CN110709702A - 治疗自身免疫性疾病和炎性疾病的方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供用于治疗自身免疫性和/或炎性疾病如狼疮的生物标记物和疗法,及使用BTK抑制剂的方法。特别地,提供用于狼疮中患者选择和预后的生物标记物,以及与之相关的治疗性治疗的方法、制造品和用于产生它们的方法、诊断试剂盒、检测方法和广告方法。
Description
发明领域
本文提供治疗自身免疫性疾病和炎性疾病的生物标记物和疗法,以及使用BTK抑制剂的方法。特别地,提供用于自身免疫性疾病和炎性疾病中患者选择和预后的生物标记物,以及与之相关的治疗性治疗的方法、制造品和用于产生它们的方法、诊断试剂盒、检测方法和广告方法。
背景技术
自身免疫性和炎性疾病和病症仍是人类健康的明显威胁。尽管治疗自身免疫性和炎性疾病和病症方面进展明显,依旧寻求改进的疗法。许多自身免疫性疾病和炎性疾病显示异质性迹象。例如,系统性红斑狼疮(SLE)是SLE患者群体中具有异质性迹象的疾病。参见Kennedy等人,Lupus Sci.&Med.,2015;2:e000080。鉴于这种异质性,除治疗自身免疫性疾病和炎性疾病(例如,SLE)的新方法外,需要使用诊断性生物标记物鉴定某些患者的方法,所述方法可以改善治疗结局。
浆母细胞是快速分裂的短寿抗体分泌细胞。已经在青少年狼疮患者的血液中鉴定到浆母细胞升高,并且通常狼疮患者中抗体转录物的丰度增加。E.Arce等人,J.Immunol.167,2361–2369(2001);L.Bennett等人,J.Exp.Med.197,711–723(2003)。尽管浆母细胞占血液中B细胞的小比例,但它们是全血mRNA中存在的大部分抗体转录物的原因。
蛋白激酶,人类酶的最大家族,涵盖大大超过500种蛋白质。Bruton酪氨酸激酶(BTK)是Tec家族酪氨酸激酶的成员,并且是B细胞早期发育以及成熟B细胞活化、信号传导与存活的调节物。已经在BTK缺陷性小鼠模型中确立BTK在过敏性病症和/或自身免疫疾病和/或炎性疾病中发挥作用的证据。例如,在SLE的鼠标准临床前模型中,已经显示BTK缺乏导致疾病进展明显改善。另外,BTK缺陷性小鼠也可以抵抗胶原所致关节炎的形成并且可以对葡萄球菌所致关节炎更不易感。大量证据支持B细胞和体液免疫系统在自身免疫性和/或炎性疾病发病机制中的作用。参见,例如,WO 2012/118750。为耗尽B细胞所开发的基于蛋白质的治疗药(如Rituxan)代表了治疗众多自身免疫性和/或炎性疾病的一种方案。因为BTK在B细胞活化中的作用,BTK的制剂可以用作B细胞介导致病性活动(如自身抗体产生)的抑制剂。BTK还在破骨细胞、肥大细胞和单核细胞中表达并且已经显示对这些细胞的功能重要。例如,小鼠中的BTK缺乏与IgE介导的肥大细胞活化(TNF-α和其他炎性细胞因子释放明显缩减)受损相关,并且人类中的BTK缺乏与活化型单核细胞的TNF-α产生大幅度减少相关。
对BTK活性的抑制可以用于治疗过敏性病症和/或自身免疫性和/或炎性疾病,如:SLE、类风湿性关节炎、多种血管炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、重症肌无力、过敏性鼻炎和哮喘(Di Paolo等人(2011)Nature Chem.Biol.7(1):41-50;Liu等人(2011)Jour.ofPharm.and Exper.Ther.338(1):154-163)。已经报告了特异性BTK抑制剂(Liu(2011)DrugMetab.and Disposition39(10):1840-1849;美国专利号7,884,108,WO 2010/056875;美国专利号7,405,295;美国专利号7,393,848;WO 2006/053121;美国专利号7,947,835;US2008/0139557;美国专利号7,838,523;US 2008/0125417;US 2011/0118233;2011年8月31日提交的PCT/US2011/050034“吡啶酮类/吡嗪酮类、其制造方法及使用方法”;2011年8月31日提交的PCT/US2011/050013吡嗪酮类、其制造方法及使用方法”;2011年5月6日提交的美国系列号13/102,720“吡啶酮和氮杂-吡啶酮化合物及其使用方法”)。
美国专利号8,716,274(其通过引用方式完整并入本文)公开了可用于抑制BTK的杂芳基吡啶和氮杂-吡啶酮化合物类别。下文所示的化合物(A)是一种具体的BTK抑制剂化合物:
化合物(A)是:(S)-2-(3'-(羟甲基)-1-甲基-5-((5-(2-甲基-4-(氧杂环丁-3-基)哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-6-氧代-1,6-二氢-[3,4'-联吡啶]-2'-基)-7,7-二甲基-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-环戊[4,5]吡咯并[1,2-a]吡嗪-1-酮。该化学结构在化学结构和化学名称之间不一致性的任何情况下占主导。
本文中提到的全部参考文献,包括专利申请和出版物,均通过引用的方式完整并入本文。
概述
本文提供一种治疗患有自身免疫性疾病或炎性疾病个体的方法,包括向个体施用治疗有效量的BTK抑制剂,其中已经发现来自个体的样品具有一种或多种选自IgJ、Mzb1和Txndc5的生物标记物的升高水平。
本文还提供一种治疗个体中自身免疫性疾病或炎性疾病的方法在,所述方法包括:
(a)确定来自个体的样品包含一种或多种选自IgJ、Mzb1和Txndc5的生物标记物的升高水平;并且
(b)向个体施用有效量的BTK抑制剂,因而治疗免疫疾病或病症。
本文还提供一种为患有自身免疫性疾病或炎性疾病个体选择疗法的方法,所述方法包括确定一种或多种选自IgJ、Mzb1和Txndc5的生物标记物的水平;并且基于生物标记物的水平选择药物。
本文还提供一种通过确定来自个体的样品中一种或多种选自IgJ、Mzb1和Txndc5的生物标记物水平,鉴定患有自身免疫性疾病或炎性疾病的个体的方法,所述个体或多或少很可能显示从包含BTK抑制剂的治疗获益,其中样品中升高的生物标记物水平表示个体更可能显示从包含BTK抑制剂的治疗获益或降低的生物标记物水平表示个体较少可能显示从包含BTK抑制剂的治疗获益。
本文还提供一种鉴定患有自身免疫性疾病或炎性疾病个体以接受BTK抑制剂的测定,所述方法包括:
(a)确定来自个体的样品中一种或多种选自IgJ、Mzb1和Txndc5的生物标记物的水平;并且
(b)基于生物标记物的水平推荐施用BTK抑制剂。
本文还提供一种诊断试剂盒,其包含一种或多种用于确定来自患有自身免疫性疾病或炎性疾病个体的样品中一种或多种选自IgJ、Mzb1和Txndc5的生物标记物的水平的试剂,其中检测到升高的生物标记物水平意味着用BTK抑制剂治疗个体时疗效增加,并且其中检测到生物标记物的低水平或基本上不可检出水平意味着用BTK抑制剂治疗自身免疫性疾病或炎性疾病个体时疗效降低。
在本文提供的方法的一些实施方案中,方法还包括向个体施用有效量的BTK抑制剂。
在本文提供的方法、测定和/或试剂盒的一些实施方案中,样品是血液样品。
在本文提供的方法、测定和/或试剂盒的一些实施方案中,BTK抑制剂是抗体、结合性多肽、小分子和/或多核苷酸。
在本文提供的方法、测定和/或试剂盒的一些实施方案中,BTK抑制剂是小分子。在一些实施方案中,小分子BTK抑制剂是化合物(A)或其可药用盐。
在本文提供的方法、测定和/或试剂盒的一些实施方案中,自身免疫性疾病或炎性疾病是系统性红斑狼疮。在一些实施方案中,自身免疫性疾病或炎性疾病是狼疮性肾炎。在一些实施方案中,自身免疫性疾病或炎性疾病是肾外狼疮(extra-renal lupus)。
先前已经公开了预测自身免疫性疾病如类风湿性关节炎,多发性硬化和狼疮中对B细胞拮抗剂(例如,抗CD20抗体)治疗应答的生物标记及其使用方法,但是未公开浆母细胞基因标签(signature)并且未在BTK抑制作用方面公开。参见WO 2012/118750,所述文献的完整内容因而在通过引用的方式并入。
如本文提供,B细胞亚群的转录谱鉴定到对浆母细胞特异的基因表达标签。这种标签与实验中体外加标物(spike)的浆母细胞丰度高度相关。使用SLE患者中B细胞亚群的FACS分析,与RNA-测序配对,现有基因表达标签显示与全血中浆母细胞的频率强烈相关。尽管浆母细胞占血液中B细胞的小比例,但它们是全血mRNA中发现的大部分抗体转录物的原因。扩大至两个附加II期临床试验队列,使用SLEDAI疾病活动性指数,发现浆母细胞标签与疾病活动性相关。该关联受浆母细胞与存在抗DNA抗体、低水平补体和白细胞减少症的相关性驱动。升高的浆母细胞标签还与高水平的干扰素活性相关。患者人种/族裔也预示浆母细胞标签水平,与疾病严重程度无关。标准护理用药,尤其麦考酚酯,减少浆母细胞标记基因的表达。用利妥昔单抗治疗患者,例如,导致明显、但最终暂时的浆母细胞标签表达减少。
附图简述
本专利或申请文件含有至少一张以彩色完成的附图。带彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求并支付必需费用时由专利局提供。
图1A-1和图1A-2.浆母细胞体外分化和分选策略。浆母细胞在含有CpG连同细胞因子IL-2、IL-6、IL-10、IL-15、IFNα的培养条件下自CD20+CD27+记忆型B细胞分化7天。初始B细胞(CD20+CD27-),和FACS分选的CD20+CD27+活化的B细胞和分化的CD20loCD38+浆母细胞用于基因表达概况分析。
图1B.浆母细胞特异性表达的基因的热图。鉴定到在0.001的FDR时由浆母细胞比初始B细胞和活化型B细胞表达高至少10倍并且在浆母细胞中具有表达水平>5RPKM的基因。值代表已经在每个基因内部针对均数0,标准偏差1归一化的方差稳定化数据。
图2A.PBMC样品中加入渐增浆母细胞数目的候选浆母细胞标签基因的热图。将浆母细胞内标入来自两位独立供体的PBMC中,如以上热图中黑色和灰色所示。值代表每个基因相对于HPRT1的ΔCt,并且针对均数0和标准偏差1归一化。
图2B-1、图2B-2、图2B-3和图2B-4.浆母细胞标签基因相对于HPRT1的表达水平或与每份样品中存在的浆母细胞百分数相比,全部三个基因的均数。点线和短划线表示不同的PBMC供体,而不同符号代表浆母细胞的不同供体。线性回归分析用来预测表达浆母细胞标签,或组分基因,其中将PBMC供体和浆母细胞供体并入模型。全部四个模型均高度统计显著,其中p<1×10-10。模型的预测力报告为来自线性模型的r2。
图2C-1、图2C-2、图2C-3和图2C-4.从在接受流感疫苗后一周的健康供体分离的B细胞群体中测量的浆母细胞基因相对HPRT1的相对表达或全部三个标签基因的均数。N=初始B细胞,M=记忆型B细胞,PB=浆母细胞。与其他群体相比,浆母细胞具有最高的标记基因表达。星号表示使用线性回归,纳入供体作为协变量,B细胞群体之间差异统计显著性;*=p<0.05,**=p<0.01,***=p<0.001。
图2D-1、图2D-2、图2D-3和图2D-4.浆母细胞标签和组分基因与狼疮患者的血液中通过FACS测量的浆母细胞频率相关。在43位患者中,历经多达3个时间点测量IgD-CD19+CD27++CD38++浆母细胞作为全血细胞的百分数,其中我们使RNA-测序数据伴随所述时间点,总计96份样品。基因表达值作为各个基因的RPKM或三个基因标签的几何平均数RPKM呈现。使用Spearman等级次序(rank-order)法计算相关系数。
图3A.浆母细胞标签与用SLEDAI测量的疾病活动性相关。值代表浆母细胞标签基因相对于HPRT1的平均表达。SLEDAI值和浆母细胞标签值来自开始治疗之前采集的样品。使用Spearman等级次序法确定相关系数。
图3B-1、图3B-2和图3B-3.SLEDAI复合指数的独立分量与增加的浆母细胞标签基因表达相关。线性回归用来评估显示每个症状的患者和那些未显示每个症状的患者之间的统计显著性;星号表示这个检验中的显著性水平:*=p<0.05,**=p<0.01,***=p<0.001。
图3C-1、图3C-2和图3C-3.血清C3和C4补体水平和血清抗dsDNA抗体滴度与浆母细胞标签表达相关。使用Spearman等级次序法计算相关系数。
图3D-1和图3D-2.全血干扰素标签表达(ISM)与浆母细胞标签值相关。使用Spearman等级次序法计算相关系数。
图4A.用利妥昔单抗治疗患者降低浆母细胞标签表达水平。线条表示在利妥昔单抗治疗队列(短划线)或安慰剂队列(实线)内部的平均表达水平,其中误差线表示平均标准误。黑色箭头表示患者何时接受药物或安慰剂输注。使用线性混合效应模型,并入年龄、人种/族裔、伴随药物使用情况、干扰素活性、SLEDAI和治疗组(treatment arm)和时间点及其交互作用作为固定效应和患者作为随机效应,对浆母细胞标签基因的表达建模。红色星号表示在利妥昔单抗治疗组中特异性显著差异的时间点:*=p<0.05,**=p<0.01,***=p<0.001。
图4B.用麦考酚酯和利妥昔单抗治疗独立地降低浆母细胞标签表达水平。线条表示安慰剂队列(实线)或利妥昔单抗治疗队列(短划线)的均数,平均标准误由误差线表示。箭头表示患者何时接受安慰剂或利妥昔单抗输注。使用线性混合效应模型,并入年龄、干扰素活性和治疗组和访视和它们的相互作用,以患者作为随机效应,对表达值建模。在曲线顶部的星号表示其中利妥昔单抗治疗的患者显示超过安慰剂组的距基线显著降低的时间点,而靠近曲线底部的星号表示无论治疗情况如何均距基线差异的时间点:*=p<0.05,**=p<0.01,***=p<0.001。
