JP2015530072A - ゲムシタビン療法による乳癌の治療方法 - Google Patents

ゲムシタビン療法による乳癌の治療方法 Download PDF

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Abstract

本願は、乳癌の対象における全生存を予測するための方法について記載する。また、本願は、乳癌の対象をスクリーニングし、その乳癌がゲムシタビンを含む乳癌治療に対し反応性があるか否かについて決定する方法について記載する。さらに本願は、ゲムシタビンを含む癌治療の効果の可能性について乳癌の対象をスクリーニングし、ゲムシタビンが効果的である可能性が高いと示されたときに対象にゲムシタビンを含む治療を施すことによって乳癌の対象を治療する方法について記載する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年６月２９日に出願した米国仮特許出願第６１／６６６，３５５号、および２０１２年１２月５日に出願した米国仮特許出願第６１／７３３，５４５号の優先権およびその利益を主張する。これらの各出願の内容はそれぞれその全体が参考として本明細書中に援用される。
本開示は、一般に癌生物学の分野、特に、特定の癌細胞の表現型の検出および同定ならびに適切な治療法との相関についての分野に関する。
ヌクレオシド類似体であるゲムシタビンを含む治療法は多くの種類の腫瘍に対し有効であることが証明されている。しかし、好中球の減少、貧血、肝臓および腎臓の変化、インフルエンザ様症状、食欲不振、脱毛、息切れ、疲労、食欲不振、吐き気、ならびに嘔吐といったゲムシタビン療法に伴う副作用が深刻である。深刻な副作用が少ない代替療法が知られている。従って、当該分野では、ゲムシタビンベースの治療法に対する反応が最も良い癌の種類、および非ゲムシタビンベースの治療法により治療した方が良いであろう癌の種類を決定する必要がある。本発明は、これらの必要性に対応するものである。
一実施形態では、本発明は、転移性乳癌を有する対象における無増悪生存を予測する方法であって、（ａ）対象由来の生体試料を用意する工程；ならびに（ｂ）生体試料をアッセイして内因性乳癌のサブタイプを決定する工程であって、該サブタイプは、ルミナールＡ型（ＬｕｍｉｎａｌＡ）、ルミナールＢ型（ＬｕｍｉｎａｌＢ）、基底細胞様型（Ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ）、およびＨＥＲ２高発現型（ＨＥＲ２−ｅｎｒｉｃｈｅｄ）サブタイプからなる群から選択される工程；を含み、ここで内因性サブタイプを、表１に記載の遺伝子のうち少なくとも４０個の遺伝子の測定値を用いることによって決定し、そして当該内因性サブタイプを用いて対象が受けたまたは受ける予定の治療とは独立して前記患者の無増悪生存を予測する方法を提供する。ルミナールＡ型およびＢ型サブタイプと決定されると疾患の無増悪生存期間が長いことを示し、そしてＨＥＲ２高発現型または基底細胞様型サブタイプと決定されると疾患の無増悪生存期間が短いことを示す。生体試料をアッセイして内因性サブタイプを決定する工程は、表１に記載の内因性遺伝子のうち少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、または５０個全てを検出することによって行う。好ましい実施形態では、内因性サブタイプを、表１に記載の遺伝子のうち少なくとも４５個を用いて決定する。
また、本発明は、乳癌を有する対象における全生存を予測する方法であって、（ａ）対象由来の生体試料を用意する工程；ならびに（ｂ）生体試料をアッセイして内因性乳癌のサブタイプを決定する工程であって、該サブタイプは、ルミナールＡ型、ルミナールＢ型、基底細胞様型、およびＨＥＲ２高発現型サブタイプからなる群から選択される工程；を含み、ここで内因性サブタイプを、表１に記載の遺伝子のうち少なくとも４０個の遺伝子の測定値を用いることによって決定し、ルミナールＡ型およびＢ型サブタイプと決定されると疾患の無増悪生存期間が長いことを示し、そしてＨＥＲ２高発現型または基底細胞様型サブタイプと決定されると疾患の無増悪生存期間が短いことを示す方法を提供する。生体試料をアッセイして内因性サブタイプを決定する工程は、表１に記載の内因性遺伝子のうち少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、または５０個全てを検出することによって行う。好ましい実施形態では、内因性サブタイプを、表１に記載の遺伝子のうち少なくとも４５個を用いて決定する。
また、本発明は、乳癌を有する対象における全生存を予測する方法を提供する。この方法は、対象由来の生体試料を用意する工程；ならびに生体試料をアッセイして生体試料が基底細胞様型サブタイプに分類されるか否かを決定する工程；を含み、ここで生体試料が基底細胞様型サブタイプに分類される場合、ゲムシタビンを含む乳癌治療により対象の全生存が延長される可能性が高くなる。乳癌は、原発性乳癌、局所進行性乳癌または転移性乳癌であり得る。
生体試料をアッセイして生体試料が基底細胞様型サブタイプに分類されるか否かを決定する工程は、ＲＮＡ発現プロファイリングを用いて行う。生体試料をアッセイして生体試料が基底細胞様型サブタイプに分類されるか否かを決定する工程は、表１に記載の内因性遺伝子のうち少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、または５０個全てを検出することによって行う。好ましくは、検出は、表１に記載の内因性遺伝子の５０個全てについて行う。表１の内因性遺伝子リストに記載の遺伝子の発現は、ナノレポーターおよびナノレポーターコードシステム（ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて決定できる。
ゲムシタビンを含む乳癌治療は、アントラサイクリン、シクロホスファミド、フルオロウラシル（または５−フルオロウラシルもしくは５−ＦＵ）、メトトレキサート、チオテパ、カルボプラチン、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、タンパク質結合パクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、イリノテカン、イクサベピロン、テモゾロミド、トポテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エリブリン、ムタマイシン、カペシタビン、カペシタビン、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ロイプロリド、アバレリクス、ブセレリン、ゴセレリン、酢酸メゲストロール、リセドロネート、パミドロネート、イバンドロネート、アレンドロネート、デノスマブ、ゾレドロネート、トラスツズマブ、タイケルブ、もしくはベバシズマブ、またはそれらの組み合わせも含み得る。好ましくは、ゲムシタビンを含む治療は、１つまたは複数のタキサンも含む。好ましくは、タキサンは、パクリタキセルまたはドセタキセルである。ゲムシタビンを含まない乳癌治療は、アントラサイクリン、シクロホスファミド、フルオロウラシル（または５−フルオロウラシルもしくは５−ＦＵ）、メトトレキサート、チオテパ、カルボプラチン、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、タンパク質結合パクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、イリノテカン、イクサベピロン、テモゾロミド、トポテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エリブリン、ムタマイシン、カペシタビン、カペシタビン、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ロイプロリド、アバレリクス、ブセレリン、ゴセレリン、酢酸メゲストロール、リセドロネート、パミドロネート、イバンドロネート、アレンドロネート、デノスマブ、ゾレドロネート、トラスツズマブ、タイケルブ、もしくはベバシズマブ、またはそれらの組み合わせを含む。好ましくは、ゲムシタビンを含まない治療は、１つまたは複数のタキサンを含む。好ましくは、タキサンは、パクリタキセルまたはドセタキセルである。
生体試料は、細胞、組織、または体液であり得る。組織は生検または塗抹から採取したものであり得る。また、試料は体液から採取したものであり得る。これらの体液として、血液、リンパ液、尿、唾液、乳頭吸引液および婦人科系体液が挙げられる。生体試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋試料であり得る。
本発明は、乳癌の治療を必要とする対象における乳癌の治療方法を提供する。この方法は、対象由来の生体試料を用意する工程；生体試料をアッセイして生体試料が基底細胞様型サブタイプに分類されるか否かを決定する工程；ならびに対象に乳癌治療を施す工程を含む。生体試料が基底細胞様型サブタイプに分類される場合、対象にゲムシタビンを含む乳癌治療を施す。生体試料が基底細胞様型サブタイプではない場合、対象にゲムシタビンを含まない乳癌治療を施す。乳癌は、原発性乳癌、局所進行性乳癌または転移性乳癌であり得る。
また、本発明は、乳癌の治療を必要とする対象における乳癌の治療方法であって、対象由来の生体試料が基底細胞様型サブタイプに分類されるか否かを決定する分析結果を提供する検査を要求する工程、ならびに患者由来の試料が基底細胞様型サブタイプに分類される場合、ゲムシタビンを含む乳癌治療を施し、あるいは患者由来の試料が基底細胞様型サブタイプではないと分類される場合、ゲムシタビンを含まない乳癌治療を施す工程を含む方法を提供する。乳癌は、原発性乳癌、局所進行性乳癌または転移性乳癌であり得る。
生体試料をアッセイして生体試料が基底細胞様型サブタイプに分類されるか否かを決定する工程は、ＲＮＡ発現プロファイリングを用いて行う。生体試料をアッセイして生体試料が基底細胞様型サブタイプに分類されるか否かを決定する工程は、表１に記載の内因性遺伝子のうち少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、または５０個全てを検出することによって行う。好ましくは、検出は、表１に記載の内因性遺伝子の５０個全てについて行う。表１の内因性遺伝子リストのメンバーの発現は、ナノレポーターおよびナノレポーターコードシステム（ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて決定できる。
ゲムシタビンを含む乳癌治療は、アントラサイクリン、シクロホスファミド、フルオロウラシル（または５−フルオロウラシルもしくは５−ＦＵ）、メトトレキサート、チオテパ、カルボプラチン、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、タンパク質結合パクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、イリノテカン、イクサベピロン、テモゾロミド、トポテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エリブリン、ムタマイシン、カペシタビン、カペシタビン、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ロイプロリド、アバレリクス、ブセレリン、ゴセレリン、酢酸メゲストロール、リセドロネート、パミドロネート、イバンドロネート、アレンドロネート、デノスマブ、ゾレドロネート、トラスツズマブ、タイケルブ、もしくはベバシズマブ、またはそれらの組み合わせも含み得る。好ましくは、ゲムシタビンを含む治療は、１つまたは複数のタキサンも含む。好ましくは、タキサンは、パクリタキセルまたはドセタキセルである。ゲムシタビンを含まない乳癌治療は、アントラサイクリン、シクロホスファミド、フルオロウラシル（または５−フルオロウラシルもしくは５−ＦＵ）、メトトレキサート、チオテパ、カルボプラチン、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、タンパク質結合パクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、イリノテカン、イクサベピロン、テモゾロミド、トポテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エリブリン、ムタマイシン、カペシタビン、カペシタビン、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ロイプロリド、アバレリクス、ブセレリン、ゴセレリン、酢酸メゲストロール、リセドロネート、パミドロネート、イバンドロネート、アレンドロネート、デノスマブ、ゾレドロネート、トラスツズマブ、タイケルブ、もしくはベバシズマブ、またはそれらの組み合わせを含む。好ましくは、ゲムシタビンを含まない治療は、１つまたは複数のタキサンを含む。好ましくは、タキサンは、パクリタキセルまたはドセタキセルである。
生体試料は、細胞、組織、または体液であり得る。組織は生検または塗抹から採取したものであり得る。また、試料は体液から採取したものであり得る。これらの体液として、血液、リンパ液、尿、唾液、乳頭吸引液および婦人科系体液が挙げられる。生体試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋試料であり得る。
また、本発明は、乳癌の治療を必要とする対象におけるゲムシタビンを含む乳癌治療の効果の可能性をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、対象由来の生体試料を用意する工程、ならびに生体試料をアッセイして生体試料が基底細胞様型サブタイプに分類されるか否かを決定する工程を含む。生体試料が基底細胞様型サブタイプに分類される場合、ゲムシタビンを含む乳癌治療が対象においてより効果的である可能性が高くなる。乳癌は、原発性乳癌、局所進行性乳癌または転移性乳癌であり得る。
生体試料をアッセイして生体試料が基底細胞様型サブタイプに分類されるか否かを決定する工程は、ＲＮＡ発現プロファイリングを用いて行う。生体試料をアッセイして生体試料が基底細胞様型サブタイプに分類されるか否かを決定する工程は、表１に記載の内因性遺伝子のうち少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、または５０個全てを検出することによって行う。好ましくは、検出は、表１に記載の内因性遺伝子の５０個全てについて行う。表１の内因性遺伝子リストのメンバーの発現は、ナノレポーターおよびナノレポーターコードシステム（ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて決定できる。
ゲムシタビンを含む乳癌治療は、アントラサイクリン、シクロホスファミド、フルオロウラシル（または５−フルオロウラシルもしくは５−ＦＵ）、メトトレキサート、チオテパ、カルボプラチン、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、タンパク質結合パクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、イリノテカン、イクサベピロン、テモゾロミド、トポテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エリブリン、ムタマイシン、カペシタビン、カペシタビン、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ロイプロリド、アバレリクス、ブセレリン、ゴセレリン、酢酸メゲストロール、リセドロネート、パミドロネート、イバンドロネート、アレンドロネート、デノスマブ、ゾレドロネート、トラスツズマブ、タイケルブ、もしくはベバシズマブ、またはそれらの組み合わせも含み得る。好ましくは、ゲムシタビンを含む治療は、１つまたは複数の抗癌タキサンも含む。より好ましくは、タキサンは、パクリタキセルまたはドセタキセルである。
