WO2016137113A1 - 유방암의 예후 및 항암화학요법 사용 여부 판단 장치 및 방법 - Google Patents

유방암의 예후 및 항암화학요법 사용 여부 판단 장치 및 방법 Download PDF

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백순명
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Definitions

  • the present invention relates to a device and method for determining the prognosis of chemotherapy and the use of chemotherapy, and more particularly, to determine the anticancer treatment direction of breast cancer using immunostaining results of progesterone receptors and immunostaining results of Ki67 protein.
  • the present invention relates to a device and a method for predicting the prognosis and the effects of chemotherapy.
  • Estrogen hormone receptor-positive (ER +) breast cancer without axillary gland metastasis which accounts for about half of breast cancer patients, has a 10-year recurrence rate of 15% with 5-year anti-hormonal therapy alone. Reduced to 5% (Fisher et al, Lancet. 10; 364 (9437): 858-68, PMID: 15351193). However, the development of the Oncotype Dx test in 2004 revealed that only some patients needed chemotherapy (Paik et al, J Clin Oncol 24 (23): 3726-34, PMID: 16720680).
  • breast cancer prognostic tests based on transcriptional gene analyzes such as oncotype Dx and Mammaprint all classified breast cancers with low proliferation rates among ER + breast cancers as cancers with good prognosis. All tests that can be used are interchangeable with oncotype Dx (Wirapati et al, Breast Cancer Research. 2008; 10 (4): R65. Doi: 10.1186 / bcr2124. PMID: 18662380).
  • the gene expression analysis method is different for each test in the clinical application of each patient, and since only the specific gene is analyzed instead of the entire transcription genome, the expression level of the control gene in the sample is normalized. Therefore, the results are different from those of the meta-analysis and have low agreement with the oncotype Dx. EndoPredict, for example, had a 76% concordance with oncotype Dx risk group classification (Varga et al, PLoS One. 2013; 8 (3): e58483, PMID: 23505515). Nevertheless, the various transcription gene tests have already been used in clinical trials in many countries around the world, including in Korea, and are expensive as oncotype Dx.
  • the inventors of the present invention have discovered an apparatus and method for determining breast cancer prognosis and anticancer chemotherapy that can predict oncotype Dx risk group classification with an accuracy of 75% or more by using an inexpensive Ki67 protein, a proliferative representative protein. Came to.
  • One object of the present invention is to provide a device that can determine the prognosis of breast cancer and the use of chemotherapy with a high accuracy of 75% or more inconsistent with the oncotype Dx risk group classification.
  • Another object of the present invention is to provide a method that can determine the prognosis and the use of chemotherapy of breast cancer with a high accuracy of 75% or more inconsistent with the oncotype Dx risk group classification.
  • Oncotype Dx (Oncotype Dx) test has been proposed as a prognostic method for selecting a subsequent chemotherapy method for breast cancer patients, but because the test cost is very expensive, it is applied to only a few patients has been a problem.
  • the oncotype Dx measures the expression level of 21 genes by a reverse transcriptase polymerase chain reaction method and reports a result value of the recurrence score (RS) between 1 and 100. Less than RS 18 was classified as a low-risk group, and 10-year recurrence rate was less than 10% even with hormonal therapy without chemotherapy. On the other hand, the high-risk group above RS 30 proved to have a high recurrence rate and a high anti-cancer effect. There is no clear anti-cancer effect in the middle-risk group of RS 18 or more and 30 or less and the recurrence rate is 10% or more (Paik et al, J Clin Oncol 24 (23): 3726-34, PMID: 16720680).
  • TAILORx low risk group Do not use chemotherapy 11 to 17 2.
  • Low risk group (TAILORx medium risk group) 18 to 24 3.
  • TAILORx Medium risk group TAILORx Selective chemotherapy waiting for results 25-30 4.
  • Medium risk group TAILORx High risk group
  • Chemotherapy > 30 5. High Risk Group
  • Oncotype Dx is already covered by national insurance in advanced countries such as the United States, Ireland and Israel, and is applied to 70,000 patients a year. However, because it is not covered in Korea, it is very expensive because it costs more than 4 million won. Applies only to some patients.
  • the most important of the 21 oncotype Dx genes are the estrogen receptor group genes ESR1, PGR, BCL2 and SCUBE2, and the proliferation group genes MKI67, STK15, Survivin, CCNB1 and MYBL2. Paik et al, N Eng J Med, 351 (27): 2817-26, PMID 15591335). Therefore, it is possible to replace the progesterone receptor representing the estrogen receptor group and the MKI67 representing the proliferative group, that is, the Ki67 protein, by immunostaining. NSABP B-20 clinical trials have not validated anticancer chemotherapy effects.
  • Recurrence score 15.31385 + Nottingham score * 1.4055 + ERIHC * (0.01924) + PRIHC * (0.02925) + (0 for HER2 negative, 0.77681 for equivocal, 11.58134 for HER2 positive) + tumor size * 0.78677 + Ki-67 index * 0.13269
  • the inventors of the present invention found that when using immunostaining results of progesterone receptors and immunostaining results of Ki67 protein, oncotype Dx results and breast cancer prognosis can be predicted with high accuracy through a very simple and inexpensive method. It came.
  • the present invention extracts a breast tissue sample from the patient, and then the ratio of the total number of cancer cells including the stained progesterone receptor or Allred score to the total number of cancer cells as a result of immunostaining of the progesterone receptor and the total number of cancer cells as a result of immunostaining of the Ki67 protein.
  • an apparatus and method for determining the prognosis and use of chemotherapy for breast cancer wherein the risk of recurrence is determined according to the ratio of the number of cancer cells containing the stained Ki67 protein.
  • the ratio of the total cancer cells to the number of cancer cells including the stained progesterone receptor (%) or the Allred score is received.
  • a second input unit for receiving a ratio (%) of the number of cancer cells including the stained Ki67 protein to the total number of cancer cells as a result of immunostaining the Ki67 protein;
  • the ratio of the number of cancer cells including the stained progesterone receptor to the total number of cancer cells input from the first input unit is greater than 20% or the Allred score is 5 or more, and includes the stained Ki67 protein relative to the total number of cancer cells input from the second input unit. If the ratio of the number of cancer cells is less than 20% classification operation for classifying a low risk group; And
  • It provides a device for determining the prognosis and chemotherapy of breast cancer including an output unit for outputting the analysis result of the classification calculation unit.
  • a first input unit for receiving a percentage (%) or allred score of cancer cells including stained progesterone receptors as a result of immunostaining of progesterone receptors of breast tissue samples extracted from breast cancer patients ;
  • a second input unit for receiving a ratio (%) of the number of cancer cells including the stained Ki67 protein to the total number of cancer cells as a result of immunostaining the Ki67 protein;
  • the ratio of the number of cancer cells including the stained progesterone receptor to the total number of cancer cells input from the first input unit is 20% or less or the Allred score is less than 5, and the stained Ki67 protein is compared to the total number of cancer cells input from the second input unit. If the ratio of the number of cancer cells is less than 10% classification unit for classifying a low risk group; And
  • It provides a device for determining the prognosis and chemotherapy of breast cancer including an output unit for outputting the analysis result of the classification calculation unit.
  • the ratio of cancer cells including the stained progesterone receptors to the total number of cancer cells is greater than 20% or the Allred score is 5 or more;
  • Ki67 protein As a result of immunostaining Ki67 protein, if the ratio of cancer cells including stained Ki67 protein to total cancer cell number is less than 20%, the prognosis of breast cancer and the use of chemotherapy are determined. It provides a method for providing information.
  • the ratio of the total number of cancer cells to the number of cells including the stained progesterone receptors is 20% or less or the Allred score is Less than 5;
  • the prognosis and the use of chemotherapy for breast cancer characterized as being classified as a low risk group It provides a method for providing information.
  • the progesterone stained relative to the total number of cancer cells in the hot spots of the immunostaining results of the progesterone receptor or Ki67 protein immunostaining results for the breast tissue samples extracted from the breast cancer patient The accuracy of risk grouping can be improved by measuring the percentage of cancer cells containing receptors or Ki67 proteins or by measuring the Allred score.
  • the immunostaining of the progesterone receptor to a breast tissue sample extracted from a breast cancer patient shows that the ratio of the number of cells containing the stained progesterone receptor to the total number of cancer cells is 20% or less or the Allred score is less than 5, the Ki67 protein
  • the ratio of the number of cancer cells containing Ki67 protein to the total number of cancer cells for the hot spot with the highest staining index can be measured.
  • the area where the dyeing index is the highest that is, the shape or area of the hot spot is not limited, but may be, for example, a circular area having a radius of 400 to 650 ⁇ m.
  • the method for determining the number of cancer cells including the stained progesterone receptor or the stained Ki67 protein relative to the total number of cancer cells is not particularly limited, but can be visually determined using a microscope of 400 magnification.
  • the low risk group has a judgment value of the recurrence score (RS) of the conventional oncotype Dx of 0 or more and 30 or less, preferably, 0 or more and 24 or less, more preferably 0 or more and 18 or less.
  • RS recurrence score
  • immunohistochemical staining refers to immunohistochemical staining (immunohistochemical staining), which stains using an antibody labeled with a specific substance in tissues or cells using an antigen-antibody reaction, and more specifically, in cells
  • Label markers are used for enzymes or fluorescent substances to visually confirm the presence or absence of a specific substance.
  • a primary antibody specific for a detection target and labeled or unlabeled is used, and a secondary antibody or polymer capable of binding to the primary antibody and bound with a label marker is used. Thereafter, the presence and intensity of the label marker may be measured to determine the presence and amount of a substance to be detected.
  • a progesterone receptor (PR) or a primary enzyme specific for Ki67 protein and a fluorescent substance or a secondary antibody or polymer labeled with an enzyme can be performed.
  • a Ventana XT device (Bentana Japan, Tokyo, Japan) may be used for immunostaining the progesterone receptor, but is not limited thereto.
  • Abcam Massachusetts, USA
  • Ki67 protein antibodies may be used, but are not limited thereto, and any antibody specific to progesterone receptors and antibodies specific to Ki67 protein that can be used in immunohistochemical staining in the art may be used without limitation.
  • the "Allred score” is a score system showing how strongly the hormone receptor, the progesterone receptor in the present invention is expressed in breast cancer tissue (see Harvey et al. Journal of Clinical Oncology, 17, 1474 [1999]),
  • the staining intensity (scores 0 to 3) and the stained ratio (scores 0 to 5) are quantified and these are summed and expressed as a total score.
