KR102428408B1 - 수정된 tmb를 포함하는 면역항암치료의 예후 예측 방법 - Google Patents

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Abstract

수정된 TMB를 분석하는 방법 및 이를 이용한 면역 관문 억제제에 대한 암 환자의 치료 반응성 예측 방법에 관한 것으로, 일 양상에 따른 정보를 제공하는 방법, 컴퓨터 기록매체 및 분석 장치에 따르면, 기존의 TMB와 비교하여 면역 항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성 예측력이 현저하게 우수하므로, 치료 효과가 나타날 것으로 예측되는 환자군을 선별할 수 있고, 결과적으로 적합한 치료를 수행하여 환자의 고통과 비용을 경감할 수 있다.

Description

수정된 TMB를 포함하는 면역항암치료의 예후 예측 방법{Method for predicting immunotherapy response with corrected TMB}
본 발명은 면역항암치료에 있어서 새로운 치료 예후를 예측하는 방법에 관한 것이다.
암은 우리나라 국민의 사망률 1위를 기록하는 질병으로, 항암제 개발의 필요성은 꾸준히 대두되고 있다.
항암제 개발 과정을 살펴보면, 빠르게 증식하는 종양세포의 특성을 이용하여 분열하는 세포를 공격하는 화학항암제와 종양 세포의 특정 분자나 신호전달 체계를 공격하는 표적항암제가 존재하였으나, 여러 부작용이 존재하였고, 체내의 선천 면역을 이용하여 부작용을 최소화 할 수 있는 면역항암제가 등장하였다.
면역항암치료란, 인체의 면역체계를 활성화 시켜서 암세포와 싸우게 하는 암 치료법을 말한다. 면역항암치료는 면역시스템을 이용하여 암세포만 공격해 기존의 항암치료보다 부작용이 적고, 면역시스템의 기억 능력과 적응력을 이용하기 때문에 장기간의 항암효과를 얻을 수 있다는 장점이 있다. 상기와 같이 기존 항암제의 단점을 극복하는 면역항암치료는 암치료의 새로운 패러다임으로 각광받고 있으며, 사이언스지는 2013년 올해의 연구로 면역항암제를 선정한 바 있다.
면역항암제는 종양 항원을 표적하는 항체치료제(Rituximab 등), 면역세포를 다시 활성화 하는 면역관문억제제(Immune checkpoint inhibitor 등), 면역세포를 직접 투여하는 면역세포치료제(Immune cell theraphy)등으로 구분할 수 있다(Oiseth et al, 2017).
최근에, 면역관문억제제 치료는 진행성 암의 치료를 발전시켰다. PD-1, PD-L1 및 세포 독성 T림프구 항원 4(CTLA-4)을 표적화 하는 항체는 모든 종류의 암에 있어서 놀라운 생존률의 향상을 제공한다는 사실이 밝혀졌다. 그러나 상기와 같은 잠재력에도 불구하고, 적은 수의 환자들만이 혜택을 얻을 수 있으며, 절반 이상의 환자가 조기 질병 악화를 경험하는 문제점이 있었다. 따라서 면역관문억제제 치료에 대한 효과적인 바이오마커에 대한 필요성이 강조되고 있다.
기존의 여러 연구에서 지속적으로 여러 종류의 암에서 높은 암 변이율(TMB)와 면역관문억제제 치료(ICIs)가 연관성을 가질 수 있음을 제기해 왔다. 특히 면역계에 의한 암 특이적 신생 항원(Tumor specific neoantigen)은 항 종양 면역반응을 활성화시키는 역할을 알 수 있는 것이 알려졌다. 그러나, 어떤 환자가 ICIs를 통해 혜택을 받을 수 있는지를 식별하는 것은 TMB의 임상적 이용에서 해결되지 않은 문제로 남아 있는 실정이다. 실제로 종양의 TMB 분포는 반응성 및 비 반응성 종양에서 중첩되어 있어 실질적으로 TMB만으로는 임상의 성공률을 예측하기에 충분하지 못하다는 지적이 있었다.
기존의 연구는 면역항암치료의 제한된 효과에 대한 기저 메커니즘을 거의 밝히지 못했다. 최근의 게놈 연구는 TMB의 한계를 인식하고 다른 잠재적 바이오마커를 탐색하고 면역항암치료와 관련된 게놈의 영향을 밝히는 추세에 있다. 실제로, 수정된 항원 제시 경로는 면역 회피의 기초가 되며 결국 항 종양 면역에 영향을 미칠 수 있다는 사실이 밝혀졌으나, ICIs 반응에서 방해 항원 제시의 임상적 의미는 뚜렷히 밝혀진 바가 없다.
따라서 본 발명자들은 면역항암치료 전 단계의 비소 세포 폐암(NSCLS)의 198개의 시퀀싱을 분석하여 항 종양 면역 반응에서의 예측가능한 새로운 바이오마커를 탐색하고 기존의 바이오마커와 조합될 수 있는지를 살펴보았다. 더불어, 수정된 항원 제시 경로와 ICIs에 사이의 연관성을 밝히기 위해 새로운 분석 방법을 도입하였다.
일 양상은 암 환자로부터 수득된 생물학적 시료를 시퀀싱(sequencing)하는 단계; 상기 시퀀싱 값을 필터링 하는 단계; 상기 필터링 된 시퀀싱 데이터를 이용하여 암 돌연변이 부담(Tumor mutation burden: TMB)을 계산하는 단계; 및 상기 계산된 TMB 값을 하기 수학식 1을 이용하여 수정된 TMB를 계산하는 단계를 포함하는 수정된 TMB(corrected TMB)를 분석하는 방법을 제공한다.
[수학식 1]
Figure 112019111934430-pat00001
다른 양상은 상기 계산된 TMB 값을 토대로 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성을 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 상기 방법을 컴퓨터에서 실행시키기 위한 프로그램을 기록한 컴퓨터로 읽을 수 있는 기록매체를 제공한다.
또 다른 양상은 암 환자로부터 수득된 생물학적 시료의 시퀀싱을 수행하여 유전자 데이터 세트를 생성하는 데이터 생성부; 상기 측정된 유전자 데이터에서 필터링을 수행함으로서 TMB를 측정하는 계산부; 및 상기 측정된 TMB 값을 하기 수학식 1을 이용하여 수정된 TMB 값으로 계산하는 수정부를 포함하는, 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성을 분석하는 장치를 제공한다.
일 양상은 암 환자로부터 수득된 생물학적 시료를 시퀀싱(sequencing)하는 단계; 상기 시퀀싱 값을 필터링 하는 단계; 상기 필터링 된 시퀀싱 데이터를 이용하여 암 돌연변이 부담(Tumor mutation burden: TMB)을 계산하는 단계; 및 상기 계산된 TMB 값을 하기 수학식 1을 이용하여 수정된 TMB를 계산하는 단계를 포함하는 수정된 TMB(corrected TMB)를 분석하는 방법을 제공한다.
Figure 112019111934430-pat00002
상기 TMB는 비동의 돌연변이(nonsynonymous alteration)(SNV 또는 indel)이며, NeoAg는 Mupexi의 결과로 계산된 신생 항원 부담(neoantigen burden)을 의미한다. 또한, NeoAgL는 Mupexi와 LOH HLA에 의해 손실된 HLA 대립유전자(alleles)와 결합할 것으로 예측되는 신생 항원(Neoantigens)의 값으로, HLA LOH가 없는 경우에는 0으로 설정하였다. NeoAgC는 손실된 HLA 대립 유전자 및 유지 된 HLA 대립 유전자 둘 다에 결합할 것으로 예측된 신생 항원(neoantigen)의 값이다. HLA LOH 가 없는 경우 값을 0으로 설정하였다.
용어 "종양 돌연변이 부담(Tumor mutation burden: TMB)은 암 세포의 DNA에서 발견되는 돌연변이의 총 수를 의미한다. 일반적으로, 많은 수 돌연변이를 가지는 암의 경우 특정 면역항암치료에 반응성이 좋은 것일 수 있다. 측정된 TMB 값은 면역항암치료의 바이오마커로 이용되는 것일 수 있다.
용어 "시퀀싱(sequencing)"은 DNA 또는 RNA 시퀀싱을 의미하는 것일 수 있다. DNA 시퀀싱은 DNA 조각에 대해 뉴클레오타이드 서열을 결정짓는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 암 환자의 생물학적 시료로부터 수득한 DNA의 서열을 분석하는 과정을 의미하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 시퀀싱 방법은 Chain termination method, pyrosequencing, Next generation sequencing, Deep sequencing 또는 Whole Exome Sequencing(WES)일 수 있다. 바람직하게는, Next generation sequencing일 수 있으며, Next generation sequencing 은 deep sequencing 또는 Whole Exome Sequencing(WES)일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, deep sequencing일 수 있다.
용어 "딥 시퀀싱(deep sequencing)"이란, high-throughput sequencing이라고도 명명되며, 유전자 지역(genomic region)을 여러 번에 걸쳐서 시퀀싱하는 것을 의미할 수 있다. 보다 구체적으로, 100번 내지 1000번 정도의 시퀀싱을 거치는 것일 수 있으며, 다세대 시퀀싱 접근 방법(Next generation sequencing approach)을 의미하는 것일 수 있다. 상기 딥 시퀀싱을 이용할 경우 전체의 1%이하의 드문 유전자 결함, 클론 타입 등을 발견할 수 있는 것일 수 있다.
상기 whole exome sequencing의 경우, 유전자 서열의 전체를 시퀀싱하는 방법으로서, 시간과 비용이 과도하게 드는 것일 수 있으며, read depth가 높지 않을 경우, 민감도가 낮아지는 문제점이 있을 수 있다. 딥 시퀀싱을 이용할 경우, High depth targeted sequencing의 한 종류로서, 상기와 같은 문제들을 최소화 할 수 있다.
용어 "필터링(filitering)"이란, 상기 시퀀싱 값을 보정하는 단계를 의미할 수 있다. 보다 구체적으로, TMB의 정의에 맞지 않는 값을 제거함으로서 정확도를 높이는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 추가 계산된 부분을 제외하여 보정하는 단계를 의미하는 것일 수 있다.