图4C.具有可检测抗嵌合抗体(HACA)的患者具有更高的浆母细胞标记基因表达。线条表示利妥昔单抗治疗的具有可检测HACA的患者(实线)或那些从不具有可检测HACA的患者(短划线)中浆母细胞标记基因的平均表达,误差线表示平均标准误。
图5A.用麦考酚酸吗乙酯(MMF)或甲氨蝶呤(MTX)治疗的患者显示比硫唑嘌呤(AZA)治疗的患者更低的浆母细胞表达。在接受不同免疫抑制给药方案的患者之间比较浆母细胞标签筛查值。将AZA与其他两种治疗分别比较,使用线性回归,检验统计显著性。星号表示治疗之间的显著差异:*=p<0.05,**=p<0.01,***=p<0.001。
图5B.在筛查时接受MMF治疗的患者倾向于具有比未接受MMF治疗的那些患者更低的浆母细胞标签。在筛查访视时服用MMF的患者和不服用MMF的那些之间使用线性回归计算p-值。
图6A.在EXPLORER临床试验队列中,欧洲血统患者具有比其他族裔患者更低水平的浆母细胞表达。值代表浆母细胞基因相对于HPRT1的平均表达水平。使用线性回归跨自我报告的人种/族裔比较筛查访视值。星号表示与自我报告为白种人/高加索人的患者相比,差异显著性:*=p<0.05,**=p<0.01,***=p<0.001。
图6B.LUNAR患者不显示基于人种/族裔的显著差异。使用线性回归,未观察到跨族裔的显著差异。
图6C.ROSE临床试验队列中欧洲血统患者显示较低的浆母细胞标记物表达。值代表浆母细胞基因的几何平均RPKM。使用针对log2变换的平均RPKM的线性回归,跨自我报告的人种/族裔比较筛查访视值。星号表示与自我报告为白种人/高加索人的患者相比,差异显著性:*=p<0.05,**=p<0.01,***=p<0.001。
图7.BTK抑制剂GDC-0852抑制CD40L介导的浆母细胞分化的剂量反应曲线显示,以剂量依赖性方式抑制浆母细胞分化。使用FACS分析,测定四位健康供体中的浆母细胞百分数,以计算每位供体的IC50值。
图8A、图8B、图8C和图8D.BTK抑制作用减少浆母细胞基因标签。使用上文描述的条件,在DMSO溶媒或370nM GDC-0852存在下,来自4位健康供体的记忆型B细胞分化成浆母细胞。浆母细胞标签基因的表达由Fluidigm测量并且对持家基因(HPRT1)归一化。将表达值作为相对于持家基因的相对转录物丰度作图。将浆母细胞标签计算为三个独立基因相对丰度的几何平均。
图9.浆母细胞基因表达与浆母细胞数相关。如通过FACS分析所测定的浆母细胞百分数与浆母细胞标签相关,如图8D中所确定(Spearman rho=0.81)。白色点表示在DMSO存在下分化的样品,而黑色点代表GDC-0852处理的样品。
图10.BTK抑制剂GDC-0852以剂量依赖性方式抑制CpG介导的浆母细胞分化。使用FACS分析,测定四位健康供体中的浆母细胞百分数,以计算每位供体的IC50值。
发明详述
I.定义
如本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”指任何长度的核苷酸聚合物,并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物,或可以由DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸,如甲基化核苷酸及其类似物。如果存在,可以在聚合物装配之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分打断。可以在合成后进一步修饰多核苷酸,如通过与标记缀合。其他类型的修饰良例如包括,“加帽”、用类似物置换一个或多个天然存在性核苷酸,核苷酸间修饰,如,例如,具有不带电荷键(例如,甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺化物、氨基甲酸酯等)和具有带电荷键(例如,硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些、含有侧挂部分(pendant)(如,例如,蛋白质(例如,核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等))的那些,具有嵌入剂(例如,吖啶、补骨脂素等)的那些、含有螯合剂(例如,金属、放射性金属、硼,氧化的金属,等)的那些、含有烷基化剂的那些、具有修饰键的那些(例如,α异头核酸等),以及未修饰形式的多核苷酸。另外,可以将通常存在于糖中的任何羟基取代(例如,用膦酸酯基团、磷酸酯基团取代)、用标准保护基保护、或激活以制备与附加核苷酸的附加键,或可以使其与固态或半固态支持物缀合。5'端和3’端OH可以磷酸化或用1至20个碳原子的胺或有机加帽基团部分取代。其他羟基也可以衍生化至标准保护基。多核苷酸还可以含有本领域通常已知的类似形式的核糖或脱氧核糖糖,例如,包括2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮基-核糖、碳环状糖类似物、α-异头糖、差向异构糖如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖糖类、呋喃糖糖类、景天庚酮糖、无环类似物和脱碱基核苷类似物如甲基核糖苷。一个或多个磷酸二酯键可以由备选性连接基团替换。这些备选性连接基团包括,但不限于这样的实施方案,其中磷酸酯由P(O)S(“硫代酯”)、P(S)S(“二硫代酯”)、(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“甲缩醛”)替换,其中每个R或R'独立地是H或取代或未取代的烷基(1-20个C),所述烷基任选含有醚(-O-)键、芳基、链烯基、环烷基、环烯基或芳醛基(araldyl)。多核苷酸中的全部键并不需要是相同的。前述说明适用于本文提及的全部多核苷酸,包括RNA和DNA。
如本文所用的“寡核苷酸”通常指短的单链多核苷酸,其小于但不必然地小于约250个核苷酸长度。寡核苷酸可以是合成的。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”不互斥。以上的多核苷酸描述同等并完整地适用于寡核苷酸。
术语“引物”指通常通过提供游离3’-OH基团,能够与核酸杂交并且之后互补性核酸聚合的单链多核苷酸。
术语“小分子”指具有约2000道尔顿或更小,优选地约500道尔顿或更小的分子量的任何分子。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”互换使用并且指已经向其中引入外源核酸的细胞,包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”,其包括原代转化细胞和从其衍生的后代,而无论传代次数是多少。后代可以在核酸含量含量方面不与亲本细胞完全相同,但是可以含有突变。本文中包括突变子代,所述突变子代具有与最初转化的细胞中所筛选或选择的子代相同的功能或生物学活性。
如本文所用,术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及并入已经将该载体引入其中的宿主细胞的基因组内的载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。
“分离的”抗体是已经与其天然环境的组分分离的一种抗体。在一些实施方案中,将抗体纯化至大于95%或99%纯度,如通过例如电泳(例如,SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳法)或色谱(例如,离子交换或反相HPLC)所确定。关于评估抗体纯度的方法的综述,例如参见Flatman等人,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“分离的”核酸指已经与其自然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括包含在通常包含该核酸分子的细胞中的核酸分子,但是该核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置处。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖多种抗体结构物,包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如,双特异性抗体)和抗体片段,只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。
“阻断性”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或减少与之结合的抗原的生物学活性的一种抗体。优选的阻断性抗体或拮抗剂抗体基本上或完全地抑制抗原的生物学活性。
“亲和力”指分子(例如,抗体)的单一结合位点及其结合配偶体(例如,抗原)之间总计非共价相互作用的强度。除非另外指出,否则如本文所用,“结合亲和力”指反映结合对子的成员(例如,抗体和抗原)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力可以通常由解离常数(Kd)代表。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量,包括本文所述的那些方法。在下文中描述用于测量结合亲和力的具体示意性和示例性实施方案。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中存在一个或多个改变的抗体,其中与不拥有这些改变的亲本抗体相比,这类改变导致抗体对抗原的亲和力改善。
术语“检测”包括任何检测手段,包括直接和间接检测。
如本文所用的术语“生物标记物”,指一种可以在样品中检出的指示物,例如,预示性、诊断性和/或预后指示物。生物标记物可以充当特征在于某些分子、病理学、组织学和/或临床特征的疾病或病症(例如,癌症)特定亚型的指示物。在一些实施方案中,生物标记物是基因。生物标记物包括但不限于,多核苷酸(例如,DNA和/或RNA),多肽,多肽和多核苷酸修饰(例如,翻译后修饰)、糖类和/或基于糖脂的分子标记。
术语“生物标记物标签”、“标签”、“生物标记物表达标签”或“表达标签”在本文中互换地使用并且指其表达情况为指示物(例如,预示性、诊断性和/或预后)的生物标记物中的一个或组合。生物标记物标签可以充当特征在于某些分子、病理学、组织学和/或临床特征的疾病或病症(例如,癌症)特定亚型的指示物。在一些实施方案中,生物标记物标签是“基因标签”。术语“基因标签”与“基因表达标签”互换使用并指其表达为指示物(例如,预示性、诊断性和/或预后)的多核苷酸中的一个或组合。在一些实施方案中,生物标记物标签是“蛋白质标签”。术语“蛋白质标签”与“蛋白质表达标签”互换使用并指其表达为指示物(例如,预示性、诊断性和/或预后)的多肽中的一个或组合。
与个体临床获益增加相关的生物标记物的“量”或“水平”是生物样品中的可检测水平。这些可以通过本领域技术人员已知并且还在本文中公开的方法测量。评估的生物标记物的表达水平或量可以用来确定对治疗的应答。
术语“表达的水平”或“表达水平”通常互换使用并且通常指生物样品中生物标记物的量。“表达”通常指(例如,基因编码的和/或表观遗传的)信息借以转换成在细胞中存在和运行的结构物的过程。因此,如本文所用,“表达”可以指转录成多核苷酸、翻译成多肽,或甚至多核苷酸和/或多肽修饰(例如,多肽翻译后修饰)。转录的多核苷酸、翻译的多肽的片段或多核苷酸和/或多肽修饰(例如,多肽翻译后修饰)的片段也应当视作表达,无论它们是源自由可变剪接或降解的转录物产生的转录物,还是源自多肽翻译后加工,例如,通过蛋白酶解。“表达的基因”包括那些转录成多核苷酸作为mRNA并且随后翻译成多肽的基因,并且还包括那些转录成RNA但不翻译成多肽(例如,转运和核糖体RNA)的基因。
“升高的表达”、“升高的表达水平”或“升高的水平”指相对于对照(如未患疾病或病症(例如,癌症)的一个或多个个体)或内对照(例如,持家生物标记物),个体中生物标记物的表达增加或水平增加。
“降低的表达”、“降低的表达水平”或“降低的水平”指相对于对照(如未患疾病或病症(例如,癌症)的一个或多个个体)或内对照(例如,持家生物标记物),个体中生物标记物的表达减少或水平减少。在一些实施方案中,减少的表达是稀少或不表达。
在某些实施方案中,术语“在参比水平”指来自个体或患者的样品中实质上与参比水平相同的生物标记物水平或指与参比水平相差多达1%、多达2%、多达3%、多达4%、多达5%的水平。在一些实施方案中,参比水平是参比群体中生物标记物的中位水平。在一些实施方案中,标记物的参比水平是参比群体中标记物的平均水平。在一些实施方案中,标记物的参比水平是参比群体中标记物的均数水平。
在某些实施方案中,术语“高于参比水平”指通过本文所述的方法测定,如与参比水平相比,来自个体或患者的样品中高于参比水平至少5%、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、100%或更大的生物标记物水平。在一些实施方案中,参比水平是参比群体中的中位水平。在一些实施方案中,标记物的参比水平是参比群体中标记物的平均水平。
