WO2021086068A1 - 수정된 tmb를 포함하는 면역항암치료의 예후 예측 방법 - Google Patents

수정된 tmb를 포함하는 면역항암치료의 예후 예측 방법 Download PDF

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WO2021086068A1
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cancer
tmb
patient
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sequencing
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박웅양
이세훈
심준호
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사회복지법인 삼성생명공익재단
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Definitions

  • the present invention relates to a method for predicting a new treatment prognosis in immunotherapy.
  • Cancer is a disease that records the number 1 mortality rate among Koreans, and the need for anticancer drug development is steadily emerging.
  • anticancer drugs there were chemical anticancer drugs that attack dividing cells using the characteristics of rapidly proliferating tumor cells, and target anticancer drugs that attack specific molecules or signaling systems of tumor cells, but there were several side effects.
  • Immuno-cancer drugs that can minimize side effects by using the innate immunity of
  • Immuno-chemotherapy refers to cancer therapy that activates the body's immune system to fight cancer cells.
  • Immuno-chemotherapy uses the immune system to attack only cancer cells, so it has fewer side effects than conventional chemotherapy, and has the advantage of obtaining long-term anti-cancer effects because it uses the memory and adaptability of the immune system.
  • immune chemotherapy which overcomes the shortcomings of existing anticancer drugs, is in the spotlight as a new paradigm for cancer treatment, and Science magazine selected immunotherapy as a study of the year in 2013.
  • Anticancer drugs can be divided into antibody treatments targeting tumor antigens (Rituximab, etc.), immune checkpoint inhibitors (Immune checkpoint inhibitors, etc.) that reactivate immune cells, and immune cell therapies (Immune cell theraphy) that directly administer immune cells. (Oiseth et al, 2017).
  • immune checkpoint inhibitor therapy has advanced the treatment of advanced cancer. It has been found that antibodies targeting PD-1, PD-L1 and cytotoxic T lymphocyte antigen 4 (CTLA-4) provide a surprising improvement in survival in all types of cancer. However, despite the above potential, only a small number of patients can benefit, and more than half of the patients experience early disease exacerbation. Therefore, the need for effective biomarkers for the treatment of immune checkpoint inhibitors is being emphasized.
  • CTL-4 cytotoxic T lymphocyte antigen 4
  • TMB cancer mutation rate
  • ICIs immune checkpoint inhibitor therapy
  • the present inventors analyzed the sequencing of 198 non-small cell lung cancer (NSCLS) in the pre-immuno-chemotherapy stage to search for a predictable new biomarker in the anti-tumor immune response and examined whether it can be combined with the existing biomarker.
  • NSCMS non-small cell lung cancer
  • a new analysis method was introduced to elucidate the association between the modified antigen presentation pathway and ICIs.
  • One aspect includes sequencing a biological sample obtained from a cancer patient; Filtering the sequencing values; Calculating a tumor mutation burden (TMB) using the filtered sequencing data; And correcting the calculated TMB value using Equation 1 below.
  • TMB tumor mutation burden
  • Another aspect provides a method of providing information for predicting the treatment responsiveness of a cancer patient to an immuno-anticancer agent using the calculated TMB value.
  • Another aspect provides a computer-readable recording medium storing a program for executing the method on a computer.
  • Another aspect is a data generation unit for generating a genetic data set by sequencing a biological sample obtained from a cancer patient;
  • a calculator configured to measure TMB by performing filtering on the measured gene data;
  • it provides an apparatus for analyzing the treatment reactivity of a cancer patient to an anticancer drug, including a correction unit that calculates the measured TMB value as a modified TMB value using Equation 1 below.
  • One aspect includes sequencing a biological sample obtained from a cancer patient; Filtering the sequencing values; Calculating a tumor mutation burden (TMB) using the filtered sequencing data; And correcting the calculated TMB value using Equation 1 below.
  • TMB tumor mutation burden
  • NeoAg means the neoantigen burden calculated as a result of Mupexi.
  • NeoAgL is a value of Neoantigens predicted to bind to HLA alleles lost by Mupexi and LOH HLA, and was set to 0 in the absence of HLA LOH.
  • NeoAgC is the value of the neoantigen predicted to bind to both the lost HLA allele and the retained HLA allele. In the absence of HLA LOH, the value was set to 0.
  • the modified TMB may be referred to as HLA-corrected TMB (HLA-corrected TMB).
  • TMB Tumor mutation burden
  • DNA sequencing may be determining the nucleotide sequence for a piece of DNA. According to an embodiment of the present invention, it may mean a process of analyzing the sequence of DNA obtained from a biological sample of a cancer patient.
  • the sequencing method may be a chain termination method, pyrosequencing, next generation sequencing, deep sequencing, or Whole Exome Sequencing (WES).
  • next generation sequencing may be used, and next generation sequencing may be deep sequencing or Whole Exome Sequencing (WES). According to an embodiment of the present invention, it may be deep sequencing.
  • deep sequencing is also referred to as high-throughput sequencing, and may mean sequencing a genomic region multiple times. More specifically, it may be to undergo sequencing of about 100 to 1000 times, and may mean a next generation sequencing approach. When using the deep sequencing, rare genetic defects, clone types, and the like of less than 1% of the total may be found.
  • FIG. 4 is a flowchart of a method for predicting a treatment response of a cancer patient to a modified TMB and an immune checkpoint inhibitor using the modified TMB according to an aspect.
  • the method may include sequencing a biological sample obtained from a cancer patient, as shown in FIG. 4.
  • the cancer patient may be a lung cancer patient or a small cell lung cancer patient, and the biological sample may be a cancer cell.
  • the step may include analyzing a gene sequence of a biological sample of a cancer patient.
  • the method may include filtering the sequencing value, as shown in FIG. 4. Specifically, it may include removing unnecessary information or variables in order to calculate TMB from the patient's genetic analysis result.
  • the filtering may be basic filtering or additional filtering.
  • the term "filitering” may mean a step of correcting the sequencing value. More specifically, it may be to increase accuracy by removing a value that does not meet the definition of TMB. More specifically, it may mean a step of correcting by excluding an additionally calculated part.
  • the filtering method may be selected from the group consisting of non-coding region variant filtering, germline variant filtering, synonymous mutation filtering, low VAF variant filtering, truncation mutation filtering, and known somatic alteration filtering.
  • the basic filtering may include removing non-coding region variants, germline variants, or synonymous mutations.
  • the basic filtering step may be a step of removing a mutation of 1% or more of a minor allele frequency, a step of removing a mutation of a non-coding portion, or a step of removing a synonymous mutation. More specifically, the basic filtering step is a step of assuming and removing mutations of more than 1% minor allele frequency as a germline variant in the Exome Aggregation Consortium (ExAC) database and the 1000 Genome Project database, and then, the Tumor mutation burden is a coding region.
  • ExAC Exome Aggregation Consortium
  • the synonymous mutation among the remaining mutations in the above two processes may be a step of removing because it does not match the definition of the Tumor mutation burden.
  • the additional filtering may include removing the Low VAF variant, truncation mutation, or known somatic alteration. More specifically, it may include the step of first removing the Low vaf variant. Since the removal of the Low VAF variant is highly likely to be a variant of a tumor subclone, it may be because if it is included in the TMB calculated to predict the patient's ICI response, the result may be confused. Next, it may include the step of removing the truncation mutation of the Tumor suppressor gene. Finally, it may include removing the Tumor driven variant. In the case of including the additional filtering as described above, a more accurate TMB calculation may be possible in deep sequencing.
  • the method may include calculating a tumor mutation burden (TMB) using the filtered sequencing data.
  • TMB tumor mutation burden
  • the TMB may be calculated as variables remaining after the filtering step.
  • TMB tumor mutation burden
  • the method may include the step of modifying the calculated TMB value using Equation 1, as shown in FIG. 4.
  • the modifying step may be to improve the accuracy of TMB in a non-smoker lung cancer patient by removing uncertainty due to the burden of new antigens by modifying an existing TMB calculation method.
  • neoantigen refers to an antigen that has not been recognized by the immune system until now.
  • the neoantigen may be derived from a fragment of a tumor cell, a tumor cell protein derived from a tumor cell mutation, or a viral protein. More specifically, when a mutation occurs in a protein-coding gene of a cancer cell, it may become a potential neoantigen.
  • the new antigen may be measured by the next generation sequencing method. According to one embodiment, it may be measured by deep sequencing.
  • nucleic acid burden may mean the number of new antigens, and may be a kind of biomarker that predicts ICI reactivity. It may also be measured by sequencing.
  • the neoantigen may decrease the accuracy of TMB by inducing immune editing in LOA patients. More specifically, it may be to increase the value of TMB by binding new antigens to the lost HLA gene.
  • biological sample refers to a sample obtained from a subject.
  • the biological sample is whole blood, plasma, serum, red blood cells, leukocytes (e.g., peripheral blood mononuclear cells), ductal fluid, ascites, pleural efflux, nipple aspirate, lymph fluid (e.g., of lymph nodes). Disseminated tumor cells), bone marrow aspirate, saliva, urine, feces (i.e.
  • tissue samples e.g., tumor tissue
  • a tumor biopsy e.g., a puncture biopsy
  • lymph nodes e.g., a sentinel lymph node biopsy
  • tissue sample e.g., a tumor Tissue
  • it may be whole blood or some components thereof, for example plasma, serum or cell pellets.
  • a sample can be obtained by isolating circulating cells of a solid tumor from whole blood or a cell fraction thereof using any technique known in the art.
  • the sample may be, for example, a formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tumor tissue sample from a solid tumor.
  • the sample may be a tumor lysate or extract prepared from frozen tissue obtained from an individual with cancer.
  • the "acquisition” may refer to obtaining a nucleic acid sample or a polypeptide sample from a biological sample.
  • the nucleic acid sample may be obtained by a conventional nucleic acid separation method.
  • a target nucleic acid is subjected to a polymerase chain reaction (PCR), a ligase chain reaction (LCR), a transcription mediated amplification, or a realtime-based amplification of a nucleic acid sequence.
  • Nucleic acid sequence based amplification can be used to amplify and purify it.
  • the target nucleic acid can be obtained from a lysate of a biological sample as a crude isolated nucleic acid.
  • the polypeptide sample may be obtained by a conventional protein extraction or separation method.
  • the cancer patient is lung cancer, melanoma, Hodgkin's lymphoma, gastric cancer, urinary tract cancer, head and neck cancer, liver cancer, colon cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, liver cancer, testicular cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, It may be a patient with cervical cancer, bladder cancer, brain cancer, breast cancer, or kidney cancer.
  • the cancer patient may be a lung cancer patient.
  • it may be a non-small cell lung cancer patient.
  • the cancer patient may be a non-smoker or a past smoker. Preferably, it may be a non-smoker.
  • the cancer of the cancer patient is lung cancer, melanoma, Hodgkin's lymphoma, stomach cancer, urinary tract cancer, head and neck cancer, liver cancer, colon cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, liver cancer, testicular cancer, ovarian cancer, endometrial It may be selected from the group consisting of cancer, cervical cancer, bladder cancer, brain cancer, breast cancer, or kidney cancer.
  • the lung cancer may be non-small cell lung cancer or small cell lung cancer.
  • sequencing a biological sample obtained from a cancer patient; Filtering the sequencing values; Calculating a cancer mutation burden (TMB) using the filtered deep sequencing; Modifying the calculated TMB value using Equation 1; And a method of providing information for predicting the treatment responsiveness of a cancer patient to an anticancer drug based on the calculated modified TMB value.
  • TMB cancer mutation burden
  • the prediction of the responsiveness is that when the value of the modified TMB is higher as compared to the control group not suffering from cancer, it is predicted that the treatment responsiveness of the cancer patient to the immune anticancer agent will be higher, and will be lower. In this case, it may be predicted that the reactivity will be low.
  • the prediction of the reactivity is when the value of the modified TMB is similar or higher when compared to the modified TMB value of a patient having good responsiveness to an immuno-anticancer agent, treatment of a cancer patient with an immuno-anticancer agent. If the reactivity is predicted to be high, and if it is lower, it may be predicted that the reactivity will be low.
  • the prediction of the reactivity predicts that the cancer patient's therapeutic responsiveness to the anticancer drug will be high when the value of the modified TMB is higher than the top 20 to 30% when compared with the total patient data. , In the case of the lower 20 to 30%, it may be predicted that the reactivity will be low.
  • immune anticancer agent is an anticancer agent that kills cancer cells by activating the body's immune cells, and may refer to a drug that exhibits the therapeutic effect of cancer by enhancing the patient's own immunity.
  • the immune anticancer agent may be an immune checkpoint inhibitor.
  • immune checkpoint inhibitor is a cancer cell by activating T cells by blocking the activation of an immune checkpoint protein, such as PD-L1, which is expressed in tumor cells. It may mean an immune anticancer agent that attacks.
  • the immune checkpoint inhibitor may be any one selected from the group consisting of anti-PD-L1, anti-PD-1, and anti-CTLA-4, for example, anti-PD-1 I can.
  • the immune checkpoint inhibitor may inhibit the binding between PD-L1 and PD-1. Specifically, it may be an antibody capable of binding to PD-L1 or PD-1, for example, a monoclonal antibody, a human antibody, a humanized antibody, or a chimeric antibody.
  • therapeutic responsiveness can mean whether a particular drug, eg, anticancer agent, exhibits a therapeutic effect against cancer in an individual patient.
  • predicting the treatment responsiveness of cancer patients may mean predicting in advance whether or not administration of a drug may be useful for the treatment of cancer, and measuring the expression level of a gene or using a biomarker to a drug It may be to predict the response to treatment.
  • prediction may mean preliminary determination of a specific result, such as treatment responsiveness, through confirmation of characteristics such as the expression level of a specific gene or identification of a biomarker.
  • total patient data may mean TMB data of cancer patients composed of a plurality of groups. More specifically, it may be data generated through the step of generating a genetic data set by performing sequencing of a sample obtained from a cancer patient.
  • the prediction of the responsiveness may be to check the distribution of all patient data and classify patients into "high TMB group” or "low TMB group” using the determined TMB cutoff.
  • the TMB cutoff may be defined as a "high TMB group” up to the upper 30% and a "low TMB group” up to the lower 30%. More specifically, the high TMB group may mean up to the top 25%, the top 20%, or the top 15%, and the low TMB group may mean up to the bottom 25%, the bottom 20%, or the bottom 15%.
  • increasing the reference point of the cutoff of the upper TMB may contribute to increasing the accuracy of determining the TMB.
  • the method comprises the steps of measuring the expression of Programmed death-ligand 1 (PD-L1) from a biological sample obtained from the cancer patient; And predicting the reactivity to an anticancer agent by combining the measured expression value of PD-L1 and the modified value of TMB.
  • PD-L1 Programmed death-ligand 1
  • the step of predicting the reactivity may be to evaluate that the higher the expression of PD-L1, the higher the ICI reactivity, and the prediction of the reactivity is incomplete with only PD-L1, but the accuracy is increased when determined in combination with the modified TMB value. It can work. More specifically, in the case of the low TMB group, the prediction based on the expression level of PD-L1 may be more accurate.