  • the evaluation criteria of the staining intensity score and the staining ratio score are as follows:
  • 0 0% stained cancer cell
  • 1 ratio of stained cancer cells greater than 0 and less than 1%
  • 2 1-10% stained cancer cells
  • 3 11-33% of cancer cells stained
  • 4 34-66% of cancer cells stained
  • the 'stained cell ratio' refers to the number of cancer cells including the progesterone receptor stained relative to the total number of cancer cells in the sample as a result of progesterone receptor immunohistochemical staining.
  • Breast cancer prognosis and anticancer chemotherapy determination device and method of the present invention can be performed at a lower cost than the conventional breast cancer prognosis and anticancer chemotherapy determination method, but relatively high accuracy and prognosis and chemotherapy of breast cancer Standardized indicators can be provided in judging their use, which in turn can contribute to improving public health.
  • FIG. 2 shows the ratio of the number of cancer cells including the stained Ki67 protein to the total number of cancer cells by immunostaining the Ki67 protein in Experimental Example 1 X-axis, cancer cells containing the stained progesterone receptor to the total number of cancer cells as a result of immunostaining of the progesterone receptor After the ratio of the number is set to the Y axis, the notation is displayed in a graph according to the oncotype Dx RS range.
  • Figure 3a shows a photograph of the immunostaining results with a 400x microscope for any spot except for hot spots after Ki67 immunostaining for breast tissue samples collected from breast cancer patients in Experimental Example 1.
  • Figure 3b shows a photograph of the immunostaining results with a 400x microscope for hot spots with the highest immunostaining index after Ki67 for breast tissue samples taken from breast cancer patients in Experimental Example 1.
  • Figure 4 shows the ratio of the number of cancer cells including the Ki67 protein stained to the total number of cancer cells to the hot spot after Ki67 protein immunostaining in Experimental Example 1 X-axis, the result of immunostaining of the progesterone receptor stained progesterone receptor compared to the total number of cancer cells After determining the ratio of the number of cancer cells included in the Y-axis, it is shown in the graph by changing the notation according to the oncotype Dx RS range.
  • 5A and 5B are 20% or less of the number of cancer cells stained as a result of immunostaining of the progesterone receptor in FIG. 4 and less than 10% of the number of cancer cells stained as a result of Ki67 immunostaining.
  • the patient was photographed by immunoassay with a 400x microscope after Ki67 immunostaining.
  • the cancer cells were Ki67 stained.
  • the immune cells were stained rather than the cancer cells.
  • Figure 6 shows the results of performing the ROC analysis on the classification result by the method of the present invention in Experimental Example 1.
  • FIG. 7 is a graph comparing the classification result according to the method of the present invention and the TAILORx-based oncotype Dx classification result in order to predict the effect of the classification result according to the method of the present invention in Experimental Example 1.
  • FIG. 8 is a graph comparing the classification result according to the method of the present invention and the oncotype Dx classification result in order to predict the effect of the classification result according to the method of the present invention in Experimental Example 1.
  • FIG. 10 shows the ratio of the number of cancer cells including Ki67 protein stained to the total number of cancer cells by immunostaining Ki67 protein against hot spots in Experimental Example 2 in the X axis and Allred scores according to the immunostaining results of the progesterone receptor. After the determination, the notation is shown in a graph according to the oncotype Dx RS range.
  • Figure 11 shows the results of performing the ROC analysis on the classification result by the method of the present invention in Experimental Example 2.
  • FIG. 12 is a graph comparing the classification result according to the method of the present invention and the TAILORx-based oncotype Dx classification result in order to predict the effect of the classification result according to the method of the present invention in Experimental Example 2.
  • FIG. 13 is a graph comparing the classification result according to the method of the present invention and the oncotype Dx classification result in order to predict the effect of the classification result according to the method of the present invention in Experimental Example 2 in the clinical example.
  • Figure 16 shows the results of performing the ROC analysis on the classification result by the method of the present invention in Experimental Example 3.
  • FIG. 17 is a graph comparing the classification result according to the method of the present invention and the TAILORx-based oncotype Dx classification result in order to predict the effect of the classification result according to the method of the present invention in Experimental Example 3 in the clinical example.
  • FIG. 18 is a graph comparing the classification result according to the method of the present invention and the oncotype Dx classification result in order to predict the effect of the classification result according to the method of the present invention in Experimental Example 3 in the clinical example.
  • Type Dx RS is a graph with different notation depending on the range.
  • Figure 21 shows the results of performing the ROC analysis on the classification result by the method of the present invention in Experimental Example 4.
  • FIG. 22 is a graph comparing the classification result according to the method of the present invention and the TAILORx-based oncotype Dx classification result in order to predict the effect of the classification result according to the method of the present invention in Experimental Example 4.
  • FIG. 23 is a graph comparing the classification result according to the method of the present invention and the oncotype Dx classification result in order to predict the effect of the classification result according to the method of the present invention in Experimental Example 4 in the clinical example.
  • FIG. 24 shows, in Comparative Example 1, the ratio of the number of cancer cells including the stained Ki67 protein to the total number of cancer cells in accordance with the subjective judgment of the pathologist without immunostaining the Ki67 protein of the patient and performing image analysis on the X-axis, progesterone receptor.
  • the ratio of all cancer cells including the progesterone receptor stained to the total number of cancer cells as a result of immunostaining of the progesterone receptor, or the allred score, and the total number of cancer cells as a result of immunostaining of the Ki67 protein are stained.
  • an apparatus and method for determining the prognosis and use of chemotherapy for breast cancer wherein the risk of recurrence is determined according to the ratio of the number of cancer cells containing Ki67 protein.
  • the X-axis (at least three 400x fields is analyzed for the ratio (%) of the number of cancer cells including Ki67 protein stained to the total number of cancer cells by immunostaining Ki67 protein in the breast tissue sample taken from the breast cancer patient. ), And the percentage of cancer cells including the stained progesterone receptor to the total number of cancer cells by immunostaining the progesterone receptor is determined on the Y axis, and the notation is changed according to the oncotype Dx Recurrence Score (RS) range of the patient. 2 is shown graphically.
  • RS oncotype Dx Recurrence Score
  • progesterone immunostaining resulted in a ratio of cancer cells including stained progesterone to total cancer cell number exceeding 20%, and Ki67 protein stained to total cancer cell numbers by immunostaining Ki67 protein.
  • proportion of cancer cells is less than 20%, all of them except the intermediate risk group ( ⁇ ) can be seen to belong to the RS low risk group.
  • Ki67 protein was immunostained to the breast tissue sample taken from the patient, and the area with the highest staining index was observed under a 400x microscope to select a circular area having a radius of approximately 400 to 650 ⁇ m as a hot spot.
  • a photograph of an arbitrary portion except for a hot spot under a 400 magnification microscope (a circular region having a radius of 400 to 650 ⁇ m) is shown in FIG. 3A, and a photograph of the hot spot observed with the 400 magnification microscope is shown in FIG. It is shown in Figure 3 (b).
  • the ratio of the number of cancer cells containing the stained Ki67 protein to the total number of cancer cells (%) is the X axis, the ratio of the number of cancer cells including the stained progesterone receptor to the total number of cancer cells (%) as the Y axis 4 and the notation according to the oncotype Dx RS range of the breast cancer patient.
  • the progesterone immunostaining result shows that the ratio of cancer cells including stained progesterone to total cancer cell number is 20% or less, and Ki67 protein is immunostained to include the total number of cancer cells in hot spots. If the proportion of cancer cells is less than 10%, most of them belong to the RS low risk group.
  • the pathological slide review showed a severe lymphoid infiltrate. It was a case. That is, as shown in (a) of FIG. 5, the cancer cells have very low Ki67 staining, but as shown in FIG. 5 (b), many lymphocytes are stained in the surrounding lymphocytic infiltration. In other words, the RS value appears to be incorrectly represented as a high risk group.
  • the prognosis of a breast cancer patient can be predicted with a very simple method or with high accuracy, and in particular, when progesterone immunostaining indicates that the percentage of cancer cells stained is 20% or less, a hot spot is selected and analyzed. It can be seen that the accuracy can be further increased.
  • the sensitivity is 90.0%
  • the specificity 88.46% can be classified as medium or high risk patients.
  • TAILORx-based oncotype Dx classification Sum Less than RS 11 RS 11 or more 18 or less RS 18 over 24 or less RS 24 over 30 or less RS 30 over Low risk group 8 (32%) 15 (60%) 1 (4%) 1 (4%) 0 25 (54.3%) Medium to High Risk 0 3 (14.3%) 7 (33.3%) 8 (38.1%) 3 (14.3%) 21 (45.7%) Sum 8 (17.4%) 18 (39.1%) 8 (17.4%) 9 (19.6%) 3 (6.5%) 46
  • the area of highest staining index was observed under a 400x microscope to select a circular area having a radius of approximately 400 to 650 ⁇ m as a hot spot. It was.
  • the percentage of cancer cells containing the stained Ki67 protein relative to the total number of cancer cells with respect to the hot spots was determined by the X axis and the Allred score according to the immunostaining results of the progesterone receptor on the Y axis, and the patient's oncotype Dx
  • the graph is shown in FIG. 10 with different notations depending on the RS range.
  • the Allred score according to the immunostaining result of the progesterone receptor is less than 5, and the ratio of the number of cancer cells including the Ki67 protein stained to the total number of cancer cells in the hot spot by immunostaining the Ki67 protein is less than 10%. In most cases, it can be seen that most belong to the RS low risk group.
  • the prognosis of the breast cancer patient can be predicted by a very simple method or high accuracy using the Allred score and the immunostaining result of Ki67 protein.In particular, when the Allred score is less than 5, the hot spot is selected. If you analyze, you can see that the accuracy can be increased.
  • Classification according to the invention TAILORx-based oncotype Dx classification Sum Less than RS 11 RS 11 or more 18 or less RS 18 over 24 or less RS 24 over 30 or less RS 30 over Low risk group 8 (27.6%) 16 (55.2%) 2 (6.9%) 3 (10.3%) 0 29 (63%) Medium to High Risk 0 2 (11.8%) 6 (35.3%) 6 (35.3%) 3 (17.6%) 17 (37%) Sum 8 (17.4%) 18 (39.1%) 8 (17.4%) 9 (19.6%) 3 (6.5%) 46
  • the prognosis method of the present invention was further performed in 65 patients who were oncotype among patients treated in Gangnam Severance Hospital.
  • image analysis of progesterone and Ki67 immunostaining results from breast tissue samples from 65 patients was performed using the Image J program and the ImmunoRatio plug in.
  • the percentage of cancer cells containing Ki67 protein stained relative to the total number of cancer cells by immunostaining Ki67 protein is expressed by X-axis and progesterone receptor by immunostaining.
  • the ratio of the number of cancer cells including the stained progesterone receptor to the number of cancer cells is determined on the Y axis, and the graph is shown in FIG. 14 by changing the notation according to the oncotype Dx RS range of the patient.
