JP5740302B2 - 乳癌の予後を予測するための遺伝子発現プロフィール - Google Patents

Description

本発明は、乳癌検体をサブタイプに分類するための方法、ならびに乳癌患者の予後および療法への応答を評価するための方法に関する。

乳癌は、米国の女性の間では、皮膚癌に次いで２番目に一般的な癌である。米国の女性は、生涯の間に８分の１の確率で乳癌を発症し、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙは、２００７年に侵襲性乳癌の１７８，４８０を超える新症例が米国で報告されると推定する。乳癌は、女性の癌死の第二の主な原因であり、毎年４０，０００人を超える死亡者が出る。過去１０年間の改善された検出方法、集団スクリーニングおよび治療の進歩は、乳癌と診断された女性の展望をかなり改善した。今日、乳癌症例の約８０％は、生存率が最高である疾患の初期段階で診断されている。その結果、乳癌患者の約８５％は、診断の少なくとも５年後に生存している。これらの進歩にもかかわらず、初期乳癌と診断された女性の約２０％は１０年予後が不良であり、この期間内で疾患の再発、転移または死を経験する。

かなりの研究が、乳癌の予後を評価し、治療応答を予測するための方法および因子を特定することに集中した（一般には、Ｒｏｓｓ ａｎｄ Ｈｏｒｔｏｂａｇｙｉ編（２００５年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ（Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）およびそこに引用されている参考文献を参照）。予後の指標には、従来の因子、例えば腫瘍サイズ、結節の状態および組織学的段階、ならびに予後および特定の治療に対する可能性の高い応答に関して多少の情報を提供する分子マーカーが含まれる。例えば、エストロゲン（ＥＲ）およびプロゲステロン（ＰｇＲ）ステロイドホルモンの受容体の状態の判定が、乳癌患者の評価において常用される方法になっている。例えば、非特許文献１を参照。ホルモン受容体陽性である腫瘍は、ホルモン療法に応答する可能性がより高いうえに攻撃性が一般的により低く、それによってＥＲ＋／ＰｇＲ＋の腫瘍を有する患者のためにより良好な予後をもたらす。膜貫通チロシンキナーゼ受容体タンパク質であるヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ）の過剰発現は、不良な乳癌予後と相関し（例えば、非特許文献２を参照）、乳房腫瘍でのＨＥＲ−２の発現レベルは、抗ＨＥＲ−２モノクローナル抗体治療薬トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）への応答を予測するために用いられる。

Ｆｉｔｚｇｉｂｂｏｎｓら、Ａｒｃｈ． Ｐａｔｈｏｌ． Ｌａｂ． Ｍｅｄ．（２０００年）１２４巻：９６６〜７８頁 Ｒｏｓｓら、Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ（２００３年）８巻：３０７〜２５頁

乳癌を有する対象を分類するための、ならびに予後および治療を評価するための方法が提供される。これらの方法は、乳癌固有のサブタイプに基づいて対象を層化するように調教された教師付きアルゴリズム（ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を用いる、乳癌サブタイプの予測を含む。予測モデルは、表１に列挙される固有遺伝子の遺伝子発現プロフィールに基づく。一部の実施形態では、アルゴリズムは、マイクロアレイ予測分析（ＰＡＭ）アルゴリズムに類似した、最近傍セントロイドアルゴリズムである。このアルゴリズムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓにアクセッション番号ＧＳＥ１０８８６として寄託されている遺伝子発現プロフィールから得られるデータに基づいて調教することができる。本明細書でＰＡＭ５０分類モデルと呼ぶこの予測モデルは、乳癌と診断されたかまたはそれが疑われる対象の固有のサブタイプを正確に予測するために用いることができる。

乳癌と診断されたかまたはそれが疑われる対象の予後または療法への応答を予測するための組成物および方法が、さらに提供される。これらの方法は、乳癌を患っている対象のために治療選択肢を指導するかまたは決定するために有用である。本発明の方法は、マイクロアレイおよび定量的ポリメラーゼ連鎖反応アッセイを含む、遺伝子発現プロフィールを評価するための手段、ならびに本発明の方法を実施するための試薬を含むキットをさらに含む。
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
試験試料で乳癌固有のサブタイプを分類する方法であって、
ａ） 乳癌固有のサブタイプによって分類された複数のトレーニング乳癌試料の各々の遺伝子発現プロフィールを得る工程であって、管腔Ａ（ＬｕｍＡ）、管腔Ｂ（ＬｕｍＢ）、基底様（基底）、ＨＥＲ２富化（ＨＥＲ２）、および正常様（正常）の固有サブタイプの各々が前記複数の乳癌試料で提示され、前記遺伝子発現プロフィールが、表１に列挙される固有遺伝子の実質的にすべての発現に基づく、工程と、
ｂ） 教師付きアルゴリズムを用いて前記トレーニングセットの乳癌固有のサブタイプの各々のセントロイドを構築する工程と、
ｃ） 前記試験試料の遺伝子発現プロフィールを得る工程であって、前記遺伝子発現プロフィールが、表１に列挙される固有遺伝子の発現に基づく工程と、
ｄ） 前記試験試料の遺伝子発現プロフィールを工程（ｂ）で構築されるセントロイドと比較する工程と、
ｅ） 前記セントロイドの各々までの、前記試験試料の遺伝子発現プロフィールの距離を計算する工程と、
ｆ） 前記試験試料を、最近傍セントロイドに基づいて乳癌固有のサブタイプの１つに割り当てる工程とを含む、方法。
（項目２）
乳癌を有する対象でネオアジュバント療法への応答を予測する方法であって、項目１に記載の方法によって前記対象を分類する工程を含み、固有の腫瘍サブタイプが、前記療法への応答を示す、方法。
（項目３）
前記療法がネオアジュバント内分泌療法であり、前記固有のサブタイプが、前記ネオアジュバント内分泌療法の開始後に前記対象から収集される試料から予測される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記試料が前記ネオアジュバント内分泌療法の開始の少なくとも１カ月後に収集される、項目３に記載の方法。
（項目５）
乳癌を有する試験対象で予後を予測する方法であって、
ａ） 乳癌固有のサブタイプによって分類された複数のトレーニング乳癌試料の各々の遺伝子発現プロフィールを得る工程であって、管腔Ａ（ＬｕｍＡ）、管腔Ｂ（ＬｕｍＢ）、基底様（基底）、ＨＥＲ２富化（ＨＥＲ２）、および正常様（正常）の固有サブタイプの各々が前記複数の乳癌試料で提示され、前記試料の予後が公知であり、前記遺伝子発現プロフィールが、表１に列挙される固有遺伝子の実質的にすべての発現に基づく、工程と、
ｂ） 教師付きアルゴリズムを用いて前記トレーニングセットの乳癌固有のサブタイプの各々のセントロイドを構築する工程と、
ｃ） 工程（ａ）で得られる遺伝子発現プロフィールに回帰モデルをあてはめることによって各トレーニング乳癌試料の危険スコアを計算する工程であって、前記回帰モデルが、工程（ｂ）で構築されるセントロイドへの各遺伝子発現プロフィールの類似性の説明となる、工程と、
ｄ） 工程（ｃ）で得られる危険スコアをより高い、およびより低い危険群に層化する工程と、
ｅ） 前記試験対象からの乳癌試料から遺伝子発現プロフィールを得る工程であって、前記遺伝子発現プロフィールが、表１に列挙される固有遺伝子の実質的にすべての発現に基づく、工程と、
ｆ） 前記試験試料の遺伝子発現プロフィールを工程（ｂ）で構築されるセントロイドと比較する工程と、
ｇ） 前記セントロイドの各々までの、前記試験試料の遺伝子発現プロフィールの距離を計算する工程と、
ｈ） 工程（ｃ）の回帰モデルおよび工程（ｆ）で得られる各セントロイドまでの距離を用いて危険スコアを計算する工程と、
ｉ） 工程（ｈ）で得られる危険スコアを工程（ｄ）で割り当てられる危険群と比較することによって、前記試験対象がより高い危険群か、またはより低い危険群に入るかを決定する工程であって、より低い危険群への帰属はより好ましい予後を示し、より高い危険群への帰属はより好ましくない予後を示す工程とを含む、方法。
（項目６）
前記危険スコアが独立変数の加重和を用いて計算される、項目５に記載の方法。
（項目７）
予後が乳癌特異的生存、無事象生存または療法への応答である、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記教師付きアルゴリズムが、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓにアクセッション番号ＧＳＥ２８４５として寄託されている遺伝子発現データを用いて調教され、前記危険スコアが、式：
ＲＯＲ−Ｓ＝［（０．０５ ^＊ 基底）＋（０．１１ ^＊Ｈ ｅｒ２）＋（−０．２５ ^＊ ＬｕｍＡ）＋（０．０７ ^＊ ＬｕｍＢ）＋（−０．１１ ^＊ 正常）］
を用いて計算される、項目５に記載の方法。
（項目９）
前記回帰モデルが、予後を１つまたは複数の臨床変数にさらに相関させる、項目５に記載の方法。
（項目１０）
前記臨床変数が、腫瘍サイズ、結節の状態、組織学的段階、エストロゲンホルモン受容体の状態、プロゲステロンホルモン受容体の状態、ＨＥＲ−２レベルおよび腫瘍倍数性からなる群より選択される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記教師付きアルゴリズムが、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓにアクセッション番号ＧＳＥ２８４５として寄託されている遺伝子発現データを用いて調教され、再発危険が、式：
ＲＯＲ−Ｃ＝［（０．０５ ^＊ 基底）＋（０．１ ^＊ Ｈｅｒ２）＋（−０．１９ ^＊ ＬｕｍＡ）＋（０．０５ ^＊ ＬｕｍＢ）＋（−０．０９ ^＊ 正常）＋（０．１６ ^＊ Ｔ）＋（０．０８ ^＊ Ｎ）］
を用いて計算される、項目９に記載の方法。
（項目１２）
予後が療法への応答であり、１つまたは複数の療法エンドポイント基準によって測定される、項目７に記載の方法。
（項目１３）
前記１つまたは複数の療法エンドポイント基準が、臨床上の応答（ＲＥＣＩＳＴ基準）、病理学的腫瘍サイズ、二値化Ｋｉ６７値または再発事象から選択される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記教師付きアルゴリズムが、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓにアクセッション番号ＧＳＥ２８４５として寄託されている遺伝子発現データを用いて調教され、再発危険が、式：
ＲＳｐ＝［（−０．０１２９ ^＊ 基底）＋（０．１０６ ^＊ Ｈｅｒ２）＋（−０．１１２ ^＊ ＬｕｍＡ）＋（０．０３９ ^＊ ＬｕｍＢ）＋（−０．０６９ ^＊ 正常）＋（０．２７２ ^＊ Ｐｒｏｌｉｆ）］
を用いて計算される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記教師付きアルゴリズムが最近傍セントロイドアルゴリズムである、項目１または５に記載の方法。
（項目１６）
前記セントロイドが、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓにアクセッション番号ＧＳＥ１０８８６として寄託されている遺伝子発現データから構築される、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記試験試料の遺伝子発現プロフィールが、前記固有遺伝子の各々に特異的なプライマーによる逆転写およびリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を用いて得られる、項目１または５に記載の方法。
（項目１８）
前記試験試料の遺伝子発現プロフィールが、前記固有遺伝子の各々の発現生成物に特異的なプローブによるマイクロアレイ分析を用いて得られる、項目１または５に記載の方法。
（項目１９）
前記トレーニング試料の遺伝子発現プロフィールおよび前記試験試料の遺伝子発現プロフィールから得られるデータが、分析の前に正規化方法を通して処理される、項目１または５に記載の方法。
（項目２０）
前記処理がハウスキーピング遺伝子のセットへの正規化を含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記ハウスキーピング遺伝子が、ＭＲＰＬ１９、ＰＳＭＣ４、ＳＦ３Ａ１、ＰＵＭ１、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤ、ＧＵＳＢ、ＲＰＬＰ０およびＴＦＲＣから選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
表１に列挙される固有遺伝子の検出に十分な試薬を含むキット。

図１は、ＰＡＭ５０クラシファイヤーを用いるサブタイプ予測に基づく予後を示す。ＬｕｍＡ、ＬｕｍＢ、ＨＥＲ２富化（Ｈｅｒ２−ｅｎｒｉｃｈｅｄ）、基底様（Ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ）および正常様（Ｎｏｒｍａｌ−ｌｉｋｅ）のＰＡＭ５０分類は、一緒にした全５つの試験セットにわたる１４５１人の患者（Ａ）、内分泌療法を単独で投与された３７６人の患者（Ｂ）、およびアジュバント全身療法を投与されなかった７０１人のリンパ節陰性患者（Ｃ）の予後有意性を示す。 図１は、ＰＡＭ５０クラシファイヤーを用いるサブタイプ予測に基づく予後を示す。ＬｕｍＡ、ＬｕｍＢ、ＨＥＲ２富化（Ｈｅｒ２−ｅｎｒｉｃｈｅｄ）、基底様（Ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ）および正常様（Ｎｏｒｍａｌ−ｌｉｋｅ）のＰＡＭ５０分類は、一緒にした全５つの試験セットにわたる１４５１人の患者（Ａ）、内分泌療法を単独で投与された３７６人の患者（Ｂ）、およびアジュバント全身療法を投与されなかった７０１人のリンパ節陰性患者（Ｃ）の予後有意性を示す。 図２は、固有のサブタイプおよび２つの臨床変数の完全なモデルを用いる試験例の危険分類を示す。（Ａ）各乳癌サブタイプについてプロットした再発危険スコア：＜−０．１の低い危険スコア、−０．１〜０．２の中程度の危険スコア、および≧０．２の高い危険スコア。（Ｂ）全１２８６個の試験試料の危険スコアのカプラン−マイヤープロットおよび有意性、（Ｃ）アジュバント内分泌療法だけを投与された３７６人の患者、および（Ｄ）リンパ節陰性で、アジュバント全身療法を投与されなかった５６０人の患者。 図３は、５年後再発の危険についてのサブタイプ−臨床モデルを用いる予後の線形スコアを示す。９５％信頼区間による線形適合は、再発危険スコアを較正する。サブタイプおよび臨床変数（ＴおよびＮ）による連続危険モデルは、ＥＲ陽性の初期乳癌を有する６５７人の患者（Ａ）から、およびＥＲ陽性およびＥＲ陰性の疾患および１〜３期を有する１２８６人の患者（Ｂ）で較正された。 図４は、アジュバントタモキシフェンで治療した、侵襲性の乳癌の７０２人の女性における、パラフィンブロックからのｑＰＣＲで測定した、ＰＡＭ５０固有のサブタイプと（Ａ）無再発生存期間および（Ｂ）疾患特異的生存期間との関連性を示す。 図５は、再発危険（Ｒｉｓｋ−Ｏｆ−Ｒｅｌａｐｓｅ）アルゴリズムをパラフィンブロックから生成したｑＰＣＲデータに適用することによって、低、中および高の危険カテゴリーに層化した患者の、乳癌疾患特異的生存期間のカプラン−マイヤー分析を示す。（Ａ）ＲＯＲ−Ｓ、（Ｂ）ＲＯＲ−Ｃ。 図６は、低、中および高の危険カテゴリー（ＲＯＲ−Ｃアルゴリズムを（Ａ）リンパ節陰性疾患および（Ｂ）リンパ節陽性疾患の女性に適用することによって独立した材料で前に定義された）に層化した患者の、乳癌疾患特異的生存期間のカプラン−マイヤー分析を示す。 図７は、低い危険のＲＯＲ−Ｃの女性（左上パネル）、中程度の危険のＲＯＲ−Ｃの女性（右上パネル）、高い危険のＲＯＲ−Ｃの女性（左下パネル）について、リンパ節陰性またはリンパ節陽性のカテゴリーに層化した患者の、乳癌疾患特異的生存期間のカプラン−マイヤー分析を示す。直接の比較のために、すべての曲線を右下のパネルに重ね合わせた。低いＲＯＲ−Ｃを有する女性の間で、結節の状態別の予後に有意差はない。 図７は、低い危険のＲＯＲ−Ｃの女性（左上パネル）、中程度の危険のＲＯＲ−Ｃの女性（右上パネル）、高い危険のＲＯＲ−Ｃの女性（左下パネル）について、リンパ節陰性またはリンパ節陽性のカテゴリーに層化した患者の、乳癌疾患特異的生存期間のカプラン−マイヤー分析を示す。直接の比較のために、すべての曲線を右下のパネルに重ね合わせた。低いＲＯＲ−Ｃを有する女性の間で、結節の状態別の予後に有意差はない。 図８は、関与するリンパ節の数によって層化したＲＯＲ−Ｃモデル対生存確率の分析が、重複する９５％信頼区間（破線で表す）を有する２５未満のＲＯＲ−Ｃ値を有する患者の間で、結節の状態のカテゴリーに関係なく良好な予後を表すことを示す。 図９は、各アジュバント危険群で別々に実施されたカプラン−マイヤー分析の結果を示し、９０〜９５％と９５〜１００％の危険群の間の生存期間の差は、ログランク検定を用いて検定した。 図１０は、各アジュバント危険群で別々に実施されたカプラン−マイヤー分析の結果、ならびに（Ａ）アジュバント予測ＢＣＳＳ８０〜９０％、ＲＯＲ−Ｓの低対中／高；（Ｂ）アジュバント予測ＢＣＳＳ７０〜８０％、ＲＯＲ−Ｓの低対中／高；および（Ｃ）アジュバント予測ＢＣＳＳ＜７０％、ＲＯＲ−Ｓの低対中／高の間の生存期間の差を示す。 図１０は、各アジュバント危険群で別々に実施されたカプラン−マイヤー分析の結果、ならびに（Ａ）アジュバント予測ＢＣＳＳ８０〜９０％、ＲＯＲ−Ｓの低対中／高；（Ｂ）アジュバント予測ＢＣＳＳ７０〜８０％、ＲＯＲ−Ｓの低対中／高；および（Ｃ）アジュバント予測ＢＣＳＳ＜７０％、ＲＯＲ−Ｓの低対中／高の間の生存期間の差を示す。 図１０は、各アジュバント危険群で別々に実施されたカプラン−マイヤー分析の結果、ならびに（Ａ）アジュバント予測ＢＣＳＳ８０〜９０％、ＲＯＲ−Ｓの低対中／高；（Ｂ）アジュバント予測ＢＣＳＳ７０〜８０％、ＲＯＲ−Ｓの低対中／高；および（Ｃ）アジュバント予測ＢＣＳＳ＜７０％、ＲＯＲ−Ｓの低対中／高の間の生存期間の差を示す。