  • the measurement of the expression level of PD-L1 is Western blot, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunity.
  • Diffusion method rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay (Immunoprecipitation Assay), complement fixation assay (Complement Fixation Assay), flow cytometry (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), and protein chip It may be performed by one or more techniques selected from the group consisting of.
  • the agent capable of measuring the expression level of the protein may be an antibody that specifically binds to the protein of the gene.
  • antibody is a term known in the art and may refer to a specific protein molecule directed against an antigenic site.
  • the form of the antibody according to one aspect is not particularly limited, and if it is a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or any one having antigen-binding properties, a part thereof may also be included, and all immunoglobulin antibodies may be included. Antibodies may also be included.
  • An antibody according to an aspect may comprise a complete form having two full-length light chains and two full-length heavy chains, as well as functional fragments of the antibody molecule.
  • the functional fragment of the antibody molecule refers to a fragment having at least an antigen-binding function, and may be, for example, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, and the like.
  • gene can refer to any nucleic acid sequence or portion thereof that has a functional role in the coding or transcription of a protein or in the regulation of other gene expression.
  • a gene may consist of all nucleic acids encoding a functional protein or only a portion of a nucleic acid encoding or expressing the protein.
  • Nucleic acid sequences may include gene abnormalities within exons, introns, initiation or termination regions, promoter sequences, other regulatory sequences, or distinct sequences adjacent to the gene.
  • the gene according to an aspect may be a tumor microenvironment gene.
  • tumor microenvironment may mean a cellular environment surrounded by blood vessels, immune cells, fibroblasts, bone marrow-derived inflammatory cells, lymphocytes, signaling molecules, extracellular matrix, etc. around cancer cells.
  • tumor microenvironment gene refers to a gene involved in the tumor microenvironment, and may be used as a marker for predicting reactivity to an immune anticancer agent.
  • Another aspect provides a computer-readable recording medium storing a program for executing the method on a computer.
  • Another aspect provides a method of operating a computing device operated by at least one processor, comprising a program for executing the method on a computer.
  • Another aspect is a computing device, comprising a memory and at least one processor that executes instructions of a program loaded in the memory, wherein the program performs sequencing of a biological sample obtained from a cancer patient A data generation step of generating a data set; Measuring TMB by performing filtering on the measured genetic data; And instructions described to execute the step of modifying the measured TMB value to the corrected TMB value using Equation 1, providing a computing device for analyzing the treatment responsiveness of a cancer patient to an immune anticancer agent.
  • FIG. 2 is a schematic diagram illustrating an apparatus or computing device for analyzing reactivity of cancer patient treatment according to an aspect.
  • the analysis device 10 may derive a modified TMB value using a biological sample obtained from a cancer patient, and predict the treatment responsiveness of the cancer patient based on this.
  • FIG. 3 is a block diagram illustrating hardware configurations of a cancer patient treatment response analysis device or a computing device according to an aspect.
  • the genetic data set received by the data generation unit 110 of the analysis device 10 may be one that generates a genetic data set by sequencing a biological sample obtained from a cancer patient.
  • TMB Modified TMB, Equation 1, immune anticancer agent, cancer, cancer patient, biological sample, sequencing, gene are as described above.
  • a data generation unit for generating a genetic data set by performing sequencing of a biological sample obtained from a cancer patient;
  • a calculator configured to measure TMB by performing filtering on the measured gene data;
  • a correction unit that calculates the measured TMB value as a modified TMB value using Equation 1 above.
  • the device predicts that when the value of the modified TMB is higher as compared to a control group that does not suffer from cancer, the cancer patient's therapeutic responsiveness to the immuno-anticancer agent is predicted to be high, and when the value of the modified TMB is lower, the responsiveness is lower. It may be to additionally include an analysis unit predicting to be low.
  • Figure 2 is a schematic diagram showing a cancer patient treatment response analysis apparatus according to an aspect.
  • the cancer patient treatment response analysis device 10 may derive a modified TMB value using a biological sample obtained from a cancer patient, and predict the treatment response of a cancer patient based on this.
  • FIG. 3 is a block diagram showing hardware configurations of an apparatus for analyzing reactivity of cancer patient treatment according to an aspect.
  • the genetic data set received by the data generation unit 110 of the cancer patient treatment reactivity analysis apparatus 10 may be one that generates a genetic data set by sequencing a biological sample obtained from a cancer patient.
  • the biological sample and sequencing are as described above.
  • the calculation unit 120 of the cancer patient treatment response analysis apparatus 10 may receive the data set, perform filtering, and measure TMB.
  • the filtering and TMB measurement are as described above.
  • the correction unit 130 of the cancer patient treatment response analysis apparatus 10 may calculate the measured TMB value as a modified TMB value using Equation 1 above. Equation 1, the modified TMB is as described above.
  • the device in the case where the modified TMB value is similar or higher as compared to the modified TMB value of a patient having good responsiveness to an immuno-anticancer agent, the device is expected to have a high therapeutic responsiveness to the cancer patient to an immuno-cancer agent. It may be predicted and, if lower, may additionally include an analysis unit that predicts that the reactivity will be low.
  • the analysis unit may check the distribution of all patient data and classify patients into “high TMB group” or “low TMB group” using the determined TMB cutoff.
  • the TMB cutoff may be defined as “high TMB group” up to the upper 30% and “low TMB group” up to the lower 30%. More specifically, it may mean up to the top 25%, the top 20%, and the top 15%, and may mean up to the bottom 25%, the bottom 20%, and the bottom 15%.
  • the device is defined as a high TMB group when the modified TMB value is in the upper 30 to 0% when compared with all patient data, and the cancer patient's therapeutic responsiveness to the immuno-cancer drug is high. It may be to further include an analysis unit predicting that.
  • the number may be the upper 30 to 0, 25 to 0, 20 to 0, 15 to 0 10 to 0%. Preferably it may be 20 to 0%.
  • the lower 30% to 0% it is defined as a low TMB group, and may additionally include an analysis unit that predicts that the cancer patient's therapeutic responsiveness to the immuno-anticancer agent will be low.
  • an analysis unit that predicts that the cancer patient's therapeutic responsiveness to the immuno-anticancer agent will be low.
  • it may be the lower 30 to 0, 25 to 0, 20 to 0, 15 to 0 10 to 0%.
  • it may be 20 to 0%.
  • increasing the reference point of the cutoff of the upper TMB may contribute to increasing the accuracy of the TMB.
  • the device comprises: a measuring unit measuring PD-L1 expression from a biological sample obtained from the cancer patient; And a determination unit configured to determine reactivity to an anticancer agent by combining the measured value and the modified TMB value.
  • the determination unit may evaluate that the higher the expression of PD-L1, the higher the ICI reactivity, and the prediction of the reactivity is incomplete with only PD-L1, but when determined in combination with the modified TMB value, the accuracy may be increased. have. More specifically, in the case of the low TMB group, the prediction based on the expression level of PD-L1 may be more accurate.
  • the measurement of the expression level of PD-L1 is Western blot, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunity.
  • Diffusion method rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay (Immunoprecipitation Assay), complement fixation assay (Complement Fixation Assay), flow cytometry (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), and protein chip It may be performed by one or more techniques selected from the group consisting of.
  • the agent capable of measuring the expression level of the protein may be an antibody that specifically binds to the protein of the gene.
  • the cancer patient is lung cancer, melanoma, Hodgkin's lymphoma, gastric cancer, urinary tract cancer, head and neck cancer, liver cancer, colon cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, liver cancer, testicular cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, It may be a patient with cervical cancer, bladder cancer, brain cancer, breast cancer, or kidney cancer.
  • the cancer patient may be a lung cancer patient.
  • it may be a non-small cell lung cancer patient.
  • the cancer patient may be a non-smoker or a past smoker. Preferably, it may be a non-smoker, but is not limited thereto.
  • the cancer of the cancer patient is lung cancer, melanoma, Hodgkin's lymphoma, gastric cancer, urinary tract cancer, head and neck cancer, liver cancer, colon cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, liver cancer, testicular cancer, ovarian cancer, endometrial It may be selected from the group consisting of cancer, cervical cancer, bladder cancer, brain cancer, breast cancer, or kidney cancer.
  • the lung cancer may be non-small cell lung cancer or small cell lung cancer.
  • a part when a part is said to be connected to another part, this includes not only the case that it is directly connected, but also the case that it is electrically connected with another component interposed therebetween. .
  • a part when a part includes a certain component, it means that other components may be further included, rather than excluding other components unless specifically stated to the contrary.
  • the terms ".. unit” and “.. module” described in the embodiments mean a unit that processes at least one function or operation, which is implemented as hardware or software, or as a combination of hardware and software. I can.
  • the predictive power of cancer patients' treatment responsiveness to an immune anticancer drug is remarkably excellent. It can be screened and, consequently, the patient's pain and cost can be alleviated by performing the appropriate treatment.
  • FIG. 1 is a flowchart of a method for predicting a treatment response of a cancer patient to a modified TMB and an immune checkpoint inhibitor using the modified TMB according to an aspect.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing an apparatus for analyzing reactivity in cancer patient treatment according to an aspect.
  • FIG. 3 is a block diagram illustrating hardware configurations of an apparatus for analyzing reactivity of cancer patient treatment according to an aspect.
  • FIG. 4 is a flowchart of a filtering method of a method for predicting treatment responsiveness of a cancer patient according to an aspect.
  • 5 to 9 are diagrams showing clinical and genetic characteristics related to responses to TMB and ICI in NSCLC patients, a study group.
  • 5 is a heat map of oncogenic drivers identified in tumors of NSCLC patients prior to immunotherapy; Each row represents individual patients grouped according to clinical response.
  • 10 to 13 are graphs of differences in biomarkers between smokers and non-smokers.
  • 10 is a graph comparing the expression of TMB and PD-L1 between the responding group and the non-responding group after classifying the patient group by smoking status.
  • 11 is a graph showing the results of patients expressing PD-L1.
  • 13A and 13B are graphs showing PFS or EGFR modification by TP53 in a group of non-smokers receiving ICI treatment.
  • 14A is a diagram showing the frequency of HLA LOH in a patient group.
  • 14B is a diagram showing the relationship between TMB and HLA LOH in the patient group.
  • 14C is a diagram showing the relationship between TMB and HLA LOH in the patient group.
  • FIG. 15 is a diagram showing a neoantigen predicted to bind to the predicted loss of HLA LOH for each patient, and a neoantigen predicted to bind to the retained HLA LOH.
  • Figure 16a is a diagram showing the correlation of the modified TMB and HLA LOH in the patient group.
  • 16B is a diagram showing the PFS of a group of patients classified as HLA LOH.
  • 17A and B are diagrams showing the proportion of non-synonymous mutations that bind only to the lost HLA allele or to the retained HLA allele for group reclassification of the patient group using the modified TMB.
  • 18A is a diagram showing the distribution of a patient group changed from a high TMB group to a low TMB group by modified TMB.
  • 18B is a diagram showing the recurrence or mortality rate of a patient group changed from a high TMB group to a low TMB group by modified TMB.
  • 19A and B are diagrams showing the recurrence or mortality rate of a patient group classified as a high TMB group by modified TMB.
  • 20A is a diagram showing the distribution of TMB values in all patient groups by modified TMB.
  • 20B is a diagram showing the distribution of TMB values in a patient group whose TMB group classification was changed by the modified TMB.
  • 21A and 21B are diagrams showing the risk of recurrence or death over time in a patient group whose TMB group classification was changed by modified TMB.
  • Figure 22b is a diagram showing the response to ICI in the high TMB patient group.
  • Figure 22c is a diagram showing the response to ICI in the high TMB patient group.
  • 22D is a diagram showing the reactivity of patient groups classified by TMB and PD-L1.
  • FIG. 23 is a diagram showing a Forest plot showing the multivariate cox proportional hazards model.
  • Table 1 is a table showing the data of 198 non-small cell lung cancer patients who participated in the experiment.
  • CR is a complete response
  • PR partial response
  • SD stable disease
  • PD is a progressive disease
  • ECOG The Eastern Cooperative Oncology Group
  • LUAD is Lung adenocarcinoma
  • LUSC is Lung squamous cell carcinoma
  • HLA LOH is a loss of heterozygosity at the class I human leukocyte antigen.
  • the aEGFR mutation is Del19, L858R, Del18, and Ins20
  • bKRAS mutation refers to G12A, G12C, G12D, G12V.
  • the target response ratio (omplete response (CR)/partial response (PR)) for single administration of ICI was 31%.
  • the median TMB ranged from 143 mutations (range, 1 to 1765 mutations), and the distribution of TMB was similar to that of non-small cell lung cancer patients treated with ICIs in previous studies.
  • 184 patients, or 93% received additional follow-up systemic chemotherapy.
  • PFS progression free survival
  • HR hazard ratio
  • CI 95% confidence interval
  • FFPE and fresh frozen tissue were taken prior to ICI treatment.
  • DNA extraction, library preparation and sequencing were processed as described above, and DNeasy blood and tissue kit (Qiagen, 69504), QIAamp DNA FFPE tissue kit (Qiagen, 56404) or AllPrep DNA / RNA Mini kit (Qiagen, 80204) were used. And extracted genomic DNA. Accordingly, the presence or absence of tumor tissue in the sequenced sample and the percentage of tumors with predicted survival were reviewed by a thoracic pathologist (Y.L.C.). The mean sequencing ranges across all tumor and blood samples were 100X and 50X, respectively, and samples with poor sequencing ranges (tumor mean target range ⁇ 25x, normal mean target range ⁇ 15x) were excluded.
  • the BAM file to be analyzed was created using the pipeline described above. To identify cancer/normal tissue, NGSCheckMate was used in the QC stage. Somatic mutations were distinguished by comparing tumor-matched peripheral blood mononuclear blood samples with the MuTect 2 and Pindel algorithms. In addition, the copy number (copy number) and B-allele frequency profiles (B-allele frequency profiles) were measured using Control-FREEC.
  • HR pathway related genes (Supplementary Table S2) found in previous studies were used, and deletions, stopgain mutations, and frameshifts or splice site alterations in these genes were used. Tumors with included truncation mutations were evaluated as HR deficient. For the BRCA1 and BRCA2 mutations, all variants were manually reviewed according to the American College of Medical Genetics and Genetics (ACMG) standards and guidelines.
  • Genes containing significant mutations were identified using MutSigCV in 198 NSCLC patients.
  • significant mutations were defined as genes mutated with a Q-value of less than 0.01 in the MutSigCV algorithm.
  • Immunotherapy-related genes were 12 kinds of STK11, JAK2, JAK1, B2M, TAP1, TAP2, TAPBP, CANX, HSPA5, PDIA3, CALR, and POLE identified in previous studies, and survival analysis was performed using one or more samples. The proceeds were limited to more altered genes.
  • Digit class HLA-I was calculated using germline WES reads using Optitype. Specifically, MuTect2 was used to generate a list of mutant peptides, and neoantigen prediction was performed with MuPeXI. The MuPeXI was NetMHCpan v4.0 (48), and MuPeXI was used to detect all 9-mer mutant peptides (novel 9- mer mutant peptides) were calculated. The prediction of affinity was predicted by percentile rank, and both mutant and normal peptides were determined using NetMHCpan-4.0. MuPeXI ranked mutant peptides based on priority scores. The priority score was calculated in the following manner.