  • progesterone immunostaining resulted in a ratio of cancer cells including stained progesterone to total cancer cell number exceeding 20%. Ki67 protein was immunostained to include the total number of cancer cells. If the proportion of cancer cells to be less than 20%, all can be seen to belong to the RS low risk group.
  • the area of highest staining index was observed under a 400x microscope to select a circular area having a radius of approximately 400 to 650 ⁇ m as a hot spot. It was.
  • the ratio of the number of cancer cells including the stained Ki67 protein to the total number of cancer cells with respect to the hot spots is determined by the X axis and the ratio of the number of cancer cells including the stained progesterone receptor to the total number of cancer cells as the Y axis.
  • the notation is changed according to the oncotype Dx RS range of the patient and is graphically shown in FIG. 15.
  • the progesterone immunostaining result shows that the ratio of cancer cells including stained progesterone to total cancer cells is 20% or less, and the number of cancer cells including Ki67 protein stained to total cancer cells by immunostaining Ki67 protein. If the ratio is less than 10%, it can be seen that most belong to the RS low risk group.
  • TAILORx-based oncotype Dx classification Sum Less than RS 11 RS 11 or more 18 or less RS 18 over 24 or less RS 24 over 30 or less RS 30 over Low risk group 12 (30.8%) 21 (53.8%) 5 (12.8%) 1 (2.6%) 0 39 (60.0%) Medium to High Risk 1 (3.8%) 4 (15.4%) 11 (42.3%) 2 (7.7%) 8 (30.8%) 26 (40.0%) Sum 13 (20%) 25 (38.5%) 16 (24.6%) 3 (4.6%) 8 (12.3%) 65
  • the Allred score according to the immunostaining result of the progesterone receptor is 5 or more, and the percentage of cancer cells containing Ki67 protein (%) compared to the total number of cancer cells by immunostaining Ki67 protein is 20%. If less, it can be seen that most belong to the RS low risk group.
  • the area of highest staining index was observed under a 400x microscope to select a circular area having a radius of approximately 400 to 650 ⁇ m as a hot spot. It was.
  • the ratio of the number of cancer cells containing the stained Ki67 protein to the total number of cancer cells with respect to the hot spots is the X axis, the Allred score according to the immunostaining result of the progesterone receptor, the Y axis, and the oncotype Dx RS range of the breast cancer patient.
  • the graph is shown in FIG.
  • the prognosis of the breast cancer patient can be predicted by a very simple method or high accuracy using the Allred score and the immunostaining result of Ki67 protein.In particular, when the Allred score is less than 5, the hot spot is selected. If you analyze, you can see that the accuracy can be increased.
  • Classification according to the invention TAILORx-based oncotype Dx classification Sum Less than RS 11 RS 11 or more 18 or less RS 18 over 24 or less RS 24 over 30 or less RS 30 over Low risk group 12 (32.4%) 20 (54.1%) 5 (13.5%) 0 0 37 (56.9%) Medium to High Risk 1 (3.6%) 5 (17.9%) 11 (39.3%) 3 (10.7%) 8 (28.6%) 28 (43.1%) Sum 13 (20%) 25 (38.5%) 16 (24.6%) 3 (4.6%) 8 (12.3%) 65
  • the present invention relates to a device and method for determining the prognosis of chemotherapy and the use of chemotherapy, and more particularly, to determine the anticancer treatment direction of breast cancer using immunostaining results of progesterone receptors and immunostaining results of Ki67 protein.
  • the present invention relates to a device and a method for predicting the prognosis and the effects of chemotherapy.

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Abstract

본 발명은 유방암의 예후 및 항암화학요법 치료 여부의 판단 장치 및 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 프로게스테론 수용체 면역 염색 결과와 Ki67 단백질의 면역 염색 결과를 이용하여 유방암의 항암 치료 방향을 결정함에 있어서 필요한 예후 및 항암화학요법 치료 효과를 예측할 수 있는 장치 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 유방암 예후 판단 방법은 종래의 유방암 예후 판단 방법에 비하여 저렴한 비용으로 수행할 수 있으면서도, 비교적 정확도가 높아 유방암의 예후 및 항암화학요법 치료 효과를 예측함에 있어 표준화된 지표를 제공할 수 있어, 최종적으로는 국민 건강 복지를 높이는 데에 이바지할 수 있다.

Description

유방암의 예후 및 항암화학요법 사용 여부 판단 장치 및 방법
본 발명은 유방암의 예후 및 항암화학요법 사용 여부 판단 장치 및 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 프로게스테론 수용체의 면역 염색 결과와 Ki67 단백질의 면역 염색 결과를 이용하여 유방암의 항암 치료 방향을 결정함에 있어서 필요한 예후 및 항암화학요법의 효과를 예측할 수 있는 장치 및 방법에 관한 것이다.
유방암 환자의 절반 정도를 차지하는 액와임프선 전이가 없는 에스트로겐 호르몬 수용체 양성 (ER+) 유방암은 5년 항호르몬 치료만으로도 10년 재발율이 15%이며, 항암화학요법을 더할 경우 10년 재발율의 절대값이 약 5% 정도로 감소된다(Fisher et al, Lancet. 10;364(9437):858-68, PMID: 15351193). 하지만 2004년 온코타입 Dx(Oncotype Dx) 테스트의 개발로 일부 환자에서만 항암화학요법이 필요하다는 사실이 밝혀졌다(Paik et al, J Clin Oncol 24(23):3726-34, PMID: 16720680).
온코타입 Dx가 개발된후에 Mammaprint, Endopredict, Breast Cancer Index, Prosigna 등 전사 유전자 분석에 근거한 유방암 예후 예측 테스트가 많이 개발 및 상용화 되었지만, 항암화학요법 사용 여부를 결정하는 임상 적용성이 증명된 테스트는 온코타입 Dx 뿐이다(Paik et al, J Clin Oncol 24(23):3726-34, PMID: 16720680).
메타 분석에 의하면 온코타입 Dx 나 Mammaprint와 같은 전사 유전자 분석에 근거한 유방암 예후예측 테스트들은 모두 ER+ 유방암 중 증식 속도가 낮은 유방암을 예후가 좋은 암으로 분류해준다는 것이 밝혀졌기 때문에 이론적으로는 증식 속도를 측정해주는 모든 테스트가 온코타입 Dx 와 상호 대체 가능하다고 할 수 있다 (Wirapati et al, Breast Cancer Research. 2008;10(4):R65. doi: 10.1186/bcr2124. PMID: 18662380).
하지만 실제 상황에서는 개개의 환자에 대한 임상 적용 시엔 각 테스트 마다 유전자 발현 분석방법이 서로 다르며, 전체 전사 유전체를 분석하는 것이 아니고 특정 유전자만 분석하기 때문에, 샘플 내 대조 유전자의 발현량으로 정규화 단계를 거치게 되므로 메타 분석과는 다른 결과를 보이며 온코타입 Dx 와 일치율이 낮다. 한 예로 EndoPredict의 경우 온코타입 Dx 위험군 분류와 일치율이 76% 에 해당하였다 (Varga et al, PLoS One. 2013;8(3):e58483, PMID: 23505515). 그럼에도 불구하고, 상기 여러 전사 유전자 테스트들은 국내를 비롯한 전세계 여러 국가에서 이미 임상에 사용되고 있으며 온코타입 Dx 와 마찬가지로 고가라는 문제점을 안고 있다.
따라서 본 발명의 발명자들은 증식관련 대표 단백질인 Ki67 단백질을 이용하여 저렴한 방법으로 온코타입 Dx 위험군 분류를 75% 이상의 정확도로 예측할 수 있는 유방암 예후 및 항암화학요법 사용 여부 판단 장치 및 방법을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다.
본 발명의 일 목적은 저렴하면서도 온코타입 Dx 위험군 분류와의 일치율이 75% 이상의 높은 정확도로 유방암의 예후 및 항암화학요법 사용 여부를 판단할 수 있는 장치를 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 저렴하면서도 온코타입 Dx 위험군 분류와의 일치율이 75% 이상의 높은 정확도로 유방암의 예후 및 항암화학요법 사용 여부를 판단할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
종래에는 유방암 환자의 후속적인 항암 치료 방법을 선택하기 위한 예후 판단 방법으로 온코타입 Dx(Oncotype Dx) 테스트가 제안되었으나, 검사 비용이 매우 비싸 극히 일부 환자에만 적용되고 있어 문제가 되었다.
상기한 온코타입 Dx는 21개 유전자의 발현량을 역전사 중합효소 연쇄반응 방법으로 측정하여 1에서 100 사이의 예후 재발율(Recurrence Score, RS)의 결과 값을 보고한다. RS 18 미만은 저위험군으로 분류되어 항암화학요법을 사용하지 않고 호르몬 요법만으로 치료하여도 10년 재발율이 10% 미만이라고 검증되었다. 반면에 RS 30 초과인 고위험군은 재발율이 매우 높은 대신 항암제의 치료 효과가 매우 크다는 것이 검증되었다. RS 18 이상 30 이하의 중간위험군은 항암 효과가 적거나 없고, 재발율은 10% 이상이므로 아직 뚜렷한 치료 방향이 없다(Paik et al, J Clin Oncol 24(23):3726-34, PMID: 16720680). 이러한 중간 위험군은 보통 환자에게 치료방향의 선택을 주며 약 절반 정도의 환자가 항암제 치료를 선택한다고 알려져 있으며 앞으로 TAILORx(the Trial Assigning IndividuaLized Options for Treatment Rx) 임상 시험의 결과에 따라 치료 방향이 결정될 예정이다(Sparano et al N Engl J Med. 2015 Sep 27. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 26412349).
TAILORx 임상 시험에서는 RS 11 미만인 경우 저위험군으로 분류하며 항암화학요법을 사용하지 않았고, RS 11 이상 25 미만인 경우 중간위험군으로 분류하여 무작위 임상 시험을 진행하였으며, RS 25 이상인 경우 고위험군으로 분류하여 항암화학요법을 사용하였다. 중간위험군의 임상 시험 결과는 아직 보고된 바 없으나, 최근 New England Journal of Medicine에서 RS 11 미만의 저위험군 환자의 경우 항호르몬 치료만으로도 예후가 매우 좋았다는 결과가 발표된 바 있다(Sparano et al, N Engl J Med. 2015 Sep 27. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 26412349). 따라서 온코타입 Dx의 예후 재발율의 값을 하기 표 1과 같이 분류화하는 것이 임상적으로 매우 의미가 있다.