生体試料は、細胞、組織、または体液であり得る。組織は、腫瘍生検または手術標本から採取したものであり得る。また、試料は体液から採取したものであり得る。これらの体液として、血液、リンパ液、尿、唾液、乳頭吸引液および婦人科系体液が挙げられる。生体試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋試料であり得る。
また、本発明は、乳癌治療の効果の可能性をスクリーニングするためのキットであって、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、または５０個全ての内因性遺伝子の検出に十分かつ基底細胞様型サブタイプの検出に十分な試薬を含むキットを提供する。好ましくは、キットは、表１に記載の内因性遺伝子の５０個全ての検出に十分な試薬を含む。表１に記載の内因性遺伝子のうち少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、または５０個全ての検出に十分な試薬は、マイクロアレイを含み得る。好ましくは、試薬は、表１に記載の内因性遺伝子のうち少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、または５０個全ての検出のためのレポータープローブおよび捕捉プローブを含む。好ましくは、検出する表１の遺伝子のいずれか１個の遺伝子につき１組のレポータープローブ／捕捉プローブ対しかない。好ましくは、キットは、試薬を利用するため、および本発明の方法のいずれかを実施するための説明書を含む。好ましくは、説明書は、乳癌治療の効果の可能性をスクリーニングするためのものである。
他に規定しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において、文脈が明確に指示しない限り、単数形は複数も含む。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができ、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及する全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。本明細書で引用した参考文献は、特許請求の範囲の発明の従来技術であるとは認められない。矛盾する場合、定義を含み本明細書が支配するものとする。さらに、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定する意図ではない。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるだろう。
図１は、研究設計のＣＯＮＳＯＲＴダイアグラムを示す概略図である。
図２Ａは、ＰＡＭ５０内因性遺伝子を用いて同定した内因性生物学的サブタイプに応じた無増悪期間（ＴＴＰ）のカプラン・マイヤー（Ｋ−Ｍ）曲線を示す線グラフである。
図２Ｂは、ＰＡＭ５０内因性遺伝子を用いて同定した内因性生物学的サブタイプに応じた全生存期間（ＯＳ）のカプラン・マイヤー（Ｋ−Ｍ）曲線を示す線グラフである。
図３Ａは、予め選択した予後因子に関する無増悪期間についての９５％ＣＩでのハザード比（ＨＲ）のフォレストプロットを示す。Ｄ、ドセタキセル；ＧＤ、ゲムシタビン＋ドセタキセル；*ＰＡＭ５０サブタイプ：ルミナールＡ型、ルミナールＢ型、Ｂａｓａｌ ｌｉｋｅ、およびＨＥＲ２高発現型を有するモデルでの推定値。
図３Ｂは、予め選択された予後因子に関する全生存期間について９５％ＣＩでのハザード比（ＨＲ）のフォレストプロットを示す。Ｄ、ドセタキセル；ＧＤ、ゲムシタビン＋ドセタキセル；*ＰＡＭ５０サブタイプ：ルミナールＡ型、ルミナールＢ型、Ｂａｓａｌ ｌｉｋｅ、およびＨＥＲ２高発現型を有するモデルでの推定値。
図４は、基底細胞様型患者について複合投与（ＧＤ）群を単一投与（Ｄ）群と比較した数１０ケ月にわたる全生存期間（ＯＳ）の中央値のＫ−Ｍ曲線を示す線グラフである。
本発明は、ゲムシタビンを含む乳癌治療が、乳癌に罹患している患者への投与に最適であるか否かを決定する方法を提供する。乳癌患者がゲムシタビンを含む治療を受けるべきか否かを決定することは、内因性遺伝子発現のセットを使用して乳癌のサブタイプを決定し、そして免疫組織化学（ＩＨＣ）を使用して乳癌の基底細胞様型サブタイプを決定することを含む。また、本開示は、乳癌患者がゲムシタビンを含む治療を受けるべきか否かを決定し、その決定に基づいて、患者に最適な乳癌治療を施すことにより乳癌を治療する方法も提供する。
内因性遺伝子は、同一個体由来の生体試料複製物の間の発現についてはばらつきが少なく、かつ様々な個体由来の試料の発現についてはばらつきが大きいように統計的に選択する。したがって、内因性遺伝子は、乳癌を分類するための分類子遺伝子として使用される。この分類は、乳癌の内因性サブタイプを導くために臨床的な情報を使用しなくとも、予後に関し有意性があることが証明されている。内因性遺伝子のスクリーニングにより乳癌を種々のサブタイプに分類できる。乳癌の主要な内因性サブタイプは、ルミナールＡ型（ＬｕｍＡ）、ルミナールＢ型（ＬｕｍＢ）、ＨＥＲ２高発現型（ＨＥＲ−２−Ｅ）、基底細胞様型、およびＮｏｒｍａｌ−ｌｉｋｅと称されるものである（Ｐｅｒｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，４０６（６７９７）：７４７−５２（２０００）；Ｓｏｒｌｉｅ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ，９８（１９）：１０８６９−７４（２００１））。
本明細書に記載のように、ＰＡＭ５０遺伝子の発現アッセイだと、標準的なホルマリン固定パラフィン包埋した腫瘍組織から内因性のサブタイプを同定することが可能である（Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．，２７（８）：１１６０−７（２００９）および米国特許出願第２０１１／０１４５１７６号参照）。この方法は、乳癌の内因性サブタイプに応じて対象の試料を分類するための教師付きアルゴリズムを利用する。本明細書でＰＡＭ５０分類モデルと称するこのアルゴリズムは、内因性遺伝子について規定したサブセットの遺伝子発現プロファイルに基づいている。この遺伝子発現プロファイルは、本明細書において、乳癌の内因性サブタイプを分類するのに優れていることと認定された。これらの遺伝子のサブセットを、それらの検出に特異的なプライマーと共に表１に記載する。標的特異的なプローブ配列は、代表的なものに過ぎず本発明を限定する意図ではない。当業者は、表１の遺伝子のいずれか（または各遺伝子それぞれ）を検出するために任意の標的配列特異的プローブを利用することができる。
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表２は、表１のＰＡＭ５０遺伝子の選択配列を示す。
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表１の遺伝子のうち少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも４０個、少なくとも４１個、少なくとも４２個、少なくとも４３個、少なくとも４４個、少なくとも４６個、少なくとも４７個、少なくとも４８個、少なくとも４９個、または５０個全てを本発明の方法で利用することができる。好ましくは、５０個の遺伝子の各々の発現を、生体試料内で決定する。４つの内因性サブタイプのプロトタイプ遺伝子発現プロファイル（すなわちセントロイド）を、遺伝子発現データの階層的クラスタリング分析を用いてＦＦＰＥ乳房腫瘍試料の訓練セットから、予め定義した。表３は、これらの４つのサブタイプのプロトタイプ遺伝子発現プロファイル（すなわちセントロイド）の実際の値を示す。
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検査乳癌腫瘍試料および検査キットの一部として設けた基準試料についての乳癌内因性サブタイプ検査を行った後、ピアソンの相関関係に基づいた計算アルゴリズムにより、検査試料のＰＡＭ５０内因性遺伝子セットについて正規化およびスケーリングした遺伝子発現プロファイルを、４つの乳癌内因性サブタイプのプロトタイプ発現サインと比較する。ＰＡＭ５０遺伝子セットの発現を決定することによって内因性サブタイプを決定し、そして再発リスク（「ＲＯＲ」）をＮＡＮＯ４６遺伝子セット（表１の全５０個の遺伝子のうちＭＹＢＬ２、ＢＩＲＣ５、ＧＲＢ７およびＣＣＮＢ１を除いたものの発現）を用いて決定する。具体的には、内因性サブタイプは、生体試料中のＰＡＭ５０遺伝子セットの発現を、４つの内因性サブタイプについて予想される発現プロファイルと比較することにより同定する。最も類似した発現プロファイルを有するサブタイプを、生体試料に割り当てる。ＲＯＲのスコアは０〜１００の整数値であり、この値が規定の意図する使用人口のうち個々の患者が１０年以内に遠隔再発する確率に相関する。ＲＯＲスコアは、生体試料中のＮＡＮＯ４６遺伝子の発現プロファイルを、上記のような４つの内因性サブタイプについての予測プロファイルと比較することによって計算し、４つの異なる相関値を計算する。これらの相関値を、増殖スコア（そして場合により腫瘍サイズといった１つまたは複数の臨床病理学的変数）と組み合わせてＲＯＲスコアを計算する。好ましくは、ＲＯＲスコアはＮＡＮＯ４６遺伝子の発現プロファイルのみを比較することによって計算する。
臨床的特徴および臨床転帰データを良好に定義しているＦＦＰＥ乳房腫瘍試料の訓練セットを用いて連続的な再発リスク（ＲＯＲ）スコアを確立した。表４の各内因性サブタイプ、増殖スコア（４６個の遺伝子のうち１８個の遺伝子サブセットの発現を意味する）、および腫瘍サイズについての相関を含むコックスモデルによる係数を用いてスコアを計算する。
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表４の検査変数は、対応する係数で乗算し、合計してリスクスコア（「ＲＯＲ−ＰＴ」）とする。
ＲＯＲ−ＰＴ式＝−０．００６７＊Ａ＋０．４３１７＊Ｂ＋−０．３１７２＊Ｃ＋０．４８９４＊Ｄ＋０．１９８１＊Ｅ＋０．１１３３＊Ｆ
これまでの研究により、ＲＯＲスコアは５年間タモキシフェンで治療したＥＲ陽性、リンパ節転移陰性の患者についての再発リスクの連続的な推定値がわかっている（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１６（２１）：５２２２−５２３２（２００９））。また、ＲＯＲスコアは、検査集団におけるＲＦＳの決定に基づく臨床モデルよりも統計的に有意な改善を示したので、従前の臨床病理学的手段と比較して、この意思決定ツールの精度が良いことがさらに証明されている（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１６（２１）：５２２２−５２３２（２００９））。
遺伝子セットには、増殖マーカーとして知られている多くの遺伝子が含まれる。本発明の方法は、増殖サイン（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を設ける遺伝子のサブセットの決定を提供する。本発明の方法は、ＡＮＬＮ、ＣＣＮＥ１、ＣＤＣ２０、ＣＤＣ６、ＣＤＣＡ１、ＣＥＮＰＦ、ＣＥＰ５５、ＥＸＯ１、ＫＩＦ２Ｃ、ＫＮＴＣ２、ＭＥＬＫ、ＭＫＩ６７、ＯＲＣ６Ｌ、ＰＴＴＧ１、ＲＲＭ２、ＴＹＭＳ、ＵＢＥ２Ｃおよび／またはＵＢＥ２Ｔから選択される、表１の内因性遺伝子の１８個の遺伝子サブセットの少なくとも１個、１つの組み合わせ、または各々、の発現を決定することを含み得る。好ましくは、表１の遺伝子セットの１８個の遺伝子サブセットの各々の発現を決定して、増殖スコアを設ける。これらの遺伝子のうちの１つまたは複数の発現を決定してもよく、試料中のこれらの遺伝子のうちの１つまたは複数の発現推定値を正規化したものを平均することによって増殖サイン指数を生成できる。試料を、高増殖サイン、中度／中間増殖サイン、低増殖サイン、または超低増殖サインに割り当てることができる。生体試料から増殖サインを決定する方法は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１６（２１）：５２２２−５２３２（２００９）および補足オンライン試料に記載されている（これらの文献は、その全体を参照することにより、本明細書に組み込まれる）。
乳癌
基底細胞様型サブタイプに該当する乳癌腫瘍を有する対象は、内因性遺伝子の分析によって分類され、驚くべきことに、ゲムシタビンを含む乳癌治療を施すと平均してより良好な予後を示すことが見出された。また、驚くべきことに、ＨＥＲ２高発現型サブタイプに該当する乳癌腫瘍は、ゲムシタビンを含む乳癌治療を施すと平均してより悪い予後を示すことが見出された。
ゲムシタビンを含む乳癌治療を施した患者について、この治療法が良い治療効果をもたらさず、また悪い副作用を伴うような場合、これらの者を基底細胞様型サブタイプを示す乳癌患者と非基底細胞様型サブタイプを示す乳癌患者に分けて臨床転帰を区別すれば、何千人もの患者の生活の質および臨床転帰が改善することにつながる。
本開示の目的において、「乳癌」には、例えば、生検または組織学的に悪性の病変として分類された状態が含まれる。乳癌診断の臨床的な描写は、医学分野でよく知られている。当業者は、乳癌が、例えば、癌腫および肉腫を含む乳房組織の悪性腫瘍のいずれもを指すことを理解するであろう。乳癌の特定の実施形態では、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、非浸潤性小葉癌（ＬＣＩＳ）、または粘液性癌腫が含まれる。また、乳癌は、浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）、小葉新生物、または浸潤性小葉癌（ＩＬＣ）を指すこともある。本開示のほとんどの実施形態では、目的の対象は、乳癌の疑いのあるまたは実際に診断されたヒト患者である。
乳癌には全ての形態の乳房の癌が含まれる。乳癌は、原発性上皮乳癌も含み得る。乳癌は、乳房がリンパ腫、肉腫、または黒色腫などの他の腫瘍を有する癌も含み得る。乳癌は、乳房の癌腫、乳房の腺管癌、乳房の小葉癌、乳癌の未分化癌、乳房の葉状嚢肉腫、乳房の血管肉腫、および乳房の原発性リンパ腫も含み得る。乳癌は、ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＩＩＣおよびＩＶの乳癌を含み得る。乳房の乳管癌には、浸潤癌、乳管内成分が優勢なｉｎ ｓｉｔｕの浸潤癌（ｉｎｖａｓｉｖｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｓｉｔｕ）、炎症性乳癌、そして面皰、粘液性（膠様）、髄様、リンパ液浸潤のある髄様、乳頭、硬性、および管状からなる群から選択される組織型を有する乳房の乳管癌を含み得る。乳房の小葉癌には、非浸潤性成分（ｉｎ ｓｉｔｕ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）が優勢な浸潤性小葉癌、および浸潤性（ｉｎｖａｓｉｖｅ）小葉癌、および浸潤性（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ）小葉癌を含み得る。乳癌は、パジェット病、管内癌を有するパジェット病、および浸潤性乳管癌を有するパジェット病を含み得る。乳癌は、組織学的および超微細構造的な不均一性（例えば、混合細胞型）を有する乳房の新生物を含み得る。
治療対象の乳癌には、家族性乳癌を含み得る。治療対象の乳癌には、散発性乳癌を含み得る。治療対象の乳癌は、男性対象に生じ得る。治療対象の乳癌は、女性対象に生じ得る。治療対象の乳癌は、閉経前の女性対象または閉経後の女性対象で生じ得る。
治療対象の乳癌は、乳房の局所的な腫瘍を含み得る。治療対象の乳癌は、陰性センチネルリンパ節（ＳＬＮ）生検と関連する乳房の腫瘍を含み得る。治療対象の乳癌は、陽性センチネルリンパ節（ＳＬＮ）生検と関連する乳房の腫瘍を含み得る。治療対象の乳癌は、任意の適用可能な方法により病期が分類されている１つまたは複数の陽性腋窩リンパ節と関連する乳房の腫瘍を含み得る。治療対象の乳癌は、結節陰性の状態（例えば、リンパ節陰性）または結節陽性の状態（例えば、リンパ節陽性）であるとして分類された乳房の腫瘍を含み得る。治療対象の乳癌は、体内の他の場所に転移した乳房の腫瘍を含み得る。治療対象の乳癌は、骨、肺、肝臓、または脳からなる群から選択された場所に転移したものとして分類し得る。治療対象の乳癌は、転移性、局在性、局部的、局所部的、局所進行性、遠隔、多中心性、両側性、同側性、対側性、新たに診断されたもの、再発性、手術不能からなる群から選択される特徴に従って分類し得る。