  • the affinity based on the percentile rank of the mutant and normal peptides was predicted, and the reference proteome match penalty and the mutant allele frequency were calculated.
  • the mutant AF was assumed to be the same constant in this study.
  • the halplotype-specific copy number of the HLA site was calculated using LOH HLA, and the estimated values of purity and ploidy of CHAT were used as input values.
  • PFS and OS were estimated using the Kaplan-Meier method, and the difference between the groups of PFS and OS was evaluated using a log rank test.
  • comparison of categorical variables between the two groups was performed using Fisher's exact test or a chi-square test for three groups.
  • a non-parametric Mann-Whitney U test or an unpaired t test was used to evaluate the difference between the mean or median value of the continuous variable between the two groups, and the Benjamini-Hochberg P value was used to explain multiple comparisons.
  • HR and 95% CI were calculated using the Cox proportional hazard model.
  • Multivariate survival assays were performed using a Cox proportional hazard model to assess the impact of TMB, PD-L1 expression, and HR gene alterations on PFS while adjusting for other covariates described.
  • a receiver operator characteristic (ROC) curve representing the sensitivity and 1-characteristics of the continuous variables was used. Also, a P value less than 0.05 was considered to be statistically significant for all comparisons, and all p values were double-sided. All statistical analysis was performed using R 3.3.3.
  • 5 is a heat map of oncogenic drivers identified in tumors of NSCLC patients prior to immunotherapy; Each row represents individual patients grouped according to clinical response.
  • Silico neoantigen prediction which is generally used, is based on peptide-HLA binding affinity, and the prediction accuracy of the method can be improved by accumulating eluted ligand data, but the new antigen burden
  • the (neoantigen burden) measurement has had a problem in its accuracy using a computer-aided prediction method so far, and there was an inaccuracy in predicting the ICI responsiveness. Therefore, the present inventors determined that TMB is more suitable for predicting ICI reactivity.
  • an HLA-corrected TMB HLA-corrected TMB (HLA-corrected TMB) of the following equation was designed.
  • TMB is the number of nonsynonymous alterations (SNV or indel),
  • NeoAg is the neoantigen burden calculated by Mupexi
  • NeoAgL is the value of neoantigens predicted to bind to lost HLA alleles calculated by Mupexi and LOH HLA. It was set to 0 in the absence of HLA LOH.
  • NeoAgC is the value of a neoantigen predicted to bind to both lost HLA alleles and keep HLA alleles. In the absence of HLA LOH, the value was set to 0.
  • TMB was measured to be greater in the OR group than in the non-responder group.
  • the inventors have used the variable cutoff of TMB to define what is'high TMB' among several studies. First, 25 TMB subgroups were defined by classifying the experimental group of non-small cell lung cancer treated with ICI by a percentage value, and the same approach was also used to determine the criteria for defining'high TMB'.
  • somatic mutations and copy number alterations contribute to the response to ICI (data not shown).
  • the mutant genes were analyzed using 12 immune-related genes and MutSigCV, which were used as predictive markers in the previous study.
  • the STK11 mutation was found in 9 patients, but no statistical significance was observed.
  • 4 truncated mutations were identified, of which 3 patients had no response.
  • JAK1, JAK2, and B2M mutations were too rare to investigate association with ICI. This is because only 3 of the patients had the JAK1, JAK2, or B2M mutations.
  • the CAN mutation was also investigated, but there was no significant association with this.
  • 10 is a graph comparing the expression of TMB and PD-L1 between the responding group and the non-responding group after classifying the patient group by smoking status.
  • 11 is a graph showing the results of patients expressing PD-L1.
  • the present inventors further analyzed whether mutations in certain genes can serve as potential markers for non-smokers.
  • 13A and 13B are graphs showing PFS or EGFR modification by TP53 in a group of non-smokers receiving ICI treatment.
  • TP53 and EGFR mutations are important biomarkers in non-smokers receiving ICI.
  • TP53 mutation was associated with a decreased treatment response in non-smokers.
  • HLA human leukocyte antigen
  • the frequency of HLA LOH was observed in 198 non-small cell lung cancer patients using a highly sensitive LOH detection pipeline that can accurately calculate the number of specific copies of the HLA site.
  • the present inventors have identified 54 of 198 people with LOH in at least one HLA-I locus. That is, it was confirmed that 27% of tumors had LOH.
  • 14A is a diagram showing the frequency of HLA LOH in a patient group.
  • 14B is a diagram showing the relationship between TMB and HLA LOH in the patient group.
  • 14C is a diagram showing the relationship between TMB and HLA LOH in the patient group.
  • FIG. 15 is a diagram showing a neoantigen predicted to bind to the predicted loss of HLA LOH for each patient, and a neoantigen predicted to bind to the retained HLA LOH.
  • Figure 16a is a diagram showing the correlation of the modified TMB and HLA LOH in the patient group.
  • 16B is a diagram showing the PFS of a group of patients classified as HLA LOH.
  • the present inventors found that the high mutation load among LOH patients was simply associated with an unrelated neoantigen in the lost HLA allele. And it was investigated whether it was not related to the anti-tumor immune response.
  • the ratio of the neoantigen estimated to be bound to the HLA allele and the corrected TMB were designed on a computer.
  • the modified TMB did not count as HLA LOH patients had higher TMB than those who did not. This suggests that HLA LOH is immune editing and indicates that it affects the elevation of TMB.
  • the present inventors investigated whether the modified TMB has another advantage over the existing TMB.
  • the modified TMB was applied to the HLA LOH sample to classify the high TMB group and the low TMB group.
  • 17A and B are diagrams showing the ratio of non-synonymous mutations that bind only to the lost HLA allele or to the retained HLA allele for group reclassification of the patient group using the modified TMB.
  • 18A is a diagram showing the distribution of a patient group changed from a high TMB group to a low TMB group by modified TMB.
  • 18B is a diagram showing the recurrence or mortality rate of a patient group changed from a high TMB group to a low TMB group by modified TMB.
  • 19A and B are diagrams showing the recurrence or mortality rate of a patient group classified as a high TMB group by modified TMB.
  • 20A is a diagram showing the distribution of TMB values in all patient groups by modified TMB.
  • 20B is a diagram showing the distribution of TMB values in a patient group whose TMB group classification was changed by the modified TMB.
  • 21A and 21B are diagrams showing the risk of recurrence or death over time in a patient group whose TMB group classification was changed by modified TMB.
  • the group change patients had lower PFS and OS, although TMB was similar to that of the top TMB 15-25% patients.
  • the present inventors compared the top 37 modified TMB (modified TMB ⁇ 272 mutation) patients with the top 37 TMB patients to investigate whether the modified TMB has an additional predictive value for distinguishing respondents and non-responders. .
  • PD-L1 AUC 0.66, 95% CI, 0.56-0.76; Supplementary Figure S3F).
  • PD-L1 expression alone was not sufficient to predict a treatment response.
  • the present inventors investigated whether the usefulness as a biomarker improves when looking at PD-L1 expression together with TMB.
  • Figure 22b is a diagram showing the response to ICI in the high TMB patient group.
  • Figure 22c is a diagram showing the response to ICI in the high TMB patient group.
  • 22D is a diagram showing the reactivity of patient groups classified by TMB and PD-L1.
  • FIG. 23 is a diagram showing a Forest plot showing the multivariate cox proportional hazards model.
  • the ORRs of patients with high TMB were similar between these two groups.
  • PD-L1 expression was evaluated in 70 of 75 patients, of which high expression of PD-L1 ( ⁇ 50% expression) was observed in 10 patients.
  • the present inventors performed comprehensive genomic analysis on high-grade NSCLC samples to investigate the role of genomic functions in determining response to ICI, and as a result, TMB as a biomarker as well as results consistent with previous findings. And the limitation of PD-L1 expression could also be found.
  • genetic features related to anticancer immune responses including HLA LOH, HR deficiency, and the TP53 mutation in non-smokers, may affect the reactivity to ICI.
  • Example 3 the present inventors found that HLA LOH is common in NSCLC prior to immunotherapy (27%) and is not associated with a reduced reactivity to antibodies targeting PD-1 / PD-L1.
  • a possible explanation for this discrepancy may be that the tumor types of patients in the existing study population were synthesized, or that the patient was treated with anti-CTLA-4, anti-PD-1, or a combination therapy thereof rather than anti-PD1 monotherapy. .
  • This finding suggests that MHC class I expression is not associated with primary resistance to anti-PD-1 agents in melanoma patients.
  • TMB tumor mutation load
  • TMB mutation burden
  • the modified TMB is a more reliable marker than the existing TMB, and is particularly superior in the non-smoker group.
  • additional genetic traits such as HR genetic modification and the STING pathway can aid in understanding and prediction of IO responses.

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Abstract

수정된 TMB를 분석하는 방법 및 이를 이용한 면역 관문 억제제에 대한 암 환자의 치료 반응성 예측 방법에 관한 것으로, 일 양상에 따른 정보를 제공하는 방법, 컴퓨터 기록매체 및 분석 장치에 따르면, 기존의 TMB와 비교하여 면역 항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성 예측력이 현저하게 우수하므로, 치료 효과가 나타날 것으로 예측되는 환자군을 선별할 수 있고, 결과적으로 적합한 치료를 수행하여 환자의 고통과 비용을 경감할 수 있다.

Description

수정된 TMB를 포함하는 면역항암치료의 예후 예측 방법
면역항암치료에 있어서 새로운 치료 예후를 예측하는 방법에 관한 것이다.
암은 우리나라 국민의 사망률 1위를 기록하는 질병으로, 항암제 개발의 필요성은 꾸준히 대두되고 있다.
항암제 개발 과정을 살펴보면, 빠르게 증식하는 종양세포의 특성을 이용하여 분열하는 세포를 공격하는 화학항암제와 종양 세포의 특정 분자나 신호전달 체계를 공격하는 표적항암제가 존재하였으나, 여러 부작용이 존재하였고, 체내의 선천 면역을 이용하여 부작용을 최소화 할 수 있는 면역항암제가 등장하였다.
면역항암치료란, 인체의 면역체계를 활성화 시켜서 암세포와 싸우게 하는 암 치료법을 말한다. 면역항암치료는 면역시스템을 이용하여 암세포만 공격해 기존의 항암치료보다 부작용이 적고, 면역시스템의 기억 능력과 적응력을 이용하기 때문에 장기간의 항암효과를 얻을 수 있다는 장점이 있다. 상기와 같이 기존 항암제의 단점을 극복하는 면역항암치료는 암치료의 새로운 패러다임으로 각광받고 있으며, 사이언스지는 2013년 올해의 연구로 면역항암제를 선정한 바 있다.
면역항암제는 종양 항원을 표적하는 항체치료제(Rituximab 등), 면역세포를 다시 활성화 하는 면역관문억제제(Immune checkpoint inhibitor 등), 면역세포를 직접 투여하는 면역세포치료제(Immune cell theraphy)등으로 구분할 수 있다(Oiseth et al, 2017).
최근에, 면역관문억제제 치료는 진행성 암의 치료를 발전시켰다. PD-1, PD-L1 및 세포 독성 T림프구 항원 4(CTLA-4)을 표적화 하는 항체는 모든 종류의 암에 있어서 놀라운 생존률의 향상을 제공한다는 사실이 밝혀졌다. 그러나 상기와 같은 잠재력에도 불구하고, 적은 수의 환자들만이 혜택을 얻을 수 있으며, 절반 이상의 환자가 조기 질병 악화를 경험하는 문제점이 있었다. 따라서 면역관문억제제 치료에 대한 효과적인 바이오마커에 대한 필요성이 강조되고 있다.
기존의 여러 연구에서 지속적으로 여러 종류의 암에서 높은 암 변이율(TMB)와 면역관문억제제 치료(ICIs)가 연관성을 가질 수 있음을 제기해 왔다. 특히 면역계에 의한 암 특이적 신생 항원(Tumor specific neoantigen)은 항 종양 면역반응을 활성화시키는 역할을 알 수 있는 것이 알려졌다. 그러나, 어떤 환자가 ICIs를 통해 혜택을 받을 수 있는지를 식별하는 것은 TMB의 임상적 이용에서 해결되지 않은 문제로 남아 있는 실정이다. 실제로 종양의 TMB 분포는 반응성 및 비 반응성 종양에서 중첩되어 있어 실질적으로 TMB만으로는 임상의 성공률을 예측하기에 충분하지 못하다는 지적이 있었다.
기존의 연구는 면역항암치료의 제한된 효과에 대한 기저 메커니즘을 거의 밝히지 못했다. 최근의 게놈 연구는 TMB의 한계를 인식하고 다른 잠재적 바이오마커를 탐색하고 면역항암치료와 관련된 게놈의 영향을 밝히는 추세에 있다. 실제로, 수정된 항원 제시 경로는 면역 회피의 기초가 되며 결국 항 종양 면역에 영향을 미칠 수 있다는 사실이 밝혀졌으나, ICIs 반응에서 방해 항원 제시의 임상적 의미는 뚜렷히 밝혀진 바가 없다.
따라서 본 발명자들은 면역항암치료 전 단계의 비소 세포 폐암(NSCLS)의 198개의 시퀀싱을 분석하여 항 종양 면역 반응에서의 예측가능한 새로운 바이오마커를 탐색하고 기존의 바이오마커와 조합될 수 있는지를 살펴보았다. 더불어, 수정된 항원 제시 경로와 ICIs에 사이의 연관성을 밝히기 위해 새로운 분석 방법을 도입하였다.
일 양상은 암 환자로부터 수득된 생물학적 시료를 시퀀싱(sequencing)하는 단계; 상기 시퀀싱 값을 필터링 하는 단계; 상기 필터링 된 시퀀싱 데이터를 이용하여 암 돌연변이 부담(Tumor mutation burden: TMB)을 계산하는 단계; 및 상기 계산된 TMB 값을 하기 수학식 1을 이용하여 수정하는 단계를 포함하는 수정된 TMB(corrected TMB)를 분석하는 방법을 제공한다.
[수학식 1]
Figure PCTKR2020014934-appb-I000001
다른 양상은 상기 계산된 TMB 값으로 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성을 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 상기 방법을 컴퓨터에서 실행시키기 위한 프로그램을 기록한 컴퓨터로 읽을 수 있는 기록매체를 제공한다.
또 다른 양상은 암 환자로부터 수득된 생물학적 시료의 시퀀싱을 수행하여 유전자 데이터 세트를 생성하는 데이터 생성부; 상기 측정된 유전자 데이터에서 필터링을 수행함으로서 TMB를 측정하는 계산부; 및 상기 측정된 TMB 값을 하기 수학식 1을 이용하여 수정된 TMB 값으로 계산하는 수정부를 포함하는, 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성을 분석하는 장치를 제공한다.