도 4는 일 양상에 따른 암 환자의 치료 반응성 예측 방법의 필터링 방법의 흐름도이다.
도 4를 참고하면, 상기 필터링 단계는 기본 필터링 및 추가 필터링을 포함하는 것일 수 있다.
상기 필터링 방법은 non-coding region variant 필터링, germline variant 필터링, synonymous mutation 필터링, Low VAF variant 필터링, truncation mutation 필터링, known somatic alteration 필터링으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 기본 필터링은 non-coding region variant, germline variant, synonymous mutation 제거를 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, Exome Aggregation Consortium(ExAC) 데이터 베이스와 1000 Genome Project 데이터 베이스에서 minor allele frequency 1% 이상의 변이는 germline variant로 가정하고 제거하는 단계, 다음으로 Tumor mutation burden은 코딩 영역의 variant들에서 계산되기 때문에 intron 등 non-coding 지역에서 발굴 된 variant또한 제외하는 단계, 마지막으로 위의 두 과정에서 남은 변이 중 synonymous mutation은 Tumor mutation burden의 정의와 맞지 않기 때문에 제거하는 단계일 수 있다.
상기 추가 필터링은 Low VAF variant, truncation mutation, known somatic alteration 제거 단계를 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 먼저 Low vaf variant를 제거한다. Low VAF variant의 경우는 tumor의 subclone의 variant일 가능성이 크기 때문에 환자의 ICI 반응을 예측 하기 위해 계산하는 TMB에 포함되면 결과에 혼동을 줄 수 있기 때문일 수 있다. 다음으로 Tumor suppressor 유전자의 truncation mutation을 제거하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 마지막으로 Tumor driven variant를 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 상기와 같은 추가 필터링을 포함할 경우 딥 시퀀싱 에서 보다 정확한 TMB계산이 가능한 것일 수 있다.
상기 TMB는 필터링 단계 후 남은 변수들로 계산하는 것일 수 있다.
용어 "신생 항원(neoantigen)"이란, 기존까지 면역계에서 인식된 바 없었던 항원을 의미하는 것이다. 신생 항원은 종양 세포의 조각, 종양 세포 돌연변이에서 유래된 종양 세포 단백질 또는 바이러스 단백질에서 유래되는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 암 세포의 단백질 코딩 유전자에 돌연변이가 일어나는 경우 잠재적인 신생 항원이 되는 것일 수 있다. 또한 신생 항원은 next generation sequencing 방법으로 측정되는 것일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 딥 시퀀싱에 의해 측정되는 것일 수 있다.
용어 "신생 항원 부담(neoantigen burden)"이란, 신생 항원의 개수 또는 측정값을 의미하는 것일 수 있으며, ICI 반응성을 예측하는 바이오마커의 일종일 수 있다. 또한 시퀀싱에 의해 측정되는 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 신생 항원은 LOA 환자들에게서 면역 편집(immune editing)을 유발하여 TMB의 정확도를 떨어뜨리는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 손실된 HLA 유전자에 신생 항원들이 결합하여 TMB의 값을 높이는 것일 수 있다.
용어 "생물학적 시료"는 대상체로부터 수득된 시료를 의미한다. 상기 생물학적 시료는 전혈, 혈장, 혈청, 적혈구, 백혈구(예를 들어 말초 혈액 단핵구), 유관액, 복수, 늑막 유출물(pleural efflux), 수유관액(nipple aspirate), 림프액(예를 들어, 림프절의 파종성 종양 세포), 골수 흡인물, 타액, 소변, 대변(즉, 배설물), 가래, 기관지 세척액, 눈물, 미세 바늘 흡인물(예를 들어, 무작위 유선 미세 바늘 흡인에 의해 수확된), 임의의 기타 체액, 조직 시료(예를 들어, 종양 조직) 예를 들어, 종양 생검(예를 들어, 천자 생검) 또는 림프절(예를 들어, 감시 (sentinel) 림프절 생검), 조직 시료(예를 들어, 종양 조직), 예를 들어, 종양의 수술적 절제, 및 이의 세포 추출물을 포함할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 전혈 또는 이의 일부 성분, 예를 들어, 혈장, 혈청 또는 세포 펠렛일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 시료는 당해 기술분야에 공지된 임의의 기법을 사용하여 전혈 또는 이의 세포 분획물로부터 고형 종양의 순환 세포를 단리함으로써 수득될 수 있다. 일 구체예에 있어서, 시료는 예를 들어, 고형 종양으로부터의 포르말린 고정된 파라핀 포매 (FFPE) 종양 조직 시료 일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 시료는 암을 갖는 개체로부터 수득한 동결 조직으로부터 제조된 종양 용해물 또는 추출물일 수 있다.
상기 "수득"은 생물학적 시료로부터 핵산 시료 또는 폴리펩티드 시료를 수득하는 것일 수 있다. 상기 핵산 시료의 수득은 통상의 핵산 분리방법에 의하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산을 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction: PCR), 리가제 연쇄 반응 (ligase chain reaction: LCR), 전사 매개 증폭 (transcription mediated amplification), 또는 실시간-핵산 서열 기초 증폭 (realtime-nucleic acid sequence based amplification: NASBA)을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 또는 표적 핵산은 조 분리된 핵산으로서 생물학적 시료의 파쇄물로부터 얻을 수 있다. 상기 폴리펩티드 시료의 수득은 통상의 단백질 추출 또는 분리 방법에 의하여 수행될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 암 환자는 폐암, 흑색종, 호지킨림프종, 위암, 요로상피세포암, 두경부암, 간암, 대장암, 전립선암, 췌장암, 간암, 고환암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 방광암, 뇌암, 유방암, 또는 신장암 환자일 수 있다. 예를 들어, 상기 암 환자는 폐암 환자일 수 있다. 바람직하게는 비소세포폐암 환자일 수 있다.
일 구체예에 있어서 상기 암 환자는 비흡연자 또는 과거 흡연자일 수 있다. 바람직하게는 비흡연자 일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 암 환자의 암은 폐암, 흑색종, 호지킨림프종, 위암, 요로상피세포암, 두경부암, 간암, 대장암, 전립선암, 췌장암, 간암, 고환암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 방광암, 뇌암, 유방암, 또는 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 폐암은 비소세포폐암 또는 소세포폐암 일 수 있다.
다른 양상에 있어서, 암 환자로부터 수득된 생물학적 시료를 시퀀싱(sequencing)하는 단계; 상기 시퀀싱 값을 필터링 하는 단계; 상기 필터링 된 딥 시퀀싱을 이용하여 암 돌연변이 부담(Tumor mutation burden: TMB)을 계산하는 단계; 상기 계산된 TMB 값을 상기 수학식 1을 이용하여 수정된 TMB를 계산하는 단계; 및 상기 계산된 TMB 값을 토대로 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성을 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 수학식 1의 신생 항원, TMB, 신생 항원 부담은 상술한 바와 같다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 반응성의 예측은 수정된 TMB의 값이 면역항암제에 반응성이 좋은 환자의 수정된 TMB 값과 비교했을 때 비슷하거나 더 높은 경우, 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성이 높을 것으로 예측하고, 더 낮을 경우, 반응성이 낮을 것으로 예측하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 반응성의 예측은 수정된 TMB의 값이 전체 환자 데이터와 비교하였을 때, 상위 50 내지 30% 이상인 경우 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성이 높을 것으로 예측하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상위 50 내지 0%까지, 상위 45% 내지 0%, 상위 40 내지 0%, 상위 35 내지 0%, 상위 30 내지 0%를 의미하는 것일 수 있다. 상기 치료 반응성이 높은 암 환자군은 "높은 TMB 그룹"으로 명명되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 반응성의 예측은 수정된 TMB의 값이 전체 환자 데이터와 비교하였을 때, 하위 50 내지 30%인 이상인 경우(즉 상위 50 내지 80% 이상인 경우) 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성이 낮을 것으로 예측하는 것일 수 있다. 예를 들어, 하위 50 내지 0%까지, 하위 45% 내지 0%, 하위 40 내지 0%, 하위 35 내지 0%, 하위 30 내지 0%를 의미하는 것일 수 있다. 상기 치료 반응성이 낮은 암 환자군은 "낮은 TMB 그룹"으로 명명되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 반응성의 예측은 수정된 TMB의 값이 전체 환자 데이터와 비교하였을 때, 상위 50 내지 30%부터 상위 0%까지 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성이 높을 것으로 예측하고 하위 50 내지 30% 부터 하위 0%까지는 반응성이 낮을 것으로 예측하는 것일 수 있다.
상기 암, 암 환자, 수득, 생물학적 시료, 시퀀싱, 필터링에 대한 설명은 상술한 바와 같다.
용어 "면역 항암제"는 인체의 면역세포를 활성화시켜서 암세포를 사멸시키는 항암제로, 환자 스스로의 면역 강화를 통해 암의 치료효과를 나타내는 약제를 의미할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 면역 항암제는 면역 관문 억제제일 수 있다.
용어 "면역 관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)"는 T 세포 억제에 관여하는 면역 관문 단백질(immune checkpoint protein) 예컨대, 종양세포에서 발현되는 PD-L1과 같은 단백질의 활성화를 차단함으로써 T 세포를 활성화시켜 암세포를 공격하는 면역 항암제를 의미할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 면역 관문 억제제는 항-PD-L1, 항-PD-1, 및 항-CTLA-4로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며 예를 들어, 항-PD-1일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 면역 관문 억제제는 PD-L1과 PD-1 사이의 결합을 억제시키는 것일 수 있다. 구체적으로, PD-L1 또는 PD-1에 결합할 수 있는 항체일 수 있으며, 예를 들어, 단일클론 항체일 수 있고, 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체일 수 있다.
용어 "치료 반응성"은 개개의 환자의 암에 대해 특정 약물 예를 들어, 항암제가 치료 효과를 나타내는지 여부를 의미할 수 있다. 용어 "암 환자의 치료 반응성 예측"은 약제의 투약이 암의 치료에 유용할 수 있는지의 여부를 투약 전에 미리 예측하는 것을 의미할 수 있고, 유전자의 발현량을 측정하거나 바이오마커를 이용하여 약제에 대한 치료 반응성을 예측하는 것일 수 있다.