온코타입 Dx 예후 재발율(RS) TAILORx 기반 위험군 분류 치료 방법
< 11 1. TAILORx 저위험군 항암화학요법은 사용하지 않음
11 ~ 17 2. 저위험군 (TAILORx 중간 위험군)
18 ~ 24 3. TAILORx 중간 위험군 TAILORx 결과를 기다리며 선택적 항암화학요법
25 ~ 30 4. 중간위험군 ( TAILORx 고위험군) 항암화학요법
> 30 5. 고위험군
온코타입 Dx는 현재 미국, 아일랜드, 이스라엘 등 선진 국가에서는 이미 국가 보험으로 시행하고 있어 연 7만명의 환자에게 적용되고 있으나, 국내에서는 보험 대상이 아니어서, 검사 비용이 400만원 이상 들어 매우 비싸기 때문에 극히 일부 환자에만 적용되고 있다.
한편, 온코타입 Dx 21개 유전자 중 가장 중요한 유전자들은 에스트로겐 수용체 그룹(estrogen receptor group) 유전자인 ESR1, PGR, BCL2, SCUBE2와 증식 그룹(proliferation group) 유전자인 MKI67, STK15, Survivin, CCNB1, MYBL2이다(Paik et al, N Eng J Med, 351(27):2817-26, PMID 15591335). 따라서 상기 에스트로겐 수용체 그룹을 대표하는 프로게스테론 수용체(Progesterone receptor)와 증식 그룹을 대표하는 MKI67, 즉 Ki67 단백질을 면역 염색으로 대체할 수 있는 가능성이 있으며 많은 연구자들이 이를 시도하고 논문을 발표하였으나, 아직 Ki67이 NSABP B-20 임상시험에서 항암화학요법 치료 효과를 예측할 수 있다는 검증은 되지 않았다.
항암화학요법 치료 효과를 예측할 수 있다는 것이 검증된 유일한 마커인 온코타입 Dx 결과를 Ki67 단백질을 이용하여 예측할 수 있다면, Ki67 단백질의 임상 적용이 가능하다. 그러나 현재 Ki67 단백질을 이용하여 온코타입 Dx 결과를 정확히 예측할 수 없는 가장 큰 이유는 면역 염색 결과의 판단이 표준화되어 있지 않기 때문이다. 최근 6곳의 유명 암 병원에서 같은 환자의 조직을 가지고 링스터디를 시행하여 그 중 두 병원에서 병리 의사가 현미경을 육안으로 보고 판단한 결과의 관계도를 도 1에 그래프로 나타내었는데, 도 1에서 보는 바와 같이 판단 결과가 서로 일치하지 않는 것을 볼 수 있다(Polley et al, J Natl Cancer Inst. 2013 Dec 18;105(24):1897-906. doi: 10.1093/jnci/djt306. Epub 2013 Nov 7. PubMed PMID:24203987).
이러한 제한에도 불구하고 일부 연구자들은 Ki67 단백질을 포함한 여러 마커를 이용해 온코타입 Dx 결과를 예측하는 알고리즘을 만들려는 시도를 하였지만 임상에 적용하기에는 정확도가 너무 낮았다. 가령 Allison 등은 트리형 분류 분석을 통해 온코타입 Dx 결과를 32% 정도 예측할 수 있었다(Allison et al, Breast Cancer Res Treat, 2012; 131(2):413-24, PMID 21369717). 또한, Kelin 등은 하기 식 (1)과 같은 예후 재발율의 알고리즘을 개발하여 온코타입 Dx 예후 재발율을 예측하려는 시도를 하였지만, 온코타입 위험 분류와의 일치율이 55% 정도에 불과하였다(Klein et al, Modern Pathology 2013; 26(5):658-64, PMID:23503643).
[식 (1)]
Recurrence score=15.31385+Nottingham score*1.4055+ERIHC*(0.01924)+PRIHC*(0.02925)+(0 for HER2 negative, 0.77681 for equivocal, 11.58134 for HER2 positive)+tumor size*0.78677+Ki-67 index*0.13269
이에 본 발명의 발명자들은 프로게스테론 수용체의 면역 염색 결과와 Ki67 단백질의 면역 염색 결과를 이용하는 경우 매우 간단하고 저렴한 방법을 통해 온코타입 Dx 결과 및 유방암의 예후를 높은 정확도로 예측할 수 있음을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다.
즉, 본 발명은 환자로부터 유방 조직 샘플을 추출한 뒤, 프로게스테론 수용체의 면역 염색 결과 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론 수용체를 포함하는 암세포 수의 비율 또는 Allred 스코어와, Ki67 단백질의 면역 염색 결과 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포의 수의 비율에 따라 재발율의 위험도를 판단하는 것을 특징으로 하는 유방암의 예후 및 항암화학요법 사용 여부 판단 장치 및 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 일 구현 예에 따르면, 유방암 환자로부터 추출한 유방 조직 샘플의 프로게스테론 수용체의 면역 염색 결과 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론 수용체를 포함하는 암세포 수의 비율(%) 또는 Allred 스코어를 입력받기 위한 제1 입력부;
Ki67 단백질을 면역 염색 결과 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율(%)을 입력받기 위한 제2 입력부;
상기 제1 입력부에서 입력된 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론 수용체를 포함하는 암세포 수의 비율이 20% 초과이거나 Allred 스코어가 5 이상이고, 제2 입력부에서 입력된 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율이 20% 미만인 경우 저위험군으로 분류하기 위한 분류 연산부; 및
상기 분류 연산부의 분석 결과를 출력하기 위한 출력부를 포함하는 유방암의 예후 및 항암화학요법 사용 여부 판단 장치를 제공한다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면 유방암 환자로부터 추출한 유방 조직 샘플의 프로게스테론 수용체의 면역 염색 결과 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론 수용체를 포함하는 암세포 수의 비율(%) 또는 Allred 스코어를 입력받기 위한 제1 입력부;
Ki67 단백질을 면역 염색 결과 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율(%)을 입력받기 위한 제2 입력부;
상기 제1 입력부에서 입력된 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론 수용체를 포함하는 암세포 수의 비율이 20% 이하이거나 Allred 스코어가 5 미만이고, 제2 입력부에서 입력된 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율이 10% 미만인 경우 저위험군으로 분류하기 위한 분류 연산부; 및
상기 분류 연산부의 분석 결과를 출력하기 위한 출력부를 포함하는 유방암의 예후 및 항암화학요법 사용 여부 판단 장치를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 유방암 환자로부터 추출한 유방 조직 샘플에 대하여 프로게스테론 수용체의 면역 염색한 결과, 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론 수용체를 포함하는 암세포 수의 비율이 20% 초과이거나 Allred 스코어가 5 이상이고;
Ki67 단백질을 면역 염색한 결과, 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율이 20% 미만인 경우, 저위험군으로 분류하는 것을 특징으로 하는 유방암의 예후 및 항암화학요법 사용 여부를 판단하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 유방암 환자로부터 추출한 유방 조직 샘플에 대하여 프로게스테론 수용체의 면역 염색한 결과, 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론 수용체를 포함하는 세포 수의 비율이 20% 이하이거나 Allred 스코어가 5 미만이고;
Ki67 단백질을 면역 염색한 결과, 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율이 10% 미만인 경우, 저위험군으로 분류하는 것을 특징으로 하는 유방암의 예후 및 항암화학요법 사용 여부를 판단하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 한 구현 예에 따르면, 유방암 환자로부터 추출한 유방 조직 샘플에 대하여 프로게스테론 수용체의 면역 염색 결과 또는 Ki67 단백질 면역 염색 결과 염색 지수가 가장 높은 부위(hot spot)에 대하여 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론 수용체 또는 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율을 측정하거나 Allred 스코어를 측정함으로써 위험군 분류의 정확도를 높일 수 있다.
보다 바람직하게는 유방암 환자로부터 추출한 유방 조직 샘플에 대하여 프로게스테론 수용체의 면역 염색한 결과, 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론 수용체를 포함하는 세포 수의 비율이 20% 이하이거나 Allred 스코어가 5 미만인 경우, Ki67 단백질 면역 염색 결과 염색 지수가 가장 높은 부위(hot spot)에 대하여 전체 암세포 수 대비 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율을 측정할 수 있다.
여기서, 상기 염색 지수가 가장 높은 부위, 즉 핫 스팟(hot spot)의 모양 또는 면적의 넓이는 제한하지는 않으나, 예를 들면 반경이 400~650㎛인 원형의 부위일 수 있다.
본 발명에서, 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론 수용체 또는 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포의 수를 확인하는 방법은 특별히 제한하지는 않으나, 예를 들면 400 배율의 현미경을 이용하여 육안으로 판별할 수 있다.
또한, 상기 저위험군은 종래의 온코타입 Dx에 따른 예후 재발율(Recurrence Score, RS)의 판단 값이 0 이상 30 이하, 바람직하게는, 0 이상 24 이하, 보다 바람직하게는 0 이상 18 이하에 해당하는 군을 의미할 수 있다.
본 발명에서 상기 "면역 염색"이란 항원-항체 반응을 이용하여 조직, 세포 내의 특정 물질을 표지한 항체를 사용하여 염색하는 면역 조직 화학 염색(immunohistochemical staining)을 의미하는 것으로, 보다 상세하게는 세포 내 특정 물질의 존재 유무를 시각적으로 확인할 수 있도록 효소 또는 형광 물질 등을 표지 마커를 이용한다. 우선, 검출 대상에 대하여 특이적이며 표지 또는 비표지된 1차 항체를 사용하고, 상기 1차 항체에 대하여 결합할 수 있으며 표지 마커가 결합된 2차 항체 또는 폴리머를 사용한다. 이후, 상기 표지 마커의 존재 유무 및 강도를 측정하여 검출 대상이 되는 물질의 존재 유무 및 그 양을 측정할 수 있다. 본 발명에서는 프로게스테론 수용체(progesterone receptor, PR) 또는 Ki67 단백질에 특이적인 1차 효소와 형광 물질 또는 효소로 표지된 2차 항체 또는 폴리머를 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 상기 프로게스테론 수용체의 면역 염색에는 벤타나 XT 장치(벤타나 재팬, 도쿄, 일본)를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, Ki67 단백질의 면역 염색에는 Abcam (메사추세츠, 미국) 사 항-Ki67 단백질 항체를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당해 기술분야에서 면역 조직 화학 염색 시 사용할 수 있는 프로게스테론 수용체에 특이적인 항체 및 Ki67 단백질에 특이적인 항체라면 제한없이 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 "Allred 스코어"란 유방암 조직에서 호르몬 수용체, 본 발명에서는 프로게스테론 수용체가 얼마나 강하게 나타나는 지 보여주는 점수체계로(Harvey et al. Journal of Clinical Oncology, 17, 1474[1999] 참고), 보다 상세하게는 프로게스테론 수용체의 면역 조직 화학 염색 후 염색 강도(스코어 0 내지 3)와 염색된 비율(스코어 0 내지 5)을 수치화한 뒤 이들을 더하여 총 스코어로 표기한다. 염색 강도 스코어와 염색 비율 스코어의 평가 기준은 다음과 같다:
(1) 염색 강도 스코어
0: 음성(negative); 1: 약함(weak); 2: 중간(intermediate); 3: 강함(strong)
(2) 염색 비율 스코어
0: 염색된 암세포 비율 0%; 1: 염색된 암세포 비율 0 초과 1% 이하; 2: 염색된 암세포 비율 1 내지 10%; 3: 염색된 암세포 비율 11 내지 33%; 4: 염색된 암세포 비율 34 내지 66%; 5: 염색된 암세포 비율 67 내지 100%
(단, 상기 '염색된 세포 비율'이란 프로게스테론 수용체 면역 조직 화학 염색 결과 시료 내 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론 수용체를 포함하는 암세포 수를 의미한다.)