概要
最近の進歩にもかかわらず、癌治療の挑戦は、異なる病因を有する異なる腫瘍型を特定の治療計画の標的にし、最終的には予後を最大にするために腫瘍治療をカスタマイズすることにとどまる。詳細には、患者が乳癌などの癌と診断されると、医師が、癌再発の可能性、患者の長期生存などを含む疾患の予想される過程を予測し、それに応じて最も適当な治療選択肢を選択することを可能にする方法が必要である。

本発明のために、「乳癌」は、例えば、生検または組織像によって悪性の病状と分類される状態を含む。乳癌診断の臨床上の描写は、医学では周知である。当業技術者は、乳癌が、例えば癌腫および肉腫を含む、乳房組織のあらゆる悪性腫瘍を指すことを理解する。乳癌の特定の形態には、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、非浸潤性小葉癌（ＬＣＩＳ）または粘液癌が含まれる。乳癌は、浸潤性の乳管癌（ＩＤＣ）または浸潤性の小葉癌（ＩＬＣ）も指す。本発明のほとんどの実施形態では、関心のある対象は、乳癌が疑われるか、または実際に乳癌と診断されるヒト患者である。

乳癌は、分子変化および細胞組成物に関して不均一な疾患である。この多様性は、臨床的に意味がある分類を開発しようと努力する研究者にとって難題となる。マイクロアレイによる遺伝子発現プロファイリングは、乳房腫瘍の複雑性への洞察を提供し、標準の病理パラメータ（１〜７）を越える予後情報を提供するために用いることができる。

乳癌の発現プロファイリングは、異なる治療法を必要とすることがある、生物学的および臨床的に異なる分子サブタイプを特定する［ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ ２００５］［Ｌｏｉ ２００７］［Ｃｈｅａｎｇ ２００８ａ］。管腔（Ｌｕｍｉｎａｌ）Ａ、管腔（Ｌｕｍｉｎａｌ）Ｂ、ＨＥＲ２富化、基底様と呼ばれる乳癌の主な固有サブタイプは、異なる臨床上の特徴、再発危険および治療応答を有する［Ｓｏｒｌｉｅ ２００３］。管腔Ａ（ＬｕｍＡ）、管腔Ｂ（ＬｕｍＢ）、ＨＥＲ２富化、基底様および正常様として公知の「固有の」サブタイプは、マイクロアレイデータの教師なし階層的クラスタリングを用いて発見された（１，８）。Ｐｅｒｏｕら（２０００年）Ｎａｔｕｒｅ４０６巻：７４７〜７５２頁に記載の固有の遺伝子は、同じ個体からの生物試料反復間で低い発現変動を有し、異なる個体からの試料全体では高い発現変動を有するように、統計学的に選択される。したがって、固有の遺伝子は、乳癌分類のためのクラシファイヤー遺伝子である。乳癌固有のサブタイプを導くために臨床上の情報を用いなかったが、この分類は予後の有意性を有することが判明した（１，６，９，１０）。

「管腔」サブタイプの乳房腫瘍はＥＲ陽性であり、乳管管腔内側の上皮細胞と類似したケラチン発現プロフィールを有する（それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕら（１９８９年）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ ９４巻：４０３〜４１３頁およびＰｅｒｏｕら（２０００年）Ｎｅｗ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ： Ａ Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｕｉｄｅ ６７〜７６頁）。逆に、ＥＲ陰性腫瘍は、２つの主なサブタイプ、すなわち、ＨＥＲ−２およびＧＲＢ７を過剰発現する（およびそれについてＤＮＡ増幅される）もの（ＨＥＲ−２富化）、ならびに基底上皮に類似した発現プロフィールを有して、ケラチン５、６Ｂおよび１７を発現する「基底様」腫瘍に分類することができる。これらの両方の腫瘍サブタイプは攻撃的であり、一般的に管腔腫瘍よりも致死性である。しかし、異なる予後を有するサブタイプの管腔腫瘍がある。予後不良の管腔腫瘍は、より高い度数である組織病理学的特徴、および高度に発現する増殖遺伝子の分子的特徴を一貫して共有する。

多数の試料および遺伝子を組織することにおいて、小さな遺伝子セットを用いて個々の試料を分類することよりも教師なしクラスタリングがより適しているので、臨床アッセイへの固有のサブタイプの翻訳は困難である。

したがって、乳癌固有のサブタイプを分類するための改善された方法および組成物が、本明細書で提供される。本方法は、乳癌固有のサブタイプに従って対象試料を分類するために、教師付きアルゴリズムを利用する。本明細書でＰＡＭ５０分類モデルと呼ばれるこのアルゴリズムは、乳癌固有のサブタイプを分類するために、および乳癌と診断された対象で再発の危険および／または療法への応答を予測するために優れていると本明細書で特定された、固有遺伝子の既定のサブセットの遺伝子発現プロフィールに基づく。遺伝子のサブセットを、それらの検出に特異的なプライマーとともに表１に示す。

一部の実施形態では、表１に記載の遺伝子の少なくとも約４０個が、ＰＡＭ５０分類モデルで用いられる。他の実施形態では、表１に列挙される固有遺伝子の少なくとも４１個、少なくとも４３個、少なくとも４４個、少なくとも４５個、少なくとも４６個、少なくとも４７個、少なくとも４８個、少なくとも４９個または５０個すべてがモデルに用いられる。本明細書に開示される方法は、表１に記載の遺伝子の１個または２，３個だけで用いることを意図していない。実際、固有のサブタイプの最も精確な分類および予後または処置に対する治療応答の予測を可能にするのは、固有遺伝子の実質的にすべての組合せである。したがって、様々な実施形態では、本明細書に開示される方法は、表１に記載の実質的にすべての遺伝子の遺伝子プロフィールを得ることを包含する。「実質的にすべて」は、表１に記載の遺伝子の少なくとも４７個、少なくとも４８個、少なくとも４９個または５０個すべてを包含することができる。特に明記しない限り、「実質的にすべて」は、表１に記載の遺伝子の少なくとも４９個を指す。表１に記載の遺伝子の１つのサブセットを用いて、乳癌サブタイプまたは予後を予測するようにアルゴリズムに教えることができ、遺伝子の別のサブセットを用いて個々の対象を特徴づけることができることも、当業技術者によく理解される。好ましくは、５０個すべての遺伝子を用いてアルゴリズムを調教し、遺伝子の少なくとも４９個を用いて対象を特徴づける。

本明細書で用いる「遺伝子発現」は、遺伝子の発現の相対レベルおよび／または発現パターンを指す。遺伝子の発現は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはその組合せのレベルで測定することができる。「遺伝子発現プロフィール」は、同じ試料について測定した複数の異なる遺伝子の発現レベルを指す。発現プロフィールは、乳癌の診断、処置または療法の前、その間、またはその後の１つまたは複数（またはその任意の組合せ）の時点で対象から収集される生体試料から導くこと、乳癌のための処置または療法がない１つまたは複数の時点で（例えば、疾患の進行を監視するかまたは乳癌の危険がある対象で疾患の発達を調査するために）対象から収集される生体試料から導くこと、あるいは健康対象から収集することができる。遺伝子発現プロフィールは、様々な細胞型、異なる組織、異なる器官または流体（例えば、血液、尿、脊髄液、汗、唾液または血清）を含む試料などの試料で、それらに限定されないが、マイクロアレイ技術ならびに定量的および半定量的ＲＴ−ＰＣＲ技術を含む様々な方法によって測定することができる。

臨床変数
本明細書に記載のＰＡＭ５０分類モデルは、再発（ＲＯＲ）予測因子の連続的危険を生成するために、臨床変数に関する情報とさらに組み合わせることができる。本明細書に記載のように、いくつかの臨床上および予後の乳癌因子が当技術分野で公知であり、治療予後および疾患再発の可能性を予測するために用いられる。そのような因子には、例えば、リンパ節関与、腫瘍サイズ、組織学的度数、エストロゲンおよびプロゲステロンホルモン受容体の状態、ＨＥＲ−２レベルおよび腫瘍倍数性が含まれる。

一実施形態では、再発危険（ＲＯＲ）スコアは、乳癌と診断されるかまたはそれが疑われる対象のために提供される。このスコアは、ＰＡＭ５０分類モデルを、結節の状態（Ｎ）および腫瘍サイズ（Ｔ）の臨床上の因子と一緒に用いる。臨床変数の評価は、乳癌病期診断のためのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ）の標準システムに基づく。このシステムでは、一次腫瘍サイズは、０〜４のスケール（Ｔ０：一次腫瘍の証拠がない；Ｔ１：≦２ｃｍ；Ｔ２：＞２ｃｍ〜≦５ｃｍ；Ｔ３：＞５ｃｍ；Ｔ４：胸壁または皮膚への直接的拡大を有する任意のサイズの腫瘍）で分類される。リンパ節の状態は、Ｎ０〜Ｎ３に分類される（Ｎ０：所属リンパ節の転移がない；Ｎ１：可動性の同側腋窩リンパ節への転移；Ｎ２：お互いに、または他の構造に固定される同側リンパ節への転移；Ｎ３：胸骨下の同側リンパ節への転移）。乳癌患者を特定して疾患を病期診断する方法は周知であり、手動検査、生検、患者および／または家族の病歴の精査、および画像化技術、例えばマモグラフィー、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）および陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）を含めることができる。

本発明のＰＡＭ５０分類法を用いて、乳癌患者の予後を、これらの臨床上の因子の評価と無関係に、またはそれと組み合わせて判定することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるＰＡＭ５０の乳癌固有サブタイプ分類法をこれらの臨床上の因子の評価と組み合わせることは、より精確な危険評価を可能にすることができる。本発明の方法は、例えば、エストロゲン受容体（ＥＲ）およびプロゲステロン受容体（ＰｇＲ）の状態、および／またはＨＥＲ−２発現レベルの分析とさらに一緒にすることができる。本発明の方法を通して乳癌予後を評価する場合、患者の臨床病歴、家族歴および閉経状態などの他の因子を考慮することもできる。

試料源
本発明の一実施形態では、乳癌サブタイプは、１つまたは複数の対象試料中の、表１に列挙される固有遺伝子の発現のパターンまたはプロフィールの評価を通して調査される。議論において、用語対象、または対象試料とは、健康状態および／または疾患状態に関係なく個体を指す。対象は、対象、試験参加者、対照対象、スクリーニング対象、または本発明の文脈で試料が得られ、評価される任意の他のクラスの個体であることができる。したがって、対象は、乳癌と診断されていてもよく、乳癌の１つまたは複数の症状、または家族歴（遺伝性）または病歴（医療）因子などの乳癌の素因を抱えてもよく、乳癌のための治療または療法を受けていてもよい、などである。あるいは、対象は、前記の因子または基準のいずれかに関して健康であってもよい。用語「健康」は、任意の絶対的評価または状態に対応するように定義することができないので、本明細書で用いる用語「健康」は、乳癌状態と比較したものであることが理解される。したがって、任意の特定の疾患または疾患基準に関して健康と定義される個体は、実際、乳癌以外の１つまたは複数の癌を含む任意の他の１つまたは複数の疾患と診断することができるか、または任意の他の１つまたは複数の疾患基準を示すことができる。しかし、健康な対照は、好ましくはいかなる癌も有しない。

特定の実施形態では、乳癌固有のサブタイプを予測する方法は、癌の細胞または組織を含む生体試料、例えば乳房組織試料または一次乳房腫瘍組織試料を収集することを含む。「生体試料」は、固有の遺伝子の発現を検出することができる細胞、組織または体液の任意のサンプリングを意味するものとする。そのような生体試料の例には、生検材料および塗抹標本が含まれるが、これらに限定されない。本発明で有用な体液には、血液、リンパ、尿、唾液、乳首吸引液、婦人科体液または任意の他の体分泌物またはそれらの派生物が含まれる。血液には、全血、血漿、血清、または血液の任意の派生物を含めることができる。一部の実施形態では、生体試料には、乳房細胞、特に生検からの乳房組織、例えば乳房腫瘍組織試料が含まれる。生体試料は、例えば、領域を削り取るかスワビングすること、針を用いて細胞もしくは体液を吸引すること、または組織試料（生検材料）を取り出すことを含む、様々な技術によって対象から得ることができる。様々な生体試料を収集する方法は、当技術分野で周知である。一部の実施形態では、乳房組織試料は、例えば針吸引生検、コア針生検または摘出生検によって得られる。検体を保存するために、および検査を容易にするために、固定剤および染色溶液を細胞または組織に加えてもよい。生体試料、特に乳房組織試料をスライドガラスへ移し、拡大して観察してもよい。一実施形態では、生体試料はホルマリン固定され、パラフィン包埋された乳房組織試料、特に一次乳房腫瘍試料である。様々な実施形態では、組織試料は、実施例４に記載の病理学者によって導かれた組織コア試料から得られる。

発現プロファイリング
様々な実施形態では、本発明は、対象で乳癌を分類するか、予後を決定するか、または監視するための方法を提供する。この実施形態では、固有遺伝子の発現の分析から得られるデータを、１つまたは複数のパターン認識アルゴリズムを用いて評価する。そのような分析法は、試験データを分類するために用いることができる、予測モデルを形成するために用いることができる。例えば、第一に公知のサブタイプの試料（例えば、特定の乳癌固有のサブタイプ、ＬｕｍＡ、ＬｕｍＢ、基底様、ＨＥＲ２富化または正常様を有することが公知の対象から）からのデータ（「モデル化データ」）を用いてモデル（「予測数理モデル」）を形成し、第二にサブタイプに従って未知の試料（例えば、「試験試料」）を分類するために、１つの便利で特に有効な分類方法は、多変量解析モデル化を使用する。

パターン認識法は、例えば、言語学、フィンガープリント、化学および心理学にわたる多くの異なる種類の問題を特徴づけるために、広く用いられている。本明細書に記載の方法との関連では、パターン認識は、データを分析し、それによって試料を分類し、様々な観察値に基づいていくつかの従属変数の値を予測するための、パラメトリックおよびノンパラメトリックの両方の多変量統計学の使用である。２つの主な手法がある。１セットの方法は「教師なし」と言われ、これらは単に合理的な方法でデータの複雑性を低減させ、さらに、ヒトの目によって解釈することができるディスプレイプロットを生成する。しかし、この種の手法は、予測アルゴリズムを調教するために用いられる最初の試料集団とは独立に、対象に由来する試料を分類するために用いることができる臨床アッセイの開発には適さないかもしれない。

他の手法は「教師付き」と呼ばれ、それによって、独立した検証データセットで次に評価される数理モデルを生成するために、公知のクラスまたは予後を有する試料のトレーニングセットが用いられる。ここでは、固有遺伝子発現データの「トレーニングセット」は、各試料の「サブタイプ」を正しく予測する統計モデルを構築するために用いられる。このトレーニングセットを、独立データ（検定セットまたは検証セットと呼ばれる）で次に検定し、コンピュータに基づくモデルの頑健性を決定する。これらのモデルは「エキスパートシステム」と呼ばれることもあるが、様々な異なる数学的手法に基づくことができる。教師付き方法は減少した次元数（例えば、最初の数主成分）のデータセットを用いることができるが、一般的に、全次元数の未削減データを用いる。すべての場合に、本方法は、その固有の遺伝子発現プロフィールに関して各サブタイプを特徴づけて、分離する、多変量境界の定量的な記述を可能にする。任意の予測に関して、例えば適合度に置かれる確率のレベルなどの信頼限界を得ることも可能である（例えばＫｏｗａｌｓｋｉら、１９８６年を参照）。選択された試料を分析から除外することによって、交差検証を用いて、予測モデルの頑健性を確認することもできる。

本明細書に記載のＰＡＭ５０分類モデルは、表１に記載される固有遺伝子を用いて、複数の対象試料の遺伝子発現プロフィールに基づく。複数の試料は、各サブタイプクラスに属する対象に由来する十分な数の試料を含む。この関係において「十分な試料」または「代表的な数」は、各サブタイプに由来する、各サブタイプと群の他のすべてとを確実に区別することができる分類モデルを構築するのに十分である試料の数量を意味するものとする。教師付き予測アルゴリズムは、アルゴリズムを「調教する」ための、客観的に選択されたプロトタイプ試料のプロフィールに基づいて開発される。拡張された固有遺伝子を用い、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ２００７／０６１８７６号に開示される方法によって試料を選択し、サブタイプに分ける。あるいは、試料は、乳癌サブタイプの分類のための任意の公知のアッセイによってサブタイプに分けることができる。サブタイプに従ってトレーニング試料を層化した後に、セントロイド（ｃｅｎｔｒｏｉｄ）に基づく予測アルゴリズムを用いて、表１に列挙される固有遺伝子セットの発現プロフィールに基づいてセントロイドを構築する。

一実施形態では、予測アルゴリズムは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＮａｒａｓｈｉｍａｎおよびＣｈｕ（２００２年）ＰＮＡＳ ９９巻：６５６７〜６５７２頁に記載されているものに関係がある、最近傍セントロイド方法論である。本発明では、本方法は各サブタイプの標準化されたセントロイドを計算する。このセントロイドは、その遺伝子のクラス内の標準偏差によって割った、各サブタイプ（または「クラス」）の各遺伝子の平均遺伝子発現である。最近傍セントロイド分類は、新しい試料の遺伝子発現プロフィールをとり、それをこれらのクラスセントロイドの各々と比較する。サブタイプ予測は、５個のセントロイドとの各試験例のスピアマン順位相関を計算し、最近傍セントロイドに基づいて試料をサブタイプに割り当てることによって実行される。

固有遺伝子の発現の検出
表１に列挙される固有遺伝子の発現を検出するために当技術分野で利用可能な任意の方法が、本明細書に包含される。「発現を検出する」ことは、固有遺伝子のＲＮＡ転写産物またはその発現生成物の量または存在を決定することを意味するものとする。