일 양상은 암 환자로부터 수득된 생물학적 시료를 시퀀싱(sequencing)하는 단계; 상기 시퀀싱 값을 필터링 하는 단계; 상기 필터링 된 시퀀싱 데이터를 이용하여 암 돌연변이 부담(Tumor mutation burden: TMB)을 계산하는 단계; 및 상기 계산된 TMB 값을 하기 수학식 1을 이용하여 수정하는 단계를 포함하는 수정된 TMB(corrected TMB)를 분석하는 방법을 제공한다.
[수학식 1]
Figure PCTKR2020014934-appb-I000002
상기 TMB는 익명 변경 횟수(nonsynonymous alteration)(SNV 또는 indel)이며, NeoAg는 Mupexi의 결과로 계산된 신생 항원 부담(neoantigen burden)을 의미한다. 또한, NeoAgL는 Mupexi와 LOH HLA에 의해 손실된 HLA alleles와 결합할 것으로 예측되는 Neoantigens의 값으로, HLA LOH가 없는 경우에는 0으로 설정하였다. NeoAgC는 손실된 HLA 대립 유전자 및 유지 된 HLA 대립 유전자 둘 다에 결합할 것으로 예측된 신생 항원(neoantigen)의 값이다. HLA LOH 가 없는 경우 값을 0으로 설정하였다.
상기 수정된 TMB는 HLA-수정된 TMB(HLA-corrected TMB)로 명명될 수 있다.
용어 "종양 돌연변이 부담(Tumor mutation burden: TMB)은 암 세포의 DNA에서 발견되는 돌연변이의 총 수를 의미한다. 일반적으로, 많은 수 돌연변이를 가지는 암의 경우 특정 면역항암치료에 반응성이 좋은 것일 수 있다. TMB는 면역항암치료의 바이오마커로 이용되는 것일 수 있다.
용어 "시퀀싱(sequencing)"은 DNA 또는 RNA 시퀀싱을 의미하는 것일 수 있다. DNA 시퀀싱은 DNA 조각에 대해 뉴클레오타이드 서열을 결정짓는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 암 환자의 생물학적 시료로부터 수득한 DNA의 서열을 분석하는 과정을 의미하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 시퀀싱 방법은 Chain termination method, pyrosequencing, Next generation sequencing, Deep sequencing 또는 Whole Exome Sequencing(WES)일 수 있다. 바람직하게는, Next generation sequencing일 수 있으며, Next generation sequencing 은 deep sequencing 또는 Whole Exome Sequencing(WES)일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, deep sequencing일 수 있다.
용어 "딥 시퀀싱(deep sequencing)"이란, high-throughput sequencing이라고도 명명되며, 유전자 지역(genomic region)을 여러 번에 걸쳐서 시퀀싱하는 것을 의미할 수 있다. 보다 구체적으로, 100번 내지 1000번 정도의 시퀀싱을 거치는 것일 수 있으며, 다세대 시퀀싱 접근 방법(Next generation sequencing approach)을 의미하는 것일 수 있다. 상기 딥 시퀀싱을 이용할 경우 전체의 1%이하의 드문 유전자 결함, 클론 타입 등을 발견할 수 있는 것일 수 있다.
상기 whole exome sequencing의 경우, 유전자 서열의 전체를 시퀀싱하는 방법으로서, 시간과 비용이 과도하게 드는 것일 수 있으며, read depth가 높지 않을 경우, 민감도가 낮아지는 문제점이 있을 수 있다. 딥 시퀀싱을 이용할 경우, High depth targeted sequencing의 한 종류로서, 상기와 같은 문제들을 최소화 할 수 있다.
도 4는 일 양상에 따른 수정된 TMB 및 이를 이용한 면역 관문 억제제에 대한 암 환자의 치료 반응성 예측 방법의 흐름도이다.
상기 방법은, 도 4에 나타낸 것과 같이, 암 환자로부터 수득된 생물학적 시료를 시퀀싱(sequencing)하는 단계를 포함할 수 있다. 암 환자는 폐암 환자 또는 소세포폐암 환자일 수 있으며, 상기 생물학적 시료는 암 세포일 수 있다. 상기 단계는 암 환자의 생물학적 시료의 유전자 서열을 분석하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법은, 도 4에 나타낸 것과 같이, 상기 시퀀싱 값을 필터링 하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 환자의 유전자 분석 결과에서 TMB를 계산하기 위하여 불필요한 정보 또는 변수를 제거하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 필터링은 기본 필터링 또는 추가 필터링일 수 있다.
용어 "필터링(filitering)"이란, 상기 시퀀싱 값을 보정하는 단계를 의미할 수 있다. 보다 구체적으로, TMB의 정의에 맞지 않는 값을 제거함으로서 정확도를 높이는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 추가 계산된 부분을 제외하여 보정하는 단계를 의미하는 것일 수 있다.
상기 필터링 방법은 non-coding region variant 필터링, germline variant 필터링, synonymous mutation 필터링, Low VAF variant 필터링, truncation mutation 필터링, known somatic alteration 필터링으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 기본 필터링은 non-coding region variant, germline variant, 또는 synonymous mutation 제거를 포함하는 것일 수 있다. 상기 기본 필터링 단계는, minor allele frequency 1% 이상의 변이를 제거하는 단계, 논코딩 부분의 변이를 제거하는 단계 또는 synonymous mutation 을 제거하는 단계일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 기본 필터링 단계는, Exome Aggregation Consortium(ExAC) 데이터 베이스와 1000 Genome Project 데이터 베이스에서 minor allele frequency 1% 이상의 변이는 germline variant로 가정하고 제거하는 단계, 다음으로 Tumor mutation burden은 코딩 영역의 variant들에서 계산되기 때문에 intron 등 non-coding 지역에서 발굴 된 variant또한 제외하는 단계, 마지막으로 위의 두 과정에서 남은 변이 중 synonymous mutation은 Tumor mutation burden의 정의와 맞지 않기 때문에 제거하는 단계일 수 있다.
상기 추가 필터링은 Low VAF variant, truncation mutation 또는 known somatic alteration 제거 단계를 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 먼저 Low vaf variant를 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 Low VAF variant의 제거는 tumor의 subclone의 variant일 가능성이 크기 때문에 환자의 ICI 반응을 예측 하기 위해 계산하는 TMB에 포함되면 결과에 혼동을 줄 수 있기 때문일 수 있다. 다음으로 Tumor suppressor 유전자의 truncation mutation을 제거하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 마지막으로 Tumor driven variant를 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 상기와 같은 추가 필터링을 포함할 경우 딥 시퀀싱 에서 보다 정확한 TMB계산이 가능한 것일 수 있다.
상기 방법은, 도 4에 나타낸 것과 같이, 상기 필터링 된 시퀀싱 데이터를 이용하여 암 돌연변이 부담(Tumor mutation burden: TMB)을 계산하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 TMB는 필터링 단계 후 남은 변수들로 계산하는 것일 수 있다. 상기 암 돌연변이 부담(Tumor mutation burden: TMB)의 계산은 기존에 공지된 계산 방법을 모두 이용할 수 있다.
상기 방법은, 도 4에 나타낸 것과 같이, 상기 계산된 TMB 값을 상기 수학식 1을 이용하여 수정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 수정하는 단계는, 기존의 TMB의 계산 방법을 수정함으로서, 신생 항원 부담 등에 의한 불확실성을 제거하여, 결과적으로 비흡연자 폐암 환자에서의 TMB 정확도를 높이는 것일 수 있다.
용어 "신생 항원(neoantigen)"이란, 기존까지 면역계에서 인식된 바 없었던 항원을 의미하는 것이다. 신생 항원은 종양 세포의 조각, 종양 세포 돌연변이에서 유래된 종양 세포 단백질 또는 바이러스 단백질에서 유래되는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 암 세포의 단백질 코딩 유전자에 돌연변이가 일어나는 경우 잠재적인 신생 항원이 되는 것일 수 있다. 또한 신생 항원은 next generation sequencing 방법으로 측정되는 것일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 딥 시퀀싱에 의해 측정되는 것일 수 있다.
용어 "신생 항원 부담(neoantigen burden)"이란, 신생 항원의 개수를 의미하는 것일 수 있으며, ICI 반응성을 예측하는 바이오마커의 일종일 수 있다. 또한 시퀀싱에 의해 측정되는 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 신생 항원은 LOA 환자들에게서 면역 편집(immune editing)을 유발하여 TMB의 정확도를 떨어뜨리는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 손실된 HLA 유전자에 신생 항원들이 결합하여 TMB의 값을 높이는 것일 수 있다.
용어 "생물학적 시료"는 대상체로부터 수득된 시료를 의미한다. 상기 생물학적 시료는 전혈, 혈장, 혈청, 적혈구, 백혈구(예를 들어 말초 혈액 단핵구), 유관액, 복수, 늑막 유출물(pleural efflux), 수유관액(nipple aspirate), 림프액(예를 들어, 림프절의 파종성 종양 세포), 골수 흡인물, 타액, 소변, 대변(즉, 배설물), 가래, 기관지 세척액, 눈물, 미세 바늘 흡인물(예를 들어, 무작위 유선 미세 바늘 흡인에 의해 수확된), 임의의 기타 체액, 조직 시료(예를 들어, 종양 조직) 예를 들어, 종양 생검(예를 들어, 천자 생검) 또는 림프절(예를 들어, 감시 (sentinel) 림프절 생검), 조직 시료(예를 들어, 종양 조직), 예를 들어, 종양의 수술적 절제, 및 이의 세포 추출물을 포함할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 전혈 또는 이의 일부 성분, 예를 들어, 혈장, 혈청 또는 세포 펠렛일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 시료는 당해 기술분야에 공지된 임의의 기법을 사용하여 전혈 또는 이의 세포 분획물로부터 고형 종양의 순환 세포를 단리함으로써 수득될 수 있다. 일 구체예에 있어서, 시료는 예를 들어, 고형 종양으로부터의 포르말린 고정된 파라핀 포매 (FFPE) 종양 조직 시료 일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 시료는 암을 갖는 개체로부터 수득한 동결 조직으로부터 제조된 종양 용해물 또는 추출물일 수 있다.
상기 "수득"은 생물학적 시료로부터 핵산 시료 또는 폴리펩티드 시료를 수득하는 것일 수 있다. 상기 핵산 시료의 수득은 통상의 핵산 분리방법에 의하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산을 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction: PCR), 리가제 연쇄 반응 (ligase chain reaction: LCR), 전사 매개 증폭 (transcription mediated amplification), 또는 실시간-핵산 서열 기초 증폭 (realtime-nucleic acid sequence based amplification: NASBA)을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 또는 표적 핵산은 조 분리된 핵산으로서 생물학적 시료의 파쇄물로부터 얻을 수 있다. 상기 폴리펩티드 시료의 수득은 통상의 단백질 추출 또는 분리 방법에 의하여 수행될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 암 환자는 폐암, 흑색종, 호지킨림프종, 위암, 요로상피세포암, 두경부암, 간암, 대장암, 전립선암, 췌장암, 간암, 고환암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 방광암, 뇌암, 유방암, 또는 신장암 환자일 수 잇다. 예를 들어, 상기 암 환자는 폐암 환자일 수 있다. 바람직하게는 비소세포폐암 환자일 수 있다.
일 구체예에 있어서 상기 암 환자는 비흡연자 또는 과거 흡연자일 수 있다. 바람직하게는 비흡연자 일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 암 환자의 암은 폐암, 흑색종, 호지킨림프종, 위암, 요로상피세포암, 두경부암, 간암, 대장암, 전립선암, 췌장암, 간암, 고환암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 방광암, 뇌암, 유방암, 또는 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 폐암은 비소세포폐암 또는 소세포폐암 일 수 있다.
다른 양상에 있어서, 암 환자로부터 수득된 생물학적 시료를 시퀀싱(sequencing)하는 단계; 상기 시퀀싱 값을 필터링 하는 단계; 상기 필터링 된 딥 시퀀싱을 이용하여 암 돌연변이 부담(Tumor mutation burden: TMB)을 계산하는 단계; 상기 계산된 TMB 값을 상기 수학식 1을 이용하여 수정하는 단계; 및 상기 계산된 수정된 TMB 값을 토대로 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성을 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 반응성의 예측은 수정된 TMB의 값이 암에 걸리지 않은 대조군과 비교했을 때 더 높은 경우, 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성이 높을 것으로 예측하고, 더 낮을 경우, 반응성이 낮을 것으로 예측하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 반응성의 예측은 수정된 TMB의 값이 면역항암제에 반응성이 좋은 환자의 수정된 TMB 값과 비교했을 때 비슷하거나 더 높은 경우, 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성이 높을 것으로 예측하고, 더 낮을 경우, 반응성이 낮을 것으로 예측하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 반응성의 예측은 수정된 TMB의 값이 전체 환자 데이터와 비교하였을 때, 상위 20 내지 30% 이상인 경우, 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성이 높을 것으로 예측하고, 하위 20 내지 30%인 경우, 반응성이 낮을 것으로 예측하는 것일 수 있다.
상기 암, 암 환자, 수득, 생물학적 시료, 시퀀싱, 필터링, TMB, 수학식 1에 대한 설명은 상술한 바와 같다.
용어 “면역 항암제”는 인체의 면역세포를 활성화시켜서 암세포를 사멸시키는 항암제로, 환자 스스로의 면역 강화를 통해 암의 치료효과를 나타내는 약제를 의미할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 면역 항암제는 면역 관문 억제제일 수 있다.
용어 “면역 관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)”는 T 세포 억제에 관여하는 면역 관문 단백질(immune checkpoint protein) 예컨대, 종양세포에서 발현되는 PD-L1과 같은 단백질의 활성화를 차단함으로써 T 세포를 활성화시켜 암세포를 공격하는 면역 항암제를 의미할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 면역 관문 억제제는 항-PD-L1, 항-PD-1, 및 항-CTLA-4로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며 예를 들어, 항-PD-1일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 면역 관문 억제제는 PD-L1과 PD-1 사이의 결합을 억제시키는 것일 수 있다. 구체적으로, PD-L1 또는 PD-1에 결합할 수 있는 항체일 수 있으며, 예를 들어, 단일클론 항체일 수 있고, 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체일 수 있다.
용어 "치료 반응성"은 개개의 환자의 암에 대해 특정 약물 예를 들어, 항암제가 치료 효과를 나타내는지 여부를 의미할 수 있다. 용어 "암 환자의 치료 반응성 예측"은 약제의 투약이 암의 치료에 유용할 수 있는지의 여부를 투약 전에 미리 예측하는 것을 의미할 수 있고, 유전자의 발현량을 측정하거나 바이오마커를 이용하여 약제에 대한 치료 반응성을 예측하는 것일 수 있다.
용어 "예측"은 특정 유전자의 발현량 또는 바이오마커의 확인 등과 같은 특징의 확인을 통해 특정 결과 예컨대, 치료 반응성을 미리 판단하는 것을 의미할 수 있다.