本開示の目的において、「ゲムシタビンを含む乳癌治療」とは、ゲムシタビンを含む乳癌の治療のことである。また、「ゲムシタビンを含む乳癌治療」は、ゲムシタビンまたは他のヌクレオシド抗腫瘍剤の類似体または誘導体を含む乳癌の治療のことであってもよい。これらの治療は、他の抗癌剤または化学療法剤を含み得る。
本開示の目的において、「ゲムシタビンを含まない乳癌治療」とは、いかなるゲムシタビンも含まない乳癌の治療のことである。これらの治療は、他の抗癌剤または化学療法剤を含む。
各クラスの抗癌剤または化学療法剤としては、以下が挙げられる：アントラサイクリン剤、アルキル化剤、白金剤、タキサン、ビンカ剤、抗エストロゲン剤、アロマターゼ阻害剤、卵巣抑制剤、内分泌／ホルモン剤、ビスホスホネート治療剤、および生物学的治療剤。
特定の抗癌剤または化学療法剤としては、以下が挙げられる：アントラサイクリン、シクロホスファミド、フルオロウラシル（または５−フルオロウラシルもしくは５−ＦＵ）、メトトレキサート、チオテパ、カルボプラチン、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、タンパク質結合パクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、イリノテカン、イクサベピロン、テモゾロミド、トポテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エリブリン、ムタマイシン、カペシタビン、カペシタビン、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ロイプロリド、アバレリクス、ブセレリン、ゴセレリン、酢酸メゲストロール、リセドロネート、パミドロネート、イバンドロネート、アレンドロネート、デノスマブ、ゾレドロネート、トラスツズマブ、タイケルブ、もしくはベバシズマブ、またはそれらの組み合わせ。
抗癌剤または化学療法剤の組み合わせとしては、以下が挙げられる：ＡＴ：Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）（ドキソルビシン）およびＴａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）（ドセタキセル）；ＡＣ：Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）（シクロホスファミド）；ＡＣ＋Ｔａｘｏｌ（登録商標）；ＡＣ＋Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）；ＣＭＦ：Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、メトトレキセート、５−フルオロウラシル；ＣＥＦ：Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｅｌｌｅｎｃｅ（登録商標）（エピルビシン）、およびフルオロウラシル；ＥＣ：Ｅｌｌｅｎｃｅ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）；ＦＡＣ：５−フルオロウラシル、Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、およびＣｙｔｏｘａｎ（登録商標）；ＧＥＴ：Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）（ゲムシタビン）、Ｅｌｌｅｎｃｅ（登録商標）、およびＴａｘｏｌ（登録商標）；ＴＣ：Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商 標）；ＴＣ：Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）、Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標）（カルボプラチン）；ＴＡＣ：Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）、Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）またはＴＣＨ：Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）、およびＰａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標）。転移性乳癌に対する化学療法剤のさらなる組み合わせとしては以下が挙げられる：Ｔａｘｏｌ（登録商標）およびＸｅｌｏｄａ（登録商標）（カペシタビン）；Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）およびＸｅｌｏｄａ（登録商標）；Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）およびＰａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標）；Ｔａｘｏｌ（登録商標）およびＰａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標）；Ｔａｘｏｌ（登録商標）およびＧｅｍｚａｒ（登録商標）；Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）（タンパク結合パクリタキセル）およびＸｅｌｏｄａ（登録商標）；Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）およびＰａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標）；Ｃａｍｐｔｏｓｏｒ（登録商標）（イリノテカン）およびＴｅｍｏｄａｒ（登録商標）（テモゾロミド）；Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）および Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標）またはＩｘｅｍｐｒａ（登録商標）（イキサベピロン）およびＸｅｌｏｄａ（登録商標）。
好ましくは、抗癌剤または化学療法剤は、１つまたは複数のタキサンを含む。より好ましくは、タキサンは、パクリタキセルまたはドセタキセルである。
好ましくはゲムシタビンを静脈内投与するが、当該分野で公知の任意の方法によって投与できる。ある実施形態では、対象または患者に１日１回約２５００ｍｇ／ｍ2〜約５０ｍｇ／ｍ2のゲムシタビンを投与する。ある実施形態では、毒性を低減するためにゲムシタビンの用量を減少して投与する。例えば、ゲムシタビンを１日１回１５００ｍｇ／ｍ2、１２５０ｍｇ／ｍ2、１０００ｍｇ／ｍ2、７５０ｍｇ／ｍ2、５００ｍｇ／ｍ2、２５０ｇ／ｍ2、１００ｍｇ／ｍ2、または５０ｍｇ／ｍ2で投与する。
タキサン剤は、臨床医が適当であると認める任意の方法で、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，５３ｔｈ Ｅｄ．（１９９９），Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ Ｅｄｗａｒｄ Ｒ．Ｂａｒｎｈａｒｔ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（「ＰＤＲ」）に記載されるような一般に容認されている有効用量の範囲内で投与することができる。好ましくはタキサンを静脈内投与するが、当該分野で公知の任意の方法によって投与できる。一般に、パクリタキセルは毎日約１３５〜約３００ｍｇ／ｍ2、好ましくは約１３５〜約１７５ｍｇ／ｍ2、そして最も好ましくは約１７５ｍｇ／ｍ2の用量で投与する。一般に、ドセタキセルは毎日約６０〜約１００ｍｇ／ｍ2、そして最も好ましく約７５ｍｇ／ｍ2の用量で投与する。
本明細書において冠詞の「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法上の目的語の単数または複数（すなわち、少なくとも１つ）を指すものとして使用する。一例として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ」は、単数または複数の要素を意味する。
本明細書を通して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」といった変形は、言及した要素、整数、または工程、あるいは一群の要素、整数、または工程を包含することを意味すると理解されるが、他の要素、整数、または工程、あるいは一群の要素、整数、または工程を排除するものではない。
内因性サブタイプ生物学について
ルミナールサブタイプ：乳癌の最も一般的なサブタイプがルミナールサブタイプであり、ルミナールＡ型およびルミナールＢ型がある。以前からの研究により、ルミナールＡ型が全乳癌の約３０％〜４０％、そしてルミナールＢ型が約２０％を占めることが示され、ホルモン受容体陽性乳癌がその９０％超を占める（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１６（２１）：５２２２−５２３２（２００９））。これらのサブタイプの遺伝子発現パターンは、乳房の管腔上皮成分に類似している。これらの腫瘍は、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、ならびにＥＲ活性化に関連する遺伝子、例えば、ＬＩＶ１、ＧＡＴＡ３、およびｃｙｃｌｉｎ Ｄ１等、加えて管腔サイトケラチン８および１８の発現が高いことを特徴とする（Ｌｉｓａ Ｃａｒｅｙ＆Ｃｈａｒｌｅｓ Ｐｅｒｏｕ（２００９）．Ｇｅｎｅ Ａｒｒａｙｓ，Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ，ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ．Ｊａｙ Ｒ．Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（４ｔｈ ｅｄ．），Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｒｅａｓｔ（ｐｐ．４５８−４７２）．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）。
ルミナールＡ型：ルミナールＡ型（ＬｕｍＡ）乳癌は、細胞周期の活性化およびＥＲＢＢ２クラスターに関連する遺伝子の発現が低く、これによりルミナールＢ型よりも良好な予後を示す。ルミナールＡ型サブグループは、全てのサブタイプの中で最も良好な予後を示し、内分泌療法に反応性がある腫瘍を多く含む。
ルミナールＢ型：ルミナールＢ型（ＬｕｍＢ）乳癌も、ＥＲおよびＥＲ関連遺伝子を発現する。細胞周期の活性化に関連する遺伝子が高度に発現され、この腫瘍型は、ＨＥＲ２（＋）（〜２０％）またはＨＥＲ２（−）であることがある。予後は（ＥＲ発現にもかかわらず）ＬｕｍＡに比べ良好ではなく、内分泌療法の反応性は一般的に低い。
ＨＥＲ２高発現型：ＨＥＲ２高発現型サブタイプは、一般的にＥＲ陰性かつＨＥＲ２陽性で、多くの場合、ＥＲＢＢ２およびＧＲＢ７を含むＥＲＢＢ２クラスターが高度に発現される。細胞周期の活性化に関連する遺伝子が高度に発現され、これらの腫瘍の予後はあまり良くない。
基底細胞様型：基底細胞様型サブタイプは、一般にＥＲ陰性で、ほとんどは臨床的にＨＥＲ２陰性であり、基底上皮サイトケラチン（ＣＫ）および上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を含む「基底」バイオマーカー群を発現する。細胞周期の活性化に関連する遺伝子が高度に発現される。
臨床的変数
本明細書に記載のＰＡＭ５０分類モデルは、さらに、連続的な再発リスク（ＲＯＲ）の予測子を生成するための臨床的変数についての情報と組み合わせてもよい。本明細書で説明するように、多数の臨床および予後乳癌因子が当該分野で公知であり、治療結果および疾患再発の可能性を予測するために使用される。このような因子としては、例えば、リンパ節転移、腫瘍サイズ、組織学的グレード、エストロゲンおよびプロゲステロンホルモン受容体の状態、ＨＥＲ−２レベルおよび腫瘍倍数性等が挙げられる。一実施形態では、再発リスク（ＲＯＲ）のスコアを、乳癌と診断されたまたはその疑いのある対象に設ける。このスコアは、ＰＡＭ５０分類モデルを、リンパ節の状態（Ｎ）および腫瘍サイズ（Ｔ）の臨床因子と組み合わせて使用する。臨床的変数の評価は、米国がん合同委員会（ＡＪＣＣ）による乳癌病期分類用に標準化されたシステムに基づく。このシステムでは、原発性腫瘍のサイズは、０〜４のスコアで分類される（ＴＯ：原発性腫瘍なし；ＴＬ：＜２ｃｍ；Ｔ２：＞２ｃｍ〜＜５ｃｍ；Ｔ３：＞５ｃｍ；Ｔ４：胸壁または皮膚に直接拡散したあらゆるサイズの腫瘍）。リンパ節の状態はＮ０〜Ｎ３に分類される（ＮＯ：リンパ節は、局所的で転移がみられない；ＮＬ：可動同側腋窩リンパ節への転移；Ｎ２：他の１つまたは複数の構造に固定された同側リンパ節への転移；Ｎ３：同側胸骨下リンパ節への転移）。乳癌患者を同定し、疾患の病期を分類する方法は周知であり、指診、生検、患者および／または家族歴の検討、およびマンモグラフィー、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）などの画像技術が挙げられる。
試料源
本開示の一実施形態では、乳癌のサブタイプは、１つまたは複数の対象試料における表１に記載の内因性遺伝子の発現パターンまたはプロファイル、および／または癌のＨＥＲ−２の状態を確認するために実施すＦＩＳＨ分析もしくはＩＨＣ評価により評価する。検討目的において、対象または対象試料という用語は、健康および／または疾患状態を問わない個体を指す。対象は、被験対象、試験参加者、対照対象、スクリーニング対象、または試料を得て開示の文脈で評価する対象の任意の他のクラスの個体であり得る。従って、対象は、乳癌と診断された者であっても、１つまたは複数の乳癌症状を呈する者であっても、乳癌の（遺伝的）家族歴や（医学的）病歴などの素因を呈する者であっても、あるいは乳癌の治療または療法を受けている者、などであってもよい。このように、対象は、乳癌の治療または乳癌の検出を必要とする対象である。あるいは、対象は、前述の要因や基準のいずれかに関し健常であってもよい。なお、本明細書で用いられる用語「健常」は、乳癌の状態に関するものであり、用語「健常」がいかなる絶対的評価または状態に対応するものとして定義することはできないことが理解されよう。したがって、ある特定疾患または疾患基準を参照して健常であると定義された個人が、実際には、乳癌以外の１つまたは複数の癌を含む他の１つまたは複数の疾患を有すると診断されることもあるし、あるいはかかる他の１つまたは複数の疾患基準を示すこともある。しかし、健常な対照は、いかなる癌も有さないことが好ましい。
本明細書で使用する「乳癌の治療を必要とする対象」とは、乳癌を有するかまたは１つもしくは複数の乳癌の症状を呈する対象、あるいは集団全体に対し乳癌を発症するリスクが高い対象である。好ましくは、乳癌の治療を必要とする患者は、乳癌を有する。乳癌は、原発性乳癌、局所進行性乳癌、または転移性乳癌であり得る。「対象」には、哺乳動物が含まれる。哺乳動物は、例えば、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、鳥類、マウス、ラット、ニワトリ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ラクダ、ヒツジ、またはブタであり得る。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