本発明の固有遺伝子の発現を検出する方法、すなわち遺伝子発現プロファイリングには、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析に基づく方法、ポリヌクレオチドの配列決定に基づく方法、免疫組織化学方法およびプロテオミクスに基づく方法が含まれる。これらの方法は、一般に、表１に列挙される固有遺伝子の発現生成物（例えば、ｍＲＮＡ）を検出する。好ましい実施形態では、ＰＣＲに基づく方法、例えば逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｗｅｉｓら、ＴＩＧ ８巻：２６３〜６４頁、１９９２年）、およびアレイに基づく方法、例えばマイクロアレイ（Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０巻：４６７〜７０頁、１９９５年）が用いられる。「マイクロアレイ」は、ハイブリダイズすることが可能なアレイ要素、例えばポリヌクレオチドプローブの、基質上での順序通りの配置を意味するものとする。用語「プローブ」は、特異的に目的とする標的生体分子、例えば、固有遺伝子によってコードされるかまたはそれに対応するヌクレオチド転写産物またはタンパク質に選択的に結合することができる任意の分子を指す。プローブは、当業技術者が合成することができるか、または適当な生物学的調製物から得ることができる。プローブは、標識されるように特異的に設計することができる。プローブとして利用することができる分子の例には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体および有機分子が含まれるが、これらに限定されない。

多くの発現検出方法が、単離されたＲＮＡを用いる。一般的に、出発物質は、生体試料、例えば腫瘍または腫瘍細胞系、およびそれぞれ対応する正常な組織または細胞系から単離される総ＲＮＡである。ＲＮＡの原料が一次腫瘍である場合、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、例えば、凍結またはアーカイブされた、パラフィン包埋および固定された（例えば、ホルマリン固定）組織試料（例えば、病理学者によって導かれた組織コア試料）から抽出することができる。

ＲＮＡ抽出のための一般方法は当技術分野で周知であって、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８７〜１９９９年を含む、分子生物学の標準教科書に開示されている。パラフィン包埋組織からのＲＮＡ抽出の方法は、例えば、ＲｕｐｐおよびＬｏｃｋｅｒ（Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ． ５６巻：Ａ６７頁、１９８７年）およびＤｅ Ａｎｄｒｅｓら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８巻：４２〜４４頁、１９９５年）に開示されている。詳細には、ＲＮＡ単離は、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）などの民間の製造業者からの精製キット、緩衝液セットおよびプロテアーゼを製造業者の指示通りに用いて実施することができる。例えば、培養細胞からの総ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニカラムを用いて単離することができる。他の市販のＲＮＡ単離キットには、ＭＡＳＴＥＲＰＵＲＥ（商標）完全ＤＮＡおよびＲＮＡ精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）およびパラフィンブロックＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）が含まれる。組織試料からの総ＲＮＡは、例えばＲＮＡ Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ、Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ、ＴＸ）を用いて単離することができる。腫瘍から調製されるＲＮＡは、例えば塩化セシウム密度勾配遠心法によって単離することができる。さらに、当業者に周知である技術、例えばＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ（米国特許第４，８４３，１５５号）のシングルステップＲＮＡ単離法を用いて、多数の組織試料を容易に処理することができる。

単離されたＲＮＡは、それらに限定されないがＰＣＲ分析およびプローブアレイを含む、ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイで用いることができる。ＲＮＡレベルの検出のための１つの方法は、単離されたＲＮＡを、検出する遺伝子によってコードされるｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子（プローブ）と接触させることを含む。核酸プローブは、例えば完全長ｃＤＮＡまたはその部分、例えば長さが少なくとも７、１５、３０、６０、１００、２５０または５００個のヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件の下で本発明の固有遺伝子または任意の誘導体ＤＮＡもしくはＲＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分であるオリゴヌクレオチドであってもよい。プローブとのｍＲＮＡのハイブリダイゼーションは、問題の固有遺伝子が発現されていることを示す。

一実施形態では、例えば単離されたｍＲＮＡをアガロースゲルの上に流し、ゲルからニトロセルロースなどの膜へｍＲＮＡを移すことによって、ｍＲＮＡを固体表面に固定し、プローブと接触させる。代替の実施形態では、例えばＡｇｉｌｅｎｔ遺伝子チップアレイで、プローブを固体表面に固定し、ｍＲＮＡをプローブと接触させる。当業者は、本発明の固有遺伝子の発現レベルの検出で用いるために、公知のｍＲＮＡ検出方法を容易に応用することができる。

試料中の固有遺伝子の発現生成物のレベルを測定するための代替法は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，２０２号）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８巻：１８９〜９３頁、１９９１年）、自律的配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７巻：１８７４〜７８頁、１９９０年）、転写増幅系（Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６巻：１１７３〜７７頁、１９８９年）、Ｑ−βレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６巻：１１９７頁、１９８８年）、ローリングサークル複製（米国特許第５，８５４，０３３号）による核酸増幅の工程、または任意の他の核酸増幅法と、それに続く、当業者に周知である技術を用いる増幅分子の検出とを含む。これらの検出スキームは、そのような分子が非常に少数存在する場合、核酸分子の検出に特に有用である。

本発明の特定の態様では、固有遺伝子の発現は、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評価される。多数の異なるＰＣＲまたはＱＰＣＲプロトコルが当技術分野で公知であり、本明細書の下に例示されており、表１に列挙される固有遺伝子の検出および／または定量のためのここに記載の組成物を用いる用途のために、直接に適用または応用することができる。一般に、ＰＣＲでは、標的ポリヌクレオチド配列は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーまたは１対のオリゴヌクレオチドプライマーとの反応によって増幅される。プライマーは標的核酸の相補的領域にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼは標的配列を増幅するためにプライマーを伸長させる。ポリメラーゼに基づく核酸増幅生成物を提供するのに十分な条件の下で、１つのサイズの核酸断片が反応生成物（増幅生成物である標的ポリヌクレオチド配列）を支配する。単一の標的ポリヌクレオチド配列の濃度を高めるために、増幅サイクルを繰り返す。ＰＣＲのために通常用いられる任意のサーモサイクラーで反応を実行することができる。しかし、リアルタイム蛍光測定能力を有するサイクラー、例えば、ＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）、ＲＯＴＯＲ−ＧＥＮＥ（商標）（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｙｄｎｅｙ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）、ＩＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．）およびＭＸ４０００（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）が好ましい。

定量測定値を提供するだけでなく、時間および汚染を低減するので、状況によっては定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）（リアルタイムＰＣＲとも呼ばれる）が好ましい。場合によっては、完全な遺伝子発現プロファイリング技術の利用可能性は、新鮮な凍結組織および専門化された実験機器の要件のために制限され、臨床でのそのような技術の常用を困難にしている。しかし、ＱＰＣＲ遺伝子測定は、標準のホルマリン固定パラフィン包埋臨床腫瘍ブロック、例えばアーカイブ組織バンクおよび常用の外科的病理検体で用いられるものに応用することができる（Ｃｒｏｎｉｎら（２００７年）Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５３巻：１０８４〜９１頁）［Ｍｕｌｌｉｎｓ２００７］［Ｐａｉｋ２００４］。本明細書で用いるように、「定量的ＰＣＲ（または「リアルタイムＱＰＣＲ」）は、反応生成物の反復サンプリングを必要としない、その発生と平行してのＰＣＲ増幅の進捗の直接モニタリングを指す。定量的ＰＣＲでは、反応生成物は、それらが生成されるにしたがってシグナル伝達機構（例えば、蛍光）を通して監視することができ、そのシグナルがバックグラウンドレベルを超えた後であるが、反応がプラトーに到達する前に追跡される。蛍光の検出可能なまたは「閾値」レベルを達成するために必要とされるサイクル数は、ＰＣＲ工程の初めの増幅可能な標的の濃度に比例するので、試料中の標的核酸の量の測定値をリアルタイムで提供するためのシグナル強度の測定を可能にしている。

本発明の別の実施形態では、発現プロファイリングのためにマイクロアレイが用いられる。マイクロアレイは、異なる実験の間の再現性のために、この目的のために特によく適している。ＤＮＡマイクロアレイは、多数の遺伝子の発現レベルの同時測定のために、１つの方法を提供する。各アレイは、固体支持体に結合されている捕捉プローブの再現可能なパターンからなる。標識ＲＮＡまたはＤＮＡは、アレイ上の相補的プローブにハイブリダイズされ、レーザー走査によって次に検出される。アレイ上の各プローブのハイブリダイゼーション強度が判定され、相対遺伝子発現レベルを表す定量値に変換される。例えば、米国特許第６，０４０，１３８号、第５，８００，９９２号および第６，０２０，１３５号、第６，０３３，８６０号および第６，３４４，３１６号を参照。試料中の多数のＲＮＡの遺伝子発現プロフィールを決定するために、高密度のオリゴヌクレオチドアレイが特に有用である。

物理的合成法を用いるこれらのアレイの合成技術は、例えば米国特許第５，３８４，２６１号に記載されている。プレーナーアレイ表面が一般に用いられるが、このアレイは、実質的にいかなる形の表面にも、または複数の表面にさえ形成することができる。アレイは、ビーズ、ゲル、重合体表面、線維（光ファイバーなど）、ガラスまたは任意の他の適当な基質の上の核酸（またはペプチド）であることができる。例えば、米国特許第５，７７０，３５８号、第５，７８９，１６２号、第５，７０８，１５３号、第６，０４０，１９３号および第５，８００，９９２号を参照。アレイは、診断または全部込みの器具の他の操作を可能にする方法でパックすることができる。例えば、米国特許第５，８５６，１７４号および第５，９２２，５９１号を参照。

マイクロアレイ技術の具体的な実施形態では、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅挿入断片が、高密度アレイの基質に適用される。マイクロチップの上に固定されているマイクロアレイ遺伝子は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに適する。蛍光標識ｃＤＮＡプローブは、関心のある組織から抽出されるＲＮＡの逆転写によって、蛍光ヌクレオチドの組込みを通して生成することができる。チップに適用される標識ｃＤＮＡプローブは、アレイの上のＤＮＡの各スポットと特異的にハイブリダイズする。非特異的に結合したプローブを除去するストリンジェントな洗浄の後、共焦レーザー顕微鏡、またはＣＣＤカメラなどの別の検出方法によってチップをスキャンする。各整列要素のハイブリダイゼーションの定量化は、対応するｍＲＮＡの存在量の評価を可能にする。

二色蛍光により、２つのＲＮＡ源から生成される、別々に標識されているｃＤＮＡプローブを、アレイにペアでハイブリダイズさせる。したがって、各特定遺伝子に対応する２つの源からの転写産物の相対存在量が、同時に測定される。ハイブリダイゼーションの小規模化は、多数の遺伝子の発現パターンの便利で速やかな評価を提供する。そのような方法は、細胞あたり少数で発現される稀な転写産物を検出するために、および発現レベルの少なくとも約２倍の差を再現的に検出するために必要とされる感度を有することが示された（Ｓｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３巻：１０６〜４９頁、１９９６年）。マイクロアレイ分析は、製造業者のプロトコルに従って市販の機器によって、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎＣｈｉｐ技術またはＡｇｉｌｅｎｔインクジェットマイクロアレイ技術を用いて実施することができる。遺伝子発現の大規模分析のためのマイクロアレイ法の開発は、様々な腫瘍型における癌分類および予後予測の分子マーカーの系統的検索を可能にする。

データ処理
例えば、欠落データ、翻訳、スケーリング、正規化、重み付け、その他に対処することによって、遺伝子発現データを前処理することがしばしば有用である。多変量予測法、例えば主成分解析（ＰＣＡ）および部分最小二乗解析（ＰＬＳ）は、いわゆるスケーリング感受性法である。研究するデータの種類についての事前の知識および経験を用いることにより、多変量モデル化の前のデータの質は、スケーリングおよび／または重み付けによって高めることができる。十分なスケーリングおよび／または重み付けは、データ内に隠されている重要で興味深い変動を明らかにすることができ、したがって、以降の多変量モデル化をより効率的にすることができる。スケーリングおよび重み付けは、研究系についての知識および経験に基づいてデータを正しい距離に置くために用いることができ、したがって、データに既に本来的に存在するパターンを明らかにすることができる。

可能な場合、欠落データ、例えばカラム値のギャップは回避するべきである。しかし、必要に応じて、そのような欠落データは、例えば、カラムの平均値（「平均充足」）；ランダムな値（「ランダム充足」）；または主成分解析に基づく値（「主成分充足」）で置換または「充足」することができる。

記述子座標軸の「翻訳」が有用となることがある。そのような翻訳の例には、正規化および平均センタリングが含まれる。「正規化」は、試料間の変動を除去するために用いることができる。マイクロアレイデータについては、正規化の過程は、２つの標識色素の蛍光強度のバランスをとることによって系統的誤差を除去することを目的とする。色素の偏りは、色素標識効率、熱および光感度の差、ならびに２つのチャンネルを走査するためのスキャナ設定を含む様々な発生源から来る可能性がある。正規化因子を計算するために通常用いられるいくつかの方法には、以下のものが含まれる。（ｉ）アレイ上のすべての遺伝子を用いる全体的正規化、（ｉｉ）継続的に発現されるハウスキーピング／不変遺伝子を用いるハウスキーピング遺伝子正規化、および（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーションの間に加えられる外因性対照遺伝子の公知の量を用いる内部対照正規化（Ｑｕａｃｋｅｎｂｕｓｈ（２００２年）Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ３２巻（補遺）、４９６〜５０１頁）。一実施形態では、本明細書に開示される固有遺伝子は、対照ハウスキーピング遺伝子に正規化することができる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００８／００３２２９３号に記載のハウスキーピング遺伝子を正規化のために用いることができる。例示的なハウスキーピング遺伝子には、ＭＲＰＬ１９、ＰＳＭＣ４、ＳＦ３Ａ１、ＰＵＭ１、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤ、ＧＵＳＢ、ＲＰＬＰ０およびＴＦＲＣが含まれる。本明細書に開示される方法は、任意の特定のハウスキーピング遺伝子への正規化に縛られず、当技術分野で公知である任意の適するハウスキーピング遺伝子を用いることができることは、当業技術者に理解されよう。

多くの正規化手法が可能であり、それらは分析のいくつかのポイントのいずれかで、しばしば適用することができる。一実施形態では、正規化機能を平滑化する全体的局所的に加重される散布図である、ＬＯＷＥＳＳ法を用いてマイクロアレイデータを正規化する。別の実施形態では、ｑＰＣＲデータは、複数のハウスキーピング遺伝子のセットの幾何平均に正規化される。

解釈を単純化するために、「平均センタリング」を用いることもできる。通常、各記述子について、すべての試料のその記述子の平均値が引かれる。この方法で、記述子の平均は起点と一致し、すべての記述子はゼロに「センタリング」される。「単位分散スケーリング」では、データを同等の分散にスケーリングすることができる。通常、各記述子の値は、１／ＳｔＤｅｖによってスケーリングされ、そこにおいて、ＳｔＤｅｖはすべての試料についてその記述子の標準偏差である。「パレートスケーリング」は、ある意味では、平均センタリングと単位分散スケーリングとの間の中間である。パレートスケーリングでは、各記述子の値は、１／ｓｑｒｔ（ＳｔＤｅｖ）スケーリングされ、そこにおいて、ＳｔＤｅｖはすべての試料についてその記述子の標準偏差である。この方法で、各記述子は、その最初の標準偏差に数値的に同等である分散を有する。パレートスケーリングは、例えば、生データまたは平均センタリングデータについて実施することができる。

データが正のスキューを有する場合、および／またはデータが大幅に、例えば数桁にわたって広がる場合に解釈を支援するために、「対数スケーリング」を用いることができる。通常、各記述子について、値はその値の対数によって置換される。「同等範囲スケーリング」では、各記述子は、すべての試料についてその記述子の範囲で割られる。この方法で、すべての記述子は、同じ範囲、すなわち１を有する。しかし、この方法は、外れ点の存在に影響される。「自動スケーリング」では、各データベクターは平均センタリングされ、単位分散がスケーリングされる。この技術は非常に有用であるが、その理由は、各記述子が次に等しく加重され、大きな値および小さな値が同等の強調で処理されるからである。このことは、非常に低いが、まだ検出可能なレベルで発現される遺伝子にとって重要となることがある。

一実施形態では、１つまたは複数の試験試料についてデータを収集し、本明細書に記載のＰＡＭ５０分類モデルを用いて分類する。複数の分析からのデータを比較する場合（例えば、１つまたは複数の試験試料の発現プロフィールを、独立した試験で収集、分析された試料から構築されたセントロイドと比較する）、これらのデータセット全般にわたってデータを正規化する必要が生じる。一実施形態では、これらのデータセットを一緒にするために、距離加重識別（ＤＷＤ）が用いられる（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＢｅｎｉｔｏら（２００４年）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０巻（１号）：１０５〜１１４頁）。ＤＷＤは、別々のデータセットに存在する系統的偏りを特定し、これらの偏りを補償するために次に全体的に調整することができる多変量解析ツールである。本質的には、各別々のデータセットはデータポイントの多次元クラウドであり、ＤＷＤは２つのポイントのクラウドをとり、それがより最適に他に重なるように１つをシフトさせる。

その方法を実施すること、および／または結果を記録することができる任意の装置を用いて、本明細書に記載の方法を実施すること、および／または結果を記録することができる。用いることができる装置の例には、すべての型のコンピュータを含む電子計算装置が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載の方法を実施し、および／またはコンピュータに記録する場合、その方法の工程を実施するためのコンピュータを構成するために用いることができるコンピュータプログラムは、コンピュータプログラムを内蔵することができる任意のコンピュータ可読媒体に内蔵されてもよい。用いることができるコンピュータ可読媒体の例には、ディスケット、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ならびに他のメモリおよびコンピュータ記憶装置が含まれるが、これらに限定されない。これらの方法の工程を実施し、および／または結果を記録するためのコンピュータを構成するために用いることができるコンピュータプログラムは、電子ネットワーク上で、例えばインターネット、イントラネットまたは他のネットワーク上で提供されてもよい。

再発危険の計算
固有のサブタイプおよび任意選択で他の臨床変数との関連で乳癌予後を予測する方法が、本明細書で提供される。予後は、全体のもしくは疾患特異的生存期間、無事象生存期間、または特定の治療もしくは療法に応じる予後を指すことができる。特に、本方法は、長期の、無病生存期間の確率を予測するために用いることができる。「乳癌患者の生存確率を予測する」ことは、患者が根底にある乳癌の結果として死に至る危険を評価することを意味するものとする。「長期の、無病生存期間」は、患者が、初期診断または治療から少なくとも５年または少なくとも１０年以上の間に根底にある乳癌から死亡しないか、またはその再発を起こさないことを意味するものとする。