용어 "예측"은 특정 유전자의 발현량 또는 바이오마커의 확인 등과 같은 특징의 확인을 통해 특정 결과 예컨대, 치료 반응성을 미리 판단하는 것을 의미할 수 있다.
용어 "전체 환자 데이터"란, 다수의 집단으로 구성된 암 환자의 TMB 데이터를 의미하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 암 환자로부터 수득된 시료의 시퀀싱을 수행하여 유전자 데이터 세트를 생성하는 단계를 통해 생성된 데이터일 수 있다. 예를 들어, 전체 환자 데이터는 10명 이상의 환자군의 TMB를 측정한 다음, 데이터 세트를 형성하는 것으로 제조될 수 있다. 데이터 세트에서 의해 해당 환자의 TMB 값이 상위 몇 %인지 계산하는 통계학적 과정을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 반응성의 예측은 전체 환자 데이터의 분포를 확인하고 결정된 TMB 컷오프(TMB cutoff)를 이용하여 환자를 "높은 TMB 그룹" 또는 "낮은 TMB 그룹"으로 분류하는 것일 수 있다.
상기 TMB 컷오프는 상위 50%까지 "높은 TMB 그룹"으로, 하위 50%까지 "낮은 TMB 그룹"으로 정의하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상위 50%, 상위 45%, 상위 40%, 상위 35%, 상위 30%, 상위 25%, 상위 20%, 상위 15%까지를 의미할 수 있으며, 하위 50%, 하위 45%, 하위 40%, 하위 35%, 하위 30%, 하위 25%, 하위 20%, 하위 15%까지를 의미하는 것일 수 있다.
예를 들어, 상위 50 내지 30%부터 상위 0%까지 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성이 높을 것으로 예측하고 하위 50 내지 30% 부터 하위 0%까지는 반응성이 낮을 것으로 예측하는 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상위 50 내지 0%까지, 상위 45% 내지 0%, 상위 40 내지 0%, 상위 35 내지 0%, 상위 30 내지 0%를 TMB 컷오프로 하여 "높은 TMB 그룹"을 정의하는 것일 수 있다. 또한, 하위 50 내지 0%까지, 하위 45% 내지 0%, 하위 40 내지 0%, 하위 35 내지 0%, 하위 30 내지 0%를 TMB 컷오프로 하여, "낮은 TMB 그룹"으로 정의하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상위 TMB의 컷오프의 기준점을 더 높게 하는 것은 TMB의 정확도를 높이는 데에 기여하는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 방법은 상기 암 환자로부터 수득된 생물학적 시료로부터 Programmed death-ligand 1(PD-L1)의 발현을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 PD-L1의 발현값과 상기 수정된 TMB의 값을 조합하여 면역항암제에 대한 반응성을 예측하는 단계를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
상기 반응성을 예측하는 단계는 PD-L1 발현이 높을수록 ICI 반응성이 높은 것으로 평가하는 것일 수 있고, PD-L1 만으로는 반응성의 예측이 불완전하나, 수정된 TMB 값과 조합하여 판단할 경우 그 정확도가 높아지는 효과가 있을 수 있다. 보다 구체적으로, 낮은 TMB 그룹의 경우 PD-L1 발현량에 의한 예측이 더 정확할 수 있다. 예를 들어, 높은 TMB, 높은 PD-L1 발현량의 경우 반응성이 좋은 것으로 판단하고, 낮은 TMB, 낮은 PD-L1 발현량일 경우 반응성이 나쁜 것으로 판단할 수 있으나, 낮은 TMB, 높은 PD-L1의 경우 PD-L1 값을 확인하여 반응성의 정도를 판단하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 PD-L1 발현량의 측정은 웨스턴 블롯, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직 면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay), 유세포분석 (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 및 단백질 칩 (protein chip)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 기법에 의해 수행되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 유전자의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
용어 "항체"는 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미할 수 있다. 일 양상에 따른 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있으며, 나아가, 인간화 항체 등의 특수항체도 포함될 수 있다. 일 양상에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편은 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등일 수 있다.
용어 "유전자"는 단백질 코딩 또는 전사 시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미할 수 있다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다. 일 양상에 따른 유전자는 종양 미세환경 유전자일 수 있다. 용어 "종양 미세환경 (Tumor microenvironment; TME)"은 암세포 주위에 혈관, 면역세포, 섬유아세포, 골수 유래 염증세포, 림프구, 신호전달 분자, 세포외 기질 등이 둘러 싸여 있는 세포환경을 의미할 수 있다. 용어"종양 미세환경 유전자"는 종양 미세환경에 관여하는 유전자로, 면역 항암제에 대한 반응성을 예측하는 마커로 활용되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서 상기 암 환자는 비흡연자 또는 과거 흡연자일 수 있다. 바람직하게는 비흡연자 일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 암 환자의 암은 폐암, 흑색종, 호지킨림프종, 위암, 요로상피세포암, 두경부암, 간암, 대장암, 전립선암, 췌장암, 간암, 고환암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 방광암, 뇌암, 유방암, 또는 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 폐암은 비소세포폐암 또는 소세포폐암 일 수 있다.
다른 양상은, 상기 방법을 컴퓨터에서 실행시키기 위한 프로그램을 기록한 컴퓨터로 읽을 수 있는 기록매체를 제공한다.
또 다른 양상은, 암 환자로부터 수득된 생물학적 시료의 시퀀싱을 수행하여 유전자 데이터 세트를 생성하는 데이터 생성부; 상기 측정된 유전자 데이터에서 필터링을 수행함으로서 TMB를 측정하는 계산부; 및 상기 측정된 TMB 값을 상기 수학식 1을 이용하여 수정된 TMB 값으로 계산하는 수정부를 포함하는, 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성을 분석하는 장치를 제공한다.
상기 수학식 1의 신생 항원, TMB, 신생 항원 부담은 상술한 바와 같다.
일 실시예에 있어서, 상기 장치는 상기 수정된 TMB의 값이 상위 TMB의 컷오프의 기준점과 비교했을 때 더 높은 경우, 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성이 높을 것으로 예측하고, 수정 전 TMB의 값에 비해 더 낮거나, 상위 TMB의 컷오프 기준점과 비교해 더 낮을 경우, 반응성이 낮을 것으로 예측하는 분석부를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
용어 "..부"는 적어도 하나의 기능이나 동작을 처리하는 단위를 의미하며, 이는 하드웨어 또는 소프트웨어로 구현되거나 하드웨어와 소프트웨어의 결합으로 구현될 수 있다. 예를 들어, 상기 생산부, 계산부, 수정부 및 분석부는 컴퓨터 또는 프로세서에 의해 수행되는 것일 수 있다.
도 2는 일 양상에 따른 암 환자 치료 반응성 분석 장치를 나타낸 모식도이다.
도 2를 참고하면, 암 환자 치료 반응성 분석 장치(10)는 암 환자로부터 수득한 생물학적 시료를 이용하여, 수정된 TMB값을 도출할 수 있고, 이를 기반으로 암 환자의 치료 반응성을 예측할 수 있다.
도 3은 일 양상에 따른 암 환자 치료 반응성 분석 장치의 하드웨어 구성들을 나타낸 블록도이다.
암 환자 치료 반응성 분석 장치(10)의 데이터 생성부(110)에서 수신하는 유전자 데이터 세트는 암 환자로부터 수득된 생물학적 시료의 시퀀싱을 수행하여 유전자 데이터 세트를 생성하는 것일 수 있다. 상기 생물학적 시료 및 시퀀싱은 상술한 바와 같다.
암 환자 치료 반응성 분석 장치(10)의 계산부(120)에서 상기 데이터 세트를 수신하여 필터링을 수행하고 TMB를 측정하는 것일 수 있다. 상기 필터링, TMB 측정은 상술한 바와 같다.
암 환자 치료 반응성 분석 장치(10)의 수정부(130)는 상기 측정된 TMB 값을 상기 수학식 1을 이용하여 수정된 TMB 값으로 계산하는 것일 수 있다. 상기 수학식 1, 수정된 TMB는 상술한 바와 같다.
일 실시예에 있어서, 상기 장치는 상기 수정된 TMB의 값이 면역항암제에 반응성이 좋은 환자의 수정된 TMB 값과 비교했을 때 비슷하거나 더 높은 경우, 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성이 높을 것으로 예측하고, 더 낮을 경우, 반응성이 낮을 것으로 예측하는 분석부를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
상기 분석부는, 전체 환자 데이터의 분포를 확인하고 결정된 TMB 컷오프(TMB cutoff)를 이용하여 환자를 "높은 TMB 그룹" 또는 "낮은 TMB 그룹"으로 분류하는 것일 수 있다. TMB 컷오프의 기준은 상술한 바와 같다.
일 구체예에 있어서, 상위 TMB의 컷오프의 기준점을 더 높게 하는 것은 TMB의 정확도를 높이는 데에 기여하는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 장치는 상기 암 환자로부터 수득된 생물학적 시료로부터 PD-L1 발현을 측정하는 측정부; 및 상기 측정값과 상기 수정된 TMB 값을 조합하여 면역항암제에 대한 반응성을 판단하는 판단부를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
상기 판단부는 PD-L1 발현이 높을수록 ICI 반응성이 높은 것으로 평가하는 것일 수 있고, PD-L1 만으로는 반응성의 예측이 불완전하나, 수정된 TMB 값과 조합하여 판단할 경우 그 정확도가 높아지는 효과가 있을 수 있다. 보다 구체적으로, 낮은 TMB 그룹의 경우 PD-L1 발현량에 의한 예측이 더 정확할 수 있다. 예를 들어, 높은 TMB, 높은 PD-L1 발현량의 경우 반응성이 좋은 것으로 판단하고, 낮은 TMB, 낮은 PD-L1 발현량일 경우 반응성이 나쁜 것으로 판단할 수 있으나, 낮은 TMB, 높은 PD-L1의 경우 PD-L1 값을 확인하여 반응성의 정도를 판단하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 PD-L1 발현량의 측정은 웨스턴 블롯, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직 면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay), 유세포분석 (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 및 단백질 칩 (protein chip)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 기법에 의해 수행되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 유전자의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 암 환자는 폐암, 흑색종, 호지킨림프종, 위암, 요로상피세포암, 두경부암, 간암, 대장암, 전립선암, 췌장암, 간암, 고환암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 방광암, 뇌암, 유방암, 또는 신장암 환자일 수 잇다. 예를 들어, 상기 암 환자는 폐암 환자일 수 있다. 바람직하게는 비소세포폐암 환자일 수 있다.