在某些实施方案中,术语“低于参比水平”指通过本文所述的方法测定,如与参比水平相比,来自个体或患者的样品中低于参比水平至少5%、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、100%或更大的生物标记物水平。在一些实施方案中,参比水平是参比群体中的中位水平。在一些实施方案中,标记物的参比水平是参比群体中标记物的平均水平。在一些实施方案中,标记物的参比水平是参比群体中标记物的均数水平。
术语“持家生物标记物”指一般在全部细胞类型中类似存在的生物标记物或生物标记物(例如,多核苷酸和/或多肽)群组。在一些实施方案中,持家生物标记物是“持家基因”。“持家基因”在本文中指编码蛋白质的基因或基因群组,所述蛋白质的活性对维持细胞功能为必需并且一般类似地存在于全部细胞类型中。
如本文所用的“扩增”通常指产生所需序列的多个拷贝的过程。“多个拷贝”意指至少两个拷贝。“拷贝”不必然地意指与模板序列互补或相同的完美序列。例如,拷贝可以包含核苷酸类似物如脱氧肌苷,有意序列改变(如通过引物引入的序列改变,所述引物包含与模板可杂交但不互补的序列),和/或扩增期间出现的序列差错。
术语“多重PCR”指出于在单个反应中扩增两种或更多种DNA序列的目的,使用多于一个引物集合对获自单一来源(例如,个体)的核酸所实施的单个PCR反应。
杂交反应的“严格性”可由本领域普通技术人员轻易地确定,并且通常是依赖于探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验计算值。通常,较长的探针需要较高的温度以正确退火,而较短的探针需要较低的温度。当互补链在低于其解链温度的环境中存在时,杂交通常依赖于变性的DNA再退火的能力。在探针和可杂交序列之间所需同源性的程度越高,可以使用的相对温度越高。因此,随之而来,较高的相对温度将倾向于使反应条件更严格,而较低的温度将倾向于使反应条件的严格性较低。关于杂交反应严格性的附加细节和解释,参见Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,Wiley IntersciencePublishers,(1995)。
如本文定义,“严格条件”或“高严格性条件”可以由以下这些确定:(1)将低离子强度和高温度用于洗涤,例如在50℃,0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1%十二烷基硫酸钠;(2)在42℃在杂交期间使用变性剂,如甲酰胺,例如,50%(v/v)甲酰胺,连同pH 6.5,0.1%牛血清白蛋白/0.1%Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液,连同750mM氯化钠,75mM柠檬酸钠;或(3)在42℃在利用50%甲酰胺、5x SSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1%焦磷酸钠、5x Denhardt溶液,超声处理鲑精DNA(50μg/ml)、0.1%SDS和10%硫酸葡聚糖的溶液中过夜杂交,同时在42℃于0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中洗涤10分钟,随后在55℃在由含有EDTA的0.1x SSC组成的高严格性洗涤10分钟。
“中等严格条件”可以如Sambrook等人,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,New York:Cold Spring Harbor Press,1989所述那样确定,并且包括使用严格性比上文所述那些更低的洗涤液和杂交条件(例如,温度、离子强度和%SDS)。中等严格条件的例子是在37℃于包含20%甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5×Denhardt溶液、10%硫酸葡聚糖和20mg/ml变性剪切鲑精DNA的溶液中孵育过夜,随后在约37-50℃于1×SSC中洗涤滤膜。技术人员将认识到如何按照需要调整温度、离子强度等以适应诸如探针长度等因素。
术语“诊断”在本文中用来指对分子或病理状态、疾病或病状(例如,癌症)的鉴定或分类。例如,“诊断”可以指鉴定特定类型的癌症。“诊断”还可以指对特定亚型癌症的分类,例如,依据组织病理学标准或依据分子特征(例如,特征在于表达一个生物标记物(例如,特定基因或由所述基因编码的蛋白质)或其组合的亚型)。
术语“辅助诊断”在本文中用来指这样的方法,所述方法辅助做出关于疾病或病症(例如,癌症)的特定类型症状或状况的存在或性质的临床确定。例如,一种辅助诊断疾病或病状(例如,癌症)的方法可以包括测量来自个体的生物样品中的某些生物标记物。
如本文所用,术语“样品”指获自或衍生自目的受试者和/或个体的组合物,所述的目的受试者和/或个体含有例如基于物理、生物化学、化学和/或生理特征待表征和/或鉴定的细胞实体和/或其他分子实体。例如,短语“疾病样品”及其变型指从目的受试者获得的任何样品,所述的目的受试者本来预期或已知含有待表征的细胞实体和/或分子实体。样品包括但不限于原代或培养的细胞或细胞系、细胞上清液、细胞裂解物、血小板、血清、血浆、玻璃体液、淋巴液、滑液、滤泡液、精液、羊水、乳、全血、血液衍生的细胞、尿、脑脊液、唾液、痰、泪、汗、黏液、肿瘤裂解物和组织培养基、组织提取物如均化的组织、肿瘤组织、细胞提取物及其组合。
“组织样品”或“细胞样品”意指一组从受试者或个体的组织获得的相似细胞。组织或细胞样品的来源可以是来自新鲜、冷冻和/或保存的器官、组织样品、活检样品和/或抽吸物的实体组织;血液或任何血液成分(如血浆);体液如脑脊液、羊水、腹膜液或间质液;来自受试者任何妊娠或发育时间的细胞。组织样品也可以是原代或培养的细胞或细胞系。任选地,从疾病组织/器官获得组织或细胞样品。组织样品可以含有在自然界中不天然与组织混合的化合物如防腐剂、抗凝血剂、缓冲剂、固定剂、养分、抗生素等。
如本文所用,“参比样品”、“参比细胞”、“参比组织”、“对照样品”、“对照细胞”或“对照组织”指用于比较目的的样品、细胞、组织、标准品或水平。在一个实施方案中,从相同受试者或个体的身体的健康和/或不患病部分(例如,组织或细胞)获得参比样品、参比细胞、参比组织、对照样品、对照细胞或对照组织。例如,与患病细胞或组织毗邻的健康和/或不患病细胞或组织(例如,与肿瘤毗邻的细胞或组织)。在另一个实施方案中,从相同受试者或个体的身体的未治疗组织和/或细胞获得参比样品。在另一个实施方案中,从不是受试者或个体的个体身体的健康和/或不患病部分(例如,组织或细胞)获得参比样品、参比细胞、参比组织、对照样品、对照细胞或对照组织。在甚至另一个实施方案中,从不是受试者或个体的个体身体的未治疗的组织和/或细胞获得参比样品、参比细胞、参比组织、对照样品、对照细胞或对照组织。
出于本文的目,组织样品的“切片”意指组织样品的单个部分或片,例如,从组织样品切下的组织或细胞的薄切片。可以理解,可以取得组织样品的多个切片并进行分析,前提是可以理解,可以在形态学水平和分子水平分析相同的组织样品切片,或就多肽和多核苷酸二者而言分析。
“相关”或“关联”意指以任何方式将第一分析或方案的性能和/或结果与第二分析或方案的性能和/或结果比较。例如,可以在实施第二方案时使用第一分析或方案的结果和/或可以使用第一分析或方案的结果以决定是否应当进行第二分析或方案。就多核苷酸分析或方案的实施方案而言,可以使用多核苷酸表达分析或方案的结果以决定是否应当进行具体治疗方案。
可以使用任何终点评估“个体应答”或“应答”,所述终点表示个体获益,包括而不限于(1)抑制疾病进展(例如,癌进展)到某个程度,包括减慢和完全停滞;(2)肿瘤尺寸减小;(3)抑制(即,减少、减慢或完全制止)癌细胞浸润入毗邻的外周器官和/或组织;(4)抑制(即,减少、减慢或完全制止)转移;(5)减轻一种或多种与疾病或病症(例如,癌症)相关症状到某个程度;(6)增加无进展生存的长度;和/或(9)降低治疗后给定时间点处的死亡率。
如本文所用,术语“基本上相同”指两个数值之间程度足够高的相似性,从而本领域技术人员将认为两个值之间的差异在用所述值测量的生物学特征(例如,Kd值或表达)的背景范围内微小或无生物显著性和/或统计显著性。所述两个值之间的差异例如小于约50%、小于约40%、小于约30%、小于约20%、和/或小于约10%,是参比/比较值的函数。
如本文所用,术语“基本上不同”指两个数值之间程度足够高的差异,从而本领域技术人员将认为两个值之间的差异在用所述值测量的生物学特征(例如,Kd值)的背景范围内统计显著性。所述两个值之间的差异例如大于约10%、大于约20%、大于约30%、大于约40%、和/或大于约50%,是参比/比较分子的值的函数。
在本文中使用时,词“标记”涉及可检测的化合物或组合物。标记一般直接或间接地缀合或融合于试剂,如多核苷酸探针或抗体,并促进检出与之缀合或融合的试剂。标记本身可以是可检测的(例如,放射性同位素标记或荧光标记),或者在酶标记的情况下,可以催化产生可检测产物的底物化合物或组合物的化学改变。
活性剂的“有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段,有效实现所需治疗结果或预防结果的量。
物质/分子、激动剂或拮抗剂的“治疗有效量”可以根据多种因素如个体的疾病状态、年龄、性别和体重,以及物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中激发所需应答的能力而变动。治疗有效量也是这样的一个量,其中物质/分子、激动剂或拮抗剂的任何有毒或有害作用被治疗有益作用所超越。“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段,有效实现所需预防结果的量。一般但不必然地,由于在受试者中在疾病之前或在疾病较早阶段使用预防性剂量,故预防有效量将小于治疗有效量。
术语“药物制剂”指一种制备物,所述制备物处于这类形式从而允许其中所含的活性成分的生物学活性有效,并且不含有对于将会施用该制剂的受试者不可接受地有毒的额外组分。
“可药用载体”指药物制剂中除活性成分之外的对受试者无毒的成分。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所用,“治疗”(和其语法变型如动词“治疗”或分词“治疗”)指意欲改变正在接受治疗的个体的天然过程的临床干预,并且可以旨在预防或在临床病理学过程期间实施。想要的治疗效果包括,但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态,以及缓解或预后改善。在一些实施方案中,抗体用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。
如本申请中所用的术语“前药”指药学活性物质的前体或衍生物形式,其中与母药相比,所述前体或衍生物对肿瘤细胞具有较低的细胞毒性并且能够酶促地被活化或转变成更有活性的母形式。参见,例如,Wilman,“Prodrugs in Cancer Chemotherapy”Biochemical Society Transactions,14,第375-382页,615th Meeting Belfast(1986)和Stella等人“Prodrugs:A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery”DirectedDrug Delivery,Borchardt等人(编著),第247-267页,Human Press(1985)。本发明的前药包括但不限于含有磷酸酯的前药、含有硫代磷酸酯的前药、含有硫酸酯的前药、含有肽的前药、D-氨基酸修饰的前药、糖基化前药、含有β-内酰胺的前药、任选地含有取代型苯氧乙酰胺的前药或任选地含有取代型苯乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和其他5-氟尿苷前药,这些前药可以转变成细胞毒性更强的游离药物。可以衍生成用于本发明中的前药形式的细胞毒性药物的实例包括,但不限于上文描述的那些化疗剂。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如,牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如,人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如,小鼠和大鼠)。在某些实施方案中,个体或受试者是人。
术语“同步”在本文中用来指施用两种或更多种治疗剂,其中至少部分的施用在时间上重叠。因此,同步施用包括在停止施用一种或多种其他活性剂后继续施用一种或多种活性剂时的给药方案时。
“降低或抑制”意指引起总体减少20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多的能力。降低或抑制可以指正在治疗的病症的症状、转移灶的存在或大小、或原发肿瘤的大小。
术语“包装插页”用来指治疗产品的商业包装中习惯性包括的说明书,所述说明书含有关于适应证、用法,剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或涉及此类治疗产品用途之警告的信息。
“制造品”是任何制品(例如,包装物或容器)或套装,其包含至少一种试剂,例如,治疗疾病或病症(例如,癌症)的药物或特异性检测本文所述生物标记物的探针。在某些实施方案中,制品和套装作为一个用于执行本文所述方法的单元推销、分销或出售。