一実施形態では、予後は、サブタイプに従う対象の分類に基づいて予測される。この分類は、表１に列挙される固有遺伝子のリストを用いる発現プロファイリングに基づく。実施例１に記載のように、ＰＡＭ５０モデルによる腫瘍サブタイプは、標準の臨床マーカー分類よりも化学療法への応答をより表した。臨床マーカーを用いてＨＥＲ２＋と分類されたが、ＰＡＭ５０モデルを用いてＨＥＲ２富化とされなかった腫瘍は、パクリタキセル、５フルオロウラシル、アドリアマイシンおよびシクロホスファミド（Ｔ／ＦＡＣ）の治療計画に対して、臨床的にＨＥＲ２＋と分類され、ＨＥＲ２富化発現サブタイプに属するとされた腫瘍よりも低い病理学的著効（ｐＣＲ）を示した。同様に、三重陰性（ＥＲ−、ＰｇＲ−およびＨＥＲ２−）と臨床的に評価されなかった基底様腫瘍は、ＰＡＭ５０によって基底様ではなかった三重陰性腫瘍と比較して、より高いｐＣＲを有した。したがって、ＰＡＭ５０モデルは、化学療法に対する応答を標準の臨床マーカーよりも正確に予測するために用いることができる。

サブタイプ帰属を提供することに加えて、ＰＡＭ５０バイオインフォマティクスモデルは、疾患状態および治療選択肢に関係なく任意の患者集団で用いることができる再発危険（ＲＯＲ）スコアに翻訳される、全４つのサブタイプへの試験試料の類似性の測定法を提供する。固有のサブタイプおよびＲＯＲは、例えば、ネオアジュバントのタキサンおよびアントラサイクリンによる化学療法で治療される女性での、病理学的著効の予測においても価値がある［Ｒｏｕｚｉｅｒ ２００５］。したがって、本発明の様々な実施形態では、予後を予測するために再発危険（ＲＯＲ）モデルが用いられる。これらの危険モデルを用いて、対象を、低、中、高の再発危険群に層化することができる。ＲＯＲの計算は、治療決定の指針となる、および／または療法への応答を監視するための予後情報を提供することができる。

本明細書に記載の一部の実施形態では、ＰＡＭ５０によって規定される固有のサブタイプおよび／または他の臨床パラメータの予後診断性能は、危険率およびその信頼区間の推定を提供する生存データのための回帰法である、Ｃｏｘ Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ Ｈａｚａｒｄｓ Ｍｏｄｅｌ解析を用いて評価される。Ｃｏｘモデルは、患者の生存と特定の変数との間の関係を探究するための、よく認識されている統計技術である。この統計的方法は、彼らの予後変数（例えば、本明細書に記載のように、追加の臨床因子を有するかまたは有しない固有遺伝子発現プロフィール）が与えられると、個人の危険（すなわち、リスク）の推定を可能にする。「危険率」は、特定の予後変数を提示する患者の、任意の所与の時点での死の危険性である。一般には、Ｓｐｒｕａｎｃｅら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ ＆ Ｃｈｅｍｏ． ４８巻：２７８７〜９２頁、２００４年を参照。

上記のように、本明細書に記載のＰＡＭ５０分類モデルは、サブタイプ距離（または相関関係）を単独で用いるか、またはサブタイプ距離を臨床変数と一緒に用いて、再発危険について調教することができる。一実施形態では、試験試料の危険スコアは、以下の方程式を用いて固有のサブタイプ距離を単独で用いて計算される。
ＲＯＲ＝０．０５＊基底＋０．１１＊Ｈｅｒ２＋−０．２５＊ＬｕｍＡ＋０．０７＊ＬｕｍＢ＋−０．１１＊正常、式中、変数「基底」、「Ｈｅｒ２」、「ＬｕｍＡ」、「ＬｕｍＢ」および「正常」は、試験試料からの発現プロフィールを、アクセッション番号ＧＳＥ２８４５でＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）に寄託されている遺伝子発現データを用いて構築されるセントロイドと比較したときの、各クラシファイヤーそれぞれについてのセントロイドまでの距離である。このデータには、インターネットアドレスｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏでアクセスすることができる。類似したＣｏｘモデル係数を誘導するために、他のデータセットを用いることができる可能性もある。ＧＳＥ２８４５として寄託されているデータセットを誘導するために用いた試料以外の試料セットから予測モデルを生成するために、表１に示す固有遺伝子のリストを用いる場合、この代わりの試料セットから再発危険を計算するための式を構築するために、実施例１または実施例３に記載の方法を用いることができる。

危険スコアは、同じく、試験発現プロフィールを、アクセッション番号ＧＳＥ２８４５としてＧＥＯに寄託されている遺伝子発現データを用いて構築されたセントロイドと比較する場合、乳癌サブタイプと臨床変数腫瘍サイズ（Ｔ）および結節の状態（Ｎ）との組合せを用いて、以下の方程式、ＲＯＲ（完全）＝０．０５＊基底＋０．１＊Ｈｅｒ２＋−０．１９＊ＬｕｍＡ＋０．０５＊ＬｕｍＢ＋−０．０９＊正常＋０．１６＊Ｔ＋０．０８＊Ｎ、を用いて計算することもできる。

さらに別の実施形態では、試験試料の危険スコアは、以下の方程式を用いて固有のサブタイプ距離を単独で用いて計算される。
ＲＯＲ−Ｓ＝０．０５＊基底＋０．１２＊Ｈｅｒ２＋−０．３４＊ＬｕｍＡ＋０．０．２３＊ＬｕｍＢ、
式中、変数「基底」、「Ｈｅｒ２」、「ＬｕｍＡ」および「ＬｕｍＢ」は上記の通りであり、試験発現プロフィールは、アクセッション番号ＧＳＥ２８４５としてＧＥＯに寄託されている遺伝子発現データを用いて構築されたセントロイドと比較される。

さらに別の実施形態では、危険スコアは、乳癌サブタイプと臨床変数腫瘍サイズ（Ｔ）との組合せを用いて、以下の方程式（変数は上記の通り）
ＲＯＲ−Ｃ＝０．０５＊基底＋０．１１＊Ｈｅｒ２＋−０．２３＊ＬｕｍＡ＋０．０９＊ＬｕｍＢ＋０．１７＊Ｔを用いて計算することもできる。

療法への応答の予測
乳癌は、例えば、手術、放射線療法、ホルモン療法、化学療法またはそのなんらかの組合せを含むことができる、いくつかの代替戦略によって管理される。当技術分野で公知であるように、個々の乳癌患者のための治療決定は、腫瘍の内分泌応答性、患者の閉経状態、関与する患者リンパ節の場所および数、腫瘍のエストロゲンおよびプロゲステロン受容体の状態、原発腫瘍のサイズ、患者の年齢、および診断時の疾患の病期に基づくことができる。様々な臨床因子および臨床試験の分析は、Ｓｔ．Ｇａｌｌｅｎ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ（２００５年）のＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｐａｎｅｌによる初期乳癌のための推奨および治療ガイドラインの進展をもたらした。Ｇｏｌｄｈｉｒｓｃｈら、Ａｎｎａｌｓ Ｏｎｃｏｌ． １６巻：１５６９〜８３頁、２００５年を参照。ガイドラインは、患者に、内分泌非応答性疾患のための化学療法を；内分泌応答性疾患のための一次療法としての内分泌療法を、このカテゴリーの一部の中間およびすべての高リスク群のために化学療法を加えて、ならびに低リスク群の者を除く、未確定内分泌応答カテゴリーのすべての患者のために化学療法および内分泌療法の両方を提供するよう推奨する。

ＰＡＭ５０モデルを用いる再発危険および本明細書に開示される危険スコアによる患者の層化は、追加のまたは代替の治療決定因子を提供する。この方法は、任意選択で１つまたは複数の臨床変数、例えば結節の状態、腫瘍サイズおよびＥＲ状態と一緒にＰＡＭ５０分類モデルを用いて、再発危険を評価することを含む。危険スコアは、治療決定の指針とするために用いることができる。例えば、低い危険スコアを有する対象は、特定の種類の療法から利益を受けることができないが、高い危険スコアを有する対象には、より攻撃的な療法を指示することができる。

本発明の方法は、初期乳癌患者のための適当な治療の選択において、特に有用である。疾患の初期段階で診断される乳癌患者の大多数は、さらなるアジュバント療法なしで、手術および／または放射線療法の後に長期生存する。しかし、これらの患者のかなりの割合（約２０％）が疾患の再発または死を経験するので、一部またはすべての初期乳癌患者がアジュバント療法を受けるべきであるとの臨床上の推奨が導かれる。本発明の方法は、初期乳癌患者のこの高リスクの予後不良な集団を特定し、それによってどの患者にとって、継続的および／またはより攻撃的な療法ならびに治療後の綿密なモニタリングが有益となるのかを決定することにおいて有用である。例えば、本明細書に開示の方法によって高い危険スコアを有すると評価される初期乳癌患者は、手術および／または放射線治療に続いて、より攻撃的なアジュバント療法、例えば化学療法のために選択することができる。特定の実施形態では、本発明の方法は、医師がより情報に基づいた乳癌治療の決定を下すことができるように、Ｓｔ．Ｇａｌｌｅｎ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅによって確立された治療ガイドラインと共に用いることができる。

様々な実施形態では、ＰＡＭ５０分類モデルは、免疫組織化学または他の組織学的分析などの標準の臨床アッセイを用いて得ることができない、乳癌サブタイプに関する情報を提供する。例えば、エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性および／またはプロゲステロン受容体（ＰＲ）陽性と評価された対象には、従来のガイドラインに従って内分泌療法が指示されるであろう。実施例２で述べるように、本明細書で開示されるモデルは、ＥＲまたはＰｇＲ状態単独に基づくと指示されなかったであろうより攻撃的な療法の必要性を指示することができる、基底様と分類されるこれらのＥＲ＋／ＰｇＲ＋症例のサブセットを特定することができる。

したがって、本明細書で開示される方法は、選択された治療に対する乳癌患者の応答を予測することにおいても有用である。「選択された治療に対する乳癌患者の応答を予測する」ことは、患者が特定の治療で正または負の予後を経験する可能性を評価することを意味するものとする。本明細書で用いるように、「正の治療予後を示す」は、選択された治療から患者が有益な結果（例えば、完全または部分的な寛解、腫瘍サイズの縮小など）を経験する可能性の増大を指す。「負の治療予後を示す」は、根底にある乳癌の進行に関して、選択された治療から患者が利益を享受できない可能性の増大を意味するものとする。

一部の実施形態では、予後または無病生存時間を評価するための関連する時間は、腫瘍の外科的除去、または腫瘍増殖の抑制、緩和もしくは阻害から始まる。別の実施形態では、ＰＡＭ５０に基づく危険スコアは、内分泌療法などのネオアジュバント療法の開始後に得られる試料に基づいて計算される。試料は、療法の開始後の任意の時間にとることができるが、不応性患者でネオアジュバント療法を化学療法に切り替えることができるように、好ましくは約１カ月後に得られる。手術の前に内分泌治療が指示される腫瘍のサブセットは、この療法に非応答性であることが示されている。本明細書で提供されるモデルは、腫瘍がエストロゲンおよび／またはプロゲステロン受容体に陽性である場合でも、内分泌療法におそらく治療抵抗性である攻撃的な腫瘍を特定するために用いることができる。この実施形態では、増殖加重ＰＡＭ５０危険スコアは、以下の方程式に従って得られる。ＲＳｐ＝（−０．０１２９＊基底）＋（０．１０６＊Ｈｅｒ２）＋（−０．１１２＊ＬｕｍＡ）＋（０．０３９＊ＬｕｍＢ）＋（−０．０６９＊正常）＋（０．２７２＊Ｐｒｏｌｉｆ）、式中、増殖スコア（「ｐｒｏｌｉｆ」）は、以下の遺伝子の平均測定値として割り当てられる（正規化後）：ＣＣＮＢ１、ＵＢＥ２Ｃ、ＢＩＲＣ５、ＫＮＴＣ２、ＣＤＣ２０、ＰＴＴＧ１、ＲＲＭ２、ＭＫＩ６７、ＴＹＭＳ、ＣＥＰ５５およびＣＤＣＡ１。他のすべての変数は、下に記載のＲＳ方程式と同じである。実施例２で述べるように、療法の開始後の危険スコアの評価は、少なくともネオアジュバント内分泌療法を受けているＥＲ＋患者集団では、治療予後においてより予測的である。

キット
本発明は、乳癌固有のサブタイプを分類するために、および／または予後情報を提供するために有用なキットも提供する。これらのキットは、表１に列挙される固有遺伝子に特異的な捕捉プローブおよび／またはプライマーのセット、ならびに固有遺伝子の発現生成物の検出および／または定量化を促進するのに十分な試薬を含む。キットは、コンピュータ可読媒体をさらに含むことができる。

本発明の一実施形態では、捕捉プローブは、アレイの上に固定化される。「アレイ」は、ペプチドまたは核酸プローブがその支持体または基質に結合している、固体支持体または基質を意味するものとする。アレイは、異なる公知の場所にある基質の表面に結合している、複数の異なる捕捉プローブを一般に含む。本発明のアレイは、固有遺伝子の発現生成物に特異的に結合することができる複数の捕捉プローブを有する基質を含む。基質上の捕捉プローブの数は、アレイの目的によって異なる。アレイは、低密度アレイまたは高密度アレイであることができ、４個以上、８個以上、１２個以上、１６個以上、３２個以上のアドレスを含むことができるが、表１に記載の５０個の固有遺伝子のための捕捉プローブを最小限含む。

物理的合成法を用いるこれらのアレイの合成技術は、例えば、すべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，３８４，２６１号に記載されている。このアレイは、実質的にいかなる形の表面にも、または複数の表面にさえ形成することができる。アレイは、ビーズ、ゲル、重合体表面、光ファイバーなどの線維、ガラスまたは他の任意の適当な基質の上のプローブ（例えば、核酸結合性プローブ）であることができる。それぞれはすべての目的のために本明細書にその全体が組み込まれる、米国特許第５，７７０，３５８号、第５，７８９，１６２号、第５，７０８，１５３号、第６，０４０，１９３号および第５，８００，９９２号を参照。アレイは、装置の上で診断または他の操作を可能にする方法でパックすることができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８５６，１７４号および第５，９２２，５９１号を参照。

別の実施形態では、キットは、表１に列挙される固有遺伝子の各々の検出および／または定量化に十分な、オリゴヌクレオチドプライマーセットを含む。オリゴヌクレオチドプライマーは、凍結乾燥または再構成された形で提供されてもよく、またはヌクレオチド配列セットとして提供されてもよい。一実施形態では、プライマーはマイクロプレートフォーマットで提供され、そこでは各プライマーセットがマイクロプレートの１つのウェル（または反復試験区の場合のように複数のウェル）を占める。下に述べるように、マイクロプレートは、１つまたは複数のハウスキーピング遺伝子の検出に十分なプライマーをさらに含むことができる。キットは、表１に記載の遺伝子からの発現生成物の増幅に十分な、試薬および指示書をさらに含むことができる。

例えば、比較、精査、回収および／または改変のために速いアクセスを容易にするために、分子シグナチュア／発現プロフィールは、一般的にデータベースに記録される。最も一般的には、データベースはコンピュータ装置によってアクセス可能なリレーショナルデータベースであるが、他のフォーマット、例えば、写真、アナログまたはデジタル画像読み出し情報、表計算ソフト、その他のような、手動でアクセス可能な発現プロフィールの索引ファイルを用いることができる。最初に記録される発現パターンの性質がアナログまたはデジタルであるかを問わず、発現パターン、発現プロフィール（総体的な発現パターン）および分子シグナチュア（相関する発現パターン）はデジタル的に保存され、データベースによってアクセスされる。一般的に、データベースは編集され、中央設備に維持されて、アクセスはローカルにおよび／または遠隔操作で利用可能である。

本明細書で冠詞「ａ」および「ａｎ」は、１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）の冠詞の文法上の目的語を指すために用いられる。例として、「要素」は、１つまたは複数の要素を意味する。

明細書全体を通して、単語「含んでいる」または変形形態の「含む」もしくは「含んでいる」などは、明示された要素、整数もしくは段階、または要素、整数もしくは段階の群が含まれることを意味するが、いかなる他の要素、整数もしくは段階、または要素、整数もしくは段階の群の除外を意味するものではないと理解される。

以下の実施例は例示のために提供され、限定するものではない。

（実施例１）
方法
試料および臨床データ：
トレーニングおよび試験セットのための患者コホートは、公開ドメイン（Ｌｏｉら（２００７年）Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２５巻：１２３９〜１２４６頁；ｖａ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒら（２００２年）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２４７巻：１９９９〜２００９頁；Ｗａｎｇら（２００５年）Ｌａｎｃｅｔ ３６５巻：６７１〜６７９頁；Ｉｓｈｖｉｎａら（２００６年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６巻：１０２９２〜１０３０１頁およびＨｅｓｓら（２００６年）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２４巻：４２３６〜４２４４頁、それぞれは参照によりその全体が組み込まれる）中の既存のデータを有する試料、ならびにそれぞれの施設で施設内審査委員会承認のプロトコルの下で収集された新鮮凍結ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織からなった。

１８９個の乳房腫瘍試料および２９個の正常な試料のトレーニングセットを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ ａｔ Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ、Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ、Ｔｈｏｍａｓ Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙおよびＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで承認されたＩＲＢプロトコルの下、新鮮凍結およびＦＦＰＥ組織として手に入れた。マイクロアレイおよびｑＲＴ−ＰＣＲによってプロファイリングされた遺伝子発現であったトレーニングセットは、４９カ月の中間の追跡調査を有し、彼らの病期、ＥＲおよびＨＥＲ２状態によって決定された治療標準に従う、不均一に治療された患者を表す。長期の疾患特異的生存期間を有する２７９個の乳癌の試験セットは、ｑＲＴ−ＰＣＲによってＦＦＰＥからプロファイリングされた遺伝子発現であった。ｑＲＴ−ＰＣＲによって分析されたトレーニングおよび試験セットの臨床データを、表２および３に示す。