본 발명의 유방암 예후 및 항암화학요법 사용 여부 판단 장치 및 방법은 종래의 유방암 예후 판단 및 항암화학요법 사용 여부 판단 방법에 비하여 저렴한 비용으로 수행할 수 있으면서도, 비교적 정확도가 높아 유방암의 예후 및 항암화학요법 사용 여부를 판단함에 있어 표준화된 지표를 제공할 수 있어, 최종적으로는 국민 건강 복지를 높이는 데에 이바지할 수 있다.
도 1은 Polley 등의 논문에서 발췌한 그림으로 임의의 두 병원에서 병리 의사가 Ki67 면역 염색 결과를 현미경을 통해 육안으로 판단한 결과의 관계도를 그래프로 나타낸 것이다 (Polley et al, J Natl Cancer Inst. 2013 Dec 18;105(24):1897-906. doi: 10.1093/jnci/djt306. Epub 2013 Nov 7. PubMed PMID:24203987).
도 2는 실험예 1에서 Ki67 단백질을 면역 염색하여 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율을 X 축, 프로게스테론 수용체의 면역 염색 결과 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론 수용체를 포함하는 암세포 수의 비율을 Y 축으로 정한 뒤, 온코타입 Dx RS 범위에 따라 표기를 달리하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 3a는 실험예 1에서 유방암 환자로부터 채취한 유방 조직 샘플에 대하여 Ki67 면역 염색 후 핫 스팟을 제외한 임의의 스팟에 대하여 400배율 현미경으로 면역 염색 결과를 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 3b는 실험예 1에서 유방암 환자로부터 채취한 유방 조직 샘플에 대하여 Ki67 면역 염색 후 면역 염색 지수가 가장 높은 핫 스팟에 대하여 400배율 현미경으로 면역 염색 결과를 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 4는 실험예 1에서 Ki67 단백질 면역 염색 후 핫 스팟에 대하여 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율을 X 축, 프로게스테론 수용체의 면역 염색 결과 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론 수용체를 포함하는 암세포 수의 비율을 Y 축으로 정한 뒤, 온코타입 Dx RS 범위에 따라 표기를 달리하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 5a 및 도 5b는 상기 도 4에서 프로게스테론 수용체의 면역 염색 결과 염색된 암세포 수의 비율을 20% 이하이고, Ki67 면역 염색 결과 염색된 암세포 수의 비율이 10% 미만이나, ▲점으로 표시된 한 명의 환자에 대하여 Ki67 면역 염색 후 400배율 현미경으로 면역 염색 결과를 관찰한 사진을 나타낸 것이다. 도 5a에서는 암세포가 Ki67 염색이 되었으나, 도 5b에서는 암세포가 아닌 면역 세포들이 염색되었다.
도 6은 실험예 1에서 본 발명의 방법에 의한 분류 결과에 대하여 ROC 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 실험예 1에서 본 발명의 방법에 의한 분류 결과가 임상에 미치는 영향을 예측하기 위하여, 본 발명의 방법에 의한 분류 결과와 TAILORx 기반 온코타입 Dx 분류 결과를 대비하여 도표로 나타낸 것이다.
도 8은 실험예 1에서 본 발명의 방법에 의한 분류 결과가 임상에 미치는 영향을 예측하기 위하여, 본 발명의 방법에 의한 분류 결과와 온코타입 Dx 분류 결과를 대비하여 도표로 나타낸 것이다.
도 9는 실험예 2에서 Ki67 단백질을 면역 염색하여 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율을 X 축, 프로게스테론 수용체의 면역 염색 결과에 따른 Allred 스코어를 Y 축으로 정한 뒤, 온코타입 Dx RS 범위에 따라 표기를 달리하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 실험예 2에서 핫 스팟에 대하여 Ki67 단백질을 면역 염색하여 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율을 X 축, 프로게스테론 수용체의 면역 염색 결과에 따른 Allred 스코어는 Y 축으로 정한 뒤, 온코타입 Dx RS 범위에 따라 표기를 달리하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 11은 실험예 2에서 본 발명의 방법에 의한 분류 결과에 대하여 ROC 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 실험예 2에서 본 발명의 방법에 의한 분류 결과가 임상에 미치는 영향을 예측하기 위하여, 본 발명의 방법에 의한 분류 결과와 TAILORx 기반 온코타입 Dx 분류 결과를 대비하여 도표로 나타낸 것이다.
도 13은 실험예 2에서 본 발명의 방법에 의한 분류 결과가 임상에 미치는 영향을 예측하기 위하여, 본 발명의 방법에 의한 분류 결과와 온코타입 Dx 분류 결과를 대비하여 도표로 나타낸 것이다.
도 14는 실험예 3에서 Ki67 단백질을 면역 염색하여 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율을 X 축, 프로게스테론 수용체의 면역 염색 결과 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론 수용체를 포함하는 암세포 수의 비율을 Y 축으로 정한 뒤, 온코타입 Dx RS 범위에 따라 표기를 달리하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 15는 실험예 3에서 핫 스팟에 대하여 Ki67 단백질을 면역 염색하여 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율을 X 축, 프로게스테론 수용체의 면역 염색 결과 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론 수용체를 포함하는 세포 수의 비율을 Y 축으로 정한 뒤, 온코타입 Dx RS 범위에 따라 표기를 달리하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 16은 실험예 3에서 본 발명의 방법에 의한 분류 결과에 대하여 ROC 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 실험예 3에서 본 발명의 방법에 의한 분류 결과가 임상에 미치는 영향을 예측하기 위하여, 본 발명의 방법에 의한 분류 결과와 TAILORx 기반 온코타입 Dx 분류 결과를 대비하여 도표로 나타낸 것이다.
도 18은 실험예 3에서 본 발명의 방법에 의한 분류 결과가 임상에 미치는 영향을 예측하기 위하여, 본 발명의 방법에 의한 분류 결과와 온코타입 Dx 분류 결과를 대비하여 도표로 나타낸 것이다.
도 19는 실험예 4에서 Ki67 단백질을 면역 염색하여 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율을 X 축, 프로게스테론 수용체의 면역 염색 결과에 따른 Allred 스코어를 Y 축으로 정한 뒤, 온코타입 Dx RS 범위에 따라 표기를 달리하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 20은 실험예 4에서 핫 스팟에 대하여 Ki67 단백질을 면역 염색하여 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포의 수를 측정한 결과는 X 축, 프로게스테론 수용체의 면역 염색 결과에 따른 Allred 스코어는 Y 축으로 정한 뒤, 온코타입 Dx RS 범위에 따라 표기를 달리하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 21은 실험예 4에서 본 발명의 방법에 의한 분류 결과에 대하여 ROC 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 실험예 4에서 본 발명의 방법에 의한 분류 결과가 임상에 미치는 영향을 예측하기 위하여, 본 발명의 방법에 의한 분류 결과와 TAILORx 기반 온코타입 Dx 분류 결과를 대비하여 도표로 나타낸 것이다.
도 23은 실험예 4에서 본 발명의 방법에 의한 분류 결과가 임상에 미치는 영향을 예측하기 위하여, 본 발명의 방법에 의한 분류 결과와 온코타입 Dx 분류 결과를 대비하여 도표로 나타낸 것이다.
도 24는 비교예 1에서, 환자의 Ki67 단백질을 면역 염색하여 이미지 분석을 수행하지 않고 병리 의사의 주관적 판단에 따라 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율을 X 축, 프로게스테론 수용체의 면역 염색 결과 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론 수용체를 포함하는 암세포 수의 비율을 Y 축으로 정한 뒤, 온코타입 Dx RS 범위에 따라 표기를 달리하여 그래프로 나타낸 것이다.
본 발명은 환자로부터 유방 조직 샘플을 추출한 뒤, 프로게스테론 수용체의 면역 염색 결과 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론 수용체를 포함하는 암세포 수의 비율 또는 Allred 스코어와, Ki67 단백질의 면역 염색 결과 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포의 수의 비율에 따라 재발율의 위험도를 판단하는 것을 특징으로 하는 유방암의 예후 및 항암화학요법 사용 여부 판단 장치 및 방법을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
[실험예 1]
온코타입 Dx를 대체할 저렴한 비용의 테스트를 만들기 위해서 연세 암병원 유방암 센터에서 치료받은 ER+/N- 환자 중 온코타입 Dx를 시행한 46명의 환자군을 대상으로 프로게스테론 및 Ki67 면역 염색 결과에 대한 이미지 분석을 Image J 프로그램(http://imagej.nih.gov)과 ImmunoRatio plug in(Tumoinet et al, Breast Cancer Res. 2010; 12(4):R56)을 이용하여 시행하였다. 단, 본 실험에서 사용된 ImmunoRatio 는 당해 기술분야에 익숙한 통상의 기술자라면 누구나 이해할 수 있는 일반적인 이미지 분석법을 적용한 것으로, 이를 대체할 수 있는 다른 이미지 분석 방법이나 기존 프로그램으로 대체 가능하다.
구체적으로는, 상기 유방암 환자로부터 채취한 유방 조직 샘플에서 Ki67 단백질을 면역 염색하여 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율(%)을 X 축(최소 3개 이상의 400x field를 분석), 그리고 프로게스테론 수용체를 면역 염색하여 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론 수용체를 포함하는 암세포 수의 비율(%)을 Y 축으로 정하고, 환자의 온코타입 Dx RS(Recurrence Score) 범위에 따라 표기를 달리하여 도 2에 그래프로 나타내었다.
도 2에서 보는 바와 같이, 프로게스테론 면역 염색 결과 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론을 포함하는 암세포 수의 비율이 20%를 초과하는 경우이고, Ki67 단백질을 면역 염색하여 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율이 20% 미만인 경우, 중간 위험군 1례(●)를 제외하고는 모두 RS 저위험군에 속하는 것을 볼 수 있다.