在本文中使用时,短语“基于”意指关于一种或多种生物标记物的信息用来告知治疗决策,在包装插页、或销售/推销指南等上提供的信息。
如本领域技术人员理解,对本文中“约”某个值或参数的提及包括(并且描述)涉及该值或参数本身的实施方案。例如,提及“约X”的描述包括对“X”的描述。
可以理解,本文所述的发明的方面和实施方案包括“由……组成”和/或“基本上由……组成”方面和实施方案。如本文所用,除非另外指明,否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数称谓。
II.方法和用途
本文提供利用浆母细胞生物标记物的方法。特别地,提供利用BTK抑制剂和浆母细胞生物标记物的方法。例如提供是治疗患有疾病或病症的个体的方法,所述方法包括:如果已经发现个体存在浆母细胞生物标记物和/或具有其升高的水平,则向个体施用治疗有效量的BTK抑制剂。另外本文提供治疗个体中疾病或病症的方法,所述方法包括:确定来自个体的样品包含升高的浆母细胞生物标记物水平,并且向个体施用有效量的BTK抑制剂,因而治疗疾病或病症。在一些实施方案中,浆母细胞生物标记物选自由IgJ、Mzb1和Txndc5组成的基因标签的组。在一些实施方案中,IgJ、Mzb1和Txndc5的基因表达是通过相对于参比水平,测量患者血液中所述基因的mRNA水平所测定的多肽表达。在一些实施方案中,疾病或病症是自身免疫性或炎性疾病或病症。在一些实施方案中,疾病或病症是SLE。在一些实施方案中,疾病或病症是狼疮性肾炎。在一些实施方案中,疾病或病症是肾外狼疮。
本文提供治疗个体中疾病或病症的方法,所述方法包括向个体施用有效量的BTK抑制剂,其中治疗基于来自个体的样品中浆母细胞生物标记物的存在和/或升高的水平。在一些实施方案中,浆母细胞生物标记物是IgJ、Mzb1和Txndc5中一者或多者的表达。在一些实施方案中,IgJ、Mzb1和Txndc5的基因表达是通过相对于参比水平,测量患者血液中所述基因的mRNA水平所测定的多肽表达。在一些实施方案中,疾病或病症是自身免疫性或炎性疾病或病症。在一些实施方案中,疾病或病症是SLE。在一些实施方案中,疾病或病症是狼疮性肾炎。在一些实施方案中,疾病或病症是肾外狼疮。
此外,本文提供为患有疾病或病症的个体选择疗法的方法,所述方法包括确定浆母细胞生物标记物的存在和/或水平,并且基于生物标记物的存在和/或水平选择药物。在一些实施方案中,基于升高的浆母细胞生物标记物水平选择药物。在一些实施方案中,浆母细胞生物标记物选自由IgJ、Mzb1和Txndc5组成的基因标签的组。在一些实施方案中,IgJ、Mzb1和Txndc5的基因表达是通过相对于参比水平,测量患者血液中所述基因的mRNA水平所测定的多肽表达。在一些实施方案中,疾病或病症是自身免疫性或炎性疾病或病症。在一些实施方案中,疾病或病症是SLE。在一些实施方案中,疾病或病症是狼疮性肾炎。在一些实施方案中,疾病或病症是肾外狼疮。
本文提供鉴定患有疾病或病症的个体的方法,所述个体或多或少很可能显示从包含BTK抑制剂的治疗获益,所述方法包括:确定来自个体的样品中浆母细胞生物标记物的存在和/或水平,其中,样品中浆母细胞生物标记物的存在和/或升高的水平表示个体更可能显示从包含BTK抑制剂的治疗获益,或浆母细胞生物标记物的不存在和/或降低的水平表示个体较少可能显示从包含BTK抑制剂的治疗获益。在一些实施方案中,浆母细胞生物标记物选自由IgJ、Mzb1和Txndc5组成的基因标签的组。在一些实施方案中,IgJ、Mzb1和Txndc5的基因表达是通过相对于参比水平,测量患者血液中所述基因的mRNA水平所测定的多肽表达。在一些实施方案中,疾病或病症是自身免疫性或炎性疾病或病症。在一些实施方案中,疾病或病症是SLE。在一些实施方案中,疾病或病症是狼疮性肾炎。在一些实施方案中,疾病或病症是肾外狼疮。
本文中还提供鉴定患有疾病或病症的个体以接受BTK抑制剂的测定,所述方法包括:(a)确定来自个体的样品中浆母细胞生物标记物的存在和/或水平;(b)基于浆母细胞生物标记物的存在和/或水平推荐BTK抑制剂。在一些实施方案中,基于升高的浆母细胞生物标记物水平,推荐BTK抑制剂。在一些实施方案中,浆母细胞生物标记物选自由IgJ、Mzb1和Txndc5组成的基因标签的组。在一些实施方案中,IgJ、Mzb1和Txndc5的基因表达是通过相对于参比水平,测量患者血液中所述基因的mRNA水平所测定的多肽表达。在一些实施方案中,疾病或病症是自身免疫性或炎性疾病或病症。在一些实施方案中,疾病或病症是SLE。在一些实施方案中,疾病或病症是狼疮性肾炎。在一些实施方案中,疾病或病症是肾外狼疮。
本文提供诊断试剂盒,所述试剂盒包含一种或多种用于确定来自患有疾病或病症的个体的样品中浆母细胞生物标记物水平的试剂,其中检测到浆母细胞生物标记物的存在和/或升高的水平意味着用BTK抑制剂治疗个体时疗效增加,并且其中检测到生物标记物的低水平或基本上不可检出水平意味着用BTK抑制剂治疗患有疾病的个体时疗效降低。本文中还提供制造品,所述制造品包含,包装在一起的包含BTK抑制剂的药物组合物和包装插页,所述包装插页表明:BTK抑制剂用于基于浆母细胞生物标记物的表达,治疗患有疾病或病症的患者。在一些实施方案中,浆母细胞生物标记物选自由IgJ、Mzb1和Txndc5组成的基因标签的组。在一些实施方案中,IgJ、Mzb1和Txndc5的基因表达是通过相对于参比水平,测量患者血液中所述基因的mRNA水平所测定的多肽表达。在一些实施方案中,疾病或病症是自身免疫性或炎性疾病或病症。在一些实施方案中,疾病或病症是SLE。在一些实施方案中,疾病或病症是狼疮性肾炎。在一些实施方案中,疾病或病症是肾外狼疮。
另外,本文提供治疗个体中疾病或病症的方法,所述方法包括向个体施用有效量的BTK抑制剂,并且在BTK抑制剂治疗期间评估来自个体的样品中一种或多种浆母细胞生物标记物的水平(例如,与参比相比)。还提供治疗个体中疾病或病症的方法,所述方法包括向个体施用有效量的BTK抑制剂,其中治疗基于来自个体的样品中一种或多种浆母细胞生物标记物的水平(例如,与参比相比)。提供在个体中监测对包含BTK抑制剂的治疗的应答性的方法,所述方法包括:确定来自个体的样品中一种或多种浆母细胞生物标记物的水平,其中,样品中降低的一种或多种浆母细胞生物标记物水平(例如,与参比相比)表示个体更可能对包含BTK抑制剂的治疗有应答,或一种或多种浆母细胞生物标记物的升高水平和/或与其治疗前水平基本上相同的水平(例如,与参比相比)表示个体较少可能对包含BTK抑制剂的治疗有应答。在一些实施方案中,浆母细胞生物标记物选自由IgJ、Mzb1和Txndc5组成的基因标签的组。在一些实施方案中,IgJ、Mzb1和Txndc5的基因表达是通过相对于参比水平,测量患者血液中所述基因的mRNA水平所测定的多肽表达。在一些实施方案中,疾病或病症是自身免疫性或炎性疾病或病症。在一些实施方案中,疾病或病症是SLE。在一些实施方案中,疾病或病症是狼疮性肾炎。在一些实施方案中,疾病或病症是肾外狼疮。
另外,提供了确定患有疾病或病症的个体是否应当继续或停用包含BTK抑制剂的治疗的方法,所述方法包括测量来自个体的样品中一种或多种浆母细胞生物标记物的水平,其中一种或多种浆母细胞生物标记物的升高水平和/或与其治疗前水平基本上相同的水平(例如,与参比相比)确定个体应当停用包含BTK抑制剂的治疗,并且一种或多种浆母细胞生物标记物的降低水平(例如,与参比相比)确定个体应当继续包含BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中,浆母细胞生物标记物选自由IgJ、Mzb1和Txndc5组成的基因标签的组。在一些实施方案中,IgJ、Mzb1和Txndc5的基因表达是通过相对于参比水平,测量患者血液中所述基因的mRNA水平所测定的多肽表达。在一些实施方案中,疾病或病症是自身免疫性或炎性疾病或病症。在一些实施方案中,疾病或病症是SLE。在一些实施方案中,疾病或病症是狼疮性肾炎。在一些实施方案中,疾病或病症是肾外狼疮。
在一些实施方案中,该方法包括:(a)测量来自患者的生物样品中选自IgJ、TXNDC5和MZB1的一种、两种或三种生物标记物的RNA水平;(b)将(a)中测量的RNA水平与参比水平比较;以及(c)当(a)中测量的RNA水平高于参比水平时,鉴定患者为更可能从BTK抑制剂疗法获益。在一些实施方案中,RNA是mRNA。在一些实施方案中,测量mRNA水平包括扩增。在一些实施方案中,测量mRNA水平包括定量PCR。在一些实施方案中,测量mRNA水平包括扩增mRNA并检测扩增产物,因而测量mRNA的水平。在一些实施方案中,参比水平是参比群体中各标记物的中位水平。
在一些实施方案中,标记物的参比水平是参比群体中标记物的中位水平。在本文所述的任何实施方案中,参比水平可以是参比群体中各标记物的平均水平(mean level)。在一些实施方案中,标记物的参比水平是参比群体中标记物的均数水平(average level)。非限制性示例性参比群体包括免疫或炎性疾病患者、健康个体和包含健康个体和免疫或炎性疾病患者的组。在一些实施方案中,参比群体包含SLE患者。
在一些实施方案中,分析或检测生物标记物的方法具有小于0.05的p值。在一些实施方案中,该方法具有高于80%的特异性。在一些实施方案中,该方法具有高于80%的灵敏度。在一些实施方案中,该方法具有高于70%的ROC。在一些实施方案中,该方法具有高于70%的AUC。在一些实施方案中,该方法具有高于70%的正预示值。在一些实施方案中,该方法具有高于70%的负预示值。在一些实施方案中,所述参比基因表达谱来自患者和/或健康志愿者的参比群体中的受试者。在一些实施方案中,比较步骤包括以下至少之一:比较表达谱的数字图像和比较表达数据的数据库。
在任何前述方法的一些实施方案中,浆母细胞生物标记物是IgJ。在任何前述方法的一些实施方案中,浆母细胞生物标记物是Mzb1。在任何前述方法的一些实施方案中,浆母细胞生物标记物是Txndc5。在任何前述方法的一些实施方案中,一种或多种浆母细胞生物标记物是IgJ和Mzb1。在任何前述方法的一些实施方案中,一种或多种浆母细胞生物标记物是IgJ和Txndc5。在任何前述方法的一些实施方案中,一种或多种浆母细胞生物标记物是Txndc5和Mzb1。在任何前述方法的一些实施方案中,一种或多种浆母细胞生物标记物是IgJ、Mzb1和Txndc5。
在以上实施方案的某些中,样品是尿样。在一些实施方案中,样品是血液样品。在一些实施方案中,生物样品选自血液、血清、血浆和外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中,生物样品是从血液,例如,全血或血液的细胞级分(如PBMC)获得的RNA。在一些实施方案中,生物样品是血清或血浆。可以在治疗之前、治疗期间或治疗后取得样品。样品可以取自怀疑患有或经诊断为患有SLE或其他免疫或炎性疾病并且因此很可能需要治疗的患者。备选地,样品可以取自不怀疑患有任何疾病的正常个体。在一些实施方案中,在检测或测量标记物的mRNA水平之前,RNA提取自本文所述的生物样品。
可以基于本领域已知的任何合适标准,定性和/或定量确定生物标记物的存在和/或表达水平/量,所述的标准包括但不限于DNA、mRNA、cDNA、蛋白质、蛋白质片段和/或基因拷贝数。在某些实施方案中,第一样品中生物标记物的存在和/或表达水平/量如与第二样品中存在/不存在和/或表达水平/量相比增加。在某些实施方案中,第一样品中生物标记物存在/不存在和/或表达水平/量与第二样品中生物标记物的存在和/或表达水平/量相比减少。在某些实施方案中,第二样品是参比样品、参比细胞、参比组织、对照样品、对照细胞或对照组织。本文中描述了确定基因的存在/不存在和/或表达水平/量的附加公开。
在任何方法的一些实施方案中,升高的表达指与参比样品、参比细胞、参比组织、对照样品、对照细胞或对照组织相比,通过现有已知的标准方法(如本文所述的那些方法)所检测,生物标记物(例如,蛋白质或核酸(例如,基因或mRNA))的水平总体增加约以下任一者:10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大。在某些实施方案中,升高的表达指样品中生物标记物的表达水平/量增加,其中增加是参比样品、参比细胞、参比组织、对照样品、对照细胞或对照组织中各生物标记物的表达水平/量至少约以下任一者:1.5X、1.75X、2X、3X、4X、5X、6X、7X、8X、9X、10X、25X、50X、75X或100X。在一些实施方案中,升高的表达指如与参比样品、参比细胞、参比组织、对照样品、对照细胞、对照组织或内对照(例如,持家基因)相比总体增加大于约1.5倍、约1.75倍、约2倍、约2.25倍、约2.5倍、约2.75倍、约3.0倍或约3.25倍。
在任何方法的一些实施方案中,减少的表达指如与参比样品、参比细胞、参比组织、对照样品、对照细胞或对照组织相比,通过现有已知的标准方法(如本文所述的那些方法)所检测,生物标记物(例如,蛋白质或核酸(例如,基因或mRNA))的水平总体减少约以下任一者:10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大。在某些实施方案中,减少的表达指样品中生物标记物的表达水平/量减少,其中减少是参比样品、参比细胞、参比组织、对照样品、对照细胞或对照组织中各自生物标记物的表达水平/量至少约以下任一者:0.9X、0.8X、0.7X、0.6X、0.5X、0.4X、0.3X、0.2X、0.1X、0.05X或0.01X。