核酸抽出：
Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔを用いるマイクロアレイのために、製造業者のプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）に従って、全ＲＮＡを新鮮凍結試料から精製した。ＲＮＡの完全性は、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いて判定した。ｑＲＴ−ＰＣＲのためにＦＦＰＥ組織（２×１０ミクロンまたは１．５ｍｍのパンチ）からＲＮＡを抽出するために、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｐａｒａｆｆｉｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いた。混入したＤＮＡは、Ｔｕｒｂｏ ＤＮアーゼ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いて除去した。総ＲＮＡの収量は、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＤＥ）を用いて評価した。

逆転写およびリアルタイム定量ＰＣＲ：
第一鎖ｃＤＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（第一鎖キット；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）ならびにランダム六量体および遺伝子特異的プライマーの混合物を用いて、１．２μｇの総ＲＮＡから合成した。反応を、５５℃で６０分間、次に７０℃で１５分間保持した。ｃＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）で洗浄し、さらなる使用時まで２５ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ中に−８０℃で保存した。各５μＬのＰＣＲ反応は、関心のある試料からの１．２５ｎｇ（０．６２５ｎｇ／μＬ）のｃＤＮＡまたは参照のために１０ｎｇ（５ｎｇ／μＬ）、２ｐｍｏｌの上流および下流のプライマー、ならびに２×のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を含んでいた。各ランは、試験試料、参照試料および陰性対照のために２反復でプロファイリングされた単一の遺伝子を含んでいた。参照試料ｃＤＮＡは、ヒト参照総ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）および乳房細胞系ＭＣＦ７、ＭＥ１６ＣおよびＳＫＢＲ３の同等の寄与量を含んでいた。ＰＣＲ増幅は、初期変性段階（９５℃、８分）と、続く４５サイクルの変性（９５℃、４秒）、アニーリング（５６℃、６秒で２．５℃／秒の遷移）および伸長（７２℃、６秒で２℃／秒の遷移）を用いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）で実施した。ｄｓＤＮＡ色素ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉからの蛍光（５３０ｎｍ）を、各サイクルで伸長段階の後に得た。ＰＣＲの特異性は、増幅後融解曲線解析によって判定した−試料を６５℃に冷却し、蛍光を連続的に（１℃ごとに１０回取得）監視しながら、２℃／秒の速度で９９℃まで徐々に加熱した。各遺伝子の相対的なコピー数は、１０ｎｇに設定したラン内キャリブレータから、１．９のＰＣＲ効率を用いて判定した。ＰＡＭ５０クラシファイヤー遺伝子の各々を、５つのハウスキーパーの幾何平均に正規化した。

マイクロアレイ：
ＡｇｉｌｅｎｔヒトＩＡｖ２マイクロアレイまたはオーダー設計されたＡｇｉｌｅｎｔヒト２２ｋのアレイでの総ＲＮＡの単離、標識化およびハイブリダイゼーションは、Ｈｕら（６）に記載のプロトコルを用いて実施した。すべてのマイクロアレイデータは、アクセッション番号ＧＳＥ１０８８６の下で、ＧＥＯ（インターネットアドレスｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／）に寄託した。すべてのマイクロアレイトレーニングおよび試験データセットの出典を、表４に示す。

マイクロアレイデータの前処理：
トレーニングセット（１８９個の試料）のマイクロアレイデータは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ（ＵＮＣ）マイクロアレイデータベースから抽出された。両チャネルからの生のシグナル強度をチップによってｌｏｗｅｓｓ正規化し、プローブは、それらが少なくとも７０％の実験の両チャネルで少なくとも３０のシグナル強度を有していない場合、データ分析から除外した。このセットの正規化データは、ＧＥＯ（ＧＳＥ１０８８６）に置いた。トレーニングセットは中央にセンタリングし、遺伝子記号は製造業者によって提供された注釈を用いて割り当てた。重複遺伝子記号は、各試料内で平均することによって折りたたんだ。

すべての試験セットの正規化データは、ＧＥＯ（ＧＳＥ２８４５、ＧＳＥ６５３２、ＧＳＥ４９２２、ＧＳＥ２０３４、ＧＳＥ１０８８６）、またはインターネットアドレスｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｍｄａｎｄｅｒｓｏｎ．ｏｒｇ／ｐｕｂｄａｔａで見出される公開データからダウンロードした（表５を参照）。すべての強度測定値（ＮＫＩデータの比）を、対数変換した。最近傍セントロイドの計算の前に、Ｈｅｓｓら（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｍｄａｎｄｅｒｓｏｎ．ｏｒｇ／ｐｕｂｄａｔａ）、ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒら（ＧＳＥ２８４５）およびＷａｎｇら（ＧＳＥ２０３４）データセットを中央にセンタリングして、プラットホーム効果を最小化した。このような調整は、トレーニングセットと比較的類似した集団のサンプリングを仮定する。Ｌｏｉら（ＧＳＥ６５３２）およびＩｖｓｈｉｎａら（ＧＳＥ４９２２）データセットは、トレーニングセットと比較してＥＲ＋試料にかなり富み、したがって、根底にある仮説はこれらのセットでは破られる可能性がある。これらの２つの例では、トレーニングセットの遺伝子は、ＥＲ＋試料の中央にセンタリングされた（すべての試料全体での中央と対照的に）。トレーニングセットと同様に、遺伝子記号は、製造業者によって提供された注釈を用いて割り当て、重複遺伝子記号は、各試料内で平均することによって折りたたんだ。

プロトタイプ固有のサブタイプ試料および遺伝子の同定：
４つの過去の試験（１、６、９、１１）で見出された遺伝子を主に含む拡張された「固有」遺伝子セットを最初に用いて、プロトタイプの腫瘍試料を同定した。正常様クラスは、乳房縮小術または肉眼的に無関係な組織からの真の「正常体」を用いて表した。１９０６個の「固有」遺伝子全体にわたる１８９個の乳房腫瘍を階層的クラスタリング（特徴／遺伝子、ピアソンの相関、平均連結法によって中央にセンタリングした）（１２）によって分析し、試料デンドログラムは、「ＳｉｇＣｌｕｓｔ」（１３）を用いて分析した。ＳｉｇＣｌｕｓｔアルゴリズムは、試料の群が単一のクラスターからのものであるとの帰無仮説を検定することによって、有意／特異な群を統計的に特定し、そこにおいて、クラスターは多変量正規分布として特徴づけられる。ＳｉｇＣｌｕｓｔは、根元から始まり、検定がもはや有意でない（ｐ＞０．００１）ときに停止するデンドログラムの各節で実行した。

プロトタイプ試料およびｑＲＴ−ＰＣＲを用いる、遺伝子セットの削減：
ｑＲＴ−ＰＣＲおよびマイクロアレイによってプロファイリングされた１８９人の個体からの１２２の乳癌は、ＳｉｇＣｌｕｓｔによる判定でプロトタイプのプロフィールを有していた（表２）。最小化遺伝子セットは、Ｍｕｌｌｉｎｓら（１４）で確立されたＦＦＰＥ性能基準に合格した１６１の遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲデータを用いて、これらのプロトタイプ試料から誘導された。各群のトップ「Ｎ」ｔ検定統計（１５）、トップクラスター索引スコア（１６）、および改変ｔ検定統計の「収縮」の後に残された遺伝子（１７）を含め、いくつかの最小化方法が使用された。最小化遺伝子セットの頑健性を評価するために、交差妥当化（５０サイクルの各々でランダムな１０％が残された）を用いた。最も低いＣＶ誤差を有するので、「Ｎ」ｔ検定法が選択された。

試料サブタイプ予測：
最小化遺伝子セットを、３つのセントロイドに基づく予測法、すなわち、マイクロアレイの予測分析（ＰＡＭ）（１７）、単純最近傍セントロイド（６）、および最近傍セントロイドの分類（ＣｌａＮＣ）（１８）にわたる分類の再現性のために比較した。サブタイプの予測は、各試験例と５個のセントロイド（ＬｕｍＡ、ＬｕｍＢ、ＨＥＲ２富化、基底様および正常様）とのスピアマンの順位相関を計算することによって実行し、最近傍セントロイドに基づいてクラスを割り当てた。ＧＳＥ１０８８６で提供されるデータを用いて、ＰＡＭアルゴリズムのために記載されている（１７）通りにセントロイドを構築した。しかし、「収縮」は用いず、スピアマン順位相関を距離測定のために用いた。大きな最小化遺伝子セットからのサブタイプ予測のその再現性のため、この方法をクラシファイヤーとして選択した。６つのマイクロアレイデータセットおよび１つのｑＲＴ−ＰＣＲデータセットでサブタイプを予測するために、最終の５０の遺伝子のクラシファイヤー（以降、ＰＡＭ５０と呼ぶ）を用いた（表４）。Ｈｅｓｓらのデータセット（１９）は予後データを有さず、臨床マーカー、サブタイプおよびネオアジュバント応答に基づいて評価される。

臨床および分子サブタイプデータを用いる予後：
再発（すなわち任意の事象）までの時間をエンドポイントとして一変量および多変量解析を用いて、固有サブタイプの分類の予後診断上の有意性を標準の臨床変数（腫瘍サイズ（Ｔ）、結節の状態（Ｎ）およびＥＲ状態）とともに評価した。入手可能な臨床データ、サブタイプデータ、ならびに臨床および分子変数の組合せのモデルを比較するために、尤度比検定を実施した。カテゴリーによる生存率分析は、ログランク検定を用いて実施し、カプラン−マイヤープロットで視覚化した。

臨床および分子データによる危険モデルの開発：
サブタイプ単独、およびサブタイプを臨床情報と用いて、再発危険（ＲＯＲ）予測のためにモデルを調教した。いずれの場合も、リッジ回帰を用いる多変量のコックスモデルをＮＫＩ２９５コホートの未処置のサブセットに適合させた（２０）。危険スコアは、サブタイプ単独との相関を用いて（ＲＯＲ；モデル１）、または完全モデルをサブタイプ相関および２つの臨床変数と用いて（ＲＯＲ（完全）；モデル２）各試験例に割り当てた：
（１）ＲＯＲ＝０．０５＊基底＋０．１１＊Ｈｅｒ２＋−０．２５＊ＬｕｍＡ＋０．０７＊ＬｕｍＢ＋−０．１１＊正常
（２）ＲＯＲ（完全）＝０．０５＊基底＋０．１＊Ｈｅｒ２＋−０．１９＊ＬｕｍＡ＋０．０５＊ＬｕｍＢ＋−０．０９＊正常＋０．１６＊Ｔ＋０．０８＊Ｎ
コックスモデルからの係数の合計は、各患者の「再発危険」スコアである。試料を特定の危険群に分類するために、高い危険群に入るためにＬｕｍＡ試料を必要とせず、低い危険群に入るために基底様試料を必要としないＮＫＩトレーニングセットから閾値を選択した。閾値はトレーニングセットから決定し、試験例を評価するときにも不変であった。サブタイプだけおよび組合せモデルの予測は、Ｃ指数（インターネットアドレスｌｉｂ．ｓｔａｔ．ｃｍｕ．ｅｄｕ／Ｓ／Ｈａｒｒｅｌｌ／Ｄｅｓｉｇｎ．ｈｔｍｌ）を用いて比較した。ＲＯＲスコアと無再発生存との間の関係を特徴づけるために、サイザー分析を実施した（２１）。ＲＯＲスコアの９５％信頼区間は二項信頼区間のローカルバージョンであり、ローカル試料サイズは、ウインド幅のＳｈｅａｔｈｅｒ−Ｊｏｎｅｓ選択に基づいて、ガウシアンカーネル密度推定量から計算される（２２）。

結果
プロトタイプ試料および遺伝子に基づく新しいサブタイプモデルの作製：
乳癌固有のサブタイプと、予後（１、６、９）、遺伝的変化（２３）および薬剤応答（２４）との間の相互作用を分析した多数の試験がある。ここに記載される方法の目的は、臨床および研究目的のために、固有のサブタイプの分類を標準化および検証することであった。「ＳｉｇＣｌｕｓｔ」は、クラスター化マイクロアレイデータから５つの固有の乳房サブタイプを客観的に特定した。これらのプロトタイプを次に用いて、最小限の５０の遺伝子のセットを誘導した（ＰＡＭ５０）。最後に、最良の分類法を選択してＰＡＭ５０と一緒に用い、マイクロアレイおよびｑＲＴ−ＰＣＲのデータから複数の試験セットについてサブタイプを予測した。予後データ（表４）による５つのマイクロアレイ試験のうち、ＵＮＣコホートは、他より有意に不良な予後を有した。組み合わせたマイクロアレイ試験セットへのサブタイプ予測は、すべての患者にわたって、内分泌物治療単独を受けた患者で、および全身アジュバント療法を投与されなかったリンパ節陰性患者で、予後有意性を示した（図１）。

生存の分子的および臨床上の予測因子を、１４５１人の患者について、一変量および多変量解析で評価した（表５）。一変量解析では、ＬｕｍＡ、ＬｕｍＢおよびＨＥＲ２富化サブタイプは、すべて有意であることがわかり、臨床変数ＥＲ、ＴおよびＮも同様であった。ＬｕｍＡおよびＨＥＲ２富化サブタイプおよび臨床変数は、多変量解析でも有意であって、最も包括的なモデルはサブタイプおよび臨床情報を含むべきであることを示唆した。この仮説の検定は、組合せモデルが、サブタイプまたは臨床変数単独よりも有意に大きな生存の変動（両試験でｐ＜０．０００１）を説明することを明らかにした。

ＥＲ陽性およびＥＲ陰性の腫瘍にわたる生物学的サブタイプの分布：
組合せマイクロアレイ試験セットのすべてのＥＲ陽性腫瘍のうち、７３％は管腔（ＡおよびＢ）、１０％はＨＥＲ２富化、５％は基底様であった（表６）。逆に、ＥＲ陰性腫瘍を考慮した場合、約１３％は管腔（ＡおよびＢ）、３１％はＨＥＲ２富化、４８％は基底様であった。正常様サブタイプと特定された腫瘍は、ＥＲ陽性（１１％）およびＥＲ陰性（８％）腫瘍の間でほとんど等しく分割された。したがって、サブタイプ提示はＥＲ状態によって分布が著しく変化したが、すべてのサブタイプがＥＲ陽性およびＥＲ陰性両方のカテゴリーで提示された。ＥＲ陽性症例単独におけるサブタイプの予後プロットは、無再発生存について有意であって、すべての侵襲性乳房疾患を考慮した場合に見られるのと同じ傾向を辿った。

サブタイプおよびネオアジュバントＴ／ＦＡＣ治療への応答：
パクリタキセル、５−フルオロウラシル、アドリアマイシンおよびシクロホスファミド（Ｔ／ＦＡＣ）のレジメンを投与された患者からの腫瘍でマイクロアレイを実施したＨｅｓｓらの試験（１９）は、ＰＡＭ５０サブタイプ、臨床マーカーの間の関係の研究、および各々が病理学的完全寛解（ｐＣＲ）とどのように関係するかについての研究を可能にした。ＨＥＲ２状態については、臨床アッセイでＨＥＲ２陽性（ＨＥＲ２＋ｃｌｉｎと呼ばれる、ＦＩＳＨ＋および／またはＩＨＣ３＋）であった腫瘍の６４％は、ＨＥＲ２富化発現サブタイプに分類され、ＨＥＲ２＋ｃｌｉｎの残りの大部分は、管腔サブタイプに関連していた。ＨＥＲ２＋ｃｌｉｎであったがＨＥＲ２富化発現サブタイプではなかった腫瘍は、ＨＥＲ２＋ｃｌｉｎおよびＨＥＲ２富化発現サブタイプであったもの（５２％）に対して、低いｐＣＲ率（１６％）を有した。

別の関連する臨床上の相違は、「三重陰性」腫瘍（ＥＲ−、ＰｇＲ−およびＨＥＲ２−）の分類であり、その６５％はＰＡＭ５０によって基底様と呼ばれ、残りはＨＥＲ２富化（１５％）、ＬｕｍＡ（４％）、ＬｕｍＢ（４％）および正常様（１２％）と呼ばれた。三重陰性と評価されなかった基底様腫瘍が、ＰＡＭ５０によって基底様でなかった三重陰性腫瘍（２２％ｐＣＲ、表７）と比較して５０％ｐＣＲを有していた点で、基底様のＰＡＭ５０分類は、ｐＣＲ率に関して臨床三重陰性より優れているようである。

生物学的サブタイプに基づく危険予測：
固有サブタイプおよび臨床変数との関連で予後を予測するために、教師付き危険クラシファイヤーを開発した。再発危険（ＲＯＲ）モデルを調教し、カットオフを選択するために、ＮＫＩマイクロアレイデータセットから未処置のコホートを選択した。組合せマイクロアレイ試験セットを用いて、２つのコックスモデル（１つはサブタイプ単独に基づき、もう１つはサブタイプ、腫瘍サイズおよび結節の状態に基づく）を検証した。臨床変数を除外すると、サブタイプのみのモデルは、低、中、高の危険の再発群への患者の層化において、成績がよかった（ｃ指数＝０．６５［０．６１〜０．６９］）。しかし、完全モデル（サブタイプ、腫瘍サイズ、結節の状態）は成績がよりよく（ｃ指数＝０．７０［０．６６〜０．７４］）、実際上、病期が説明を必要とするパラメータである（図２）。図３は、完全モデルを用いて連続線形目盛としてプロットされる、５年時の無再発生存の確率を示す。

ｑＲＴ−ＰＣＲによって分析したＰＡＭ５０クラシファイヤーを、１９７６年〜１９９５年にアーカイブされた不均一に処置されたコホートに適用した。サブタイプ分類は、マイクロアレイデータで見られるのと同じ生存傾向を辿り、ＲＯＲスコアは長期再発予測について有意であった。この老齢試料セットは、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって標準の臨床マーカー（ＥＲおよびＨＥＲ２）についても評価し、遺伝子発現に基づく試験と比較した。遺伝子発現によるＥＳＲ１およびＥＲＢＢ２の分析は、ＩＨＣアッセイと比較して高い感度および特異性を示した。

