistical Institute, North Carolina)進行。結果
第一部分研究由6位狼瘡對照(LC)和6位狼瘡性腎炎(LN)個體所組成。個體由以下標準確診為狼瘡(SLE): 該個體在風濕病門診(Rheumatology Out-patient Clinic)進行超過六個月的追蹤，SLE的診斷標準基於1997年修訂的1982年美國風濕病學會(ACR)的SLE分類標準，而SLE疾病活動的臨床評估基於SLE疾病活動指數(SLEDAI)進行。
以
NGS
剖析微小
RNA
將收集自6位LC個體和6位LN個體(性別及年齡匹配)的MNC的RNA樣本平均地合併3位LN與3位LC，以產生兩個LC與LN合併的RNA基因庫。我們按照TruSeq®小RNA(Illumina)樣品製備方案製備了合併的基因庫，並使用Illumina MiSeq平台進行定序。如Kuo HC, Hsieh KS, Ming-Huey Guo M, Weng KP, Ger LP, Chan WC, Li SC. Next-generation sequencing identifies micro-RNA-based biomarker panel for Kawasaki disease. J Allergy Clin Immunol. 2016; 138: 1227-30. doi: 10.1016/j.jaci.2016.04.050所述，使用miRSeq分析分析生成的原始數據，評估整體定序質量並確定微小RNA表達譜。我們將狼瘡性腎炎組與狼瘡對照組之間的商數(quotient)維持在0.8至1.2，其確定了41個標靶miRNA(參照表2)。
[表2]使用次代定序比較狼瘡性腎炎與無狼瘡性腎炎患者
縮寫：hsa-miR，miRNA或微小RNA；LN1，三個第一狼瘡性腎炎患者的微小RNA混合物；LN2，三個第二狼瘡性腎炎患者的微小RNA混合物；SLE，全身性紅斑狼瘡；SLE1，三個第一非狼瘡性腎炎患者的微小RNA混合物；SLE2，三個第二非狼瘡性腎炎患者的微小RNA混合物。
接著選定15個微小RNA標靶並使用即時qPCR於第二部分研究SLE個體進行測試。如表3所示，驗證外周單核細胞(peripheral mononuclear cell)中的miRNA表達。mir-125a-5p、miR-146a-5p及mir-221-3p分別顯示在NGS篩選研究和即時qPCR驗證研究之間顯示出顯著相關性，並且三者皆在LN患者組與LC患者組之間顯著差異(皆為p ＜0.05)。然而，雖然我們從文獻回顧選擇的miRNA中僅一個miR-193b顯示在LN組與LC組之間存在顯著差異(p ＜0.05)，但在此研究開始時所進行的NGS篩選研究證實該差異並未達到顯著性。
[表3] 確認患有狼瘡性腎炎(β)與無狼瘡性腎炎(α)的外周單核細胞中的所選定的微小RNA水平並比較其之間差異
縮寫：SLE表示為全身性紅斑狼瘡；數據以平均±SD(標準偏差)表示；兩組之間的連續變量利用Student’s T-test在α與β之間進行比較(α：無狼瘡性腎炎的SLE，β：患有狼瘡性腎炎的SLE)；*表示p值＜0.05；使用費雪精確性檢定對性別進行比較。
臨床標誌物與三種識別的微小
RNA
之間的相關性
臨床白血球、嗜中性球、淋巴球及肌酸酐水平與mir-146a-5p顯著相關(參照表6，皆為p＜0.05)。此四種臨床標誌物是衍生自患有狼瘡性腎炎與非狼瘡性腎炎的狼瘡病患之間具有顯著差異的六種標誌物(參照表4，所有皆為p＜0.05)。白蛋白水平與尿蛋白/肌酸酐比與mir-146a-5p並不具相關性(表6)，其表示mir-146a-5p具有作為甚至以在白蛋白和尿蛋白/肌酸酐比例水平變化之前的標誌物的作用(表4)。
[表4] 臨床實驗室數據與使用NGS篩選的三種miRNA之間的相關性，並各別藉由即時PCR確認
LN
患者的初步縱向追蹤研究
在LN患者接受治療後， LN患者的mir-125a-5p顯著地升高(p＜0.05)，mir-146a-5p升高且非常接近統計學意義(n = 8，p = 0.053)。
微小
RNA
的協同效應：
miRNA-146a-5p
、
miRNA-125a-5p
及
miRNA-221-3p
在此研究中，我們使用即時PCR以橫截面方式(cross-sectional fashion)確認幾種標靶miRNA水平，包括SMAD4、ZNF652、EIF5A2、TRAF6、ETS1及IRAK1可由mir-125a-5p、miR-146a-5p和mir-221-3p所抑制。