特定の実施形態では、乳癌の内因性サブタイプまたはＨｅｒ−２の状態を予測するための方法は、乳房組織試料または原発性乳房腫瘍組織試料などの、癌細胞または組織を含む生体試料を採取することを含む。「生体試料」とは、内因性遺伝子の発現を検出することができる細胞、組織、または体液の任意の採取物を意図する。そのような生体試料の例としては、生検試料および塗抹試料が挙げられるが、これらに限定されない。本開示において有用な体液は、血液、リンパ液、尿、唾液、乳頭吸引液、婦人科系体液、または任意の他の身体の分泌物、あるいはそれらの誘導体が挙げられる。血液は、全血、血漿、血清、または血液の任意の誘導体を含み得る。いくつかの実施形態では、生体試料は、乳房細胞、特に乳房腫瘍組織試料といった生検由来の乳房組織を含む。生体試料は、例えば、ある部位を掻爬するまたは綿棒でこする、針を使用して細胞または体液を吸引する、あるいは組織試料を取り出す（すなわち、生検）といった種々な技術によって、対象から得ることができる。様々な生体試料を収集する方法は当分野で周知である。いくつかの実施形態では、乳房組織試料は、例えば、細針吸引生検、コア針生検、または切除生検によって得られる。細胞または組織に固定液および染色溶液を施して試料を保存したり検査しやすくしてもよい。生体試料、特に乳房組織試料を、ガラススライドに移し拡大観察してもよい。一実施形態では、生体試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋乳房組織試料、特に原発乳房腫瘍試料である。様々な実施形態において、組織試料は、病理学者のガイドによる組織コア試料から得られる。
発現プロファイリング
様々な実施形態において、本開示は、対象における乳癌を分類、予測、またはモニタリングするための方法を提供する。本実施形態では、１つまたは複数のパターン認識アルゴリズムを使用して、内因性遺伝子発現の分析から得られたデータを評価する。このような分析方法を使用して、検査データを分類するために使用可能な予測モデルを作成してもよい。例えば、１つの特に有効で便利な分類方法は、多変量統計解析モデルを用いるものである。これは、第１に、サブタイプが分かっている試料（例えば、特定の乳癌内因性サブタイプ：ＬｕｍＡ、ＬｕｍＢ、基底細胞様型、ＨＥＲ２高発現型、またはＮｏｒｍａｌ−ｌｉｋｅを有していることが分かっている試料）からのデータ（「モデリングデータ」）を使用してモデル（「予測数学モデル」）を作成する。そして、第２に、サブタイプに応じて未知の試料（例えば、「検査試料」）を分類する。パターン認識法は、多くの異なる種類の問題、例えば、言語学、フィンガープリンティング、化学、および心理学など多岐にわたる問題を特徴付けるのに広く用いられている。本明細書に記載の方法の文脈において、パターン認識は、パラメトリックおよびノンパラメトリックの両方の多変量統計を使用してデータを分析し、それにより、試料を分類し、そして観察された測定値の範囲に基づいて、いくつかの従属変数の値を予測する。２つの主要なアプローチがある。方法の一つ目のセットは「教師なし」と呼ばれ、これらは、合理的な方法でデータの複雑さを単純に軽減し、そして、人間の目によって解釈可能な表示プロットを生成する。しかし、この種のアプローチは、予測アルゴリズムを訓練するのに使用する初期試料集団から独立した対象由来の試料を分類するのに使用可能な臨床的なアッセイを開発するには適していない。
もう一つ目のアプローチは「教師付き」と呼ばれ、クラスまたは結果が分かっている試料の訓練セットを使用して数学的モデルを生成する。その後、このモデルを、独立した検証用データセットを用いて評価する。ここで、内因性遺伝子発現データの「訓練セット」は、各試料の「サブタイプ」を正確に予測する統計モデルを構築するために使用する。その後、この訓練セットを、独立したデータ（検査または検証セットとも呼ばれる）を用いて検査してコンピュータベースのモデルのロバスト性を決定する。これらのモデルは、時々「エキスパートシステム」と呼ばれることもあるが、ある範囲内の異なる数学的手順に基づいたものであってもよい。教師付きの方法は、縮小次元を有するデータセット（例えば、最初のいくつかの主成分）を使用できるが、典型的には全ての次元で、縮小されていないデータを使用する。全ての場合において、これらの方法は、その内因性遺伝子発現プロファイルについて特徴づけを行いそして各サブタイプに分離する多変量境界の定量的記述を可能にする。例えば、確率のレベルが適合度に当てはまるように、任意の予測における信頼限界を得ることも可能である。選択された試料を分析から除外することにより、予測モデルのロバスト性も相互検証により確認できる。
本明細書に記載のＰＡＭ５０分類モデルは、表１に記載の内因性遺伝子を用いた複数の対象試料についての遺伝子発現プロファイルに基づく。複数の試料には、各サブタイプクラスに属する対象由来の十分な数の試料が含まれる。この文脈における「十分な試料」または「代表数」とは、各サブタイプをその群内の他の全サブタイプから確実に区別できる分類モデルを構築するのに十分な各サブタイプ由来試料の量を意図する。教師付き予測アルゴリズムは、アルゴリズムの「訓練」用に客観的に選択したプロトタイプ試料のプロファイルに基づいて開発されている。試料は、その全体が参考として本明細書中に援用される国際特許公報第ＷＯ２００７／０６１８７６号および米国特許公開公報第２００９／０２９９６４０号に開示された方法に応じて拡大した内因性遺伝子のセットを用いて選択しサブタイプに分類される。あるいは、試料は、乳癌のサブタイプを分類する任意の公知アッセイに応じてサブタイプに分類できる。サブタイプに応じた訓練試料を階層化した後、セントロイドベースの予測アルゴリズムを用いて、表１に記載の内因性遺伝子セットの発現プロファイルに基づいたセントロイドを構築する。
一実施形態では、予測アルゴリズムは、その全体が参考として本明細書中に援用されるＮａｒａｓｈｉｍａｎ ａｎｄ Ｃｈｕ（２００２）ＰＮＡＳ ９９：６５６７−６５７２に記載したものに関連する最短セントロイド法である。本開示では、この方法で、各サブタイプについての標準セントロイドを計算する。このセントロイドは、各サブタイプ（または「クラス」）における各遺伝子についてのクラス内標準偏差で除算した当該遺伝子の遺伝子発現の平均である。最短セントロイド分類は、新たな試料の遺伝子発現プロファイルを取り出して、このプロファイルをこれらのクラスの各セントロイドと比較する。サブタイプ予測は、５つのセントロイドに対して各検査ケースのスペアマンの順位相関を計算し、次いで最短セントロイドに基づいて試料をサブタイプに指定することによって行われる。
内因性遺伝子発現の検出
表１に記載の内因性遺伝子の発現を検出するための、当分野で利用可能な全ての方法が本明細書に含まれる。「発現の検出」とは、内因性遺伝子のＲＮＡ転写物またはその発現産物の量または存在を決定する意図である。本開示の内因性遺伝子の発現を検出する方法、すなわち遺伝子発現プロファイリングは、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析に基づく方法、ポリヌクレオチドの配列決定に基づく方法、免疫組織化学法、およびプロテオミクスに基づく方法を含む。これらの方法は、一般に、表１に記載の内因性遺伝子の発現産物（例えば、ｍＲＮＡ）を検出する。好ましい実施形態では、ＰＣＲに基づく方法、例えば、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｗｅｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＧ８：２６３−６４，１９９２）、およびアレイに基づく方法、例えば、マイクロアレイ（Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７−７０，１９９５）が使用される。「マイクロアレイ」とは、例えば、ポリヌクレオチドプローブといったハイブリダイズ可能なアレイ成分が基板上に規則的に配置されたものという意図である。用語「プローブ」は、特に意図する標的生体分子、例えば、内因性遺伝子によってコードされるか、あるいは対応するヌクレオチド転写物またはタンパク質に選択的に結合可能な任意の分子を指す。プローブは、当業者が合成してもよいし、あるいは適切な生体標本由来であってもよい。プローブは、標識用に特別に設計してもよい。プローブとして利用できる分子の例として、これらに限定されないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、および有機分子が挙げられる。
多くの発現検出法は、単離ＲＮＡを使用する。出発材料は、典型的には、生体試料、例えば、腫瘍または腫瘍細胞株、および対応する正常組織または細胞株からそれぞれ単離された全ＲＮＡである。ＲＮＡ源が、原発性腫瘍である場合、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、例えば、凍結または保存されたパラフィン包埋固定（例えば、ホルマリン固定）組織試料（例えば、病理学者のガイドによる組織コア試料）から抽出できる。
ＲＮＡ抽出の一般的な方法は、当分野で周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８７−１９９９等の分子生物学の標準的な教科書に記載されている。パラフィン包埋組織からのＲＮＡ抽出方法は、例えば、Ｒｕｐｐ ａｎｄ Ｌｏｃｋｅｒ，Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．５６：Ａ６７，（１９８７）、およびＤｅ Ａｎｄｒｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８：４２−４４，（１９９５）に開示されている。特に、ＲＮＡの単離は、市販の業者、例えば、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）の精製キット、バッファセット、およびプロテアーゼを用いて、その業者の説明書に従って実施できる。例えば、培養細胞由来の全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニカラムを用いて単離できる。他の市販のＲＮＡ単離キットとして、ＭＡＳＴＥＲＰＵＲＥ（商標）完全ＤＮＡおよびＲＮＡ精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）およびパラフィンブロックＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）が挙げられる。組織試料からの全ＲＮＡは、例えば、ＲＮＡ Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）を用いて単離できる。腫瘍から調製したＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心法によって単離できる。また、多数の組織試料を、当業者に周知の技術、例えば、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉの単一工程ＲＮＡ単離法（米国特許第４，８４３，１５５号）を用いて容易に処理できる。
単離ＲＮＡは、これらに限定されないが、ＰＣＲ分析およびプローブアレイなどのハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイに用いることができる。ＲＮＡレベルを検出する１つの方法は、単離ＲＮＡを、検出対象の遺伝子によってコードされるｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な核酸分子（プローブ）に接触させることを含む。核酸プローブは、例えば完全長ｃＤＮＡあるいはその一部、例えば、ストリンジェントな条件下で本開示の内因性遺伝子または任意の誘導体ＤＮＡもしくはＲＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分で長さが、例えば、少なくとも７、１５、３０、６０、１００、２５０、もしくは５００のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり得る。ｍＲＮＡとプローブがハイブリダイゼーションすると、問題の内因性遺伝子が発現しているということである。
一実施形態では、ｍＲＮＡを固体の表面に固定しプローブに接触させる、例えば、単離ｍＲＮＡをアガロースゲルに流してｍＲＮＡをゲルからニトロセルロースなどの膜に移す。代替的な実施形態では、プローブを固体の表面に固定し、ｍＲＮＡを、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ遺伝子チップアレイのプローブに接触させる。当業者であれば、本開示の内因性遺伝子の発現レベルの検出に用いるために既知のｍＲＮＡ検出法を容易に改変できる。
試料における内因性遺伝子発現産物のレベルを決定する代替的な方法では、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，２０２号）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ８８：１８９−９３，（１９９１））、自己持続性配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ８７：１８７４−７８，（１９９０））、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ ＵＳＡ８６：１１７３−７７，（１９８９））、Ｑベータレプリカーゼ法（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７，（１９８８））、ローリングサークル複製法（米国特許第５，８５４，０３３号）、または他の任意の核酸増幅法による核酸増幅プロセスを行い、その後当業者に周知の技術を用いた増幅分子の検出を行う。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に少ない数で存在する場合、かかる核酸分子を検出するのに特に有用である。
本開示の特定の態様では、内因性遺伝子発現は、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評価できる。数多くの様々なＰＣＲまたはＱＰＣＲプロトコルが当分野で公知であり、以下に例示される。かかるプロトコルは、表１に記載の内因性遺伝子の検出および／または定量に直接適用してもよく、あるいはここに記載の組成物を用いた用途に適合させてもよい。一般に、ＰＣＲでは、標的ポリヌクレオチド配列を、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーまたは一対のオリゴヌクレオチドプライマーと反応させることで増幅する。プライマーは標的核酸の相補領域にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼがプライマーを伸長して標的配列を増幅する。ポリメラーゼベースの核酸増幅産物をもたらすのに十分な条件下で、１つのサイズの核酸断片が、反応産物（増幅産物である標的ポリヌクレオチド配列）のほとんどを占める。増幅サイクルを繰り返して、単一の標的ポリヌクレオチド配列の濃度を増加させる。反応は、一般的にＰＣＲに使用される任意のサーモサイクラーで行うことができる。しかし、好ましいのは、リアルタイム蛍光測定性能を有するサイクラー、例えば、ＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）、ＲＯＴＯＲ−ＧＥＮＥ（商標）（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）、ＩＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）、およびＭＸ４０００（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）である。