또한, 상기 환자로부터 채취한 유방 조직 샘플에 대하여 Ki67 단백질을 면역 염색한 뒤 가장 염색 지수가 높은 부위를 400배율 현미경으로 관찰하여 반경이 대략 400 내지 650㎛인 원형의 부위를 핫 스팟으로 선정하였다. 이때 핫 스팟을 제외한 임의의 부위를 400배율 현미경으로 관찰한 사진(반경이 400~650㎛인 원형 부위)은 도 3의 (a)에 나타내었고, 상기 400배율 현미경으로 관찰한 핫 스팟의 사진은 도 3의 (b)에 나타내었다. 상기 핫 스팟에 있어서, 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율(%)을 X 축, 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론 수용체를 포함하는 암세포 수의 비율(%)을 Y 축으로 정하고, 상기 유방암 환자의 온코타입 Dx RS 범위에 따라 표기를 달리하여 도 4에 그래프로 나타내었다.
도 4에서 보는 바와 같이, 프로게스테론 면역 염색 결과 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론을 포함하는 암세포 수의 비율이 20% 이하이고, Ki67 단백질을 면역 염색하여 핫 스팟에서 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율이 10% 미만인 경우, 대부분이 RS 저위험군에 속하는 것을 볼 수 있다.
다만, 한 명의 환자가 프로게스테론 면역 염색 결과가 20% 이하이고, Ki67 면역 염색 결과가 10% 미만임에도 높은 RS 값을 보였는데(▲), 이 경우 병리 슬라이드 리뷰 결과 림프구성 침윤(lymphoid infiltrate)이 심하게 있는 경우였다. 즉, 도 5의 (a)에서 보는 바와 같이 암세포는 Ki67 염색이 매우 낮은 반면 도 5의 (b)에서 보는 바와 같이 주위의 림프구성 침윤에서 많은 림프구가 염색된 것을 볼 수 있다. 즉, RS 값이 고위험군으로 잘못 나타낸 것으로 보인다.
따라서, 본 발명의 방법에 의하는 경우 매우 간단한 방법이나 높은 정확도로 유방암 환자의 예후를 예측할 수 있고, 특히 프로게스테론 면역 염색 결과 염색된 암세포 수의 비율이 20% 이하인 경우에는 핫 스팟을 선정하여 분석하는 경우 그 정확도를 더욱 높일 수 있음을 알 수 있다.
도 2 및 도 4에 나타낸 이미지 분석을 이용하여 프로게스테론 면역 염색 결과 및 Ki67 면역 염색 결과를 이용한 위험군 분류와 온코타입 Dx 분류 결과를 대비하면 하기 표 2와 같다.
본 발명에 따른 분류 온코타입 Dx 분류 합계
저위험군(RS 18 미만) 중위험군 내지 고위험군(RS 18 이상)
저위험군 23 2 25 (54.3%)
중위험군 내지 고위험군 3 18 21 (45.7%)
합계 26 (56.5%) 20 (43.5%) 46
(p=0.00000082 (Fisher's exact test))
상기 표 2에서 보는 바와 같이, 본 발명의 방법에 의하는 경우 비교적 정확히 항암화학요법이 필요없는 저위험군을 분류할 수 있다. 저위험군이 50% 이상이므로 많은 환자들을 불필요한 항암치료로부터 해방시킬 수 있어 그들을 심리적 불안과 항암치료 부작용에 의한 육체적 부담 및 경제적 부담감을 완화시킬 수 있다.
또한, 상기 결과의 통계적 정확도를 확인하기 위하여 ROC(Receiver-Operating Characteristic analysis) 분석을 추가로 수행하였다. 그 결과는 하기 표 3 및 도 6에 나타내었다.
민감도(Sensitivity) 90.00% 68.30% to 98.77%
특정도(Specificity) 88.46% 69.85% to 97.55%
곡선하 면적(Area Under Curve) 0.89 0.77 to 0.96
양성우도비율(Positive　Likelihood　Ratio) 7.8 2.66 to 22.84
음성우도비율 (Negative　Likelihood　Ratio) 0.11 0.03 to 0.42
유병률(Disease　prevalence) 50.00% 　
양성예측도(Positive　Predictive　Value) 88.64% 68.71% to 97.91%
음성예측도(Negative　Predictive　Value) 89.84% 69.84% to 98.46%
상기 표 3 및 도 6에서 보는 바와 같이, 민감도(Sensitivity)가 90.0%이고, 특정도(Specificity)가 88.46%로 중간 또는 고위험도의 환자를 분류할 수 있음을 알 수 있다.
또한, 도 2 및 도 4에 나타낸 이미지 분석을 이용하여 프로게스테론 면역 염색 결과 및 Ki67 면역 염색 결과를 이용한 위험군 분류와 TAILORx 기반 온코타입 Dx 분류 결과를 대비하면 하기 표 4와 같다.
본 발명에 따른 분류 TAILORx 기반 온코타입 Dx 분류 합계
RS 11 미만 RS 11 이상 18이하 RS 18 초과 24 이하 RS 24 초과 30 이하 RS 30 초과
저위험군 8(32%) 15(60%) 1(4%) 1 (4%) 0 25(54.3%)
중위험군 내지 고위험군 0 3(14.3%) 7(33.3%) 8(38.1%) 3(14.3%) 21(45.7%)
합계 8(17.4%) 18(39.1%) 8(17.4%) 9(19.6%) 3(6.5%) 46
(p=0.00000082 (Fisher's exact test))
상기 표 4에서 보는 바와 같이, 본 발명의 방법에 의하는 경우 매우 정확하게 항암 화학요법이 필요가 없는 저위험군을 분류할 수 있는 것을 볼 수 있다.
또한, 상기 실험 결과의 통계적 유의성을 확인하기 위하여 카이-자승 검증(Chi-squared test)을 수행하였고, 그 결과는 하기 표 5에 나타낸 바와 같이 통계적으로 의미있는 결과임을 확인할 수 있다.
카이-자승 28.814
DF 4
유의도 P<0.0001
또한 상기 실험 결과가 임상에 미치는 영향을 예측하기 위하여 도표로 표시하여 도 7 및 도 8에 나타내었다. 현재 TAILORx 임상 시험에서 저위험군으로 분류되어 항암 화학요법을 안 받는 환자군 (RS<11)은 모두 본 발명의 방법에 의해 저위험군으로 분류되었으며, 나머지 환자 중에 일반적으로 저위험군으로 분류되는 RS 11 내지 18 인 환자 중 83.3% 가 본 발명의 방법에 의해 저위험군으로 분류되었다. 또한 현재 반드시 항암 화학요법을 받아야 하는 환자군 (RS>30) 은 모두 본 발명의 방법에 의해 고위험군으로 분류되었다.
[실험예 2]
상기 실험예 1에서 연세 암병원 유방암 센터에서 치료받은 ER+/N- 환자 중 온코타입 Dx를 시행한 46명의 환자군에 대하여 프로게스테론 수용체의 면역 염색 결과에 따른 Allred 스코어를 측정하여 이를 Y축으로 하고, 상기 환자로부터 채취한 유방 조직 샘플에서 Ki67 단백질을 면역 염색하여 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율(%)을 X 축으로 정한 뒤, 상기 유방암 환자의 온코타입 Dx RS 범위에 따라 표기를 달리하여 도 9에 그래프로 나타내었다.
도 9에서 보는 바와 같이, 프로게스테론 수용체의 면역 염색 결과에 따른 Allred 스코어가 5 이상인 경우이고, Ki67 단백질을 면역 염색하여 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율이 20% 미만인 경우, 대부분 RS 저위험군에 속하는 것을 볼 수 있다.
또한, 상기 환자로부터 채취한 유방 조직 샘플에 대하여 Ki67 단백질을 면역 염색한 뒤 그 중 염색 지수가 가장 높은 부위를 400배율 현미경으로 관찰하여 반경이 대략 400 내지 650㎛인 원형의 부위를 핫 스팟으로 선정하였다. 상기 핫 스팟에 대하여 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율(%)을 X 축, 프로게스테론 수용체의 면역 염색 결과에 따른 Allred 스코어를 Y 축으로 정한 뒤, 상기 환자의 온코타입 Dx RS 범위에 따라 표기를 달리하여 도 10에 그래프로 나타내었다.
도 10에서 보는 바와 같이, 프로게스테론 수용체의 면역 염색 결과에 따른 Allred 스코어가 5 미만이고, Ki67 단백질을 면역 염색하여 핫 스팟에서 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율이 10% 미만인 경우, 대부분이 RS 저위험군에 속하는 것을 볼 수 있다.
다만, 한 명의 환자(▲)가 RS 값으로 고위험군에 속하는 것으로 나타났으나, 이에 대하여 병리 슬라이드 리뷰 결과 상기 실험예 1에서와 마찬가지로 암세포가 아닌 림프구성 침윤(lymphoid infiltrate)에 염색된 것으로, 온코타입 Dx에서는 고위험군이었으나, 면역 염색 결과는 암세포만 스코어 하므로, 저위험군으로 분류할 수 있다.
이처럼 본 발명의 방법에 의하는 경우 Allred 스코어와 Ki67 단백질의 면역 염색 결과를 이용하여 매우 간단한 방법이나 높은 정확도로 유방암 환자의 예후를 예측할 수 있고, 특히 Allred 스코어가 5 미만인 경우에는 핫 스팟을 선정하여 분석하는 경우 그 정확도를 더욱 높일 수 있음을 알 수 있다.
도 9 및 도 10에 나타낸 위험군 분류 결과와 온코타입 Dx 분류 결과를 대비하면 하기 표 6과 같다.
본 발명에 따른 분류 온코타입 Dx 분류 합계
저위험군(RS 18 미만) 중위험군 내지 고위험군(RS 18 이상)
저위험군 24 3 29 (63%)
중위험군 내지 고위험군 2 15 17 (37%)
합계 26 (56.5%) 20 (43.5%) 46
(p=0.000004738 (Fisher's exact test))
상기 표 6에서 보는 바와 같이, 본 발명의 방법에 의하는 경우 비교적 정확히 항암화학요법이 필요없는 저위험군을 분류할 수 있다. 저위험군이 50% 이상이므로 많은 환자들을 불필요한 항암치료로부터 해방시킬 수 있어 그들을 심리적 불안과 항암치료 부작용에 의한 육채적 부담 및 경제적 부담감을 완화시킬 수 있다.
또한, 상기 결과의 통계적 정확도를 확인하기 위하여 ROC(Receiver-Operating Characteristic analysis) 분석을 추가로 수행하였다. 그 결과는 하기 표 7 및 도 11에 나타내었다.