考察
乳癌の固有サブタイプのための臨床診断試験を提供する目的で、統計的に誘導した遺伝子および試料セットを用いてＰＡＭ５０クラシファイヤーを開発し、複数のコホートおよびプラットホームにわたって検証した。大きくて多様な試験セットは、集団レベルでの、および標準の分子マーカーに関してアッセイの性能の評価を可能にした。これらの分析からの重要な知見は、臨床的に定義されたＥＲ陽性およびＥＲ陰性の腫瘍サブセットに固有サブタイプのすべてが存在し、ＥＲ陽性患者のサブタイプ指定が予後の有意性を示すことである。したがって、分子サブタイプは、単にＥＲ状態に基づく分類の別の方法ではない。

個々のサブタイプに関して、他の重要な知見もあった。例えば、ＨＥＲ２富化発現サブタイプに分類される腫瘍のいくつかはＨＥＲ２＋ｃｌｉｎではなく、ＨＥＲ２遺伝子増幅によって誘起されないＥＲ陰性非基底サブタイプの存在を示唆した。約１０％の乳癌が正常様に分類され、ＥＲ陽性またはＥＲ陰性のいずれかであることができ、中間の予後を有することも見出された。これらの腫瘍は正常な乳房組織でのトレーニングによって予測されたので、正常様クラスは、腫瘍検体中の高率の正常な「汚染」を有することのアーチファクトであり得る。他の可能性は、これらが、増殖遺伝子の高発現を欠く増殖の遅い基底様腫瘍であるか、または低クラウディン腫瘍と呼ばれているおそらく新しいサブタイプであるということである（２５）。これらの問題を解決するために、これらの症例の詳細な組織学的、免疫組織化学的およびさらなる遺伝子発現分析が必要である。

サブタイプと標準の分子マーカーとの間の相違は、重要な治療上の意味合いを有する。例えば、ＥＲ陽性またはＰｇＲ陽性と評価された基底様サブタイプ腫瘍の患者は、内分泌療法によっておそらく治療され、基底様特異的療法（例えば白金含有療法）の開発を目的とするプロトコルに適格でないであろう。Ｈｅｓｓらのデータセット（１９）のこれらの分析は、ＬｕｍＡサブタイプを有する患者は攻撃的なネオアジュバント療法を投与した場合にｐＣＲを有しなかったが、基底様腫瘍のｐＣＲ率は５９％であったことを示した。さらに、三重陰性（ＥＲ−、ＰＲ−、ＨＥＲ２−）表現型が基底様発現サブタイプと同じであるかどうかについての議論があった２６。３７４４個の腫瘍の最近の組織マイクロアレイ試験は、三重陰性症例の予後不良を確認したが、すべてのマーカーを欠く腫瘍が、１つまたは２つの基底様マーカー（すなわち、ＣＫ５／６またはＨＥＲ１）に陽性のものと同じ行動を取らないことも明らかにした（２７）。臨床上のＥＲおよびＰｇＲ状態とは無関係に基底様診断を下すべきとの考えに一致して、三重陰性であるが基底様でないと特定されたもの（２２％）に対して、基底様であるが三重陰性でないと特定された対象（５０％）で、Ｔ／ＦＡＣへのより高い治療応答が見出された。このことは、高度の化学療法感受性を有する腫瘍の特定において、基底様サブタイプ指定が、三重陰性定義より優れていることが最終的に証明される可能性を示唆する。

腫瘍は別々の生物学的実体として存在しないので、絶対的なサブタイプ分類を提供することは、いくぶん人工的である。各サブタイプセントロイドまでの距離に基づく低〜中〜高の危険群への腫瘍の分類（すなわちＲＯＲモデル）は、この問題を扱う試みであり、有意な生存上の分離を与えた。すべての試験症例を組み合わせた場合、または内分泌療法だけを投与されたコホート、もしくは全身アジュバント治療が無投与のコホートへの層化の後、このことは真であった。ＲＯＲ予測因子の主要な利点の１つは、再発の危険が非常に低く、アジュバント化学療法が有益である可能性が低いＬｕｍＡ患者の同定である。この関係において、サブタイプに基づくＲＯＲ予測因子は、ＥＲ陽性、リンパ節陰性患者のＯｎｃｏｔｙｐｅＤｘ再発スコアに類似した情報を提供する（４、５）。しかし、ＰＡＭ５０に基づくアッセイは、ＥＲ陰性疾患の患者を含むすべての患者について、再発危険スコアを提供する。

要約すると、このサブタイプ予測因子およびＲＯＲクラシファイヤーは、予後診断および治療にとって重要である乳房腫瘍の分子的特徴を効果的に特定する。ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイは、アーカイブされた乳房組織を用いて実施することができ、それは、後向き研究および前向き臨床試験のために有用である。

（実施例２）
序論および背景データ
この技術は、ネオアジュバント内分泌療法場面での予測的および予後診断のシグナチュアとしての、ＰＡＭ５０に基づく固有サブタイプのクラシファイヤーの使用も含む。第２期および３期のＥＲおよび／またはＰｇＲ陽性乳癌を有する閉経後患者は、乳房周囲の組織に侵入した腫瘍の状況で臨床予後を改善するために、すなわち乳房保存手術の使用を促進するために、または手術の可能性を向上させるために、手術の前に内分泌剤で、一般的にはアロマターゼ阻害薬またはタモキシフェンで治療することができる。個々の患者がネオアジュバント内分泌療法に応答するという信頼性を増加させる予測的試験は、かなりの進歩である。

概要
内分泌剤による治療の開始後に収集されるＥＲ＋乳癌からの試料に適用される場合、ＰＡＭ５０に基づく固有サブタイプおよび増殖加重の危険スコアは、内分泌剤による長期療法を受けるＥＲ＋乳癌患者のために、ネオアジュバント内分泌療法への応答を予測して、予後を決定するために用いることができる。治療の前に取られた腫瘍試料で調教された予後診断遺伝子発現モデル（ＰＡＭ５０増殖加重危険スコア−本明細書の他に記載される）を、ネオアジュバント内分泌療法の開始後に取られた試料に適用した。遺伝子発現プロフィールと予後との相互作用に関する過去の研究は、処置前試料を調べただけで、これらのモデルを処置後試料に決して適用しなかったので、この手法は特異である。ベースライン試料でのＰＡＭ５０の固有サブタイプおよび増殖加重予後診断モデルの予後診断および予測特性を、ネオアジュバント内分泌療法の開始から１カ月後に取られた試料に適用された同じモデルと比較する。処置後１カ月試料へのＰＡＭ５０の固有サブタイプおよび増殖加重再発危険モデルの適用は、ネオアジュバントまたはアジュバント内分泌治療に応答しない攻撃的な腫瘍を正確に特定する。これらの劣る腫瘍は内分泌療法抵抗性の攻撃的な疾患として行動するので、これらの腫瘍患者は、化学療法などの代替ネオアジュバント治療を直ちに優先するべきである。高度の相関がＫｉ６７増殖マーカーと増殖加重ＰＡＭ５０の危険スコアとの間で確立され、ＰＡＭ５０の増殖加重危険スコアが予後診断特性を有するとの主張を支持する。しかし、内分泌剤に曝露させた腫瘍から収集された試料にこの分析を適用する場合、これらの予後診断特性は著しく高められる。実際上、決定的な手術の前に内分泌剤を数週間処方することによって、または不応性腫瘍を同定するためにネオアジュバント内分泌治療の早期に腫瘍を再サンプリングすることによって、これを容易に達成することができる。

方法論：
これらの主張を支持する証拠は、アロマターゼ阻害薬レトロゾールによるネオアジュバント療法のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅが支援する第２相試験（ＮＣＩ助成金番号Ｒ０１ ＣＡ０９５６１４）からもたらされる。試験の適格性は、ＥＲおよび／またはＰｇＲ陽性の第２期および３期の乳癌を有する閉経後の女性であった。患者は４カ月の療法を受け、その後手術を受けた。凍結腫瘍試料をベースライン、１カ月および手術の時点で得た。試料を凍結切片によって分析し、標準の方法を用いて腫瘍に富む検体からＲＮＡを抽出し、Ａｇｉｌｅｎｔ １×４４Ｋアレイを用いる遺伝子発現分析にかけた。ＰＡＭ５０クラシファイヤーを調教するために用いたデータセットにデータを正規化し（上記の方法）、２つの読み出し情報を生成した：固有の分類（ＬｕｍＡ、ＬｕｍＢ、ＨＥＲ２富化、基底様、正常様）および増殖加重ＰＡＭ５０危険スコア。この試験の狙いは、ネオアジュバント内分泌療法の予後を、ベースライン試料および１カ月時に取られた処置後試料の両方に由来する固有の分類および増殖加重危険スコアに関連させることであった。

結果：
ＰＡＭ５０固有サブタイプおよび増殖加重危険スコアは、療法から１カ月後に顕著な変化を示した（表８）。移行のほとんどがＬｕｍＢ群で起こり、大多数がＬｕｍＡに変化したが、１６％は治療にもかかわらずＬｕｍＢカテゴリーのままであった。対照的に、ほとんどのＬｕｍＡ腫瘍は、療法後もＬｕｍＡにとどまった。処置後試料においてＰＡＭ５０増殖加重危険スコアが類似した移行を示し、高危険と分類された腫瘍の大部分（６８％）は中または低の危険になったので、これらの移行は、ＬｕｍＢ群の増殖クラスターの抑制によるものであった。Ｋｉ６７免疫組織化学との緊密な相関は、この結論をさらに鮮明に示す。ベースラインＫｉ６７値とＰＡＭ５０増殖加重危険スコアとの相関は高かった（Ｐ＝２．８×Ｅ−８）。同様に、１カ月時Ｋｉ６７値および１カ月時ＰＡＭ５０増殖スコアも、緊密に相関していた（Ｐ＝３．８Ｅ−１０）。しかし、ベースラインＰＡＭ５０増殖加重危険スコアサブタイプは試験終了時Ｋｉ６７値と非常に弱い相関を示しただけである（Ｐ＝０．０４）が、１カ月時ＰＡＭ５０増殖加重危険スコアと試験終了時Ｋｉ６７値との間には緊密な相関があり、そのほとんどは４〜６カ月後の手術時に得られた（Ｐ＝６．８Ｅ−１１）。この最後の観察は、最終手術試料が低い増殖速度などの好ましいバイオマーカー特徴を有するかどうか予測するために、早期の処置後ＰＡＭ５０に基づく試験を用いることができるとの主張を強く支持する。

これらの内分泌療法によって誘導された、固有の乳癌サブタイプおよび危険スコアの変化に関連する臨床上の相関を決定するために、以下の４つのエンドポイントを調べた：臨床上の応答（ＲＥＣＩＳＴ基準）、病理学的Ｔサイズ（Ｔ１対より高いもの−治療による病理学的ダウンステージングの証拠として）、二分Ｋｉ６７値（１以下のＫｉ６７自然対数値を示す腫瘍は、好ましいプロフィールを示しているとみなす）、および再発事象。ベースラインサブタイプまたは危険スコアは、これらのエンドポイントのいずれかを予測するための納得のいく能力を示さず、それは、再発に関して、この試験の小さい試料サイズの作用であろう（表９）。対照的に、また小さい試料サイズにもかかわらず、１カ月時のＰＡＭ５０固有サブタイプ（表１０）は、臨床上の応答（Ｐ＝０．０１）、好ましい処置終了時Ｋｉ６７値（Ｐ＝０．０００３）および再発（０．００９）と統計的に有意な関係を示した。これらの強い関係は、処置後検体で「非管腔」または管腔Ｂと指定された腫瘍に関連する極めて劣る予後によって誘起された。ＰＡＭ５０増殖加重危険スコアは、類似した特性を有していた。ベースラインのＰＡＭ５０増殖加重危険スコアは、あまり効果的にはネオアジュバントまたは長期予後を予測しなかった（表１１）。しかし、１カ月時に高危険と指定された腫瘍は、調べた４つのエンドポイントのすべてにおいて、予後不良と有意な相関、すなわち劣る臨床応答（Ｐ＝０．０２）、低い病理学的ダウンステージング（ｐ＝０．０２）、好ましからぬ処置終了後Ｋｉ６７値（Ｐ＝０．０００１）および再発（ｐ＝０．００１）を示した（表１２）。

したがって、内分泌剤で手術前処置を受けた一次ＥＲ＋乳癌から収集された腫瘍試料への、ＰＡＭ５０に基づく固有サブタイプおよび危険スコアの適用は、以下の目的のために用いることができる：
１）ネオアジュバント内分泌療法に対する不応答の予測
２）その後アジュバント内分泌治療を受けるＥＲ＋乳癌を有する患者の予後の判定。

（実施例３）
正常様クラスをモデルから除いたこと以外は、実施例１に記載の試料で再発危険分析を実施した。正常様クラスは、乳房縮小術または肉眼的に無関係な組織からの真の「正常体」を用いて表した。したがって、このクラスはすべての予後分析から除かれ、この分類は品質管理測定とみなされる。下に記載されない方法は、実施例１に記載の方法と同一である。

方法
臨床および分子サブタイプデータを用いる予後診断および予測モデル：
無処置患者およびネオアジュバント化学療法を投与された患者で固有のサブタイプ（ＬｕｍＡ、ＬｕｍＢ、ＨＥＲ２富化、および基底様）の有意性を決定するために、一変量および多変量解析を用いた。予後診断のために、再発（すなわち、任意の事象）までの時間をエンドポイントとして、サブタイプを標準の臨床変数（Ｔ、Ｎ、ＥＲ状態および組織学的段階）と比較した。病理学的病期分類が適用不可であるので、ネオアジュバント設定での予測のために、サブタイプを段階および分子マーカー（ＥＲ、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、ＨＥＲ２）と比較した。入手可能な臨床データ、サブタイプデータ、ならびに臨床および分子変数の組合せの比較されたモデルに対して尤度比検定を実施した。カテゴリーによる生存分析は、ログランク検定を用いて実施し、カプラン−マイヤープロットで視覚化した。

臨床および分子データによる危険モデルの開発
ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒら（２００２年）のコホートのリンパ節陰性未処置サブセットへのリッジ回帰適合を用いて、サブタイプ危険モデルを多変量コックスモデルで調教した。サブタイプ単独（１）（ＲＯＲ−Ｓ）との相関を用いて、またはサブタイプ相関を腫瘍サイズ（２）（ＲＯＲ−Ｃ）とともに用いて、ＲＯＲスコアを各試験症例に割り当てた：
（１）ＲＯＲ−Ｓ＝０．０５＊基底＋０．１２＊Ｈｅｒ２＋−０．３４＊ＬｕｍＡ ＋０．０２３＊ＬｕｍＢ
（２）ＲＯＲ−Ｃ＝０．０５＊基底＋０．１１＊Ｈｅｒ２＋−０．２３＊ＬｕｍＡ＋０．０９＊ＬｕｍＢ＋０．１７＊Ｔ
コックスモデルからの係数の合計は、各患者のＲＯＲスコアである。特定の危険群へ試料を分類するために、実施例１に記載のトレーニングセットから閾値を選択した。ＲＯＲスコアと無再発生存との間の関係を特徴づけるために、サイザー分析を実施した。ＲＯＲスコアの９５％ＣＩは二項ＣＩのローカルバージョンであり、ローカル試料サイズは、ウインド幅のＳｈｅａｔｈｅｒ−Ｊｏｎｅｓ選択に基づいて、ガウシアンカーネル密度推定量から計算される。

再発予測モデルの比較
再発の予測のために４つのモデルを比較した：（１）臨床変数単独（腫瘍サイズ、段階およびＥＲ状態）のモデル、（２）ＲＯＲ−Ｓ、（３）ＲＯＲ−Ｃ、および（４）サブタイプ、腫瘍サイズおよび段階を組み合わせたモデル。様々なモデルの強さを比較するために、Ｃ指数を選択した。各モデルについて、２／３のトレーニングセットおよび１／３の試験セットへの、未処置コホートの１００個の無作為化からＣ指数を推定した。各試験セットについてＣ指数を計算して各モデルの推定を生成し、２つの試料のｔ検定を用いて、Ｃ指数推定値をモデル全体で比較した。

結果
リンパ節陰性乳癌における予後のための再発危険モデル
固有のサブタイプを単独で、および臨床変数と一緒に用いてコックスモデルを検定した。表１３は、無処置患者の独立コホートにおけるこれらのモデルの多変数解析を示す（実施例１を参照）。モデルＡでは、サブタイプ、腫瘍サイズ（Ｔ１以上）および組織学的段階が、ＲＯＲの有意な因子であることが見出された。大多数の基底様腫瘍（９５．９％）は、中または高の段階であることが見出され、したがって、段階のない分析であるモデルＢでは、基底様が有意になる。モデルＣは、リンパ節陰性集団でサブタイプの有意性を示す。サブタイプおよび臨床変数を含んでいたすべてのモデルは、臨床単独（Ｐ＜０．０００１）またはサブタイプ単独（Ｐ＜０．０００１）よりも有意に良好であった。固有サブタイプおよび臨床変数との関連で予後を予測するために、再発クラシファイヤーを調教した。ＲＯＲモデルを調教し、カットオフを選択するために、ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒら（２００２）のマイクロアレイデータセットからリンパ節陰性の無全身治療コホート（ｎ＝１４１）を選択した。有効な臨床変数だけのモデルと比較して、サブタイプ（ＲＯＲ−Ｓ）による生成で明白な改善があった（Ｐａｒｋｅｒら（２００９年）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２７巻（８号）：１１６０〜１１６７頁を参照）。臨床変数およびサブタイプの組合せ（ＲＯＲ−Ｃ）も、個々の予測因子のいずれかよりも有意に改善されている。しかし、段階に関する情報は、組合せモデルでのＣ指数を有意に改善せず、段階の予後診断値が、固有サブタイプモデルによって提供される情報によって取って代わられたことを示した。未処置のリンパ節陰性患者の予後診断試験セットでＲＯＲのためにＲＯＲ−Ｃを用いる場合、ＬｕｍＡ群だけが低危険患者を含み、低、中、高の危険の３クラス識別が予後診断能を有した。また、ＲＯＲ−Ｃスコアは、５年後の再発の確率と線形関係を有する。