本開示の別の実施形態では、発現プロファイリングにマイクロアレイを使用する。マイクロアレイは、様々な実験の間で再現性があるので、特にこの目的に適している。ＤＮＡマイクロアレイは、多数の遺伝子の発現レベルを同時に測定するための１つの方法をもたらす。各アレイは、固体支持体に結合した捕捉プローブの再現性のあるパターンからなる。標識ＲＮＡまたはＤＮＡが、アレイ上の相補プローブにハイブリダイズし、次いでレーザー走査によって検出される。アレイ上の各プローブのハイブリダイゼーション強度が決定され、相対的な遺伝子発現レベルを表す定量値に変換される。例えば、米国特許第６，０４０，１３８号、第５，８００，９９２号、第６，０２０，１３５号、第６，０３３，８６０号、および第６，３４４，３１６号を参照のこと。試料における多数のＲＮＡの遺伝子発現プロファイルの決定には、高密度オリゴヌクレオチドアレイが特に有用である。
好ましい実施形態では、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分析システムを用いて内因性遺伝子発現を検出する。ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分析システムのベースは、アッセイ対象の各核酸標的に割り当てられた固有のコードである（その全体が参考として本明細書中に援用される国際特許出願公報第ＷＯ０８／１２４８４７号、米国特許番号第８，４１５，１０２号、およびＧｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２００８．２６（３）：３１７−３２５）。コードは、アッセイ対象の各標的の固有バーコードを作成する整列した一連の着色蛍光スポットからなる。ビオチン化捕捉プローブおよびレポータープローブが蛍光バーコードを有するように一対のプローブを各ＤＮＡまたはＲＮＡ標的用に設計する。このシステムは、本明細書において、ナノレポーターコードシステムとも称される。
各標的に対し特定のレポータープローブおよび捕捉プローブを合成する。レポータープローブは、以下を含み得る：第１シグナルを構成する光を放射する１つまたは複数の標識モノマーが結合している少なくとも１つの第１標識結合領域；第２シグナルを構成する光を放射する１つまたは複数の標識モノマーが結合し、第１標識結合領域とはオーバーラップしない少なくとも１つの第２標識結合領域；および第１標的特異的配列。好ましくは、配列特異的なレポータープローブは、それぞれ、表１のＰＡＭ５０遺伝子のうちたった１つのみとハイブリダイズ可能な標的特異的配列を含み、そして場合により、少なくとも３つ、または少なくとも４つの標識結合領域を含み、ここで、前記標識結合領域には、少なくとも第３、または少なくとも第４シグナルをそれぞれ構成する光を放射する１つまたは複数の標識モノマーが結合している。捕捉プローブは、第２標的特異的配列；および第１アフィニティータグを含み得る。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、１つまたは複数の標識結合領域をも含み得る。好ましくは、レポータープローブの第１標的特異的配列および捕捉プローブの第２標的特異的配列は、検出対象である同じ表１の遺伝子の異なる領域にハイブリダイズする。レポータープローブおよび捕捉プローブは、全て１つのハイブリダイズ混合物、つまり「プローブライブラリー」に保存される。好ましくは、プローブライブラリーは、表１の各ＰＡＭ５０遺伝子につき一組のプローブ対（捕捉プローブおよびレポータープローブ）を含む。
各標的の相対的な存在量を、１回の多重ハイブリダイゼーション反応で測定する。この方法は、生体試料をプローブライブラリーに接触させることを含み、ここでこのライブラリーは、試料内に標的が存在すると表１のＰＡＭ５０遺伝子の一組のプローブ対と標的複合体を形成するような一組のプローブ対を含む。次いでこの複合体を精製する。より具体的には、試料をプローブライブラリーと組み合わせて、溶液中でハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイゼーション後、３つからなるハイブリダイズ複合体（プローブ対および標的）を、捕捉プローブおよびレポータープローブ上のユニバーサル配列に相補的なオリゴヌクレオチドに結合する磁気ビーズを用いた２段階の手順で精製する。この２段階精製プロセスにより、標的特異的プローブが非常に過剰に存在する状態でハイブリダイゼーション反応が完了することになるが、これらのプローブは最終的に除去されるので、試料の結合および画像化の妨げにならない。ハイブリダイゼーション後の全ての工程は、カスタム液体操作ロボット（Ｐｒｅｐ Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりロボットが操作する。
精製した反応物を、Ｐｒｅｐ Ｓｔａｔｉｏｎにより試料カートリッジの個々のフローセル内に投入し、ストレプトアビジンでコーティングした表面に捕捉プローブを介して結合させ、電気泳動してレポータープローブを伸長し、固定する。処理後、試料カートリッジを、完全自動画像化およびデータ収集装置（Ｄｉｇｉｔａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ，ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に移す。各試料を画像化し当該標的のコードが検出された回数をカウントすることによって標的の発現レベルを測定する。各試料に対し、典型的には、約１０ｍｍ2の結合表面を表す６００視野（ＦＯＶ）が画像化される（１３７６×１０２４ピクセル）。典型的な画像密度では、多重化度、投入した試料の量、および全体の標的存在度により、レポーターのカウント数は１視野当たり１００〜１２００である。データは、各試料について各標的当たりのカウント数を列記する単純な表計算形式で出力される。
このシステムは、ナノレポーターと共に使用できる。ナノレポーターに関するさらなる開示は、それぞれその全体が参考として本明細書中に援用される国際公報第ＷＯ０７／０７６１２９号および第ＷＯ０７／０７６１３２号、ならびに米国特許公開公報第２０１０／００１５６０７号および第２０１０／０２６１０２６号に見られる。さらに、核酸プローブおよびナノレポーターという用語は、その全体が参考として本明細書中に援用される国際出願番号第２０１０／０１９８２６号および米国特許公開公報第２０１０／００４７９２４号に記載の合理的に設計されたもの（例えば、合成配列）を含み得る。
データ処理
例えば、欠測データのアドレス指定、変換、スケーリング、正規化、重み付けなどによって遺伝子発現データを前処理することが有用なことが多い。多変量投影法、例えば、主成分分析（ＰＣＡ）および部分最小二乗法（ＰＬＳ）は、いわゆるスケーリング高感度法と呼ばれる。試験データの種類について従来からの知識および経験を用いることにより、多変量モデリング前のデータの質を、スケーリングおよび／または重み付けによって向上させることができる。適切なスケーリングおよび／または重み付けにより、データ内に隠れている重要で興味深い変動を明確にでき、これによりその後の多変量モデリングがより効率的になる。スケーリングおよび重み付けにより、データを試験システムの知識および経験に基づいた正しい尺度に補正してもよく、これによりデータに元々存在するパターンが明確になる。
可能なら、欠測データ、例えば、列の値の抜けを回避すべきである。しかし、必要なら、このような欠測データを、例えば、列の平均値（「平均値充当」）；乱数値（「乱数値充当」）；または主成分分析に基づいた値（「主成分値充当」）で置き換えるまたは「充当する」してもよい。
記述子座標軸の「変換」が有用なことがある。このような変換の例として、正規化および平均センタリングが挙げられる。「正規化」により試料間のばらつきを排除してもよい。マイクロアレイデータでは、正規化プロセスは、２つの標識色素の蛍光強度を釣り合わせることによってシステムエラーを排除することを目的とする。色素の偏りは、色素標識効率の違い、熱および光の感受性、ならびに２つのチャネルを走査するためのスキャナ設定を含む様々な原因から生じ得る。正規化因子を計算するために一般的に使用される方法のいくつかでは、以下を含む：（ｉ）アレイ上の全ての遺伝子を使用する全正規化；（ｉｉ）常に発現しているハウスキーピング／不変遺伝子を使用するハウスキーピング遺伝子の正規化；および（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション中に加える既知量の外来対照遺伝子を使用する内部対照の正規化（Ｑｕａｃｋｅｎｂｕｓｈ Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３２（Ｓｕｐｐｌ．），４９６−５０１（２００２））。一実施形態では、本明細書に開示の内因性遺伝子を対照ハウスキーピング遺伝子に対し正規化できる。例えば、その全体が参考として本明細書中に援用される米国特許公開公報第２００８／００３２２９３号に記載のハウスキーピング遺伝子を正規化に使用できる。ハウスキーピング遺伝子の例として、ＭＲＰＬ１９、ＰＳＭＣ４、ＳＦ３Ａ１、ＰＵＭｌ、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤ、ＧＵＳＢ、ＲＰＬＰＯ、およびＴＦＲＣが挙げられる。当業者であれば、本明細書に開示の方法が、特定のハウスキーピング遺伝子に対する正規化に拘束されず、当分野で公知の任意の適切なハウスキーピング遺伝子を使用できることを理解されよう。
多数の正規化手法が可能であり、このよう正規化手法は、分析における任意のいくつかの点で適用できることが多い。一実施形態では、マイクロアレイデータは、ＬＯＷＥＳＳ法を用いて正規化される。ＬＯＷＥＳＳ法は、全局所重み付き散布図平滑正規化関数（ｇｌｏｂａｌ ｌｏｃａｌｌｙ ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｓｃａｔｔｅｒｐｌｏｔ ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）である。別の実施形態では、ｑＰＣＲデータは、複数のハウスキーピング遺伝子セットの幾何平均に対して正規化される。
変換を簡単にするために、「平均センタリング」を使用してもよい。通常、各記述子ごとに、全ての試料についてその記述子の平均値を減算する。このように、記述子の平均値が、原点に一致し、全ての記述子が、０に「センタリング」される。「単位分散スケーリング（ｕｎｉｔ ｖａｒｉａｎｃｅ ｓｃａｌｉｎｇ）」では、データを、同等の分散にスケーリングできる。通常、各記述子の値は、１／ＳｔＤｅｖによってスケーリングされる、ここでＳｔＤｅｖは、全ての試料についてのその記述子の標準偏差である。「パレートスケーリング」は、ある意味、平均センタリングと単位分散スケーリングの中間である。パレートスケーリングでは、各記述子の値は、ｌ／ｓｑｒｔ（ＳｔＤｅｖ）によってスケーリングされる、ここでＳｔＤｅｖは、全ての試料についてのその記述子の標準偏差である。このように、各記述子は、その初期標準偏差と数値的に等しい分散を有する。パレートスケーリングは、例えば、生データまたは平均センタリングデータに対して行ってもよい。
データが正のスキューを有する場合および／またはデータが例えば、数桁の規模で広範にわたる場合、「対数スケーリング」により解釈しやすくしてもよい。通常、各記述子につき、ある値を、その値の対数に置き換える。「同等レンジスケーリング」では、各記述子を、全ての試料についてその記述子のレンジで除算する。このように、全ての記述子は、同じレンジ、すなわち１を有する。しかしながら、この方法は、外れ点の存在に影響されやすい。「自動スケーリング」では、各データベクトルに、平均センタリングおよび単位分散スケーリングを行う。この技術は、各記述子が等しく重み付けされ、大きい値と小さい値が等しい重要性で扱われるため、非常に有用である。これは、非常に低レベルであるものの検出可能なレベルで発現する遺伝子に重要であり得る。
一実施形態では、１つまたは複数の検査試料についてのデータを収集し、本明細書に記載のＰＡＭ５０分類モデルを用いて分類する。複数の分析からのデータを比較する（例えば、１つまたは複数の検査試料の発現プロファイルを、独立した試験で収集および分析した試料から構築されたセントロイドと比較する）場合、これらのデータセット全体にわたってデータを正規化する必要がある。一実施形態では、距離重み付け区別（ＤＷＤ）を使用してこれらのデータセットを一緒に組み合わせる（その全体が参考として本明細書中に援用されるＢｅｎｉｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０（１）：１０５−１１４）。ＤＷＤは、別々のデータセットに存在する系統的な偏りを識別して、全体的に調整してこれらの偏りを補正できる多変量解析ツールである：つまり、本質的に、各別々のデータセットは、データポイントの多次元クラウドであり、ＤＷＤは、２つのポイントクラウドをとり、一方が他方により最適に重なるようにシフトさせるものである。
本方法を実施可能および／または結果を記録可能な任意の装置を用いて本明細書に記載の方法を実施してもよくおよび／または結果を記録してもよい。使用できる装置の例として、これらに限定されないが、あらゆる種類のコンピュータを含む電子計算装置が挙げられる。本明細書に記載の方法をコンピュータで実施および／または記録する場合、この方法の工程を実施するためのコンピュータを構成するのに使用可能なコンピュータプログラムを、このコンピュータプログラムを保存できる任意のコンピュータ可読媒体に保存することができる。使用可能なコンピュータ可読媒体の例として、これらに限定されないが、ディスケット、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ならびに他のメモリおよびコンピュータ記憶装置が挙げられる。この方法の工程を実施およびかつ／または結果を記録するためのコンピュータを構成するのに使用可能なコンピュータプログラムは、電子ネットワーク、例えば、インターネット、イントラネット、または他のネットワークを介して設けてもよい。
再発リスクの計算
本明細書では、内因性サブタイプのコンテクスト内での乳癌の転帰、そして場合により他の臨床的変数を予測するための方法を提供する。転帰とは、全生存または疾患特異的生存、無事象生存、あるいは特定の治療または療法に対する転帰のことを指し得る。特に、この方法を、長期間にわたる無疾患生存の可能性を予測するのに使用してもよい。「乳癌患者の生存の可能性を予測する」とは、内在性乳癌の結果として患者が死亡するリスクを評価するという意図である。「長期間にわたる無疾患生存」とは、最初の診断または治療から少なくとも５年、少なくとも１０年、またはそれ以上の年数の間に患者が死亡あるいは患者が内在性乳癌を再発することもないという意図である。
一実施形態では、転帰は、サブタイプに従った対象の分類に基づいて予測される。この分類は、表１に記載の内因性遺伝子のリストを用いた発現プロファイリングに基づく。ＰＡＭ５０バイオインフォマティクスモデルは、サブタイプの割り当てに加えて、４つのサブタイプ全てに対する検査試料の類似性の測定値を設ける。この測定値は、疾患状態および治療の選択にかかわらず、あらゆる患者集団に使用可能な再発リスク（ＲＯＲ）スコアに変換される。また、内因性サブタイプおよびＲＯＲは、例えば、ネオアジュバントのタキサンおよびアントラサイクリン化学療法（その全体が参考として本明細書中に援用される（Ｒｏｕｚｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２３：８３３１−９（２００５））を用いて治療した女性についての病理学的完全奏効の予測に関する値を有する。したがって、本開示の様々な実施形態では、再発リスク（ＲＯＲ）モデルを使用して転帰を予測する。これらのリスクモデルを使用して、再発について低リスク、中リスク、および高リスク群に対象を階層化できる。ＲＯＲの計算により、治療決定をガイドおよび／または療法に対する反応をモニターする予後情報を提供できる。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ＰＡＭ５０によって規定する内因性サブタイプおよび／または他の臨床パラメーターの予後成績を、コックス比例ハザードモデル解析を利用して評価する。この解析は、ハザード比の推定値およびその信頼区間を提供する生存データの回帰法である。コックスモデルは、患者の生存と特定の変数との間の関係を調べるため広く認識されている統計技術である。この統計方法だと、ある個体についての予後変数（例えば、本明細書に記載の追加の臨床因子を有するまたは有しない内因性遺伝子発現プロファイル）を設けると、その個体のハザード（すなわち、リスク）の推定が可能になる。「ハザード比」とは、特定の予後変数を示す患者がいずれかの時点で死亡するリスクのことである。一般的には、Ｓｐｒｕａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ＆Ｃｈｅｍｏ．４８：２７８７−９２（２００４）を参照のこと。