我們測定狼瘡性腎炎或狼瘡對照組患者中的mRNA水平。假設如果狼瘡性腎炎患者的mRNA水平顯著升高，則必定是導致狼瘡性腎炎而不是狼瘡對照組的活性基因。結果顯示，從ZNF652基因和ETS1基因的測試，在狼瘡性腎炎病患中mRNA表達較高(均為p ＜0.05)。此外，與狼瘡對照組相比，TRAF6基因(p= 0.05)和IRAK1基因(p = 0.08)的狼瘡性腎炎的臨界顯著較高。狼瘡性腎炎與狼瘡對照組之間，CD80 mRNA水平並無差異(p＞ 0.05)。
綜合文獻回顧，ZNF652可由所有三種mir-125a-5p、miR-146a-5p和mir-221-3p的miRNA抑制，並且狼瘡性腎炎中的ZNF652水平顯著更高，並且如結果所示，所有三種mir-125a-5p、miR-146a-5p和mir-221-3p的miRNA在狼瘡性腎炎的PBMC中顯著降低。三種微小RNA中的每一個的低力價的組合與顯著較高水平的ZNF652 mRNA相關(p＜0.05)。此外，TRAF6可由miR-146a-5和mir-125a-5p所抑制，且在狼瘡性腎炎病患中，TRAF6的mRNA水平顯著較高(p = 0.05)。
由ZNF652和TRAF6 mRNA表達水平證實，MiR-146a-5和mir-125a-5p的組合在狼瘡性腎炎的檢測中具有協同效應。
無。
無。
Claims (7)
- 一種用於檢測狼瘡性腎炎或預測罹患狼瘡性腎炎的風險之方法，其包含以下步驟： (a)自疑似患有狼瘡性腎炎之一個體取得一測試樣品，體外測定該測試樣品中的至少一miRNA的表達水平，該至少一miRNA係選自由miRNA-146a-5p、miRNA-125a-5p及miRNA-221-3p所組成的群組；以及 (b)若該測試樣品中的該至少一miRNA的表達水平相對於一無狼瘡性腎炎測試樣本中對應的miRNA的表達水平較低時，則識別該個體患有狼瘡性腎炎或具有罹患狼瘡性腎炎的風險。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該測定步驟包含測定miRNA-146a-5及miRNA-125a-5p的表達水平。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該miRNA的表達水平係藉由即時PCR進行測定。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該miRNA的表達水平係藉由特定於該miRNA的一寡核苷酸探針進行測定。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該測試樣品係選自由生物檢體、血液、血漿、血清、淋巴液、骨髓、唾液及其組合所組成之群組。
- 一種識別待測試治療劑抑制狼瘡性腎炎細胞的體外方法，其包含以下步驟： (a)在一待測試治療劑與一或多個狼瘡性腎炎細胞接觸之前，測定細胞中的至少一miRNA的表達水平，該至少一miRNA係選自由miRNA-146a-5p、miRNA-125a-5p及miRNA-221-3p所組成的群組；以及 (b)在該待測試治療劑與一或多個狼瘡性腎炎細胞接觸之後，測定該細胞中該步驟(a)對應的miRNA的表達水平， 其中在該待測試治療劑與一或多個狼瘡性腎炎細胞接觸之後的該miRNA的一或多個的表達水平相對於該待測試治療劑與一或多個狼瘡性腎炎細胞接觸之前的對應的miRNA的表達水平增加時，則表示該待測試治療劑對於治療狼瘡性腎炎為有效的。
- 一種用於確定抑制所需個體的狼瘡性腎炎的治療有效性的方法，其包含以下步驟： (a)向一個體提供至少一部分治療之前，自該個體取得一第一樣品，體外測定該第一樣品中的至少一miRNA的表達水平，該至少一miRNA係選自由miRNA-146a-5p、miRNA-125a-5p及miRNA-221-3p所組成的群組；以及 (b)向該個體提供至少一部分的該治療後，自該個體取得一第二樣品，體外測定該第二樣品中的該步驟(a)對應的miRNA的表達水平， 其中，在該第二樣品中的該miRNA的一或多個的表達水平相對於該第一樣品中對應的miRNA的表達水平增加時，則表示該治療對於狼瘡性腎炎為有效的。
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