JP2017067706A - 腎疾患診断のためのエクソソーム回収法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(1)生体試料からエクソソームを分離するステップ、(2)分離したエクソソームの中から、α8インテグリンを表面に発現しているエクソソームを分取するステップを含む、メサンギウム細胞由来のエクソソームの回収法が提供される。
【選択図】なし
Description
以下の発明は、主として以上の成果に基づく
[1]以下のステップ(1)及び(2)を含む、メサンギウム細胞由来のエクソソームの回収法:
(1)生体試料からエクソソームを分離するステップ;
(2)分離したエクソソームの中から、α8インテグリンを表面に発現しているエクソソームを分取するステップ。
[2]抗α8インテグリン抗体による捕捉によって、ステップ(2)の分取が行われる、[1]に記載の回収法。
[3]抗α8インテグリン抗体が固相担体に固定化されている、[2]に記載の回収法。
[4]固相担体が磁気ビーズである、[3]に記載の回収法。
[5]生体試料が血漿、血清又は尿である、[1]〜[4]のいずれか一項に記載の回収法。
[6]遠心処理、密度勾配遠心分離、フィルター処理、サイズ排除クロマトグラフィー及び超遠心処理からなる群より選択される一以上の処理によって、ステップ(1)の分離が行われる、[1]〜[5]のいずれか一項に記載の回収法。
[7]ステップ(2)の後、抗α8インテグリン抗体に捕捉された状態でエクソソームを回収する、[1]〜[6]のいずれか一項に記載の回収法。
[8]ステップ(2)の後、抗α8インテグリン抗体からエクソソームを脱離し、回収する、[1]〜[6]のいずれか一項に記載の回収法。
[9]α8インテグリンの発現を指標として回収したエクソソーム内又は表面の標的分子を検出することを特徴とする、腎疾患の検査法。
[10]標的分子がRNA、DNA又はタンパク質である、[9]に記載の検査法。
[11]RNAがmicroRNAである、[10]に記載の検査法。
[12]エクソソームが[1]〜[6]のいずれか一項に記載の回収法で回収されたものである、[9]〜[11]のいずれか一項に記載の検査法。
[13]エクソソームが[7]に記載の回収法で回収されたものであり、
抗α8インテグリン抗体に捕捉された状態のエクソソームを試料として標的分子を検出する、[9]〜[11]のいずれか一項に記載の検査法。
[14]α8インテグリンの発現を指標として一定量の生体試料から回収したエクソソームの量を検出することを特徴とする、検査法。
(1)生体試料からエクソソームを分離するステップ
(2)分離したエクソソームの中から、α8インテグリンを表面に発現しているエクソソームを分取するステップ
1.メサンギウム細胞由来エクソソームの表面抗原の解析
(1)方法
ヒト培養メサンギウム細胞(Normal human mesangium cell)(RONZA社)を5% CO2、37℃の条件で培養した。培養後の上清を回収し、従来法でエクソソームを濃縮した。得られた溶液と、抗CD63抗体が予め固相化された磁気ビーズExosomes-Human CD63 Isolation/Detection(Invitrogen; 10606D)とを混合し、1時間、常温でインキュベートした。専用マグネット台に静置することで磁気ビーズを回収し、抗α8インテグリン抗体を用いた免疫染色(電子顕微鏡)に供した。
ヒト培養メサンギウム細胞由来のエクソソーム上には、メサンギウム細胞本体と同様に、α8インテグリンが発現していることが確認された(図1)。
(1)方法
プロテインGが固相化された磁気ビーズ(Exosomes Immunoprecipitation (proteinG) ;Imvitrogen ;10612D)を、マニュアルに沿って抗α8インテグリン抗体(Santa Cruz Niotechnology, INC; sc-365798)とインキュベートし、抗α8インテグリン抗体でコートされた磁気ビーズを作製した。
電子顕微鏡による観察の結果、磁気ビーズ表面にエクソソームが捕捉されていることが確認された(図2)。即ち、抗α8インテグリン抗体でコートされた磁気ビーズによって、ヒト血漿からα8インテグリンを発現する、メサンギウム細胞由来のエクソソームを回収することに成功した。尚、内皮細胞(HUVEC)からは、抗α8インテグリン抗体でコートされた磁気ビーズでエクソソームを回収することはできなかった。即ち、高い選択性があることが示された。
(1)方法
回収したエクソソーム(磁気ビーズに捕捉された状態)から、Trizolを用いたRNA抽出法にてRNAを調製し、各種解析に供した。
磁気ビーズで捕捉して回収したエクソソームからRNAを抽出し、バイオアナライザー(Agilent Technologies, Inc)にて解析した結果、十分な品質かつ量のRNAが回収できていた。得られたRNAをPCRにて解析したところ、メサンギウム細胞に異常を認める糖尿病性腎症の患者血漿では、糖尿病腎症のマーカーとして報告されたmiRNA(miR-21)の発現が有意差をもって変化していることがわかった(図3右)。尚、比較のために、抗CD63抗体でコートされた磁気ビーズを用いて非選択的に回収したエクソソームから抽出したRNAを試料とした場合の結果を図3左に示した。
Claims (14)
- 以下のステップ(1)及び(2)を含む、メサンギウム細胞由来のエクソソームの回収法:
(1)生体試料からエクソソームを分離するステップ;
(2)分離したエクソソームの中から、α8インテグリンを表面に発現しているエクソソームを分取するステップ。 - 抗α8インテグリン抗体による捕捉によって、ステップ(2)の分取が行われる、請求項1に記載の回収法。
- 抗α8インテグリン抗体が固相担体に固定化されている、請求項2に記載の回収法。
- 固相担体が磁気ビーズである、請求項3に記載の回収法。
- 生体試料が血漿、血清又は尿である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の回収法。
- 遠心処理、密度勾配遠心分離、フィルター処理、サイズ排除クロマトグラフィー及び超遠心処理からなる群より選択される一以上の処理によって、ステップ(1)の分離が行われる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の回収法。
- ステップ(2)の後、抗α8インテグリン抗体に捕捉された状態でエクソソームを回収する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の回収法。
- ステップ(2)の後、抗α8インテグリン抗体からエクソソームを脱離し、回収する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の回収法。
- α8インテグリンの発現を指標として回収したエクソソーム内又は表面の標的分子を検出することを特徴とする、腎疾患の検査法。
- 標的分子がRNA、DNA又はタンパク質である、請求項9に記載の検査法。
- RNAがmicroRNAである、請求項10に記載の検査法。
- エクソソームが請求項1〜6のいずれか一項に記載の回収法で回収されたものである、請求項9〜11のいずれか一項に記載の検査法。
- エクソソームが請求項7に記載の回収法で回収されたものであり、
抗α8インテグリン抗体に捕捉された状態のエクソソームを試料として標的分子を検出する、請求項9〜11のいずれか一項に記載の検査法。 - α8インテグリンの発現を指標として一定量の生体試料から回収したエクソソームの量を検出することを特徴とする、検査法。
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