용어 "전체 환자 데이터"란, 다수의 집단으로 구성된 암 환자의 TMB 데이터를 의미하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 암 환자로부터 수득된 시료의 시퀀싱을 수행하여 유전자 데이터 세트를 생성하는 단계를 통해 생성된 데이터일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 반응성의 예측은 전체 환자 데이터의 분포를 확인하고 결정된 TMB 컷오프(TMB cutoff)를 이용하여 환자를 "높은 TMB 그룹" 또는 "낮은 TMB 그룹"으로 분류하는 것일 수 있다. 상기 TMB 컷오프는 상위 30%까지 "높은 TMB 그룹"으로, 하위 30%까지 "낮은 TMB 그룹"으로 정의하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 높은 TMB 그룹은 상위 25%, 상위 20% 또는 상위 15%까지를 의미할 수 있으며, 낮은 TMB 그룹은 하위 25%, 하위 20% 또는 하위 15%까지를 의미하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상위 TMB의 컷오프의 기준점을 더 높게 하는 것은 TMB 판단의 정확도를 높이는 데에 기여하는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 방법은 상기 암 환자로부터 수득된 생물학적 시료로부터 Programmed death-ligand 1(PD-L1)의 발현을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 PD-L1의 발현값과 상기 수정된 TMB의 값을 조합하여 면역항암제에 대한 반응성을 예측하는 단계를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
상기 반응성을 예측하는 단계는 PD-L1 발현이 높을수록 ICI 반응성이 높은 것으로 평가하는 것일 수 있고, PD-L1 만으로는 반응성의 예측이 불완전하나, 수정된 TMB 값과 조합하여 판단할 경우 그 정확도가 높아지는 효과가 있을 수 있다. 보다 구체적으로, 낮은 TMB 그룹의 경우 PD-L1 발현량에 의한 예측이 더 정확할 수 있다. 예를 들어, 높은 TMB, 높은 PD-L1 발현량의 경우 반응성이 좋은 것으로 판단하고, 낮은 TMB, 낮은 PD-L1 발현량일 경우 반응성이 나쁜 것으로 판단할 수 있으나, 낮은 TMB, 높은 PD-L1의 경우 PD-L1 값을 확인하여 반응성의 정도를 판단하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 PD-L1 발현량의 측정은 웨스턴 블롯, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직 면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay), 유세포분석 (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 및 단백질 칩 (protein chip)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 기법에 의해 수행되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 유전자의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
용어 "항체"는 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미할 수 있다. 일 양상에 따른 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있으며, 나아가, 인간화 항체 등의 특수항체도 포함될 수 있다. 일 양상에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편은 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등일 수 있다.
용어 "유전자"는 단백질 코딩 또는 전사 시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미할 수 있다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다. 일 양상에 따른 유전자는 종양 미세환경 유전자일 수 있다. 용어 "종양 미세환경 (Tumor microenvironment; TME)"은 암세포 주위에 혈관, 면역세포, 섬유아세포, 골수 유래 염증세포, 림프구, 신호전달 분자, 세포외 기질 등이 둘러 싸여 있는 세포환경을 의미할 수 있다. 용어"종양 미세환경 유전자"는 종양 미세환경에 관여하는 유전자로, 면역 항암제에 대한 반응성을 예측하는 마커로 활용되는 것일 수 있다.
다른 양상은, 상기 방법을 컴퓨터에서 실행시키기 위한 프로그램을 기록한 컴퓨터로 읽을 수 있는 기록매체를 제공한다.
다른 양상은, 적어도 하나의 프로세서에 의해 동작하는 컴퓨팅 장치가 동작하는 방법으로서, 상기 방법을 컴퓨터에서 실행시키기 위한 프로그램을 포함하는, 동작 방법을 제공한다.
다른 양상은, 컴퓨팅 장치로서, 메모리, 그리고 상기 메모리에 로드된 프로그램의 명령들(instructions)을 실행하는 적어도 하나의 프로세서를 포함하고, 상기 프로그램은 암 환자로부터 수득된 생물학적 시료의 시퀀싱을 수행하여 유전자 데이터 세트를 생성하는 데이터 생성 단계; 상기 측정된 유전자 데이터에서 필터링을 수행함으로서 TMB를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 TMB 값을 상기 수학식 1을 이용하여 수정된 TMB 값으로 수정하는 단계를 실행하도록 기술된 명령들을 포함하는, 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성을 분석하는 컴퓨팅 장치를 제공한다.
도 2는 일 양상에 따른 암 환자 치료 반응성 분석 장치 또는 컴퓨팅 장치를 나타낸 모식도이다.
도 2를 참고하면, 분석 장치(10)는 암 환자로부터 수득한 생물학적 시료를 이용하여, 수정된 TMB값을 도출할 수 있고, 이를 기반으로 암 환자의 치료 반응성을 예측할 수 있다.
도 3은 일 양상에 따른 암 환자 치료 반응성 분석 장치 또는 컴퓨팅 장치의 하드웨어 구성들을 나타낸 블록도이다.
분석 장치(10)의 데이터 생성부(110)에서 수신하는 유전자 데이터 세트는 암 환자로부터 수득된 생물학적 시료의 시퀀싱을 수행하여 유전자 데이터 세트를 생성하는 것일 수 있다.
수정된 TMB, 수학식 1, 면역항암제, 암, 암 환자, 생물학적 시료, 시퀀싱, 유전자는 전술한 바와 같다.
또 다른 양상은, 암 환자로부터 수득된 생물학적 시료의 시퀀싱을 수행하여 유전자 데이터 세트를 생성하는 데이터 생성부; 상기 측정된 유전자 데이터에서 필터링을 수행함으로서 TMB를 측정하는 계산부; 및 상기 측정된 TMB 값을 상기 수학식 1을 이용하여 수정된 TMB 값으로 계산하는 수정부를 포함하는, 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성을 분석하는 장치를 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 장치는 상기 수정된 TMB의 값이 암에 걸리지 않은 대조군과 비교했을 때 더 높은 경우, 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성이 높을 것으로 예측하고, 더 낮을 경우, 반응성이 낮을 것으로 예측하는 분석부를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
도 2는 일 양상에 따른 암 환자 치료 반응성 분석 장치를 나타낸 모식도이다.
도 2를 참고하면, 암 환자 치료 반응성 분석 장치(10)는 암 환자로부터 수득한 생물학적 시료를 이용하여, 수정된 TMB값을 도출할 수 있고, 이를 기반으로 암 환자의 치료 반응성을 예측할 수 있다.
도 3은 일 양상에 따른 암 환자 치료 반응성 분석 장치의 하드웨어 구성들을 나타낸 블록도이다.
암 환자 치료 반응성 분석 장치(10)의 데이터 생성부(110)에서 수신하는 유전자 데이터 세트는 암 환자로부터 수득된 생물학적 시료의 시퀀싱을 수행하여 유전자 데이터 세트를 생성하는 것일 수 있다. 상기 생물학적 시료 및 시퀀싱은 상술한 바와 같다.
암 환자 치료 반응성 분석 장치(10)의 계산부(120)에서 상기 데이터 세트를 수신하여 필터링을 수행하고 TMB를 측정하는 것일 수 있다. 상기 필터링, TMB 측정은 상술한 바와 같다.
암 환자 치료 반응성 분석 장치(10)의 수정부(130)는 상기 측정된 TMB 값을 상기 수학식 1을 이용하여 수정된 TMB 값으로 계산하는 것일 수 있다. 상기 수학식 1, 수정된 TMB는 상술한 바와 같다.
일 실시예에 있어서, 상기 장치는 상기 수정된 TMB의 값이 면역항암제에 반응성이 좋은 환자의 수정된 TMB 값과 비교했을 때 비슷하거나 더 높은 경우, 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성이 높을 것으로 예측하고, 더 낮을 경우, 반응성이 낮을 것으로 예측하는 분석부를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
상기 분석부는, 전체 환자 데이터의 분포를 확인하고 결정된 TMB 컷오프(TMB cutoff)를 이용하여 환자를 “높은 TMB 그룹” 또는 “낮은 TMB 그룹”으로 분류하는 것일 수 있다. 또한, 상기 TMB 컷오프는 상위 30%까지 “높은 TMB 그룹”으로, 하위 30%까지 “낮은 TMB 그룹”으로 정의하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상위 25%, 상위 20%, 상위 15%까지를 의미할 수 있으며, 하위 25%, 하위 20%, 하위 15%까지를 의미하는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 장치는 상기 수정된 TMB의 값이 전체 환자 데이터와 비교하였을 때, 상위 30 내지 0%인 경우, 높은 TMB 그룹으로 정의하며, 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성이 높을 것으로 예측하는 분석부를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 수치는 상위 30 내지 0, 25 내지 0, 20 내지 0, 15 내지 0 10 내지 0%일 수 있다. 바람직하게는 20 내지 0% 일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 하위 30 내지 0%인 경우, 낮은 TMB 그룹으로 정의하며, 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성이 낮을 것으로 예측하는 분석부를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 하위 30 내지 0, 25 내지 0, 20 내지 0, 15 내지 0 10 내지 0%일 수 있다. 바람직하게는 20 내지 0% 일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상위 TMB의 컷오프의 기준점을 더 높게 하는 것은 TMB의 정확도를 높이는 데에 기여하는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 장치는 상기 암 환자로부터 수득된 생물학적 시료로부터 PD-L1 발현을 측정하는 측정부; 및 상기 측정값과 상기 수정된 TMB 값을 조합하여 면역항암제에 대한 반응성을 판단하는 판단부를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
상기 판단부는 PD-L1 발현이 높을수록 ICI 반응성이 높은 것으로 평가하는 것일 수 있고, PD-L1 만으로는 반응성의 예측이 불완전하나, 수정된 TMB 값과 조합하여 판단할 경우 그 정확도가 높아지는 효과가 있을 수 있다. 보다 구체적으로, 낮은 TMB 그룹의 경우 PD-L1 발현량에 의한 예측이 더 정확할 수 있다. 예를 들어, 높은 TMB, 높은 PD-L1 발현량의 경우 반응성이 좋은 것으로 판단하고, 낮은 TMB, 낮은 PD-L1 발현량일 경우 반응성이 나쁜 것으로 판단할 수 있으나, 낮은 TMB, 높은 PD-L1의 경우 PD-L1 값을 확인하여 반응성의 정도를 판단하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 PD-L1 발현량의 측정은 웨스턴 블롯, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직 면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay), 유세포분석 (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 및 단백질 칩 (protein chip)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 기법에 의해 수행되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 유전자의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 암 환자는 폐암, 흑색종, 호지킨림프종, 위암, 요로상피세포암, 두경부암, 간암, 대장암, 전립선암, 췌장암, 간암, 고환암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 방광암, 뇌암, 유방암, 또는 신장암 환자일 수 잇다. 예를 들어, 상기 암 환자는 폐암 환자일 수 있다. 바람직하게는 비소세포폐암 환자일 수 있다.
일 구체예에 있어서 상기 암 환자는 비흡연자 또는 과거 흡연자일 수 있다. 바람직하게는 비흡연자 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구체예에 있어서, 상기 암 환자의 암은 폐암, 흑색종, 호지킨림프종, 위암, 요로상피세포암, 두경부암, 간암, 대장암, 전립선암, 췌장암, 간암, 고환암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 방광암, 뇌암, 유방암, 또는 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 폐암은 비소세포폐암 또는 소세포폐암 일 수 있다.
상기 수득, 생물학적 시료, 시퀀싱, 필터링, TMB, 수학식 1, 면역항암제, 치료 반응성 및 발현은 상술한 바와 같다.
본 실시예들에서 사용되는 용어는 본 실시예들에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 기술분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 임의로 선정된 용어도 있으며, 이 경우 해당 실시예의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서, 본 실시예들에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 실시예들의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
실시예들에 대한 설명들에서, 어떤 부분이 다른 부분과 연결되어 있다고 할 때, 이는 직접적으로 연결되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 구성요소를 사이에 두고 전기적으로 연결되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성요소를 포함한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 또한, 실시예들에 기재된 "..부", "..모듈"의 용어는 적어도 하나의 기능이나 동작을 처리하는 단위를 의미하며, 이는 하드웨어 또는 소프트웨어로 구현되거나 하드웨어와 소프트웨어의 결합으로 구현될 수 있다.
본 실시예들에서 사용되는 "구성된다" 또는 "포함한다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 여러 구성 요소들, 도는 여러 단계들을 반드시 모두 포함하는 것으로 해석되지 않아야 하며, 그 중 일부 구성 요소들 또는 일부 단계들은 포함되지 않을 수도 있고, 또는 추가적인 구성 요소 또는 단계들을 더 포함할 수 있는 것으로 해석되어야 한다.
하기 실시예들에 대한 설명은 권리범위를 제한하는 것으로 해석되지 말아야 하며, 해당 기술분야의 당업자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 실시예들의 권리범위에 속하는 것으로 해석되어야 할 것이다. 이하 첨부된 도면들을 참조하면서 오로지 예시를 위한 실시예들을 상세히 설명하기로 한다.
일 양상에 따른 수정된 TMB 및 이를 이용한 면역 관문 억제제에 대한 암 환자의 치료 반응성 예측 방법에 따르면, 면역 항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성 예측력이 현저하게 우수하므로, 치료 효과가 나타날 것으로 예측되는 환자군을 선별할 수 있고, 결과적으로 적합한 치료를 수행하여 환자의 고통과 비용을 경감할 수 있다.
도 1은 일 양상에 따른 수정된 TMB 및 이를 이용한 면역 관문 억제제에 대한 암 환자의 치료 반응성 예측 방법의 흐름도이다.
도 2는 일 양상에 따른 암 환자 치료 반응성 분석 장치를 나타낸 모식도이다.
도 3은 일 양상에 따른 암 환자 치료 반응성 분석 장치의 하드웨어 구성들을 도시한 블록도이다.
도 4는 일 양상에 따른 암 환자의 치료 반응성 예측 방법의 필터링 방법의 흐름도이다.
도 5 내지 9는 연구 집단인 NSCLC 환자들에게서 TMB 및 ICI에 대한 반응과 관련된 임상 및 유전적 특성을 나타낸 도이다.
도 5는 면역 요법 전의 NSCLC 환자 종양에서 확인된 암 유발성 유전자(oncogenic drivers)의 열지도이다; 각 열은 임상 반응에 따라 그룹화된 개별 환자들을 나타낸다.
도 6는 높은 TMB 및 낮은 TMB 를 갖는 환자에서 ORR 대 ICI를 나타낸 그래프이다(Fisher's exact test 사용).
도 7는 TMB와 관련된 유전적 및 임상적 특징을 나타낸 그래프이다(왼쪽부터 암 유발성 유전자(oncogenic drivers) 돌연변이 대 야생형, P = 0.0105; 흡연자 대 비흡연자, P <0.0001; 이전 흡연자 대 비흡연자, P <0.0001; 현 흡연자 과거 흡연자, P = 0.2332; HR 변형 대 야생형의 경우, P <0.0001 이며, Mann-Whitney U test 사용하였다).
도 8는 ICI의 PFS를 TMB의 높고 낮음에 의해 계층화 한 그래프이다.
도 9는 Kaplan-Meier 생존 분석으로 ICI로 치료받은 환자의 HR 결핍이 PFS 증가와의 관련성 여부를 나타내는 그래프이다; P값은 양면 로그 랭크 테스트(two-sided log-rank test)를 나타낸다.