可以通过众多方法分析样品中多种生物标记物的存在和/或表达水平/量体系,其中所述方法许多是本领域已知的并且被技术人员理解,包括但不限于免疫组织化学(“IHC”)、Western印迹分析、免疫沉淀法、分子结合测定法、ELISA、ELIFA、荧光激活细胞分选法(“FACS”)、MassARRAY、蛋白质组学、基于血液的定量性测定法(例如,血清-ELISA)、生物化学酶活性测定法、原位杂交、Southern分析、Northern分析、全基因组测序、聚合酶链反应(“PCR”)(其包括定量实时PCR(“qRT-PCR”))和其他扩增型检测方法,例如,分支的DNA、SISBA、TMA等),RNA-Seq、FISH、微阵列分析、基因表达概况分析,和/或基因表达连续分析(“SAGE”),以及可以通过蛋白、基因和/或组织阵列分析实施的多种类型测定法的任一者。例如Ausubel等人编著,1995,Current Protocols In Molecular Biology,单元2(Northern印迹法)、单元4(Sourther印迹法)、单元15(免疫印迹法)和单元18(PCR分析)中存在评价基因和基因产物的状态的常见方案。也可以使用多重免疫测定法,如从RulesBased Medicine或Meso Scale Discovery(“MSD”)可获得的那些。
在一些实施方案中,使用这样的方法确定生物标记物的存在和/或表达水平/量,所述方法包括:(a)对样品(如受试者癌样品)进行基因表达概况分析、PCR(如rtPCR)、RNA-seq、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术或FISH;和b)确定样品中生物标记物的存在和/或表达水平/量。在一些实施方案中,微阵列方法包括使用微阵列芯片,所述微阵列芯片具有一种或多种可以在严格条件下与编码上文提到的基因的核酸分子杂交的核酸分子或具有一种或多种可以与上文提到的基因编码的一种或多种蛋白质结合的多肽(如肽或抗体)。在一个实施方案中,PCR方法是qRT-PCR。在一个实施方案中,PCR方法是多重PCR。在一些实施方案中,通过微阵列测量基因表达。在一些实施方案中,通过qRT-PCR测量基因表达。在一些实施方案中,通过多重PCR测量表达。
评估细胞中mRNA的方法是熟知的并且例如包括,使用互补性DNA探针(如使用对一个或多个基因特异的的标记核糖探针的原位杂交、Northern印迹和相关技术)的杂交测定法和各种核酸扩增测定法(如使用对一个或多个基因特异的互补引物的RT-PCR,和其他扩增类型检测方法,如,例如,分支DNA、SISBA、TMA等)。
使用Northern印迹法、斑点印迹法或PCR分析,可以便利测定来自哺乳动物的样品的mRNA。此外,这类方法可以包括一个或多个允许确定生物样品中靶mRNA水平的步骤(例如,通过同时检查“持家”基因(如肌动蛋白家族成员)的对比性对照mRNA序列的水平)。任选地,可以测定扩增的靶cDNA的序列。
任选的方法包括通过微阵列技术检查或检测组织样品或细胞样品中mRNA(如靶mRNA)的方案。使用核酸微阵列,逆转录来自测试组织样品和对照组织样品的测试和对照mRNA样品并标记以产生cDNA探针。探针随后与固定在固相支持物上的核酸阵列杂交。阵列如此配置,从而阵列的每个成员的序列和位置已知。例如,可以在固相支持物上排列其表达与抗血管生成疗法临床获益增加或减少相关的基因选择。标记探针与阵列特定成员的杂交表示探针所来源的样品表达该基因。
根据一些实施方案,通过观察前述基因的蛋白质表达水平,测量存在和/或表达水平/量。在某些实施方案中,该方法包括:使生物样品与针对本文所述的生物标记物的抗体在允许结合该生物标记物的条件下接触,并且检测抗体和生物标记物之间是否形成复合物。这种方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中,抗体用来选择BTK抑制剂疗法合格的受试者,例如,用于选择个体的生物标记物。
在某些实施方案中,使用IHC和染色方案,检查样品中生物标记物蛋白的存在和/或表达水平/量。已经显示组织切片IHC染色法是确定或检测样品中蛋白质存在的可靠方法。在任何方法、测定和/或试剂盒的一些实施方案中,浆母细胞生物标记物选自IgJ、Mzb1和Txndc5中一者或多者。在一些实施方案中,通过免疫组织化学检测IgJ、Mzb1和/或Txndc5。在一些实施方案中,来自个体的样品中升高的浆母细胞生物标记物表达是升高的蛋白质表达和,在进一步的实施方案中,使用IHC来确定。在一个实施方案中,使用这样的方法确定生物标记物表达水平,所述方法包括:(a)用抗体进行样品的IHC分析;和b)确定样品中生物标记物的表达水平。在一些实施方案中,相对于参比确定IHC染色强度。在一些实施方案中,参比是参比值。在一些实施方案中,参比是参比样品(例如,对照细胞系染色样品)。在一些实施方案中,组织是肾组织。在其他实施方案中,使用荧光原位杂交替代IHC进行以上技术。
IHC可以与附加技术如形态染色和/或荧光原位杂交组合进行。IHC的两种一般方法可用;直接测定法和间接测定法。根据第一测定法,直接确定抗体与靶抗原的结合。这种直接测定法使用标记的试剂,如荧光标记或酶标记的第一抗体,后者可以在无其他抗体相互作用下可视化。在常见的间接测定法中,未缀合的第一抗体与抗原结合并且随后标记的第二抗体与第一抗体结合。其中第二抗体与酶标记缀合,添加生色性或荧光底物以提供抗原可视化。因为几种第二抗体可能与第一抗体上的不同表位反应,故发生信号放大。
用于IHC的第一和/或第二抗体一般将会用可检测部分标记。可用的众多标记物通常可以分组入以下类别:(a)放射性同位素,如35S、14C、125I、3H和131I;(b)胶体金粒子;(c)荧光标记物,包括,但不限于稀土元素螯合物(铕螯合物)、德克萨斯红、罗丹明、荧光素、丹磺酰、丽丝胺、伞形酮、藻红蛋白(phycocrytherin)、藻青蛋白、或可商购荧光团如SPECTRUMORANGE7和SPECTRUM GREEN7和/或上述任一者或多者的衍生物;(d)各种酶-底物标记物可用和美国专利号4,275,149提供对这些标记物中某些的综述。酶标记物的例子包括萤光素酶(例如,萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶;美国专利号4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如,葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。
酶-底物组合的例子例如包括辣根过氧化物酶(HRPO)与氢过氧化物酶作为底物;碱性磷酸酶(AP)与对硝基苯基磷酸酯作为生色底物;和β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与生色底物(例如,对-硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物(例如,4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷酶)。关于这些组合的一般综述,参见美国专利号4,275,149和4,318,980。
在任何方法的一些实施方案中,使用诊断性抗体(即,第一抗体),通过免疫组织化学检测浆母细胞生物标记物。在一些实施方案中,待分析的组织是肾组织。在一些实施方案中,诊断性抗体特异性结合IgJ、Mzb1或Txndc5。在任何诊断性抗体的一些实施方案中,诊断性抗体是非人类抗体。在一些实施方案中,诊断性抗体是大鼠、小鼠或兔抗体。在一些实施方案中,诊断性抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中,直接标记诊断性抗体。
在备选方法中,样品可以在足以形成抗体-生物标记物复合物的条件下与所述生物标记物特异的抗体接触并且随后检测所述复合物。可以按许多方式,如通过分析多种组织和样品(包括血浆或血清)的Western印迹法和ELISA方法,检测生物标记物的存在。广泛的使用这种测定模式的免疫测定法技术可用,例如参见美国专利号4,016,043、4,424,279和4,018,653。这些方法包括非竞争性类型以及在传统竞争性结合测定中的单位点和双位点或“夹心”测定法。这些测定法也包括标记抗体与靶生物标记物的直接结合。
也可以通过功能性或基于活性的测定法,检查组织或细胞样品中选定生物标记物的存在和/或表达水平/量。例如,如果生物标记物是酶,则可以实施本领域已知的测定法确定或检测组织或细胞样品中给定酶活性的存在。
在某些实施方案中,样品针对所分析生物标记物的量的差异性和所用样品的质量的变异性及测定法运行之间的变异性归一化。可以通过检测和并入某些归一化生物标记物(包括熟知的持家基因,如ACTB)的表达,实现这种归一化。备选地,归一化可以基于所有已分析的基因或其巨大子集的平均或中位数信号(总体归一化方案)。在基因x基因基础上,受试者样品mRNA或蛋白质的测量的归一化量与参比集合中存在的量比较。每位受试者每份受检样品的每种mRNA或蛋白质的归一化表达水平可以表述为参比集合中测量的表达水平的百分数。在待分析的具体受试者样品中测量的存在和/或表达水平/量将落在这个范围内部的某个些百分位数处,这可以通过本领域熟知的方法确定。
在某些实施方案中,如下确定基因的相对表达水平:
相对表达基因1样品1=2exp(Ct持家基因–Ct基因1),其中在样品中测定Ct。
相对表达基因1参比RNA =2exp(Ct持家基因–Ct基因1),其中在参比样品中测定Ct。
归一化相对表达基因1样品1=(相对表达基因1样品1/相对表达基因1参比RNA)x100
Ct是阈值循环。Ct是反应内部生成的荧光与阈值线交叉时的循环数。
全部实验均对作为其来自各种组织来源的RNA的综合混合的参比RNA(例如,来自Clontech,Mountain View,CA的参比RNA #636538)归一化。每个qRT-PCR运行中纳入相同的参比RNA,从而允许比较不同实验运行之间的结果。
在一个实施方案中,样品是临床样品。在另一个实施方案中,样品用于诊断性测定中。在一些实施方案中,样品从组织获得。组织活检经常用来获得代表性组织片。备选地,可以按照已知或认为其含有目的细胞的组织或流体的形式间接地获得肿瘤细胞。可以从组织或从其他身体样品如尿、痰、血清或血浆检测基因或基因产物。通过筛选这类身体样品,可以通过测试这类身体样品的靶基因或基因产物,更容易地监测疗法进展。
在某些实施方案中,参比样品、参比细胞、参比组织、对照样品、对照细胞或对照组织是单一样品或来自相同受试者或个体的合并多重样品,所述的多重样品在获得测试样品时的一个或多个不同时间点获得。例如,在早于获得测试样品时的时间点从相同受试者或个体获得参比样品、参比细胞、参比组织、对照样品、对照细胞或对照组织。如果在疾病初诊期间获得参比样品并且当疾病已经进展时稍后获得测试样品,这种参比样品、参比细胞、参比组织、对照样品、对照细胞或对照组织可以有用。
在某些实施方案中,参比样品、参比细胞、参比组织、对照样品、对照细胞或对照组织是来自不是受试者或个体的一位或多位健康个体的合并多重样品。在某些实施方案中,参比样品、参比细胞、参比组织、对照样品、对照细胞或对照组织是来自不是受试者或个体的一位或多位患有疾病或病症的个体的合并多重样品。在某些实施方案中,参比样品、参比细胞、参比组织、对照样品、对照细胞或对照组织是来自正常组织的汇集RNA样品或来自不是受试者或个体的一位或多位个体的汇集血浆或血清样品。在某些实施方案中,参比样品、参比细胞、参比组织、对照样品、对照细胞或对照组织是来自组织的汇集RNA样品或来自不是受试者或个体的一位或多位患有疾病或病症的个体的汇集血浆或血清样品。
在某些实施方案中,参比样品、参比细胞、参比组织、对照样品、对照细胞或对照组织是样品细胞系。在某些实施方案中,参比样品、参比细胞、参比组织、对照样品、对照细胞或对照组织是血液。
在一些实施方案中,样品是来自个体的组织样品。在一些实施方案中,组织样品是血液或尿样品。在一些实施方案中,组织样品是血液样品。
在任何方法的一些实施方案中,BTK抑制剂是小分子BTK抑制剂。在一些实施方案中,小分子BTK抑制剂是化合物(A)或其可药用盐。
在任何方法的一些实施方案中,根据任何以上实施方案的个体或患者可以是人。
在又一个实施方案中,本文提供治疗SLE的方法。在一个实施方案中,该方法包括向患有SLE的个体施用有效量的小分子BTK抑制剂。在这样一个实施方案中,该方法还包括向该个体施用有效量的如下文描述的至少一种额外治疗药。在一些实施方案中,个体可以是人。
本文所述的BTK抑制剂可以在疗法中单独或与其他药活性剂组合使用。例如,附加的治疗药可以是抗炎剂、免疫调节剂、化疗剂、凋亡增强物、亲神经因子、治疗肝心血管疾病的活性剂、治疗肝脏疾病的活性剂、抗病毒剂、治疗血液病症的活性剂、治疗糖尿病的活性剂和治疗免疫缺陷病症的活性剂。第二治疗剂可以是NSAID抗炎剂。第二治疗剂可以是化疗剂。药物联合制剂或给药方案的第二化合物优选地与化合物(I)具有互补活性,从而它们没有彼此不利地影响。