민감도(Sensitivity) 75.00% 50.90% to 91.34%
특정도(Specificity) 92.31% 74.87% to 99.05%
곡선하 면적(Area Under Curve) 0.84 0.70 to 0.93
양성우도비율(Positive　Likelihood　Ratio) 9.75 2.51 to 37.81
음성우도비율 (Negative　Likelihood　Ratio) 0.27 0.13 to 0.58
유병률(Disease　prevalence) 50.00% 　
양성예측도(Positive　Predictive　Value) 90.70% 68.46% to 99.07%
음성예측도(Negative　Predictive　Value) 78.69% 58.75% to 91.97%
상기 표 7 및 도 11에서 보는 바와 같이, 민감도(Sensitivity)가 75%이고, 특정도(Specificity)가 92.31%로 중간 또는 고위험도의 환자를 분류할 수 있음을 알 수 있다.
또한, 도 9 및 도 10에 나타낸 위험군 분류 결과와 TAILORx 기반 온코타입 Dx 분류 결과를 대비하면 하기 표 8과 같고, 상기 실험 결과의 통계적 유의성을 확인하기 위하여 카이-자승 검증을 수행하여 그 결과는 하기 표 9에 나타내었다.
본 발명에 따른 분류 TAILORx 기반 온코타입 Dx 분류 합계
RS 11 미만 RS 11 이상 18이하 RS 18 초과 24 이하 RS 24 초과 30 이하 RS 30 초과
저위험군 8 (27.6%) 16 (55.2%) 2 (6.9%) 3 (10.3%) 0 29 (63%)
중위험군 내지 고위험군 0 2 (11.8%) 6 (35.3%) 6 (35.3%) 3 (17.6%) 17 (37%)
합계 8 (17.4%) 18 (39.1%) 8 (17.4%) 9 (19.6%) 3 (6.5%) 46
카이-자승 23.347
DF 4
유의도 P<0.0001
또한 상기 실험 결과가 임상에 미치는 영향을 예측하기 위하여 도표로 표시하여 도 12 및 도 13에 나타내었다.
상기 표 8 내지 9 및 도 12 내지 13에서 보는 바와 같이, 본 발명의 방법에 의한 위험군 분류를 TAILROx 온코타입 Dx 위험군 분류와 비교해 보아도 통계적으로 매우 유의한 상관관계를 갖는 것을 관찰할 수 있다. 즉, 본 발명의 방법에 의하는 경우 반드시 항암 화학요법으로 치료받아야 하는 환자 3명 모두 저위험군으로 분류되지 않았고, 항암치료를 받지 않아도 되는 RS 11 미만의 저위험군 환자의 경우 모두 저위험군으로 분류되는 것을 볼 수 있다.
[실험예 3]
독립 검증 코호트에서도 같은 결과를 도출할 수 있는지 검증을 위해 강남 세브란스병원에서 치료받은 환자 중 온코타입 시행한 65명의 환자를 대상으로도 추가로 본 발명의 예후 판단 방법을 시행하였다. 즉 65명의 환자로부터 채취한 유방 조직 샘플의 프로게스테론 및 Ki67 면역 염색 결과에 대한 이미지 분석을 Image J 프로그램과 ImmunoRatio plug in을 이용하여 시행하였다.
구체적으로는, 상기 유방암 환자로부터 채취한 유방 조직 샘플에서 Ki67 단백질을 면역 염색하여 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율(%)을 X 축, 그리고 프로게스테론 수용체를 면역 염색하여 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론 수용체를 포함하는 암세포 수의 비율(%)을 Y 축으로 정한 뒤, 상기 환자의 온코타입 Dx RS 범위에 따라 표기를 달리하여 하여 도 14에 그래프로 나타내었다.
도 14에서 보는 바와 같이, 프로게스테론 면역 염색 결과 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론을 포함하는 암세포 수의 비율이 20%를 초과하는 경우이고, Ki67 단백질을 면역 염색하여 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율이 20% 미만인 경우, 모두 RS 저위험군에 속하는 것을 볼 수 있다.
또한, 상기 환자로부터 채취한 유방 조직 샘플에 대하여 Ki67 단백질을 면역 염색한 뒤 그 중 염색 지수가 가장 높은 부위를 400배율 현미경으로 관찰하여 반경이 대략 400 내지 650㎛인 원형의 부위를 핫 스팟으로 선정하였다. 상기 핫 스팟에 대하여 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율(%)을 X 축, 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론 수용체를 포함하는 암세포 수의 비율(%)을 Y 축으로 정한 뒤, 상기 환자의 온코타입 Dx RS 범위에 따라 표기를 달리하여 도 15에 그래프로 나타내었다.
도 15에서 보는 바와 같이, 프로게스테론 면역 염색 결과 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론을 포함하는 암세포 수의 비율이 20% 이하이고, Ki67 단백질을 면역 염색하여 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율이 10% 미만인 경우, 대부분이 RS 저위험군에 속하는 것을 볼 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 의한 결과가 온코타입 Dx의 RS 분류를 얼마나 정확하게 예측하는 지 검정하기 위하여, 도 14 및 도 15에 나타낸 프로게스테론 면역 염색 결과 및 Ki67 면역 염색 결과를 이용한 위험군 분류와 온코타입 Dx 분류 결과를 대비하면 하기 표 10과 같다.
본 발명에 따른 분류 온코타입 Dx 분류 합계
저위험군(RS 18 미만) 중위험군 내지 고위험군(RS 18 이상)
저위험군 33 (86.5%) 6 (13.5%) 37 (56.9%)
중위험군 내지 고위험군 5 (21.4%) 21 (78.6%) 28 (43.1%)
합계 38 (58.5%) 27 (41.5%) 65
(p=0.000000303 (Fisher's exact test))
상기 표 10에서 보는 바와 같이, 본 발명의 방법에 따른 분류와 온코타입 Dx의 위험군 분류의 상관관계는 매우 유의한 결과를 보였으며 (p=0.000000303 (Fisher's exact test)), 대략 83%((23 + 18)/65 *100)는 온코타입 Dx와 동일한 분류 결과를 보였다.
또한, 상기 결과의 통계적 정확도를 확인하기 위하여 ROC(Receiver-Operating Characteristic analysis) 분석을 추가로 수행하였다. 그 결과는 하기 표 11 및 도 16에 나타내었다.
민감도(Sensitivity) 77.78% 57.74% to 91.38%
특정도(Specificity) 86.84% 71.91% to 95.59%
곡선하 면적(Area Under Curve) 0.82 0.71 to 0.91
양성우도비율(Positive　Likelihood　Ratio) 5.91 2.55 to 13.71
음성우도비율 (Negative　Likelihood　Ratio) 0.26 0.12 to 0.52
유병률(Disease　prevalence) 41.54% 29.44% to 54.44%
양성예측도(Positive　Predictive　Value) 80.77% 60.65% to 93.45%
음성예측도(Negative　Predictive　Value) 84.62% 69.47% to 94.14%
상기 표 11 및 도 16에서 보는 바와 같이, 민감도(Sensitivity)가 77.78%이고, 특정도(Specificity)가 86.84%로 중간 또는 고위험도의 환자를 분류할 수 있음을 알 수 있다.
또한, 도 14 및 도 15에 나타낸 프로게스테론 면역 염색 결과 및 Ki67 면역 염색 결과를 이용한 위험군 분류와 TAILORx 기반 온코타입 Dx 분류 결과를 대비하면 하기 표 12와 같다.
본 발명에 따른 분류 TAILORx 기반 온코타입 Dx 분류 합계
RS 11 미만 RS 11 이상 18이하 RS 18 초과 24 이하 RS 24 초과 30 이하 RS 30 초과
저위험군 12 (30.8%) 21 (53.8%) 5 (12.8%) 1 (2.6%) 0 39 (60.0%)
중위험군 내지 고위험군 1 (3.8%) 4 (15.4%) 11 (42.3%) 2 (7.7%) 8 (30.8%) 26 (40.0%)
합계 13 (20%) 25 (38.5%) 16 (24.6%) 3 (4.6%) 8 (12.3%) 65
(p=0.00000082 (Fisher's exact test))
상기 표 12에서 보는 바와 같이, 본 발명에 의하는 경우 매우 정확하게 항암 화학요법이 필요가 없는 저위험군을 분류할 수 있는 것을 볼 수 있다.
또한, 상기 실험 결과의 통계적 유의성을 확인하기 위하여 카이-자승 검증(Chi-squared test)을 수행하였고, 그 결과는 하기 표 13에 나타낸 바와 같이 통계적으로 의미있는 결과임을 확인할 수 있다.
카이-자승 30.053
DF 4
유의도 P<0.0001
또한 상기 실험 결과가 임상에 미치는 영향을 예측하기 위하여 도표로 표시하여 도 17 및 도 18에 나타내었다. 본 발명의 방법에 의해 저위험군으로 분류된 환자 중에 현재 항암 화학요법이 반드시 필요한 온코타입 Dx RS가 30 초과인 환자는 없었다. 이처럼 본 발명의 방법에 의하는 경우 통계적으로 유의하게 또는 임상적으로 매우 의미있게 온코타입 Dx 위험군 분류를 예측할 수 있음을 알 수 있다.
[실험예 4]
상기 실험예 3에서 강남 세브란스병원에서 치료받은 환자 중 온코타입 시행한 65명의 환자군에 대하여 프로게스테론 수용체의 면역 염색 결과에 따른 Allred 스코어를 측정하여 이를 Y축으로 하고, 상기 환자로부터 채취한 유방 조직 샘플에서 Ki67 단백질을 면역 염색하여 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율(%)을 X 축으로 정한 뒤, 상기 유방암 환자의 온코타입 Dx RS 범위에 따라 표기를 달리하여 도 19에 그래프로 나타내었다.
도 19에서 보는 바와 같이, 프로게스테론 수용체의 면역 염색 결과에 따른 Allred 스코어가 5 이상인 경우이고, Ki67 단백질을 면역 염색하여 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율(%)이 20% 미만인 경우, 대부분 RS 저위험군에 속하는 것을 볼 수 있다.
또한, 상기 환자로부터 채취한 유방 조직 샘플에 대하여 Ki67 단백질을 면역 염색한 뒤 그 중 염색 지수가 가장 높은 부위를 400배율 현미경으로 관찰하여 반경이 대략 400 내지 650㎛인 원형의 부위를 핫 스팟으로 선정하였다. 상기 핫 스팟에 대하여 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율(%)이 X 축, 프로게스테론 수용체의 면역 염색 결과에 따른 Allred 스코어를 Y 축, 상기 유방암 환자의 온코타입 Dx RS 범위에 따라 표기를 달리하여 도 20에 그래프로 나타내었다.