도 10 내지 13은 흡연자와 비 흡연자 사이의 바이오마커 차이점에 관한 그래프이다.
도 10은 환자 그룹을 흡연 여부로 분류한 다음, 반응 그룹과 무 반응 그룹 사이의 TMB 및 PD-L1 발현을 비교한 그래프이다.
도 11은 PD-L1을 발현하는 환자들의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12은 비흡연자 그룹에서의 ICI 반응성에 관련된 비동의적 돌연변이(ninsynonymous mutations)를 나타낸 것이다; 각 유전자들은 Q value 0.01 이하인 것만 측정하였다.
도 13a 및 b는 ICI 치료를 받는 비흡연자 그룹에서 TP53에 의한 PFS 또는 EGFR 변형을 나타낸 그래프이다.
도 14a는 환자군의 HLA LOH의 빈도를 나타낸 도이다.
도 14b는 환자군의 TMB 및 HLA LOH 연관성을 나타낸 도이다.
도 14c는 환자군의 TMB 및 HLA LOH 연관성을 나타낸 도이다.
도 15는 환자 별 예측된 손실된 HLA LOH에 결합할 것으로 예측되는 신생 항원, 유지된 HLA LOH에 결합할 것으로 예측되는 신생 항원을 나타낸 도이다.
도 16a는 환자군의 수정된 TMB 및 HLA LOH 연관성을 나타낸 도이다.
도 16b는 HLA LOH로 분류된 환자군의 PFS를 나타낸 도이다.
도 17a 및 b는 수정된 TMB를 이용한 환자군의 그룹 재분류를 위하여, 손실 된 HLA 대립 유전자에만 결합하거나 유지된 HLA 대립 유전자에 결합하는 비동의적 돌연변이의 비율을 나타낸 도이다.
도 18a는 수정된 TMB에 의해 높은 TMB 군에서 낮은 TMB군으로 변화된 환자군의 분포를 나타낸 도이다.
도 18b는 수정된 TMB에 의해 높은 TMB 군에서 낮은 TMB군으로 변화된 환자군의 재발 또는 사망률을 나타낸 도이다.
도 19a 및 b는 수정된 TMB에 의해 높은 TMB 군으로 분류된 환자군의 재발 또는 사망률을 나타낸 도이다.
도 20a는 수정된 TMB에 의한 전체 환자군의 TMB 값 분포를 나타낸 도이다.
도 20b는 수정된 TMB에 의해 TMB 군 분류가 변화된 환자군의 TMB 값 분포를 나타낸 도이다.
도 21a 및 b는 수정된 TMB에 의해 TMB 군 분류가 변화된 환자군의 시간에 따른 재발 또는 사망 위험을 나타낸 도이다.
도 22a는 CR / PR (n = 45) 대 SD / PD (n = 99) 환자의 PD-L1 발현 분포 및 높은 TMB (n = 35) 대 낮은 TMB (n) 환자의 PD-L1 발현 분포른 나타낸 도이다.
도 22b는 높은 TMB 환자군의 ICI에 대한 반응을 나타낸 도이다.
도 22c는 높은 TMB 환자군의 ICI에 대한 반응을 나타낸 도이다.
도 22d는 TMB 및 PD-L1 별로 분류된 환자군의 반응도를 보여주는 도이다.
도 23은 다변량 콕스 비례 위험 모델(the multivariate cox proportional hazards model)을 나타내는 포레스트 플롯(Forest plot)을 나타내는 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 실험 재료 및 실험 준비
1.1 환자 그룹 준비 및 반응 평가(Response Evaluation) 방법
비소세포폐암 환자 198명을 대상으로 연구를 수행하였다. 구체적으로, 상기 환자들은 항 PD-1 억제제 단일 치료를 받은 환자군 (77%), 항 PD-L1 단일 치료를 받은 환자군(23%)로 구성되었다. 상기 환자들은 ICI 치료를 시작하기 전에 생검 표본을 채취하였다. 또한 효능 분석에 대한 유효한 데이터를 얻을 수 있는 조건인 경우에만 등록을 허여하였다.
표 1은 실험에 참가한 비소세포폐암 환자 198명의 데이터를 나타낸 표이다.
Patient All Patients CR/PR SD/PD p Value
N = 198 No.(%) 61 (31%) No.(%) 137 (69%) No.(%)
Median Age (range) 62.1 (33-84) 65.1 (44-83) 61.4 (33-84) 0.0236
Gender 0.3528
Male 140 (71) 48 (75) 94 (69)
Female 58 (29) 15 (25) 43 (31)
Median TMB (range) 143 (1-1765) 194 (3-1765) 131 (1-1035) 0.0069
Smoking status 0.1492
Current/former 130(66) 45(74) 85(62)
Never 68(34) 16(26) 52(38)
Performance status 0.2526
ECOG 0 & 1 172(87) 56(92) 116(85)
ECOG 2 26(13) 5(8) 21(15)
Histology 0.9664
LUAD 129(65) 40(66) 89(65)
LUSC 58(29) 18(29) 40(29)
Others 11(6) 3(5) 8(6)
Immunotherapy 0.5976
Nivolumab 74(37) 20(33) 54(40)
Pembrolizumab 78(40) 27(44) 51(37)
Anti-PDL-1 agent 46(23) 14(23) 32(23)
Line of therapy 0.3931
First 14(7) 5(8) 9(6)
Second 66(33) 24(39) 42(31)
Third or more 118(60) 32(53) 86(63)
PD-1 expression 0.0209
<1% 34(17) 8(13) 26(19)
1-49% 35(18) 6(10) 29(21)
≥50% 75(38) 31(51) 44(32)
Unknown 54(27) 16(26) 38(28)
Actionable mutations
EGFR muta 36 7 29
KRAS mutb 26 11 15
ALK fusion 6 1 5
BRAF mut (p.V600E) 4 1 3
ROS1 fusion 2 1 1
RET fusion 2 0 2
표 1의 줄임말은, CR 은 완전 반응(complete response); PR은 부분 반응(partial response); SD은 안정적 반응(stable disease); PD는 공격적 병증(progressive disease); ECOG은 The Eastern Cooperative Oncology Group; LUAD은 Lung adenocarcinoma; LUSC은 Lung squamous cell carcinoma; HLA LOH은 loss of heterozygosity at the class I human leukocyte antigen이다. 또한, aEGFR mutation은 Del19, L858R, Del18, and Ins20; bKRAS mutation은 G12A, G12C, G12D, G12V를 의미한다.
표 1에 나타낸 것과 같이, ICI 단일 투여에 대한 목표 반응 비율(omplete response (CR)/partial response (PR))은 31%이었다. median TMB는 143개의 돌연변이였으며(range, 1 to 1765 mutations), TMB의 분포는 기존의 연구에서 ICIs 치료를 받은 비소세포폐암 환자의 것과 유사하였다. 총 198명의 환자 중 184명의 환자, 즉 93%가 추가적인 후속 전신 항암 요법을 받았다. 반응군과 비 반응 군 사이의 ECOG(Eastern Cooperative Oncology Group) 점수는 비슷하였다. 그러나 2점의 ECOG 점수를 보이는 26명, 즉 13%의 환자가 유의적으로 progression free survival [PFS]가 짧은 것을 확인할 수 있었다(PFS; hazard ratio (HR) = 2.43, 95% confidence interval (CI)). 그 밖의 다른 임상적 특성은 OR 그룹과 무 반응 그룹 사이에 균등하게 분배되어 있었다.
상기와 같은 연구 준비는 삼성 의료원 기관 윤리 심의위원회/개인 정보 보호위원회 (승인 번호: 2018-03-130 및 2013-10-112) 또는 서울대학교병원 생명 윤리위원회 (승인 번호: 1805-109)에 의해 승인되었다. 모든 참여 환자는 등록 전에 서면 동의서를 제공하였고, using Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, version 1.1 (RECIST v1.1)으로 객관적 반응을 평가하였다. 보다 구체적으로 CR 또는 PR 환자는 반응자인 것으로, SD 또는 PD 환자는 비 응답자로 평가하였다. 환자 그룹의 통계학적 특성은 전자 의료 차트로부터 수득하였다. 샘플에서의 PD-L1 발현 평가는 FDA 승인 Dako PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 키트 (Agilent Technologies)를 기초로 하였다.
1.2 조직 게놈학적(Tissue genomic) 분석
모든 종양 샘플은(FFPE 및 신선한 냉동 조직) ICI 처리 전에 채취하였다. DNA 추출, 라이브러리 준비 및 시퀀싱은 전술한 바와 같이 처리하였으며, DNeasy 혈액 및 조직 키트 (Qiagen, 69504), QIAamp DNA FFPE 조직 키트 (Qiagen, 56404) 또는 AllPrep DNA / RNA Mini 키트 (Qiagen, 80204)를 사용하여 게놈 DNA를 추출 하였다. 이에 따라 서열 분석된 샘플에서 종양 조직의 존재 여부 및 생존이 예상되는 종양의 백분율을 흉부 병리학자(thoracic pathologist)(Y.L.C)가 검토하였다. 모든 종양 샘플 및 혈액 샘플에 걸친 평균 시퀀싱 범위는 각각 100X 및 50X이었으며, 시퀀싱 범위가 불량한 샘플(종양 평균 목표 범위 <25x, 정상 평균 목표 범위 <15x)은 제외하였다. 분석할 BAM 파일은 상술할 파이프 라인을 사용하여 생성하였다. 암 /정상 조직을 확인하기 위해, NGSCheckMate를 QC 단계에서 사용하였다. 체세포 돌연변이는 MuTect 2와 Pindel 알고리즘으로 종양과 일치하는 말초 혈액 단핵 혈액 샘플을 비교함으로써 구별되었다. 또한 카피 넘버(copy number) 및 B-대립 유전자 빈도 프로파일(B-allele frequency profiles)은 Control-FREEC를 사용하여 측정하였다.
1.3 HR 유전자 및 HR 결실 평가
기존 연구에서 밝혀진 HR 관련 유전자 (HR pathway related genes) (보충 표 S2)를 사용하였으며, 상기 유전자에서 결실, 스톱게인 돌연변이(stopgain mutation) 및 프레임 시프트(frameshift) 또는 스플 라이스 변경(splice site alterations)을 포함한 절단 돌연변이를 갖는 종양을 HR 결핍으로 평가하였다. BRCA1 및 BRCA2 돌연변에 대해서는 미국 의학 유전학 및 유전학 대학의(ACMG) 표준 및 지침에 따라 모든 변이체를 수동 검토하였다.
1.4 유의미한 돌연변이 유전자 및 면역 관련 유전자 정의
198명의 NSCLC 환자에서 MutSigCV를 사용하여 유의미한 돌연변이를 포함하는 유전자를 확인하였다. 본 실험에서는 유의미한 돌연변이를 MutSigCV 알고리즘에서 0.01 미만의 Q- 값으로 돌연변이 된 유전자로 정의하였다. 면역 요법 관련 유전자는 기존 연구에서 밝혀진 12가지의 STK11, JAK2, JAK1, B2M, TAP1, TAP2, TAPBP, CANX, HSPA5, PDIA3, CALR, POLE를 사용하였으며, 생존 분석(survival analysis)은 1 개 이상의 샘플보다 변경된 유전자로 제한해 진행하였다.
1.5 HLA 분석 방법 및 Silico Neoantigen 예측 파이프 라인
digit class HLA-I는 Optitype을 사용한 생식 계열 WES 판독(germline WES reads)을 사용하여 계산되었다. 구체적으로, 돌연변이 펩티드의 목록을 생성하기 위해 MuTect2을 사용하였으며, MuPeXI 로 신생 항원 예측을 수행 하였다. 상기 MuPeXI은 NetMHCpan v4.0 (48)을 사용하였고, MuPeXI를 사용하여 점 돌연변이(somatic mutation), 삽입 및 결실로 구성된 검출된 체세포 돌연변이(nonsynonymous point mutation)로부터 모든 9-mer 돌연변이 펩티드(novel 9-mer mutant peptides)를 계산하였다. 친화도의 예측은 백분위 순위로 예측하였으며, 돌연변이 및 정상 펩티드 모두 NetMHCpan-4.0를 이용하여 결정하였다. MuPeXI는 우선 순위 점수에 기초하여 돌연변이 펩타이드를 순위화하였다. 우선 순위 점수는 하기와 같은 방법으로 계산하였다. 우선, 돌연변이 및 정상 펩티드의 백분위 순위 기반의 친화도를 예측하고, 기준 프로테옴 매치 패널티 및 돌연변이 대립 유전자 빈도를 계산하였다. 또한 실행 가능한 변이체의 상당 부분이 동일한 임상 표본의 섹션 내에서 낮은 대립 유전자 빈도(allele frequency: AF)와 가변 AF를 가질 수 있기 때문에, 본 연구에서 돌연변이 AF는 동일 상수로 가정하였다.
1.5 HLA 분석 방법 및 Silico Neoantigen 예측 파이프 라인
HLA 위치의 halplotype-specific copy number는 LOH HLA를 사용하여 계산했으며, CHAT의 순도 및 배수성 추정값은 입력 값을 사용하였다.
1.6 통계 분석
본 발명에서, PFS 및 OS는 Kaplan-Meier 방법을 사용하여 추정하였고, 로그 순위 테스트를 사용하여 PFS와 OS의 그룹 간 차이를 평가하였다. 또한 두 그룹 사이의 범주 변수에 대한 비교는 Fisher's exact test 또는 세 그룹에 대한 카이-제곱 검정(chi-square test)을 사용하여 수행하였다. non-parametric Mann-Whitney U test 또는 unpaired t test을 이용하여 두 그룹 간의 연속 변수에 대한 평균 또는 중앙값의 차이를 평가하였으며, 다중 비교를 설명하기 위해 Benjamini-Hochberg P 값을 사용하였다. HR 및 95 % CI는 Cox 비례 위험 모델을 사용하여 계산하였다. 다변량 생존 분석을 기술 된 다른 공변량을 조정하면서 PFS에 대한 TMB, PD-L1 발현, HR 유전자 변경의 영향을 평가하기 위해 Cox 비례 위험 모델을 사용하여 수행하였다. 연속 변수의 민감도 및 1-특성을 표시하는 수신기 운영자 특성(ROC) 곡선(1-specificity of continuous variables)이 사용되었다. 또한 0.05보다 작은 P 값은 모든 비교에 대해 통계적으로 유의함을 나타내는 것으로 간주되었으며, 모든 p 값은 양면이었다. 모든 통계 분석은 R 3.3.3을 사용하여 수행하였다.
도 5는 면역 요법 전의 NSCLC 환자 종양에서 확인된 암 유발성 유전자(oncogenic drivers)의 열지도이다; 각 열은 임상 반응에 따라 그룹화된 개별 환자들을 나타낸다.
도 6는 높은 TMB 및 낮은 TMB 를 갖는 환자에서 ORR 대 ICI를 나타낸 그래프이다(Fisher's exact test 사용).