在一些实施方案中,附加的治疗药选自:皮质类固醇类(例如,泼尼松、泼尼松龙(prednisolone)、甲基泼尼松龙和氢化可的松);病情改善型抗风湿药(“DMARD”,例如,免疫抑制剂或抗炎剂);抗疟疾剂(例如,羟氯喹和氯喹);免疫抑制剂(例如,环磷酰胺、硫唑嘌呤、麦考酚酸吗乙酯、甲氨蝶呤);抗炎剂(例如,阿司匹林、NSAID(例如,布洛芬(ibuprofen)、萘普生、吲哚美辛、萘丁美酮、塞来昔布));抗高血压剂(例如,钙通道阻滞剂(例如,氨氯地平、硝苯地平)和利尿剂(例如,呋塞米));他汀类(例如,阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀);抗B细胞剂(例如,抗CD20(例如,利妥昔单抗)、抗CD22);抗B淋巴细胞刺激剂(“抗BLyS”,例如,贝利单抗(belimumab)、blisibimod);1型干扰素受体拮抗剂(例如,anifrolumab);T细胞调节物(例如,rigerimod);阿巴西普(abatacept);抗凝血剂(例如,肝素、华法林);和维生素D补充物。
联合疗法可以在同时或依次方案施用。当依次施用时,组合可以在两次或更多次施用中给予。联合施用包括使用独立制剂或单一药物制剂的共施用,和按任何顺序的连续施用,其中优选地存在两种(或全部)活性剂同时发挥其生物学活性的时间段。前述共施用活性剂的任何的合适剂量是目前使用的那些剂量并且可以因额外治疗剂的联合作用(协同)而降低。
联合疗法可以是“协同”的,从而,当所述活性成分一起使用时所实现的作用大于因分别使用所述化合物而产生的作用的总和。将活性成分:(1)同时施用或递送;(2)交替或平行施用;或(3)通过某些其他方案施用时,可以达到协同效应。当以交替疗法递送时,可以在依次施用或递送化合物时达到协同效应。通常,在交替疗法期间,将有效剂量的每种活性成分依次地即顺次地施用,而在联合疗法中,将有效剂量的两种或更多种活性成分一起施用。
在联合疗法中,试剂盒可以包含(a)第一容器,其具有本公开的剂型组合物,和任选地,(b)第二容器,其中含有用于与本公开的剂型组合物共施用的第二药物制剂。在这些方面,试剂盒可以包含用于含有独立组合物的容器,如分割瓶(divided bottle)或分割箔包装(divided foil packet)。然而,独立组合物也可以包含于单个、未分割的容器内部。一般,试剂盒包含施用独立组分的说明。当独立组分优选地在不同的(例如,口服和肠胃外)剂型中施用、按不同剂量间隔施用时或当处方医师想要滴定组合的单独组分时,试剂盒形式特别有利。
可以通过任何合适的手段施用BTK抑制剂,所述的合适手段包括口服、肠胃外、肺内和鼻内以及(如果局部治疗需要)病灶内施用。在优选的实施方案中,口服施用BTK抑制剂。
包含BTK抑制剂的口服剂型包括但不限于包含BTK抑制剂或其可药用盐和一种或多种可药用赋形剂的片剂或胶囊剂。在一些实施方案中,可以根据本文提供的方法每日一次或两次施用包含BTK抑制剂的片剂或胶囊剂。在本文提供的某些实施方案中,口服剂型是包含化合物(A)或其可药用盐和一种或多种可药用赋形剂的片剂。
肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。可以通过任何合适的途径进行给药,例如通过注射,如静脉内或皮下注射,这部分地取决于施用是否为短暂或长期。本文中构思了各种给药方案,包括但不限于单次或在各种时间点多次施用、推注施用和脉冲输注。
本文所述的BTK抑制剂可以按照符合良好医学实践的方式配制、定剂量和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的具体疾病或病症、正在治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、疾病或病症的原因、活性剂递送部位、施用方法、施用计划和医疗执业者已知的其他因素。BTTK抑制剂不需要与当前用来预防或治疗所讨论疾病或病症的一种或多种活性剂一起配制,但是任选地与它们一起配制。此类的其他活性剂的有效量取决于该制剂中存在的BTK抑制剂的量、疾病或病症的类型或治疗和上文讨论的其他因素。这些药物通常以与本文所述相同的剂量并且采用与本文所述施用途径使用,或以约1%至99%的本文所述剂量使用,或以经验地/临床上确定适宜的任何剂量和任何途径使用。
III.包含BTK抑制剂的治疗性组合物
在本文的组合物、方法和试剂盒中提供小分子BTK抑制剂。如本文提供的小分子BTK抑制剂优选地是除结合性多肽或抗体之外的有机分子,并且可以使用已知的方法鉴定及化学合成。结合性有机小分子通常在大小方面小于约2000道尔顿,备选地在大小方面小于约1500、750、500、250或200道尔顿,其中可以在无需过多实验的情况下使用熟知的技术鉴定能够与如本文所述的BTK结合、优选地特异性结合的这类有机小分子。在这个方面,应当指出,本领域熟知筛选能够与多肽靶结合的分子的有机小分子文库的技术(参见,例如,PCT公开号WO 2000/00823和WO 2000/39585)。结合性有机小分子可以例如是醛、酮、肟、腙、半卡巴腙(semicarbazone)、卡巴肼、伯胺、仲胺、叔胺、N-取代的肼、酰肼、醇、醚、硫醇、硫醚、二硫化物、羧酸、酯、酰胺、脲、氨基甲酸酯、碳酸酯、缩酮、硫代缩酮、缩醛、硫代缩醛、芳基卤化物、芳基磺酸酯、烷基卤化物、烷基磺酸酯、芳族化合物、杂环化合物、苯胺类、烯、炔、二醇、氨基醇、噁唑烷、噁唑啉、噻唑烷、噻唑啉、烯胺、磺酰胺、环氧化物、氮丙啶、异氰酸酯、磺酰氯、重氮基化合物、酰基氯等。
在任何方法的一些实施方案中,BTK抑制剂选自:依鲁替尼、阿可替尼(acalabrutinib)、spebrutinib、BIIB068(Biogen)、BMS-986195(Bristol-Myers Squibb)、BMS-986142(Bristol-Myers Squibb)、BMS-935177(Bristol-Myers Squibb)、M2951(MerckKGaA)、PRN-1008(Principia Biopharma)、HM71224/LY3337641(Hanmi/Lilly)、ONO-4059/GS-4059(Gilead/Ono)、AC0058(ACEA Biosciences)、AC0025(ACEA Biosciences)、ABBV-599(AbbVie)、ABBV-105(AbbVie)、PF-303(Pfizer)、BI-BTK1(Boehringer Ingelheim)、CC90008(Celgene)、AS550(Carna Biosciences)、ARQ 531(Arqule)、AEG42766(AegeraTherapeutics)、BGB-3111(Beigene)、RN486(Simcere Pharma)、HCI-1401(LSK BioPharma/Hustman Cancer Inst.)、KBP-7536(KBP Bioscience)、RDX002(RedX Biopharma)、SNS-062(Sunesis)、TAS5315(Taiho Pharma)、TAX-020(Takeda)、WX486/WXFL-10230486(WuXiAppTec/Humanwell)和X-022(X-Rx Discovery)。
在一些实施方案中,BTK抑制剂是化合物(A)或其可药用盐。本文提供的BTK抑制剂的可药用盐可以用于本文的方法。如本文所用,术语“可药用盐”意在包括活性化合物的盐,其中取决于本文所述的化合物上存在的具体取代基,用相对无毒的酸或碱制备所述盐。当本发明的化合物含有相对酸性的官能团时,通过使中性形式的这类化合物与足够量的所需碱在无溶剂下(neat)或在合适的惰性溶剂中接触,获得碱加成盐。衍生自可药用无机碱的盐的例子包括铝盐、铵盐、钙盐、铜盐、铁盐、亚铁盐、锂盐、镁盐、锰盐、亚锰盐、钾盐、钠盐、锌盐等。衍生自可药用有机碱的盐包括以下者的盐:伯胺、仲胺和叔胺,包括取代胺、环状胺、天然存在的胺等,如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N,N'-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、还原葡糖胺(glucamine)、葡萄糖胺、组氨酸、哈胺(hydrabamine)、异丙胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、多胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等。当本发明的化合物含有相对碱性的官能团时,通过使中性形式的这类化合物与足够量的所需酸在无溶剂下或在合适的惰性溶剂中接触,获得酸加成盐。可药用的酸加成盐的例子包括衍生以下无机酸的那些盐,如氢氯酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢酸盐、磷酸二氢酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、氢碘酸盐或亚磷酸盐等,以及衍生自相对无毒的有机酸的盐,如乙酸盐、丙酸盐、异丁酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、延胡索酸盐、扁桃酸盐、酞酸盐、苯磺酸盐、对-甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐等。还包括氨基酸的盐如精氨酸盐等,和有机酸(如葡糖醛酸或半乳糖醛酸)的盐等(参见,例如,Berge,S.M.等人,"Pharmaceutical Salts",Journal of Pharmaceutical Science,1977,66,1-19)。本发明的某些具体化合物含有允许化合物转化成碱加成盐或酸加成盐的碱性官能团和酸性官能团。
可以通过使盐与碱或酸接触并以常规方式分离母体化合物,再生中性形式的化合物。母体形式化合物在某些物理特性(如极性溶剂中的溶解度)方面不同于多种盐形式,但是出于本发明目的,盐与母体形式的化合物等同。
除盐形式之外,本发明提供前药形式的化合物。如本文所用,术语“前药”指在生理条件下轻易发生化学变化以提供本发明化合物的那些化合物。另外,前药可以在离体环境通过化学方法或生物化学方法转化成本发明的化合物。例如,在含有合适酶或化学试剂的透皮储库贴剂(transdermal patch reservoir)放置时,前药可以缓慢转化成本发明的化合物。
本发明的前药包括这样的化合物其中氨基酸残基或具有两个或更多个(例如,二、三个或四个)氨基酸残基的多肽链通过酰胺或酯键与本发明化合物的游离氨基、羟基或羧酸基共价接合。氨基酸残基包括但不限于20种通常用三字母符号命名的天然存在性氨基酸,并且还包括磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸酪氨酸、4-羟脯氨酸、羟赖氨酸、锁链素(demosine)、异锁链素(isodemosine)、γ-羧谷氨酸、马尿酸、八氢吲哚-2-羧酸、statine、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、青霉胺、鸟氨酸、3-甲基组氨酸、正缬氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、瓜氨酸、同型半胱氨酸、高丝氨酸、甲基-丙氨酸、对苯甲酰基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、炔丙基甘氨酸、肌氨酸、甲硫氨酸砜和叔丁甘氨酸。
还涵盖其他类型的前药。例如,本发明化合物的游离羧基可以衍生化为酰胺或烷基酯。作为另一个例子,包含游离羟基的本发明的化合物可以通过使羟基转化成以下基团而衍生化为前药,如,但不限于磷酸酯、半琥珀酸酯、氨基乙酸二甲酯或羟基磷酰基氧甲氧羰基,如Fleisher,D.等人,(1996)Improved oral drug delivery:solubilitylimitations overcome by the use of prodrugs Advanced Drug Delivery Reviews,19:115中所概述。还包括具有羟基和氨基的氨基甲酸酯前药,还包括具有羟基的碳酸酯前药、磺酸酯和硫酸酯。还涵盖羟基衍生化为(酰氧基)甲醚和(酰氧基)乙醚,其中酰基可以是任选用基团取代的烷基酯,所述基团包括但不限于醚、胺和羧酸官能团,或其中酰基是如上文所述的氨基酸酯。J.Med.Chem.,(1996),39:10中描述了这种类型的前药。更具体的例子包括用以下基团替换醇基的氢原子,如(C1-6)烷酰氧基甲基、1-((C1-6)烷酰氧基)乙基、1-甲基-1-((C1-6)烷酰氧基)乙基、(C1-6)烷氧基羰基氧甲基、N-(C1-6)烷氧羰基氨基甲基、琥珀酰基、(C1-6)烷酰基、α-氨基酸(C1-4)烷酰基、芳基酰基和α-氨酰基、或α-氨酰基-α-氨酰基,其中每个α-氨酰基独立选自天然存在的L-氨基酸、P(O)(OH)2、-P(O)(O(C1-6)烷基)2或糖基(因移除糖的半缩醛形式的羟基产生的原子团)。
关于前药衍生物的额外的例子,例如参见,a)Design of Prodrugs,H.Bundgaard编著(Elsevier,1985)和Methods in Enzymology,第42卷,第309-396页,K.Widder等人编著(Academic Press,1985);b)A Textbook of Drug Design and Development,Krogsgaard-Larsen和H.Bundgaard编著,H.Bundgaard的第5章"Design and Applicationof Prodrugs,"第113-191页(1991);c)H.Bundgaard,Advanced Drug Delivery Reviews,8:1-38(1992);d)H.Bundgaard等人,Journal of Pharmaceutical Sciences,77:285(1988);和e)N.Kakeya等人,Chem.Pharm.Bull.,32:692(1984),所述文献各自专门地通过引用方式并入本文。