일 구체예에 있어서 상기 암 환자는 비흡연자 또는 과거 흡연자일 수 있다. 바람직하게는 비흡연자 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구체예에 있어서, 상기 암 환자의 암은 폐암, 흑색종, 호지킨림프종, 위암, 요로상피세포암, 두경부암, 간암, 대장암, 전립선암, 췌장암, 간암, 고환암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 방광암, 뇌암, 유방암, 또는 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 폐암은 비소세포폐암 또는 소세포폐암 일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 면역 항암제는 면역 관문 억제제일 수 있다.
상기 수득, 생물학적 시료, 시퀀싱, 필터링, TMB, 수학식 1, 면역항암제, 치료 반응성 및 발현은 상술한 바와 같다.
본 실시예들에서 사용되는 용어는 본 실시예들에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 기술분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 임의로 선정된 용어도 있으며, 이 경우 해당 실시예의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서, 본 실시예들에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 실시예들의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
실시예들에 대한 설명들에서, 어떤 부분이 다른 부분과 연결되어 있다고 할 때, 이는 직접적으로 연결되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 구성요소를 사이에 두고 전기적으로 연결되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성요소를 포함한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 또한, 실시예들에 기재된 "..부", "..모듈"의 용어는 적어도 하나의 기능이나 동작을 처리하는 단위를 의미하며, 이는 하드웨어 또는 소프트웨어로 구현되거나 하드웨어와 소프트웨어의 결합으로 구현될 수 있다.
본 실시예들에서 사용되는 "구성된다" 또는 "포함한다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 여러 구성 요소들, 도는 여러 단계들을 반드시 모두 포함하는 것으로 해석되지 않아야 하며, 그 중 일부 구성 요소들 또는 일부 단계들은 포함되지 않을 수도 있고, 또는 추가적인 구성 요소 또는 단계들을 더 포함할 수 있는 것으로 해석되어야 한다.
하기 실시예들에 대한 설명은 권리범위를 제한하는 것으로 해석되지 말아야 하며, 해당 기술분야의 당업자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 실시예들의 권리범위에 속하는 것으로 해석되어야 할 것이다. 이하 첨부된 도면들을 참조하면서 오로지 예시를 위한 실시예들을 상세히 설명하기로 한다.
일 양상에 따른 수정된 TMB 및 이를 이용한 면역 관문 억제제에 대한 암 환자의 치료 반응성 예측 방법에 따르면, 면역 항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성 예측력 및 생존 기간에 대한 예측력이 현저하게 우수하므로, 치료 효과가 나타날 것으로 예측되는 환자군을 선별할 수 있고, 결과적으로 적합한 치료를 수행하여 환자의 고통과 비용을 경감할 수 있다.
도 1은 일 양상에 따른 수정된 TMB 및 이를 이용한 면역 관문 억제제에 대한 암 환자의 치료 반응성 예측 방법의 흐름도이다.
도 2는 일 양상에 따른 암 환자 치료 반응성 분석 장치를 나타낸 모식도이다.
도 3은 일 양상에 따른 암 환자 치료 반응성 분석 장치의 하드웨어 구성들을 도시한 블록도이다.
도 4는 일 양상에 따른 암 환자의 치료 반응성 예측 방법의 필터링 방법의 흐름도이다.
도 5 내지 9는 연구 집단인 NSCLC 환자들에게서 TMB 및 ICI에 대한 반응과 관련된 임상 및 유전적 특성을 나타낸 개요이다.
도 5는 면역 요법 전의 NSCLC 환자 종양에서 확인된 암 유발성 유전자(oncogenic drivers)의 열지도이다; 각 열은 임상 반응에 따라 그룹화된 개별 환자들을 나타낸다.
도 6는 높은 TMB (> 272 돌연변이로 정의 됨) 및 낮은 TMB (높은 TMB 대 낮은 TMB, P = 0.001)를 갖는 환자에서 ORR 대 ICI를 나타낸 그래프이다(Fisher's exact test 사용).
도 7는 TMB와 관련된 유전적 및 임상적 특징을 나타낸 그래프이다(왼쪽부터 암 유발성 유전자(oncogenic drivers) 돌연변이 대 야생형, P = 0.0105; 흡연자 대 비흡연자, P <0.0001; 이전 흡연자 대 비흡연자, P <0.0001; 현 흡연자 과거 흡연자, P = 0.2332; HR 변형 대 야생형의 경우, P <0.0001 이며, Mann-Whitney U test 사용하였다).
도 8는 높은 TMB, 낮은 TMB 군에서 각각 나타낸 ICI의 PFS를 나타낸 그래프이다.
도 9는 Kaplan-Meier 생존 분석으로 ICI로 치료받은 환자의 HR 결핍이 PFS 증가와의 관련성 여부를 나타내는 그래프이다; P값은 양면 로그 랭크 테스트(two-sided log-rank test)를 나타낸다.
도 10 내지 13은 흡연자와 비 흡연자 사이의 바이오마커 차이점에 관한 그래프이다.
도 10은 환자 그룹을 흡연 여부로 분류한 다음, 반응 그룹과 무 반응 그룹 사이의 TMB 및 PD-L1 발현을 비교한 그래프이다.
도 11는 흡연자와 절대-비흡연자를 분류한 후, OR 그룹과 반응 군 사이의 PD-L1발현을 비교한 그래프이다. (n=144).
도 12은 비흡연자 그룹에서의 ICI 반응성에 관련된 비동의적 돌연변이(ninsynonymous mutations)를 나타낸 것이다; 각 유전자들은 Q value 0.01 이하인 것만 측정하였다.
도 13는 ICI 치료를 받는 흡연자 그룹에서 TP53에 의한 PFS 또는 EGFR 변형을 나타낸 그래프이다.
도 14 내지 16은 TMB에 대한 HLA LOH의 영향 및 이들의 비소세포폐암 환자 ICI 반응성과의 연관성을 나타낸 그래프이다.
도 14은 환자 그룹에서 HLA LOH의 빈도(HLA LOH, n=54, HLA intact, n=144) 및 LOH 수를 나타내고(왼쪽, LOH at 1 locus, n = 20; LOH at 2 locus, n = 20; LOH at 3 locus, n = 14), 상승된 ORR과 관련성이 없으나 TMB와 관련된 HLA LOH을 나타낸 그래프이다(가운데, 오른쪽, median TMB 199 versus 118 mutations, P = 0.0008).
도 15은 상승된 ORR과 관련성이 없으나 TMB와 관련된 HLA LOH을 나타낸 그래프(왼쪽, median TMB 199 versus 118 mutations, P = 0.0008)이고, 환자별 신생 항원 계산 값을 히스토그램으로 표시하였으며, 적색 막대는 손실된 HLA 대립 유전자에 결합하는 것으로 예측되는 신생 항원, 파란색 막대는 손실된 HLA 대립 또는 정상 HLA 대립 유전자에 결합하는 것으로 예측되는 신생 항원, 주황색 막대는 정상 HLA 대립 유전자에만 결합하는 것으로 예측되는 신생 항원의 비율을 나타낸 그래프이다; 주황색과 파란색 막대의 비율을 사용하여 수정된 TMB를 계산하였다.
도 16은 HLA LOH 상태에 의해 수정된 TMB를 박스플랏(Boxplot)으로 나타낸 그래프이다.
도 17 내지 19는 수정된 TMB가 효과적 항종양 면역을 유발하는 비동의성 돌연변이(Nonsynonymous mutations)를 반영한다는 것을 나타내는 그래프이다.
도 17은 대립유전자가 손실된 HLA 유전자를 적색으로, 또는 대립유전자 유지된 HLA 유전자를 파란색으로 나타내었고, 각각에 결합할 것으로 예상되는 돌연변이 비율을 막대 그래프로 나타낸 것이다; 10명의 환자가 높은 TMB 그룹에서 낮은 TMB 그룹으로 재편성된 것을 시사하고 있다.
도 18은 TMB 분류 그룹이 변화한 환자에서 ORR 대 ICI를 나타낸 그래프이다(왼쪽); 수정된 TMB에 의해 그룹화된 환자의 Kaplan-Meier 곡선을 나타낸 그래프이다(오른쪽).
도 19는 수정된 TMB에 의해 그룹화된 환자의 Kaplan-Meier 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 20 내지 21은 높은 TMB 그룹에서 낮음 TMB 그룹으로 재분류된 환자의 특성을 나타낸 그래프이다.
도 20은 수정된 TMB로 판단한 환자군의 TMB 분포를 나타낸 그래프이고(왼쪽), 하위군으로 재 분류된 환자와 HLA LOH가 없는 TMB 상위 15 내지 25% 환자를 비교한 그래프이다(오른쪽).
도 21은 소그룹으로 재 분류된 환자군이 TMB 상위 15 내지 25% 환자보다 재발 또는 사망 위험이 더 높다는 것을 나타내는 그래프이다.
도 22 내지 23은 TMB와 PD-L1 발현의 조합한 예측값을 나타낸 그래프이다.
도 22의 A는 CR/PR (n = 45) 대 SD/PD (n = 99)환자군의 PD-L1 분포를 나타낸 그래프(왼쪽), 높은 TMB 환자군 대 낮은 TMB 환자군에서 PD-L1 발현 데이터를 나타낸 그래프이고, B 및 C는 환자의 TMB 상태에 대해 제시된 PD-L1 발현량을 나타낸 그래프이며, D는 TMB 및 PD-L1 발현에 따라 분할 된 환자에서의 반응률을 나타내는 히스토그램을 나타낸 그래프이다.