그 결과, 도 5 내지 6에 나타낸 것과 같이, 실험 대상인 198명의 환자군의 TMB 및 ICI에 대한 반응과 관련된 임상 및 유전적 특성을 분석할 수 있었다.
실시예 2. TMB를 수정한 Corrected TMB 계산 방법
일반적으로 이용되는 Silico 신생 항원 예측(Silico neoantigen prediction)은 펩티드-HLA 결합 친화도에 기반한 것으로, 상기 방법의 예측 정확도는 용리된 리간드 데이터(eluted ligand data)를 축적함으로서 개선될 수 있지만, 신생 항원 부담(neoantigen burden) 측정은 지금까지 컴퓨터를 이용한 예측 방법을 이용하여 그 정확도에 문제가 있었으며, ICI 반응성을 예측하기에는 부정확한 면이 있었다. 따라서, 본 발명자들은 TMB가 ICI 반응성을 예측하는 데 더 적합하다고 판단하였다. 상기와 같은 이유로, 본 발명에서는 신생 항원 부담(neoantigen burden)을 사용하는 대신 하기와 같은 방정식의 HLA-수정된 TMB(HLA-corrected TMB)를 설계하였다.
[수학식 1]
Figure PCTKR2020014934-appb-I000003
TMB는 익명 변경 횟수(nonsynonymous alteration)(SNV 또는 indel),
NeoAg는 Mupexi로 계산된 신생 항원 부담(neoantigen burden),
NeoAgL는 Mupexi 및 LOH HLA에 의해 계산된 손실된 HLA alleles(lost HLA alleles)와 결합할 것으로 예측되는 신생 항원(Neoantigens)의 값이다. HLA LOH가 없는 경우 0으로 설정하였다.
NeoAgC는 손실된 HLA 대립 유전자(lost HLA alleles) 및 유지된 HLA 대립 유전자(keep HLA alleles) 둘 다에 결합할 것으로 예측된 신생 항원(neoantigen)의 값이다. HLA LOH 가 없는 경우 값을 0으로 설정하였다.
실시예 3. 비소세포폐암(NSCLC) 환자에서 요인별 ICI 반응 연관성 확인
3.1 TMB의 수정 필요성의 판단
상기 실시예 1의 환자군에서 TMB를 측정한 결과, TMB는 OR 그룹에서 무 반응 그룹보다 더 크게 측정되었다. 본 발명자들은 TMB의 변수 컷오프를 사용하여 여러 연구 사이에서 '높은 TMB' 가 무엇인지 정의하였다. 먼저 ICI 처리된 비소세포폐암의 실험 그룹을 퍼센트 값으로 분류해 25개의 TMB 하위 그룹을 정의하였는데, 상기와 같은 접근 방식을 '높은 TMB'를 정의하기 위한 기준을 결정하는 데에도 사용하였다.
도 8는 ICI의 PFS를 TMB의 높고 낮음에 의해 계층화 한 그래프이다.
도 9는 Kaplan-Meier 생존 분석으로 ICI로 치료받은 환자의 HR 결핍이 PFS 증가와의 관련성 여부를 나타내는 그래프이다; P값은 양면 로그 랭크 테스트(two-sided log-rank test)를 나타낸다.
도 8 및 9에 따르면, 높은 TMB(독립적인 연구 집단에서 상위 25%로 정의된, 272개의 돌연변이로 지정)와 개선된 무진행 생존률(PFS)(HR = 0.67, 95% CI, 0.45-0.99; log-rank test, P = 0.043)간에는 연관성이 존재하였다. 그러나 곡선 아래 면적(AUC)는 0.62(95%)이었으며, 이는 TMB가 단독으로 사용될 경우 매우 불량한 바이오마커임을 의미하는 것이다.
3.3 상동-의존성 재조합 유전자 변형(Homology-dependent recombination gene alteration)과 증가된 TMB 및 ICIs 치료 효과 간의 연관성 확인
다음으로, 본 발명자들은 TMB가 다른 유전적, 임상적 특징과 관련성이 있는지를 조사하였다.
도 7는 TMB와 관련된 유전적 및 임상적 특징을 나타낸 그래프이다(왼쪽부터 암 유발성 유전자(oncogenic drivers) 돌연변이 대 야생형, P = 0.0105; 흡연자 대 비흡연자, P <0.0001; 이전 흡연자 대 비흡연자, P <0.0001; 현 흡연자 과거 흡연자, P = 0.2332; HR 변형 대 야생형의 경우, P <0.0001 이며, Mann-Whitney U test 사용하였다).
도 7에 따르면, 현재 또는 과거의 흡연, 상동 재조합 결핍은 높은 TMB 값과 관련이 있었으며, 반면에 대표적 암 유전자 돌연변이는 낮은 TMB 값과 관련성이 있었다.
전체 환자군 중, HR 결핍의 존재는 37명의 환자(18.7%)에서 관찰되었으며, 상기와 같은 HR 결핍의 존재는 카플란-마이어 생존 분석(HR = 0.65, 95% CI, 0.42-1.00, 로그 순위 테스트, P = 0.049)분석에 따르면, 보다 긴 PFS와 연관되었다. 단, OR 대 ICI(OR to ICIs, odds ratio = 1.70, P = 0.17)와 HR 결핍은 연관성이 확인될 만큼 데이터가 풍부하지 않았다. ICI 반응과 HR 결핍의 연관성을 명확히 하기 위해, 우리는 이 연관성이 다변성 모델에서 통계적으로 유의미한지 여부를 조사하였다. PD-L1 발현은 144명의 환자에서 가능하였다. 수정된 HR 기능 (144 중 27, 18.8%)은 이들 환자에서 연령, 성별, ECOG, 이력, 흡연 및 PD-L1 표현(HR 0.58, 95% CI, 0.34-0.99, P = 0.046, 데이터 미도시)을 조정한 후 ICI에 대한 응답의 독립적인 예측 변수로 남아 있었다(데이터 미도시).
3.4 체세포 돌연변이 (Somatic mutations)와 비흡연자 비소세포폐암(NSCLC) 환자의 ICI 반응성 간의 연관성
ICI 반응성의 유전적 측면을 자세히 살펴보기 위해, 본 발명자들은 체세포 돌연변이 및 copy number alterations(CAN)가 ICI에 대한 반응에 기여하는지 여부를 조사하였다(데이터 미도시). 먼저, 이전의 연구에서 예측 마커로 사용되었던 12개의 면역 관련 유전자 및 MutSigCV를 이용하여 돌연변이 유전자를 분석하였다. STK11 돌연변이의 경우 9명의 환자에서 발견되었지만, 통계적 유의성은 관찰되지 않았다. 또한 9명의 환자에서, 4개의 절단 돌연변이가 확인되었고, 그 중 3명의 환자에서는 아무런 반응이 없었다. 또한 JAK1, JAK2, 및 B2M 돌연변이는 ICI와의 연관성을 조사하기에는 빈도가 너무 드물었다. 전체 중 3명의 환자만이 JAK1, JAK2, 또는 B2M 돌연변이를 가지고 있었기 때문이다. CAN 돌연변이 또한 조사하였으나, 이와 유의미한 연관성은 없었다.
본 실험에서의 연구 집단은 기존의 연구 집단보다 비 흡연자의 비율이 34.4%로 더 높았기 때문에, 본 발명자들은 비흡연자가 다른 분자 메커니즘을 통해 ICI 반응에 관여하는지를 살펴보았다.
도 10은 환자 그룹을 흡연 여부로 분류한 다음, 반응 그룹과 무 반응 그룹 사이의 TMB 및 PD-L1 발현을 비교한 그래프이다.
도 11은 PD-L1을 발현하는 환자들의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12은 비흡연자 그룹에서의 ICI 반응성에 관련된 비동의적 돌연변이(ninsynonymous mutations)를 나타낸 것이다; 각 유전자들은 Q value 0.01 이하인 것만 측정하였다.
도 10 및 12에 따르면, 비흡연자의 경우 ICI 반응자가 비 반응자에 비해 TMB 및 PD-L1 발현이 유의미하게 높지 않은 것으로 확인되었다. 이는 현재 널리 사용되고 있는 바이오 마커들이 비흡연자에게 효과적이지 않을 수 있음을 의미하는 것이다.
따라서 본 발명자들은 특정 유전자의 돌연변이가 비 흡연자에게 잠재적인 표지로서 역할을 할 수 있는지를 추가로 분석하였다.
도 13a 및 b는 ICI 치료를 받는 비흡연자 그룹에서 TP53에 의한 PFS 또는 EGFR 변형을 나타낸 그래프이다.
도 13에 따르면, TP53 및 EGFR 돌연변이가 ICI를 받는 비흡연자에서 중요한 바이오마커임을 확인하였다. 또한, TP53 돌연변이는 비흡연자에서 감소된 치료 반응과 관련이 있는 것을 확인하였다.
3.5 클래스 1 HLA에서의 LOH(Loss of heterozygosity) 및 TMB 사이의 연관성
class 1 human leukocyte antigen(HLA)에서 loss of heterozygosity(LOH) locus가 TMB 및 면역 항암에 대한 반응에 미치는 영향에 대해 연구하기 위하여, 198명의 비소세포폐암 환자에서 HLA LOH의 빈도를 관찰하였다.
구체적으로, HLA 위치의 특이적 복사본 수를 정확하게 계산할 수 있는 고감도 LOH 검출 파이프라인을 사용하여 198명의 비소세포폐암 환자에서 HLA LOH의 빈도를 관찰하였다. 본 발명자들은 적어도 하나의 HLA-I locus 에서 LOH를 가진 198명 중 54명을 확인하였다. 즉 27%의 종양에서 LOH를 가짐을 확인하였다.
도 14a는 환자군의 HLA LOH의 빈도를 나타낸 도이다.
도 14b는 환자군의 TMB 및 HLA LOH 연관성을 나타낸 도이다.
도 14c는 환자군의 TMB 및 HLA LOH 연관성을 나타낸 도이다.
도 15는 환자 별 예측된 손실된 HLA LOH에 결합할 것으로 예측되는 신생 항원, 유지된 HLA LOH에 결합할 것으로 예측되는 신생 항원을 나타낸 도이다.
도 16a는 환자군의 수정된 TMB 및 HLA LOH 연관성을 나타낸 도이다.
도 16b는 HLA LOH로 분류된 환자군의 PFS를 나타낸 도이다.
도 14 내지 16에 따르면, HLA LOH와 항 PD-L1 작용제에 대한 개선된 반응 사이에는 연관성이 없었다.
상기 살펴본 바와 같이, HLA LOH와 TMB 및 높은 돌연변이 부담 간의 ICI 반응성에 대한 관련성이 밝혀지지 않았기 때문에, 본 발명자들은 LOH 환자 중에서 높은 돌연변이 부하가 단순히 손실된 HLA 대립 유전자에 관련 없는 신생 항원과 결합한 것이 원인이고, 항 종양 면역반응과는 관련이 없는 것인지를 조사하였다. 먼저, 도 11에 나타낸 것과 같이 HLA 대립 유전자에 결합되는 것으로 추정되는 신생 항원의 비율 및 corrected TMB를 컴퓨터상에 디자인하였다.
그 결과, 수정된 TMB는 HLA LOH 환자가 그렇지 않은 환자보다 높은 TMB를 가지고 있다고 계산하지 않았다. 이는 HLA LOH가 면역 편집을 제안하며, TMB의 상승에 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 이러한 관찰은 기존의 TMB 계산 방법이 항원 제시 경로의 방해가 존재하는 일부 환자에서 적합하지 않음을 시사하는 것이다.
3.6 HLA에서의 corrected TMB와 ICI 반응성 간의 연관성
HLA 유전자에서 항원 제시와의 관련성을 감안할 때, 본 발명자들은 수정된 TMB가 기존의 TMB를 능가하는 또 다른 이점이 있는지를 조사하였다.
먼저, 수정된 TMB를 HLA LOH 샘플에 적용하여 높은 TMB 그룹과 낮은 TMB 그룹을 분류하였다.
도 17a 및 b는 수정된 TMB를 이용한 환자군의 그룹 재분류를 위하여, 손실된 HLA 대립 유전자에만 결합하거나 유지된 HLA 대립 유전자에 결합하는 비동의적 돌연변이의 비율을 나타낸 도이다.
도 18a는 수정된 TMB에 의해 높은 TMB 군에서 낮은 TMB군으로 변화된 환자군의 분포를 나타낸 도이다.
도 18b는 수정된 TMB에 의해 높은 TMB 군에서 낮은 TMB군으로 변화된 환자군의 재발 또는 사망률을 나타낸 도이다.
도 19a 및 b는 수정된 TMB에 의해 높은 TMB 군으로 분류된 환자군의 재발 또는 사망률을 나타낸 도이다.
도 17 내지 19에서 나타낸 것과 같이, 10명의 환자가 높은 TMB그룹에서 낮은 TMB 그룹으로 재 분류되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 객관적 반응률(ORR), PFS 및 OS 는 높은 TMB 에서 낮은 TMB로 변경된 환자에게서 모두 낮은 것을 확인하였다. 이러한 데이터는 HLA LOH가 감소된 종양의 항원성과 관련이 있고(n = 9; median TMB 308 mutations), ICI에 대한 반응성에 영향을 준다는 것을 의미하는 것이다(n = 10; TMB range 282-477 mutations; Corrected TMB 143-271 mutations).
도 20a는 수정된 TMB에 의한 전체 환자군의 TMB 값 분포를 나타낸 도이다.
도 20b는 수정된 TMB에 의해 TMB 군 분류가 변화된 환자군의 TMB 값 분포를 나타낸 도이다.
도 21a 및 b는 수정된 TMB에 의해 TMB 군 분류가 변화된 환자군의 시간에 따른 재발 또는 사망 위험을 나타낸 도이다.
도 20 및 21에 나타낸 것과 같이, 그룹 변경 환자 들은 TMB가 상위 TMB 15-25% 환자들과 비슷함에도 불구하고, PFS, OS는 더 낮았다.
다음으로, 본 발명자들은 수정된 TMB(수정된 TMB ≥ 272 돌연변이) 환자 상위 37명과 TMB 환자 상위 37명을 비교하여 수정된 TMB가 응답자 및 무 응답자를 구별하기 위한 추가적인 예측값을 가지고 있는지 여부를 조사하였다.
그 결과, 수정된 TMB는 PFS 예측 부분에서 기존 TMB보다 더 뛰어남을 확인하였다(corrected TMB high versus low, PFS log-rank p = 0.005; TMB high versus low, PFS log-rank p = 0.020, 데이터 미도시).
3.7 TMB와 PD-L1 조합의 임상적 유용성
TMB와 PD-L1 조합의 임상적 유용성을 확인하기 위하여, PD-L1 발현은 144명의 환자에서 확인되었고, PD-L1가 높은 수준으로 발현되는(≥50 %) 환자는 42 %의 ORR을 산출함을 확인하였다. PD-L1 발현은 OR 환자에서 유의하게 더 높았다 (CR / PR 대 SD / PD, Mann-Whitney 테스트, P = 0.0020). PD-L1은 TMB와 비교하였을 때 유사한 정도로 무 반응 군으로부터 객관적으로 약제에 대한 반응을 구별할 수 있었다(PD-L1 AUC = 0.66, 95 % CI, 0.56-0.76; 보충도 S3F). 그러나 TMB와 마찬가지로, PD-L1 발현만으로는 치료 반응을 예측하기에는 충분하지 않았다. PD-L1 발현의 분포는 상위 TMB 군 및 하위 TMB 군(Mann-Whitney 테스트, P = 0.1222; 도 6A, 오른쪽)에서 유사하였으며, 이는 PD-L1 발현 수준이 TMB와 관련성이 없음을 의미하는 것이다.