本明細書に記載のＰＡＭ５０分類モデルは、サブタイプ距離（または相関）のみを用いて、あるいは上述の臨床的変数と共にサブタイプ距離を用いて再発のリスクの訓練が可能である。一実施形態では、検査試料のリスクスコアを、内因性サブタイプ距離のみを用いて以下の式により計算する。
ＲＯＲ＝０．０５＊Ｂａｓａｌ＋０．１ ｌ＊ＨＥＲ２＋−０．２５＊ＬｕｍＡ＋０．０７＊ＬｕｍＢ＋−０．１ ｌ＊Ｎｏｒｍａｌ
式中、変数「Ｂａｓａｌ」、「ＨＥＲ２」、「ＬｕｍＡ」、「ＬｕｍＢ」、および「Ｎｏｒｍａｌ」は、それぞれの分類子についてのセントロイドへの距離のことであり、検査試料からの発現プロファイルを、受託番号ＧＳＥ２８４５としてＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）に寄託した遺伝子発現データを用いて構築したセントロイドと比較する際に用いる。
リスクスコアは、乳癌のサブタイプと臨床的変数である腫瘍サイズ（Ｔ）およびリンパ節状態（Ｎ）との組み合わせを用いて以下の式により計算することもできる。
ＲＯＲ（ｆｕｌｌ）＝０．０５＊Ｂａｓａｌ＋０．１＊ＨＥＲ２＋−０．１９＊ＬｕｍＡ＋０．０５＊ＬｕｍＢ＋−０．０９＊Ｎｏｒｍａｌ＋０．１６＊Ｔ＋０．０８＊Ｎ
上記と同様に、検査発現プロファイルを、受託番号ＧＳＥ２８４５としてＧＥＯに寄託した遺伝子発現データを用いて構築したセントロイドと比較する際に用いる。
さらに別の実施形態では、検査試料のリスクスコアを、内因性サブタイプの距離のみを用いて以下の式により計算する。
ＲＯＲ−Ｓ＝０．０５＊Ｂａｓａｌ＋０．１２＊ＨＥＲ２＋−０．３４＊ＬｕｍＡ＋０．０．２３＊ＬｕｍＢ
式中、変数「Ｂａｓａｌ」、「ＨＥＲ２」、「ＬｕｍＡ」、および「ＬｕｍＢ」は、上記の説明通りであり、検査発現プロファイルを、受託番号ＧＳＥ２８４５としてＧＥＯに寄託した遺伝子発現データを用いて構築したセントロイドと比較する際に用いる。さらに別の実施形態では、リスクスコアは、乳癌のサブタイプと臨床的変数である腫瘍サイズ（Ｔ）との組み合わせを用いて以下の式（変数は上記の説明通り）により計算することもできる。
ＲＯＲ−Ｃ＝０．０５＊Ｂａｓａｌ＋０．１ ｌ＊ＨＥＲ２＋−０．２３＊ＬｕｍＡ＋０．０９＊ＬｕｍＢ＋０．１７＊Ｔ
さらに別の実施形態では、検査試料のリスクスコアを、内因性サブタイプの距離と増殖サイン（「Ｐｒｏｌｉｆ」）との組み合わせを用いて以下の式により計算する。
ＲＯＲ−Ｐ＝−０．００１＊Ｂａｓａｌ＋０．７＊ＨＥＲ２＋−０．９５＊ＬｕｍＡ＋０．４９＊ＬｕｍＢ＋０．３４＊Ｐｒｏｌｉｆ
式中、変数「Ｂａｓａｌ」、「ＨＥＲ２」、「ＬｕｍＡ」、「ＬｕｍＢ」、および「Ｐｒｏｌｉｆ」は、上記の説明の通りであり、検査発現プロファイルを、受託番号ＧＳＥ２８４５としてＧＥＯに寄託した遺伝子発現データを用いて構築したセントロイドと比較する際に用いる。
さらに別の実施形態では、リスクスコアは、乳癌のサブタイプと増殖サインおよび臨床的変数である腫瘍サイズ（Ｔ）の組み合わせを用いて上記の表３と共に記載したＲＯＲ−ＰＴにより計算することもできる。
サブタイプの検出
エストロゲン（ＥＲ）、プロゲステロン（ＰｇＲ）、ＨＥＲ２、およびＫｉ６７の免疫組織化学を、色原体として３，３’−ジアミノベンジジンを用いる標準的なストレプトアビジン−ビオチン複合体法により連続切片に対し同時に実施できる。ＥＲ、ＰｇＲ、およびＨＥＲ２の解釈のための染色は、従前に記載のように実施できるが（Ｃｈｅａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８；１４（５）：１３６８-１３７６．）、当分野で公知の任意の方法を使用してもよい。
例えば、Ｋｉ６７抗体（クローンＳＰ６；ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を１：２００に希釈して３２分間処理し、その後Ｖｅｎｔａｎａ Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｅｒ（Ｖｅｎｔａｎａ，Ｔｕｃｓｏｎ ＡＺ）の標準的なＣｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ １（ＣＣ１という専用のバッファ）プロトコルに従い９８℃で３０分間処理できる。ＥＲ抗体（クローンＳＰ１；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ ＣＡ）を１：２５０の希釈で用いて、１０分間インキュベートし、８分間マイクロ波処理した後、抗原を１０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）中に回収できる。即使用できるＰＲ抗体（クローン１Ｅ２；Ｖｅｎｔａｎａ）を、上記のようにＣＣ１プロトコルに従って使用できる。スチーマーで３０分間９５℃に加熱しながら０．０５Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ１０．０）中に抗原を回収した後に、１：１００に希釈したＳＰ３抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＨＥＲ２染色を行うことができる。ＨＥＲ２蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイではＰａｔｈＶｙｓｉｏｎ ＨＥＲ−２ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ ｋｉｔ（Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）を使用することにより、製造元の説明書に従前から記載されているような（Ｂｒｏｗｎ ＬＡ，Ｉｒｖｉｎｇ Ｊ，Ｐａｒｋｅｒ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＥＭＳＹ，ａ ｎｏｖｅｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｏｎ １１ｑ１３，ｉｎ ｈｉｇｈ ｇｒａｄｅ ｏｖａｒｉａｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ．２００６；１００（２）：２６４-２７０）前処理およびハイブリダイゼーションの変更を加えたものに従って、スライドを、ＬＳＩ（位置特異的識別子）ＨＥＲ２／ｎｅｕおよびセントロメア１７に対するプローブにハイブリダイズできる。スライドをその後４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールで対比染色し、染色物質をＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ落射蛍光顕微鏡で可視化し、そしてシグナルをＭｅｔａｆｅｒ画像取得システム（Ｍｅｔａｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｔｌｕｓｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて分析できる。免疫組織化学アッセイによるバイオマーカーの発現をその後２人の病理学者によりスコア付けできる。これらの病理学者は、臨床病理学的な特性および転帰について知らされておらず、他の乳癌コホートに対し開発されたバイオマーカーの発現レベルについて以前に確立され公開されている基準を用いる。
以前から記載されているように、腫瘍は、免疫染色が腫瘍核の１％超に見られると、ＥＲまたはＰＲに陽性であると見なされる。免疫染色がＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ基準による３＋というスコアだと、腫瘍はＨＥＲ２に陽性であると見なされ、ここで蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの増幅比２．０以上というのが、免疫組織化学的に曖昧な腫瘍（２＋のスコア）を分類するのに用いることができる基準値である（Ｙａｚｉｊｉ，ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ，２９１（１６）：１９７２-１９７７（２００４））。Ｋｉ６７は、陽性免疫染色が背景レベルよりも高い腫瘍細胞核の割合について視覚的にスコア付けできる。
他の方法を用いて、ＨＥＲ２＋サブタイプを検出することもできる。これらの手法として、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、またはＦＡＣＳ分析が挙げられる。
キット
本開示は、乳癌内因性サブタイプの分類および／またはゲムシタビンへの反応性が高い乳癌を同定する予後情報の提供に有用なキットについても記載する。このようなキットは、表１に記載の内因性遺伝子に特異的な捕捉プローブおよび／またはプライマーのセットを含み、そしてさらに、表１の遺伝子を検出し、乳癌内因性サブタイプを分類し、および／またはゲムシタビンへの反応性が高い乳癌を同定する予後情報を提供するための説明書を含み得る。キットは、細胞をＨＥＲ２＋として分類するために、ＨＥＲ２の検出および／または定量をしやすくするのに十分な試薬をも含み得る。好ましくは、キットは、表１に記載の内因性遺伝子のうち少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、あるいは５０個全ての内因性遺伝子に特異的な捕捉プローブおよび／またはプライマーのセットを含む。キットはさらに、コンピュータ可読媒体を含んでもよい。
本開示の一実施形態では、捕捉プローブはアレイに固定される。「アレイ」とは、ペプチドまたは核酸プローブが結合した固体支持体または基板という意図である。アレイは、典型的には、異なる既知の位置にある基板の表面に結合している複数の異なる捕捉プローブを含む。本開示のアレイは、内因性遺伝子発現産物に特異的に結合可能な複数の捕捉プローブを有する基板を含む。基板上の捕捉プローブの数は、アレイの意図する目的によって異なる。アレイは、低密度アレイであっても高密度アレイであってもよく、そして４個以上、８個以上、１２個以上、１６個以上、または３２個以上のアドレスを含んでもよいが、最低限表１に記載の内因性遺伝子のうち少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、あるいは５０個全ての内因性遺伝子に対する捕捉プローブを含む。
機械合成法を用いるこのようなアレイの合成技術は、例えば、全ての目的においてその全体が参考として本明細書中に援用される米国特許第５，３８４，２６１号に記載されている。アレイは、実質的に任意の形状の表面、または複数の表面上にも作成できる。アレイは、ビーズ、ゲル、ポリマー表面、光ファイバーなどのファイバー、ガラス、または任意の他の適切な基板上のプローブ（例えば、核酸結合プローブ）であってもよい。全ての目的においてその全体がそれぞれ参考として本明細書中に援用される米国特許第５，７７０，３５８号、同第５，７８９，１６２号、同第５，７０８，１５３号、同第６，０４０，１９３号、および同第５，８００，９９２号を参照のこと。アレイは、デバイス上で診断または他の操作ができるようなパッケージにしてもよい。例えば、参考として本明細書中に援用される米国特許第５，８５６，１７４号および第５，９２２，５９１号を参照のこと。
別の実施形態では、キットは、表１に記載の内因性遺伝子のそれぞれの検出および／または定量に十分なオリゴヌクレオチドプライマーのセットを含む。好ましくは、キットは、表１に記載の内因性遺伝子のうち少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、あるいは５０個全ての内因性遺伝子の検出および／または定量に十分なオリゴヌクレオチドプライマーのセットを含む。オリゴヌクレオチドプライマーは、凍結乾燥形態または再構成形態で設けてもよいし、あるいはヌクレオチド配列のセットとして設けてもよい。一実施形態では、プライマーを、マイクロプレート形式で設け、各プライマーセットが、マイクロプレートの１つのウェル（または、繰り返す場合には複数のウェル）を占めるようにする。マイクロプレートは、以下に説明する１つまたは複数のハウスキーピング遺伝子の検出に十分なプライマーをさらに含んでもよい。キットは、表１に記載の遺伝子の発現産物の増幅に十分な試薬および説明書をさらに含んでもよい。
例えば、比較、精査、回収、および／または変更のため容易にアクセスしやすくするために、典型的には、分子サイン／発現プロファイルがデータベースに記録されている。最も典型的には、データベースは、計算機によってアクセス可能なリレーショナルデータベースであるが、他の形式、例えば、写真、アナログまたはデジタル画像読み出し形式、表計算形式など手動でアクセス可能な発現プロファイルのインデックスファイルも使用することができる。最初に記録する発現パターンの形式がアナログまたはデジタルであるかにかかわらず、発現パターン、発現プロファイル（集合的発現パターン）、および分子サイン（相関発現パターン）が、デジタルで記録され、データベースを介してアクセスされる。典型的には、データベースは、中心施設でコンパイルおよび保持され、局地的および／または遠隔からアクセス可能である。
ある実施形態では、キットは、Ｈｅｒ−２の発現レベルを発見するために使用する物質も含む。この物質は、抗体または核酸プローブであり得る。これらの物質を使用して、ＦＩＳＨ、ＩＨＣ、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、またはＦＡＣＳ分析によりＨｅｒ−２を検出できる。場合により、キットは、試料におけるＨｅｒ−２発現の検出物質の検出およびＨＥＲ−２発現の定量を可能にする試薬も含む。
実施例１．ＰＡＭ５０を用いた腫瘍の分類
患者コホート研究
この研究は、局所進行性または転移性疾患を有する３３７人の女性について、ドセタキセルのみの単一投与（Ｄ）とゲムシタビンおよびドセタキセルの複合投与（ＧＤ）との有効性を比較する無作為試験に参加した患者コホートに基づく（３）。患者は無作為に１日目および２１日おきにドセタキセル（１００ｍｇ／ｍ2）を投与するか、あるいは１日目および８日目にゲムシタビン（１０００ｍｇ／ｍ2）加えて８日目にドセタキセル（７５ｍｇ／ｍ2）を投与する群に割り当てた。患者は、転移性乳癌のレジメンについて、以前は治療を行っていない、以前からアントラサイクリンベースの（ネオ）アジュバント化学療法を受けていた、または以前からアントラサイクリンベースの単一化学療法を受けていたかのいずれかであった。Ｄａｎｉｓｈ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐ（ＤＢＣＧ）が独自のプロトコルならびにバイオマーカーのサプリメントを調製し、デンマーク国立生物医学研究倫理委員会がその独自プロトコルならびに活性化前の添加物（ＫＦ０２−０４５−０１およびＨ−ＫＦ−０２−０４５−０１）を承認した。
マクロ切開およびＲＮＡ単離
保管されていたホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）原発性乳房腫瘍組織をヘマトキシリンおよびエオシン染色した切片を、病理学者（ＴＯＮ）の監督下で生物学者（ＣＬＴＪ）によって検討した。代表的な浸潤性乳癌を含む領域の輪郭を、スライドにとった。腫瘍表面積に応じて、１０〜１５μｍ厚の１〜６枚の未染色組織切片を、正に荷電した顕微鏡用スライドガラス上にマウントし、４５℃で一晩ベーキングした。未染色組織切片は、ＣｉｔｒｏＳｏｌｖで脱パラフィンし、エタノールで洗浄し、乾燥させた。組織は、３％グリセロールで再水和してから、手作業でマクロ切開して輪郭領域外の周辺正常組織を除去した。