도 23은 다변량 콕스 비례 위험 모델(cox proportional hazards model)을 나타내는 산림도(Forest plot)이다; 오차 막대는 95 % CI이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 실험 재료 및 실험 준비
1.1 환자 그룹 준비 및 반응 평가(Response Evaluation) 방법
항 PD-L1 단일 치료를 받은 비소세포폐암 환자를 대상으로 연구하였으며, 상기 환자들은 ICI 치료를 시작하기 전에 생검 표본을 채취하였다. 또한 효능 분석에 대한 유효한 데이터를 얻을 수 있는 조건인 경우에만 등록을 허여하였다. 상기와 같은 연구 준비는 삼성 의료원 기관 윤리 심의위원회/개인 정보 보호위원회 (승인 번호: 2018-03-130 및 2013-10-112) 또는 서울 대학교 병원 생명 윤리위원회 (승인 번호: 1805-109)에 의해 승인되었다. 모든 참여 환자는 등록 전에 서면 동의서를 제공하였고, using Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, version 1.1 (RECIST v1.1)으로 객관적 반응을 평가하였다. 보다 구체적으로 CR 또는 PR 환자는 반응자인 것으로, SD 또는 PD 환자는 비 응답자로 평가하였다. 환자 그룹의 통계학적 특성은 전자 의료 차트로부터 얻어졌다. 샘플에서 PD-L1 발현 평가는 FDA 승인 Dako PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 키트 (Agilent Technologies)를 기초로 하였다.
1.2 조직 게놈학적(Tissue genomic) 분석
모든 종양 샘플은(FFPE 및 신선한 냉동 조직) ICI 처리 전에 채취하였다. DNA 추출, 라이브러리 준비 및 시퀀싱은 상술한 바와 같이 처리하였으며, DNeasy 혈액 및 조직 키트 (Qiagen, 69504), QIAamp DNA FFPE 조직 키트 (Qiagen, 56404) 또는 AllPrep DNA / RNA Mini 키트 (Qiagen, 80204)를 사용하여 게놈 DNA를 추출 하였다. 이에 따라 서열 분석 된 샘플에서 종양 조직의 존재 및 생존 가능한 종양의 백분율을 흉부 병리학자(thoracic pathologist)(Y.L.C)가 검토하였다. 모든 종양 샘플 및 혈액 샘플에 걸친 평균 시퀀싱 범위는 각각 100X 및 50X이었으며, 시퀀싱 범위가 불량한 샘플(종양 평균 목표 범위 <25x, 정상 평균 목표 범위 <15x)은 제외하였다. 분석할 BAM 파일은 상술할 파이프 라인을 사용하여 생성하였다. 암 /정상 조직을 확인하기 위해, NGSCheckMate를 QC 단계에서 사용하였다. 체세포 돌연변이는 MuTect 2와 Pindel 알고리즘으로 종양과 일치하는 말초 혈액 단핵 혈액 샘플을 비교함으로써 구별되었다. 또한 카피 넘버(copy number) 및 B- 대립 유전자 빈도 프로파일(B-allele frequency profiles)은 Control-FREEC를 사용하여 측정하였다. 도 5은 면역 용법 전의 환자들을 특징에 따라 그룹화하여 암 유발 유전자의 열지도를 나타낸 것이다.
1.3 HR 유전자 및 HR 결실 평가
기존 연구에서 밝혀진 HR 관련 유전자 (HR pathway related genes) (보충 표 S2)를 사용하였으며, 상기 유전자에서 결실, 스톱게인 돌연변이(stopgain mutation) 및 프레임 시프트(frameshift) 또는 스플 라이스 변경(splice site alterations)을 포함한 절단 돌연변이를 갖는 종양을 HR 결핍으로 평가하였다. BRCA1 및 BRCA2 돌연변에 대해서는 근에 출시 된 미국 의학 유전학 및 유전학 대학 (ACMG)표준 및 지침에 따라 모든 변이체를 수동 검토하였다.
1.4 유의미한 돌연변이 유전자 및 면역 관련 유전자 정의
198명의 NSCLC 환자에서 MutSigCV를 사용하여 유의하게 돌연변이 된 유전자를 확인 하였다. 우리는 유의미한 돌연변이를 MutSigCV 알고리즘에서 0.01 미만의 Q- 값으로 돌연변이 된 유전자로 정의하였다. 면역 요법 관련 유전자는 기존 연구에서 밝혀진 12가지의 STK11, JAK2, JAK1, B2M, TAP1, TAP2, TAPBP, CANX, HSPA5, PDIA3, CALR, POLE를 사용하였으며, 생존 분석은 1 개 이상의 샘플이 변경된 유전자로 제한해 진행하였다.
1.5 HLA 분석 방법 및 Silico Neoantigen 예측 파이프 라인
간략하게, digit class HLA-I는 Optitype을 사용한 생식 계열 WES 판독(germline WES reads)을 사용하여 계산되었다. 보다 구체적으로, 돌연변이 펩티드의 목록을 생성하기 위해 MuTect2을 사용하였으며, MuPeXI 로 신생 항원 예측을 수행 하였다. 상기 MuPeXI은 NetMHCpan v4.0 (48)을 사용하였고, MuPeXI를 사용하여 점 돌연변이(somatic mutation), 삽입 및 결실로 구성된 검출된 체세포 돌연변이(nonsynonymous point mutation)로부터 모든 9-mer 돌연변이 펩티드(novel 9-mer mutant peptides)를 계산하였다. 친화도의 예측은 백분위 순위를 예측하여 하였으며, 돌연변이 및 정상 펩티드 모두 NetMHCpan-4.0를 이용하여 결정하였다. MuPeXI는 우선 순위 점수에 기초하여 돌연변이 펩타이드를 순위화하였다. 우선 순위 점수는 하기와 같은 방법으로 계산하였다. 우선, 돌연변이 및 정상 펩티드 둘 다의 백분위 순위 친화도를 예측하고, 기준 프로테옴 매치 패널티 및 돌연변이 대립 유전자 빈도를 계산하였다. 또한 실행 가능한 변이체의 상당 부분이 동일한 임상 표본의 섹션 내에서 낮은 대립 유전자 빈도 (AF)와 가변 AF를 가질 수 있기 때문에, 본 연구에서 돌연변이 AF는 동일 상수로 가정하였다.
1.5 HLA 분석 방법 및 Silico Neoantigen 예측 파이프 라인
HLA 위치의 halplotype-specific copy number)는 LOH HLA를 사용하여 계산했으며, CHAT의 순도 및 배수성 추정값은 입력 값을 사용하였다.
1.6 통계 분석
본 발명에서, PFS 및 OS는 Kaplan-Meier 방법을 사용하여 추정하였고, 로그 순위 테스트를 사용하여 PFS와 OS의 그룹 간 차이를 평가하였다. 또한 두 그룹 사이의 범주 변수에 대한 비교는 Fisher's exact test 또는 세 그룹에 대한 카이-제곱 검정(chi-square test)을 사용하여 수행하였다. non-parametric Mann-Whitney U test 또는 unpaired t test을 이용하여 두 그룹 간의 연속 변수에 대한 평균 또는 중앙값의 차이를 평가하였으며, 다중 비교를 설명하기 위해 Benjamini-Hochberg P 값을 사용하였다. HR 및 95 % CI는 Cox 비례 위험 모델을 사용하여 계산하였다. 다변량 생존 분석을 기술 된 다른 공변량을 조정하면서 PFS에 대한 TMB, PD-L1 발현, HR 유전자 변경의 영향을 평가하기 위해 Cox 비례 위험 모델을 사용하여 수행하였다. 연속 변수의 민감도 및 1-특성을 표시하는 수신기 운영자 특성(ROC) 곡선(1-specificity of continuous variables)이 사용되었다. 또한 0.05보다 작은 P 값은 모든 비교에 대해 통계적으로 유의함을 나타내는 것으로 간주되었으며, 모든 p 값은 양면이었다. 모든 통계 분석은 R 3.3.3을 사용하여 수행하였다.
실시예 2. TMB를 수정한 Corrected TMB 계산 방법
Silico 신생 항원 예측(Silico neoantigen prediction)에 현재 알고리즘은 펩티드-HLA 결합 친화도를 예측하는 것에 기반한 것이다. 상기 방법의 예측 정확도는 용리된 리간드 데이터를 축적함으로서 개선될 수 있지만, 신생 항원 부담(neoantigen burden) 측정은 지금까지 컴퓨터를 이용한 예측 방법을 이용하여 그 정확도에 문제가 있었으며, ICI 반응성을 예측하기에는 부정확한 면이 있었다. TMB가 ICI 반응성을 예측하는 데 더 적합하였다.
상기와 같은 이유로, 본 발명에서는 신생 항원 부담(neoantigen burden)을 사용하는 대신 하기와 같은 방정식의 수정된 TMB(corrected TMB)를 설계하였다.
Figure 112019111934430-pat00003
TMB: 비동의 돌연변이(nonsynonymous alteration)(SNV 또는 indel).
NeoAg: Mupexi의 결과로 계산된 신생 항원 부담(neoantigen burden).
NeoAgL: Mupexi와 LOH HLA에 의해 손실된 HLA alleles와 결합할 것으로 예측되는 Neoantigens의 값이다. HLA LOH가 없는 경우 0으로 설정하였다.
NeoAgC: 손실된 HLA 대립 유전자 및 유지 된 HLA 대립 유전자 둘 다에 결합할 것으로 예측된 신생 항원(neoantigen)의 값이다. HLA LOH 가 없는 경우 값을 0으로 설정하였다.
실시예 3. 비소세포폐암(NSCLC) 환자에서 요인별 ICI 반응 연관성 확인
3.1 연구 집단(study cohort)의 임상적 및 게놈학적 특징
2014년 7월부터 2018년 8월까지, WES를 수행할 수 있는 종양 샘플을 보유한 선별된 비소세포폐암 환자 198명이 연구 집단에 포함되었다(표 1). 대부분의 환자는 PD-1 억제제 단일 요법(PD-1 inhibitor monotherapy)을(152/198, 77%), 나머지 환자는 항-PD-L1 단일 요법(PD-1 inhibitor monotherapy)을 받았다(46/198, 23%). 표 1에 연구 집단 환자의 기본 특성이 요약되어 있다.