サブタイプおよびネオアジュバントＴ／ＦＡＣ治療への応答の予測
Ｔ／ＦＡＣで治療した患者からの腫瘍に対してマイクロアレイを実施したＨｅｓｓら（２００６年）の試験は、サブタイプと臨床マーカーとの間の関係、および各々がどのようにｐＣＲ＞に関係するかの研究を可能にした。表１４は、臨床分子マーカー（ＥＲ、ＰＲ、ＨＥＲ２）と一緒の、および組織学的段階と一緒の（モデルＡ）または一緒でない（モデルＢ）サブタイプの多変数解析を示す。この試験との関連で唯一の有意変数は、固有サブタイプであった。ｐＣＲを予測するためにＲＯＲ−Ｓモデルを用いた場合、化学療法に不応答なものの特定について、９４％感受性および９７％陰性予測値が見出された。高危険スコアとｐＣＲのより高い確率との間の関係は、無痛性ＥＲ陽性腫瘍（ＬｕｍＡ）が化学療法により不応答性であるという結論と一貫している。しかし、予後診断のためのＲＯＲとは異なり、ＲＯＲ対ｐＣＲの確率についてプラトーに到達するようであり、最も高い危険の腫瘍の間でのかなりの化学療法耐性の存在を確認する。

（実施例４）
この試験では、エストロゲン受容体陽性であって彼らの唯一のアジュバント全身療法としてタモキシフェンで治療された、一般的な臨床上重要な女性群でＰＡＭ５０クラシファイヤーの予後診断値を評価するために、ｑＲＴ−ＰＣＲおよびそれ以前に確立された切点（実施例１を参照）を用いた。ほとんどの過去の報告とは異なり、この均一に治療された試験コホートは、大きな割合のリンパ節陽性患者を含む。入手可能な詳細な長期追跡調査は、すべての標準の臨床病理学的危険因子と比較して、無再発生存だけでなく、乳癌疾患特異的死の危険の評価も可能にする。

方法
患者：
試験コホートは、１９８６年〜１９９２年にブリティッシュコロンビア州で新たに診断された侵襲性の乳癌女性患者に由来する。組織は州周辺の様々な病院で摘出され、冷凍され、バンクーバー病院の中央エストロゲン受容体（ＥＲ）研究室に運ばれた。受領した材料の組織学的参照としてホルマリン固定およびパラフィン包埋された部分を、この試験で用いる。検体に関連付けられた臨床情報には、年齢、組織学、段階、腫瘍サイズ、関与した腋窩リンパ節の数、リンパまたは血管への侵入、ＤＣＣ法によるＥＲ状態、局所および最初のアジュバント全身療法の種類、診断日、最初の局所、領域または遠隔の再発、死亡日および死因が含まれる。この患者コホートの特性は、予後診断モデルＡＤＪＵＶＡＮＴ！を検証した集団に基づく試験［Ｏｌｉｖｏｔｔｏ ２００５］でそれ以前に詳細に記載されており、ＥＲ［Ｃｈｅａｎｇ ２００６］およびＨＥＲ２［Ｃｈｉａ ２００８］発現について特徴づけられた組織マイクロアレイを組み立てるために、同じソースブロックが用いられた。この試験のために、免疫組織化学によるＥＲ陽性腫瘍を有し、彼らの唯一のアジュバント全身療法としてタモキシフェンを投与された患者を選定した。これらの患者が彼らの治療を投与された間、リンパ血管性侵入などの、いくらか高い危険の特徴が存在したＥＲ陽性腫瘍を有する閉経後の女性のために、州のガイドラインはアジュバントタモキシフェンを推奨した。高い危険の特徴のない類似した患者は、アジュバント全身療法なしで主に治療した。ほとんどの場合、化学療法は閉経前の女性だけに提供された。

ＲＮＡ調製：
ＲＮＡは、病理学者によって指導された組織コアから単離した。簡潔には、各ブロックからのＨ＆Ｅ切片が、病理学者によって精査された。代表的な侵襲性乳癌を含む領域を選択し、ソースブロックを囲んだ。１．０ｍｍパンチ針を用いて、少なくとも２つの腫瘍コアを円領域から抽出した。高純度ＲＮＡパラフィンキット（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ）を用いてＲＮＡを回収し、Ｔｕｒｂｏ Ｄｎａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）でＤＮＡを除去し、ＮＤ−１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ ＤＥ）を用いてＲＮＡ収量を評価した。

ｑＲＴ−ＰＣＲ：
ランダム六量体および遺伝子特異的プライマーの混合物を用いてｃＤＮＡ合成を実施し、ｑＰＣＲは前述の通り、Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０器具で実施した［Ｍｕｌｌｉｎｓ ２００７］。各３８４ウェルプレートは、試料を２反復で（反応につき２．５ｎｇのｃＤＮＡ）、キャリブレータを３反復で（反応につき１０ｎｇのｃＤＮＡ）含んだ。参照対照（ＡＣＴＢ、ＰＳＭＣ４、ＲＰＬＰ０、ＭＲＰＬ１９またはＳＦ３Ａ１）のいずれかが失敗した場合、腫瘍試料は品質不十分とみなされた。ＰＣＲは、７３％の例で全５０の識別遺伝子について、別の１５％の例では５０のうちの４９について技術的に成功した。欠落遺伝子情報に対するＰＡＭ５０アッセイ結果の寛容性を評価するために、増大する数の遺伝子のランダムな擬似除去に続いて、ＲＯＲ−Ｃ値をデータで評価した。１つの遺伝子の減少は、危険スコアの０〜２単位の変化をもたらし、これは、１０年後の疾患特異的生存の１％の増加／減少に対応した。

臨床試料への生物学的サブタイプの割り当て：
管腔Ａ、管腔Ｂ、ＨＥＲ２富化、基底様および正常様サブタイプに対応する遺伝子発現セントロイドは、実施例１およびＰａｒｋｅｒら（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２００７ Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２７巻（８号）：１１６０〜７頁）に記載の固有の５０遺伝子パネルを用いて構築した。検体は、スピアマンの順位相関によって計算された最近傍セントロイド距離に基づいて、予後データに盲検化された試験担当医によって固有のサブタイプに割り当てられた。

臨床予後とのＰＡＭ５０サブタイプの関係：
統計分析は、ＳＰＳＳ ｖ１６．０およびＲ ｖ２．８．０を用いて行った。乳癌の遠隔無再発性および乳癌疾患特異的生存に対する腫瘍サブタイプの一変量解析は、カプラン−マイヤー解析によって実施し、有意性のためにはログランク検定を用いた。多変量解析は、腫瘍サイズ、結節の状態（検査した全体に対する陽性リンパ節の割合）、組織学的段階、患者の年齢およびＨＥＲ２状態の標準の臨床パラメータに対して実施した（組織マイクロアレイに組み立てられ、臨床同等プロトコルを用いる免疫染色およびＦＩＳＨ分析にかけた、同じソースブロックからの隣接したコアに基づく［Ｃｈｉａ ２００８］）。ｑＰＣＲによって割り当てられた乳癌サブタイプの調整危険率を推定するために、コックス回帰モデル［Ｃｏｘ １９８４］を構築した［Ｔｒｕｏｎｇ ２００５］。すべての共変量のための情報を有する場合だけが、解析に含まれた。比例危険仮説を評価するために、加重Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄ残差の平滑化プロットを用いた［Ｇｒａｍｂｓｃｈ １９９４］。

臨床上の予後との再発危険（ＲＯＲ）スコアとの関係：
ＲＯＲスコアアルゴリズム（管腔Ａ、管腔Ｂ、ＨＥＲ２富化、および基底様サブタイプとの試料の相関を組み込むＲＯＲ−Ｓ；この情報に加えて腫瘍サイズを組み込むＲＯＲ−Ｃ）を、マイクロアレイによってプロファイリングされた３つの乳癌系およびｑＰＣＲによってプロファイリングされた１つの乳癌系で調教し、検証した。管腔Ａ患者が高危険カテゴリーに分類されず、基底様患者が低危険カテゴリーに分類されないように、危険層化カットポイントをトレーニングセットに割り当てた。カプラン−マイヤーおよびコックス回帰分析を、上記のように行った。

結果
１５〜２０年前にホルマリン固定およびパラフィン包埋された手術検体を元に、９９１の症例について侵襲性の乳癌の病理学者によって特定された領域から腫瘍コアを抽出した。ＲＮＡ抽出の後、８１５個の試料は、少なくとも２５ｎｇ／μＬの濃度の少なくとも１．２μｇの総ＲＮＡを与え、ＰＣＲ分析に進行した。鋳型は、８０６個でｑＲＴ−ＰＣＲについて技術的に十分な品質であった（内部のハウスキーパー遺伝子対照に基づく）。これらの症例の間で、合計７１１個の検体が、ＰＡＭ５０識別遺伝子のうちの少なくとも４９個の高品質ｑＲＴ−ＰＣＲ定量データを与え、以降の臨床および生存分析に含まれた。これらの７１１人の患者の臨床特性を、表１５に示す。

最近傍ＰＡＭ５０セントロイドに基づき、遺伝子発現によって、これらの臨床的ＥＲ陽性症例のうちの合計３２９症例（４６．３％）を管腔Ａ、３１２症例（４３．８％）を管腔Ｂ、５８症例（８．２％）をＨＥＲ２富化、３症例（０．４％）を基底様、および９症例（１．３％）を正常様固有乳癌サブタイプに割り当てた（表１３）。正常様に割り当てられた９症例については、ソースブロックの同じ領域から取られた組織マイクロアレイコアを用いて、組織像を精査した。これらの９症例のうちの８症例では、生存可能な侵襲性の癌細胞は、隣接したコアには存在しないかまたは稀であって、不適切な腫瘍サンプリングを表す正常様発現プロフィールと一貫していた。したがって、正常様症例は、さらなる分析から除外した。

固有の生物学的サブタイプは、カプラン−マイヤー分析によって、高い予後診断能を有した（図４）。この試験のための試料獲得時のブリティッシュコロンビア州の集団では、臨床的に低い危険プロフィールを有する多くの患者は、アジュバント全身療法を投与されなかった［Ｏｌｉｖｏｔｔｏ ２００５］。対照的に、この試験の対象であるアジュバントタモキシフェンを投与された患者は、より高い臨床危険群を含み、全体の１０年遠隔無再発生存が６２％、乳癌疾患特異的生存率が７２％であった。ＰＡＭ５０アッセイによって管腔Ａプロフィールを有すると判定された患者は、管腔Ｂ、ＨＥＲ２富化または基底様腫瘍よりも有意に良好な予後（１０年無再発生存７４％、疾患特異的生存＝８３％）を有した。

この試験のすべての症例は、中央評価免疫組織化学［Ｃｈｅａｎｇ ２００６］によってエストロゲン受容体陽性であって、９８．７％は、臨床デキストラン−チャコールコーティング生化学アッセイによっても陽性であった。これにもかかわらず、ＰＡＭ５０遺伝子の発現の公開データセットを調べた場合に以前に観察されたように、ＰＡＭ５０のｑＰＣＲパネルは、症例の１０％を非管腔サブタイプに、その大部分はＨＥＲ２富化に割り当てた（実施例２）。

彼女らの唯一のアジュバント全身療法として一様にタモキシフェンで治療された、臨床的にエストロゲン受容体陽性の女性のこのコホートについては、多変量コックスモデルを構築して、患者の年齢ならびに腫瘍サイズ、結節の状態、組織学的段階およびＨＥＲ２発現（表１６）の標準の臨床病理学的因子に対してＰＡＭ５０サブタイプの独立値を検定した。固有の生物学的サブタイプは、結節の状態および腫瘍サイズと同様に多変量モデルで有意のままであったが、このコホートの一変量解析で有意である段階および臨床上のＨＥＲ２状態は、ＰＡＭ５０結果を組み込んでいた多変量モデルでは、無再発または疾患特異的生存について有意な独立予後診断情報に寄与しなかった。

再発危険（ＲＯＲ）スコアは、ＰＡＭ５０ ｑＰＣＲパネルから計算することができる。ＲＯＲ−Ｓ（ＰＡＭ５０パネルからの分子サブタイピングだけに基づく）およびＲＯＲ−Ｃ（サブタイプおよび腫瘍サイズ情報を組み合わせる）の両スコアは、アジュバントタモキシフェンで均一に治療された集団で、多数のリンパ節陽性症例を含む系に、および乳癌特異的生存のエンドポイントに対して予後診断能が非常に高い（図５）。

図６に示すように、ＲＯＲ−Ｃアルゴリズムは、リンパ節陰性患者の間で予後診断能が非常に高いだけでなく、リンパ節陽性患者の間で疾患特異的生存のさらに広い差も明らかにする。本アルゴリズムは、リンパ節陽性であるにもかかわらず、低危険と分類される臨床的ＥＲ陽性患者（化学療法ではなくアジュバントタモキシフェンで治療された）の１６％を特定し、これらの女性は８９％の１０年後疾患特異的生存率を有する。

連続変数として、ＲＯＲ−Ｃは、陽性リンパ節の割合との有意な相互作用、およびリンパ節段階との境界線上の有意な相互作用を有する（表１７）。リンパ節段階は、中〜高のＲＯＲ−Ｃ値（＞２３．５）を有する患者の間で有意な予測因子であるが、低いＲＯＲ−Ｃスコアを有する患者の間では、予後は結節の状態に関係なく良好である（図７および図８）。

ＲＯＲ−Ｃは腫瘍サイズ情報を含んでいるので、ＲＯＲアルゴリズムがこの患者集団で標準の臨床パラメータ（腫瘍サイズを含む）を越える独立したさらなる予後診断情報を与えるかどうかを評価するために、ＲＯＲ−Ｓを組み込むコックスモデルを検定した（表１８）。エンドポイントが無再発生存または疾患特異的生存であるかを問わず、またはカテゴリーもしくは連続変数としてＲＯＲ−Ｓが含まれる場合、それは有意にとどまるが、段階および臨床上のＨＥＲ２状態は、ｑＰＣＲ由来の情報を含む多変量解析では有意でない。

この系の症例は、ＥＲ、ＰＲ、ＨＥＲ２、サイトケラチン５／６、上皮成長因子受容体およびＫｉ６７について免疫組織化学によって以前に評価され［Ｃｈｅａｎｇ ２００８］［Ｃｈｅａｎｇ ２００９］、代わりの免疫組織化学的定義による固有のサブタイプ分類の割り当てを可能にした。この系のすべての症例は免疫組織化学によってＥＲ陽性であるので、すべては管腔Ａ（ＨＥＲ２陰性およびＫｉ６７低の場合）または管腔Ｂ（ＨＥＲ２陽性またはＫｉ６７高の場合）に割り当てられた。ｑＰＣＲサブタイプ分類割り当ての利用可能性は、この均一に治療されたコホートでの患者予後に対して、同じ材料での免疫組織化学的割り当てとの比較を可能にする。合計６０６症例は、両方法による管腔サブタイプへの割り当てのために十分に完全な免疫組織化学的およびｑＰＣＲデータを有した。これらの間で、２５５症例は両方法により管腔Ａに、１９３症例は管腔Ｂに割り当てられ、一方、９９症例は免疫染色により管腔Ａに割り当てられたが、ｑＰＣＲによると管腔Ｂに割り当てられ、５９症例は免疫染色により管腔Ｂに割り当てられたが、ｑＰＣＲによると管腔Ａに割り当てられ、７４％の一致、κ＝０．４８であった。結果が不一致の場合、ＰＣＲによって管腔Ｂに割り当てられた症例だけが、一致して管腔Ａに割り当てられたものより有意に劣る予後を有した。これらの症例間の多変数解析では、免疫組織化学およびＰＡＭ５０の両割り当ては、無再発生存の独立に有意な予測因子であるが、段階およびＨＥＲ２状態はモデルから脱落する（表１９）。疾患特異的生存については、ＰＡＭ５０は有意であるが、免疫組織化学は境界線上である。特定された危険の大きさは、両エンドポイントについてｑＰＣＲ割り当てでより高い。免疫組織化学およびｑＰＣＲの両割り当てを組み込む段階的コックス回帰モデルでは、ｑＰＣＲだけが有意のままである。

Ａｄｊｕｖａｎｔ！予測からの結果
乳癌患者のコホートで、Ａｄｊｕｖａｎｔ！モデルによって予測された予後とＲＯＲモデルによって予測された予後との比較を行った。このコホートは、１９８６年〜１９９２年に、侵襲性のエストロゲン受容体陽性乳癌と診断された８０６人の患者からなる。すべての患者は、一次手術およびタモキシフェン単独でアジュバント全身療法を受けた。これらの患者のすべては、化学療法で治療されなかった。患者の年齢、腫瘍サイズ、組織学的段階、リンパ血管侵襲および陽性リンパ節の数の標準の臨床病理学的特徴を用いて１０年後の乳癌特異的生存（ＢＣＳＳ）の確率を計算するために、Ａｄｊｕｖａｎｔ予後診断モデルを用いた。すべての患者はＥＲ陽性であって、乳癌死の危険はアジュバントタモキシフェン療法について調整された。

８０６人の患者のうち、７４８人はＢＣＳＳのＡｄｊｕｖａｎｔ推定を得るために十分な臨床病理学的データを有した。残りの５８人の患者は、腫瘍サイズまたはリンパ節のデータが欠落していた。平均Ａｄｊｕｖａｎｔ予測ＢＣＳＳは、７３．７％であった。これは、７３．２％のＢＣＳＳ観察値に対応する。次に、１０年後のＡｄｊｕｖａｎｔ予測ＢＣＳＳに基づいてコホートをサブグループに分割した（表２０）。

Ａｄｊｕｖａｎｔ危険群の各々の１０年後のＢＣＳＳ観察値は、Ａｄｊｕｖａｎｔによって予測されたＢＣＳＳに類似していた（表２１）。１つの注目すべき例外は、９０〜１００％のＡｄｊｕｖａｎｔ！予測ＢＣＳＳを有するサブグループの最も低い危険群であり、１０年後のＢＣＳＳ観察値は８９％である。その結果として、Ａｄｊｕｖａｎｔがこの低危険群の生存を過大評価しているようである。これは、ＢＣＯＵデータベースを用いるＡｄｊｕｖａｎｔ！の検証試験と一貫している（Ｏｌｉｖｏｔｔｏら（２００５年））。この検証試験では、Ａｄｊｕｖａｎｔが、Ｔ１Ｎ０疾患のサブグループで乳癌死を４．９％過小評価したことが判明した。９０〜１００％のＢＣＳＳ予測値を有する患者のサブグループでは、１２２人中８７人の患者はＴ１Ｎ０乳癌を有していた。