本发明的某些化合物可以按非溶剂化形成以及溶剂化形式(包括水合形式)存在。通常,溶剂化形式等同于非溶剂化形成并且意在涵盖于本发明的范围内。本发明的某些化合物可以按多种晶型或无定形形式存在。通常,全部物理形成均对本发明构思的用途等同并意在处于本发明的范围内。
本发明的某些化合物拥有不对称碳原子(光学中心)或双键;外消旋物、非对映异构体、几何异构体、位置异构体和个体异构体(例如,独立的对映异构体)均意在涵盖于本发明的范围内。
IV.药物制剂
在本文的方法和试剂盒中提供BTK抑制剂的药物制剂。
在任何方法的一些实施方案中,基于患者体重,BTK抑制剂(例如,化合物(A)或其可药用盐)按约0.1mg/kg/天至约100mg/kg/天、约0.5mg/kg/天至约20mg/kg/天、或约1mg/kg/天至约10mg/kg/天的剂量施用。在一些实施方案中,化合物(A)或其可药用盐作为片剂按约10至800mg的剂量施用。在一些实施方案中,化合物(A)作为片剂中的游离碱按约25至300mg的剂量施用。在一些实施方案中,片剂包含25至300mg作为游离碱的化合物(A)和延胡索酸,其中化合物(A)/延胡索酸的重量比是约1:5至约3:1;或约1:2至约2:1;或约1:1.5至约1.5:1。在一些实施方案中,片剂包含25至300mg作为游离碱的化合物(A)和延胡索酸,并且其中延胡索酸含量是约5wt.%至约50wt.%、约5wt.%至约40wt.%、约5wt.%至约30wt.%、约10wt.%至约30wt.%、约20wt.%至约25wt.%、约5wt.%至约15wt.%、或约10wt.%至约15wt.%。在以上实施方案的某些中,片剂重量是约100mg、约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg或约1000mg。在一些实施方案中,片剂还包含至少一种选自填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂和助流剂的可药用赋形剂。在一些实施方案中,片剂包含乳糖和微晶纤维素。
本公开的片剂组合物可以进一步适当地包含一种或多种可药用赋形剂,所述可药用赋形剂选自但不限于填充剂(稀释剂)、崩解剂、粘合剂、助流剂和润滑剂。填充剂(或稀释剂)可以用来增加构成片剂的粉状药物的堆体积。崩解剂可以用来支持片剂在其摄入时破碎成小碎片,理想地独立的药物粒子,并且因而促进药物的快速溶解和吸收。粘合剂可以用来确保可以形成具有所要求的机械强度的颗粒剂和片剂并且在已经压缩片剂后使其在一起,防止它在包装、配送和例行处置期间破碎成其组分粉末。助流剂可以用来在生产期间改善构成片剂的粉末的流动性。润滑剂可以用来在制造期间确保造片粉末不黏附于用来压制片剂的设备、在混合和压制期间改善粉末的流动并且在成品片剂从设备喷出时最小化摩擦和破裂。
填充剂和粘合剂可以包括磷酸氢钙、微晶纤维素乳糖、或任何其他合适的填料(bulking agent)。合适填充剂的例子包括微晶纤维素,如Avicel PH 101、AvicelPH102、Avicel PH 200、Avicel PH 105、Avicel DG、Ceolus KG 802、Ceolus KG 1000、SMCCSO和Vivapur 200;乳糖一水合物,如乳糖FastFlo;与其他赋形剂共加工的微晶纤维素,如与乳糖一水合物共加工的微晶纤维素(MicroceLac 100)和与胶态二氧化硅共加工的微晶纤维素(SMCCSO、Prosolv 50和Prosolv HD 90);异麦芽酮糖衍生物的混合物如galenIQ;和其他合适的填充剂及其组合。填充剂可以作为颗粒内组分和/或作为颗粒外组分存在。在一些具体方面,本公开的片剂组合物包含乳糖和微晶纤维素。
可以在公开的制剂中包含崩解剂以促进颗粒在压实物内部彼此分离并且维持释放的颗粒彼此分离。崩解剂可以作为颗粒内组分和/或作为颗粒外组分存在。崩解剂可以包括任何合适的崩解剂,如,例如,交联型聚合物,如交联的聚乙烯吡咯烷酮和交联的羧甲基纤维素钠或交联羧甲纤维素钠。在一些具体方面,崩解剂是交联羧甲纤维素钠。崩解剂含量适当地是约1wt.%、约1.5wt.%、约2wt.%、约2.5wt.%、约3wt.%、约3.5wt.%、约4wt.%、约4.5wt.%、或约5wt.%及其范围,如约1wt.%至约5wt.%、或约2wt.%至约4wt.%。
助流剂可以例如包括胶态二氧化硅,包括高度分散的硅石(silica)或任何其他合适的助流剂,如动物或植物脂肪或蜡。在一些具体方面,助流剂是烟雾硅胶(fumed silica)。助流剂含量适当地是约0.1wt.%、约0.5wt.%、约1wt.%、约1.5wt.%、约2wt.%、约2.5wt.%或约3wt.%及其范围,如约0.1wt.%至约3wt.%、约0.5wt.%至约2wt.%、约0.5wt.%至约1.5wt.%。
润滑剂可以用于药物组合物中压制颗粒。润滑剂可以例如包括聚乙二醇(例如,具有约1000至约6000的分子量)、硬脂酸镁和硬脂酸钙、硬脂酰富马酸钠、滑石、或任何其他合适的润滑剂。在一些具体方面,润滑剂是硬脂酸镁和/或硬脂酰富马酸钠。润滑剂可以作为颗粒内组分和/或作为颗粒外组分存在。润滑剂含量适当地是约0.5wt.%、约1wt.%、约1.5wt.%、约2wt.%、约2.5wt.%、约3wt.%、约3.5wt.%、约4wt.%、约4.5wt.%、或约5wt.%及其范围,如约0.5wt.%至约5wt.%、约1wt.%至约4wt.%、约1wt.%至约3wt.%、或约1wt.%至约2wt.%。
可以施加包衣(如薄膜包衣)至本公开的片剂。薄膜衣可以例如用来有助于容易吞咽片剂。也可以使用薄膜衣改善滋味和外观。如果需要,薄膜衣可以是肠溶衣。薄膜衣可以包含聚合成膜材料,如羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯共聚物,和聚乙烯醇-聚乙二醇接枝共聚物如Opadry和Kollicoat IR。除成膜聚合物之外,薄膜衣还可以包含增塑剂,例如聚乙二醇、表面活性剂,例如型,和任选地颜料,例如二氧化钛或氧化铁类。薄膜包衣还可以包含滑石作为抗胶粘剂。薄膜衣一般按剂型的重量占据小于约5%。
本文中的制剂也可以根据正在治疗的特定适应证需要而含有多于一种活性成分,优选地是具有并未相互不利影响的互补活性的那些活性成分。这种活性成分以有效用于预期目的的量适当地组合存在。
活性成分可以包埋于制备的微胶囊(例如分别通过凝聚技术或界面聚合(例如,羟甲基纤维素微胶囊或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊))、胶态药物递送系统(例如,脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或粗乳液中。此类技术在Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编著(1980)中公开。
可以制备持续释放制品。持续释放制品的合适例子包括含有BTK抑制剂的固态疏水性聚合物半通透性基质,所述基质处于成型制品(例如,薄膜或微胶囊)形式。
待用于体内施用的制剂通常是无菌的。可以例如通过借助无菌滤膜过滤轻易地实现无菌性。
V.制造品
另一个实施方案中,提供一种制造品,所述制造品含有上文描述的可用于治疗、预防和/或诊断病症的材料。该制造品包括容器以及或在该容器上或与之结合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小药瓶、注射器、静脉内输液袋等。容器可以从多种材料如玻璃或塑料中形成。该容器容纳了本身或与另一种组合物组合时有效治疗、预防和/或诊断病症的组合物并且可以具有无菌接入口(例如该容器可以是静脉内输液袋或是具有皮下注射针头可穿透的瓶塞的小药瓶)。组合物中的至少一种活性物质是本文所述的BTK抑制剂。标签或包装插页说明该组合物用于治疗选择的病状。而且,制造物可以包含(a)其中含有组合物的第一容器,其中所述组合物包含BTK抑制剂;和(b)其中含有组合物的第二容器,其中所述组合物包含其他细胞毒性剂或另外的治疗剂。
在一些实施方案中,该制造品包含容器、所述容器上的标签和包含于所述容器内部的组合物;其中组合物包括一种或多种试剂(例如,与一种或多种生物标记物结合的第一抗体(例如,B-9Santa Cruz Biotechnology抗体)或针对本文所述的一种或多种生物标记物的探针和/或引物)、容器上表明该组合物可以用来评价样品中一种或多种生物标记物存在的标签和使用试剂评价样品中一种或多种生物标记物存在的说明。制造品还可以包含一套用于制备样品和利用试剂的说明和资料。在一些实施方案中,制造品可以包括试剂如第一和第二抗体,其中第二抗体与标记(例如,酶标记)缀合。在一些实施方案中,制造品包含一种或多种针对本文所述的生物标记物中一者或多者的探针和/或引物。
在这个实施方案中制造品还可以包含指示组合物可以用来治疗具体病状的包装插页。备选或额外地,该制造品可以还包含第二(或第三)容器,其包含可药用缓冲剂,如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸缓冲盐水、Ringer溶液和右旋葡萄糖(dextrose)溶液。它可以还包括从商业和用户观点看想要的其他材料,包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
制造品中的其他任选组分包括一种或多种缓冲剂(例如,封闭缓冲液、洗涤缓冲液、底物缓冲液等)、其他试剂如底物(例如,被过酶标记物化学改变的生色原)、表位修复溶液、对照样品(阳性和/或阴性对照)、对照切片等。
实施例
以下是方法和组合物的实施例。应当理解,鉴于上文提供的一般性描述,可以实施多种其他实施方案。
血液样品分析:3-基因浆母细胞标签表达测定。在PAXgene RNA管(PreAnalytiX)中采集血液;使用市售试剂盒根据生产商说明书(Qiagen)提取总RNA。
生物标记物:IgJ、TXNDC5、MZB1。参比基因:TMEM55B
通过人类基因组U133 Plus 2.0阵列(Affymetrix Inc.,Santa Clara,CA)评估血液样品中候选生物标记物基因的表达。微阵列杂交由Asuragen Inc.(Austin,TX)进行。总结原始CEL文件数据并且使用Robust多阵列平均法(RMA)归一化并使用R和Bioconductor分析。
备选地,通过Fluidigm qPCR测定法定性血液样品中候选生物标记物基因的表达。3基因分数计算自IgJ、TXNDC5和MZB1的平均,并且使用参比基因TMEM55B归一化。使用在Cobas 4800平台(Roche Molecular Systems)上开发的这种测定法,评估血液样品。
实施例1:浆母细胞转录组的表征
进行体外分化的CD20loCD38+浆母细胞、CD20+CD27+活化的B细胞和CD20+CD27-初始B细胞的转录概况分析,以鉴定在B细胞亚群之间强烈差异性表达的基因(图1A-1)。以0.001的错误发现率(FDR)鉴定到86个在浆母细胞中表达比活化型B细胞或初始B细胞高>10倍的基因。进行这些数据的进一步精修以仅纳入浆母细胞中具有>5nRPKM的基因,产生总计40个基因。这些基因中许多包含重链区段和轻链区段以及涉及免疫球蛋白蛋白质生物合成的基因。选择了不是免疫球蛋白基因座的部分的生物标记物候选者,从而从候选基因的列表移除这些候选者(图1B)。
通过进行体外浆母细胞分化测定法,确认浆母细胞分化受Bruton’s酪氨酸激酶(BTK)活性调节,其中将人记忆型B细胞置于分化条件并且随后在5天后,使用针对CD20loCD38++浆母细胞的流式细胞定量法,对其测量。使用BTK激酶活性的特定和强力抑制剂GDC-0852以剂量依赖性方式抑制CD40L诱导的浆母细胞分化(图7)。GDC-0852是(S)-2-(5-氟-2-(羟甲基)-3-(1-甲基-5-(5-(2-甲基-4-(氧杂环丁-3-基)哌嗪-1-基)吡啶-2-基氨基)-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)-苯基)-3,4,6,7,8,9-六氢吡啶并[3,4-b]吲嗪-1(2H)-酮,下文显示其结构:
为了确保选择的生物标记物候选者可以准确地以高灵敏度和高特异性确定样品中浆母细胞的比例,进行来自3位供体的体外分化的浆母细胞的2倍系列稀释,从40,000个至39个细胞,稀释至1,000,000个来自两位独立供体的PBMC。使用Fluidigm,评价候选浆母细胞标记物基因的表达水平,并报告为相对于持家基因,HPRT1的ΔCt。线性回归用来对依据log10浆母细胞频率所预测的候选基因的ΔCt建模,以浆母细胞供体和PBMC供体作为协变量。我们的大部分候选基因显示与浆母细胞频率强烈关联,及浆母细胞供体之间差异最小。三个基因IGJ、MZB1和TXNDC5尤其表现良好,分别显示r2为0.84、0.75和0.69(图2B-1、图2B-2、图2B-3、图2B-4)。取三个基因的平均作为标签分数产生了r2为0.79的标签评分。