도 20에서 보는 바와 같이, 프로게스테론 수용체의 면역 염색 결과에 따른 Allred 스코어가 5 미만이고, Ki67 단백질을 면역 염색하여 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율이 10% 미만인 경우, 모두 RS 저위험군에 속하는 것을 볼 수 있다.
이처럼 본 발명의 방법에 의하는 경우 Allred 스코어와 Ki67 단백질의 면역 염색 결과를 이용하여 매우 간단한 방법이나 높은 정확도로 유방암 환자의 예후를 예측할 수 있고, 특히 Allred 스코어가 5 미만인 경우에는 핫 스팟을 선정하여 분석하는 경우 그 정확도를 더욱 높일 수 있음을 알 수 있다.
도 19 및 도 20에 나타낸 위험군 분류 결과와 온코타입 Dx 분류 결과를 대비하면 하기 표 14와 같다.
본 발명에 따른 분류 온코타입 Dx 분류 합계
저위험군(RS 18 미만) 중위험군 내지 고위험군(RS 18 이상)
저위험군 32 (86.5%) 5 (13.5%) 37 (56.9%)
중위험군 내지 고위험군 6 (21.4%) 22 (78.6%) 28 (43.1%)
합계 38 (58.5%) 27 (41.5%) 65
(p=0.000004738 (Fisher's exact test))
상기 표 14에서 보는 바와 같이, 본 발명의 방법에 의하는 경우 비교적 정확히 항암화학요법이 필요 없는 저위험군을 분류할 수 있다. 저위험군이 50% 이상이므로 많은 환자들을 불필요한 항암치료로부터 해방시킬 수 있어 그들을 심리적 불안과 항암화학요법 부작용의 육체적 부담 및 경제적 부담감을 완화시킬 수 있다.
또한, 상기 결과의 통계적 정확도를 확인하기 위하여 ROC(Receiver-Operating Characteristic analysis) 분석을 추가로 수행하였다. 그 결과는 하기 표 15 및 도 21에 나타내었다.
민감도(Sensitivity) 81.48% 61.92% to 93.70%
특정도(Specificity) 84.21% 68.75% to 93.98%
곡선하 면적(Area Under Curve) 0.83 0.71 to 0.91
양성우도비율(Positive　Likelihood　Ratio) 5.16 2.42 to 10.99
음성우도비율 (Negative　Likelihood　Ratio) 0.22 0.10 to 0.49
유병률(Disease　prevalence) 41.54% 29.44% to 54.44%
양성예측도(Positive　Predictive　Value) 78.57% 59.05% to 91.70%
음성예측도(Negative　Predictive　Value) 86.49% 71.23% to 95.46%
상기 표 15 및 도 21에서 보는 바와 같이, 민감도(Sensitivity)가 81.48%이고, 특정도(Specificity)가 84.21%로 중간 또는 고위험도의 환자를 분류할 수 있음을 알 수 있다.
또한, 도 19 및 도 20에 나타낸 위험군 분류 결과와 TAILORx 기반 온코타입 Dx 분류 결과를 대비하면 하기 표 16과 같고, 상기 실험 결과의 통계적 유의성을 확인하기 위하여 카이-자승 검증을 수행하여 그 결과는 하기 표 17에 나타내었다.
본 발명에 따른 분류 TAILORx 기반 온코타입 Dx 분류 합계
RS 11 미만 RS 11 이상 18이하 RS 18 초과 24 이하 RS 24 초과 30 이하 RS 30 초과
저위험군 12 (32.4%) 20 (54.1%) 5 (13.5%) 0 0 37 (56.9%)
중위험군 내지 고위험군 1 (3.6%) 5 (17.9%) 11 (39.3%) 3 (10.7%) 8 (28.6%) 28 (43.1%)
합계 13 (20%) 25 (38.5%) 16 (24.6%) 3 (4.6%) 8 (12.3%) 65
카이-자승 30.904
DF 4
유의도 P<0.0001
또한 상기 실험 결과가 임상에 미치는 영향을 예측하기 위하여 도표로 표시하여 도 22 및 도 23에 나타내었다.
상기 표 16 내지 17 및 도 22 내지 23에서 보는 바와 같이, 본 발명의 방법에 의한 위험군 분류를 TAILROx 온코타입 Dx 위험군 분류와 비교해 보아도 통계적으로 매우 유의한 상관관계를 갖는 것을 관찰할 수 있다. 즉, 본 발명의 방법에 따라 저위험군으로 분류된 환자 중 온코타입 Dx나 TAILORx 상 반드시 항암 치료가 요구되는 고위험군의 환자가 존재하지 않았다.
[비교예 1]
상기 실험예 1에 있어서 이미지 분석을 수행하지 않고, 병리 의사의 판단에 따라 임상 Ki67 면역 염색 결과에 의하면, 도 24에서 보는 바와 같이, Ki67 이나 프로게스테론 수용체의 면역 염색 결과만을 이용하여서는 RS 위험군의 분류 또는 예후에 대한 예측이 전혀 불가능하였다.
구체적으로 Ki67 면역 염색 결과 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율을 20% 미만으로 하는 경우 여러 고 위험 환자가 저위험군으로 잘못 분류되는 것을 볼 수 있고, 또한 10% 미만으로 한다면 여러 저위험군 환자가 고위험군 환자로 분류되는 것을 볼 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 유방암의 예후 및 항암화학요법 사용 여부 판단 장치 및 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 프로게스테론 수용체의 면역 염색 결과와 Ki67 단백질의 면역 염색 결과를 이용하여 유방암의 항암 치료 방향을 결정함에 있어서 필요한 예후 및 항암화학요법의 효과를 예측할 수 있는 장치 및 방법에 관한 것이다.

Claims (12)

  1. 유방암 환자로부터 추출한 유방 조직 샘플의 프로게스테론 수용체의 면역 염색 결과 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론 수용체를 포함하는 암세포 수의 비율(%) 또는 Allred 스코어를 입력받기 위한 제1 입력부;
    Ki67 단백질을 면역 염색한 결과 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율(%)을 입력받기 위한 제2 입력부;
    상기 제1 입력부에서 입력된 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론 수용체를 포함하는 암세포 수의 비율(%)이 20% 초과이거나, Allred 스코어가 5 이상이고, 제2 입력부에서 입력된 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 세포 수의 비율(%)이 20% 미만인 경우 저위험군으로 분류하기 위한 분류 연산부; 및
    상기 분류 연산부의 분석 결과를 출력하기 위한 출력부를 포함하는 유방암의 예후 및 항암화학요법 사용 여부 판단 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제2 입력부에 입력되는 유방 조직 샘플의 Ki67 단백질을 면역 염색한 결과는 면역 염색 후 가장 염색 지수가 높은 400~650㎛ 반경의 원형 부위에 대하여 수행된 결과가 입력되는, 유방암 예후 분석 장치.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 저위험군은 온코타입 Dx에 따른 예후 재발율(Recurrence Score, RS)의 판단값이 0 이상 18 이하에 해당하는 군인, 유방암의 예후 및 항암화학요법 사용 여부 판단 장치.
  4. 유방암 환자로부터 추출한 유방 조직 샘플의 프로게스테론 수용체의 면역 염색 결과 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론 수용체를 포함하는 암세포 수의 비율(%) 또는 Allred 스코어를 입력받기 위한 제1 입력부;
    Ki67 단백질을 면역 염색한 결과 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율(%)을 입력받기 위한 제2 입력부;
    상기 제1 입력부에서 입력된 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론 수용체를 포함하는 암세포 수의 비율(%)이 20% 이하이거나, Allred 스코어가 5 미만이고, 제2 입력부에서 입력된 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율(%)이 10% 미만인 경우 저위험군으로 분류하기 위한 분류 연산부; 및
    상기 분류 연산부의 분석 결과를 출력하기 위한 출력부를 포함하는 유방암의 예후 및 항암화학요법 사용 여부 판단 장치.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 제2 입력부에 입력되는 유방 조직 샘플의 Ki67 단백질을 면역 염색한 결과는 면역 염색 후 가장 염색 지수가 높은 400~650㎛ 반경의 원형 부위에 대하여 수행된 결과가 입력되는, 유방암의 예후 및 항암화학요법 사용 여부 판단 장치.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 저위험군은 온코타입 Dx에 따른 예후 재발율(Recurrence Score, RS)의 판단값이 0 이상 18 이하에 해당하는 군인, 유방암의 예후 및 항암화학요법 사용 여부 판단 장치.
  7. 유방암 환자로부터 추출한 유방 조직 샘플에 대하여 프로게스테론 수용체의 면역 염색한 결과, 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론 수용체를 포함하는 암세포 수의 비율(%)이 20% 초과이거나 Allred 스코어가 5 이상이고,
    Ki67 단백질을 면역 염색한 결과, 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율(%)이 20% 미만인 경우, 저위험군으로 분류하는 것을 특징으로 하는 유방암의 예후 및 항암화학요법 사용 여부를 판단하기 위한 정보 제공 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 유방 조직 샘플의 Ki67 단백질을 면역 염색한 결과는 면역 염색 후 가장 염색 지수가 높은 400~650㎛ 반경의 원형 부위에 대하여 수행된 결과인, 유방암의 예후 및 항암화학요법 사용 여부를 판단하기 위한 정보 제공 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 저위험군은 온코타입 Dx에 따른 예후 재발율(Recurrence Score, RS)의 판단값이 0 이상 18 이하에 해당하는 군인, 유방암의 예후 및 항암화학요법 사용 여부를 판단하기 위한 정보 제공 방법.
  10. 유방암 환자로부터 추출한 유방 조직 샘플에 대하여 프로게스테론 수용체의 면역 염색한 결과, 전체 암세포 수 대비 염색된 프로게스테론 수용체를 포함하는 암세포 수의 비율(%)이 20% 이하이거나 Allred 스코어가 5 미만이고,
    Ki67 단백질을 면역 염색한 결과, 전체 암세포 수 대비 염색된 Ki67 단백질을 포함하는 암세포 수의 비율(%)이 10% 미만인 경우 저위험군으로 분류하는 것을 특징으로 하는 유방암의 예후 및 항암화학요법 사용 여부를 판단하기 위한 정보 제공 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 유방 조직 샘플의 Ki67 단백질을 면역 염색한 결과는 면역 염색 후 가장 염색 지수가 높은 400~650㎛ 반경의 원형 부위에 대하여 수행된 결과인, 유방암의 예후 및 항암화학요법 사용 여부를 판단하기 위한 정보 제공 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 저위험군은 온코타입 Dx에 따른 예후 재발율(Recurrence Score, RS)의 판단값이 0 이상 18 이하에 해당하는 군인, 유방암의 예후 및 항암화학요법 사용 여부를 판단하기 위한 정보 제공 방법.
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