Patient All Patients CR/PR SD/PD p Value
N = 198 No.(%) 61 (31%) No.(%) 137 (69%) No.(%)
Median Age (range) 62.1 (33-84) 65.1 (44-83) 61.4 (33-84) 0.0236
Gender 0.3528
Male 140 (71) 48 (75) 94 (69)
Female 58 (29) 15 (25) 43 (31)
Median TMB (range) 143 (1-1765) 194 (3-1765) 131 (1-1035) 0.0069
Smoking status 0.1492
Current/former 130(66) 45(74) 85(62)
Never 68(34) 16(26) 52(38)
Performance status 0.2526
ECOG 0 & 1 172(87) 56(92) 116(85)
ECOG 2 26(13) 5(8) 21(15)
Histology 0.9664
LUAD 129(65) 40(66) 89(65)
LUSC 58(29) 18(29) 40(29)
Others 11(6) 3(5) 8(6)
Immunotherapy 0.5976
Nivolumab 74(37) 20(33) 54(40)
Pembrolizumab 78(40) 27(44) 51(37)
Anti-PDL-1 agent 46(23) 14(23) 32(23)
Line of therapy 0.3931
First 14(7) 5(8) 9(6)
Second 66(33) 24(39) 42(31)
Third or more 118(60) 32(53) 86(63)
PD-1 expression 0.0209
<1% 34(17) 8(13) 26(19)
1-49% 35(18) 6(10) 29(21)
≥50% 75(38) 31(51) 44(32)
Unknown 54(27) 16(26) 38(28)
Actionable mutations
EGFR muta 36 7 29
KRAS mutb 26 11 15
ALK fusion 6 1 5
BRAF mut (p.V600E) 4 1 3
ROS1 fusion 2 1 1
RET fusion 2 0 2
Abbreviation: CR, complete response; PR, partial response; SD, stable disease; PD, progressive disease; ECOG, The Eastern Cooperative Oncology Group; LUAD, Lung adenocarcinoma; LUSC, Lung squamous cell carcinoma; HLA LOH, loss of heterozygosity at the class I human leukocyte antigen a EGFR mutation: Del19, L858R, Del18, and Ins20; b KRAS mutation: G12A, G12C, G12D, G12V
ICI 단일 투여에 대한 목표 반응 비율(omplete response (CR)/partial response (PR))은 31%이었다. median TMB는 143개의 돌연변이였으며(range, 1 to 1765 mutations), TMB의 분포는 기존의 연구에서 ICIs 치료를 받은 비소세포폐암 환자의 것과 유사하였다(보충 도면 1비, 1씨). 총 198명의 환자 중 184명의 환자, 즉 93%가 추가적인 후속 전신 항암 요법을 받았다. Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) performance status score은 객관적 반응(OR)과 반응 없음 사이에서 유사함을 확인할 수 있었다(stable disease (SD)/progressive disease (PD)). 그러나 도 5에 따르면, 2점의 ECOG 점수를 보이는 26명, 즉 13%의 환자가 유의적으로 progression free survival(PFS)가 짧은 것을 확인할 수 있었다[PFS; hazard ratio (HR) = 2.43, 95% confidence interval (CI), 1.54-3.84; log-rank test, P < 0.0001;] and OS (HR = 4.95, 95% CI, 2.98-8.21; log-rank test, P < 0.0001)] 그 밖의 다른 임상적 특성은 OR 그룹과 무 반응 그룹 사이에 균등하게 분배되어 있었다.
3.2 TMB와 ICIs 반응성 간의 연관성 확인
TMB는 OR 그룹에서 무 반응 그룹보다 더 크게 측정되었다. 이는 기존 연구와 일치하는 경향이었다(median TMB 194 versus 131 mutations, Mann-Whitney test, P = 0.0069). 본 발명자들은 TMB의 변수 컷오프를 사용하여 여러 연구 사이에서 '높은 TMB' 가 무엇인지 정의하였다. 먼저 ICI 처리된 비소세포폐암의 실험 그룹을 퍼센트 값으로 분류해 25개의 TMB 하위 그룹을 정의하였는데, 상기와 같은 접근 방식을 '높은 TMB'를 정의하기 위한 기준을 결정하는 데에도 사용하였다. 도 8에 따르면, 높은 TMB(독립적인 연구 집단에서 상위 25%로 정의된, 272개의 돌연변이로 지정)와 개선된 무진행 생존률(PFS)(HR = 0.67, 95% CI, 0.45-0.99; log-rank test, P = 0.043)간에는 분명한 연관성이 존재하고 있었다. 그러나 곡선 아래 면적(AUC)는 0.62(95%)였으며, 이는 TMB가 단독으로 사용될 경우 매우 불량한 바이오마커임을 시사하는 것이다.
3.3 상동-의존성 재조합 유전자 변형(Homology-dependent recombination gene alteration)과 증가된 TMB 및 ICIs 치료 효과 간의 연관성 확인
다음으로, 본 발명자들은 TMB가 다른 유전적, 임상적 특징과 관련성이 있는지를 조사하였다. 도 7에 따르면,현재 또는 과거의 흡연, 상동 재조합 결핍은 높은 TMB 값과 관련이 있었으며, 반면에 대표적 암 유전자 돌연변이는 낮은 TMB 값과 관련성이 있었다.
HR 결핍의 존재는 37명의 환자(18.7%)에서 관찰되었으며, 카플란-마이어 생존 분석(HR = 0.65, 95% CI, 0.42-1.00, 로그 순위 테스트, P = 0.049, 그림 1E; 보충 표 S2)에서 보다 긴 PFS와 연관되었다. 단, OR 대 ICI에서 HR 결핍은 농축되지 않았다(odds ratio = 1.70, P = 0.17). ICI 반응과 HR 결핍의 연관성을 명확히 하기 위해, 우리는 이 연관성이 다변성 모델에서 통계적으로 유의한지 여부를 조사했다. PD-L1 표현은 144명의 환자가 사용할 수 있었다. 변경된 HR 기능 (144 중 27, 18.8%)은 이들 환자에서 연령, 성별, ECOG, 이력, 흡연 및 PD-L1 표현(HR 0.58, 95% CI, 0.34-0.99, P = 0.046, 데이터 미도시)을 조정한 후 ICI에 대한 응답의 독립적인 예측 변수로 남아 있었다(데이터 미도시).
3.4 체세포 돌연변이 (Somatic mutations)와 비흡연자 비소세포폐암(NSCLC) 환자의 ICI 반응성 간의 연관성
ICI 반응성의 유전적 측면을 자세히 살펴보기 위해, 본 발명자들은 체세포 돌연변이 및 copy number alterations(CAN)가 ICI에 대한 반응에 기여하는지 여부를 조사하였다(데이터 미도시). 먼저, 이전의 연구에서 예측 마커로 사용되었던 12개의 면역 관련 유전자 및 MutSigCV를 이용하여 돌연변이 유전자를 분석하였다. STK11 돌연변이의 경우 9명의 환자에서 발견되었지만, 통계적 유의성은 관찰되지 않았다. 또한 9명의 환자에서, 4개의 절단 돌연변이가 확인되었고, 그 중 3명의 환자에서는 아무런 반응이 없었다. 또한 JAK1, JAK2, 및 B2M 돌연변이는 ICI와의 연관성을 조사하기에는 빈도가 너무 드물었다. 전체 중 3명의 환자만이 JAK1, JAK2, 또는 B2M 돌연변이를 가지고 있었기 때문이다. CAN 돌연변이 또한 조사하였으나, 이와 유의미한 연관성은 없었다.
본 실험에서의 연구 집단은 기존의 연구 집단보다 비 흡연자의 비율이 34.4%로 더 높았기 때문에, 본 발명자들은 비흡연자가 다른 분자 메커니즘을 통해 ICI 반응에 관여하는지를 살펴보았다. 주목할 점은, 도 10 내지 12에 따르면, 비흡연자의 경우 ICI 반응자가 비 반응자에 비해 TMB 및 PD-L1 발현이 유의미하게 높지 않은 것으로 확인된 것이다. 이는 현재 널리 사용되고 있는 바이오 마커들이 비흡연자에게 충분히 효과적이지 못함을 시사한다. 따라서 본 발명자들은 특정 유전자의 돌연변이가 비 흡연자에게 잠재적인 표지로서 역할을 할 수 있는지를 추가로 분석하였다. 그 결과 도 13에 따르면, TP53 및 EGFR 돌연변이가 ICI를 받는 비흡연자에서 중요한 바이오마커임을 확인하였다. 다만 TP53은 FDR 보정을 통과하지 못했으나, TP53 돌연변이는 높은 TMB와의 연관성이 알려져 있음에도 불구하고, 비흡연자에서 감소된 치료 반응과 관련이 있는 것으로 확인되었다.
3.5 클래스 1 HLA에서의 LOH(Loss of heterozygosity) 및 TMB 사이의 연관성
다음으로, class 1 human leukocyte antigen(HLA)에서 loss of heterozygosity(LOH) locus가 TMB 및 면역항암에 대한 반응에 미치는 영향에 대해 연구하였다. 최근에 HLA LOH가 비소세포폐암 환자에서 상승된 non-synonymous mutation burden 과 관련이 있다는 사실이 밝혀졌다. 198명의 비소세포폐암 환자에서 HLA LOH의 빈도를 결정하기 위해, 본 발명자들은 HLA 위치의 특이적 복사본 수를 정확하게 계산할 수 있는 고감도 LOH 검출 파이프라인을 사용하였다. 본 발명자들은 적어도 하나의 HLA-I locus 에서 LOH를 가진 54/198, 즉 27%의 종양을 관찰하였다. 도 14 내지 16에 따르면, 기존의 연구와 일치하게, HLA LOH와 항 PD-L1 작용제에 대한 개선된 반응 사이에는 연관성이 없었다.