为了在体内分化的浆母细胞中验证该基因标签,测量它们在直接分选自五位健康供体的浆母细胞中的表达,其中所述健康供体之前一周已经接种流感疫苗。相对于初始和记忆型B细胞,全部三个候选生物标记物基因在浆母细胞中更高度表达(图2C-1、图2C-2、图2C-3、图2C-4)。
实施例2:浆母细胞标记物基因在体内与浆母细胞频率相关
在来自具有配对RNA测序数据的ROSE II期临床试验的狼疮患者队列中[3],使用流式细胞术,测量全血中的浆母细胞频率。显示选定的浆母细胞标签基因展示与IgD-CD19+CD27++CD38++浆母细胞的频率高相关(图2D-1、图2D-2、图2D-3、图2D-4)。IGJ、MZB1和TXNDC5显示在与浆母细胞含量的最高相关系数中,Spearm相关系数分别是0.66、0.71和0.71。取三个标签基因的平均作为标签显示了与浆母细胞频率的强相关性(Spearmanρ=0.71)。这些结果显示,可以使用选定的三个基因标签在全血样品中测量浆母细胞的相对丰度。
实施例3:浆母细胞标签与SLE中增加的疾病活动性相关
先前工作已经展示了浆母细胞频率和如依据红斑狼疮中雌激素安全性(SELENA)–系统性红斑狼疮疾病活动性指数(SLEDAI)分数所测量的疾病严重程度之间的强相关性。这种相关性似乎受患有静止性疾病和活动性疾病的患者中的差异驱动。在来自EXPLORERII期临床试验的中度至重度肾外狼疮队列内部观察[4],发现浆母细胞标签显示与疾病活动性的低、但显著的相关性(Spearmanρ=0.19,p=0.03,图3A)。更密切地考察驱动这种相关性的SLEDAI组分,发现三个分项分数尤其与更高的浆母细胞丰度相关:DNA结合作用、低补体和淋巴细胞减少(图3B-1、图3B-2、图3B-3)。
在多个狼疮患者队列中,在浆母细胞丰度和补体组分C3和C4的血清浓度之间发现中度负相关(Spearmanρ分别=-0.34,-0.38,图3C)。在这些队列中还观察到浆母细胞含量和抗双链DNA抗体的滴度之间的中等相关性(Spearman’sρ=0.39,图3C-1、图3C-2、图3C-3)。
大部分狼疮患者显示干扰素活性的转录标签[2,5]。浆母细胞标签显示与使用三个基因标签测量的干扰素活性有中度相关性(图3D-1和图3D-2;[5])。相关性似乎受干扰素活性水平高的患者亚群中升高的浆母细胞标签表达驱动,低干扰素标签的大部分患者具有浆母细胞基因的低表达,而干扰素活性高的患者显示低水平和高水平浆母细胞基因表达的混杂状况。但是,浆母细胞标签与疾病严重程度和血清学活动性相关,与干扰素标签无关;使用反向模型选择,以Akaike信息标准作为度量,浆母细胞标签和干扰素标签预示血清补体水平,并且浆母细胞标签单独预示抗dsDNA抗体滴度和SLEDAI。
在浆母细胞标签分数和作为复合分数或针对个体疾病域的British Isles LupusAssessment Group(BILAG)活动性指数之间未见关联性。这些数据支持浆母细胞在自身抗体、淋巴细胞减少和低补体血症驱动的血清学疾病活动性中的作用。
实施例4:利妥昔单抗治疗减少浆母细胞标签
从来自评估利妥昔单抗在SLE中安全性和疗效的II期临床试验的两个中度至重度狼疮患者队列采集浆母细胞标签值。队列是狼疮性肾炎(LUNAR)或肾外狼疮(EXPLORER)患者[4,6]。治疗期间,并入年龄、人种、伴随用药、干扰素活性、SLEDAI、访视、治疗组及它们的相互作用的协变量,以建模的患者作为随机效应,对浆母细胞标签值的混合效应建模,鉴定到浆母细胞标签特异性在利妥昔单抗治疗的患者内的明显下降(图4A、图4B)。这种影响在接受利妥昔单抗输注后两周的时间点最明显,影响随时间削弱。在EXPLORER试验中,第四次利妥昔单抗输注后两周,在第28周观察到3.48倍最大下降(p=2×10-11)。同样地,在LUNAR试验中,在第28周时间点观察到最低水平的浆母细胞标签表达,降低3.31倍(p=0.0011)。
在EXPLORER试验中,监测患者针对小鼠-人嵌合抗体(HACA)的抗体的存在。尽管利妥昔单抗治疗的大部分患者显示浆母细胞标签下降,但观察到继续形成抗药物抗体的患者在利妥昔单抗治疗后显示浆母细胞标签下降有限至无下降(图4C)。使用与上文相同的线性混合效应模型,2.8倍更高的浆母细胞标记物基因表达存在于继续形成HACA的患者中(p=0.0007)。
实施例5:狼疮标准医护治疗改变浆母细胞标签
先前研究确定了不同免疫抑制治疗和浆母细胞相关基因的表达降低之间的关联性[7]。检查来自EXPLORER临床试验的筛查样品,与硫唑嘌呤治疗的患者相比,低得多的浆母细胞标签表达存在于麦考酚酯或甲氨蝶呤治疗的患者中(图5A)。在基线时接受麦考酚酯治疗的患者中观察到来自LUNAR试验的患者中浆母细胞标签基因表达较低的趋势(图5B),尽管相对较少的患者在MMF治疗池中。
实施例6:患者人种/族裔影响浆母细胞标签水平
患者群体之间生物标记物水平往往不同。数据分析揭示在EXPLORER临床试验人群和ROSE临床试验人群中,相对于非洲裔或西班牙裔血统患者,欧洲血统患者的浆母细胞标签的水平显著较低。当考虑干扰素活性、年龄和疾病严重程度时,这保持真实(图6A、图6B、图6C)。
实施例7:BTK抑制作用对浆母细胞分化的影响
浆母细胞分化:从健康供体PBMC分离记忆型B细胞(Miltenyi记忆B细胞分离试剂盒)。为了进行浆母细胞分化,将1.5x10^5/ml的记忆型B细胞随后在存在细胞因子混合物:IL-2(20U/ml)、IL-10(50ng/ml)、IL-15(10ng/ml)、IL-6(50ng/ml)、IFNa(10ng/ml)时培养并用ODN2006(TLR-9配体)5ug/ml或CD40L(3ug/ml)刺激5天。使用始于10uM的抑制剂3倍剂量滴定,在单独溶媒(DMSO)和多种浓度的GDC-0852存在时实施浆母细胞分化。进行流式细胞术以计算(CD20-CD38++)浆母细胞百分数并评估GDC-0852的抑制作用。
RNA制备:在5天从DMSO和GDC-0852(370nM)处理的细胞(n=4),从培养细胞提取RNA。在RLT缓冲液中使用Qiashredder(Qiagen,Valencia,CA)破坏细胞并且随后使用包含柱上DNA酶消化的RNeasy微型试剂盒(Qiagen)提取RNA。使用NanoDrop 8000(ThermoScientific)确定总RNA浓度和RNA样品的完整性。分离的RNA用于Fluidigm定量RT-PCR分析。
QT PCR:使用iScript cDNA合成试剂盒(Biorad,Hercules,CA),对100ng总RNA进行cDNA合成。对3个基因(IgJ、MZB1、TXNDC5,包括持家基因TMEM55B)进行基因特异性预扩增(Applied Biosystems)。使用生产商的方案,使用BioMark 48.48动态阵列(FluidigmCorporation)进行RT-PCR。使用BioMark数据采集软件,采集数据,并且使用BioMark RT-PCR分析软件(V.2.1.1,Fluidigm)获得CT值。针对HPRT1计算相对丰度(dCt):2log-(平均Ct基因-平均Ct HPRT1)。为了统计分析,低于检测下限的值设定成低于最低记录值1个Ct。
使用R编程语言书写的<>或订制脚本,执行统计分析。为了鉴定基因表达的差异,我们将线性混合效应模型针对log2变换的相对转录物丰度拟合,以处理作为固定效应并以供体作为随机效应。为了比较DMSO处理的样品和化合物处理的样品之间的浆母细胞百分数,我们使用Wilcoxon秩和检验。使用GraphPad Prism软件计算BTK抑制的IC50值。人重组白介素(IL)-2和干扰素-α(IFN-α)购自R&D systems(Minneapolis,MN)并且IL-10、IL-6和IL-15购自Peprotech(Rocky Hill,NJ)。CpG(ODN2006)购自Invivogen(San Deigo,CA)并且CD40L购自R&D systems(Minneapolis,MN)。
结果:B细胞分化成浆母细胞可以因多种活化刺激物而发生并且涉及不同的分子变化。通过CD40、和/或Toll样受体(TLR)活化B细胞导致CD20+CD27++记忆型B细胞分化成CD20-CD38++浆母细胞。使用CD40L刺激,通过T细胞介导的应答,或使用Toll-样受体配体(CpG)的T细胞非依赖性应答,我们评价BTK抑制剂GDC-0852在浆母细胞分化过程中的影响
在第5天,GDC-0852以剂量依赖性方式抑制CD40L诱导的浆母细胞分化,IC50效价为20.0nM(+/-0.002)(图7)。对DMSO处理的细胞和GDC-0852处理的细胞的基因表达分析显示,浆母细胞标签基因IgJ(p=0.011)、MZB1(p=0.0023)、TXNDC5(p=0.0032)和复合的浆母细胞3个基因标签(p=0.0026)显著降低,同时初始B细胞显示非常低水平的标签基因表达(p<1x10-6)(图8)。将基因表达值与浆母细胞丰度比较,我们在3个基因标签和浆母细胞百分数之间观察到强相关性(Spearman rho=0.81)(图9)。CpG介导的浆母细胞分化(n=3)也受GDC-0852抑制,IC50效价为48nM(+/-57)(图10)。
当介绍本公开或其优选实施方案的要素时,冠词“一个(a)”、“一种(an)”、“该(the)”和“所述”意指存在一个或多个所述要素。术语“包含”、“包括”和“具有”意在是包括性的并且意指可以存在除所列要素之外的额外要素。
虽然已经出于清晰理解的目的,以说明和举例方式某种程度地详细描述前述发明,但是这些说明和实施例不应当解释为限制范围。本文中援引的全部专利和科学文献的公开内容通过引用方式明确地以其整体并入。
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Claims (20)
1.一种治疗患有自身免疫性疾病或炎性疾病个体的方法,包括向个体施用治疗有效量的BTK抑制剂,其中已经发现来自个体的样品具有一种或多种选自IgJ、Mzb1和Txndc5的生物标记物的升高水平。
2.治疗个体中自身免疫性疾病或炎性疾病的方法,所述方法包括:
(a)确定来自个体的样品包含一种或多种选自IgJ、Mzb1和Txndc5的生物标记物的升高水平;以及
(b)向个体施用有效量的BTK抑制剂,因而治疗免疫疾病或病症。
3.为患有自身免疫性疾病或炎性疾病个体选择疗法的方法,包括确定一种或多种选自IgJ、Mzb1和Txndc5的生物标记物的水平;并且基于生物标记物的水平选择药物。
4.一种通过确定来自个体的样品中一种或多种选自IgJ、Mzb1和Txndc5的生物标记物水平,鉴定患有自身免疫性疾病或炎性疾病的个体的方法,所述个体或多或少很可能显示从包含BTK抑制剂的治疗获益,其中样品中升高的生物标记物水平表示个体更可能显示从包含BTK抑制剂的治疗获益或降低的生物标记物水平表示个体较少可能显示从包含BTK抑制剂的治疗获益。
5.鉴定患有自身免疫性疾病或炎性疾病个体以接受BTK抑制剂的测定,所述方法包括:
(a)确定来自个体的样品中一种或多种选自IgJ、Mzb1和Txndc5的生物标记物的水平;并且
(b)基于生物标记物的水平推荐施用BTK抑制剂。
6.诊断试剂盒,包含一种或多种用于确定来自患有自身免疫性疾病或炎性疾病个体的样品中一种或多种选自IgJ、Mzb1和Txndc5的生物标记物的水平的试剂,其中检测到升高水平的生物标记物意味着用BTK抑制剂治疗个体时疗效增加,并且其中检测到低水平或基本上不可检出水平的生物标记物意味着用BTK抑制剂治疗具有自身免疫性疾病或炎性疾病个体时疗效降低。
7.根据权利要求3和4中任一项所述的方法,其中方法还包括向个体施用有效量的BTK抑制剂。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法、测定法和/或试剂盒,其通过测量相对于参比水平的生物标记物的RNA水平进行确定生物标记物的水平。
9.根据权利要求8所述的方法、测定和/或试剂盒,其中测量RNA水平包括扩增。
10.根据权利要求9所述的方法、测定和/或试剂盒,其中测量RNA水平包括定量PCR。
11.根据权利要求10所述的方法、测定和/或试剂盒,其中测量RNA水平包括扩增RNA并检测扩增产物,因而测量相对于参比水平的RNA的水平。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法、测定和/或试剂盒,其中样品是血液样品。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法、测定和/或试剂盒,其中BTK抑制剂是抗体、结合性多肽、小分子和/或多核苷酸。
14.根据权利要求13所述的方法、测定和/或试剂盒,其中BTK抑制剂是小分子。
16.根据权利要求中1-15任一项所述的方法、测定和/或试剂盒,其中自身免疫性疾病或炎性疾病是系统性红斑狼疮。
17.根据权利要求16所述的方法、测定和/或试剂盒,其中自身免疫性疾病或炎性疾病是狼疮性肾炎。
18.根据权利要求16所述的方法、测定和/或试剂盒,其中自身免疫性疾病或炎性疾病是肾外狼疮。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法、测定法和/或试剂盒,其中选择生物标记物中的两种。
20.根据权利要求1-18中任一项所述的方法、测定法和/或试剂盒,其中选择生物标记物中的三种。
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