따라서, 본 발명자들은 TMB와 함께 PD-L1 발현을 살필 경우 바이오 마커로서의 유용성이 개선되는지 여부를 조사했다.
도 22a는 CR / PR (n = 45) 대 SD / PD (n = 99) 환자의 PD-L1 발현 분포 및 높은 TMB (n = 35) 대 낮은 TMB (n) 환자의 PD-L1 발현 분포를 나타낸 도이다.
도 22b는 높은 TMB 환자군의 ICI에 대한 반응을 나타낸 도이다.
도 22c는 높은 TMB 환자군의 ICI에 대한 반응을 나타낸 도이다.
도 22d는 TMB 및 PD-L1 별로 분류된 환자군의 반응도를 보여주는 도이다.
도 23은 다변량 콕스 비례 위험 모델(the multivariate cox proportional hazards model)을 나타내는 포레스트 플롯(Forest plot)을 나타내는 도이다.
그 결과, 도 22 내지 23에 나타낸 것과 같이, ORM은 TMB가 낮은 환자에서 PD-L1 발현 그룹의 낮은 수준(<50 %)보다 높은 수준의 PD-L1 발현 그룹에서 유의하게 더 높았다(P = 0.0003) 더불어 TMB가 높은 환자의 ORR은 이 두 그룹간에 유사하였다.
종합하면, 이들 데이터는 PD-L1 발현이 TMB가 낮은 환자에서 더 우수한 예측력을 가짐을 의미하는 것이다(낮은 TMB의 PD-L1 AUC, 0.75, 95 % CI, 0.64-0.86; 높은 TMB의 PD-L1 AUC, 0.56, 95 % CI, 0.36-0.76; 보충적인 그림 S6A 및 S6B).
보다 자세하게, 진행 또는 사망의 위험 비율은 0.58 (PFS, 95 % CI, 0.38-0.89; P = 0.014) 및 0.55 (OS, 95 % CI, 0.31-0.95; P = 0.033)으로, 각각 TMB가 낮은 환자 그룹에서 높은 PD-L1 발현량 대 낮은 PD-L1 발현량 그룹의 사망률을 의미한다. 다변량 분석은 PD-L1 발현이 TMB가 낮은 환자군에서 연령, 성별, 조직학, 흡연 상태, ECOG 점수와 같은 변수를 제어한 경우, PFS (HR 0.57; 95 % CI, 0.36-0.92; P = 0.021) 및 OS (HR 0.51; 95 % CI, 0.27-0.97; P = 0.039)와 독립적으로 연관되어 있음을 확인하였다.
상기 결과의 검증을 위해, 독립적 ICI-처리 집단(resourceed ICI-cohort)의 75 개의 종양을 추가로 분석 하였다. PD-L1 발현은 75 명의 환자 중 70 명을 평가하였고, 그 중 10명의 환자에서 높은 발현의 PD-L1(≥ 50 % 발현)이 관찰되었다.
실시예 4. ICI 반응성을 예측하는 바이오마커의 확인
4.1 PD-L 및 TMB의 한계와 가능성의 확인
상기와 같이, 본 발명자들은 ICI에 대한 반응을 결정하는 게놈 기능의 역할을 조사하기 위해 고급 NSCLC 샘플에 대한 포괄적인 게놈 분석을 수행하였고, 그 결과 이전의 발견과 일치하는 결과뿐만 아니라 바이오 마커로서 TMB 및 PD-L1 발현의 한계 또한 발견할 수 있었다. 더불어 HLA LOH, HR 결핍 및 비 흡연자에서 TP53 돌연변이를 포함한 항암 면역 반응과 관련된 유전적 특징이 ICI에 대한 반응성에 영향을 줄 수 있음을 관찰하였다.
상기 실시예에 의하면 TMB가 낮은 환자는 PD-L1 발현과 ICIs 반응간에 유의 한 양의 상관 관계를 나타내는 반면, TMB가 높은 환자는 PD-L1 발현에 관계없이 반응성이 좋은 것으로 관찰되었다. 또한 높은 TMB를 정의할 때, 높은 TMB 컷오프 값(최고 20-25 %)을 적용하는 것이 도움이 됨을 확인하였고, PD-L1은 TMB의 조합 또한 활용성에 도움이 되는 것으로 판단되었다. 결과적으로 PD-L1은 TMB와 함께 적용될 때 향상된 임상적 유용성을 제공하는 것을 확인하였다.
4.2 ICI에 대한 반응과 HLA LOH의 관련성의 확인
상기와 같은 실시예 3을 통해, 본 발명자들은 HLA LOH가 면역 요법 전에 NSCLC에서 흔하며(27%) PD-1 / PD-L1을 표적으로 하는 항체에 대한 감소된 반응성과 관련이 없음을 발견하였다. 이러한 불일치에 대한 가능한 설명은 기존 연구 집단의 환자들의 종양 유형이 종합되었거나, 환자가 항-PD1 단일 요법이 아니라 항-CTLA-4, 항-PD-1 또는 이들의 조합 요법으로 치료되었기 때문일 수 있다. 상기 발견은 MHC 클래스 I 발현이 흑색종 환자에서 항-PD-1 작용제에 대한 일차 저항과 관련이 없음을 시사하는 것이다.
상기와 같이 관찰된 결과와 면역 감시 가설 간에 예상치 못한 불일치가 있기 때문에, 본 발명자들은 ICI에 대한 반응과 HLA LOH의 연관성이 종양 돌연변이 부하(TMB)를 고려할 때 정확도가 높아지는지를 살펴보았다.
그 결과, HLA LOH를 갖는 종양은 HLA LOH를 갖지 않는 종양에 비해 더 높은 돌연변이 부담(TMB)을 가졌지 만, 보정된 TMB는 HLA LOH를 갖는 종양에서 유의하게 상승되지 않았다. 이 관찰은 HLA LOH가 후속 하위 클론 확장(18)을 허용하는 개념을 뒷받침한다. HLA LOH를 나타내는 종양 샘플에서 TMB 상승이 확인되었으며, 상승된 TMB가 손실된 HLA 위치에 결합할 것으로 예상되는 하위 클론 신생 항원에 기여할 수 있음을 확인하였다. 이러한 데이터는 손실된 주장과 결합할 것으로 예측된 신생 항원이 하위 클론 확장에 기여할 수 있으며, 하위 클론 확장은 HLA 손실을 나타내는 종양의 TMB 증가로 이어질 수 있음을 암시한다.
더불어 수정된 TMB의 도입 결과 예측의 정확도가 높아진 것을 확인할 수 있었다. 보다 구체적으로 HLA LOH를 고려하는 상술한 접근 방식을 통해 높은 TMB와 ICI 반응성 사이의 관계에서 관찰된 이상치를 조정할 수 있었다. 그 결과 잃어버린 HLA 대립 유전자에만 결합할 것으로 예상되었던 신생 항원이 효과적인 항종양 면역을 이끌어내지 못할 수도 있다는 가설을 세웠다. 이러한 결과는, 수정 된 TMB는 높은 TMB에도 불구하고 ICI에 응답하지 않는 환자를 식별하는 데 더 유리함을 의미한다.
4.3 HR 유전자 변형과 TMB 연관성의 확인
상기 실시예에서, 본 발명자들은 HR 유전자 변형이 더 높은 TMB 및 더 긴 PFS와 관련이 있음을 분석하였다. 결함 DNA 손상 반응 및 복구 메커니즘에서 파생된 cytosolic DNA 조각이 인터페론 유전자 자극기(STING) 신호 경로를 자극하여 ICI에 대한 반응에 영향을 미치고, 체크 포인트 차단 반응(ICI)에서 DNA 복구 변경에 추가적으로 영향을 미치는 것일 수 있다. 다양한 세포질 DNA 센서가 세포질 DNA 단편에 결합하고 유형 1 인터페론 및 T 세포 모집을 통해 항 종양 활성을 유도하는 STING 경로를 활성화시키는 것으로 가정된다. 더불어 STK11 손실이 메틸화로 인한 STING 억제를 통해 면역 회피로 이어진다는 것을 관찰했다. 실제로, STK11-돌연변이는 NSCLC 집단에서 ICI에 대한 1 차 저항과 관련이 있었다. 또한 STK11 절단 돌연변이를 갖는 3/4 (75 %) 환자가 객관적인 반응에 도달하지 않는 것으로 관찰되었다. 전체적으로, 이들 연구는 면역 요법에서 STING 경로의 임상적 이용 가능성을 암시한다. 예를 들어, 의존적 항 종양 활성을 증가시키는 것은 ICI에 반응하지 않는 환자에서 효과적인 조합 전략이 될 수 있다.
4.4 비흡연자 비소세포폐암 환자에서의 ICI 반응성 예측 결과 확인
비 흡연자에서 발생하는 NSCLC는 발암 물질의 돌연변이 유발 효과에 의해 발생하는 흡연자의 NSCLC와는 다른 작용 기작을 가지는지 확인하기 위하여, 본 실험의 연구 집단에서, PD-L1 발현 및 TMB로는 흡연자로부터 ICI에 대한 반응성을 결정하기에 충분하지 않았다. 이러한 사실은, ICI 반응성 판단에 주요 체세포 돌연변이 여부가 중요함을 암시하는 것이다. 더불어 EGFR 돌연변이가 있는 환자는 객관적인 반응을 확인할 수 없음을 확인하였다. 또한, TP53 돌연변이는 증가 된 TMB 및 PD-L1 발현과의 공지된 연관성에도 불구하고 ICI에 대한 감소된 반응성과 관련이 있었다. 전임상 모델에서, 초기 데이터는 p53 기능의 상실이 감소 된 케모카인 생산을 통해 면역 세포 침윤을 감소 시킨다는 것을 시사하고 있다. 실제로, 종양의 면역 탈출()은 항 종양의 프라이밍() 및 트 래킹 주기를 비활성화함으로써 달성될 수 있었다.
상기와 같은 결과는, 수정된 TMB가 기존 TMB보다 더 신뢰할 수 있는 마커이며, 특히 비흡연자 군에서 더 뛰어남을 시사한다. 또한, HR 유전자 변형 및 STING 경로와 같은 추가적인 유전적 특성은 IO 반응의 이해 및 예측에 도움이 될 수 있다.

Claims (18)

  1. 암 환자로부터 수득된 생물학적 시료를 시퀀싱(sequencing)하는 단계;
    상기 시퀀싱 값을 필터링 하는 단계;
    상기 필터링된 시퀀싱 값을 이용하여 암 돌연변이 부담(Tumor mutation burden: TMB)을 계산하는 단계; 및
    상기 계산된 TMB 값을 하기 수학식 1을 이용하여 수정하는 단계를 포함하는 수정된 TMB(corrected TMB)를 분석하는 방법.
    [수학식 1]
    Figure PCTKR2020014934-appb-I000004
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 암 환자는 폐암 환자인 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 암 환자는 비 흡연자인 것인 방법.
  4. 암 환자로부터 수득된 생물학적 시료를 시퀀싱(sequencing)하는 단계;
    상기 시퀀싱 값을 필터링 하는 단계;
    상기 필터링 된 시퀀싱 값을 이용하여 암 돌연변이 부담(Tumor mutation burden: TMB)을 계산하는 단계;
    상기 계산된 TMB 값을 하기 수학식 1을 이용하여 수정하는 단계; 및
    상기 계산된 TMB 값을 토대로 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
    [수학식 1]
    Figure PCTKR2020014934-appb-I000005
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 반응성의 예측은 수정된 TMB의 값이 전체 환자 데이터와 비교하였을 때, 상위 20 내지 30% 이상인 경우, 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성이 높을 것으로 예측하고, 하위 20 내지 30%인 경우, 반응성이 낮을 것으로 예측하는 것인 방법.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 방법은 상기 암 환자로부터 수득된 생물학적 시료로부터 Programmed death-ligand 1(PD-L1)의 발현을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 PD-L1의 발현값과 상기 수정된 TMB의 값을 조합하여 치료 반응성을 예측하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
  7. 청구항 4에 있어서, 상기 면역항암제는 면역체크포인트억제제(Immune checkpoint inhibitors: ICIs)인 것인 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 면역체크포인트억제제(Immune checkpoint inhibitors: ICIs)는 항 PD-L1, 항-PD-L1, 항-PD-1, 또는 항-CTLA-4인 것인 방법.
  9. 청구항 4에 있어서, 상기 암 환자의 암은 폐암, 흑색종, 호지킨림프종, 위암, 요로상피세포암, 두경부암, 간암, 대장암, 전립선암, 췌장암, 간암, 고환암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 방광암, 뇌암, 유방암, 및 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 폐암은 비소세포 폐암 또는 소세포 폐암인 것인 방법.
  11. 청구항 4에 있어서, 상기 암 환자는 비 흡연자인 것인 방법.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항의 방법을 컴퓨터에서 실행시키기 위한 프로그램을 기록한 컴퓨터로 읽을 수 있는 기록매체.
  13. 암 환자로부터 수득된 생물학적 시료의 시퀀싱을 수행하여 유전자 데이터 세트를 생성하는 데이터 생성부;
    상기 측정된 유전자 데이터에서 필터링을 수행함으로서 TMB를 측정하는 계산부; 및
    상기 측정된 TMB 값을 하기 수학식 1을 이용하여 수정된 TMB 값으로 계산하는 수정부를 포함하는, 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성을 분석하는 장치.
    [수학식 1]
    Figure PCTKR2020014934-appb-I000006
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 장치는 수정된 TMB의 값이 전체 환자 데이터와 비교하였을 때, 상위 30% 내지 0%인 경우, 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성이 높을 것으로 예측하고, 하위 30% 내지 0%인 경우, 반응성이 낮을 것으로 예측하는 분석부를 추가적으로 포함하는 것인 장치.
  15. 청구항 13에 있어서, 상기 장치는 상기 암 환자로부터 수득된 생물학적 시료로부터 PD-L1 발현을 측정하는 측정부; 및
    상기 측정값과 상기 수정된 TMB 값을 조합하여 면역항암제에 대한 반응성을 판단하는 판단부를 추가적으로 포함하는 것인 장치.
  16. 청구항 13에 있어서, 상기 암 환자의 암은 폐암, 흑색종, 호지킨림프종, 위암, 요로상피세포암, 두경부암, 간암, 대장암, 전립선암, 췌장암, 간암, 고환암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 방광암, 뇌암, 유방암, 및 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 장치.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 폐암은 비소세포 폐암 또는 소세포 폐암인 것인 장치.
  18. 청구항 13에 있어서, 상기 암 환자는 비 흡연자인 것인 장치.
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