５０遺伝子からのｑＲＴ−ＰＣＲデータを用いたＲＯＲ−Ｓを次に用いて、各Ａｄｊｕｖａｎｔ！群を低対中／高の危険に分離した（表２２）。各群の比較的小さなサイズのために、中および高の危険群を組み合わせて統計力を向上させた。また、Ａｄｊｕｖａｎｔ！危険サブグループは臨床因子を用いて既に定義されているので、ＲＯＲ−Ｓ（ＲＯＲ−Ｃではなく）を適用した。

各Ａｄｊｕｖａｎｔ危険群で次にカプラン−マイヤー分析を別々に実施し、低対中／高の危険ＲＯＲ−Ｓ群の間の生存の差を、ログランク検定を用いて検定した（表２３）。ＲＯＲ−Ｓは、各Ａｄｊｕｖａｎｔ危険群で低危険サブグループを単離できることが観察された。９０〜１００％群以外のすべてのサブグループにおいて、ＢＣＳＳの統計的に有意な差が、低危険対中／高危険患者で見出された。

この低危険群では、ＲＯＲ−Ｓはあまり統計的に有意でない（ｐ＝０．０５８）。しかし、この群は、ＲＯＲ−Ｓが追加の予後診断情報をＡｄｊｕｖａｎｔ！に加えているというある程度の説得力のある証拠を提供する。Ａｄｊｕｖａｎｔ！予測ＢＣＳＳ９０〜９５％対９５〜１００％によること以外同じ群のカプラン−マイヤー分析を、図９に示す。

中危険群では、ＲＯＲ−Ｓは、低危険対より高い危険の患者を特定する能力に優れる。８０〜９０％群（図１０Ａ）および７０〜８０％群（図１０Ｂ）の両方において、ＲＯＲ−Ｓは１０年ＢＣＳＳ＞９０％のサブグループを特定する。ＲＯＲ−Ｓは化学療法なしでうまくいく高危険患者を伝統的に特定するので、これは重要な結果である。

Ａｄｊｕｖａｎｔ！によって特定される非常に高い危険のサブグループ（予測ＢＣＳＳ＜７０％）でも、ＲＯＲ−Ｓは、異なる予後診断群を特定することがまだできる（図１０Ｃ）。

考察
過去の試験は、いくつかの遺伝子発現マイクロアレイプラットホームでプロファイリングされた、複数の異なる機関からの乳癌コホートにおいて、管腔Ａ、管腔Ｂ、ＨＥＲ２富化および基底様サブタイプの特徴を示す固有の生物学的シグナチュアが存在し、予後診断の有意性を有することを証明した［Ｃａｌｚａ ２００６］［Ｋａｐｐ ２００６］［Ｈｕ ２００６］［Ｆａｎ ２００６］。標準のホルマリン固定パラフィン包埋病理検体でこれらのサブタイプを特定するために、５０の遺伝子のパネルに基づいてこれらのサブタイプを特定する、定量的逆転写酵素ＰＣＲ試験を開発した［Ｍｕｌｌｉｎｓ ２００７］。

ここで報告される分析は、長期の詳細な追跡調査を有する一連の比較的古い（１５〜２０年）パラフィンブロックに適用された、ｑＰＣＲに基づく試験から専らなり、無再発生存だけでなく、乳癌疾患特異的生存の分析を可能にする。本試験は、彼女らの唯一のアジュバント治療としてホルモン療法（タモキシフェン）を投与された、特に臨床上重要で現代的関連性のある群である、エストロゲン受容体陽性乳癌の女性からなる。エストロゲン受容体およびＨＥＲ２状態を中心に判定した。これらの女性の７０％は、受診時リンパ節陽性であって、現在の慣行では、アジュバント化学療法の投与が通常推奨されるであろう。ＰＣＲによって判定されるＰＡＭ５０サブタイプ割り当ては、これらの女性で高い予後診断能を有する。サブタイプは多変量解析で有意のままであるが、段階および臨床上のＨＥＲ２状態はそうではない。通常使用される無再発生存の代わりのエンドポイントを用いる知見は、すべてが乳癌疾患特異的生存に通用する。

このコホートからの患者は２０年を超える前に治療されたが、この研究からの知見は、中程度の再発危険を有する乳癌患者の治療に今でも重要である。そのような患者はアジュバントホルモン療法から有意な利益を導くことができるが、化学療法のさらなる追加は適度の効果（１０年無再発生存の２〜５％の改善）を有することができる。アジュバント化学療法の続行の決定は、患者および担当腫瘍学者が下す個々の決定であるが、向上した予後判定は治療上の意思決定を容易にする。

再発危険スコアを開発し、無再発生存のエンドポイントに対して、アジュバント全身療法を投与されなかったリンパ節陰性患者からのマイクロアレイデータ（実施例２）で検証した。このアルゴリズムは、１３３人の患者の公開されたネオアジュバントＴ／ＦＡＣ治験データセットで病理的完全寛解を予測すること、およびそのｑＰＣＲフォーマットで、不均一に治療された２７９人の乳癌女性のコホートで無再発生存を予測することが示されている。パラフィンブロック検体からｑＰＣＲによって生成されたＲＯＲスコアは、リンパ節陰性およびリンパ節陽性の両サブセットで、タモキシフェンで治療されたエストロゲン陽性女性でも予後診断能がある。ＲＯＲ−Ｃは、結節の状態でさえ予測因子でなく、したがって、例えば、第３世代化学療法治療計画および胸壁放射線を含む、リンパ節陽性患者のために通常留保される治療手法を必要としない可能性があるであろう低危険患者群を特定する。

ＰＡＭ５０クラシファイヤーを一次乳癌の大きなセットからのＤＮＡマイクロアレイデータに適用した場合の１２％と比較して、ＰＣＲアッセイを用いると、極めて少ない症例（１．３％）が正常様に分類される。ＤＮＡマイクロアレイ分析は、腫瘍に富ませるための肉眼的解剖にもかかわらずかなりの量の正常乳房組織をまだ含む可能性のある、ホモジナイズした腫瘍検体を利用する。対照的に、ＰＡＭ５０のｑＰＣＲアッセイは、ソースブロック中の純粋な腫瘍の代表的領域の直接顕微鏡的同定に基づいて、病理学者の指導による組織コアで実施される。この差は、パラフィンブロックに適用されたＰＡＭ５０のｑＰＣＲ法を用いて得られた、正常様プロフィールのずっと低い頻度を説明するようである。隣接組織から抽出される組織マイクロアレイコアで表される組織像の精査は、９つのうちの８つの正常様症例で正常様プロフィールの原因である不十分な腫瘍提示と一貫している。

ＰＡＭ５０クラシファイヤーを有する公開データセットの調査に基づいて前に指摘したように、このアッセイは、免疫組織化学的アッセイおよびリガンド結合アッセイの両方によって腫瘍が陽性である場合でさえ、臨床的ＥＲ陽性の女性の間でＥＲ陰性の生物学的サブタイプを特定する。優に１０％の症例が非管腔のサブタイプに再割り当てされ、これらのタモキシフェンで治療された女性は予後不良であって、ホルモン非依存性の生物学的現実に矛盾しない。ＥＲおよびＨＥＲ２状態の臨床上の測定は、それ自体で乳癌患者を予後診断および予測サブグループに層化することができる［Ｈａｙｅｓ ２００７］。しかも、乳癌の予後診断および治療を割り当てるために単一の遺伝子（ＥＲ、ＰＲ）の測定に依存することは、偽陽性および陰性の単一の測定の問題だけでなく、腫瘍の根底の生物学がホルモン非依存性である（経路の１つのメンバーがタンパク質レベルで発現されるにもかかわらず）可能性の危険を冒す。この点に関し、他の生物学的サブタイプの陽性マーカーと一緒にエストロゲン応答性経路の他のものを含む、５０遺伝子を並行して測定することによって提供される情報は、根底にある腫瘍生物学のより精確な反映であろう［Ｏｈ ２００６］。

より大きな免疫組織化学的代用パネルが、発現プロフィールのゴールドスタンダードに関連付けられ、ＥＲ、ＰＲおよびＨＥＲ２の単純測定よりも多くの情報を提供することができる［Ｃｈｅａｎｇ ２００８ｂ］［Ｃｈｅａｎｇ ２００９］。限られた抗体パネルが標準のパラフィンブロックに容易に適用され、標準の臨床病理学的危険因子を越える有意な予後診断情報を加えることができる［Ｒｏｓｓ ２００８］。この研究において、５０遺伝子のｑＰＣＲアッセイに対する、確立された６つの免疫染色パネル（ＥＲ、ＰＲ、ＨＥＲ２、Ｋｉ６７、サイトケラチン５／６および上皮成長因子受容体）の直接比較を、同じソースブロックを用いて行った。各方法は、標準の因子を越えて有意な予後診断情報を加える。しかし、臨床的ＥＲ陽性患者のこのセットでは、固有の生物学的サブタイプに対する多くの矛盾した割り当てがあり、ｑＰＣＲ手法はこれらの症例での予後の予測でより良好であった。

主な臨床危険因子を組み込む多変量解析では、ＰＡＭ５０サブタイプまたはＲＯＲが含まれる場合、段階はもはや有意ではない。再発スコアおよびゲノム段階指数などの他のシグナチュアと比較すると［Ｐａｉｋ ２００４］［Ｉｖｓｈｉｎａ ２００６］［Ｓｏｔｉｒｉｏｕ ２００６］、ＰＡＭ５０は、高危険症例を、全身療法選択肢（例えば、ホルモン、抗ＨＥＲ２およびアントラサイクリン対非アントラサイクリン化学療法治療）に異なる応答をするであろう管腔Ｂ、ＨＥＲ２富化および基底様サブタイプに区別する利点も有する。このアッセイは、凍結組織［Ｇｌａｓ ２００６］も切断切片の手動顕微手術［Ｐａｉｋ ２００４］も必要とせず、臨床試験からのものなどのアーカイブ組織を含む標準のパラフィンブロックに容易に適用することができるので、実施するのもより簡単である。しかし、このアッセイは所望によりこの種の試料で実施することができる。ＰＡＭ５０アッセイは乳癌の根底にある生物学の主要な特徴を反映するように設計されたので、特定の集団での予後に対して最適化されるのと対照的に、それは他の患者コホートにうまく外挿され、予測能を保持する可能性が特にある［Ｒｏｕｚｉｅｒ ２００５］。この研究では、ＰＡＭ５０のｑＰＣＲアッセイが、リンパ節陽性であろうがリンパ節陰性であろうが、エストロゲン受容体陽性のタモキシフェンで治療された女性の間で、有意で独立した予後診断能力を有することが初めて証明された。本アッセイは、ＥＲ陽性である（免疫組織化学およびリガンド結合アッセイによって）と臨床的に決定された最高１０％の症例がＥＲ陰性高危険群に分類されることを確認し、多変量の予後診断モデルで段階およびＨＥＲ２状態を置換し、免疫組織化学的サブタイプ分類および臨床危険クラシファイヤーより優れている。

本明細書中に挙げたすべての刊行物および特許出願は、本発明が関連する技術分野の当業者のレベルを示すものである。すべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることが具体的におよび個々に示されているかのように、同じ程度に参照により本明細書に組み込まれている。

上記発明は理解の明快さの目的のために例示および実施例としてある程度詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲の範囲内で、ある変更および修正を加えることができることが明らかとなる。

Claims (20)

1. 試験試料で乳癌固有のサブタイプを分類する方法であって、
   ａ） 乳癌固有のサブタイプによって分類された複数のトレーニング乳癌試料の各々の遺伝子発現プロフィールを得る工程であって、管腔Ａ（ＬｕｍＡ）、管腔Ｂ（ＬｕｍＢ）、基底様（基底）、ＨＥＲ２富化（ＨＥＲ２）、および正常様（正常）の固有サブタイプの各々が前記複数の乳癌試料で提示され、前記遺伝子発現プロフィールが、表１に列挙される少なくとも４０個の固有遺伝子の発現に基づく、工程と、
   ｂ） アルゴリズムを用いて前記トレーニングセットの乳癌固有のサブタイプの各々の遺伝子発現プロフィールまたはセントロイドを構築する工程と、
   ｃ） 前記試験試料の遺伝子発現プロフィールを得る工程であって、前記遺伝子発現プロフィールが、工程ａ）において用いられたものと同じ表１に列挙される少なくとも４０個の固有遺伝子の発現に基づく工程と、
   ｄ） 前記試験試料の遺伝子発現プロフィールを工程（ｂ）で構築されるセントロイドと比較する工程と、
   ｅ） 前記セントロイドの各々までの、前記試験試料の遺伝子発現プロフィールの距離を計算する工程と、
   ｆ） 前記試験試料を、最近傍セントロイドに基づいて乳癌固有のサブタイプの１つに割り当てる工程とを含む、方法。
2. 乳癌を有する対象でネオアジュバント療法および／またはアジュバント療法への応答を予測する方法であって、請求項１に記載の方法によって前記対象を分類し、その後前記応答を予測する工程を含み、前記固有の腫瘍サブタイプが、前記療法への応答を示す、方法。
3. 前記療法がネオアジュバント内分泌療法であり、前記固有のサブタイプが、前記ネオアジュバント内分泌療法の開始後に前記対象から収集される試料から予測される、請求項２に記載の方法。
4. 前記試料が前記ネオアジュバント内分泌療法の開始の少なくとも１カ月後に収集される、請求項３に記載の方法。
5. 乳癌を有する試験対象で予後を予測する方法であって、
   ａ） 乳癌固有のサブタイプによって分類された複数のトレーニング乳癌試料の各々の遺伝子発現プロフィールを得る工程であって、管腔Ａ（ＬｕｍＡ）、管腔Ｂ（ＬｕｍＢ）、基底様（基底）、ＨＥＲ２富化（ＨＥＲ２）、および正常様（正常）の固有サブタイプの各々が前記複数の乳癌試料で提示され、前記試料の予後が公知であり、前記遺伝子発現プロフィールが、表１に列挙される少なくとも４０個の固有遺伝子の発現に基づく、工程と、
   ｂ） アルゴリズムを用いて前記トレーニングセットの乳癌固有のサブタイプの各々のセントロイドを構築する工程と、
   ｃ） 工程（ａ）で得られる遺伝子発現プロフィールにモデルをあてはめることによって各トレーニング乳癌試料の危険スコアを計算する工程であって、前記モデルが、工程（ｂ）で構築されるセントロイドへの各遺伝子発現プロフィールの類似性の説明となる、工程と、
   ｄ） 工程（ｃ）で得られる危険スコアを、複数の危険群に層化する工程と、
   ｅ） 前記試験対象からの乳癌試料から遺伝子発現プロフィールを得る工程であって、前記遺伝子発現プロフィールが、工程ａ）において用いられたものと同じ表１に列挙される少なくとも４０個の固有遺伝子の発現に基づく、工程と、
   ｆ） 前記試験試料の遺伝子発現プロフィールを工程（ｂ）で構築されるセントロイドと比較する工程と、
   ｇ） 前記セントロイドの各々までの、前記試験試料の遺伝子発現プロフィールの距離を計算する工程と、
   ｈ） 工程（ｃ）のモデルおよび工程（ｆ）で得られる各セントロイドまでの距離を用いて危険スコアを計算する工程と、
   ｉ） 工程（ｈ）で得られる危険スコアを工程（ｄ）で割り当てられる危険群と比較することによって、前記試験対象がどの危険群に入るかを決定する工程であって、より低い危険群への帰属はより好ましい予後を示し、より高い危険群への帰属はより好ましくない予後を示す工程とを含む、方法。
6. 前記危険スコアが独立変数の加重和を用いて計算される、請求項５に記載の方法。
7. 予後が乳癌特異的生存、無事象生存または療法への応答である、請求項５に記載の方法。
8. 前記アルゴリズムが、請求項５において得られる遺伝子発現データを用いて調教される、請求項５に記載の方法。
9. 前記モデルが、予後を１つまたは複数の臨床変数にさらに相関させる、請求項５に記載の方法。
10. 前記臨床変数が、腫瘍サイズ、結節の状態、組織学的段階、エストロゲンホルモン受容体の状態、プロゲステロンホルモン受容体の状態、ＨＥＲ−２レベルおよび腫瘍倍数性からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
11. 予後が療法への応答であり、１つまたは複数の療法エンドポイント基準によって測定される、請求項７に記載の方法。
12. 前記１つまたは複数の療法エンドポイント基準が、臨床上の応答（ＲＥＣＩＳＴ基準）、病理学的腫瘍サイズ、二値化Ｋｉ６７値または再発事象から選択される、請求項１１に記載の方法。
13. 前記アルゴリズムが最近傍セントロイドアルゴリズムである、請求項１または５に記載の方法。
14. 前記セントロイドが、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓにアクセッション番号ＧＳＥ１０８８６として寄託されている遺伝子発現データから構築される、請求項１に記載の方法。
15. 前記試験試料の遺伝子発現プロフィールが、前記固有遺伝子の各々に特異的なプライマーによる逆転写およびリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を用いて得られる、請求項１または５に記載の方法。
16. 前記試験試料の遺伝子発現プロフィールが、前記固有遺伝子の各々の発現生成物に特異的なプローブによるマイクロアレイ分析を用いて得られる、請求項１または５に記載の方法。
17. 前記トレーニング試料の遺伝子発現プロフィールおよび前記試験試料の遺伝子発現プロフィールから得られるデータが、分析の前に正規化方法を通して処理される、請求項１または５に記載の方法。
18. 前記処理がハウスキーピング遺伝子のセットへの正規化を含む、請求項１７に記載の方法。
19. 前記ハウスキーピング遺伝子が、ＭＲＰＬ１９、ＰＳＭＣ４、ＳＦ３Ａ１、ＰＵＭ１、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤ、ＧＵＳＢ、ＲＰＬＰ０およびＴＦＲＣから選択される、請求項１８に記載の方法。
20. 表１に列挙される４０〜５０個の固有遺伝子の発現レベルの測定に十分な試薬からなる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載される方法において使用するためのキット。

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