상기 살펴본 바와 같이, HLA LOH와 TMB 및 높은 돌연변이 부담 간의 ICI 반응성에 대한 관련성이 밝혀지지 않았기 때문에, 본 발명자들은 LOH 환자 중에서 높은 돌연변이 부하가 단순히 손실된 HLA 대립 유전자에 관련 없는 신생 항원과 결합한 것이 원인이고, 항 종양 면역반응과는 관련이 없는 것인지를 조사하였다. 먼저, 도 15에 나타낸 것과 같이 HLA 대립 유전자에 결합되는 것으로 추정되는 신생 항원의 비율 및 corrected TMB를 컴퓨터상에 디자인하였다. 그 결과, 수정된 TMB는 HLA LOH 환자가 그렇지 않은 환자보다 높은 TMB를 가지고 있다고 계산하지 않았다. 이는 HLA LOH가 면역 편집을 제안하며, TMB의 상승에 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 이러한 관찰은 기존의 TMB 계산 방법이 항원 제시 경로의 방해가 존재하는 일부 환자에서 적합하지 않음을 시사하는 것이다.
3.6 HLA에서의 corrected TMB와 ICI 반응성 간의 연관성
HLA 유전자에서 항원 제시와의 관련성을 감안할 때, 본 발명자들은 수정된 TMB가 기존의 TMB를 능가하는 또 다른 이점이 있는지를 조사하였다(ORR 20% versus 59%, Fisher's exact test, P = 0.0363; PFS HR = 2.91, 95% CI, 1.29-6.54; log-rank test, P = 0.007; OS HR = 3.43, 95% CI, 1.41-8.34; log-rank test, P = 0.004). 먼저, 수정된 TMB를 HLA LOH 샘플에 적용하였고, 그 결과 도 17 내지 18에서 나타낸 것과 같이, 10명의 환자가 높은 TMB그룹에서 낮은 TMB 그룹으로 재 분류되는 것을 확인할 수 있었다. 더욱 주목할 점은, 객관적 반응률(ORR), PFS 및 OS 는 높은 TMB 에서 낮은 TMB로 변경된 환자에게서 모두 낮은 것을 확인한 것이다. 이러한 데이터는 HLA LOH가 감소된 종양의 항원성과 관련이 있고(n = 9; median TMB 308 mutations), ICI에 대한 반응성에 영향을 준다는 것을 시사하는 것이다(n = 10; TMB range 282-477 mutations; Corrected TMB 143-271 mutations). 또한 도 17에 나타낸 것과 같이, 그룹 변경 환자 들은 TMB가 상위 TMB 15-25% 환자들과 비슷함에도 불구하고, PFS, OS는 더 낮았다. 더불어, 또한 수정된 TMB(수정된 TMB ≥ 272 돌연변이) 환자 상위 37명과 TMB 환자 상위 37명을 비교하여 수정된 TMB가 응답자 및 무 응답자를 구별하기 위한 추가적인 예측값을 가지고 있는지 여부를 조사하였다. 그 결과, 수정된 TMB는 PFS 예측 부분에서 기존 TMB보다 더 뛰어남을 알 수 있었다(corrected TMB high versus low, PFS log-rank p = 0.005; TMB high versus low, PFS log-rank p = 0.020; Supplementary Fig.S5).
3.7 TMB와 PD-L1 조합의 임상적 유용성
PD-L1 발현은 144명의 환자에 대해 이용가능하였고, PD-L1가 높은 수준으로 발현되는(≥50 %) 환자는 42 %의 ORR을 산출 하였다. PD-L1 발현은 OR 환자에서 유의하게 더 높았다 (CR / PR 대 SD / PD, Mann-Whitney 테스트, P = 0.0020;도 6A, 왼쪽). PD-L1은 TMB와 비교하였을 때 유사한 정도로 무 반응 군으로부터 객관적으로 반응을 구별할 수 있었다(PD-L1 AUC = 0.66, 95 % CI, 0.56-0.76; 보충도 S3F). 그러나 TMB와 마찬가지로, PD-L1 발현만으로는 치료 반응을 예측하기에는 충분하지 않았다. PD-L1 발현의 분포는 상위 TMB 군 및 하위 TMB 군(Mann-Whitney 테스트, P = 0.1222; 도 6A, 오른쪽)에서 유사하였으며, 이는 PD-L1 발현 수준이 TMB와 관련성이 없음을 의미하는 것이다.
따라서, 본 발명자들은 TMB와 함께 PD-L1 발현을 살필 경우 바이오 마커로서의 유용성이 개선되는지 여부를 조사했다. 그 결과, 도 18에 나타낸 것과 같이, ORM은 TMB가 낮은 환자에서 PD-L1 발현 그룹의 낮은 수준(<50 %)보다 높은 수준의 PD-L1 발현 그룹에서 유의하게 더 높았다(P = 0.0003) 더불어 TMB가 높은 환자의 ORR은 이 두 그룹간에 유사하였다. 종합하면, 도 19에 나타낸 것과 같이, 이들 데이터는 PD-L1 발현이 TMB가 낮은 환자에서 더 우수한 예측력을 가짐을 의미하는 것이다(낮은 TMB의 PD-L1 AUC, 0.75, 95 % CI, 0.64-0.86; 높은 TMB의 PD-L1 AUC, 0.56, 95 % CI, 0.36-0.76; 보충적인 그림 S6A 및 S6B). 보다 자세하게, 진행 또는 사망의 위험 비율은 0.58 (PFS, 95 % CI, 0.38-0.89; P = 0.014) 및 0.55 (OS, 95 % CI, 0.31-0.95; P = 0.033)으로, 각각 TMB가 낮은 환자 그룹에서 높은 PD-L1 발현량 대 낮은 PD-L1 발현량 그룹의 사망률을 의미하는 것이다. 다변량 분석은 TMB가 낮은 환자군에서 연령, 성별, 조직학, 흡연 상태, ECOG 점수 및 TMB을 제어한 경우, PD-L1 발현이 PFS (HR 0.57; 95 % CI, 0.36-0.92; P = 0.021) 및 OS (HR 0.51; 95 % CI, 0.27-0.97; P = 0.039)와 독립적으로 연관되어 있음을 확인하였다.
상기 결과의 검증을 위해, 독립적 ICI- 처리 집단(resourceed ICI-cohort)의 75 개의 종양을 추가로 분석 하였다. PD-L1 발현은 75 명의 환자 중 70 명에서 평가하였고, 그 중 10명의 환자에서 높은 발현의 PD-L1(≥ 50 % 발현)이 관찰되었다. 또한 상기와 같은 경항은 하위 TMB를 정의할 때에도 관찰된 것이다.
실시예 4. ICI 반응성을 예측하는 바이오마커의 확인
4.1 PD-L 및 TMB의 한계와 가능성의 확인
상기와 같이, 본 발명자들은 ICI에 대한 반응을 결정하는 게놈 기능의 역할을 조사하기 위해 고급 NSCLC 샘플에 대한 포괄적인 게놈 분석을 수행하였고, 그 결과 이전의 발견과 일치하는 결과뿐만 아니라 바이오 마커로서 TMB 및 PD-L1 발현의 한계 또한 발견할 수 있었다. 더불어 HLA LOH, HR 결핍 및 비 흡연자에서 TP53 돌연변이를 포함한 항암 면역 반응과 관련된 유전적 특징이 ICI에 대한 반응성에 영향을 줄 수 있음을 관찰하였다.
상기 실시예에 의하면 TMB가 낮은 환자는 PD-L1 발현과 ICIs 반응간에 유의 한 양의 상관 관계를 나타내는 반면, TMB가 높은 환자는 PD-L1 발현에 관계없이 반응성이 좋은 것으로 관찰되었다. 또한 높은 TMB를 정의할 때, 높은 TMB 컷오프 값(최고 20-25 %)을 적용하는 것이 도움이 됨을 확인하였고, PD-L1은 TMB의 조합 또한 활용성에 도움이 되는 것으로 판단되었다. 결과적으로 PD-L1은 TMB와 함께 적용될 때 향상된 임상적 유용성을 제공하는 것을 확인하였다.
4.2 ICI에 대한 반응과 HLA LOH의 관련성의 확인
상기와 같은 실시예 3을 통해, 본 발명자들은 HLA LOH가 면역 요법 전에 NSCLC에서 흔하며(27%) PD-1 / PD-L1을 표적으로 하는 항체에 대한 감소된 반응성과 관련이 없음을 발견했다. 이 발견은 HLA LOH와 ICI에 대한 감소 된 반응 사이의 연관성을 보여주는 최근 연구와 일치하지 않을 수 있다. 이러한 불일치에 대한 가능한 설명은 기존 연구 집단의 환자들의 종양 유형이 종합되었거나, 환자가 항-PD1 단일 요법이 아니라 항-CTLA-4, 항-PD-1 또는 이들의 조합 요법으로 치료되었기 때문일 수 있다. 상기 발견은 MHC 클래스 I 발현이 흑색종 환자에서 항-PD-1 작용제에 대한 일차 저항과 관련이 없음을 시사하는 것이다.
상기와 같이 관찰 된 결과와 면역 감시 가설간에 예상치 못한 불일치가 있기 때문에, 본 발명자들은 ICI에 대한 반응과 HLA LOH의 연관성이 종양 돌연변이 부하(TMB)를 고려할 때 더 정확해지는지를 살펴보았다. 그 결과, HLA LOH를 갖는 종양은 HLA LOH를 갖지 않는 종양에 비해 더 높은 돌연변이 부담(TMB)을 가졌지만, 보정된 TMB는 HLA LOH를 갖는 종양에서 유의하게 상승되지 않았다. 이 관찰은 HLA LOH가 후속 하위 클론 확장(18)을 허용하는 개념을 뒷받침한다. HLA LOH를 나타내는 종양 샘플에서 TMB 상승이 확인되었으며, 상승된 TMB가 손실된 HLA 위치에 결합할 것으로 예상되는 하위 클론 신생 항원에 기여할 수 있음을 확인하였다. 이러한 데이터는 손실된 주장과 결합할 것으로 예측된 신생 항원이 하위 클론 확장에 기여할 수 있으며, 하위 클론 확장은 HLA 손실을 나타내는 종양의 TMB 증가로 이어질 수 있음을 암시한다.