全ＲＮＡを、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｐａｒａｆｆｉｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ，ｃａｔ＃０３２７０２８９００１）を用い製造元のプロトコルに従って抽出した。ＲＮＡの収量および純度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−１０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＤＥ）を用いて評価した。下流分析に用いるＲＮＡ試料は、予め特定した品質基準、つまり、全ＲＮＡの初期濃度≧１２．５ｎｇ／μｌ、最小合計収量２５０ｎｇ、および純度比１．７〜２．５の範囲内を満たしていた。
ＰＡＭ５０ ｎＣｏｕｎｔｅｒシステムアッセイ
遺伝子発現は、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ解析システムで測定した。これは、何百ものｍＲＮＡ転写物の相対量についてデジタル表示を通じた多重測定値を直接示すものである。簡潔には、表１の５０個の標的遺伝子（ＰＡＭ５０）の発現ならびに正規化「ハウスキーピング」遺伝子（例えばＭＲＰＬ１９、ＰＳＭＣ４、ＳＦ３Ａ１、ＰＵＭｌ、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＧＵＳＢ、ＲＰＬＰＯ、およびＴＦＲＣ）を、いかなる酵素反応も使用せず、単一のハイブリダイゼーション反応で測定した。ＰＡＭ５０標的に対する遺伝子特異的プローブ対、ならびに外来ポジティブおよびネガティブコントロールを有するｎＣｏｕｎｔｅｒ ＣｏｄｅＳｅｔを、溶液中でハイブリダイズさせた、１２５〜５００ｎｇの全ＲＮＡ（名目上２５０ｎｇ）にした。一晩のハイブリダイゼーションの後、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ Ｐｒｅｐ ＳｔａｔｉｏｎおよびＤｉｇｉｔａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒをその説明書に従い、そしてＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのキットを用いて試料を処理した。各試料からのデータは、各反応に含まれるポジティブおよびネガティブコントロールについてあらかじめ定義した品質管理メトリクスを使用して品質チェックをした。
品質チェックをした患者試料の内因性サブタイプ分類は、ＰＡＭ５０遺伝子発現サイン（ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）に基づいていた。全試料に対し各標的ｍＲＮＡ分子のデジタル量または「カウント」を含むレポーター・コード・カウント・ファイルは、あらかじめ定義し固定された独自のアルゴリズムを使用してＰＡＭ５０サブタイプ呼び出し用のＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに送付された。サブタイプの指定は、臨床パラメーターまたは転帰に関する情報を有さない研究者が、盲検様式で実施した。
結果
３３７人の参加者を対象とするＧＤ対Ｄのオリジナル試験；保存腫瘍組織は、２７３人（８１％）の患者から入手可能であった（ＣＯＮＳＯＲＴダイアグラム、図１）。このＣＯＮＳＯＲＴダイアグラムにおいて、一部の患者は以下のいずれかの理由で除外した：保存組織が利用不能（ｎ＝３８）、試料は利用可能だが腫瘍細胞がない（ｎ＝１２）、針生検しか利用可能でない／ＰＡＭ５０に不適当な組織（ｎ＝１１）、転移しか利用可能でない組織試料（ｎ＝３）であった。
以前の（ネオ）アジュバント化学療法、アジュバントホルモン療法、およびアジュバント放射線治療については、評価可能な２７０人の患者と６７人の評価不能な患者間で違いがあった（Ｐ＜０．０５）が、他に評価パラメーターについては違いがなかった（表５）。これらの違いは除外したコホートにおいて局所進行の症例数が多いことの反映であると考えられる。局所進行性の患者の原発性腫瘍試料は、一般的に、利用不能かまたはサブタイプ分析用の組織として不十分である（すなわち針生検のみ）かのいずれかの場合が多かった。
十分に高品質なＲＮＡを、ＰＡＭ５０アルゴリズムの正確な推定が可能な２７０人の患者から得た。最短ＰＡＭ５０セントロイドアルゴリズムに基づいて、内因性乳癌のサブタイプを、遺伝子発現を利用して以下のように割り当てた：８４個の試料（３１．１％）はルミナールＡ型、９７個の試料（３５．９％）はルミナールＢ型、４３個（１５．９％）は基底細胞様型、そして４６個（１７．１％）はＨＥＲ２高発現型。２７０症例の患者およびベースライン特性を内因性サブタイプに応じて表６にまとめる。
統計的考察
主な研究について、ＰＡＭ５０サブタイプおよび予後および人口動態変数の間の関連性を評価した（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＪＣＯ ２０１１；２９：４７４８−４７５４）。ＰＡＭ５０サブタイプとカテゴリ変数（レジメン、ホルモン受容体の状態、ＨＥＲ２の状態、転移部位の種類、病期、および以前に化学療法、ホルモン療法、および放射線療法を受けたか否か）間の関連性は、フィッシャーの直接確率検定によって評価し、一方、ＰＡＭ５０サブタイプおよび順番および変動時間間隔（ＷＨＯによる一般状態、無作為抽出による年齢、転移部位の数、および無疾患期間）間の関連性は、クラスカル・ワリス検定によって評価した。
無増悪期間（ＴＴＰ）は、オリジナル試験ならびにこのバイオマーカーサブ試験の一次評価項目であった（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＪＣＯ ２０１１；２９：４７４８−４７５４）。全生存（ＯＳ）および反応速度（ＲＲ）は、二次評価項目であった。ＴＴＰは、無作為割り当て分類から再発が記録された日付を測定し、そして最終訪問日または死亡日もチェックした。ＯＳは、無作為割り当て分類の日および生存患者についてチェックした最終訪問日から計算した。事象が起こるまでの時間についての評価項目（ＴＴＰおよびＯＳ）は、カプラン・マイヤー法によって推定し、ＰＡＭ５０サブタイプはログランク検定を用いて比較した。ＰＡＭ５０サブタイプの分析は、多変量コックス比例ハザードモデルで予め選択した共変量について調整したおよび調整していない両方について行った。予め選択した共変量は、主な研究における以前の分析で有意だと見出されたものであった（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＪＣＯ ２０１１；２９：４７４８−４７５４）：レジメン、疾患の種類、病期なども、それらとＰＡＭ５０サブタイプとの間に分子的な関連があるので含んだ：ホルモン受容体の状態（陽性／不明ｖｓ．陰性）およびＨＥＲ２の状態（増幅ｖｓ．正常／欠損／不明）。調整したモデルは、以前の化学療法についてさらに階層化した（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＪＣＯ ２０１１；２９：４７４８−４７５４）。比例ハザードの仮定は、ショーンフェルド残差により評価した。
分析を行って、ＴＴＰおよびＯＳに対する治療効果が、ＰＡＭ５０サブタイプまたはあらかじめ選択した変数のレベルに応じて変化するか否かを評価した。多変量コックス比例ハザードモデルを、１つの交互作用項によって一度に拡張した。交互作用項をＷａｌｄ検定を用いて検定し、結果をフォレストプロットにした。ＲＲを、測定可能な疾患を有する患者について評価した。全ＲＲを、ＲＥＣＩＳＴ基準、バージョン１．０により完全または部分反応と定義した。ＲＲは、フィッシャーの正確確率検定を用いて比較した。
統計分析はＳＡＳシステム（バージョン９．２）を用いて行った。全ての統計的検定は、両側評価により行い、Ｐ＜０．０５を統計学的に有意とみなした。この研究の結果を、腫瘍マーカーの予後研究について報告された推奨に従って示す（ＭｃＳｈａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ ２００６；１００：２２９−２３５）。Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ（ＪＮＣＩ ｃｏｍｍｅｎｔａｒｉｅｓ ２００９；１０１：１４４６−１４５２）に記載されているように、研究設計は、プロスペクティブ回顧である。
結果
再発パターンは、分子サブタイプ間で有意な差があった。内臓転移は、ルミナールＢ型およびＨＥＲ２高発現型サブタイプにおいてより一般的であり、非内臓転移は、ルミナールＡ型および基底細胞様型サブタイプで頻繁にあった。ルミナールＢ型およびＨＥＲ２高発現型は全身再発によく見られる部位にほぼ同じパターンを示したが、ルミナールのケースは、基底細胞様型およびＨＥＲ２高発現型サブタイプの両者と比較してより頻繁に骨転移を伴っていた。ルミナールＡ型サブタイプでは胚への転移が少ない一方、統計的に有意ではないが、基底細胞様型の患者では肝臓への転移がより少なく観察された。
無増悪期間の中央値（ＭＤＦ）（原発性癌と診断されてから再発するまでの時間の間隔）は、サブタイプ間で有意に異なっていた（Ｐ＜０．００１）。ルミナールＡ型およびＢサブタイプでは、ＭＤＦ期間が最も長く（それぞれ、４５ヶ月および３７ヶ月）、これに対しＨＥＲ２高発現型および基底細胞様型群では、ＭＤＦ期間は有意に短かった（それぞれ、２０ヶ月および１５ヶ月）。
内因性サブタイプおよび単変量解析
カプラン・マイヤー分析では、内因性の生物学的なサブタイプはＴＴＰ（Ｐ＝０．０００６）およびＯＳ（Ｐ＝０．００８３）と有意に関連していた（それぞれ、図２Ａおよび２Ｂ）。ＰＡＭ５０アッセイによりルミナールＡ型と割り当てた者の結果は、無増悪期間および全生存（月）の中央値が有意に良好であり（ＴＴＰの中央値：１２．８，９５％ＣＩ：１０．７〜１６．９；ＯＳの中央値：２４．０，９５％ＣＩ：１９．４〜２９．６）、これに比べ、ルミナールＢ型（ＴＴＰの中央値：９．２，９５％ＣＩ：７．３〜１１．２；ＯＳの中央値：１８．１，９５％ＣＩ：１５．９〜２２．２）、ＨＥＲ２高発現型（ＴＴＰの中央値：８．２，９５％ＣＩ：６．１〜１１．８；ＯＳの中央値：１７．６，９５％ＣＩ：１４．５〜２２．０）、または基底細胞様型腫瘍（ＴＴＰの中央値：６．２，９５％ＣＩ：４．１〜８．２；ＯＳの中央値：１２．４，９５％ＣＩ：８．６〜１７．６）の結果は有意に劣っていた。
ＴＴＰおよびＯＳ（表７）についてのコックス単変量比例ハザードモデルによりこの結果を確認した（表７）（ＴＴＰ，Ｐ＝．０００８；ＯＳ，Ｐ＝．００９）。
さらに、ルミナールＡ型サブタイプと非ルミナールＡ型サブタイプとを比較（ＴＴＰ，ＨＲ，０．５６；９５％ＣＩ，０．４０〜０．７９；Ｐ＝．００１；ＯＳ，ＨＲ，０．７１；９５％ＣＩ，０．５４〜０．９４；Ｐ＝．０２）、そして基底細胞様型と非基底細胞様型サブタイプとを比較（ＴＴＰ，ＨＲ，１．８０；９５％ＣＩ，１．２３〜２．６４；Ｐ＝．００３；ＯＳ，ＨＲ，１．６５；９５％ＣＩ，１．１８〜２．３１；Ｐ＝．００４）すると結果の有意差が明らかであった。
多変量解析
標準的な臨床的および病理学的因子に対するＰＡＭ５０サブタイプの独立値を検査するために、多変量コックスモデルを構築した。内因性の生物学的なサブタイプは、ＴＴＰおよびＯＳの両方に重要な独立した予後因子であった（表８）。
治療効果がオリジナルの研究で観察された効果と同様で（ＴＴＰではＨＲ＝０．６８、ＯＳではＨＲ＝０．９４）（３）、ＨＲはＧＤについてはＴＴＰのほうが良好で（調整ＨＲ０．５７、Ｐ＝０．０００７）、ＯＳはあまり良好ではなかった（調整ＨＲ０．８１、Ｐ＝０．１３）。
ＴＴＰおよびＯＳに対する治療効果についての交互作用試検定
多変量コックス回帰分析では、ＨＥＲ２の状態およびＰＡＭ５０内因性サブタイプに応じた治療の不均一性をさらに調べた。ＴＴＰはＰＡＭ５０内因性サブタイプ内で均等に改善したようである（図３Ａ）、一方、ＨＥＲ２の状態と化学療法レジメンの間で有意な交互作用が観察された（Ｗａｌｄ検定、Ｐ＝．００１９）。対照的に、ＯＳについては、ＰＡＭ５０サブタイプに応じた有意な不均一性が観察された（図３Ｂ；Ｐ＝．０００８）。基底細胞様型乳癌患者にＧＤを与えるとＯＳが有意に改善したが、一方、ＨＥＲ２高発現型サブタイプの患者にゲムシタビンを与えるとＯＳが有意に悪化した。更に、このモデルで、ＨＥＲ２の状態および化学療法レジメンの間での有意な交互作用が観察された（Ｐ＝０．１９）。よって、ＰＡＭ５０内因性サブタイプの分類は、治療群による全生存の非常に重要な予測子であった（Ｐ＝０．００１６）。基底細胞様型サブタイプの患者は、ドセタキセル単一投与に比べ、ドセタキセルにゲムシタビンを加えた複合投与だと相対死亡率が７１％減少した（図３Ａおよび３Ｂ）。
カプラン・マイヤー推定値により、基底細胞様型患者の何１０ヶ月にわたる全生存率の中央値が単一投与群に比べて複合投与群では高く、全生存率の中央値が非基底細胞様型患者と同じレベルに達していたことが分かった（図４）。無増悪期間については同様の有意な低下は見られなかった。浸潤性が高いサブタイプ（非ルミナールＡ型）の患者においてドセタキセルにゲムシタビンを追加することによる一般的な利益について確認できなかった。
内因性サブタイプおよび反応率
測定可能な疾患を有する患者（ｎ＝１６８）について、全体ＲＲ（完全反応プラス部分反応）は、４つのサブタイプ間でも（ルミナールＡ型３７．５％、ルミナールＢ型４２．０％、基底細胞様型２４．１％、ＨＥＲ２高発現型４３．３％；Ｐ＝．３６；表９）、基底細胞様型と非基底細胞様型（Ｐ＝．１０）間でも、ルミナールＡ型と非ルミナールＡ型（Ｐ＝１．００）間でも事前に特定したサブタイプ群間で有意差は認められなかった。
考察
乳癌の内因性サブタイプを分類することが、個別治療への洞察の一助となり得る。よって、分子サブタイプにより治療薬に対する反応が異なるという仮説をテストするために、進行乳癌に対しドセタキセルの単一投与とゲムシタビンおよびドセタキセルの複合投与を比較する無作為試験に参加した利用可能な腫瘍部を有する患者において、ＰＡＭ５０アッセイとゲムシタビンの効果によって分類した分子サブタイプとの間の関係を評価した。臨床試験では、全体分析でドセタキセル群とゲムシタビン＋ドセタキセル群との間に臨床的に意味のある違いを示すことができないが、本発明でサブタイプによって評価すると、２つの治療群間でＴＴＰとＯＳが非常に異なることが示された。ＰＡＭ５０内因性サブタイプの分類によれば、基底細胞様型サブタイプの患者では、ドセタキセル単一投与に比べドセタキセルとゲムシタビンの複合投与のほうが死亡率が相対的に７３％減少したことが示された。対照的に、非基底細胞様型サブタイプの患者では、ドセタキセルの単一投与と比較してゲムシタビンとドセタキセルの複合投与による生存率の上昇に有意な効果がなかった。基底細胞様型サブタイプおよびゲムシタビン追加の間の交互作用についての試験は、ＯＳについては非常に有意であった（Ｐinteraction＝．０００４）。統計的に有意な差ではなかったものの、基底細胞様型患者についてＴＴＰが相対的に６３％減少し、他のサブタイプの患者については３７％減少するという同様の傾向が見られた（Ｐinteraction＝．１９）。浸潤性の高いサブタイプ（非ルミナールＡ型）の患者においては、ドセタキセルにゲムシタビンを追加することによる一般的な利益については確認されなかった。ＨＥＲ２が増幅した腫瘍を有する患者における予想外の発見は、複合投与の場合ドセタキセル単一投与と比較してＴＴＰ事象のリスク（Ｐinteraction＝．００１９）および死亡率（Ｐinteraction＝．０１９）が高いということだった。同様の傾向はＰＡＭ５０によるＨＥＲ２高発現型サブタイプの患者について見られた。
この研究により、進行性乳癌を継続的に有し続ける患者の原発性腫瘍間における内因性分子サブタイプがさらに明らかになる。全種のサブタイプが示された。予想通りルミナールサブタイプが最もよく見られ（６７％）たが、ルミナールＢ型サブタイプがルミナールＡ型よりも一般に見られるという多くの公開文献（３３〜３６）とは異なっていた。ルミナールＢ型サブタイプは、ルミナールＡ型に比較して、再発高リスクと関連し、これは、早期乳癌患者について他に公開された一連の文献と比較して進行乳癌を有する患者においてはルミナールＢ型のほうが頻度が高いという説明になり得る。それにもかかわらず、疾患が再発した患者のかなりの割合では、その原発性腫瘍がルミナールＡ型サブタイプであった。