더불어 수정된 TMB의 도입 결과 예측의 정확도가 높아진 것을 확인할 수 있었다. 보다 구체적으로 HLA LOH를 고려하는 상술한 접근 방식을 통해 높은 TMB와 ICI 반응성 사이의 관계에서 관찰된 이상치를 조정할 수 있었다. 그 결과 잃어버린 HLA 대립 유전자에만 결합할 것으로 예상되었던 신생 항원이 효과적인 항종양 면역을 이끌어내지 못할 수도 있다는 가설을 세웠다. 이와 관련하여 수정 된 TMB는 높은 TMB에도 불구하고 ICI에 응답하지 않는 환자를 식별하는 데 도움이 될 수 있다. 이러한 결과은 높은 TMB와 ICI 반응성 예측 관련하여 일부 명백한 이상 징후를 이해하는 데 도움이 될 수 있을 것이다.
4.3 HR 유전자 변형과 TMB 연관성의 확인
상기 실시예의 결과에서, 본 발명자들은 HR 유전자 변형이 더 높은 TMB 및 더 긴 PFS와 관련이 있음을 분석하였다. 결함 DNA 손상 반응 및 복구 메커니즘에서 파생 된 cytosolic DNA 조각이 인터페론 유전자 자극기(STING) 신호 경로를 자극하여 ICI에 대한 반응에 영향을 미치고, 체크 포인트 차단 반응(ICI)에서 DNA 복구 변경에 추가적으로 영향을 미치는 것일 수 있다. 다양한 세포질 DNA 센서가 세포질 DNA 단편에 결합하고 유형 1 인터페론 및 T 세포 모집을 통해 항 종양 활성을 유도하는 STING 경로를 활성화시키는 것으로 가정된다. 더불어 STK11 손실이 메틸화로 인한 STING 억제를 통해 면역 회피로 이어진다는 것을 관찰했다. 실제로, STK11-돌연변이는 NSCLC 집단에서 ICI에 대한 1 차 저항과 관련이 있었다. 또한 STK11 절단 돌연변이를 갖는 3/4 (75 %) 환자가 객관적인 반응에 도달하지 않는 것으로 관찰되었다. 전체적으로, 이들 연구는 면역 요법에서 STING 경로의 임상적 이용 가능성을 암시한다. 예를 들어, 의존적 항 종양 활성을 증가시키는 것은 ICI에 반응하지 않는 환자에서 효과적인 조합 전략이 될 수 있다.
4.4 비흡연자 비소세포폐암 환자에서의 ICI 반응성 예측 결과 확인
비 흡연자에서 발생하는 NSCLC는 발암 물질의 돌연변이 유발 효과에 의해 발생하는 흡연자의 NSCLC와는 다른 작용 기작을 가질 수 있다. 본 실험의 연구 집단에서, PD-L1 발현 및 TMB는 흡연자에서 ICI에 대한 반응성을 결정하기에 충분하지 않았고, 이는 ICI 반응성에 관여하는 주요 체세포 돌연변이의 중요성을 암시하는 것이다. 더불어 EGFR 돌연변이가 있는 환자는 객관적인 반응을 달성 할 수 없음을 관찰하였다. 또한, TP53 돌연변이는 증가 된 TMB 및 PD-L1 발현과의 공지된 연관성에도 불구하고 ICI에 대한 감소된 반응성과 관련이 있었다. 전임상 모델에서, 초기 데이터는 p53 기능의 상실이 감소 된 케모카인 생산을 통해 면역 세포 침윤을 감소 시킨다는 것을 시사하고 있다. 실제로, 종양의 면역 탈출은 항 종양의 프라이밍 및 트래 피킹주기를 비활성화함으로써 달성될 수 있다.
결론적으로, 게놈 및 임상 데이터의 통합 분석을 통해, 우리는 게놈 또는 병리학 적 바이오 마커와 ICI 반응 사이의 관계에서 관찰 된 불일치의 이유에 초점을 맞추었다. 주목할만한 점은 수정 된 TMB가 기존 TMB보다 더 신뢰할 수 있는 마커 일 수 있음을 시사한다. 또한, HR 유전자 변형 및 STING 경로와 같은 추가적인 유전적 특성은 IO 반응의 이해 및 예측에 도움이 될 것이다.
10은 암 환자 치료 반응성 분석장치(프로세서)이다.
110은 상기 프로세서의 데이터 생성부이다.
120은 상기 프로세서의 계산부이다.
130은 상기 프로세서의 수정부이다.

Claims (18)

  1. 컴퓨터 프로그램이 실행됨에 따라 컴퓨터 장치에 의해 각 단계가 수행되는, 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성을 분석하는 방법으로서,
    암 환자로부터 수득된 생물학적 시료를 시퀀싱(sequencing)하는 단계;
    상기 시퀀싱 값을 필터링(filitering) 하는 단계;
    상기 필터링 된 시퀀싱 값을 이용하여 암 돌연변이 부담(Tumor mutation burden: TMB)을 계산하는 단계; 및
    상기 계산된 TMB 값을 하기 수학식 1을 이용하여 수정된 TMB를 계산하는 단계를 포함하는 수정된 TMB(corrected TMB)를 분석하는 방법.
    [수학식 1]
    Figure 112022028044545-pat00004

    상기 식에서, TMB는 비동의 돌연변이(nonsynonymous alteration)(SNV 또는 indel)이며, NeoAg는 Mupexi의 결과로 계산된 신생 항원 부담(neoantigen burden)을 의미하고, NeoAgL는 Mupexi와 LOH HLA에 의해 손실된 HLA 대립유전자(alleles)와 결합할 것으로 예측되는 신생 항원(Neoantigens)의 값이며(HLA LOH가 없는 경우에는 0으로 설정), NeoAgC는 손실된 HLA 대립 유전자 및 유지된 HLA 대립 유전자 둘 다에 결합할 것으로 예측된 신생 항원(neoantigen)의 값을 의미함(HLA LOH 가 없는 경우 값을 0으로 설정).
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 암 환자는 폐암 환자인 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 암 환자는 비 흡연자인 것인 방법.
  4. 암 환자로부터 수득된 생물학적 시료를 시퀀싱(sequencing)하는 단계;
    상기 시퀀싱 값을 필터링(filitering) 하는 단계;
    상기 필터링 된 시퀀싱 값을 이용하여 암 돌연변이 부담(Tumor mutation burden: TMB)을 계산하는 단계;
    상기 계산된 TMB 값을 하기 수학식 1을 이용하여 수정된 TMB를 계산하는 단계; 및
    상기 계산된 TMB 값을 토대로 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법;
    [수학식 1]
    Figure 112022028044545-pat00005
    .
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 반응성의 예측은 수정된 TMB의 값이 전체 환자 데이터와 비교하였을 때, 상위 50 내지 30%부터 상위 0%까지 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성이 높을 것으로 예측하고 하위 50 내지 30% 부터 하위 0%까지는 반응성이 낮을 것으로 예측하는 것인 방법.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 방법은 상기 암 환자로부터 수득된 생물학적 시료로부터 Programmed death-ligand 1(PD-L1)의 발현을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 PD-L1의 발현값과 상기 수정된 TMB의 값을 조합하여 치료 반응성을 예측하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
  7. 청구항 4에 있어서, 상기 면역항암제는 면역관문억제제(Immune checkpoint inhibitors: ICIs)인 것인 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 면역관문억제제(Immune checkpoint inhibitors: ICIs)는 항 PD-L1, 항-PD-L1, 항-PD-1, 또는 항-CTLA-4인 것인 방법.
  9. 청구항 4에 있어서, 상기 암 환자의 암은 폐암, 흑색종, 호지킨림프종, 위암, 요로상피세포암, 두경부암, 간암, 대장암, 전립선암, 췌장암, 간암, 고환암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 방광암, 뇌암, 유방암, 및 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 폐암은 비소세포 폐암 또는 소세포 폐암인 것인 방법.
  11. 청구항 4에 있어서, 상기 암 환자는 비 흡연자인 것인 방법.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항의 방법을 컴퓨터에서 실행시키기 위한 프로그램을 기록한 컴퓨터로 읽을 수 있는 기록매체.
  13. 암 환자로부터 수득된 생물학적 시료의 시퀀싱을 수행하여 유전자 데이터 세트를 생성하는 데이터 생성부;
    상기 측정된 유전자 데이터에서 필터링을 수행함으로서 TMB를 측정하는 계산부; 및
    상기 측정된 TMB 값을 하기 수학식 1을 이용하여 수정된 TMB 값으로 계산하는 수정부를 포함하는, 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성을 분석하는 장치;
    [수학식 1]
    Figure 112022028044545-pat00006
    .
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 장치는 수정된 TMB의 값이 전체 환자 데이터와 비교하였을 때, 상위 50 내지 30%부터 상위 0%까지 면역항암제에 대한 암 환자의 치료 반응성이 높을 것으로 예측하고 하위 50 내지 30% 부터 하위 0%까지는 반응성이 낮을 것으로 예측하는 분석부를 추가적으로 포함하는 것인 장치.
  15. 청구항 13에 있어서, 상기 장치는 상기 암 환자로부터 수득된 생물학적 시료로부터 PD-L1 발현을 측정하는 측정부; 및
    상기 측정값과 상기 수정된 TMB 값을 조합하여 면역항암제에 대한 반응성을 판단하는 판단부를 추가적으로 포함하는 것인 장치.
  16. 청구항 13에 있어서, 상기 암 환자의 암은 폐암, 흑색종, 호지킨림프종, 위암, 요로상피세포암, 두경부암, 간암, 대장암, 전립선암, 췌장암, 간암, 고환암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 방광암, 뇌암, 유방암, 및 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 장치.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 폐암은 비소세포 폐암 또는 소세포 폐암인 것인 장치.
  18. 청구항 13에 있어서, 상기 암 환자는 비 흡연자인 것인 장치.
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