以前の研究と一致して、ＰＡＭ５０内因性サブタイプと遠隔再発のタイミングの有意な違いとは関連していた。最近の研究によりサブタイプに応じた部位特異的な再発パターンについて説明され、これは転移の拡散および生存率についてのパターンの違いを示唆する従来の公開物をサポートになる。本研究は、ＰＡＭ５０内因性サブタイプに応じた転移についてのパターンの違いをサポートするのに加えて、サブタイプは再発後の生存率にも影響しているということをサポートする。
要約すると、この回顧サブタイプ分析を前向き臨床試験に適用すると、未選択患者コホートでは明確でなかった予測能力が、サブタイプ分類により明確になることが示される。基底細胞様型腫瘍の患者において、ドセタキセル単独投与と比較して、ゲムシタビンおよびドセタキセルの複合投与だと死亡率が実質的に減少することが実証された。しかし、ＴＴＰ事象において同様の有意な減少があることは示されなかった。
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Claims (46)

  1. 乳癌を有する対象における疾患の無増悪生存を予測する方法であって、
    （ａ）対象由来の生体試料を用意する工程；ならびに
    （ｂ）生体試料をアッセイして内因性乳癌のサブタイプを決定する工程であって、該サブタイプは、ルミナールＡ型、ルミナールＢ型、基底細胞様型、およびＨＥＲ２高発現型サブタイプからなる群から選択される工程；を含み、
    ここで内因性サブタイプを、表１に記載の遺伝子のうち少なくとも４０個の遺伝子の測定値を用いることによって決定し、ルミナールＡ型およびＢ型サブタイプと決定されると疾患の無増悪生存期間が長いことを示し、そしてＨＥＲ２高発現型または基底細胞様型サブタイプと決定されると疾患の無増悪生存期間が短いことを示す方法。
  2. 内因性サブタイプを、表１に記載の遺伝子のうち少なくとも４５個の遺伝子を用いて決定する、請求項１に記載の方法。
  3. 乳癌を有する対象における全生存を予測する方法であって、
    （ａ）対象由来の生体試料を用意する工程；ならびに
    （ｂ）生体試料をアッセイして生体試料が基底細胞様型サブタイプに分類されるか否かを決定する工程；を含み、
    ここで生体試料が基底細胞様型サブタイプに分類される場合、ゲムシタビンを含む乳癌治療により対象の全生存が延長される可能性が高くなる方法。
  4. 乳癌は、原発性乳癌である、請求項３に記載の方法。
  5. 乳癌は、局所進行性または転移性乳癌である、請求項３に記載の方法。
  6. 生体試料をアッセイして生体試料が基底細胞様型サブタイプに分類されるか否かを決定する工程を、免疫組織化学（ＩＨＣ）または蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いて行う、請求項３に記載の方法。
  7. 生体試料をアッセイして生体試料が基底細胞様型サブタイプに分類されるか否かを決定する工程を、表１に記載の内因性遺伝子のうち少なくとも４０個の遺伝子を検出することにより行う、請求項３に記載の方法。
  8. ゲムシタビンを含む乳癌治療が、アントラサイクリン、シクロホスファミド、フルオロウラシル（または５−フルオロウラシルもしくは５−ＦＵ）、メトトレキサート、チオテパ、カルボプラチン、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、タンパク質結合パクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、イリノテカン、イクサベピロン、テモゾロミド、トポテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エリブリン、ムタマイシン、カペシタビン、カペシタビン、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ロイプロリド、アバレリクス、ブセレリン、ゴセレリン、酢酸メゲストロール、リセドロネート、パミドロネート、イバンドロネート、アレンドロネート、デノスマブ、ゾレドロネート、トラスツズマブ、タイケルブ、もしくはベバシズマブ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の抗癌剤をさらに含む、請求項３に記載の方法。
  9. ゲムシタビンを含む乳癌治療が、１つまたは複数のタキサンを含む、請求項３に記載の方法。
  10. タキサンは、ドセタキセルおよびパクリタキセルからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
  11. 生体試料は、細胞、組織、および体液からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
  12. 組織は生検から得られる、請求項１１に記載の方法。
  13. 体液は、血液，リンパ液，尿，唾液、および乳頭吸引液からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
  14. 生体試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋試料である、請求項３に記載の方法。
  15. 乳癌の治療を必要とする対象における乳癌の治療方法であって、
    （ａ）対象由来の生体試料を用意する工程；
    （ｂ）生体試料をアッセイして生体試料が基底細胞様型サブタイプに分類されるか否かを決定する工程；ならびに
    （ｃ）対象に乳癌治療を施す工程；を含み、
    ここで生体試料が基底細胞様型サブタイプに分類される場合、対象にゲムシタビンを含む乳癌治療を施し、そして生体試料が基底細胞様型サブタイプではない場合、対象にゲムシタビンを含まない乳癌治療を施す、ことにより対象における乳癌を治療する方法。
  16. 乳癌は、原発性乳癌である、請求項１５に記載の方法。
  17. 乳癌は、局所進行性または転移性乳癌である、請求項１５に記載の方法。
  18. 生体試料をアッセイして生体試料が基底細胞様型サブタイプに分類されるか否かを決定する工程を、免疫組織化学（ＩＨＣ）または蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いて行う、請求項１５に記載の方法。
  19. 生体試料をアッセイして生体試料が基底細胞様型サブタイプに分類されるか否かを決定する工程を、表１に記載の内因性遺伝子のうち少なくとも４０個の遺伝子を検出することにより行う、請求項１５に記載の方法。
  20. ゲムシタビンを含む乳癌治療は、アントラサイクリン、シクロホスファミド、フルオロウラシル（または５−フルオロウラシルもしくは５−ＦＵ）、メトトレキサート、チオテパ、カルボプラチン、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、タンパク質結合パクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、イリノテカン、イクサベピロン、テモゾロミド、トポテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エリブリン、ムタマイシン、カペシタビン、カペシタビン、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ロイプロリド、アバレリクス、ブセレリン、ゴセレリン、酢酸メゲストロール、リセドロネート、パミドロネート、イバンドロネート、アレンドロネート、デノスマブ、ゾレドロネート、トラスツズマブ、タイケルブ、もしくはベバシズマブ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の抗癌剤をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
  21. ゲムシタビンを含む乳癌治療は、１つまたは複数のタキサンをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
  22. タキサンは、ドセタキセルおよびパクリタキセルからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
  23. ゲムシタビンを含まない乳癌治療は、アントラサイクリン、シクロホスファミド、フルオロウラシル（または５−フルオロウラシルもしくは５−ＦＵ）、メトトレキサート、チオテパ、カルボプラチン、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、タンパク質結合パクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、イリノテカン、イクサベピロン、テモゾロミド、トポテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エリブリン、ムタマイシン、カペシタビン、カペシタビン、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ロイプロリド、アバレリクス、ブセレリン、ゴセレリン、酢酸メゲストロール、リセドロネート、パミドロネート、イバンドロネート、アレンドロネート、デノスマブ、ゾレドロネート、トラスツズマブ、タイケルブ、もしくはベバシズマブ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の抗癌剤をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
  24. ゲムシタビンを含まない乳癌治療は、１つまたは複数のタキサンを含む、請求項１５に記載の方法。
  25. タキサンは、ドセタキセルおよびパクリタキセルからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
  26. 生体試料は、細胞、組織、および体液からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
  27. 組織は生検から得られる、請求項２６に記載の方法。
  28. 体液は、血液，リンパ液，尿，唾液、および乳頭吸引液からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
  29. 生体試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋試料である、請求項１５に記載の方法。
  30. 乳癌の治療を必要とする対象におけるゲムシタビンを含む乳癌治療の効果の可能性をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）対象由来の生体試料を用意する工程；ならびに
    （ｂ）生体試料をアッセイして生体試料が基底細胞様型サブタイプに分類されるか否かを決定する工程；を含み、
    ここで生体試料が基底細胞様型サブタイプに分類される場合、ゲムシタビンを含む乳癌治療が対象においてより効果的である可能性が高くなる方法。
  31. 乳癌は、原発性乳癌である、請求項３０に記載の方法。
  32. 乳癌は、局所進行性または転移性乳癌である、請求項３０に記載の方法。
  33. 生体試料をアッセイして生体試料が基底細胞様型サブタイプに分類されるか否かを決定する工程を、免疫組織化学（ＩＨＣ）または蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いて行う、請求項３０に記載の方法。
  34. 生体試料をアッセイして生体試料が基底細胞様型サブタイプに分類されるか否かを決定する工程を、表１に記載の内因性遺伝子のうち少なくとも４０個の遺伝子を検出することにより行う、請求項３０に記載の方法。
  35. ゲムシタビンを含む乳癌治療は、アントラサイクリン、シクロホスファミド、フルオロウラシル（または５−フルオロウラシルもしくは５−ＦＵ）、メトトレキサート、チオテパ、カルボプラチン、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、タンパク質結合パクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、イリノテカン、イクサベピロン、テモゾロミド、トポテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エリブリン、ムタマイシン、カペシタビン、カペシタビン、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ロイプロリド、アバレリクス、ブセレリン、ゴセレリン、酢酸メゲストロール、リセドロネート、パミドロネート、イバンドロネート、アレンドロネート、デノスマブ、ゾレドロネート、トラスツズマブ、タイケルブ、もしくはベバシズマブ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の抗癌剤をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
  36. ゲムシタビンを含む乳癌治療は、１つまたは複数のタキサンをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
  37. タキサンは、ドセタキセルおよびパクリタキセルからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
  38. 生体試料は、細胞、組織、および体液からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
  39. 組織は生検から得られる、請求項３８に記載の方法。
  40. 体液は、血液，リンパ液，尿，唾液、および乳頭吸引液からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
  41. 生体試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋試料である、請求項３０に記載の方法。
  42. 表１に記載の内因性遺伝子のうち少なくとも４０個の遺伝子の検出に十分な試薬を含む、乳癌の内因性サブタイプを決定するためのキット。
  43. 表１に記載の内因性遺伝子の検出に十分な試薬は、マイクロアレイを含む、請求項４２に記載のキット。
  44. 乳癌の治療を必要とする対象におけるゲムシタビンを含む乳癌治療の効果の可能性をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）対象由来の生体試料を用意する工程；ならびに
    （ｂ）生体試料をアッセイして生体試料がＨＥＲ２高発現型サブタイプに分類されるか否かを決定する工程；を含み、
    ここで生体試料がＨＥＲ２高発現型サブタイプに分類される場合、ゲムシタビンを含む乳癌治療は有害となる可能性が高くなる方法。
  45. 乳癌を有する対象における全生存を予測する方法であって、
    （ａ）対象由来の生体試料を用意する工程；ならびに
    （ｂ）生体試料をアッセイして内因性乳癌のサブタイプを決定する工程であって、該サブタイプは、ルミナールＡ型、ルミナールＢ型、基底細胞様型、およびＨＥＲ２高発現型サブタイプからなる群から選択される工程；を含み、
    ここで内因性サブタイプを、表１に記載の遺伝子のうち少なくとも４０個の遺伝子の測定値を用いることによって決定し、ルミナールＡ型およびＢ型サブタイプと決定されると全生存が長いことを示し、そしてＨＥＲ２高発現型または基底細胞様型サブタイプと決定されると全生存が短いことを示す方法。
  46. 内因性サブタイプを、表１に記載の遺伝子のうち少なくとも４５個の遺伝子を用いて決定する、請求項１に記載の方法。
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